JP7233087B2 - 抗動脈硬化剤 - Google Patents
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Description
動物、飼料及び処置
実験デザインを図1に示す。5週齢のApoE-/-マウスは、C57BL/6J系統をバックグラウンドとする公知のマウス(Lo Sasso et al., J Transl Med 2016, 14:146, DOI 10.1186/s12967-016-0901-1; Kapourchali et al., World J Clin Cases 2014 May 16, vol. 2, issue 5, p.126-132; Li et al., Protein Cell 2011, vol. 2, issue 3, p.189-201)を橋本博士(横浜市立大学大学院医学研究科)より譲り受けた。実験に用いたマウスは全て30週の研究期間中生存させた(馴化5週、実験観察期間25週)。マウスを実験群及びコントロール群にランダムに割り当てる前に、全てのマウスに標準的な固形飼料(標準飼料; ND)と水道水を5週間自由摂取させた。この馴化期間後にマウスを次の通りグループ分けした。ND群は、NDを引き続き15週間又は25週間給餌した。WD群は、馴化期間後、脂質21.22%(g/100 g)、タンパク質17.01%、炭水化物48.48%、コレステロール0.15%を含む高脂質・高コレステロールのウェスタン飼料(オリエンタル酵母、日本国東京)に切り替えた。15週間後、WD群のマウスをさらに、コントロール群(引き続きWDを第30週まで10週間、合計で25週間WDを給餌)と、WD給餌に加えて緩下剤処置も行なった群(ルビプロストン(500μg/kg), センノシド(25 mg/kg)又は水酸化マグネシウム(Mg(OH)2) (60 mg/kg), 第30週までの10週間毎日強制経口投与)に割り当てた。ND群とWD群のマウスを第20週で犠牲死させ、動脈硬化病変の進行と脂質プロファイルの血清レベルのベースライン測定を行なった。
腸管壁のin vivo透過性は、既報[1]の通り、4 kDaフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン(Sigma-Aldrich、米国MO州St. Louis)の透過性として数量化した。簡潔に記載すると、6時間絶食させた27週齢のマウス(7週間の緩下剤投与あり又はなし)にFITC-デキストラン(500 mg/kg)を強制経口投与した後、顔面静脈から採血して血清サンプルを調製した。FITC-デキストランの血清濃度は、蛍光分光光度計(ARVO MX, PerkinElmer, 米国MA州Boston)で励起波長485 nm、蛍光波長535 nmで測定した。これにより、腸管バリア機能の変化を直接的に評価できた。
ND又はWDを15週間又は25週間給餌した後、マウスを犠牲死させて心臓と大動脈を採取し、大動脈根の横断面解析及び大動脈全体(上行大動脈から総腸骨動脈まで)の正面解析により大動脈病変を定量化した。血管周囲脂肪組織(PVAT)の採取後、大動脈を10%ホルマリン中で固定し、長軸方向に切開し、オイルレッドO溶液(Sigma-Aldrich)で脂質沈着を染色した。Image Jプログラム(National Institutes of Health, 米国MD州Baltimore)を用いて大動脈病変の面積を算出した。観察された全てのプラークの面積を合算し、血管の総面積に対する割合(%)で表した。心臓はパラフィン包埋し、3つの大動脈弁尖の始端から上行大動脈までを5μm厚の連続切片に切り出し、ヘマトキシリン-エオシン染色した。免疫組織化学的検査のため、成熟マクロファージの特異的マーカーである抗F4/80抗体(Abcam, 英国Cambridge)で連続切片を染色した。陽性染色面積(F4/80陽性面積)の強度をImage Jソフトウェアで解析した。
脾臓全体、PVATおよび回腸をそれぞれTRIzol試薬(カタログ番号00571510, Thermo Fisher Scientific)中でホモジナイズし、RiboPure Kit(カタログ番号AM1924, Life Technologies)を製造者のプロトコールに従い用いてトータルRNAを抽出した。High Capacity RNA-to-cDNA Kit(カタログ番号4387406, Applied Biosystems)を製造者のプロトコールに従い用いてRNA計500 ngをcDNAに逆転写した。次いでcDNAをRT2 SYBR Green ROX qPCR Master mix(カタログ番号1712516, Thermo Fisher Scientific)と混合し、製造者の指示書に従いリアルタイムPCRを行なった。温度サイクリングと蛍光検出は、ABI7500リアルタイムPCR機(Applied Biosystems)を製造者の推奨条件に従い使用して実施した。グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)をハウスキーピング遺伝子とし、2[-ΔΔC(T)]法により相対mRNA発現レベルを決定した。リアルタイムPCRに使用したプライマーの配列を表1に示す。
マウス犠牲死時に右側心室穿刺を介して全血サンプルを採取した。低比重リポ蛋白コレステロール(LDL-c)、高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-c)及びトリグリセリド(TG)レベルの測定はエスアールエル(SRL Inc., 日本国東京)に委託した。総血清IgGは、Mouse IgG ELISA Kit(Bethyl Laboratories, E99-131)を製造者の指示書に従い用いて希釈血清で測定した。血清IgG3はMouse IgG3 ELISA Kit(Bethyl Laboratories, E99-111)を用いて測定した。アイソタイプスタンダードの標準曲線に基づき、データをミリリットル当たりのマイクログラム(μg/ml)で表した。
本研究における全ての実験は横浜市立大学大学院医学研究科の動物ケアガイドラインに従って実施した。
連続データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)で表した。群間差は、A prioriに解析し、分散分析(ANOVA)を行い、事後解析で検定した。p値<0.05を有意とした。全ての解析はJMP 9.1ソフトウェア(SAS Institute Inc., 米国NC州Cary)を用いて行なった。
1.ルビプロストンの経口投与は動脈硬化の進行を減弱させる
長軸方向に切開した大動脈のオイルレッドO染色によって示される通り、NDと比較してWDの15週間給餌はより大きな動脈硬化病変の形成を誘導し、この病変形成はWDをさらに10週間継続給餌することで増大した(図2)。15週間WD給餌後のルビプロストン10週間投与は、25週WD群と比べて動脈硬化病変進行が69%(p<0.01)有意に抑制された。大動脈根の組織学的検査により、動脈硬化病変が26%減少したことが確認された(p<0.05, 図3)。しかしながら、長軸方向切開大動脈および大動脈根のどちらの領域も、大動脈病変の面積はルビプロストン投与マウス群においてベースライン(15週WD群)よりもなお大きかった。これらの結果は、ルビプロストンの経口投与が、WDにより誘導される動脈硬化病変形成の増悪を減弱したが、アテローム性プラークの退縮を誘導するには不十分であったことを示している。大動脈根の免疫組織化学的解析によると、F4/80染色で調べたプラーク中へのマクロファージ浸潤は、ルビプロストンにより有意に減少した(P<0.05, 図3E)。
経口投与したFITC-デキストランの血漿成分への移行によって調べた生体内腸透過性は、WD群においてND群よりも有意に高かった(図4A)。しかしながら、WD給餌を継続したにもかかわらず、FITC-デキストランの血漿成分への移行はルビプロストン投与により有意に低下した。
B細胞は脾臓のほかPVAT及び血管外膜層にも存在することが知られている[2,3]。我々は過去に、WD給餌マウスのPVATにおいて明白なB2細胞浸潤が増加すること、B2細胞浸潤が動脈硬化の誘導に必須の寄与因子であることを報告した(非特許文献3)。ルビプロストンの効果がB2細胞の不活化によってもたらされているという仮説を検証するため、我々はPVATにおけるB2細胞の凝集を解析した。
Mg(OH)2投与群及びセンノシド投与群では、LDL-c及びTGの血清レベルがWD群よりも有意に低かった(図4F、4H)。ルビプロストン投与群ではLDL-c及びTGの血清レベルの低下はわずかで有意差がなかった。しかしながら、緩下剤投与した3群(Mg(OH)2、センノシド、ルビプロストン)のうち、ルビプロストンが抗動脈硬化作用において優位であるにもかかわらず、ルビプロストン群のみで血清HDL-cレベルの有意な低下が見られた(図4G)。これらのデータは、Mg(OH)2又はセンノシドを投与したマウスにおいて脂質代謝が少なくとも部分的には中等度の抗動脈硬化作用を付与しているかもしれないが、ルビプロストンは脂質代謝とは独立したメカニズムで動脈硬化の進行を抑制できることを示唆している。
[1] Wang Q, Fang CH, Hasselgren PO. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001; 281: R1013-1023.
[2] Grabner R1, Lotzer K, Dopping S, Hildner M, Radke D, Beer M, Spanbroek R, Lippert B, Reardon CA, Getz GS, Fu YX, Hehlgans T, Mebius RE, van der Wall M, Kruspe D, Englert C, Lovas A, Hu D, Randolph GJ, Weih F, Habenicht AJ. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged ApoE-/- mice. J Exp Med. 2009; 206: 233-248. doi: 10.1084/jem.20080752
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Claims (2)
- ルビプロストン又はその薬剤的に許容される塩を有効成分として含有する、抗動脈硬化剤。
- 動脈硬化病変の発生を低減又は動脈硬化症の進行を抑制する剤である、請求項1記載の抗動脈硬化剤。
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Non-Patent Citations (2)
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Biochemical and Biophysical Research Communications,2012年,Vol. 426,pp. 374-379 |
荒川健太郎 ほか,Lubiprostone as a Potential Therapeutic Agent to Improve Intestinal Permeability and Prevent the Development of Atherosclerosis in ApoE-/- Mice,第83回日本循環器学会学術集会 オンライン抄録,2019年03月18日,PJ058-2 |
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