JP7240659B2 - Spermatogenic induction medium - Google Patents
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Description
本願は、***形成誘導用培地およびそれを用いた***形成誘導方法等に関する。 The present application relates to a spermatogenesis-inducing medium, a spermatogenesis-inducing method using the same, and the like.
佐藤ら（非特許文献１）は、アガロースゲル上で新生仔マウス精巣を培養する精巣器官培養法において、血清代替物であるKnockOut（商標） Serum Replacement（KSR）（Gibco（商標））もしくは牛血清由来アルブミン製剤であるAlbuMAX（商標）（Gibco（商標））を用いることで精原幹細胞から完全な***までの分化に成功したことを報告している。しかしながら、これら製品の製法および成分は全てが明らかにされている訳ではないため、化学組成の明らかな合成培地（CDM: Chemically-defined medium）での研究が続けられている。三條ら（非特許文献２）はCDMを用いてのin vitro***形成において、4.5日齢以降のマウス精巣組織を用いて円形***細胞まで分化させることに成功した。その過程で、CDMにおける精巣器官培養法にはアルブミンが重要な成分の１つであることを見出した。しかしながら、CDMでは完全な***までの分化は得られておらず、更なる研究が継続されている。
アルブミンは血漿等を精製して得られるが、得られたアルブミンは重合体を形成し易く不安定であり、その安定化には脂肪酸の添加が有効であることが知られている（非特許文献３など）。脂肪酸のなかでもカプリル酸がアルブミンの安定剤として通常使用されている（非特許文献４など）。
Sato et al. (Non-Patent Document 1) used KnockOut (trademark) Serum Replacement (KSR) (Gibco (trademark) ) or bovine serum as a serum substitute in a testicular organ culture method for culturing neonatal mouse testes on an agarose gel. They reported successful differentiation from spermatogonial stem cells to complete spermatozoa using AlbuMAX ™ (Gibco ™ ), an albumin-derived preparation. However, the production methods and components of these products have not been completely elucidated, and research continues on chemically-defined media (CDM) with a clear chemical composition. Sanjo et al. (Non-Patent Document 2) succeeded in in vitro spermatogenesis using CDM, using mouse testis tissue after 4.5 days of age to differentiate into round spermatids. In the process, we discovered that albumin is one of the important ingredients for the testicular organ culture method in CDM. However, differentiation to complete spermatozoa has not been obtained with CDM, and further research is ongoing.
Albumin can be obtained by purifying plasma or the like, but the albumin thus obtained tends to form polymers and is unstable. 3, etc.). Among fatty acids, caprylic acid is commonly used as an albumin stabilizer (Non-Patent
本願の課題は、インビトロにおける***形成誘導を向上する方法およびその手段の提供である。 The object of the present application is to provide methods and means for improving spermatogenesis induction in vitro.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、カプリル酸が***形成誘導を阻害するため、カプリル酸低含有アルブミンを精巣器官培養に使用することで***形成誘導は向上されることを見出し、本願発明に至った。
本願は下記を提供する。
The present inventors conducted intensive studies to solve the above problems, and found that since caprylic acid inhibits the induction of spermatogenesis, the induction of spermatogenesis was improved by using albumin with a low caprylic acid content in testis organ culture. The inventors have found that and have completed the present invention.
The present application provides:
［１］ インビトロ***形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤。
［２］ 該インビトロ***形成誘導が精巣器官培養を含む、［１］に記載の剤。
［３］ 該カプリル酸低含有アルブミンが、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として７０μｍｏｌ以下含む、［１］または［２］に記載の剤。
［４］ インビトロ***形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤；および
該剤をインビトロ***形成誘導に使用される培地に使用することの説明；
を含む、インビトロ***形成誘導における培地用キット。
［５］ インビトロ***形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地。
［６］ 該インビトロ***形成誘導が精巣器官培養を含む、［５］に記載の培地。
［７］ 該カプリル酸低含有アルブミンが、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として７０μｍｏｌ以下含む、［５］または［６］に記載の剤。
［８］ インビトロ***形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地；および
該培地をインビトロ***形成誘導に使用することの説明；
を含む、インビトロ***形成誘導における培地用キット。
［９］ カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とする、インビトロ***形成誘導方法。
[1] An agent containing caprylic acid-low content albumin for use in a medium used for in vitro spermatogenesis induction.
[2] The agent of [1], wherein the in vitro spermatogenesis induction comprises testicular organ culture.
[3] The agent according to [1] or [2], wherein the low caprylic acid content albumin contains 70 μmol or less of caprylic acid in free form per 1 g of albumin.
[4] an agent containing albumin with low caprylic acid content for use in a medium used for in vitro spermatogenesis induction; and a description of the use of the agent in a medium used for in vitro spermatogenesis induction;
A kit for media in in vitro spermatogenesis induction, comprising:
[5] A medium containing caprylic acid-low albumin for use in in vitro spermatogenesis induction.
[6] The medium of [5], wherein the in vitro spermatogenesis induction comprises testicular organ culture.
[7] The agent according to [5] or [6], wherein the albumin with low caprylic acid content contains 70 μmol or less of free form caprylic acid per 1 g of albumin.
[8] A medium containing low caprylic acid albumin for use in in vitro spermatogenesis induction; and a description of the use of said medium for in vitro spermatogenesis induction;
A kit for media in in vitro spermatogenesis induction, comprising:
[9] A method for inducing spermatogenesis in vitro, characterized by using a medium containing albumin with a low caprylic acid content.
本発明によれば、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することで、インビトロ***形成誘導は向上する。 According to the present invention, in vitro induction of spermatogenesis is improved by using a medium containing albumin with low caprylate content.
１つの態様において、本願は、インビトロ***形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤を提供する。本願の剤は、例えば培地製造の原料として、あるいは、インビトロ***形成誘導の基礎培地等に適宜添加して使用されるサプリメントとして使用されうる。 In one aspect, the present application provides an agent containing caprylate-low albumin for use in media used for in vitro spermatogenesis induction. The agent of the present application can be used, for example, as a raw material for medium production, or as a supplement that is appropriately added to a basal medium for inducing spermatogenesis in vitro.
別の態様において本願は、インビトロ***形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を提供する。 In another aspect, the present application provides a medium containing low caprylate albumin for use in in vitro spermatogenesis induction.
さらに別の態様として本願は、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とする、インビトロ***形成誘導方法を提供する。 In still another aspect, the present application provides a method for inducing spermatogenesis in vitro, characterized by using a medium containing albumin with a low caprylic acid content.
本願において「培地」とは、***形成誘導において細胞等に適用されうるものであれば、その使用目的は特に限定されない。例えば、本願における培地は、細胞等を培養するために、細胞を洗浄するために、細胞等を懸濁するために、および細胞等を保存するために使用されうる。 In the present application, the term "medium" is not particularly limited as long as it can be applied to cells or the like in spermatogenesis induction. For example, the medium in the present application can be used for culturing cells, washing cells, suspending cells, and preserving cells.
本願において***形成誘導とは、幹細胞（例えば***幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）から***が形成される過程に見られる一連のステップを完全にまたは部分的に誘導することを意味する。 In the present application, spermatogenic induction means complete or partial induction of a series of steps seen in the process of sperm formation from stem cells (eg, spermatogonial stem cells, ES cells, iPS cells).
本願においてインビトロ***形成誘導とは、インビトロでなされる***形成誘導を意味する。インビトロ***形成誘導は、インビボでの***形成誘導と組み合わせて行われても良い。インビトロ***形成誘導の例として、精巣器官培養が挙げられる。 In the present application, in vitro spermatogenesis induction means spermatogenesis induction performed in vitro. In vitro spermatogenesis induction may be performed in combination with in vivo spermatogenesis induction. Examples of in vitro spermatogenesis induction include testicular organ culture.
精巣組織には通常、***幹細胞、精原細胞、***細胞、精細胞等の***の前駆細胞が存在する。精巣器官培養とは***形成を誘導するために精巣組織片をインビトロで培養する方法である。精巣器官培養の方法は特に限定されず、当該技術分野における通常の方法により行うことができる。例えば精巣組織片を培養液（例えばアルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）を添加した、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地）に半分浸したゲル（例えばアガロースゲル）に載せて培養することにより行うことができる。 Testis tissue usually contains spermatogonial progenitor cells such as spermatogonial stem cells, spermatogonia, spermatocytes and spermatids. Testicular organ culture is a method of culturing testicular tissue pieces in vitro to induce spermatogenesis. The testis organ culture method is not particularly limited, and can be carried out by a conventional method in the technical field. For example, testicular tissue pieces can be cultured by placing them on a gel (eg, agarose gel) half-immersed in a culture medium (eg, αMEM medium, RPMI medium supplemented with albumin (preferably bovine serum albumin)).
本願において、***形成が誘導されたかどうかは、当該技術分野における通常の基準に照らして、例えば、組織学的観察等により決定される。インビトロ***形成誘導が実験動物において行われる場合には***形成の過程でGFPが発現するように設計されたトランジェニック動物を用いて観察されてもよい。 In the present application, whether or not spermatogenesis is induced is determined by, for example, histological observation in light of the standard in the technical field. When in vitro spermatogenesis induction is performed in experimental animals, it may be observed using transgenic animals designed to express GFP during spermatogenesis.
本願において、インビトロ***形成誘導の対象は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サル））であり、さらに好ましくはヒトである。 In the present application, the target for in vitro spermatogenesis induction is not particularly limited, but preferably mammals (humans and mammals other than humans (e.g., cows, horses, pigs, dogs, cats, mice, rats, rabbits, monkeys)), Humans are more preferred.
本願において、カプリル酸低含有アルブミンは、カプリル酸を***形成誘導に悪影響を及ぼす程度には含有しないアルブミンを意味する。 In the present application, albumin with low caprylic acid content means albumin that does not contain caprylic acid to such an extent that spermatogenesis induction is adversely affected.
カプリル酸低含有アルブミンに含まれうるカプリル酸の量は***形成誘導に悪影響を及ぼさない限り特に限定されないが、例えば、アルブミン１ｇに含まれるカプリル酸の量は遊離形態として、７０μｍｏｌ以下、好ましくは５０μｍｏｌ以下、より好ましくは４０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは３６μｍｏｌ以下、またさらに好ましくは３０μｍｏｌ以下、またさらにより好ましくは２８μｍｏｌ以下、さらに好ましくは２６μｍｏｌ以下である。さらに、カプリル酸低含有アルブミンの量の例として、アルブミン１ｇに対してカプリル酸（遊離形態として）を０．０１～７０μｍｏｌ、好ましくは０．１～５０μｍｏｌ、さらに好ましくは０．５～４０μｍｏｌ、さらにより好ましくは１～３６μｍｏｌ、またさらにより好ましくは２～３０５μｍｏｌ、さらに好ましくは３～２８μｍｏｌ、より好ましくは５～２６μｍｏｌ含むアルブミンが挙げられる。あるいはアルブミン１ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）の好ましい範囲は、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ、０．５μｍｏｌ、１μｍｏｌ、２μｍｏｌ、３μｍｏｌ、４μｍｏｌ、および５μｍｏｌから選択される下限値；および７０μｍｏｌ、６０μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、４０μｍｏｌ、３６μｍｏｌ、３０μｍｏｌ、２８μｍｏｌ、２６μｍｏｌ、２４μｍｏｌ、２２μｍｏｌ、および２０μｍｏｌから選択される上限値；の組合せにより示されうる。 The amount of caprylic acid that can be contained in albumin with low caprylic acid content is not particularly limited as long as it does not adversely affect the induction of spermatogenesis. Below, more preferably 40 μmol or less, still more preferably 36 μmol or less, even more preferably 30 μmol or less, even more preferably 28 μmol or less, still more preferably 26 μmol or less. Furthermore, as an example of the amount of caprylic acid-low content albumin, caprylic acid (as a free form) is 0.01 to 70 μmol, preferably 0.1 to 50 μmol, more preferably 0.5 to 40 μmol, and more preferably 0.5 to 40 μmol per 1 g of albumin. Albumin containing more preferably 1 to 36 μmol, still more preferably 2 to 305 μmol, still more preferably 3 to 28 μmol, more preferably 5 to 26 μmol. Alternatively, a preferred range of caprylic acid (as free form) contained in 1 g of albumin is a lower limit selected from 0.01 μmol, 0.1 μmol, 0.5 μmol, 1 μmol, 2 μmol, 3 μmol, 4 μmol, and 5 μmol; an upper limit selected from 60 μmol, 50 μmol, 40 μmol, 36 μmol, 30 μmol, 28 μmol, 26 μmol, 24 μmol, 22 μmol, and 20 μmol;
アルブミンの量の測定方法は特に限定されず、当該技術分野で通常用いられる方法により測定することができる。例えばアルブミンの量は蛋白質量として、例えばブラッドフォード法により測定されることができる。 The method for measuring the amount of albumin is not particularly limited, and it can be measured by a method commonly used in the art. For example, the amount of albumin can be measured as the amount of protein, eg, by the Bradford method.
カプリル酸（遊離形態として）を測定する方法は特に限定されず、当該技術分野で通常用いられる方法により測定することができる。例えば、アルブミン含有液を抽出し（例えばBligh-Dyer抽出により）、得られた脂質分画を（好ましくはトリメチルシリル化後に）ガスクロマトグラフィー質量分析計に供して測定することができる。 The method for measuring caprylic acid (as free form) is not particularly limited, and it can be measured by a method commonly used in the art. For example, the albumin-containing fluid can be extracted (eg, by Bligh-Dyer extraction) and the resulting lipid fraction (preferably after trimethylsilylation) subjected to gas chromatography-mass spectrometry for measurement.
アルブミンに含まれるカプリル酸（遊離形態として）を測定する好ましい方法を以下に例示する。
（１）アルブミンに、溶媒（例えば水）を加える（例えば、蛋白質濃度（例えばブラッドフォード法による）として４ｗ／ｖ％となるように）。
（２）得られたアルブミン含有液を抽出（例えばBligh-Dyer抽出）し、得られた脂質分画を（例えばトリメチルシリル化後に）ガスクロマトグラフィー質量分析計に供して遊離カプリル酸量を測定する。
A preferred method for measuring caprylic acid (as free form) in albumin is illustrated below.
(1) A solvent (eg, water) is added to albumin (eg, so that the protein concentration (eg, according to the Bradford method) is 4 w/v%).
(2) The resulting albumin-containing liquid is extracted (for example, Bligh-Dyer extraction), and the resulting lipid fraction (for example, after trimethylsilylation) is subjected to a gas chromatography-mass spectrometer to measure the amount of free caprylic acid.
本願のカプリル酸低含有アルブミンは、天然由来（例えば卵白アルブミン、ブタ由来アルブミン、ウシ由来アルブミン、ヒト由来アルブミン）のアルブミンであっても、ウシ型、ブタ型、またはヒト型等の遺伝子組換え体のアルブミンであってもよく、好ましくはウシ由来アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）である。 The albumin with low caprylic acid content of the present application may be a naturally-derived albumin (e.g., ovalbumin, porcine-derived albumin, bovine-derived albumin, or human-derived albumin), or a genetic recombinant such as bovine, porcine, or human. albumin, preferably bovine-derived albumin (eg, bovine serum albumin).
本願においてアルブミンの製造方法は特に限定されず、常法により製造することができる。例えば、アルブミンは血漿から精製されて、または遺伝子組換え技術を使って酵母等で産生させ精製することによって製造される。当該精製方法としては、例えば、低温エタノール分画法、熱処理法、およびクロマトグラフィー精製法が挙げられる。 In the present application, the method for producing albumin is not particularly limited, and albumin can be produced by a conventional method. For example, albumin is purified from plasma, or produced in yeast or the like using genetic recombination techniques and purified. Such purification methods include, for example, a low-temperature ethanol fractionation method, a heat treatment method, and a chromatographic purification method.
精製後（特に低温エタノール分画法および熱処理法による精製後）のアルブミンは重合化しやすく不安定であるため、カプリル酸（遊離形態または塩形態）が添加され得る。カプリル酸が***形成誘導に悪影響を及ぼす程度添加されている場合には、カプリル酸を除去することで、本願のカプリル酸低含有アルブミンを得ることができる。 Caprylic acid (free form or salt form) may be added since albumin after purification (particularly after purification by cold ethanol fractionation and heat treatment methods) is prone to polymerization and unstable. When caprylic acid is added to the extent that it adversely affects the induction of spermatogenesis, the low caprylic acid content albumin of the present application can be obtained by removing the caprylic acid.
１つの実施態様において、本願に用いられるカプリル酸低含有アルブミンとしては、低温エタノール分画法（例えばコ－ンのFraction V）または熱処理法、好ましくは低温エタノール分画法で精製され、かつカプリル酸（遊離形態または塩形態）が添加されたアルブミンから、適宜カプリル酸が除去されたアルブミンが使用されうる。 In one embodiment, the caprylic acid-low content albumin used in the present application is purified by a low-temperature ethanol fractionation method (eg Cohn's Fraction V) or a heat treatment method, preferably a low-temperature ethanol fractionation method, and caprylic acid Albumin to which caprylic acid has been removed, as appropriate, can be used from albumin to which (free form or salt form) has been added.
商業的に入手可能なアルブミンの例には下記のものが挙げられ、適宜カプリル酸を除去して、本願のカプリル酸低含有アルブミンとして用いることができる。
ウシ血清アルブミン： Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, BioReagent, suitable for cell culture, 96% (SIGMA-ALDRICH)、アルブミン, 牛血清由来（和光純薬工業）、Bovine Albumin Fraction V（ThermoFisher Scientific）
組換えヒトアルブミン：CellPrime rAlbumin AF-s（Merck）
ヒト血漿由来アルブミン：Human Serum Albumin Solution (Irvine Scientific)、HUMAN SERUM ALBUMIN (InVitroCare)
Examples of commercially available albumins include the following, which can be used as low caprylic acid content albumin of the present application by appropriately removing caprylic acid.
Bovine serum albumin: Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, BioReagent, suitable for cell culture, 96% (SIGMA-ALDRICH), albumin, derived from bovine serum (Wako Pure Chemical Industries), Bovine Albumin Fraction V (ThermoFisher Scientific)
Recombinant human albumin: CellPrime rAlbumin AF-s (Merck)
Human plasma albumin: Human Serum Albumin Solution (Irvine Scientific), HUMAN SERUM ALBUMIN (InVitroCare)
カプリル酸を除去する方法は特に限定されず、脂肪酸の除去に通常用いられる方法（例えば活性炭を用いる方法）を使用することができる。酸性下で活性炭処理後、さらに脱イオン処理することで脂質や金属イオンを除去する方法（Ｉｓｃｏｖｅ処理）を用いてもよい。 A method for removing caprylic acid is not particularly limited, and a method commonly used for removing fatty acids (for example, a method using activated charcoal) can be used. A method (Iscove treatment) in which lipids and metal ions are removed by deionization after treatment with activated carbon in an acidic environment may also be used.
あるいは、イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法を用いて、人為的に添加されたカプリル酸を除去することで本願のカプリル酸低含有アルブミンを得ることができる。イオン交換処理の方法は特に限定されないが、陽イオン交換処理および陰イオン交換処理の両方が行われることが好ましい。 Alternatively, the caprylic acid-low content albumin of the present application can be obtained by removing artificially added caprylic acid using a method for removing caprylic acid using ion exchange treatment. The method of ion exchange treatment is not particularly limited, but both cation exchange treatment and anion exchange treatment are preferably performed.
陽イオン交換処理は、弱酸性陽イオン交換処理（例えばカルボン酸基を交換基として用いる）であっても、強酸性陽イオン交換処理（例えばスルホン酸基を交換基として用いる）であってもよいが、強酸性陽イオン交換処理（例えばスルホン酸基を交換基として用いる）であることが好ましい。交換基のイオン形態は特に限定されず、たとえば、水素、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、好ましくは水素が用いられる。陽イオン交換処理は例えば陽イオン交換樹脂（例えば弱酸性陽イオン交換樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂）を用いて、通常の方法に従って行うことができる。 The cation exchange treatment may be weakly acidic cation exchange treatment (for example, using carboxylic acid groups as exchange groups) or strongly acidic cation exchange treatment (for example, using sulfonic acid groups as exchange groups). However, it is preferably a strongly acidic cation exchange treatment (for example, using a sulfonic acid group as an exchange group). The ionic form of the exchange group is not particularly limited, and examples thereof include hydrogen, sodium salts, potassium salts, etc. Hydrogen is preferably used. The cation exchange treatment can be carried out according to conventional methods using, for example, cation exchange resins (eg, weakly acidic cation exchange resins, strongly acidic cation exchange resins).
陰イオン交換処理は、弱塩基性陰イオン交換処理（例えば一～三級アミノ基を交換基として用いる）であっても、強塩基性陰イオン交換処理（例えば四級アンモニウムを交換基として用いる）であってもよいが、強塩基性陰イオン交換処理であることが好ましい。四級アンモニウムの例としては、トリメチルアンモニウム基およびジメチルエタノールアンモニウム基が挙げられ、好ましくはトリメチルアンモニウム基が用いられる。交換基のイオン形態は特に限定されず、例えば、塩化物、水酸化物、酢酸塩、ギ酸塩が挙げられ、好ましくは水酸化物が使用される。陰イオン交換処理は例えば陰イオン交換樹脂（例えば弱塩基性陰イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂）を用いて、通常の方法に従って行うことができる。 The anion exchange treatment is a weakly basic anion exchange treatment (for example, using a primary to tertiary amino group as an exchange group) or a strongly basic anion exchange treatment (for example, using a quaternary ammonium group as an exchange group). However, it is preferably a strongly basic anion exchange treatment. Examples of quaternary ammonium groups include trimethylammonium groups and dimethylethanolammonium groups, preferably trimethylammonium groups are used. The ionic form of the exchange group is not particularly limited, and examples thereof include chloride, hydroxide, acetate and formate, preferably hydroxide. The anion exchange treatment can be carried out according to a conventional method using, for example, an anion exchange resin (eg, weakly basic anion exchange resin, strongly basic anion exchange resin).
イオン交換樹脂の母体は特に限定されず、通常イオン交換樹脂の母体として使用されるもの（例えばスチレンジビニルベンゼン）を用いることができる。 The base of the ion exchange resin is not particularly limited, and those commonly used as bases of ion exchange resins (eg, styrenedivinylbenzene) can be used.
好ましいイオン交換樹脂としては、作業性の観点から、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を両方含む混床樹脂（例えば、ＡＧ ５０１－Ｘ８ （Ｄ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、およびＡＧ ５０１－Ｘ８（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いることが好ましい。 From the viewpoint of workability, preferred ion exchange resins include mixed bed resins containing both a cation exchange resin and an anion exchange resin (for example, AG 501-X8 (D) (BIO-RAD) and AG 501-X8 ( BIO-RAD) is preferably used.
当該イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法は、例えば、イオン交換樹脂とカプリル酸を含有しうるアルブミンを適当な溶媒（例えば水）下で混合（好ましくは、低温（例えば１～１０℃、好ましくは２～６℃）・遮光下、例えば１～４８時間、好ましくは３～３６時間、さらに好ましくは５～３０時間）することにより行うことができる。 The caprylic acid removal method using the ion exchange treatment is, for example, mixing an ion exchange resin and albumin that may contain caprylic acid in a suitable solvent (eg water) (preferably at a low temperature (eg 1 to 10° C., preferably 2 to 6° C.) under light shielding, for example, 1 to 48 hours, preferably 3 to 36 hours, more preferably 5 to 30 hours).
得られたアルブミン含有液はそのままで、あるいはｐＨの調整、安定剤（例えばカプリル酸以外の脂肪酸）の添加等、当該技術分野で知られるアルブミンの安定化技術を適宜行って、カプリル酸低含有アルブミン含有剤として使用することができる。 The resulting albumin-containing solution is left as it is, or is appropriately subjected to albumin stabilization techniques known in the art, such as adjustment of pH and addition of a stabilizer (for example, a fatty acid other than caprylic acid), to obtain an albumin with a low caprylic acid content. It can be used as an inclusion agent.
あるいは、得られたアルブミン含有液は凍結乾燥や限外濾過などにより濃縮されてもよい。またろ過によってウィルス・細菌等の除去を行ってもよい。この場合にも当該技術分野で知られるアルブミンの他の安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）が適宜施されてもよい。 Alternatively, the resulting albumin-containing liquid may be concentrated by freeze-drying, ultrafiltration, or the like. Viruses, bacteria, and the like may also be removed by filtration. In this case also, other stabilization techniques for albumin known in the art (for example, addition of fatty acids other than caprylic acid) may be applied as appropriate.
本願のカプリル酸低含有アルブミンは、人為的にカプリル酸が添加されていないアルブミンであっても良い。例えば、カプリル酸低含有アルブミンは低温エタノール分画法（例えばコ－ンのFraction V）または熱処理法、好ましくは低温エタノール分画法で精製されたアルブミンであって、カプリル酸が人為的に添加されていないアルブミンが挙げられる。これらの精製法で精製されたアルブミンは不安定でありうるため、適宜安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）を施して使用することが好ましい。 The low caprylic acid content albumin of the present application may be albumin to which caprylic acid is not artificially added. For example, albumin with low caprylic acid content is albumin purified by a low-temperature ethanol fractionation method (eg Cohn's Fraction V) or a heat treatment method, preferably a low-temperature ethanol fractionation method, to which caprylic acid is artificially added. albumin that is not Since albumin purified by these purification methods may be unstable, it is preferable to apply stabilization techniques (for example, addition of fatty acids other than caprylic acid) before use.
アルブミンは、種々の物質と結合する能力の高いタンパク質であり、例えば血清由来のアルブミンは血清中に含まれる種々の物質と結合している。そのため人為的にカプリル酸が添加されていなくてもアルブミンは生体由来のカプリル酸を担持することがあるが、***形成誘導に悪影響を及ぼさない量であれば含まれていてもよい。***形成誘導に悪影響を及ぼしうる量が含まれている場合には、イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法または活性炭を用いる方法等の従来方法によりカプリル酸を除去し、適宜安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）を施して使用することができる。 Albumin is a protein that has a high ability to bind to various substances. For example, serum-derived albumin binds to various substances contained in serum. Therefore, even if caprylic acid is not artificially added, albumin may carry bio-derived caprylic acid, but albumin may contain caprylic acid in an amount that does not adversely affect the induction of spermatogenesis. If it contains an amount that can adversely affect spermatogenesis induction, caprylic acid is removed by a conventional method such as a method of removing caprylic acid using ion exchange treatment or a method using activated carbon, and appropriate stabilization techniques (e.g., caprylic acid addition of fatty acid other than acid) can be used.
本願において、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの量は、特に限定されず、インビトロ***形成誘導におけるその培地の使用目的に応じて、通常使用される範囲において適宜選択され得る。例えば、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの濃度は０．１～１０ｗ／ｖ％、好ましくは１～８ｗ／ｖ％、よりこのましくは２～６ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは３～５ｗ／ｖ％、またさらに好ましくは４ｗ／ｖ％であり得る。あるいは、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの量の好ましい範囲は、０．１ｗ／ｖ％、１ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、および４ｗ／ｖ％から選択される下限値；および１０ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、および４ｗ／ｖ％から選択される上限値；の組合せにより示されうる。 In the present application, the amount of caprylic acid-low albumin contained in the medium is not particularly limited, and can be appropriately selected within a range normally used according to the purpose of use of the medium in in vitro spermatogenesis induction. For example, the concentration of caprylic acid-low content albumin contained in the medium is 0.1 to 10 w/v%, preferably 1 to 8 w/v%, more preferably 2 to 6 w/v%, still more preferably 3 to It may be 5 w/v %, or even more preferably 4 w/v %. Alternatively, the preferred range of the amount of albumin with low caprylic acid content contained in the medium is 0.1 w/v%, 1 w/v%, 2 w/v%, 3 w/v%, and 4 w/v%. and an upper limit selected from 10 w/v%, 8 w/v%, 6 w/v%, 5 w/v%, and 4 w/v%.
本願において、カプリル酸低含有アルブミンの安定化（例えば重合体の形成防止）のために使用されうる脂肪酸は、カプリル酸以外の脂肪酸が好ましく、例えば炭素数１０～２０の飽和または不飽和脂肪酸またはその塩（例えばラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、それらの塩（例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびその混合）、およびそれらの混合）が挙げられる。その量は特に限定されないが、例えばアルブミン１ｇに対して当該脂肪酸またはその塩が、遊離形態として１０～１００μｍｏｌ、好ましくは２０～８０μｍｏｌ、さらに好ましくは３０～５０μｍｏｌ含まれる。 In the present application, the fatty acid that can be used for stabilizing the albumin with a low caprylic acid content (for example, preventing the formation of a polymer) is preferably a fatty acid other than caprylic acid, such as a saturated or unsaturated fatty acid having 10 to 20 carbon atoms, or a fatty acid thereof. salts (e.g. lauric acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, salts thereof (e.g. alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and mixtures thereof); and mixtures thereof). Although the amount thereof is not particularly limited, for example, 1 g of albumin contains 10 to 100 μmol, preferably 20 to 80 μmol, more preferably 30 to 50 μmol of the fatty acid or salt thereof in free form.
本願のインビトロ***形成誘導に使用される培地に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する剤の形状は特に限定されず、例えば適当な溶媒（例えば、水、緩衝液）等と混合された液体（適宜好ましいｐH（例えばｐH７～８）に調製される）、凍結乾燥等された固体であることができる。本願の剤には、***形成誘導に悪影響を及ぼさない限り、培地構成成分として公知の添加物を含んでいてもよい。例えば、これらに限定されないが、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、レチノイン酸、レチノール、テストステロン、トリヨードチロニン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、NaHCO3、抗菌剤、抗真菌剤等が挙げられる。また、従来からインビトロ***形成誘導における培養等に用いられてきた他の添加物も適宜含むことができる。添加物は、インビトロ***形成誘導や製品の安定性に悪影響を及ぼさない限りにおいて、それぞれ公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。 The form of the agent containing albumin with low caprylic acid content for use in the medium used for the in vitro induction of spermatogenesis of the present application is not particularly limited. It can be a liquid (adjusted to a preferred pH (for example, pH 7-8)) or a freeze-dried solid. The agent of the present application may contain known additives as medium constituents as long as they do not adversely affect the induction of spermatogenesis. For example, but not limited to, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, cholesterol, sphingomyelin, phosphatidylcholine, retinoic acid, retinol, testosterone, triiodothyronine, luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, Examples include NaHCO 3 , antibacterial agents, antifungal agents, and the like. In addition, other additives that have been conventionally used for culture and the like in in vitro spermatogenesis induction can also be included as appropriate. Additives are preferably contained within known concentration ranges, as long as they do not adversely affect in vitro spermatogenesis induction or product stability.
本願のインビトロ***形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地の形状は特に限定されず、固体培地（寒天培地など）、液体培地等、粉末培地（例えば水に溶かして液体培地として使用される）等、インビトロ***形成誘導における培地の使用目的に応じて適宜選択され、常法を用いて製造することができる。本願培地は、上記の本願の剤と同様に、***形成誘導に悪影響を及ぼさない限り、培地構成成分として公知の添加物を公知の濃度範囲で含んでいてもよい。例えば、本願のインビトロ***形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地はインビトロ***形成誘導用として知られる既知の培地（例えば、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地（適宜、必須脂肪酸（例えば、リノール酸、リノレン酸）、レチノール、レチノイン酸、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、テストステロン、トリヨードチロニン等を添加、さらにパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸が適宜添加されてもよい））にカプリル酸低含有アルブミンを添加することによって製造することができる。 The form of the medium containing albumin with low caprylic acid content for use in the in vitro spermatogenesis induction of the present application is not particularly limited. ), etc., can be appropriately selected according to the purpose of use of the medium in in vitro spermatogenesis induction, and can be produced using a conventional method. The medium of the present application may contain additives known as medium constituents within a known concentration range, as well as the agent of the present application described above, as long as they do not adversely affect the induction of spermatogenesis. For example, the medium containing albumin with low caprylic acid content for use in in vitro spermatogenesis induction of the present application is a known medium known for in vitro spermatogenesis induction (e.g., αMEM medium, RPMI medium (optionally, essential fatty acids (e.g., linoleic acid, linolenic acid), retinol, retinoic acid, follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, testosterone, triiodothyronine, etc., and palmitic acid, stearic acid, and oleic acid may be added as appropriate)) to caprylyl It can be prepared by adding acid-low content albumin.
本願のインビトロ***形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地に添加されうる成分の例には、これらに限定されないが、カプリル酸以外の脂肪酸（例えば培地中濃度が６００～６０００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０００～４０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５００～２５００μｍｏｌ／Ｌ：例えば、パルミチン酸（例えば培地中濃度が２００～１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００～１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００～７００μｍｏｌ／Ｌ）、ステアリン酸（例えば培地中濃度が２００～１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００～１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００～７００μｍｏｌ／Ｌ）、オレイン酸（例えば培地中濃度が２００～１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００～１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００～７００μｍｏｌ／Ｌ）、リノール酸（例えば培地中濃度が３０～３００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０～１５０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは８０～１２０μｍｏｌ／Ｌ）、およびリノレン酸（例えば培地中濃度が１０～１５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０～８０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３０～７０μｍｏｌ／Ｌ）からなる群から選択される脂肪酸の任意の組合せ）、コレステロール（例えば培地中濃度が１～１０μｇ／ｍＬ、好ましくは２～５μｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５～４μｇ／ｍＬ）、スフィンゴミエリン（例えば培地中濃度が１～１０μｇ／ｍＬ、好ましくは２～５μｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５～４．５μｇ／ｍＬ）、ホスファチジルコリン（例えば培地中濃度が５～６０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０～４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１５～２５μｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（例えば培地中濃度が０．３～３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．５μｍｏｌ／Ｌ）、レチノール（例えば培地中濃度が０．３～３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．５μｍｏｌ／Ｌ）、テストステロン（例えば培地中濃度が０．３～３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５～２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．５μｍｏｌ／Ｌ）、トリヨードチロニン（例えば培地中濃度が０．５～６ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～４ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５～２．５ｎｇ／ｍＬ）、黄体形成ホルモン（例えば培地中濃度が０．３～３μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７～１．５μｇ／ｍＬ）、卵胞刺激ホルモン（例えば培地中濃度が０．３～３μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７～１．５μｇ／ｍＬ）、NaHCO3（例えば培地中濃度が０．５～５ｇ／Ｌ、好ましくは１～４ｇ／Ｌ、より好ましくは１．２～２．５ｇ／Ｌ）、抗菌剤、抗真菌剤等が挙げられる。該カプリル酸以外の脂肪酸は、その全てまたは一部が、アルブミンの安定化剤として予めアルブミンと混合された状態で、培地中に添加されてもよい。 Examples of components that may be added to media containing caprylic acid-low albumin for use in in vitro spermatogenic induction herein include, but are not limited to, fatty acids other than caprylic acid (e.g. /L, preferably 1000-4000 μmol/L, more preferably 1500-2500 μmol/L: For example, palmitic acid (for example, the concentration in the medium is 200-1800 μmol/L, preferably 300-1000 μmol/L, more preferably 500-700 μmol /L), stearic acid (e.g. medium concentration 200-1800 μmol/L, preferably 300-1000 μmol/L, more preferably 500-700 μmol/L), oleic acid (e.g. medium concentration 200-1800 μmol/L, preferably 300 to 1000 μmol/L, more preferably 500 to 700 μmol/L), linoleic acid (for example, the concentration in the medium is 30 to 300 μmol/L, preferably 50 to 150 μmol/L, more preferably 80 to 120 μmol/L); and linolenic acid (for example, any combination of fatty acids selected from the group consisting of medium concentrations of 10 to 150 μmol/L, preferably 20 to 80 μmol/L, more preferably 30 to 70 μmol/L), cholesterol (for example, medium medium concentration of 1 to 10 μg/mL, preferably 2 to 5 μg/mL, more preferably 2.5 to 4 μg/mL), sphingomyelin (for example, medium concentration of 1 to 10 μg/mL, preferably 2 to 5 μg/mL) , more preferably 2.5 to 4.5 μg/mL), phosphatidylcholine (for example, the concentration in the medium is 5 to 60 μg/mL, preferably 10 to 40 μg/mL, more preferably 15 to 25 μg/mL), retinoic acid (for example, medium concentration of 0.3 to 3 μmol/L, preferably 0.5 to 2 μmol/L, more preferably 0.7 to 1.5 μmol/L), retinol (for example, medium concentration of 0.3 to 3 μmol/L , preferably 0.5 to 2 μmol/L, more preferably 0.7 to 1.5 μmol/L), testosterone (for example, the concentration in the medium is 0.3 to 3 μmol/L, preferably 0.5 to 2 μmol/L, more preferably 0.7 to 1.5 μmol / L), triiodothyronine (for example, the concentration in the medium is 0.5 to 6 ng / mL, preferably 1 to 4 ng / mL, more preferably 1.5 to 2.5 ng / mL), luteinizing hormone (e.g. medium concentration is 0.3 to 3 μg/mL, preferably 0.5 to 2 μg/mL, more preferably 0.7 to 1.5 μg/mL), follicle-stimulating hormone (for example, the concentration in the medium is 0.3 to 3 μg/mL, preferably 0.5 to 2 μg/mL, more preferably 0.7 to 1.5 μg/mL), NaHCO 3 (for example, the concentration in the medium is 0.5 to 5 g/L, preferably 1 to 4 g/L, more preferably is 1.2 to 2.5 g/L), antibacterial agents, antifungal agents, and the like. All or part of the fatty acid other than caprylic acid may be added to the medium in a state in which it is previously mixed with albumin as an albumin stabilizer.
本願のインビトロ***形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地にはカプリル酸低含有アルブミン以外にはカプリル酸を供給しうる成分は含有されないことが好ましい。当該培地中に含まれうるカプリル酸の量は***形成誘導に悪影響を及ぼさない限り特に限定されないが、例えば、培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量は遊離形態として、２８００μｍｏｌ以下、好ましくは２５００μｍｏｌ以下、より好ましくは２０００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１８００μｍｏｌ以下、またさらに好ましくは１５００μｍｏｌ以下、またさらにより好ましくは１４００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１３００μｍｏｌ以下である。さらに、培地１０００ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）量の例として、０．０１～２８００μｍｏｌ、好ましくは０．１～２５００μｍｏｌ、さらに好ましくは０．５～２０００μｍｏｌ、さらにより好ましくは１～１８００μｍｏｌ、またさらにより好ましくは２～１５００μｍｏｌ、さらに好ましくは３～１４００μｍｏｌ、より好ましくは５～１３００μｍｏｌが挙げられる。あるいは培地１０００ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）の量の好ましい範囲は、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ、０．５μｍｏｌ、１μｍｏｌ、２μｍｏｌ、３μｍｏｌ、４μｍｏｌ、および５μｍｏｌから選択される下限値；および２８００μｍｏｌ、２５００μｍｏｌ、２０００μｍｏｌ、１８００μｍｏｌ、１５００μｍｏｌ、１４００μｍｏｌ、１３００μｍｏｌ、１２００μｍｏｌ、１１００μｍｏｌ、および１０００μｍｏｌから選択される上限値；の組合せにより示されうる。 The medium containing low caprylic acid albumin for use in in vitro spermatogenesis in the present application preferably does not contain components capable of supplying caprylic acid other than low caprylic acid albumin. The amount of caprylic acid that can be contained in the medium is not particularly limited as long as it does not adversely affect the induction of spermatogenesis. For example, the amount of caprylic acid contained per 1000 g of the medium is 2800 μmol or less, preferably 2500 μmol or less, in free form. , more preferably 2000 μmol or less, still more preferably 1800 μmol or less, still more preferably 1500 μmol or less, even more preferably 1400 μmol or less, still more preferably 1300 μmol or less. Furthermore, examples of the amount of caprylic acid (as free form) contained in 1000 g of medium are 0.01 to 2800 μmol, preferably 0.1 to 2500 μmol, more preferably 0.5 to 2000 μmol, still more preferably 1 to 1800 μmol, Still more preferably 2 to 1500 μmol, still more preferably 3 to 1400 μmol, more preferably 5 to 1300 μmol. Alternatively, a preferred range for the amount of caprylic acid (as free form) contained in 1000 g of medium is a lower limit selected from 0.01 μmol, 0.1 μmol, 0.5 μmol, 1 μmol, 2 μmol, 3 μmol, 4 μmol, and 5 μmol; and an upper limit selected from 2800 μmol, 2500 μmol, 2000 μmol, 1800 μmol, 1500 μmol, 1400 μmol, 1300 μmol, 1200 μmol, 1100 μmol, and 1000 μmol;
本願の別の態様において、本願の剤または培地、およびこれらがインビトロ***形成誘導において使用されることの説明を含む、キットが提供される。該説明は、その形態はとくに限定されず、使用説明書であっても、当該説明の内容をインターネット上で閲覧するためのアクセス情報（URL、QRコード等）が記載されていてもよい。 In another aspect of the present application, kits are provided comprising agents or media of the present application and instructions for their use in in vitro spermatogenesis induction. The form of the explanation is not particularly limited, and it may be an instruction manual or may include access information (URL, QR code, etc.) for viewing the contents of the explanation on the Internet.
以下、実施例および試験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to these.
試験例1 実験動物の準備
RIKEN BRCから入手したAcr-Gfp transgenic mice (C57BL/6 strain)を交配させ、生後4.5～5.5日齢のArc-Gfp (+/+)もしくは(+/-)のマウスを培養試験に用いた。Acr-Gfpマウスの精細胞はmid-pachytene期からGFPを発現し、***細胞の先体に集積する。全ての動物実験は横浜市立大学動物実験委員会の承認のもと、動物実験指針に従い実施した。
Test Example 1 Preparation of Experimental Animals
Acr-Gfp transgenic mice (C57BL/6 strain) obtained from RIKEN BRC were mated, and Arc-Gfp (+/+) or (+/-) mice aged 4.5 to 5.5 days after birth were used for the culture test. Sperm cells of Acr-Gfp mice express GFP from the mid-pachytene stage and accumulate in the acrosome of sperm cells. All animal experiments were carried out in accordance with the animal experiment guidelines under the approval of the Yokohama City University Animal Care and Use Committee.
試験例2 アルブミンの浄化処理
2.1 活性炭及びイオン交換処理
ウシ血清アルブミン（BSA）はSigma社の製品番号A9418のうち、Lot. SLBF5061V、SLBF1402V、SLBJ3866Vを用いた。Dextran（D299100, TRC Canada）を200mLの蒸留水に溶解し、2gの活性炭（Wako）を加え室温で30分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。そこに10gのBSAを加え、HClでpH 3.0に調整した。得られた溶液は、撹拌しながら60℃で60分間インキュベートし、2700gで遠心し上清を回収した。得られた溶液に、1M NaOHを加えてpHを5.5に調整し、0.22μmのフィルター（Millipore Express（商標） PLUS）を通した。ろ液にイオン交換樹脂（Bio-Rex（商標） MSZ 501(D) Resin）を加え4℃で一晩インキュベート後、限外ろ過膜（VIVASPIN TURBO 15, Sartorius）で濃縮し、Bradford法で蛋白質濃度を測定した。得られた溶液をろ過滅菌し、使用まで4℃で保存した。
2.2 遊離脂肪酸測定
処理前後のウシ血清アルブミンを蛋白質濃度で4w/v％に超純水で調製し、Bligh-Dyer抽出し、得られた脂質分画をトリメチルシリル化後ガスクロマトグラフィー質量分析計（7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent）に供して遊離脂肪酸濃度を測定した。得られた結果を表1に示す。
表1. 活性炭及びイオン交換処理前後のBSAの脂肪酸濃度（4w/v%BSAあたりのμmol/L）
2.1 Activated Carbon and Ion Exchange Treatment As bovine serum albumin (BSA), Lot. Dextran (D299100, TRC Canada) was dissolved in 200 mL of distilled water, 2 g of activated charcoal (Wako) was added and incubated with gentle agitation for 30 minutes at room temperature. 10 g of BSA was added thereto and adjusted to pH 3.0 with HCl. The resulting solution was incubated at 60° C. for 60 minutes with stirring, centrifuged at 2700 g and the supernatant collected. The resulting solution was adjusted to pH 5.5 by adding 1M NaOH and passed through a 0.22 μm filter (Millipore Express ™ PLUS). An ion-exchange resin (Bio-Rex (trademark) MSZ 501(D) Resin) was added to the filtrate and incubated overnight at 4°C. was measured. The resulting solution was sterile filtered and stored at 4°C until use.
2.2 Measurement of free fatty acids Bovine serum albumin before and after treatment was prepared with ultrapure water to a protein concentration of 4 w/v%, subjected to Bligh-Dyer extraction, and the obtained lipid fraction was subjected to trimethylsilylation, followed by gas chromatography mass spectrometry (7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent) to measure the free fatty acid concentration. Table 1 shows the results obtained.
Table 1. Fatty acid concentrations in BSA before and after activated carbon and ion exchange treatment (μmol/L per 4w/v% BSA)
同一製品であってもロット毎に含有される脂肪酸の量はばらつきがあった。活性炭及びイオン交換処理により殆どの脂肪酸が除去できた。 Even in the same product, the amount of fatty acid contained in each lot varied. Most of the fatty acids could be removed by activated carbon and ion exchange treatment.
試験例3 精巣組織の培養法
遊離脂肪酸（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸）、コレステロール、スフィンゴミエリン、フォスファチジルコリンをエタノールに溶解し、終濃度が表２の通りになるようガラスビーカーに加えた後、エタノールを蒸発させた。カプリル酸（159-02382, Wako）を添加する場合、6.31mmol/Lのストック液を作製後、それぞれ終濃度が1000μmol/L、3000μmol/L、5000μmol/Lとなるようガラスビーカーに加えた。そこに蒸留水で8w/v％に調製した試験例２の処理前後のBSAおよびAlbuMAX(商標)（Gibco（商標））をそれぞれ加え、室温で4時間撹拌した。この溶液に2倍濃縮した等量のαMEMを加え、レチノイン酸、レチノール、テストステロン、トリヨードサイロニン、LH、FSH、NaHCO3、抗菌剤-抗真菌剤を終濃度が表２の通りになるよう添加しCDMを作製して精巣組織の培養に用いた。
Test Example 3 Cultivation method of testicular tissue Free fatty acids (palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid), cholesterol, sphingomyelin, and phosphatidylcholine were dissolved in ethanol, and the final concentrations were as shown in Table 2. After adding to a glass beaker, the ethanol was evaporated. When adding caprylic acid (159-02382, Wako), after preparing a 6.31 mmol/L stock solution, it was added to a glass beaker so that the final concentrations were 1000 μmol/L, 3000 μmol/L and 5000 μmol/L, respectively. BSA and AlbuMAX (trademark) (Gibco (trademark) ) before and after treatment in Test Example 2, which had been adjusted to 8 w/v% with distilled water, were added thereto, and stirred at room temperature for 4 hours. An equal volume of 2-fold concentrated αMEM was added to this solution, and retinoic acid, retinol, testosterone, triiodothyronine, LH, FSH, NaHCO 3 , and antibacterial-antimycotic agents were added to the final concentrations shown in Table 2. It was added to prepare CDM and used for culture of testis tissue.
表2. CDMの組成(4w/v％ BSA含有)
組織培養のためのアガロースゲルは、アガロースを蒸留水に加えて1.5w/v％とした後、オートクレーブし、固まる前に10cmディッシュに33mL注ぎ入れて5mm厚のゲルを作製した。得られたゲルは、約10mm2の大きさにカットした。培養開始の6時間以上前から12wellマイクロプレート内にゲルを入れ、0.5mLの培地を加えてゲルの下側半分が浸かる状態にして34℃、5％CO2条件下で平衡化した。それぞれのゲルには2～4個の精巣組織をのせ、週1回培地交換しながら培養を継続した。 Agarose gel for tissue culture was prepared by adding agarose to distilled water to 1.5 w/v %, autoclaving, and pouring 33 mL into a 10 cm dish before hardening to form a 5 mm thick gel. The resulting gel was cut to a size of approximately 10 mm 2 . At least 6 hours before the start of culture, the gel was placed in a 12-well microplate, 0.5 mL of medium was added, and the bottom half of the gel was submerged, and equilibrated at 34°C and 5% CO 2 . Two to four testis tissues were placed on each gel, and the culture was continued while changing the medium once a week.
試験例4 カプリル酸の毒性評価
培養開始から10日目に蛍光実体顕微鏡（Leica M205 FA, Leica）で精巣組織を観察した。精細管にそったGFPの発現を***形成誘導のサインとし、GFP発現率をスコア化した。ただし、組織の中心部は栄養素が行き届かず多くの場合GFP発現しないので評価対象外とした。得られた結果を図１および図２に示す。
Test Example 4 Toxicity Evaluation of Caprylic
図1および図2のとおり、高濃度のカプリル酸存在下では***形成誘導が阻害された。 As shown in Figures 1 and 2, spermatogenesis induction was inhibited in the presence of high concentrations of caprylic acid.
試験例5：
試験例2で使用した処理前のウシ血清アルブミン（Lot. SLBJ3866V）を用いて、カプリル酸無添加群（0μmol/L）、および1000μmol/L、2000μmol/L、4000μmol/Lとなるようカプリル酸を添加した群をそれぞれ試験例3と同様の方法で精巣組織を培養した。また同時に、AlbuMAX(商標)（Gibco（商標））を用いて試験例3と同様の方法で精巣組織を培養した。培養開始から8日目、16日目、22日目、25日目にGFP発現領域を計測した。
Test example 5:
Using the bovine serum albumin (Lot. SLBJ3866V) before treatment used in Test Example 2, the caprylic acid-free group (0 μmol/L), 1000 μmol/L, 2000 μmol/L, and 4000 μmol/L. The testicular tissues of the added groups were cultured in the same manner as in Test Example 3, respectively. At the same time, testis tissue was cultured in the same manner as in Test Example 3 using AlbuMAX (trademark) (Gibco (trademark) ). GFP-expressing regions were measured on the 8th, 16th, 22nd and 25th days from the start of the culture.
図３に示すとおり、カプリル酸濃度依存的に***形成誘導能は低下した。 As shown in FIG. 3, the ability to induce spermatogenesis decreased in a caprylic acid concentration-dependent manner.
試験例6. イオン交換処理によるカプリル酸除去 Test example 6. Removal of caprylic acid by ion exchange treatment
6.1 カプリル酸除去処理
あらかじめ超純水で洗浄したイオン交換樹脂(AG 501-X8 (D), BIO-RAD)と10％遺伝子組換えヒトアルブミン（rHA, Merck）もしくはヒト血清アルブミン（HSA, Irvine Scientific）を混合後、ローテーター（RT50, TAITEC）を用いて4℃遮光下で24時間穏やかに撹拌した。処理後のアルブミン溶液を回収し、ブラッドフォード法により蛋白質濃度を定量し、5w/v％（pH7.4）となるよう超純水と2mol/L NaOHで調製した。
6.1 Caprylic acid removal treatment Ion-exchange resin (AG 501-X8 (D), BIO-RAD) washed with ultrapure water in advance and 10% recombinant human albumin (rHA, Merck) or human serum albumin (HSA, Irvine Scientific ), and then gently stirred for 24 hours at 4°C in the dark using a rotator (RT50, TAITEC). The albumin solution after the treatment was recovered, and the protein concentration was quantified by the Bradford method, and prepared with ultrapure water and 2 mol/L NaOH so as to be 5 w/v% (pH 7.4).
6.2 遊離脂肪酸測定
処理前のrHA（比較例1）とHSA（比較例2）、処理後のrHA（実施例1）とHSA（実施例2）をそれぞれBligh-Dyer抽出し、得られた脂質分画をトリメチルシリル化後ガスクロマトグラフィー質量分析計（7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent）に供し遊離脂肪酸濃度を測定した。得られた結果を表３に示す。
6.2 Free fatty acid measurement Lipid content obtained by Bligh-Dyer extraction of rHA (Comparative Example 1) and HSA (Comparative Example 2) before treatment, and rHA (Example 1) and HSA (Example 2) after treatment, respectively. After trimethylsilylation, the fraction was subjected to gas chromatography-mass spectrometry (7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent) to measure free fatty acid concentration. Table 3 shows the results obtained.
表3. イオン交換処理前後の5w/v％アルブミン溶液中の遊離脂肪酸濃度（μmol/L）
表３に示すように、イオン交換処理をおこなうことで、アルブミン溶液に含まれている遊離脂肪酸のち、カプリル酸を特異的に除去することができた。 As shown in Table 3, the ion exchange treatment was able to specifically remove caprylic acid among the free fatty acids contained in the albumin solution.
本願の剤または培地を用いれば***形成誘導を向上することができる。 Spermatogenesis induction can be improved using the agent or medium of the present application.
Claims (11)
該培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量が遊離形態として２０００μｍｏｌ以下であり、
該カプリル酸低含有アルブミンは、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として５０μｍｏｌ以下含む、剤。 An agent containing low caprylic acid albumin for use in a medium used for in vitro spermatogenesis induction, comprising:
The amount of caprylic acid contained in 1000 g of the medium is 2000 μmol or less as a free form,
The low caprylic acid content albumin contains 50 μmol or less of caprylic acid in free form per 1 g of albumin.
該剤をインビトロ***形成誘導に使用される培地に使用することの説明；
を含む、インビトロ***形成誘導における培地用キットであって、
該培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量が遊離形態として２０００μｍｏｌ以下であり、
該カプリル酸低含有アルブミンは、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として５０μｍｏｌ以下含む、キット。 an agent containing caprylate-depleted albumin for use in a medium used for in vitro spermatogenesis induction; and a description of the use of the agent in a medium used for in vitro spermatogenesis induction;
A kit for media in in vitro spermatogenesis induction, comprising
The amount of caprylic acid contained in 1000 g of the medium is 2000 μmol or less as a free form,
The kit, wherein the low caprylic acid content albumin contains 50 μmol or less of caprylic acid in free form per 1 g of albumin.
該培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量が遊離形態として２０００μｍｏｌ以下であり、
該カプリル酸低含有アルブミンは、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として５０μｍｏｌ以下含む、培地。 1. A medium containing low caprylate albumin for use in in vitro spermatogenesis induction, comprising:
The amount of caprylic acid contained in 1000 g of the medium is 2000 μmol or less as a free form,
A medium in which the low caprylic acid content albumin contains 50 μmol or less caprylic acid in free form per 1 g of albumin.
該培地をインビトロ***形成誘導に使用することの説明；
を含む、インビトロ***形成誘導における培地用キットであって、
該培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量が遊離形態として２０００μｍｏｌ以下であり、
該カプリル酸低含有アルブミンは、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として５０μｍｏｌ以下含む、キット。 A medium containing low caprylic acid albumin for use in in vitro spermatogenesis induction; and a description of the use of said medium for in vitro spermatogenesis induction;
A kit for media in in vitro spermatogenesis induction, comprising
The amount of caprylic acid contained in 1000 g of the medium is 2000 μmol or less as a free form,
The kit, wherein the low caprylic acid content albumin contains 50 μmol or less of caprylic acid in free form per 1 g of albumin.
該培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量が遊離形態として２０００μｍｏｌ以下であり、
該カプリル酸低含有アルブミンは、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として５０μｍｏｌ以下含む、方法。 A method for inducing spermatogenesis in vitro, characterized by using a medium containing albumin with a low caprylic acid content,
The amount of caprylic acid contained in 1000 g of the medium is 2000 μmol or less as a free form,
The method, wherein the low caprylic acid content albumin contains 50 μmol or less caprylic acid in free form per gram of albumin.
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| Biotechnology (2017) 8:18，pp.1-8，DOI 10.1186/s40104-017-0148-6 |
| Theriogenology 80(2013)712-721 |
| 家畜繁殖誌２４巻２号，1978年06月，６３－６８頁 |
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