JP7235507B2 - 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 - Google Patents
多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7235507B2 JP7235507B2 JP2018546540A JP2018546540A JP7235507B2 JP 7235507 B2 JP7235507 B2 JP 7235507B2 JP 2018546540 A JP2018546540 A JP 2018546540A JP 2018546540 A JP2018546540 A JP 2018546540A JP 7235507 B2 JP7235507 B2 JP 7235507B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- microglial
- medium
- cell culture
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5058—Neurological cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2334—Interleukin-34 (IL-34)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
Description
本願は、2016年3月3日に出願された米国仮特許出願第62/303,301号および2016年10月20日に出願された米国仮特許出願第62/410,645号の優先権の恩典を主張し、前記仮特許出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号AG046170の下に、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
参照による組み入れを許す管轄区域に限り、この開示において引用される参考文献はすべて、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる(この特許開示において本文に続く括弧内の数字または上付きの数字は、この特許明細書の「参考文献一覧」の項に掲載する番号付きの参考文献を指す)。加えて、本明細書において引用されまたは言及される製品すべてについて、製造元の使用説明書またはカタログが、いずれも参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられる文書またはそこに含まれる任意の教示内容は、本発明の実施において使用することができる。
ミクログリアは脳の常在性組織特異的マクロファージである。ミクログリアは中枢神経系(CNS)の発生および維持において決定的な役割をいくつか果たす。ミクログリアは、卵黄嚢において原始CD45+CX3CR1-骨髄系前駆体から生じ、それが、二次造血の出現前に、CD45+CX3CR1+ミクログリア前駆体に分化して、発生中の脳に入りこむ。無傷の血液脳関門を持つ健常な成人の脳において、ミクログリアは、循環骨髄由来細胞によって補充されることのない長寿命の自立的集団として存続する。高度に枝分かれしたミクログリア細胞は「静止型」と定義されるが、それらの突起は、恒常性の破綻がないかどうか脳を調べるために絶えず移動しているので、実際には極めて活動的である。
[本発明1001]
(a)CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞の生成につながる骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、ならびに
(b)CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を、(i)IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または(ii)M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、培養する工程
を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、ミクログリア細胞を生成するための方法。
[本発明1002]
工程(b)においてCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を培養する前に、工程(a)において産生されたCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を単離する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
工程(a)が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
骨髄系前駆細胞のCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
工程(a)が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1011]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1013]
工程(a)が、
a)細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25~50日間培養される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、本発明1006の方法。
[本発明1020]
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、本発明1007または本発明1008の方法。
[本発明1021]
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、本発明1009または本発明1010の方法。
[本発明1022]
細胞培養物を、およそ11~36日間、第4の組成物と接触させることを含む、本発明1011または本発明1012の方法。
[本発明1023]
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、本発明1006の方法。
[本発明1024]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、本発明1006の方法。
[本発明1025]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、本発明1006の方法。
[本発明1026]
前記造血細胞培地がStemPro-34である、本発明1007~1012のいずれかの方法。
[本発明1027]
CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14+抗体および/またはCX3CR1+抗体と接触させることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1028]
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
蛍光活性化細胞選別(FACS)を行うことを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1032]
工程(a)中に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1033]
工程(a)の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1034]
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1013の方法。
[本発明1035]
多能性幹細胞が誘導多能性幹(iPS)細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1036]
多能性幹細胞が胚性幹(ES)細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1037]
(a)骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、
(b)工程(a)において生成したCD14+および/またはCX3CR1+細胞を単離する工程
を含み、該CD14+および/またはCX3CR1+細胞がミクログリア前駆細胞である、ミクログリア前駆細胞を生成するための方法。
[本発明1038]
工程(a)が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
骨髄系前駆細胞のCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
工程(a)が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、本発明1037の方法。
[本発明1042]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せを含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1045]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSFおよびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
工程(a)が、
a)細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、本発明1037の方法。
[本発明1049]
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25~50日間培養される、本発明1037の方法。
[本発明1050]
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、本発明1041または本発明1047の方法。
[本発明1051]
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、本発明1043、本発明1043、または本発明1048の方法。
[本発明1052]
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、本発明1044、本発明1045、または本発明1048の方法。
[本発明1053]
細胞培養物を、およそ11~36日間、第4の組成物と接触させることを含む、本発明1046、本発明1047、または本発明1048の方法。
[本発明1054]
多能性幹細胞の分化に適した培地が多能性因子を含まない、本発明1041の方法。
[本発明1055]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まない、本発明1041の方法。
[本発明1056]
多能性幹細胞の分化に適した培地が、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、本発明1041の方法。
[本発明1057]
CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14+抗体および/またはCX3CR1+抗体と接触させることを含む、本発明1037の方法。
[本発明1058]
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
蛍光活性化細胞選別(FACS)を行うことを含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、本発明1058の方法。
[本発明1061]
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1037の方法。
[本発明1062]
工程(a)の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1037の方法。
[本発明1063]
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、本発明1044~1048のいずれかの方法。
[本発明1064]
多能性幹細胞が誘導多能性幹(iPS)細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1065]
多能性幹細胞が胚性幹(ES)細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1066]
(i)IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または(ii)M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を培養する工程を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、CD14+および/またはCX3CR1+ヒトミクログリア前駆細胞からミクログリア細胞を生成するための方法。
[本発明1067]
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1070]
CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、本発明1066の方法。
[本発明1071]
処置を必要とする対象に、本発明1001~1036または1066~1070のいずれかの方法を使って生成したミクログリア細胞または本発明1037~1065のいずれかの方法を使って生成したミクログリア前駆細胞を投与する工程を含み、それによって対象を処置する、処置の方法。
[本発明1072]
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、本発明1071の方法。
[本発明1073]
対象が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症(FTLD)、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、本発明1071の方法。
[本発明1074]
ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞が、前記対象から得られる体細胞に由来する誘導多能性幹(iPS)細胞から生成される、本発明1071の方法。
[本発明1075]
a)対象から得られた体細胞から誘導多能性幹(iPS)細胞を生成する工程、
b)本発明1001~1036または1066~1070のいずれかの方法を使ってiPS細胞からミクログリア細胞を生成する工程、または本発明1037~1065のいずれかの方法を使ってiPS細胞からミクログリア前駆細胞を生成する工程、および
c)前記対象に前記ミクログリア細胞または前記ミクログリア前駆細胞を投与する工程、
d)それによって対象を処置する工程
を含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
[本発明1076]
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、本発明1075の方法。
[本発明1077]
対象が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症(FTLD)、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、本発明1076の方法。
[本発明1078]
ミクログリア細胞またはミクログリア先駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害の処置または予防に有用な化合物を同定する方法であって、本発明1001~1036または1066~1070のいずれかの方法によって生成したミクログリア細胞、または本発明1037~1065のいずれかの方法によって生成したミクログリア前駆細胞を、候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物がミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の前記欠陥または欠乏を改善するかどうかを決定する工程を含む、方法。
[本発明1079]
ハイスループット法である、本発明1077の方法。
[本発明1080]
本発明1001~1036または1066~1070のいずれかの方法によって生成したミクログリア細胞を候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物が、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の調節物質を同定する方法。
[本発明1081]
ハイスループット法である、本発明1079の方法。
本発明の主要な局面の一部は、この特許開示の上記発明の概要の項にまとめた。さらなる局面を、この開示の実施例、図面および特許請求の範囲の項に記載する。発明の詳細な説明というこの項では一定の追加説明を加えるが、これは、この特許開示の他のすべての項の開示と一緒にそれらと合わせて読解されるものとする。さらにまた、この開示の各項に記載されるさまざまな態様は、多種多様に組み合わせることができ、そのような組合せはすべて、本発明の範囲内に包含されるものとする。この特許開示において使用される見出しおよび小見出しはいずれも、便宜上、参照/読解が容易になるように提供するに過ぎず、明細書全体を参照することによって理解されるべき本明細書に記載する発明のさまざまな局面または態様の限定を意味するものではない。
一定の用語を、すぐ下に定義するが、これらの用語のそれぞれは、それらが使用される文脈によって、また明細書全体を参照することによって、より完全に定義されうる。すぐ下に特には定義されない用語は、この特許開示のどこか他の項で定義されるか、またはそれらの意味はそれらの用語が使用される文脈から明白であるか、さもなければ、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されているとおり、それぞれの通常の意味に従って使用されている。当業者は、例えば「The Dictionary of Cell and Molecular Biology」(5th ed. J.M.Lackie ed., 2013)、「Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology」(2d ed. R.Cammack et al. eds., 2008)、および「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」P-S.Juo,(2d ed. 2002)に、本明細書において使用されるいくつかの用語の一般的定義を見いだすことができる。
ミクログリア細胞およびミクログリア前駆細胞を生成するためのさまざまな方法を、この特許開示の発明の概要、実施例および特許請求の範囲の項に記載する。そのような方法において使用される多能性幹細胞は、任意の適切なタイプの多能性幹細胞であることができる。一態様において、多能性幹細胞はESCまたはiPSCであり、それらはそれぞれ当技術分野において周知である。iPSCが使用される場合、そのような細胞は、当技術分野において公知の任意の適切な手段を使って、例えば限定するわけではないが、修飾RNAに基づく方法、センダイウイルスに基づく方法などを使って、非多能性状態から多能性状態へと「リプログラム」されていてもよい。さらにまた、そのような細胞は、当技術分野において公知のリプログラミング因子の任意の適切な混合物を使って多能性状態にリプログラムされていてもよい。
ミクログリア細胞は胚発生中に卵黄嚢において骨髄系前駆体から生じるので、本発明者らは、ヒトPSCを骨髄細胞系譜に分化させるための無血清および無フィーダープロトコールを確立しようと考えた。本発明者らが作成したこのプロトコールを、図1A)に模式的に示す。過去の研究(Yanagimachi et al., 2013)に基づいて、本発明者らは、BMP4シグナリングによって原条様細胞を誘導して、原始血管芽細胞のKDR+CD235a+集団を得た(Sturgeon et al., 2014)(図S1A)。CD45+CX3CR1-ミクログリア前駆体が16日目までに培養の上清画分に現れ、20日目と25日目の間にCX3CR1がアップレギュレートされた。対照的に、付着集団はCD45+CX3CR1+前駆体をわずかな割合しか含有しなかった。興味深いことに、CD45+CX3CR1-集団のサブセットは、CX3CR1のアップレギュレーション前に、16日目付近でCD14をアップレギュレートした(図1B)。25日目と50日目の間に、82±5%のCD14+細胞がCX3CR1を共発現した。このプロトコールのミクログリア前駆体生成効率は、CD14発現に基づいて、2種のESC株および15種のiPSC株を含む試験した17株全体で、68±4%であった(図5D)。ミクログリア前駆体は最大1ヶ月にわたって上清画分中に生成し続け、それらは週に1回、プレーティングした100×103個のPSCごとに、1回の単離につき、224±42×103細胞の平均収量で単離された。ミクログリア前駆体は、さらなる分化のために、または液体窒素中での長期保存のために、FACS分取(図5B、C)または磁気ビーズによる分離のいずれかによって単離された。融解させた前駆体はそれらの分化能を保っており、融解後生存率は57±5%であった。
ミクログリアを生成させるために本発明者らが開発したプロトコールを図1A)に模式的に示す。実施例1で述べたようにiPSCからミクログリア前駆体を生産した。2週間にわたるIL-34およびGM-CSF刺激によって、単離ミクログリア前駆体からミクログリアへの分化を誘導した。iPSC由来ミクログリア細胞(iPSC-MG)は付着細胞として成長し、多くの突起を伸ばし、ミクログリア細胞に特有の形態を呈した(図2A)。さらにまた、iPSC-MGのタイムラプスビデオ顕微鏡観察により、それらの突起は、運動性が高く、インビボでのミクログリア細胞と同様に微小環境を常に走査していることが示された(Davalos et al., 2005; Nimmerjahn, 2012)。iPSC-MGは、IBA-1、CD11c、TMEM119、P2RY12、CD11bおよびCX3CR1を含む公知の抗原マーカーを発現した(図2A~C)。注目すべきことに、Thermanoxプラスチックカバースリップは、細胞の分枝が増えるように見え、最適な表面環境を与えるようであった。比較には市販のヒト初代ミクログリア細胞(hMG)を使用した(図6)。
iPSC-MGのアイデンティティをさらに確認するために、次世代ディープRNAシークエンシング(RNAseq)によって、全トランスクリプトーム解析を行った。血縁でない6人の健常ドナーからのiPSC-MGを、末梢血由来マクロファージ(PB-M(-))、M(LPS,IFNγ)、M(IL4,IL13)およびM(IL10)に極性化したマクロファージ、初代ヒト肝マクロファージ(hhM)、ならびに業者によって供給された血清含有培地で培養された初代ヒトミクログリア(hMG)または本発明者らの無血清培地で培養された初代ヒトミクログリア(hMG-SF)と比較した。本発明者らは、高品質なシークエンシングリードを得て(平均Phred品質スコア>38.4)、そのうちの86.2%超がSTARアライナーによってヒトゲノムhg19にマッピングされた。全部で18,516の遺伝子が発現しているとみなされ、それらをさらなる解析に使用した。
インビトロでのPSCの造血分化は、インビボでの二次造血ではなく原始造血に等価である。これは、PSC由来の造血前駆体が長期多系譜再構築を生じることができないことの説明になりうる(Vanhee et al., 2015)。本発明者らは、PSC由来骨髄系前駆体は原始卵黄嚢骨髄系前駆体に似ているがゆえに、胚発生中に起きるように、インビトロでミクログリアを生じるのかもしれないという仮説を立てた。本発明者らは、骨髄系誘導培地でPSCを刺激することにより、KDR+CD235a+原始血管芽細胞集団を生産し、インビトロでCD45+CX3CR1-ミクログリア前駆体からCD45+CX3CR1+ミクログリア前駆体への進行を再現した。
この実施例では、実施例1で概説した研究を行うために使用した材料および方法に関する詳細を記す。
この研究では2種のヒトESC株(RUES1およびH9、どちらもNIHの承認を受けている)および15種のiPSC株を使用した。これらの株については補足情報に記載する。iPSC株の一つはRicardo Feldman博士から譲渡されたものであり、他のiPSC株はすべてNYSCF Research Instituteにおいてリプログラムされた。ヒト初代ミクログリアおよび肝マクロファージはScienCell Research Laboratoriesから購入した。
80ng/ml BMP4を含有するmTeSR Custom培地(StemCell Technologies)を使って、PSCの分化を誘導した。4日目に、StemPro-34 SFM(2mM GutaMAX含有、Life Technologies)中の25ng/ml bFGF、100ng/ml SCFおよび80ng/ml VEGFで、細胞を誘導した。2日後に、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、5ng/ml TPO、50ng/ml M-CSFおよび50ng/ml Flt3を培地に添加し、14日目からは、50ng/ml M-CSF、50ng/ml Flt3および25ng/ml GM-CSFを添加した。25日目と50日目の間に、CD14+前駆体またはCD14+CX3CR1+前駆体を単離し、ミクログリア培地(RPMI-1640、Life Technologies、2mM GlutaMAX-I、10ng/ml GM-CSFおよび100ng/ml IL-34を含む)中、組織培養処理が施されたディッシュまたはThermanoxプラスチックカバースリップ(いずれもThermo Scientific製)上に、再プレーティングした。少なくとも2週間は3日~4日ごとに培地を補充した。
別段の言明がある場合を除き、培養はすべて、37℃の培養器中、5%CO2で行った。また、別段の言明がある場合を除き、成長因子はいずれもR&D Systemsから購入したヒト組換えタンパク質である。培地はすべて1×ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)または1×抗生物質-抗真菌剤(Antibiotic-Antimycotic)(Life Technologies)を含有する。RT:室温。
培養の上清画分からの細胞を、CX3CR1および/またはCD14コンジュゲート一次抗体(表3参照)またはそれらそれぞれのアイソタイプ対照と共に、氷上で40分インキュベートした。次に、細胞をFACS緩衝液(PBS、0.5%BSA、2mM EDTA、20mMグルコース)で洗浄し、300gで6分間、ペレット化し、死細胞を除外するためにDAPIを含有するFACS緩衝液に再懸濁した。CD14+細胞またはCD14+CX3CR1+細胞を、100μmセラミックノズルおよび20psiを用いて、ARIA IIu(商標)セルソーター(BD Biosciences)でのFACSにより単離した。
骨髄系前駆細胞を、単離後に、90%FBS(Life Technologies)と10%DMSO(Sigma-Aldrich)とからなる凍結培地中、低温貯蔵バイアル(Thermo Scientific)において凍結した。次に、細胞をMr.Frosty(Thermo Scientific)容器に移し、-80℃に一晩置いた。翌日、長期保存のために低温貯蔵バイアルを液体窒素に移した。
PSCを、24時間、10μM Rock阻害剤を含有するmTeSR1培地中、15×103細胞/cm2の密度で、Matrigel(BD Biosciences)上にプレーティングした。個々のコロニーが目に見えるようになったら(通常はプレーティングの2~4日後)、80ng/ml BMP4を含有するmTeSR Custom培地(StemCell Technologies)を与えて分化を誘導した。mTeSR Custom培地は、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFおよびTGFβ1を含まないmTeSR1培地である(StemCell Technologies)。4日間、培地を毎日替えてから、25ng/ml bFGF、100ng/ml SCFおよび80ng/ml VEGFを添加したStemPro-34 SFM(2mM GutaMAX-I含有、Life Technologies)を使って細胞を誘導した。2日後に、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、5ng/ml TPO、50ng/ml M-CSFおよび50ng/ml Flt3を含有するStemPro-34に、培地を切り替えた。10日目に、培養の上清画分をペレット化し、新鮮な培地(前と同じ)に再懸濁し、それぞれのディッシュに戻した。14日目に、浮遊細胞をペレット化し、50ng/ml M-CSF、50ng/ml Flt3および25ng/ml GM-CSFを含有するStemPro-34に再懸濁し、再プレーティングによってそれぞれのディッシュに戻した。この手順を4日ごとに繰り返した。24日目から52日目までは、CD14/CX3CR1二重陽性前駆体のピークを決定するために、少量の浮遊細胞をフローサイトメトリー分析用に加工した。CD14+前駆体またはCD14+CX3CR1+前駆体の単離後に、組織培養処理を施したディッシュまたはThermanoxプラスチックカバースリップ(いずれもThermo Scientific製)上に、SF-ミクログリア培地(2mM GlutaMAX-I、10ng/ml GM-CSFおよび100ng/ml IL-34を添加したLife Technologies製のRPMI-1640)中、40~50×103細胞/cm2でプレーティングした。少なくとも2週間は3日~4日ごとに培地を補充した。
New York Blood Centerにおいて、以前に記載されたように(Pallotta et al., 2015)、健常個体の末梢血から得られた単離ヒト単核球からマクロファージを分化させた。簡単に述べると、Ficoll勾配およびEasySep Human CD14 Positive Selection Kit(STEMCELL Technologies)を使った磁気ビーズに基づく分離を経て、CD14+細胞を単離した。次に、細胞を5×105細胞/mlの密度で超低接着プレートに5日間播種し、2mM GlutaMAX-I、10%熱非働化ヒト血清(Sigma-Aldrich)および20ng/ml M-CSF(PeproTech)を添加したRPMI-1640を使って、マクロファージに分化させた。極性化のために、マクロファージを同じ培地に維持するか(M(-))、または100ng/ml LPS(Sigma-Aldrich)および100ng/ml IFNγ(M(LPS,IFNγ))、40ng/ml IL-4および20ng/ml IL-13(M(IL4,IL13))もしくは40ng/ml IL-10(M(IL10);いずれもPeproTech製)マクロファージで処理した。
細胞を、PBS-T(0.1%Triton-X100を含有するPBS)で10分ずつ3回洗浄し、ブロッキング血清(5%ロバ血清を含むPBS-T)中で2時間インキュベートし、一次抗体(表3参照)を4℃で一晩適用した。翌日、細胞をPBS-T中で15分ずつ3回洗浄し、二次抗体と共に室温(RT)で2時間インキュベートし、PBS-T中で10分ずつ3回洗浄し、DAPIを使って室温で15分間対比染色し、PBS中で2回洗浄した。二次抗体は1:500希釈で使用した。オリンパス(Olympus)DP30BW白黒デジタルカメラを装備したオリンパスIX71倒立顕微鏡を使って画像を取得した。蛍光色は、オリンパスソフトウェアDP ManagerまたはimageJを使って、デジタルに適用した。
細胞を37℃で5分間のAccutase処理によって酵素的に回収した後、セルリフター(Sigma-Aldrich)を使って掻き取った。次に、適当量の蛍光コンジュゲート抗体(表3参照)を含有するそれぞれの培地100μlに再懸濁し、遮光して氷上で40分間インキュベートした。アイソタイプ対照または二次抗体のみを使って、ベースライン背景シグナルを測定した。死細胞の除外にはDAPIまたはSytox Green(Thermofisher)を使用した。分析は、5レーザーBD Biosciences ARIA-IIu(商標)セルソーターまたは4レーザーAttune NxTフローサイトメーター(ThermoFisher)で行った。データはBD FACSDiva(商標)ソフトウェアまたはFlowJoバージョン9.9.4(Flow Jo LLC)を使って解析した。
貪食アッセイは、以前に記載されたように行った(Enomoto et al., 2013)。簡単に述べると、付着ミクログリア細胞が入っているディッシュに、Fluoresbrite YGカルボキシレートマイクロスフェア1.00μm(Polysciences)を200マイクロスフェア/細胞の比で加えた。その培養物を37℃で3時間インキュベートした後、オリンパスDP30BW白黒デジタルカメラを装備したオリンパスIX71倒立顕微鏡で、蛍光像を取得した。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、Accutaseで5分間処理し、セルリフターで完全に剥離させた。遠心分離後に、DAPIを含有するFACS緩衝液に細胞を再懸濁し、BD Biosciences ARIA-IIu(商標)セルソーターで分析した。
ミクログリア細胞の分泌サイトカインプロファイルを分析するために、プロテオームプロファイラー抗体アレイのヒトXLサイトカインアレイキット(R&D Systems)を、製造元の使用説明書に従って使用した。培養から上清を収集し、最長3ヶ月間、-80℃で保存した。メンブレンをKodak Image Station 4000MM PROで直接可視化し、Carestream分子イメージングソフトウェアを使って画像を取得した。
細胞をThermanoxプラスチックカバースリップ(ThermoFisher)上で培養し、Pluronic-127試薬と1:1で混合した蛍光性Ca2+色素Fluo-4/AM(2□M)(どちらもInvitrogen製)を添加した培地と共に、37℃で30分間インキュベートした。次に、pHを7.5に調整した1%BSA(Life Technologies)、1×GlutaMAX-Iおよび10mM HEPES(Sigma-Aldrich)を含有するRPMI-1640培地で、細胞を2回洗浄した。色素のエステル化を保証するために、細胞をさらに30分間回復させた。次に、カバースリップを、正立型オリンパスBX61顕微鏡にマウントした記録チャンバに移した。蛍光を冷却CCDカメラ(Hamamatsu Orca R2)によって2Hzで記録した。薬物適用は室温で60秒間の全チャンバ灌流によって行った。[Ca2+]iトランジェントはΔF(t)/F0の形式で表され、ここで、F0は所与の関心領域のベースライン蛍光であり、ΔFは蛍光F(t)とF0の電流レベルの間の相違である。0.05未満であるΔF(t)/F0のゆらぎは、非応答とみなした。
RNA単離は、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)をQIAshredder(Qiagen)と共に使用して行った。Accutaseによる5分間の処理後にセルリフターを使って、細胞を酵素的に剥離させた。遠心分離後に細胞をPBSで洗浄し、溶解緩衝液に再懸濁した。次に、製造元の使用説明書に従ってさらに加工するまで、試料を-80℃で保存した。RNAを30μlのRNaseフリーddH2Oに溶出させ、NanoDrop 8000分光測光器(Thermo Scientific)で定量した。
頻度はエクセルで算出し、平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。対応のないスチューデントのt検定を使って[Ca2+]iトランジェント振幅の統計的解析を行い、エクセルで平均値を比較した。6種のシグネチャー遺伝子に基づくデンドログラムに関するクラスターパーティションのP値有意性は、2つの中心を持つk平均クラスターから得られるクラスター中心距離が元のデータのそれよりも遠い1000重複順列(各遺伝子内で遺伝子発現値をシャフリング)の分率として推定した。サイトカイン放出データに関するiPSC-MGとhMGまたはhMG-SFとの間のピアソン相関係は、GraphPad Prism 6を使って計算した。
多能性幹細胞からミクログリアを生成させるための代替的プロトコール
この実施例は、多能性幹細胞からミクログリアを生成させるための代替的な例示的プロトコールを提供する。これらのプロトコールでは、CD14+/CX3CR1+ミクログリア前駆体がFACSによって単離されるか、CD14発現だけに基づいて磁気ビーズによる単離を使って単離され、単離されたCD14+前駆体は次に、組織培養処理が施されたプラスチックに、代替(「A」)ミクログリア分化培地(M-CSF、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2を含む)または通常(「R」)ミクログリア分化培地(GM-CSFおよびIL-34を含む、実施例1および2において使用されたもの)に入れて、プレーティングされる。別段の言明がある場合を除き、この実施例での材料および方法は、実施例1および2について上述したものと同じである。
0日目:Matrigel上で成長させた未分化iPSCコロニー(だいたい直径1mm)を、80ng/ml BMP4を添加したmTSeR Customに切り替えることによって誘導する。培地を毎日替える。
4日目:2mM Glutamax、25ng/ml bFGF、100ng/ml SCFおよび80ng/ml VEGFを含むStemPro-34に、培地を切り替える。
6日目:2mM Glutamax、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、5ng/ml TPO、50ng/ml M-CSF、50ng/ml Flt-3を含むStemPro-34に、培地を切り替える。
10日目:上清から細胞を収集、遠心沈殿させ、2mM Glutamax、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-3、5ng/ml TPO、50ng/ml M-CSF、50ng/ml Flt-3を含むStemPro-34に再懸濁する。細胞をそれぞれのウェルに戻す。
14日目:上清から細胞を収集、遠心沈殿させ、2mM Glutamax、50ng/ml M-CSF、50ng/ml Flt-3、25ng/ml GM-CSFを含むStemPro-34に再懸濁する。細胞をそれぞれのウェルに戻す。4日ごとに繰り返す。
24日目~52日目:CD14+細胞に関して、FACS分取するか、磁気ビーズ単離を使用する。ProFreezeまたは50%FBS/10%DMSOを使って、60%の生存率でCD14+細胞を凍結する。このCD14+前駆体を使用して、以下の分化工程でミクログリア細胞を生産する。
Claims (27)
- (a)骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程であって、細胞培養物を、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFおよびTGFβ1を含有しない改変mTeSR1培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物がヒト多能性幹細胞を含み、培地変更を行うときに、上清を取っておき、上清中に存在する細胞を回収して、細胞培養物に戻すことを含む、工程、ならびに
(b)工程(a)において生成したCD14+および/またはCX3CR1+細胞を単離する工程
を含む、該CD14+および/またはCX3CR1+細胞がミクログリア前駆細胞である、ミクログリア前駆細胞を生成するための方法。 - (a)CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞の生成につながる骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程であって、細胞培養物を、塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFおよびTGFβ1を含有しない改変mTeSR1培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物がヒト多能性幹細胞を含み、培地変更を行うときに、上清を取っておき、上清中に存在する細胞を回収して、細胞培養物に戻すことを含む、工程、ならびに
(b)CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を、(i)IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または(ii)M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、培養する工程
を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、ミクログリア細胞を生成するための方法。 - 工程(b)においてCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を培養する前に、工程(a)において産生されたCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を単離する工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 工程(a)が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 骨髄系前駆細胞のCD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii)bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せ、を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii) SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せ、を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii) MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せ、を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)が、
a)細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d)細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地において15日間にわたって培養される、請求項2に記載の方法。
- ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下で25~50日間培養される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 細胞培養物を、4日間、第1の組成物と接触させることを含む、請求項1、請求項2または請求項10に記載の方法。
- 細胞培養物を、2日間、第2の組成物と接触させることを含む、請求項7または請求項10に記載の方法。
- 細胞培養物を、8日間、第3の組成物と接触させることを含む、請求項8または請求項10に記載の方法。
- 細胞培養物を、11~36日間、第4の組成物と接触させることを含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
- 前記無血清造血細胞培地がStemPro-34である、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。
- CD14+および/またはCX3CR1+ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14+抗体および/またはCX3CR1+抗体と接触させることを含む、請求項1または請求項3に記載の方法。
- 抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項21に記載の方法。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)を行うことを含む、請求項22に記載の方法。
- 細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項22に記載の方法。
- 工程(a)の開始後10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項8~10のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞が、(i)誘導多能性幹(iPS)細胞である、または(ii)胚性幹(ES)細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022072376A JP2022106847A (ja) | 2016-03-03 | 2022-04-26 | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662303301P | 2016-03-03 | 2016-03-03 | |
US62/303,301 | 2016-03-03 | ||
US201662410645P | 2016-10-20 | 2016-10-20 | |
US62/410,645 | 2016-10-20 | ||
PCT/US2017/020709 WO2017152081A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-03-03 | Microglia derived from pluripotent stem cells and methods of making and using the same |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022072376A Division JP2022106847A (ja) | 2016-03-03 | 2022-04-26 | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019512221A JP2019512221A (ja) | 2019-05-16 |
JP2019512221A5 JP2019512221A5 (ja) | 2020-04-09 |
JP7235507B2 true JP7235507B2 (ja) | 2023-03-08 |
Family
ID=59723991
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018546540A Active JP7235507B2 (ja) | 2016-03-03 | 2017-03-03 | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
JP2022072376A Pending JP2022106847A (ja) | 2016-03-03 | 2022-04-26 | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022072376A Pending JP2022106847A (ja) | 2016-03-03 | 2022-04-26 | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11149250B2 (ja) |
EP (1) | EP3423564A4 (ja) |
JP (2) | JP7235507B2 (ja) |
AU (1) | AU2017228466B2 (ja) |
CA (1) | CA3016575A1 (ja) |
WO (1) | WO2017152081A1 (ja) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11473061B2 (en) | 2016-02-01 | 2022-10-18 | Cedars-Sinai Medical Center | Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices |
US11913022B2 (en) | 2017-01-25 | 2024-02-27 | Cedars-Sinai Medical Center | In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells |
JP2020513794A (ja) * | 2017-02-28 | 2020-05-21 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 |
US11767513B2 (en) | 2017-03-14 | 2023-09-26 | Cedars-Sinai Medical Center | Neuromuscular junction |
US11414648B2 (en) | 2017-03-24 | 2022-08-16 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium |
JP7457505B2 (ja) * | 2017-05-10 | 2024-03-28 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | 神経精神障害を処置する方法 |
EP3775161A4 (en) * | 2018-04-06 | 2022-04-06 | Cedars-Sinai Medical Center | NEURODEGENERATIVE DISEASE MODELS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENTIC STEM CELLS ON A MICROFLUIDIC CHIP |
US11981918B2 (en) | 2018-04-06 | 2024-05-14 | Cedars-Sinai Medical Center | Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells |
WO2020069515A1 (en) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Stem cell-derived human microglial cells, methods of making and methods of use |
WO2020186237A1 (en) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | The Broad Institute, Inc. | Microglial progenitors for regeneration of functional microglia in the central nervous system and therapeutics uses thereof |
EP3976766A1 (en) * | 2019-05-27 | 2022-04-06 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Rapid and deterministic generation of microglia from human pluripotent stem cells |
GB2584664B (en) * | 2019-06-10 | 2023-05-24 | Newcells Biotech Ltd | Improved retinal organoids and methods of making the same |
WO2021041316A1 (en) | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Sana Biotechnology, Inc. | Cd24 expressing cells and uses thereof |
WO2021107117A1 (ja) * | 2019-11-28 | 2021-06-03 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からの造血細胞の製造法 |
KR20210077634A (ko) * | 2019-12-17 | 2021-06-25 | 코아스템(주) | 인간 만능 줄기세포로부터 3d 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법 |
TW202202155A (zh) | 2020-03-25 | 2022-01-16 | 美商薩那生物科技公司 | 用於治療神經病症及病況之低免疫原性神經細胞 |
EP4196568A1 (en) | 2020-08-13 | 2023-06-21 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions |
CN114426951B (zh) * | 2020-10-29 | 2024-05-14 | 北京赛尔湃腾科技咨询合伙企业(有限合伙) | 利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法 |
EP4347797A1 (en) | 2021-05-27 | 2024-04-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g |
KR20240028351A (ko) | 2021-07-02 | 2024-03-05 | 미쓰비시 마테리알 가부시키가이샤 | 에지 와이즈 굽힘 가공용 동조, 및, 전자·전기 기기용 부품, 버스 바 |
EP4370544A2 (en) | 2021-07-14 | 2024-05-22 | Sana Biotechnology, Inc. | Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells |
CA3227613A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | William Dowdle | Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells |
AU2022325231A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions |
AU2022326565A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy |
WO2023019225A2 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions |
WO2023064570A1 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | National Stem Cell Foundation | Methods and systems for culturing organoids |
WO2023150089A1 (en) * | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Bluerock Therapeutics Lp | Methods for treating inherited metabolic disorders |
WO2023183313A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods |
WO2023205303A1 (en) * | 2022-04-20 | 2023-10-26 | The Regents Of The University Of California | Microglial cells as therapeutic targets in neurodevelopmental disorders |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120107898A1 (en) | 2009-04-28 | 2012-05-03 | Harald Neumann | Method for obtaining human microglial precursor cells from pluripotent stem cells |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0891419A4 (en) | 1996-03-12 | 2000-03-01 | Life Technologies Inc | NUTRIENT ADDITIVE FOR HEMATOPOETIC CELL CULTURES |
CA2857295C (en) | 2011-12-01 | 2021-06-29 | New York Stem Cell Foundation | Automated system for producing induced pluripotent stem cells or differentiated cells |
WO2013116307A1 (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-08 | Mount Sinai School Of Medicine | Method for programming differentiated cells into hematopoietic stem cells |
US10081792B2 (en) | 2014-12-31 | 2018-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Derivation of human microglia from pluripotent stem cells |
-
2017
- 2017-03-03 AU AU2017228466A patent/AU2017228466B2/en active Active
- 2017-03-03 US US15/449,519 patent/US11149250B2/en active Active
- 2017-03-03 EP EP17760917.9A patent/EP3423564A4/en active Pending
- 2017-03-03 JP JP2018546540A patent/JP7235507B2/ja active Active
- 2017-03-03 CA CA3016575A patent/CA3016575A1/en active Pending
- 2017-03-03 WO PCT/US2017/020709 patent/WO2017152081A1/en active Application Filing
-
2021
- 2021-09-13 US US17/473,257 patent/US20210403863A1/en active Pending
-
2022
- 2022-04-26 JP JP2022072376A patent/JP2022106847A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120107898A1 (en) | 2009-04-28 | 2012-05-03 | Harald Neumann | Method for obtaining human microglial precursor cells from pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Journal of Neuroscience Methods, 2012, Vol.209, pp.79-89 |
PLoS One, 2013, Vol.8, No.4, e59243, pp,1-9 |
Scientific Reports, 2014, Vol.4, No.4957, pp.1-7 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2017228466B2 (en) | 2023-05-25 |
AU2017228466A1 (en) | 2018-09-27 |
EP3423564A4 (en) | 2019-08-21 |
US11149250B2 (en) | 2021-10-19 |
US20170253856A1 (en) | 2017-09-07 |
JP2019512221A (ja) | 2019-05-16 |
EP3423564A1 (en) | 2019-01-09 |
WO2017152081A1 (en) | 2017-09-08 |
US20210403863A1 (en) | 2021-12-30 |
JP2022106847A (ja) | 2022-07-20 |
CA3016575A1 (en) | 2017-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7235507B2 (ja) | 多能性幹細胞由来のミクログリアならびにその作製および使用方法 | |
Konttinen et al. | PSEN1ΔE9, APPswe, and APOE4 confer disparate phenotypes in human iPSC-derived microglia | |
Douvaras et al. | Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia | |
Zhang et al. | Long-term propagation of porcine undifferentiated spermatogonia | |
Wang et al. | Retinoic acid is sufficient for the in vitro induction of mouse spermatocytes | |
Wiley et al. | cGMP production of patient-specific iPSCs and photoreceptor precursor cells to treat retinal degenerative blindness | |
Takashima et al. | Functional differences between GDNF-dependent and FGF2-dependent mouse spermatogonial stem cell self-renewal | |
US20230323303A1 (en) | Haematopoietic stem/progenitor cells | |
Nolan et al. | Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration | |
Nikmanesh et al. | Heparan sulfate proteoglycan mediates shear stress‐induced endothelial gene expression in mouse embryonic stem cell‐derived endothelial cells | |
French et al. | Human induced pluripotent stem cell-derived B lymphocytes express sIgM and can be generated via a hemogenic endothelium intermediate | |
JP2023071728A (ja) | 多能性幹細胞および造血始原細胞からのヒトミクログリア様細胞の分化と使用 | |
JP2022097752A (ja) | ヒト心室前駆細胞の生着のための遺伝子マーカー | |
Javed et al. | Microcephaly modeling of kinetochore mutation reveals a brain-specific phenotype | |
US20160320409A1 (en) | Method for identifying and selecting cardiomyocytes | |
EP3600362A1 (en) | Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids and methods of use thereof | |
Pini et al. | ALX 1‐related frontonasal dysplasia results from defective neural crest cell development and migration | |
EP3790561A2 (en) | Cell populations and gene expression associated with in vitro beta cell differentiation | |
US20170121683A1 (en) | Aryl hydrocarbon receptor disruption and enhancement | |
US20170349883A1 (en) | Mature cardiac muscle cell marker | |
CN111836884A (zh) | 源自干细胞的泪腺组织的制作方法 | |
Harichandan et al. | Molecular signatures of primary human spermatogonial progenitors and its neighboring peritubular stromal compartment | |
Kirsanov et al. | Modeling mammalian spermatogonial differentiation and meiotic initiation in vitro | |
Seo et al. | iPSC-based modeling of helicase deficiency reveals impaired cell proliferation and increased apoptosis after NK cell lineage commitment | |
Soucy et al. | Introduced chemokine gradients guide transplanted and regenerated retinal neurons toward their natural position in the retina |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180914 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190521 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200225 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200225 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210329 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210628 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210730 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210823 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20211227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220426 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220426 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220510 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220511 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220627 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220915 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221223 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230125 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230224 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7235507 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |