JP7232503B2 - Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of bone disease - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 日本農芸化学会２０１８年度大会 講演要旨集 ウェブサイト１、公開日：平成３０年３月５日 Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry 2018 Annual Meeting Abstracts Website 1, Published: March 5, 2018

特許法第３０条第２項適用 日本農芸化学会２０１８年度大会 講演要旨集 ウェブサイト２、公開日：平成３０年３月５日 Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry 2018 Annual Meeting Abstracts Website 2, Published: March 5, 2018

特許法第３０条第２項適用 第３１回日本動物細胞工学会２０１８年度国際会議（ＪＡＡＣＴ２０１８）ウェブサイト、公開日：平成３０年９月１８日Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act The 31st International Conference of the Japanese Society for Animal Cell Technology 2018 (JAACT2018) website, release date: September 18, 2018

本発明は、グリーンプロポリス及びキク科バッカリス属植物から抽出された桂皮酸誘導体類の骨代謝調節作用に基づく各種骨疾患の予防又は治療剤または健康食品に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to preventive or therapeutic agents or health foods for various bone diseases based on the bone metabolism regulating action of cinnamic acid derivatives extracted from green propolis and plants belonging to the genus Baccharis of the Asteraceae family.

骨減少性疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等に代表される外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化といった内因性の疾患とに大別される。本明細書中においては、「骨減少性疾患」という用語には、上述した外因性疾患及び内因性疾患以外に、歯周病による歯又は歯槽骨または歯周組織の吸収又は破壊及びそれに起因する疾患が含まれるものとする。骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制、歯や歯槽骨の成長・形成、歯槽骨並びに歯周組織の破壊の予防及び骨並びに歯の再生は、「骨減少性疾患」を予防、治療及び/又は改善させる原因に含まれる。 Osteopenic diseases include exogenous diseases such as traumatic fractures and stress fractures, osteoporosis, osteoporosis, hypercalcemia, hyperparathyroid hormoneemia, Paget's disease of bone, arthritis, rheumatoid arthritis, and breast cancer. Bone metastasis, osteomalacia, weakened bone tissue caused by malignant tumors and other diseases, and endogenous diseases such as weakened bone tissue caused by malnutrition. As used herein, the term "osteopenic disease" includes, in addition to the above-mentioned extrinsic and intrinsic diseases, resorption or destruction of teeth or alveolar bone or periodontal tissue due to periodontal disease and disease shall be included. Promotion of osteoblast differentiation, suppression of osteoclast differentiation, promotion of bone formation, suppression of bone resorption, growth and formation of teeth and alveolar bone, prevention of destruction of alveolar bone and periodontal tissue, and regeneration of bone and teeth , are included in the causes of preventing, treating and/or ameliorating "osteopenic diseases".

ヒトの骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを絶えず繰り返しつつ、恒常性を維持している。しかし、加齢や炎症等により、恒常性が維持できなくなり、骨吸収が過剰になると、骨粗鬆症や関節リウマチ等の病態が生じる。 Human bones maintain homeostasis by constantly repeating bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts. However, homeostasis cannot be maintained due to aging, inflammation, or the like, and when bone resorption becomes excessive, pathological conditions such as osteoporosis and rheumatoid arthritis occur.

骨粗鬆症や歯周病患者はどちらも１，０００万人を超えており、社会的に大きな問題となっている。また、急速な高齢化により６５才以上の人口が増加し、骨粗鬆症さらに患者が増加すの一途を辿ることが推測されている。また、骨粗鬆患者の増加に伴って、高齢者の骨折のも増加すると考えられる人体において骨は絶えず骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞である。骨の形成、維持、修復には、これらの細胞の形成と吸収のバランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症などの骨代謝疾患がもたらされることが知られている。よって骨形成が骨吸収を下回らないことが骨量の維持・増強に重要であると考えられている。 The number of osteoporosis and periodontal disease patients exceeds 10 million, and it is a serious social problem. In addition, it is estimated that the population aged 65 and over will increase due to the rapid aging of the population, and that the number of osteoporosis patients will continue to increase. In addition, as the number of osteoporosis patients increases, the number of bone fractures in the elderly is also expected to increase. In the human body, bones constantly repeat bone resorption and bone formation. osteoblasts are the cells involved in Bone formation, maintenance, and repair depend on the balance between the formation and resorption of these cells, and when this balance is disrupted, bone resorption exceeds bone formation, leading to bone metabolic diseases such as osteoporosis. It has been known. Therefore, it is considered important for maintenance and enhancement of bone mass that bone formation does not fall short of bone resorption.

骨吸収は破骨細胞によって行なわれるため、破骨細胞の分化や機能を抑制する化合物やホルモンが骨吸収抑制剤として用いられているの分化および活性化が顕著であるほど、骨吸収率は高くなる。一方、骨量を増加させる方法としてはカルシウム製剤やカルシウムの吸収を高めるビタミンＤ製剤などが主流である。骨形成は骨芽細胞によって行なわれるため、骨芽細胞の分化や機能を促進させる化合物やホルモンは骨形成促進剤として有用であり、副甲状腺ホルモン製剤などが実用化されている。骨減少性疾患をさらに効率的に予防や治療をするためには、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持つことが望ましいが、および活性化が顕著であるほど、骨形成率は高くなる。そのため、骨吸収率を減少させる骨吸収抑制作用を有し、骨形成率を高める骨形成促進作用を有する組成物が得られれば、骨粗鬆症に有効である。このような効果が報告されているものとして、特許文献１には、例えば、破骨細胞分化抑制作用に基づく骨吸収抑制作用と骨芽細胞分化促進作用に基づく骨形成促進作用を併せ持つ骨代謝改善剤として、トケイソウ科に属する植物に含まれるハルミンを有効成分とする骨代謝改善組成物（特許文献１参照）などが知られている。 Since bone resorption is performed by osteoclasts, compounds and hormones that suppress the differentiation and function of osteoclasts are used as bone resorption inhibitors. Become. On the other hand, as methods for increasing bone mass, calcium preparations and vitamin D preparations that enhance calcium absorption are the mainstream. Since bone formation is performed by osteoblasts, compounds and hormones that promote the differentiation and function of osteoblasts are useful as osteogenesis promoters, and parathyroid hormone preparations and the like have been put to practical use. In order to prevent or treat osteopenic diseases more efficiently, it is desirable to have both bone resorption inhibitory action and bone formation promotion action, and the more significant the activation, the higher the bone formation rate. Therefore, it would be effective for osteoporosis if a composition having a bone resorption inhibitory effect to decrease the bone resorption rate and a bone formation promoting effect to increase the bone formation rate could be obtained. For example, Patent Document 1 discloses that such an effect is reported. As an agent, a bone metabolism improving composition containing harmine contained in a plant belonging to Passifloraceae as an active ingredient (see Patent Document 1) is known.

特願2008-558102Patent application 2008-558102

従来では、骨吸収抑制剤としてはエストロゲン製剤、ビスフォスフォネート、ビタミンＤ、カルシトニンなどの薬剤が臨床使用応用されてきた。また、最近、骨形成促進剤としてカルシウム製剤やビタミンＤ製剤に加えて副甲状腺ホルモン製剤が実用化されて一定の成果を上げている。しかしながら、その作用、副作用、コストなどの面でが、これらによる治療法は充分とはいえず、より優れた新たな治療薬が求められている。 Conventionally, drugs such as estrogen preparations, bisphosphonates, vitamin D and calcitonin have been clinically applied as bone resorption inhibitors. In addition to calcium preparations and vitamin D preparations, parathyroid hormone preparations have recently been put to practical use as osteogenesis promoters, with certain results. However, in terms of action, side effects, cost, etc., these therapeutic methods are not sufficient, and new, more excellent therapeutic agents are desired.

本発明の目的は、これまでにも食に供された経験があり、破骨細胞分化抑制作用及び骨形成促進作用を有し、骨粗鬆症骨減少性疾患の予防及び／又はおよび改善に有用な有効成分のための組成物又はその使用方法を提供することにある。 The object of the present invention is to provide an effective food that has been used in food, has an osteoclast differentiation inhibitory action and an osteogenesis promoting action, and is useful for the prevention and/or improvement of osteoporotic osteopenic diseases. The object is to provide a composition for the component or a method of using the same.

本発明者らは、破骨細胞分化抑制作用および骨形成促進作用を有する有効成分について、種々の素材から探索を重ねた結果、グリーンプロポリスから抽出されたアルテピリンC（artepillin C）、バッカリン（baccharin）、ドルパニン（drupanin）などの桂皮酸誘導体が、破骨細胞への分化を抑制するとともに、し、さらに骨芽細胞の分化骨形成を促進することを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have repeatedly searched various materials for active ingredients having osteoclast differentiation inhibitory action and osteogenesis promoting action, and as a result, artepillin C and baccharin extracted from green propolis. The inventors have found that cinnamic acid derivatives such as drupanin suppress osteoclast differentiation and promote osteoblast differentiation and osteogenesis, thereby completing the present invention.

本発明は、桂皮酸誘導体であるアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを少なくとも１種以上含有する破骨細胞分化抑制剤及び／又は骨芽細胞分化促進剤および骨形成促進剤、骨粗鬆症の予防および骨代謝改善剤である。 The present invention provides osteoclast differentiation inhibitors and/or osteoblast differentiation promoters and osteogenesis promoters containing at least one or more of cinnamic acid derivatives artepillin C, baccarin, or drupanin, prevention of osteoporosis, and osteoporosis. It is a metabolic improver.

また、本発明は、桂皮酸誘導体であるアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを少なくとも１種以上含有する骨吸収抑制剤及び／又は骨形成促進剤であり、本発明は、桂皮酸誘導体を含有する飲食品である骨代謝調節剤である。 In addition, the present invention is a bone resorption inhibitor and/or bone formation promoter containing at least one of cinnamic acid derivatives artepillin C, baccarin, or drupanin, and the present invention contains a cinnamic acid derivative. It is a bone metabolism regulator which is food and drink.

すなわち、
本発明は以下のとおりである。
[１] アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する、破骨細胞分化抑制剤、及び／又は骨芽細胞分化促進剤。
[２] アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する、骨吸収抑制剤及び/又は骨形成促進剤。
[３] アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
[４] アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する、骨代謝調節用医薬製剤。
[５] アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は改善用機能性食品。
[６] 骨減少性疾患を予防及び/又は治療するための方法であって、上記方法は、
上記骨減少性疾患を患っている対象者に、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンからなる群から選ばれる化合物を少なくとも１種以上含有する医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を投与するステップを含む、方法。 i.e.
The present invention is as follows.
[1] An osteoclast differentiation inhibitor and/or an osteoblast differentiation accelerator containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin.
[2] A bone resorption inhibitor and/or bone formation promoter containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin.
[3] A pharmaceutical composition for preventing and/or treating an osteopenic disease, containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin.
[4] A pharmaceutical preparation for regulating bone metabolism, containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin.
[5] A functional food for preventing and/or improving osteopenic diseases, containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin.
[6] A method for preventing and/or treating an osteopenic disease, comprising:
A step of administering a pharmaceutical composition or pharmaceutical preparation for regulating bone metabolism containing at least one compound selected from the group consisting of artepillin C, baccarin, and drupanin to a subject suffering from the osteopenic disease. including, method.

本発明の骨代謝改善剤は、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有し、破骨細胞への分化抑制作用により骨吸収を抑制し、さらに骨芽細胞の分化促進作用により、骨形成を促し、様々な骨減少性疾患を予防及び／又は改善できる。 The agent for improving bone metabolism of the present invention contains artepillin C, baccarin, or drupanin, suppresses bone resorption by inhibiting differentiation into osteoclasts, and promotes bone formation by promoting differentiation of osteoblasts. , can prevent and/or ameliorate various osteopenic diseases.

本発明の機能性食品は、グリーンプロポリスの抽出成分であるアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有し、経口摂取することにより破骨細胞への分化抑制、骨芽細胞の分化を促進し、骨粗鬆症を予防及び／又は改善できる。 The functional food of the present invention contains artepillin C, baccarin, or drupanin, which is an extract component of green propolis, and when taken orally, inhibits differentiation into osteoclasts, promotes differentiation of osteoblasts, and prevents osteoporosis. can be prevented and/or ameliorated.

多核破骨細胞形成に対するアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンの抑制作用を示すTRAP染色写真である。1 is a TRAP-stained photograph showing the inhibitory action of artepillin C, baccarin, and dorpanin on multinucleated osteoclast formation. 破骨細胞分化に対するアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンの抑制作用を示すTRAP活性のグラフある。1 is a graph of TRAP activity showing the inhibitory effects of artepillin C, baccarin, and drupanin on osteoclast differentiation. 破骨細胞の分化マーカー遺伝子の発現の発現に対するアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンによる抑制作用を示すグラフである。1 is a graph showing the inhibitory effects of artepillin C, baccarin, and dolpanin on the expression of osteoclast differentiation marker genes. 骨芽細胞分化に対するアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンの促進作用を示すALP活性のグラフである。1 is a graph of ALP activity showing the promoting effects of artepillin C, baccarin and drupanin on osteoblast differentiation. 骨芽細胞分化に対するアルテピリンCとバッカリンの促進作用を示す石灰化染色写真である。Fig. 3 is a calcification-stained photograph showing the promoting action of artepillin C and baccarin on osteoblast differentiation. 骨芽細胞の分化マーカー遺伝子発現に対するバッカリンの促進作用を示すグラフである。Fig. 3 is a graph showing the promoting effect of baccarin on osteoblast differentiation marker gene expression.

本発明の破骨細胞分化抑制剤又は骨芽細胞分化促進剤、又は骨吸収抑制剤、又は骨形成促進剤又は骨減少性疾患予防及び／又は治療剤は、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを有効成分として含有する。アルテピリンCは下記の式（１）に示す構造式を有し、正式な化合物名は４ヒドロキシ３，５ジプレニル桂皮酸である。バッカリンは下記の式（２）に示す構造式を有し、正式な化合物名は３－プレニル－4－(ジヒドロジヒドロシナモイルオキシ)桂皮酸である。ドルパニンは、下記の式（３）に示す構造式を有し、４－ヒドロキシ－３－(３-メチル-２-ブテニル)桂皮酸である。

The osteoclast differentiation inhibitor, osteoblast differentiation promoter, bone resorption inhibitor, osteogenesis promoter, or osteopenic disease preventive and/or therapeutic agent of the present invention contains artepillin C, baccarin, or dolpanin. Contains as an active ingredient. Artepillin C has a structural formula shown in formula (1) below, and its formal compound name is 4-hydroxy-3,5-diprenylcinnamic acid. Baccarin has a structural formula shown in formula (2) below, and its formal compound name is 3-prenyl-4-(dihydrodihydrocinnamoyloxy)cinnamic acid. Dorpanin has the structural formula shown below in formula (3) and is 4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)cinnamic acid.

アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンは、精製された化合物であってよく、合成された化合物でもよい。また、上記化合物はグリーンプロポリスやキク科バッカリス属植物の抽出物に含まれた形態であってもよい。グリーンプロポリスの抽出物からの上記化合物の精製は、例えば、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール等の有機溶媒を用いて抽出し、液液分配、クロマトグラフィーなど汎用的な分画技術を用いることができ、さらに疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーにより分離、精製することができる。グリーンプロポリス乾燥体1 kgから１～10 g程度のアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを分離、精製することができる。疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーとして、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）であるコスモシールＣ１８（ナカライテスク）等を用いたクロマトグラフィーが挙げられる。
キク科バッカリス属に属する植物（学名：バッカリス・ドラクンクリフォリア）（Baccharis dracunculifolia）は、南アメリカを中心に生育しており、生植物として入手しても良く、抽出エキスとして加工された形態として入手することも可能である。
また、上述した植物から単離された任意の化合物に化学的処理を施して、上記化合物を合成してもよく、植物から単離した化合物を用いずに化学合成により得てもよい。さらに、上記化合物は、存在可能な水和物又は塩であってもよい。 Artepillin C, or baccarin, or dorpanin may be a purified compound or a synthesized compound. Moreover, the above compound may be in a form contained in green propolis or an extract of a plant belonging to the genus Baccharis of the Asteraceae family. Purification of the above compounds from an extract of green propolis is carried out by extraction with an organic solvent such as acetone, hexane, ether, ethyl acetate, chloroform, butanol, propanol, methanol, ethanol, liquid-liquid partition, chromatography, etc. A general-purpose fractionation technique can be used, and furthermore, separation and purification can be performed by chromatography using hydrophobic interaction. About 1 to 10 g of artepillin C, baccarin, or dolpanin can be separated and purified from 1 kg of dried green propolis. Chromatography using hydrophobic interaction includes chromatography using COSMOSIL C18 (Nacalai Tesque), which is octadecylsilylated silica gel (ODS), and the like.
Baccharis dracunculifolia, a plant belonging to the genus Baccharis of the Asteraceae family (scientific name: Baccharis dracunculifolia), grows mainly in South America and can be obtained as a raw plant or as a processed extract. It is also possible to obtain
In addition, any compound isolated from the plant may be chemically treated to synthesize the compound, or the compound may be obtained by chemical synthesis without using the compound isolated from the plant. Additionally, the above compounds may be hydrates or salts that may exist.

＜実施形態１：医薬組成物＞
本発明によれば、
上記化学式（１）～（３）で示される化合物であるアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療する医薬組成物が提供される。
アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンは単独で使用してもよく、任意の割合で配合してもよい。
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。また、着色料、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、それぞれあげられる。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。 <Embodiment 1: Pharmaceutical composition>
According to the invention,
Provided is a pharmaceutical composition for preventing and/or treating osteopenic diseases, containing artepillin C, a compound represented by the above chemical formulas (1) to (3), baccarin, or drupanin.
Artepillin C, baccarin, or drupanin may be used alone, or may be blended in any ratio.
The pharmaceutical composition may contain pharmaceutically acceptable excipients, lubricants, binders, disintegrants, coating agents and the like. It may also contain coloring agents, fragrances, preservatives, and the like. Examples of excipients include lactose, glucose, corn starch, sorbitol, and crystalline cellulose; examples of lubricants include talc, magnesium stearate, polyethylene glycol, hydrogenated vegetable oil; and examples of binders include dimethyl cellulose, polyvinyl alcohol, Polyvinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, etc. Disintegrants include starch, sodium alginate, gelatin powder, calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, and the like. The form of use is not particularly limited, and can be in the form of capsules, powders, granules, tablets, liquids, etc., and can also be used in the form of creams, pastes, gels, etc. as external preparations.

＜実施形態２：飲食用組成物＞
本発明のグリーンプロポリス由来、または、キク科バッカリス属植物由来、または、合成により得られたアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンは、骨代謝調節用のサプリメントとして用いることができ、あるいは、飲食物に混合してまたは飲食用組成物として用いることもできる。
サプリメントとして用いる場合、錠剤や顆粒の形態で用いることができ、他の有用成分と混合してもよい。
飲食用組成物として用いる場合、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等として供することが可能である。これらの飲食品は、骨代謝を改善する機能性食品として供することができ、特定保健用飲食品やその他のサプリメント、健康飲食品等には、骨吸収を抑制する、骨形成を促進する、骨粗鬆症を予防または改善する等の機能を表示することができる。
飲食用組成物は、固形物、液状、粉末、顆粒状、ペースト状等の種々の形態であり、具体的には、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ－ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。 <Embodiment 2: Food and drink composition>
The green propolis-derived, Asteraceae Baccharis genus plant-derived, or synthetically obtained artepillin C, baccharin, or dolpanin of the present invention can be used as a supplement for regulating bone metabolism, or added to food and drink. It can also be mixed or used as an edible composition.
When used as a supplement, it can be used in the form of tablets or granules, and may be mixed with other useful ingredients.
When used as a food or drink composition, it can be provided as a health food or drink, a food or drink for specified health use, a food or drink with nutrient function, a health supplement food or drink, or the like. These foods and drinks can be provided as functional foods that improve bone metabolism, and are used as foods and drinks for specified health use, other supplements, and health foods and drinks that suppress bone resorption, promote bone formation, and prevent osteoporosis. It is possible to display functions such as preventing or improving
Food and drink compositions are in various forms such as solids, liquids, powders, granules, and pastes, and specific examples include soft drinks, lactic acid drinks, luxury drinks, coffee, green tea, black tea, and oolong tea. beverages; confectionery such as candies, chocolates, biscuits, sweet breads, cakes, rice cakes, and rice confectionery; processed vegetables and fruits such as fruit drinks, vegetable drinks, jams and pastes; sake, shochu, wine , Chinese liquor, whiskey, vodka, brandy, gin, rum, liquor, beer, soft alcoholic beverages, fruit wines, liqueurs; dairy products such as yogurt, ice cream, butter, cheese, condensed milk, powdered milk Oil and fat processed products such as dressings, mayonnaise, tempura oil, and salad oil; Seasonings such as soy sauce, sauces, vinegar, mirin, and dressing-type seasonings; Powdered juices, powdered soups, instant coffee, instant noodles, instant curry, instant miso soup, Dried foods such as cooked foods, cooked beverages, and cooked soups, processed grain products such as processed flour products and processed starch products, and the like. For example, it may be used as solids such as candy, cookies, chewing gum and biscuits, or may be used as liquids such as soft drinks, milk, yogurt and syrup. When used as a food or drink, additives commonly used in food or drink, such as citric acid, lactic acid, and casein, can be added.

医薬組成物は、経口で投与してもよく、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。
アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有する医薬組成物薬剤、サプリメントまたはあるいは飲食物等の飲食用組成物におけるアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニン含有量は、その剤型に応じて異なるが、通常アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンが、全組成物中の0.01～50重量％、好ましくは0.01～20重量％程度含まれていればよい。アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンの場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重、症状の種類、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、一日当たりの摂取量が0.01～300mg/kgになるように、各投与形態に合わせて設定するのが好ましい。医薬組成物、飲食要素生物、生体適合性材料のいずれの形態においても、１日１回または数回に分けて投与、又は摂取すればよい。
本発明のアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。 The pharmaceutical composition may be administered orally, or may be administered parenterally such as intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration and transdermal administration.
Pharmaceutical Compositions Containing Artepillin C or Baccarin or Dolpanin The content of artepillin C or baccarin or dorpanin in pharmaceutical compositions, supplements, or food and drink compositions such as food and drink varies depending on the dosage form, but is usually Artepillin C, baccarin, or dolpanin may be contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.01 to 20% by weight, of the total composition. In the case of artepillin C, baccarin, or dolpanin, the intake amount can be increased or decreased as appropriate in consideration of the age, sex, weight, type of symptoms, degree of symptoms, etc., but the daily intake should be 0.01 to 300 mg. /kg, preferably set for each dosage form. In any of the forms of pharmaceutical compositions, food and drink elements, and biocompatible materials, administration or ingestion may be performed once or divided into several times a day.
The artepillin C, baccarin, or dolpanin-containing pharmaceutical compositions, supplements, or food and drink compositions such as food and drink of the present invention are intended for mammals including humans. Mammals other than humans include primates such as monkeys, rodents such as rats and mice, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, and the like.

＜実施形態３：生体適合性素材＞
本願発明によれば、
アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンより選択される少なくとも１つの化合物を含有する、生体適合性素材が提供される。
この生体適合性素材を用いることで、骨減少性疾患の患部に直接接触させることが可能になる。
「生体適合性」とは、生体組織や細胞に対して炎症反応、免疫反応、中毒反応といった負の反応を引き起こさないか、そのような反応が小さいことを意味する。「生体適合性素材」には、生分解性素材や非生分解性素材が含まれる。「生分解性素材」は、生体内で分解され得る素材や生体内で吸収され得る素材であり、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、ハイドロキシアパタイト、TCP、ポリ乳酸（PLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、PLGA、ポリエチレングリコール（PEG）、MPCポリマー、アガロースゲルを挙げることができる。「非生分解性素材」は、生体内で分解及び吸収されない、又は、実質的に分解及び吸収されない素材であり、例えば、チタン、チタン合金、ステンレス、セラミックスが挙げられる。また、生体適合性素材は、細胞の足場材(スキャフォールド)であってもよく、更には、所望の細胞が接着した足場材(例えば、細胞シート、細胞塊)であってもよい。生体適合性素材として非生分解性素材を用いる場合、非生分解性素材は、その表面に、例えば、上記化合物を含有する上記生分解性素材が付着していてもよい。生体適合性素材は、当業者にとって公知の方法により、徐放性を有していてもよい。
生体適合性素材は、骨減少性疾患の患部に埋設することができ、骨及び歯(歯槽骨を含む)の形成又は再生、歯周組織の再生、骨折部位の修復に利用することができ、インプラント歯の埋入の前処理に利用することもできる。 <Embodiment 3: Biocompatible material>
According to the present invention,
A biocompatible material is provided that contains at least one compound selected from artepillin C, or baccarin, or drupanin.
The use of this biocompatible material enables direct contact with the affected area of osteopenic disease.
"Biocompatibility" means that it does not cause negative reactions such as inflammatory reactions, immune reactions, and toxic reactions to living tissues and cells, or that such reactions are minimal. "Biocompatible material" includes biodegradable and non-biodegradable materials. "Biodegradable materials" are materials that can be decomposed or absorbed in the body, such as collagen, atelocollagen, hyaluronic acid, hydroxyapatite, TCP, polylactic acid (PLLA), polyglycolic acid ( PGA), PLGA, polyethylene glycol (PEG), MPC polymer, agarose gel. A "non-biodegradable material" is a material that is not decomposed and absorbed in vivo, or is not substantially decomposed and absorbed in vivo, and examples thereof include titanium, titanium alloys, stainless steel, and ceramics. Moreover, the biocompatible material may be a cell scaffold, or a scaffold to which desired cells adhere (eg, cell sheet, cell mass). When a non-biodegradable material is used as the biocompatible material, the non-biodegradable material may have, for example, the biodegradable material containing the above compound attached to its surface. The biocompatible material may have sustained release properties by methods known to those skilled in the art.
The biocompatible material can be embedded in the affected area of osteopenic disease, and can be used for the formation or regeneration of bones and teeth (including alveolar bone), regeneration of periodontal tissue, and repair of fracture sites. It can also be used for pretreatment before embedding implant teeth.

＜実施形態４：骨減少性疾患を予防又は治療するための方法＞
本願発明によれば、
骨減少性疾患を予防又は治療するための方法であって、上記方法は、
上記骨減少性疾患を患っている対象者に、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを含有する医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を投与するステップを含む、
方法が提供される。
上記医薬組成物を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、PSA値、尿流量及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、上述した用量及び用法で、1日1回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよく、以上のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
上記医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤の１日当たりの投与量、投与期間及び投与回数は、上述した治療薬と同様であってもよい。上記医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤の投与は、医師による判断により終了してもよいし、患者の自己判断で終了してもよい。 <Embodiment 4: Method for preventing or treating osteopenic disease>
According to the present invention,
A method for preventing or treating an osteopenic disease, the method comprising:
administering to a subject suffering from the osteopenic disease a pharmaceutical composition containing artepillin C, or baccarin, or dorpanin, or a pharmaceutical formulation for regulating bone metabolism;
A method is provided.
When the above pharmaceutical composition is administered to a patient, the dosage varies depending on various conditions such as severity of symptoms, age, body weight, PSA level, urine flow rate and health condition of the patient. Generally, it may be administered once or more times a day at the dosage and administration method described above, and the frequency and amount of administration may be appropriately increased or decreased according to the above conditions.
The daily dose, administration period, and administration frequency of the pharmaceutical composition or pharmaceutical preparation for bone metabolism regulation may be the same as those of the therapeutic agent described above. The administration of the pharmaceutical composition or the pharmaceutical preparation for bone metabolism regulation may be terminated by the doctor's judgment or by the patient's own judgment.

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる：例えば、ヒト及び動物の多くの硬組織（骨や歯）減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防・治療のための、食品組成物、健康食品、医薬組成物、衛生用品とその方法；骨折、事故、手術、その他要因による硬組織（骨や歯）減少・欠損部位における骨形成・骨再生の誘導剤、促進剤とその方法；インプラント歯埋入前処理としての歯槽骨形成・歯槽骨再生促進剤とその方法；歯周病における歯槽骨・歯周組織の破壊の予防・再生剤とその方法；上記組成物を用いて作成した骨・歯・歯周組織再生促進用細胞とその使用、作成方法が挙げられる。 Although the embodiments of the present invention have been described above, these are examples of the present invention, and various configurations other than those described above can be adopted: for example, reduction of many hard tissues (bones and teeth) of humans and animals Food compositions, health foods, pharmaceutical compositions, sanitary products and methods thereof for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases (osteoporosis, rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget's disease, bone metastasis of cancer, etc.); Bone formation/bone regeneration inducer/promoter and its method in hard tissue (bone and tooth) loss/deficit sites due to accidents, surgery, and other factors; Agent and its method; Agent for preventing/regenerating destruction of alveolar bone and periodontal tissue in periodontal disease and its method; method.

＜実施例１＞ 破骨細胞分化試験
マウスマクロファージ様RAW264細胞（理研より入手）は、破骨細胞分化誘導因子（RANKL）存在下で培養することで破骨細胞へと分化する。破骨細胞の初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性の測定と染色によって、破骨細胞分化の評価を行った。 <Example 1> Osteoclast differentiation test Mouse macrophage-like RAW264 cells (obtained from RIKEN) are differentiated into osteoclasts by culturing in the presence of osteoclast differentiation-inducing factor (RANKL). Osteoclast differentiation was assessed by measuring and staining tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, an early osteoclast differentiation marker.

RAW264細胞を10%胎児血清を含むαMEM培地を用いて3,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、RANKL(50 ng/mL)の存在下で、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを最終濃度が10、30、100 μMになるように添加して72時間培養した。培養後、１０％ホルマリン及びエタノールにて細胞を固定後、定法によりTRAP活性を測定後、TRAP染色を行った。 RAW264 cells were seeded in 96-well plates at 3,000 cells/well using αMEM medium containing 10% fetal serum, and artepillin C, or baccarin, or dorpanin was added in the presence of RANKL (50 ng/mL) to a final concentration of It was added to 10, 30 and 100 µM and cultured for 72 hours. After culturing, the cells were fixed with 10% formalin and ethanol, TRAP activity was measured by a standard method, and then TRAP staining was performed.

結果
RANKLによって破骨細胞分化を誘導するとTRAP染色によって赤色に染まり、核を複数持つ多核破骨細胞の形成が多数認められるが（図1a）、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを添加した場合、多核破骨細胞の形成が明らかに減少した(図１b-d）。
また、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）の活性はRANKL添加によって著しく誘導されるが、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを添加した場合、いずれにおいても、TRAP活性の有意な抑制作用が認められた（図２）。
このことは、アルテピリンC、バッカリン、ドルパニンが破骨細胞の分化を抑制することを示しており、破骨細胞による骨吸収をアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンが抑制することを示している。 result
When osteoclast differentiation was induced by RANKL, TRAP staining resulted in red staining, and formation of many multinucleated osteoclasts with multiple nuclei was observed (Fig. 1a). Formation of osteoclasts was clearly reduced (FIG. 1b-d).
In addition, the activity of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), a marker enzyme for osteoclasts, is significantly induced by the addition of RANKL. A significant inhibitory effect was observed (Fig. 2).
This indicates that artepillin C, baccharin, and dorpanin suppress differentiation of osteoclasts, and that artepillin C, baccharin, and dorpanin suppress bone resorption by osteoclasts.

＜実施例２＞ 破骨細胞関連遺伝子発現解析
RAW264細胞を、実施例１と同様の密度になるように6ウェルプレートに播種したのち、RANKL(50 ng/mL)とアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを最終濃度が10、30、100 μMになるように添加して72時間培養した。TRIzol（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、Total RNAを抽出後、定法によりcDNAを作製して、リアルタイムRT-PCR法により、破骨細胞の初期の分化のマーカーである酒石酸耐性酸フォスファターゼ(Trap)および、後期の分化のマーカーであるカテプシンK（Ctsk）の遺伝子発現について解析した。 <Example 2> Osteoclast-related gene expression analysis
After seeding RAW264 cells in a 6-well plate at the same density as in Example 1, RANKL (50 ng/mL) and artepillin C, baccarin, or dorpanin were added to final concentrations of 10, 30, or 100 μM. and cultured for 72 hours. After extracting total RNA using TRIzol (Life Technologies Japan), cDNA was prepared by a standard method, and tartrate-resistant acid phosphatase (Trap), a marker of early differentiation of osteoclasts, was detected by real-time RT-PCR. And gene expression of cathepsin K (Ctsk), a marker of late differentiation, was analyzed.

結果
RANKLによって破骨細胞分化を誘導するとマーカー遺伝子であるTrapおよびCtskの遺伝子発現が著しく上昇するが、アルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを添加した条件では、TrapおよびCtskの遺伝子発現が抑制された（図３）。
このことは、アルテピリンC、バッカリン、ドルパニンは、遺伝子レベルでも破骨細胞の初期および後期の分化を抑制することを示している。 result
When osteoclast differentiation is induced by RANKL, the expression of the marker genes Trap and Ctsk is remarkably increased, but the expression of Trap and Ctsk is suppressed when artepillin C, baccarin, or drupanin is added ( Figure 3).
This indicates that artepillin C, baccarin, and dorpanin suppress early and late differentiation of osteoclasts at the gene level as well.

＜実施例３＞ 骨芽細胞分化試験
マウス頭蓋骨由来繊維芽細胞MC3T3-E1細胞（理研より入手）を5,000細胞/ウェルとなるように96ウェルマルチウェルプレートに播種し、10%牛胎児血清を含むαMEM培地を用いて2日間培養した。各ウェルにアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを最終濃度が10、30、100 μMになるように添加してさらに6日間培養後、メタノールで細胞を固定した。骨芽細胞の初期分化マーカー酵素として知られるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を定法により測定した。 <Example 3> Osteoblast differentiation test Mouse skull-derived fibroblast MC3T3-E1 cells (obtained from RIKEN) were seeded at 5,000 cells/well in a 96-well multiwell plate containing 10% fetal bovine serum. It was cultured for 2 days using αMEM medium. Artepillin C, baccarin, or dorpanin was added to each well to a final concentration of 10, 30, or 100 μM, and the cells were further cultured for 6 days, after which the cells were fixed with methanol. Alkaline phosphatase (ALP) activity, known as an early differentiation marker enzyme for osteoblasts, was measured by a standard method.

結果
コントロールと比較して、アルテピリンC、バッカリン、ドルパニンを添加して培養すると、ALP活性の上昇が認められた（図４）。このことは、アルテピリンC、バッカリン、ドルパニンが骨芽細胞の初期分化を促進することを示している。 Results When cultured with the addition of artepillin C, baccarin, and dorpanin, an increase in ALP activity was observed compared to the control (Fig. 4). This indicates that artepillin C, baccarin, and dorpanin promote early differentiation of osteoblasts.

＜実施例４＞ 骨芽細胞石灰化試験
MC3T3-E1細胞は骨芽細胞に分化すると、カルシウムを沈着して石灰化を引き起こす。マウス頭蓋骨由来繊維芽細胞MC3T3-E1細胞（理研より入手）を5,000細胞/ウェルとなるように96ウェルマルチウェルプレートに播種し、10%牛胎児血清を含むαMEM培地を用いて2日間培養した。各ウェルに分化誘導剤であるアスコルビン酸（50 μg/mL）およびβグリセロフォスフェート（10 mM）とともにアルテピリンC、又はバッカリン、又はドルパニンを最終濃度が10、30、100 μMになるように添加してさらに１２日間培養後、メタノールで細胞を固定した。石灰化により沈着したカルシウムをアリザリンレッド染色法にて染色した。 <Example 4> Osteoblast mineralization test
When MC3T3-E1 cells differentiate into osteoblasts, they deposit calcium and cause mineralization. Mouse skull-derived fibroblast MC3T3-E1 cells (obtained from RIKEN) were seeded in a 96-well multiwell plate at 5,000 cells/well and cultured for 2 days using αMEM medium containing 10% fetal bovine serum. Ascorbic acid (50 μg/mL) and β-glycerophosphate (10 mM) as differentiation inducers were added to each well, and artepillin C, baccharin, or dorpanin was added to a final concentration of 10, 30, or 100 μM. After culturing for an additional 12 days, the cells were fixed with methanol. Calcium deposited by calcification was stained by alizarin red staining.

結果
コントロール（図５a）と比較して、アルテピリンC (図５b)、バッカリン(図５c)を添加して培養した細胞は、アリザリンレッド染色によって赤色に染色される面積が明らかに増加した。このことは、アルテピリンC 、バッカリン骨芽細胞の後期分化も促進されて石灰化が誘導されることを示しており、骨芽細胞による骨形成をアルテピリンC とバッカリンが促進することを示している。 Results Compared to the control (Fig. 5a), cells cultured with the addition of artepillin C (Fig. 5b) and baccarin (Fig. 5c) clearly increased the area stained red by alizarin red staining. This indicates that artepillin C and baccharin promote late-stage differentiation of osteoblasts and induce mineralization, indicating that artepillin C and baccharin promote bone formation by osteoblasts.

＜実施例５＞ 骨芽細胞関連遺伝子発現解析
MC3T3-E1細胞を、実施例３と同様の密度になるように6ウェルプレートに播種したのち、バッカリンを最終濃度が10、30、100 μMになるように添加して6日間培養した。TRIzol（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、Total RNAを抽出後、定法によりcDNAを作製して、リアルタイムRT-PCR法により、骨芽細胞の初期の分化のマーカーであるアルカリフォスファターゼ（Alpl）と後期の分化のマーカーであるオステオカルシン（Osteocalcin）の遺伝子発現について解析した。 <Example 5> Osteoblast-related gene expression analysis
After MC3T3-E1 cells were seeded in a 6-well plate at the same density as in Example 3, baccarin was added to final concentrations of 10, 30 and 100 μM and cultured for 6 days. After extracting total RNA using TRIzol (Life Technologies Japan), cDNA was prepared by a standard method, and by real-time RT-PCR, alkaline phosphatase (Alpl), a marker of early differentiation of osteoblasts, and late We analyzed the gene expression of osteocalcin, a marker of differentiation.

結果
コントロールと比較して、バッカリンを添加した条件では、AlplおよびOsteocalcinの遺伝子発現が増加した（図6）。
このことは、バッカリンが遺伝子レベルでも骨芽細胞の初期および後期の分化を促進することを示している。 Results Compared to the control, the expression of Alpl and Osteocalcin was increased under the baccarin-added condition (Fig. 6).
This indicates that baccharin also promotes early and late differentiation of osteoblasts at the genetic level.

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。 The present invention has been described above based on the embodiments. It should be understood by those skilled in the art that this embodiment is merely an example, and that various modifications are possible and that such modifications are within the scope of the present invention.

ブラジル産グリーンプロポリス由来の桂皮酸誘導体であるアルテピリンC、バッカリン、ドルパニンは、破骨細胞の分化を抑制したことから、骨吸収抑制作用があることが示された。また、アルテピリンCとバッカリン（baccharin）、は、骨芽細胞の分化を促進して石灰化も亢進させることから、骨形成促進作用があることが示された。したがって、骨減少性のヒトおよび動物の多くの硬組織（骨や歯）減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防・治療等に有用である。また、骨折、事故、手術、その他要因による硬組織（骨や歯）減少・欠損部位における骨形成・骨再生の誘導・促進、さらには歯周病における歯槽骨・歯周組織の破壊の予防や再生にも有用である。 Brazilian green propolis-derived cinnamic acid derivatives, artepillin C, baccharin, and drupanin, inhibited osteoclast differentiation, suggesting that they have an inhibitory effect on bone resorption. In addition, artepillin C and baccharin promoted the differentiation of osteoblasts and accelerated mineralization, indicating that they have an osteogenesis-promoting effect. Therefore, it is useful for the prevention and treatment of many osteopenic human and animal hard tissue (bone and tooth) depleting diseases (osteoporosis, rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget's disease, bone metastasis of cancer, etc.). is. In addition, it is also used to induce and promote bone formation and bone regeneration in hard tissue (bone and teeth) loss and defect sites due to fractures, accidents, surgery, and other factors, as well as prevent destruction of alveolar bone and periodontal tissue in periodontal disease. Also useful for playback.

Claims (2)

バッカリンを含有する、骨芽細胞分化促進剤。 An osteoblast differentiation promoting agent containing baccarin . バッカリンを含有する、骨形成促進剤。 An osteogenesis promoter containing baccarin .

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