JP7232201B2 - Bile duct cell proliferation method - Google Patents

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Description

［資金提供］
本発明につながる研究は、欧州連合の第７フレームワークプログラム（European Union's Seventh Framework Programme）（ＦＰ７／２００７－２０１３）のＥＲＣ助成契約番号２８１３３５に基づく欧州研究評議会と、ＭＲＣ－Ｓｐａｒｋｓ臨床研究トレーニングフェローシップ（MRC-Sparks Clinical Research Training Fellowship）（ＭＲ／Ｌ０１６７６１／１）とから資金提供を受けた。 [Funding]
The research leading to the present invention was funded by the European Research Council under ERC grant contract number 281335 of the European Union's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and by the MRC-Sparks Clinical Research Training Fellowship. (MRC-Sparks Clinical Research Training Fellowship) (MR/L016761/1).

本発明は、例えば疾患モデリング、薬物スクリーニング及び再生医療において使用するための成人又は小児のヒト初代胆管細胞の分離及び成長に関する。 The present invention relates to the isolation and growth of adult or pediatric human primary cholangiocytes for use in, for example, disease modeling, drug screening and regenerative medicine.

肝外胆管の障害は、かなりの罹患率及び死亡率をもたらす。実際、小児肝移植の７０％は胆管閉鎖症を治療するために行われる（非特許文献１）。原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）単独で米国の肝移植の５％を占め（非特許文献２）、そして胆管合併症は死肝移植後の移植不全の主な原因である（非特許文献３、非特許文献４）。しかしながら、肝外胆管上皮の研究は、長期培養と初代胆管細胞の大規模な増殖とにおける技術的課題より限定される。これらの課題により、これまでＰＳＣ及びその他の胆管症を標的とする薬物スクリーニング及び細胞療法のための大規模な実験は不可能となっていた。さらに、罹患した胆管及び／又は胆嚢を再建及び置換するために使用され得る健康なドナー組織が不足しているため、治療の選択肢は限られたままである（非特許文献５、非特許文献６）。 Extrahepatic bile duct disorders result in significant morbidity and mortality. In fact, 70% of pediatric liver transplants are performed to treat bile duct atresia (Non-Patent Document 1). Primary sclerosing cholangitis (PSC) alone accounts for 5% of liver transplants in the United States (2), and biliary complications are the leading cause of graft failure after deceased liver transplantation (3). , Non-Patent Document 4). However, studies of extrahepatic bile duct epithelium are limited by technical challenges in long-term culture and large-scale expansion of primary cholangiocytes. These challenges have so far prevented large-scale experiments for drug screening and cell therapy targeting PSC and other cholangiopathies. Furthermore, treatment options remain limited due to the lack of healthy donor tissue that can be used to reconstruct and replace diseased bile ducts and/or gallbladders (5, 6). .

天然の胆管細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖は、この課題に対処することができ、胆管再建等の組織エンジニアリング用途に適した細胞を提供することができる。しかしながら、初代胆管上皮の培養には、問題が残されたままである（非特許文献７）。オルガノイド培養システムを使用する初代肝幹細胞の取得は以前に報告されている（非特許文献８）。しかしながら、得られた細胞が機能的胆管細胞へと分化し、ｉｎ ｖｉｖｏで胆管系に定着する能力は、まだ実証されていない。さらに、そのようなプラットフォームのｉｎ ｖｉｖｏでの適用は、移植後に不適切に増殖する能力及び／又は非胆管の細胞型へと分化する能力を有する幹細胞のコンタミネーションにより限定される。ヒト組織の入手の制限は、初代細胞に基づくシステムにとって大きな障害となる。 In vitro expansion of native cholangiocytes can address this issue and can provide cells suitable for tissue engineering applications such as bile duct reconstruction. However, the culture of primary bile duct epithelium remains problematic (Non-Patent Document 7). Obtaining primary hepatic stem cells using an organoid culture system has been previously reported (Non-Patent Document 8). However, the ability of the resulting cells to differentiate into functional cholangiocytes and colonize the biliary system in vivo has not yet been demonstrated. Furthermore, the in vivo application of such platforms is limited by the contamination of stem cells with the ability to inappropriately proliferate and/or differentiate into non-biliary cell types after transplantation. Limited availability of human tissue is a major obstacle for primary cell-based systems.

Murray K.F. & Carithers R.L., Hepatology 2005, 41:1407-1432Murray K.F. & Carithers R.L., Hepatology 2005, 41:1407-1432 Perkins J.D., Liver Transplant 2007, 13, 465-466Perkins J.D., Liver Transplant 2007, 13, 465-466 Skaro A.I. et al., Surgery 2009, 146:543-553Skaro A.I. et al., Surgery 2009, 146:543-553 Enestvedt C.K. et al., Liver Transpl. 2013, 19:965-72Enestvedt C.K. et al., Liver Transpl. 2013, 19:965-72 Gallo A. & Esquivel C.O, Pediatr. Transplant. 2013, 17:95-98Gallo A. & Esquivel C.O, Pediatr. Transplant. 2013, 17:95-98 Felder S.I. et al., JAMA Surg 2013, 148:253-7-8Felder S.I. et al., JAMA Surg 2013, 148:253-7-8 Sampaziotis, F et al., Hepaology 2015, 62:303-311Sampaziotis, F et al., Hepaology 2015, 62:303-311 Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312

本発明者らは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達が阻害され、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達が増強される培養条件により、予想外にも胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）の形で初代胆管細胞の効率的な増殖が可能となることを認識した。本明細書に記載されるように増殖された初代胆管細胞の集団は、例えば再生医療において有用であり得る。 We have unexpectedly found that culture conditions in which canonical Wnt signaling is inhibited and non-canonical Wnt/PCP signaling is enhanced efficiently stimulate primary cholangiocytes in the form of cholangiocyte organoids (CO). I realized that it would be possible to grow A population of primary cholangiocytes expanded as described herein can be useful, for example, in regenerative medicine.

本発明の態様は、初代胆管細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、
（ｉ）分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、増殖された集団を生成することと、
を含む、方法を提供する。 An aspect of the invention is a method of growing primary cholangiocytes in vitro, comprising:
(i) providing a population of isolated primary cholangiocytes;
(ii) culturing said population in a growth medium comprising epidermal growth factor (EGF), a canonical Wnt signaling inhibitor, and a non-canonical Wnt signaling enhancer to produce an expanded population; and
A method is provided, comprising:

前記胆管細胞は、増殖培地中でオルガノイドを形成することができる。 Said cholangiocytes are capable of forming organoids in growth medium.

非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、古典的及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の増強剤、好ましくはＲ－スポンジンであり得る。 The non-canonical Wnt signaling enhancer can be an enhancer of canonical and non-canonical Wnt signaling, preferably R-spondin.

前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ－１）であり得る。 Said inhibitor of canonical Wnt signaling may be Dickkopf-related protein 1 (DKK-1).

好ましくは、初代胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。 Preferably, the primary cholangiocytes are cultured in three-dimensional culture in growth medium.

幾つかの実施の形態では、上記方法は、オルガノイドを破壊して、分離された胆管細胞の集団を生成させることを更に含み得る。分離された胆管細胞を、増殖培地中で更に培養することで、上記集団を増殖又は成長させることができる。 In some embodiments, the method can further comprise disrupting the organoids to generate an isolated population of cholangiocytes. The isolated cholangiocytes can be further cultured in a growth medium to expand or grow the population.

本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離された胆管細胞の集団を提供する。胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない（sub-organoid）集成体又は個別の細胞の形であり得る。 Another aspect of the invention provides an isolated population of cholangiocytes produced by the methods described herein. Bile duct cells can be in the form of organoids, sub-organoid aggregates or individual cells.

前記初代胆管細胞は、肝外胆管細胞であることが好ましい。 The primary cholangiocytes are preferably extrahepatic cholangiocytes.

本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された胆管細胞を含む足場を提供する。 Another aspect of the invention provides a scaffold comprising cholangiocytes produced by the methods described herein.

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成された分離された胆管細胞の集団を胆管障害の治療を必要とする個体に投与することを含む、胆管障害の治療方法を提供する。 Another aspect of the invention is a method of treating a biliary disorder comprising administering to an individual in need of treatment a biliary disorder a population of isolated cholangiocytes produced as described herein. offer.

本発明の別の態様は、化合物をスクリーニングする方法であって、
本明細書に記載されるように生成された胆管細胞の集団を試験化合物と接触させることと、
前記胆管細胞に対する前記試験化合物の効果及び／又は前記試験化合物に対する前記胆管細胞の効果を測定することと、
を含む、方法を提供する。 Another aspect of the invention is a method of screening a compound, comprising:
contacting a population of cholangiocytes produced as described herein with a test compound;
measuring the effect of the test compound on the cholangiocytes and/or the effect of the cholangiocytes on the test compound;
A method is provided, comprising:

好ましくは、胆管細胞は、オルガノイド（ＣＯ）の形で試験化合物と接触される。 Preferably, the cholangiocytes are contacted with the test compound in the form of organoids (CO).

本発明の別の態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞の生成のためのキットを提供する。 Another aspect of the invention is for the generation of cholangiocytes, comprising a growth medium comprising epidermal growth factor (EGF), a canonical Wnt signaling inhibitor, and a non-canonical Wnt/PCP signaling enhancer. Offer a kit.

本発明の別の態様は、胆管障害のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングをする方法であって、
（ｉ）胆管障害を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）上記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、胆管障害の遺伝子型又は表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
を含む、方法を提供する。 Another aspect of the invention is a method for in vitro modeling of biliary disorders comprising:
(i) providing an isolated population of primary cholangiocytes from an individual with a biliary disorder;
(ii) culturing the population in a growth medium containing epidermal growth factor (EGF), a canonical Wnt signaling inhibitor, and a non-canonical Wnt signaling enhancer to determine the biliary disorder genotype or producing a population of expanded cholangiocytes exhibiting a phenotype;
A method is provided, comprising:

本発明の別の態様は、個体を胆管障害について試験する方法であって、
上記個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
上記胆管細胞の集団を、上記の本発明の一態様の方法を使用して増殖させることと、
上記胆管細胞の表現型を決定することと、
を含む、方法を提供する。 Another aspect of the invention is a method of testing an individual for biliary disorders comprising:
providing an isolated population of primary cholangiocytes from the individual;
growing the population of cholangiocytes using the method of one aspect of the present invention described above;
Determining the phenotype of the cholangiocytes;
A method is provided, comprising:

本発明の態様及び実施形態を、以下でより詳細に説明する。 Aspects and embodiments of the invention are described in more detail below.

種々の方法による初代胆管細胞の分離後の平均生存率を示す図である。Ｃ＋Ｄ：コラゲナーゼ＋ディスパーゼ。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３。アスタリスクは、機械的解離とその他の分離法との間の生存率における統計的有意差を表す；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析）。FIG. 2 shows average viability after isolation of primary cholangiocytes by various methods. C+D: collagenase + dispase. Error bars indicate standard deviation; n=3. Asterisks represent statistically significant differences in survival between mechanical dissociation and other separation methods; *** P<0.001, *** P<0.0001 (Dunnett for multiple comparisons) one-way ANOVA with correction for ). ＥＣＯの取得のための機械的「スクレイピング」法の概略図を示す。Figure 2 shows a schematic of the mechanical "scraping" method for ECO acquisition. 様々な成長因子との７日間の培養後に得られる細胞の平均数を示す図である。ＥＧＦ：上皮成長因子、Ｒ：Ｒ－スポンジン、Ｄ：ＤＫＫ－１、ＩＬ６：インターロイキン－６、ＨＧＦ：肝細胞成長因子、ＶＥＧＦ：血管内皮成長因子、ＦＢＳ：ウシ胎児血清、Ｆ２：線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２、Ｆ７：ＦＧＦ－７、Ｆ１０：ＦＧＦ－１０、Ａ：アクチビン－Ａ、ＳＢ：アクチビン阻害剤ＳＢ－４３１５４２。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３。アスタリスクは、Ｅ＋Ｒ＋Ｄとその他の培養条件との間での、得られる細胞の数における統計的有意差を表す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析）。FIG. 4 shows the average number of cells obtained after 7 days of culture with various growth factors. EGF: epidermal growth factor, R: R-spondin, D: DKK-1, IL6: interleukin-6, HGF: hepatocyte growth factor, VEGF: vascular endothelial growth factor, FBS: fetal bovine serum, F2: fibroblast Growth factor (FGF) 2, F7: FGF-7, F10: FGF-10, A: Activin-A, SB: Activin inhibitor SB-431542. Error bars indicate standard deviation; n=3. Asterisks represent statistically significant differences in the number of cells obtained between E+R+D and other culture conditions ( *** P<0.0001; one-way with Dunnett's correction for multiple comparisons Analysis of variance). 種々の培養条件下で７日間にわたり成長させた分離したての初代胆管細胞の代表的なライブイメージを示す図である。ＥＧＦ：上皮成長因子。スケールバー：５００μｍ。FIG. 4 shows representative live images of freshly isolated primary cholangiocytes grown under various culture conditions for 7 days. EGF: epidermal growth factor. Scale bar: 500 μm. ポジティブコントロールとして使用されるＲ－スポンジン単独又はＲスポンジン及びＧＳＫ－３阻害剤ＣＨＩＲ ９９０２１（ＣＨＩＲ）と比較した、Ｒ－スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯにおけるリン酸化β－カテニンのレベルの増加を示す定量的ウェスタンブロット分析を示す図である。Shows increased levels of phosphorylated β-catenin in ECOs treated with R-spondin and DKK compared to R-spondin alone or R-spondin and the GSK-3 inhibitor CHIR 99021 (CHIR) used as a positive control. Quantitative Western blot analysis. Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３２、Ｒ－スポンジン単独、Ｒ－スポンジン及びＧＳＫ－３阻害剤ＣＨＩＲ ９９０２１、又はＲ－スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯにおけるＲｈｏキナーゼ活性のアッセイを示す図である。精製されたＲｈｏＫは、参照のために含まれる。これは、Ｒ－スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯが、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達／ＰＣＰ経路の活性化と一致するＲｈｏキナーゼ活性の増加を示すことを裏付けている。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析；ｎ＝３。FIG. 3 shows assays of Rho kinase activity in ECOs treated with Rho kinase inhibitor Y-27632, R-spondin alone, R-spondin and GSK-3 inhibitor CHIR 99021, or R-spondin and DKK. Purified RhoK is included for reference. This confirms that ECOs treated with R-spondin and DKK show increased Rho kinase activity consistent with activation of the non-canonical Wnt signaling/PCP pathway. Error bars indicate standard deviation; *** P<0.0001; one-way ANOVA with Dunnett's correction for multiple comparisons; n=3. 胆嚢及び総胆管のブラッシングからのＥＣＯの取得方法の概略図を示す。Figure 2 shows a schematic of the method of obtaining ECO from gallbladder and common bile duct brushings. ネガティブコントロールとして使用される分離したての初代胆管細胞（ＰＣ）及び胚性幹（ＥＳ）細胞と比較した、１代継代（Ｐ１）、１０代継代（Ｐ１０）及び２０代継代（Ｐ２０）のＥＣＯにおける胆管マーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）の結果を示す図である（ｎ＝４つのＥＣＯ系統）。中心線、中央値；ボックス、四分位範囲（ＩＱＲ）；ひげ、範囲（最小から最大まで）。値はハウスキーピング遺伝子のヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）を基準とする。Passage 1 (P1), passage 10 (P10) and passage 20 (P20) compared to freshly isolated primary cholangiocytes (PC) and embryonic stem (ES) cells used as negative controls. ) shows the results of quantitative real-time PCR (QPCR) of bile duct markers in ECOs of ECO (n=4 ECO lines). Centerline, median; box, interquartile range (IQR); whiskers, range (minimum to maximum). Values are based on the housekeeping gene hydroxymethylvilane synthase (HMBS). 初代胆管細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ）、２０代継代ＥＣＯ（ＥＣＯ）、ｈＩＰＳＣ由来の肝内胆管細胞様細胞（ｉＣｈｏＬＣ）、ＥＳ細胞（ＥＳ）及び肝細胞（ＨＥＰ）のトランスクリプトームを比較するユークリッド階層的クラスター分析を示す図である。各プローブについて、標準スコア（ｚ－スコア）は、全ての試料にわたる平均レベルからの標準偏差の数で測定された発現差異を示している。ＥＣＯ、初代胆管細胞又は両方の細胞型において発現された遺伝子のクラスターが示されている。Euclidean hierarchy comparing transcriptomes of primary cholangiocytes (Primary), passage 20 ECO (ECO), hIPSC-derived intrahepatic cholangiocyte-like cells (iChoLC), ES cells (ES) and hepatocytes (HEP) FIG. 13 illustrates cluster analysis; For each probe, the standard score (z-score) indicates the differential expression measured in number of standard deviations from the mean level across all samples. Clusters of genes expressed in ECO, primary cholangiocytes or both cell types are indicated. ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルによって阻害される、ＥＣＯの内腔におけるＭＤＲ１蛍光性基質のローダミン１２３の分泌を示す図である。スケールバー、１００μｍ。FIG. 2 shows secretion of the MDR1 fluorogenic substrate rhodamine 123 in the lumen of ECOs, which is inhibited by the MDR1 inhibitor verapamil. Scale bar, 100 μm. 播種したての初代胆管細胞（Ｒｈｏ ＰＣ）、２０代継代ＥＣＯ（Ｒｈｏ Ｐ２０）及びベラパミルで処理されたＰ２０のＥＣＯ（Ｖｅｒ）における、バックグラウンドに対して正規化された平均腔内ローダミン１２３蛍光強度を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝全体で１５６５の測定。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定。Mean intraluminal rhodamine 123 fluorescence normalized to background in freshly plated primary cholangiocytes (Rho PC), passage 20 ECOs (Rho P20) and verapamil-treated P20 ECOs (Ver) FIG. 4 is a diagram showing intensity; Error bars indicate standard deviation; n=1565 measurements overall. *** P<0.001, Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for multiple comparisons. フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が負荷されたコントロールと比較した、胆汁酸の移動が確認される蛍光性胆汁酸コリル－リジル－フルオレセイン（ＣＬＦ）の内腔排出を示す図である。スケールバー、１００μｍ。FIG. 11 shows luminal excretion of the fluorescent bile acid cholyl-lysyl-fluorescein (CLF) confirming bile acid mobilization compared to controls loaded with fluorescein isothiocyanate (FITC). Scale bar, 100 μm. ＦＩＴＣが負荷された播種したての初代胆管細胞（ＦＩＴＣ）、ＣＬＦで負荷された播種したての初代胆管細胞（ＣＬＦ ＰＣ）及びＣＬＦが負荷された２０代継代ＥＣＯ（ＣＬＦ ＰＣ２０）における、バックグラウンドに対して正規化された平均腔内蛍光強度を示す図である。ｎ＝全体で１９４７の測定。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１；多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定。In FITC-loaded freshly plated primary cholangiocytes (FITC), CLF-loaded freshly seeded primary cholangiocytes (CLF PC) and CLF-loaded passage 20 ECOs (CLF PC20). FIG. 4 shows mean intraluminal fluorescence intensity normalized to ground. n=1947 measurements in total. Error bars indicate standard deviation; *** P<0.001; Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for multiple comparisons. Ｐ２０ ＥＣＯ及び播種したてのＰＣの平均γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性を示す図である；エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析。Mean γ-glutamyltransferase (GGT) activity of P20 ECOs and freshly seeded PCs; error bars indicate standard deviation; n=3; *** P<0.001; One-way ANOVA with Dunnett's correction for . セクレチン又はセクレチン及びソマトスタチンで処理されたＥＣＯの平均直径測定を示す図である（ｎ＝８）。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＃Ｐ＞０．０５（多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定）。Mean diameter measurements of ECOs treated with secretin or secretin and somatostatin (n=8). Error bars indicate standard deviation; *** P<0.001;#P>0.05 (Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for multiple comparisons). ＥＣＯとして成長した初代胆管細胞（ＥＣＯ）と比較した、単層として播種された初代胆管細胞（２Ｄ）の成長曲線を示す図であり、こうして２Ｄの胆管細胞は数代の継代後に増殖を止めることが裏付けられる。同じ数の細胞（５×１０５）から出発して、２Ｄの胆管細胞は、ＰＧＡ足場に播種するのに必要とされる細胞数（１０７個の細胞）を提供することができない。FIG. 4 shows growth curves of primary cholangiocytes (2D) seeded as a monolayer compared to primary cholangiocytes (ECOs) grown as ECO, thus 2D cholangiocytes stop proliferating after several passages. This is supported. Starting from the same number of cells (5×10 5 ), cholangiocytes in 2D cannot provide the number of cells (10 7 cells) required to seed the PGA scaffold. ２Ｄの胆管細胞が増殖してＰＧＡ足場に定着することができず、注入部位に限定されたままであることを裏付ける明視野画像を示す。単一細胞に解離されたＥＣＯが定着した足場（ＥＣＯ－ＳＣ）の明視野画像は、ポジティブコントロールとして提供される。その足場には、２Ｄの胆管細胞足場と同じ数の細胞が播種され、それと同じ時間にわたり培養された。スケールバー：１００μｍ。2D shows brightfield images confirming that 2D cholangiocytes cannot proliferate and colonize the PGA scaffold and remain confined to the injection site. Bright field images of scaffolds populated with ECO dissociated into single cells (ECO-SC) serve as a positive control. The scaffold was seeded with the same number of cells as the 2D cholangiocyte scaffold and cultured for the same time. Scale bar: 100 μm. ＥＣＯを使用する肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）マウスモデルにおける胆管再建のために使用される方法の概略図を示す。FIG. 2 shows a schematic of the method used for bile duct reconstruction in the extrahepatic bile duct injury (EHBI) mouse model using ECO. ＥＣＯを使用するＥＨＢＩマウスモデルにおける胆管再建後のカプラン・マイヤー生存分析を示す図であり、こうして、無細胞足場（足場のみ）ではなくＥＣＯが定着した足場（被移植）により胆管再建した後のＥＨＢＩマウスのレスキューが裏付けられる。＊＊Ｐ＜０．０１（ログ・ランク検定）。FIG. 12 shows Kaplan-Meier survival analysis after bile duct reconstruction in the EHBI mouse model using ECO, thus EHBI after bile duct reconstruction with ECO-populated scaffolds (implanted) rather than acellular scaffolds (scaffold only). Mouse rescue is supported. ** P<0.01 (log-rank test). 無細胞ＰＧＡ足場（足場のみ）、ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場（被移植）により再建された胆嚢及び天然の未再建胆嚢コントロール（移植なし）を示す図であり、こうしてＥＣＯが定着した足場による完全再建が裏付けられる。ＣＤ：胆嚢管、ＣＢＤ：総胆管、ＣＨＤ：総肝管、Ｆ：底部、Ａ：前面、Ｐ：後面。スケールバー、５００μｍ。FIG. 12 shows gallbladder reconstructed with acellular PGA scaffold (scaffold only), ECO-populated PGA scaffold (implanted) and native unreconstructed gallbladder control (no implant), thus complete reconstruction with ECO-populated scaffold. is backed up. CD: cystic duct, CBD: common bile duct, CHD: common hepatic duct, F: bottom, A: anterior surface, P: posterior surface. Scale bar, 500 μm. 被移植のＥＣＯが定着した足場の無作為に選択された断面で定量化されたＣＫ１９陽性／ＣＫ７陽性、ＣＫ１９陽性／ＧＦＰ陽性、及びＶＩＭ／ＧＦＰ陽性の細胞の比を示す図である（ｎ＝１８）。エラーバーは、標準偏差を表す。FIG. 2 shows ratios of CK19-positive/CK7-positive, CK19-positive/GFP-positive, and VIM/GFP-positive cells quantified in randomly selected cross-sections of implanted ECO-populated scaffolds (n= 18). Error bars represent standard deviation. ＥＣＯ集団のための高密度化コラーゲン管状足場の作製に使用される方法の概略図を示す。FIG. 11 shows a schematic of the method used to create densified collagen tubular scaffolds for the ECO population. ＧＦＰ陽性ＥＣＯが定着した管のその作製後の最大強度投影画像（左）と、ＥＣＯが定着したコラーゲン管の内腔開通性を示す共焦点顕微鏡写真（右）とを示す。スケールバー、３０μｍ。A maximum intensity projection image of a GFP-positive ECO-populated tube after its fabrication (left) and a confocal micrograph (right) showing the luminal patency of an ECO-populated collagen tube are shown. Scale bar, 30 μm. ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管を使用する胆管置換の方法の概略図を示す。FIG. 2 shows a schematic of a method of bile duct replacement using ECO-populated densified collagen ducts. ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管及び線維芽細胞が定着した高密度化コラーゲン管のヘマトキシリン及びエオシン染色並びに免疫蛍光分析を示す図であり、こうしてＥＣＯ管においてＧＦＰ陽性／ＣＫ１９陽性の上皮により裏打ちされた胆管上皮及び開存内腔が存在するが、内腔が閉塞した線維芽細胞構築物には存在しないことが裏付けられる。Hematoxylin and eosin staining and immunofluorescence analysis of ECO-populated and fibroblast-populated densified collagen ducts, thus lined by GFP-positive/CK19-positive epithelium in ECO ducts. It confirms the presence of a biliary epithelium and a patent lumen, but not in the lumen-occluded fibroblastic constructs. ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管及び線維芽細胞が定着した高密度化コラーゲン管を使用する胆管置換のＦＩＴＣ胆管造影図を示し、こうして線維構造物における内腔閉塞と比較したＥＣＯ管における内腔開通性が裏付けられる。スケールバー、１００μｍ（ＥＣＯ）及び５００μｍ（線維芽細胞）。FITC cholangiography of bile duct replacement using ECO-populated densified collagen ducts and fibroblast-populated densified collagen ducts, thus showing lumen in ECO ducts compared to lumen occlusion in fibrous constructs. Patency is supported. Scale bars, 100 μm (ECO) and 500 μm (fibroblasts). 本明細書に記載される肝外胆管細胞オルガノイドを作製する方法を使用することで、肝臓全体、生検組織又はＥＰＣＡＭソーティングされた肝内胆管細胞からも肝内胆管細胞オルガノイド（ＩＣＯ）を取得し得ることを裏付ける明視野画像を示す。Ｐ０、Ｐ２０：０代継代、２０代継代。Intrahepatic cholangiocyte organoids (ICOs) were also obtained from whole liver, biopsy tissue, or EPCAM-sorted intrahepatic cholangiocytes using the methods of making extrahepatic cholangiocyte organoids described herein. Bright field images are shown to support the acquisition. P0, P20: 0 passages, 20 passages. ＩＣＯによる肝系譜マーカーの不存在下での重要な胆管マーカーの発現を実証することにより、この集団が均質であることが確認されるＱＰＣＲ分析を示す図である。ハウスキーピング遺伝子発現の倍率変化は、マーカーＣＫ１９、ＣＫ７、ＳＯＸ９、ＣＦＴＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＧＴ、ＡＬＢ、Ａ１ＡＴ及びＨＮＦ４Ａについて示されている。QPCR analysis confirms the homogeneity of this population by demonstrating expression of key bile duct markers in the absence of hepatic lineage markers by ICO. Fold changes in housekeeping gene expression are shown for markers CK19, CK7, SOX9, CFTR, EPCAM, GGT, ALB, A1AT and HNF4A. ＩＣＯがアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すためＩＣＯが機能的であることを示す図である。FIG. 4 shows that ICOs are functional as they exhibit alkaline phosphatase (ALP) activity. ＩＣＯがγ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性を示すためＩＣＯが機能的であることを示す図である。FIG. 4 shows that ICOs are functional as they exhibit γ-glutamyltransferase (GGT) activity. ベラパミルの存在下で阻害される（左下）ＩＣＯによるローダミン１２３の内腔蓄積（左上）及び蛍光性胆汁酸のＣＬＦの内腔***（右下）によって示されるように、ＩＣＯが薬物を輸送し得るためＩＣＯが機能的であることを裏付ける図である。ICO can transport the drug as shown by luminal accumulation of rhodamine 123 by ICO (top left) and luminal excretion of fluorescent bile acids by CLF (bottom right), which is inhibited in the presence of verapamil (bottom left). FIG. 10 is a diagram that proves that ICO is functional. ＣＯの単一細胞ＲＮＡシーケンシングの特性を示す図であり、これは、胆管細胞オルガノイド（ＥＣＯ及びＩＣＯ）が、それらの元の組織とは免疫遺伝子を含む特定の因子の発現について異なることを示している。胆管系の種々の領域からの胆管細胞オルガノイドを初代胆管細胞と比較するＰＣＡプロットが示されている。左のパネルは、細胞型に基づくアノテーション（オルガノイド対初代）を示す。右のパネルは、元の領域に基づくアノテーションを示す（ＣＢＤ：総胆管、ＧＢ：胆嚢、及びＩＨＤ：肝内）。FIG. 10. Characterization of single-cell RNA sequencing of CO, showing that cholangiocyte organoids (ECO and ICO) differ from their tissue of origin in the expression of specific factors, including immune genes. ing. PCA plots are shown comparing cholangiocyte organoids from various regions of the biliary system with primary cholangiocytes. Left panel shows annotation based on cell type (organoid vs. primary). The right panel shows annotations based on original regions (CBD: common bile duct, GB: gallbladder, and IHD: intrahepatic). 胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）と初代胆管細胞との間での遺伝子発現の差異を裏付けるヒートマップを示す。表示遺伝子は、右側に示されている。Heatmaps demonstrating differences in gene expression between cholangiocyte organoids (CO) and primary cholangiocytes are shown. Displayed genes are shown on the right.

本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む細胞培養培地（「増殖培地」と呼称する）を使用する初代胆管細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に関する。本明細書に記載されるように増殖された胆管細胞は、例えば再生医療及びスクリーニングにおいて有用であり得る。 The present invention uses a cell culture medium (referred to as "growth medium") containing epidermal growth factor (EGF), a canonical Wnt signaling inhibitor, and a non-canonical Wnt signaling enhancer. for the in vitro proliferation of Bile duct cells expanded as described herein may be useful, for example, in regenerative medicine and screening.

胆管細胞は、胆管系の内腔表面を覆う単層である胆管組織の上皮由来の細胞である。胆管細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで胆汁分泌及び電解質輸送に重要な役割を担う。 Bile duct cells are cells derived from the epithelium of biliary tissue, the monolayer that lines the luminal surface of the biliary system. Bile duct cells play an important role in bile secretion and electrolyte transport in vivo.

初代胆管細胞は、胆管又は胆嚢等の肝内又は肝外胆管組織の上皮から直接分離され、連続（人工的に不死化された）胆管細胞系統とは異なる。初代胆管細胞は、肝内又は肝外胆管細胞であり得る。 Primary cholangiocytes are isolated directly from the epithelium of intrahepatic or extrahepatic bile duct tissue, such as the bile duct or gallbladder, and are distinct from continuous (artificially immortalized) cholangiocyte lineages. Primary cholangiocytes can be intrahepatic or extrahepatic cholangiocytes.

本明細書に記載される使用のための初代胆管細胞は、哺乳動物、好ましくはヒトである。初代胆管細胞は、成人又は小児のドナーから取得され得る。 Primary cholangiocytes for use as described herein are mammalian, preferably human. Primary cholangiocytes can be obtained from adult or pediatric donors.

初代胆管細胞の集団は、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞を含まない。上記集団における初代胆管細胞の分化能力は、その起源の系譜に限定されており、肝細胞又は膵臓細胞等のその他の系譜の細胞へと分化することはできない（すなわち、上記集団は、胆管細胞及び胆管細胞前駆体からなる）。 A population of primary cholangiocytes does not contain stem cells or other pluripotent or multipotent cells. The differentiation capacity of primary cholangiocytes in the population is restricted to their lineage of origin and cannot differentiate into cells of other lineages such as hepatocytes or pancreatic cells (i.e., the population is composed of cholangiocytes and consisting of cholangiocyte precursors).

幾つかの実施形態では、初代胆管細胞は、癌性細胞であり得て、該細胞は、例えば薬物スクリーニングにおいて有用であり得る。 In some embodiments, primary cholangiocytes can be cancerous cells, which can be useful in drug screening, for example.

初代胆管細胞は、本明細書に記載される方法において初代胆組織から取得若しくは分離されてもよく、又は初代胆組織から以前に取得されたものであってもよい。適切な胆組織は、胆嚢、並びに総胆管（ＣＢＤ）、胆嚢管、総肝管、右肝管、左肝管、肝内管及び膵管を含む、肝膵胆管（ＨＰＢ）、膵胆管（ＰＢ）又は胆管系の任意の部分からの胆管を含み得る。初代胆組織は、例えば、肝外植片、肝組織、肝生検材料、胆管切除物、胆嚢摘出物又は膵臓切除物から取得され得る。 Primary cholangiocytes may be obtained or isolated from primary bile tissue in the methods described herein, or may have been previously obtained from primary bile tissue. Suitable bile tissues include gallbladder and hepatopancreatic bile duct (HPB), pancreatic bile duct (PB) including common bile duct (CBD), cystic duct, common hepatic duct, right hepatic duct, left hepatic duct, intrahepatic duct and pancreatic duct. or may contain bile ducts from any part of the biliary system. Primary bile tissue can be obtained, for example, from a liver explant, liver tissue, liver biopsy, bile duct resection, cholecystectomy, or pancreatic resection.

幾つかの好ましい実施形態では、胆管細胞は、肝外胆管細胞である。肝外胆管細胞は、肝外胆管系の胆管上皮に由来し、胆嚢、胆嚢管、総胆管又は総肝管等の肝外胆組織から取得され得る。 In some preferred embodiments, the cholangiocytes are extrahepatic cholangiocytes. Extrahepatic cholangiocytes are derived from the biliary epithelium of the extrahepatic biliary system and can be obtained from extrahepatic bile tissue such as the gallbladder, cystic duct, common bile duct or common hepatic duct.

他の実施形態では、胆管細胞は、肝内胆管細胞である。肝内胆管細胞は、肝内胆管系の胆管上皮に由来する。 In other embodiments, the cholangiocytes are intrahepatic cholangiocytes. Intrahepatic cholangiocytes are derived from the biliary epithelium of the intrahepatic biliary system.

胆管細胞が得られる元の初代胆組織は、ドナー個体においてｉｎ ｓｉｔｕであっても、又は例えば胆管切除、肝切除若しくは移植、膵臓切除、胆道鏡検査若しくは胆嚢摘出等の手術若しくは解剖後にドナー個体から以前に取得された組織試料であってもよい。適切な組織は、使用前に保存液中に貯蔵され得る。 The primary bile tissue from which the cholangiocytes are obtained may be obtained from the donor individual either in situ, or after surgery or dissection, such as cholangiectomy, hepatectomy or transplantation, pancreatic resection, cholangioscopy or cholecystectomy. It may be a previously obtained tissue sample. Suitable tissue may be stored in a preservation solution prior to use.

胆管細胞の集団は、任意の適切な技術によって初代胆組織から取得され得る。幾つかの実施形態では、初代胆細胞の集団を取り外すために、例えばブラッシング又はスクレイピングによる初代胆組織の機械的解離等の周術期技術が使用され得る。他の実施形態では、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）ブラッシング等の侵襲が最小限の技術が使用され得る。 A population of cholangiocytes can be obtained from primary bile tissue by any suitable technique. In some embodiments, perioperative techniques such as mechanical dissociation of primary bile tissue by brushing or scraping, for example, may be used to remove populations of primary bile cells. In other embodiments, minimally invasive techniques such as endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) brushing may be used.

幾つかの実施形態では、胆管細胞の集団は、肝生検材料又は外植組織の機械的解離により、例えば、本明細書に記載される培養条件での組織の小（例えば、ミリメートル未満）切片をＨＧＦ及びフォルスコリン等の因子を添加して又はそれらの因子を添加せずに播種することにより取得され得る。あるいは肝組織、胆嚢及び胆管外植片は、機械的解離（スクレイピング／ダイシング）とリベラーゼ、コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼ等のマトリックス消化酵素を使用する酵素的消化との組み合わせを使用して、単一の初代細胞又は小塊へと解離され得る。引き続き、単一の初代細胞は、ＥＰＣＡＭ等の胆管マーカーに対する抗体で標識され、磁気関連細胞ソーティング又は蛍光関連細胞ソーティング（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）等の免疫単離法で分離され得る。 In some embodiments, cholangiocyte populations are obtained by mechanical dissociation of liver biopsies or explanted tissue, e.g., into small (e.g., sub-millimeter) sections of tissue under the culture conditions described herein. can be obtained by seeding with or without the addition of factors such as HGF and forskolin. Alternatively, liver tissue, gallbladder and bile duct explants were isolated to single primary cells using a combination of mechanical dissociation (scraping/dicing) and enzymatic digestion using matrix digestive enzymes such as liberase, collagenase or hyaluronidase. or may be dissociated into nodules. Subsequently, single primary cells can be labeled with antibodies against bile duct markers such as EPCAM and isolated by immunoisolation methods such as magnetically-associated cell sorting or fluorescence-associated cell sorting (MACS or FACS).

分離された単一細胞は、本明細書に記載される３Ｄ培養条件を使用して播種され得るか、又は単一細胞ＲＮＡシーケンシングのために処理され得る。本明細書におけるデータは、本明細書に記載される３Ｄ培養条件で、胆管細胞オルガノイドが選択的に増殖することを示している。肝細胞等のその他の肝細胞型はこれらの条件で成長しない。これは、例えば、肝マーカーの下方調節により示され得る（図２８）。 Isolated single cells can be seeded using the 3D culture conditions described herein or processed for single-cell RNA sequencing. The data herein demonstrate that cholangiocyte organoids selectively proliferate in the 3D culture conditions described herein. Other hepatocyte types, such as hepatocytes, do not grow in these conditions. This can be shown, for example, by down-regulation of liver markers (Figure 28).

初代胆組織は、健康な個体又は疾患モデリングを可能にすることが知られる病理を有する患者に由来し得る。 Primary bile tissue can be derived from healthy individuals or patients with pathologies known to permit disease modeling.

胆管障害を伴う個体に由来する胆管細胞を使用することで、胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を示す増殖された集団を作製することができる。胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞を生成する方法は、
胆管障害を伴う個体由来の初代胆管細胞の集団を準備することと、
本明細書に記載されるように初代胆管細胞を増殖させることと、
それにより胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞の集団を生成することと、
を含み得る。 Bile duct cells derived from individuals with biliary disorders can be used to generate expanded populations exhibiting genotypes or phenotypes associated with biliary disorders. A method of generating cholangiocytes having a genotype or phenotype associated with biliary disorders comprises:
providing a population of primary cholangiocytes from an individual with a biliary disorder;
growing primary cholangiocytes as described herein;
thereby generating a population of cholangiocytes having a genotype or phenotype associated with cholangiopathy;
can include

胆管障害に関連する表現型を有する増殖された集団は、胆管障害の１つ以上の特徴を示し得る。幾つかの実施形態では、胆管障害の１つ以上の特徴は、特定の条件又は処理に応答して示され得る。例えば、胆管細胞を１種以上のその他の細胞型と共培養することで、胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。例えば、胆管細胞をＴ細胞等の免疫細胞と共培養することで、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）等の自己免疫性胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。 An expanded population with a phenotype associated with biliary disorders may exhibit one or more characteristics of biliary disorders. In some embodiments, one or more characteristics of biliary disorders may be exhibited in response to a particular condition or treatment. For example, co-culturing cholangiocytes with one or more other cell types can induce a phenotype associated with cholangiopathy. For example, co-culturing cholangiocytes with immune cells such as T cells can induce phenotypes associated with autoimmune cholangiopathies such as primary biliary cirrhosis (PBC).

生成されたら、胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、例えばスクリーニングで使用するために培養、増殖及び維持され得る。 Once generated, cholangiocytes having a phenotype associated with cholangiopathy can be cultured, expanded and maintained, eg, for use in screening.

胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、胆管障害の１つ以上の特性、特徴又は病理を示し得る。 Bile duct cells having a phenotype associated with cholangiopathy may exhibit one or more properties, characteristics or pathologies of cholangiopathy.

増殖培地は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）の形の肝外胆管細胞の増殖に対応する細胞培養培地である。 A growth medium is a cell culture medium that accommodates the growth of extrahepatic cholangiocytes in the form of organoids (cholangiocyte organoids).

増殖培地は、ＥＧＦと、古典的Ｗｎｔ阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ増強剤とを含む栄養培地である。 The growth medium is a nutrient medium containing EGF, classical Wnt inhibitors and non-classical Wnt enhancers.

非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を刺激、促進又は増加させる化合物である。 A non-canonical Wnt signaling potentiator is a compound that stimulates, enhances or increases the activity of the non-canonical Wnt signaling pathway.

非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、脊椎動物における組織極性及び形態発生過程に関与するβ－カテニン非依存性経路である（Komiya, Y. & Habas, R. Organogenesis 4, 68-75 (2008)；Patel, V. et al.. Hum. Mol. Genet. 17, 1578-1590 (2008)；Strazzabosco, M. & Somlo, S. Gastroenterology 140, (2011)）。 The non-canonical Wnt signaling pathway is a β-catenin-independent pathway involved in tissue polarity and morphogenesis processes in vertebrates (Komiya, Y. & Habas, R. Organogenesis 4, 68-75 (2008); Patel, V. et al.. Hum. Mol. Genet. 17, 1578-1590 (2008); Strazzabosco, M. & Somlo, S. Gastroenterology 140, (2011)).

非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素としては、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１、ＬＲＰ５／６、Ｄｓｈ、Ｆｚ、Ｄａａｍ１、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｐｒｉｃｋｌｅ及びＳｔｒａｂｉｓｍｕｓが挙げられる。非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＡＴＦ－２に基づくレポーターアッセイ（Ohkawara et al (2011) Dev Dyn 240 (1) 188-194）及びＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）に基づくアッセイが挙げられる。 Components of the non-canonical Wnt signaling pathway include Wnt4, Wnt5a, Wnt11, LRP5/6, Dsh, Fz, Daam1, Rho, Rac, Prickle and Strabismus. Suitable methods for measuring activity of the non-canonical Wnt/PCP signaling pathway are well known in the art and include the ATF-2-based reporter assay (Ohkawara et al (2011) Dev Dyn 240 (1 ) 188-194) and Rho-associated protein kinase (ROCK)-based assays.

非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を選択的に増強し得るか、又はより好ましくは、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達の経路の両方を増強し得る（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト）。 A non-canonical Wnt signaling enhancing agent may selectively enhance non-canonical Wnt signaling, or more preferably both non-canonical Wnt signaling and canonical Wnt signaling pathways. (ie Wnt signaling agonists).

好ましい非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤としては、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストのＲ－スポンジンが挙げられる。 Preferred non-classical Wnt signaling potentiators include the Wnt signaling agonists R-spondin.

Ｒ－スポンジンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を正に制御する２つのシステインリッチのフリン様ドメインと１つのトロンボスポンジン１型ドメインとを有する分泌性活性化タンパク質である。好ましくは、Ｒ－スポンジンは、ヒトＲ－スポンジンである。 R-spondins are secretory activating proteins with two cysteine-rich furin-like domains and a thrombospondin type 1 domain that positively regulate the Wnt signaling pathway. Preferably, the R-spondin is human R-spondin.

Ｒ－スポンジンとしては、ＲＳＰＯ１（遺伝子ＩＤ２８４６５４ 核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０３８６３３．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０３３７２２．１）、ＲＳＰＯ２（遺伝子ＩＤ３４０４１９ 核酸配列リファレンスＮＭ＿００１２８２８６３．１、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１２６９７９２．１）、ＲＳＰＯ３（遺伝子ＩＤ８４８７０、核酸配列リファレンスＮＭ＿０３２７８４．４、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿１１６１７３．２）又はＲＳＰＯ４（遺伝子ＩＤ３４３６３７、核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０２９８７１．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０２５０４２．２）が挙げられ得る。 R-spondins include RSPO1 (gene ID 284654 nucleic acid sequence reference NM_001038633.3, amino acid sequence reference NP_001033722.1), RSPO2 (gene ID 340419 nucleic acid sequence reference NM_001282863.1, amino acid sequence reference NP_001269792.1), RSPO3 (gene ID 84870, nucleic acid sequence reference sequence reference NM_032784.4, amino acid sequence reference NP_116173.2) or RSPO4 (gene ID 343637, nucleic acid sequence reference NM_001029871.3, amino acid sequence reference NP_001025042.2).

Ｒ－スポンジンは、商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞を増殖させるために適したＲ－スポンジンの濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌ、好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌのＲ－スポンジンを含み得る。 R-spondin is readily available from commercial suppliers (eg, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Suitable concentrations of R-spondin for growing the cholangiocytes described herein can be readily determined using standard techniques. For example, the growth medium can contain 50 ng/ml to 5 μg/ml of R-spondin, preferably about 500 ng/ml.

古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を阻害、遮断又は減少させる化合物である。 A canonical Wnt signaling inhibitor is a compound that inhibits, blocks or reduces the activity of the canonical Wnt signaling pathway.

古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、遺伝子発現の調節に関与するβ－カテニン依存性経路である（Klaus et al Nat. Rev. Cancer (2008) 8 387-398、Moon et al (2004) Nat. Rev. Genet. 5 691-701、Niehrs et al Nat Rev Mol. Cell Biol. (2012) 13 763-779）。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＴＯＰ－ｆｌａｓｈアッセイ（Molenaar et al Cell. 1996 Aug 9; 86(3):391-9）及びβ－カテニンのためのアッセイが挙げられる。 The canonical Wnt signaling pathway is a β-catenin-dependent pathway involved in the regulation of gene expression (Klaus et al Nat. Rev. Cancer (2008) 8 387-398, Moon et al (2004) Nat. Rev. Genet. 5 691-701, Niehrs et al Nat Rev Mol. Cell Biol. (2012) 13 763-779). Suitable methods for measuring activity of the canonical Wnt signaling pathway are well known in the art and include the TOP-flash assay (Molenaar et al Cell. 1996 Aug 9; 86(3):391-9). ) and assays for β-catenin.

適切な古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１～４（ＤＫＫ１～４）、Ｓｏｇｇｙ－１／Ｄｋｋｌ１、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１～５（ｓＦＲＰ１～５）、Ｗｎｔ阻害因子－１（ＷＩＦ－１）、ドラキシン、ＳＯＳＴ／スクレロスチン、ＩＧＦＢＰ－４、ＵＳＡＧ１及びＮｏｔｕｍが挙げられる。 Suitable classical Wnt signaling inhibitors include Dickkopf-related proteins 1-4 (DKK1-4), Soggy-1/Dkkl1, secretory Frizzled-related proteins 1-5 (sFRP1-5), Wnt inhibitor-1 ( WIF-1), draxin, SOST/sclerostin, IGFBP-4, USAG1 and Notum.

好ましくは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ＤＫＫ－１である。ＤＫＫ－１（遺伝子ＩＤ２２９４３ 核酸配列リファレンスＮＭ＿０１２２４２．２、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿０３６３７４．１）は、胚形成に役割を果たす２つのシステインリッチ領域を有する分泌性タンパク質である。ＤＫＫ－１は、商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＤＫＫ－１の濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ－１を含み得る。 Preferably, the classical Wnt signaling inhibitor is DKK-1. DKK-1 (gene ID 22943 nucleic acid sequence reference NM_012242.2, amino acid sequence reference NP_036374.1) is a secreted protein with two cysteine-rich regions that play a role in embryogenesis. DKK-1 is readily available from commercial suppliers (eg, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Suitable concentrations of DKK-1 for growing the cholangiocyte organoids described herein can be readily determined using standard techniques. For example, the growth medium may contain DKK-1 from 10 ng/ml to 1 μg/ml, such as about 100 ng/ml.

上皮成長因子（ＥＧＦ；ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：１９５０、核酸配列ＮＭ＿００１１７８１３０．１ ＧＩ：２９６０１１０１２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１ ＧＩ：２９６０１１０１３）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することにより、細胞の成長、増殖及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。ＥＧＦは、通常の組み換え技術を使用して製造することができるか、又は商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス；Stemgent Inc社、米国）から得ることができる。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＥＧＦの濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、２ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含み得る。 Epidermal growth factor (EGF; NCBI Gene ID: 1950, nucleic acid sequence NM_001178130.1 GI: 296011012; amino acid sequence NP_001171601.1 GI: 296011013) regulates cell growth, A protein factor that stimulates proliferation and cell differentiation. EGF can be produced using conventional recombinant techniques or obtained from commercial sources (eg, R&D Systems, Minneapolis, MN; Stemgent Inc, USA). Suitable concentrations of EGF for growing the cholangiocyte organoids described herein can be readily determined using standard techniques. For example, the growth medium may contain EGF from 2 ng/ml to 500 ng/ml, preferably about 20 ng/ml.

好ましくは、初代胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。３次元培養の場合に、増殖培地は３次元での細胞の成長及び増殖を支持し、胆管細胞がオルガノイドに集成することを可能にする足場マトリックスを更に含む。 Preferably, the primary cholangiocytes are cultured in three-dimensional culture in growth medium. In the case of three-dimensional culture, the growth medium further contains a scaffolding matrix that supports cell growth and proliferation in three dimensions and allows cholangiocytes to assemble into organoids.

適切な足場マトリックスは、当該技術分野においてよく知られており、ハイドロゲル、例えばコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、圧縮コラーゲン（例えば、ＲＡＦＴ（商標）、TAP Biosystems社）、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、及び合成ポリマーハイドロゲル（Gjorevski et al Nature（2016）539 560-564）、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）ハイドロゲル及び架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh社、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、並びに単離された天然ＥＣＭ足場（Engitix Ltd社、英国、ロンドン）が挙げられる。 Suitable scaffolding matrices are well known in the art and include hydrogels such as collagen, collagen/laminin, compacted collagen (eg RAFT™, TAP Biosystems), alginate, agarose, complex protein hydrogels. , e.g. basement membrane extracts, and synthetic polymer hydrogels (Gjorevski et al Nature (2016) 539 560-564), e.g. polyglycolic acid (PGA) hydrogels and cross-linked dextran and PVA hydrogels (e.g. Cellendes Gmbh, Germany , Reutlingen), inert matrices such as porous polystyrene, and isolated native ECM scaffolds (Engitix Ltd, London, UK).

足場マトリックスは、化学的に定義されたもの、例えばコラーゲン若しくは高密度化コラーゲンハイドロゲル、又は化学的に定義されていないもの、例えば複合タンパク質ハイドロゲルであり得る。好ましくは、増殖培地中の足場マトリックスは、複合タンパク質ハイドロゲルである。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エナクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン等の細胞外マトリックス成分を含み得る。複合タンパク質ハイドロゲルとしては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の細胞外マトリックスタンパク質のハイドロゲルも挙げられ得る。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、商業的供給業者から入手可能であり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Corning Life Sciences社）又はＣｕｌｔｒｅｘ（商標）ＢＭＥ ２ ＲＧＦ（Amsbio（商標）Inc社）が挙げられる。例えば、増殖培地は、６６％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含み得る。 The scaffold matrix can be chemically defined, such as collagen or densified collagen hydrogels, or chemically undefined, such as complex protein hydrogels. Preferably, the scaffold matrix in the growth medium is a complex protein hydrogel. Suitable complex protein hydrogels may include extracellular matrix components such as laminin, collagen IV, enactin and heparin sulfate proteoglycans. Complex protein hydrogels may also include hydrogels of extracellular matrix proteins from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells. Suitable complex protein hydrogels are available from commercial suppliers and include Matrigel™ (Corning Life Sciences) or Cultrex™ BME 2 RGF (Amsbio™ Inc). For example, the growth medium can contain 66% Matrigel™.

増殖培地は、足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）ＤＫＫ－１等の古典的Ｗｎｔ阻害剤、及び（ｉｉｉ）Ｒ－スポンジン等の非古典的Ｗｎｔ増強剤が補充された栄養培地とを含むか又はそれらからなり得る。 The growth medium comprises a scaffold matrix and a nutrient medium supplemented with (i) EGF, (ii) classical Wnt inhibitors such as DKK-1, and (iii) non-classical Wnt enhancers such as R-spondin. may comprise or consist of;

栄養培地は、基礎培地を含み得る。適切な基礎培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、アドバンスト・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Price et al Focus (2003), 25 3-6）、ウィリアムＥ（Williams, G.M. et al Exp. Cell Research, 89, 139-142 (1974)）及びＲＰＭＩ－１６４０（Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508）が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ウィリアムＥ培地、例えば３３％のウィリアムＥ培地が好ましい場合がある。 A nutrient medium may include a basal medium. Suitable basal media include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), Ham's F12, Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) or DMEM/F12 (Price et al Focus (2003), 25 3-6), William E. Cell Research, 89, 139-142 (1974)) and RPMI-1640 (Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508). In some embodiments, Williams E medium, such as 33% Williams E medium, may be preferred.

基礎培地には、培地添加物及び／又は１つ以上の追加成分、例えばトランスフェリン、１－チオグリセロール、脂質、Ｌ－グルタミン若しくはＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（例えば、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標））等の代用物、ニコチンアミド、リノール酸及び亜セレン酸（例えば、ＩＴＳ＋プレミックス）、デキサメタゾン、セレン、ピルビン酸塩、ＨＥＰＥＳ等のバッファー、重炭酸ナトリウム、ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、グルコース並びにペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質、そして任意にポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール及びインスリン、血清アルブミン、又は血清アルブミン及びインスリンが補充され得る。 Base media include media supplements and/or substitutions of one or more additional components such as transferrin, 1-thioglycerol, lipids, L-glutamine or L-alanyl-L-glutamine (eg Glutamax™). nicotinamide, linoleic and selenious acids (e.g. ITS+premix), dexamethasone, selenium, pyruvate, buffers such as HEPES, sodium bicarbonate, phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, glucose and penicillin and Antibiotics such as streptomycin and optionally polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol and insulin, serum albumin, or serum albumin and insulin may be supplemented.

例えば、基礎培地には、１０ｍＭのニコチンアミド、１７ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．２ｍＭの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、６．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１４ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６μｇ／ｍｌのインスリン、６μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、５μｇ／ｍｌのリノール酸、０．１μＭのデキサメタゾン、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充され得る。 For example, the basal medium contains 10 mM nicotinamide, 17 mM sodium bicarbonate, 0.2 mM 2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, 6.3 mM sodium pyruvate, 14 mM glucose, 20 mM HEPES, 6 μg/ml insulin, 6 μg/ml human transferrin, 6 ng/ml selenite, 5 μg/ml linoleic acid, 0.1 μM dexamethasone, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin can be supplemented.

栄養培地は、化学的に定義された基礎栄養培地であり得る。化学的に定義された培地は、規定の成分、好ましくは化学構造が既知の成分のみを含有する細胞培養のための栄養液である。化学的に定義された培地には、未定義の成分、又は未定義の成分を含む構成成分、例えばフィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の複雑な細胞外マトリックスは含まれない。化学的に定義された培地は、ヒト化されていてよい。化学的に定義されたヒト化培地には、非ヒト動物に由来する又は非ヒト動物から単離された成分又は添加物、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びマウスフィーダー細胞は含まれない。コンディショニングされた培地は、培養される細胞からの未定義の成分を含み、化学的に定義されていない。 The nutrient medium may be a chemically defined basal nutrient medium. A chemically defined medium is a nutrient solution for cell culture that contains only defined components, preferably those of known chemical structure. Chemically defined media contain undefined components, or components containing undefined components, such as feeder cells, stromal cells, serum, serum albumin and complex extracellular matrices such as Matrigel™. Not included. A chemically defined medium may be humanized. Chemically defined humanized media include components or additives derived from or isolated from non-human animals, such as fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) and mouse feeder cells. is not included. Conditioned medium contains undefined components from the cells being cultured and is chemically undefined.

適切な化学的に定義された栄養培地は、当該技術分野でよく知られており、ニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、ＩＴＳ＋プレミックス（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸及びリノール酸）、デキサメタゾン、グルタマックス、ペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。 Suitable chemically defined nutrient media are well known in the art and include nicotinamide, sodium bicarbonate, 2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt, sodium pyruvate, glucose, HEPES, ITS+ Williams E medium supplemented with premixes (insulin, transferrin, selenite and linoleic acid), dexamethasone, glutamax, penicillin and streptomycin.

胆管細胞は、増殖培地中で多重継代にわたり培養され得る。例えば、胆管細胞は、１０代以上、２０代以上、３０代以上、４０代以上又は５０代以上の継代にわたり培養され得る。１代継代には、２日間～８日間、好ましくは約５日間かかり得る。 Bile duct cells can be cultured for multiple passages in growth medium. For example, cholangiocytes can be cultured for 10 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more passages. Passage 1 can take from 2 days to 8 days, preferably about 5 days.

胆管細胞は、足場マトリックスを消化し、遠心分離により胆管細胞オルガノイドを採取し、該オルガノイドを個別の胆管細胞に破壊することにより継代され得る。胆管細胞は、増殖培地中で上記のように再懸濁及び培養され、そこで胆管細胞はオルガノイドへと再編する。 Bile duct cells can be passaged by digesting the scaffold matrix, harvesting cholangiocyte organoids by centrifugation, and breaking the organoids into individual cholangiocytes. The cholangiocytes are resuspended and cultured as above in growth medium, where they reorganize into organoids.

細胞培養のために適した技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451、Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293、Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430、Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997)、'Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997)、'Human Embryonic Stem Cells' by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside' by A. Bongso (2005)、Peterson & Loring (2012)Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide Academic Press and 'Human Embryonic Stem Cell Protocols' by K. Turksen (2006)を参照）。その培地及び成分は、商業的供給業者（例えば、Gibco社、Roche社、Sigma社、Europa bioproducts社、R&D Systems社）から取得され得る。標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素が上記培養工程のために使用され得る。培地を、好ましくは２日毎に交換し、細胞は重力により沈降させた。 Techniques suitable for cell culture are well known in the art (e.g. Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451, Human Cell Culture Protocols ( Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293 , Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430, Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997), ' Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997), 'Human Embryonic Stem Cells' by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside' by A. Bongso (2005) ), Peterson & Loring (2012) Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide Academic Press and 'Human Embryonic Stem Cell Protocols' by K. Turksen (2006)). The media and components can be obtained from commercial suppliers (eg Gibco, Roche, Sigma, Europa bioproducts, R&D Systems). Standard mammalian cell culture conditions such as 37° C., 21% oxygen, 5% carbon dioxide can be used for the above culturing steps. Medium was changed preferably every two days and cells were allowed to settle by gravity.

胆管細胞の集団は、本明細書に記載される増殖培地中でオルガノイドとして１０５倍以上、１０１０倍以上、１０１５倍以上、１０２０倍、又は１０３０倍以上に増殖され得る。 A population of cholangiocytes can be expanded 10 5 -fold or more, 10 10 -fold or more, 10 15 -fold or more, 10 20- fold or 10 30 -fold or more as organoids in the growth media described herein.

初代胆管細胞の集団は、増殖培地中で増殖し、オルガノイド（ＣＯ）へと集成する。胆管細胞オルガノイドは、内腔を取り囲み、それを外部環境から隔離する、密着結合により連結された胆管細胞の層を含む３次元多細胞集成体又は嚢胞である。胆管細胞は、ＣＦＴＲ等のマーカーの極性発現を示し得る。 A population of primary cholangiocytes proliferate in growth medium and assemble into organoids (CO). Bile duct cell organoids are three-dimensional multicellular aggregates or cysts containing layers of cholangiocytes connected by tight junctions that surround the lumen and isolate it from the external environment. Bile duct cells can show polar expression of markers such as CFTR.

増殖培地中で胆管細胞により形成されるオルガノイドは、胆管細胞、例えばＣＢＤ胆管細胞等の肝外胆管細胞の形態又は物理的特性を示し得る。オルガノイドは、例えば繊毛、密着結合、微絨毛、エキソソーム及び／又は管状構造を含み得る。オルガノイドの形態及び物理的特性は、標準的な顕微鏡法によって測定され得る。 Organoids formed by cholangiocytes in growth medium may exhibit the morphology or physical characteristics of cholangiocytes, eg, extrahepatic cholangiocytes such as CBD cholangiocytes. Organoids can include, for example, cilia, tight junctions, microvilli, exosomes and/or tubular structures. Organoid morphology and physical properties can be determined by standard microscopy techniques.

オルガノイドの形でも又は個別の細胞の形でも、増殖された胆管細胞の集団はその他の細胞型を含み得ないか又は実質的に含み得ない。すなわち、胆管細胞の集団は均質又は実質的に均質であり得る。例えば、該集団は培地中での培養後に８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の胆管細胞を含み得る。好ましくは、胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分にその他の細胞型を含まない。 The expanded population of cholangiocytes, either in the form of organoids or individual cells, may be free or substantially free of other cell types. That is, the population of cholangiocytes can be homogeneous or substantially homogeneous. For example, the population can comprise 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more cholangiocytes after culture in medium. Preferably, the population of cholangiocytes is sufficiently free of other cell types that purification is not required.

胆管細胞は１つ以上の胆管マーカーを発現し得る。例えば、胆管細胞は、サイトケラチン７（ＫＲＴ７又はＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９又はＣＫ１９）、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、肝細胞核因子１ベータ（ＨＮＦ１Ｂ）、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、ナトリウム依存性胆汁酸輸送体１（ＡＳＢＴ／ＳＬＣ１０Ａ２）、ＳＲＹ－ｂｏｘ ９（ＳＯＸ９）、Ｊａｇｇｅｄ １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（Apical Salt and Bile Transporter）（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を発現し得る。典型的には、集団中の胆管細胞の少なくとも９８％は、本明細書に記載されるように増殖培地中で２０代継代した後にＣＫ７及びＣＫ１９を共発現し得る。 Bile duct cells can express one or more biliary markers. For example, cholangiocytes produce cytokeratin 7 (KRT7 or CK7), cytokeratin 19 (KRT19 or CK19), γ-glutamyltransferase (GGT), hepatocyte nuclear factor 1 beta (HNF1B), secretin receptor (SCTR), sodium-dependent bile acid transporter 1 (ASBT/SLC10A2), SRY-box 9 (SOX9), Jagged 1 (JAG1), NOTCH2, SCR, SSTR2, Apical Salt and Bile Transporter (ASBT), Aquaporin 1 and anion exchanger and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Typically, at least 98% of cholangiocytes in a population can co-express CK7 and CK19 after 20 passages in growth medium as described herein.

好ましくは、胆管細胞は、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞に相当するレベルで成熟胆管マーカーを発現する。胆管細胞は成熟胆管細胞であり得て、胎児の特徴を欠如し得る。 Preferably, the cholangiocytes express mature bile duct markers at levels comparable to primary common bile duct (CBD) cholangiocytes. The cholangiocytes may be mature cholangiocytes and may lack fetal characteristics.

初代胆管細胞とは対照的に、増殖された集団における胆管細胞は、ＭＨＣクラス１又はクラス２のタンパク質、例えばＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－ＤＲＢ１等のＨＬＡタンパク質の発現を欠如し得る。さらに、胆管細胞は、初代胆管細胞の領域特異性に特有の遺伝子、例えば炎症又は胆汁酸の勾配により誘導される遺伝子の発現を欠如し得る。それらの胆管細胞は増殖性であり、免疫プロファイルマーカーが少ないか又は免疫プロファイルマーカーが存在しないので、本明細書に記載されるように生成される胆管細胞は、増殖せず免疫プロファイルマーカーが高い初代胆管細胞とは異なる。 In contrast to primary cholangiocytes, cholangiocytes in expanded populations may lack expression of MHC class 1 or class 2 proteins, eg, HLA proteins such as HLA-E or HLA-DRB1. In addition, cholangiocytes may lack expression of genes characteristic of the region-specificity of primary cholangiocytes, such as genes induced by inflammation or bile acid gradients. Because those cholangiocytes are proliferative and have few or no immune profile markers, the cholangiocytes generated as described herein are primary cholangiocytes that do not proliferate and have high immune profile markers. Different from bile duct cells.

胆管細胞の集団には、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞は含まれない。胆管細胞は、コントロール細胞に対して、幹細胞マーカー、例えばＰＯＵ５Ｆ１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ＬＧＲ－４、５若しくは６等のロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、ＫＬＦ－４及びｃ－ｍｙｃの発現を示さないか又はそれらの発現が低い。幾つかの好ましい実施形態では、胆管細胞は、高レベルの胆管マーカー、低レベルのＬＧＲ５及びＰＲＯＭ１等の幹細胞マーカーを発現し、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ及びＳｏｘ２等の多能性マーカーは発現しない。 A population of cholangiocytes does not include stem cells or other pluripotent or multipotent cells. Bile duct cells were tested relative to control cells for stem cell markers, e.g. No or low expression of SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, KLF-4 and c-myc. In some preferred embodiments, the cholangiocytes express high levels of biliary markers, low levels of stem cell markers such as LGR5 and PROM1, and no pluripotency markers such as Oct4, NANOG and Sox2.

胆管細胞の集団には、肝細胞又は膵臓細胞等の非胆管細胞は含まれない。胆管細胞は、肝細胞マーカー又は膵マーカー等の非胆管系譜のマーカーを発現しない。例えば、胆管細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１又は６ Ａ１ＡＴ）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）及びＡＦＰ等の胎児肝芽細胞マーカーの発現を欠如し得る。 A population of cholangiocytes does not include non-cholangiocytes such as hepatocytes or pancreatic cells. Bile duct cells do not express markers of non-biliary lineage such as hepatocyte or pancreatic markers. For example, cholangiocytes are labeled with fetal hepatoblast markers such as albumin (ALB), α1-antitrypsin (SERPINA1 or 6 A1AT), pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1), insulin (INS), glucagon (GCG) and AFP. can lack expression of

胆管細胞の集団は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーを発現しない。例えば、胆管細胞は、ビメンチン（ＶＩＭ）、ｓｎａｉｌファミリー転写リプレッサー１（ＳＮＡＩ１）及び／又はＳ１００カルシウム結合タンパク質９Ａ４（Ｓ１００Ａ４）の発現を欠如し得る。 Bile duct cell populations do not express epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers. For example, cholangiocytes may lack expression of vimentin (VIM), snail family transcriptional repressor 1 (SNAI1) and/or S100 calcium binding protein 9A4 (S100A4).

１つ以上の胆管マーカーの発現及び１つ以上の非胆管マーカーの発現の不存在は、増殖された胆管細胞の集団において観察及び／又は検出され得る。例えば、増殖された胆管細胞の集団における上記の成熟胆管マーカーの１つ以上の発現又は生成が測定され得る。これにより、増殖された胆管細胞の集団の均質性を測定及び／又は観察することが可能となる。 Expression of one or more biliary markers and absence of expression of one or more non-biliary markers can be observed and/or detected in the population of expanded cholangiocytes. For example, the expression or production of one or more of the mature bile duct markers described above in a population of expanded bile duct cells can be measured. This makes it possible to measure and/or observe the homogeneity of the expanded cholangiocyte population.

本明細書に記載されるように生成された増殖された胆管細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代胆管細胞、例えば初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞等の肝外胆管細胞の１つ以上の機能的特性を示し得る。例えば、胆管細胞は、以下に記載される特性の１つ以上、好ましくは全てを示すオルガノイドへと集成し得る。 Populations of expanded cholangiocytes produced as described herein can be used in vitro to express one or more functional cells of primary cholangiocytes, e.g., extrahepatic cholangiocytes such as primary common bile duct (CBD) cholangiocytes. characteristics. For example, cholangiocytes may assemble into organoids exhibiting one or more, preferably all, of the properties described below.

胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の移動、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性及び／又はγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性を示し得る。ＡＬＰ及びＧＧＴ活性の量は、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示されるＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量に相当し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、例えば本明細書に記載されるように測定され得る。 Bile duct cell organoids can exhibit bile acid mobilization, alkaline phosphatase (ALP) activity and/or γ-glutamyl transpeptidase (GGT) activity. The amount of ALP and GGT activity can correspond to the amount of ALP and GGT activity exhibited by primary common bile duct (CBD) cholangiocytes. ALP activity and GGT activity can be measured, for example, as described herein.

胆管細胞オルガノイドは、能動分泌、例えば多剤耐性タンパク質－１（ＭＤＲ１）によって媒介される分泌を示し得る。この分泌は、本明細書に記載されるように、ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルの存在下及び不存在下で、胆管細胞オルガノイドの内腔におけるローダミン１２３等の蛍光性ＭＤＲ１基質の蓄積を計測することにより測定され得る。 Bile duct cell organoids can exhibit active secretion, eg, secretion mediated by multidrug resistance protein-1 (MDR1). This secretion is measured by measuring the accumulation of fluorescent MDR1 substrates, such as rhodamine 123, in the lumen of cholangiocyte organoids in the presence and absence of the MDR1 inhibitor verapamil, as described herein. can be measured.

胆管細胞オルガノイドは、セクレチン及びソマトスタチンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、セクレチンに応答して分泌活性の増加を示し、ソマトスタチンに応答して活性の減少を示し得る。これは、オルガノイドのサイズの変化を計測することにより測定され得る。例えば、セクレチンは胆管細胞オルガノイドのサイズを増大させ得て、ソマトスタチンはそのサイズを減少させ得る。 Bile duct cell organoids can exhibit responses to secretin and somatostatin. For example, cholangiocyte organoids can exhibit increased secretory activity in response to secretin and decreased activity in response to somatostatin. This can be measured by measuring changes in organoid size. For example, secretin can increase the size of cholangiocyte organoids and somatostatin can decrease their size.

胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の能動的移動、例えば頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）により媒介される移動を示し得る。胆汁酸移動活性は、例えば、本明細書に記載されるように、ＦＩＴＣ等の別の蛍光性化合物に対するＣＬＦ等の蛍光性胆汁酸塩の能動的移動を計測することにより測定され得る。 Bile duct cell organoids can exhibit active translocation of bile acids, eg, translocation mediated by the apical salt bile transporter (ASBT). Bile acid transfer activity can be measured, for example, by measuring the active transfer of a fluorescent bile salt such as CLF to another fluorescent compound such as FITC, as described herein.

胆管細胞オルガノイドは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）活性を示し得る。ＣＴＦＲ活性は、本明細書に記載されるように、様々な塩化物濃度、例えば、蛍光性の塩化物指示薬のＮ－（６－メトキシキノリル）アセトエチルエステル（ＭＱＡＥ）を有する培地に応答する細胞内及び腔内の塩化物濃度を計測することにより測定され得る。 Bile duct cell organoids can exhibit cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) activity. CTFR activity responds to media with varying chloride concentrations, such as the fluorescent chloride indicator N-(6-methoxyquinolyl)acetoethyl ester (MQAE), as described herein. It can be measured by measuring the intracellular and intraluminal chloride concentration.

胆管細胞オルガノイドは、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答を示し得る。例えば、細胞内Ｃａ２＋レベルは、胆管細胞オルガノイドにおいて、ＡＴＰ又はアセチルコリンに応答して増大し得る。細胞内Ｃａ２＋レベルは、標準的な技術を使用して測定され得る。 Bile duct cell organoids can exhibit responses to ATP and acetylcholine. For example, intracellular Ca 2+ levels can increase in response to ATP or acetylcholine in cholangiocyte organoids. Intracellular Ca 2+ levels can be measured using standard techniques.

胆管細胞オルガノイドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ６等のマイトジェン及びエストロゲンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、ＶＥＧＦに応答して増殖の増加を示し得る。 Bile duct cell organoids can exhibit responses to mitogens such as vascular endothelial growth factor (VEGF), IL6, and estrogens. For example, cholangiocyte organoids can exhibit increased proliferation in response to VEGF.

胆管細胞オルガノイドは、ルマカフトール（ＶＸ８０９）等の薬物に対する応答を示し得る。例えば、サイズ、ＣＦＴＲ活性及び／又は腔内液分泌は、嚢胞性線維症を伴うドナー個体から得られた初代胆管細胞から増殖された胆管細胞オルガノイドにおいてルマカフトールに応答して増加し得る。ルマカフトールに対する応答を測定するために適した方法は、以下に記載される。 Bile duct cell organoids can exhibit responses to drugs such as lumacafthol (VX809). For example, size, CFTR activity and/or intraluminal fluid secretion may increase in response to lumacaftol in cholangiocyte organoids grown from primary cholangiocytes obtained from donor individuals with cystic fibrosis. A suitable method for measuring the response to lumacafthol is described below.

特許請求の範囲に記載される方法により生成される胆管細胞オルガノイドの応答及び／又は活性の量は、初代胆管細胞、好ましくは初代肝内胆管細胞又は初代肝外胆管細胞、例えば総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示される応答及び／又は活性の量に相当し得る。 The amount of response and/or activity of the cholangiocyte organoids produced by the claimed method is determined by primary cholangiocytes, preferably primary intrahepatic cholangiocytes or primary extrahepatic cholangiocytes, such as common bile duct (CBD) It can correspond to the amount of response and/or activity exhibited by cholangiocytes.

上記のような増殖培地中での増殖後に、胆管細胞オルガノイドを解離又は破壊することで、個別の胆管細胞が生成され得る。 Individual cholangiocytes can be generated by dissociating or disrupting the cholangiocyte organoids after growth in a growth medium as described above.

オルガノイドを個別の構成細胞へと解離する適切な方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、胆管細胞オルガノイドを、ディスパーゼ又は非酵素的回収溶液、例えばＣｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Corning社）を使用して増殖培地から採取し、トリプシン等のプロテアーゼを使用して解離させることができる。適切な試薬は市販されており、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ThermoFisher Scientific社）が挙げられる。 Suitable methods for dissociating organoids into individual constituent cells are well known in the art. For example, cholangiocyte organoids can be harvested from the growth medium using dispase or a non-enzymatic recovery solution such as Cell Recovery Solution™ (Corning) and dissociated using a protease such as trypsin. Suitable reagents are commercially available and include TrypLE™ Express (ThermoFisher Scientific).

本明細書に記載されるように増殖された胆管細胞が１つ以上の胆管細胞機能を発揮する能力が観察及び／又は測定され得る。例えば、細胞がオルガノイドへと集成する能力、及び／又はＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答若しくはＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、若しくはセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答の１つ以上を発揮する能力が観察及び／又は測定され得る。 The ability of cholangiocytes expanded as described herein to perform one or more cholangiocyte functions can be observed and/or measured. For example, the ability of cells to assemble into organoids and/or exert one or more of MDR1 function, bile acid mobilization, VEGF response, acetylcholine or ATP response, CFTR-mediated chloride transport, or secretin or somatostatin response. The ability to do so can be observed and/or measured.

本明細書に記載されるように生成される胆管細胞は、本明細書に記載されるように増殖されるか、又は標準的な哺乳動物細胞培養技術を使用して培養若しくは維持されるか、又は更なる操作若しくは処理に供され得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるように生成された胆管細胞集団は、例えば凍結乾燥及び／又は凍結保存により貯蔵され得る。胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞として貯蔵され得る。適切な貯蔵方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、胆管細胞は、凍結保存培地（例えば、Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ（商標）（AMS Biotechnology Ltd社、英国））中に懸濁され、例えば－７０℃以下で凍結され得る。 Bile duct cells produced as described herein are either grown as described herein or cultured or maintained using standard mammalian cell culture techniques; or subjected to further manipulation or processing. In some embodiments, cholangiocyte populations produced as described herein can be stored, eg, by lyophilization and/or cryopreservation. Bile duct cells can be stored as organoids, sub-organoid aggregates or individual cells. Suitable storage methods are well known in the art. For example, cholangiocytes can be suspended in a cryopreservation medium (eg, Cellbanker™ (AMS Biotechnology Ltd, UK)) and frozen at, eg, −70° C. or below.

胆管細胞の集団は、バッファー、担体、希釈剤、保存剤及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤等のその他の試薬と混合され得る。適切な試薬は、以下でより詳細に記載される。本明細書に記載される方法は、胆管細胞の集団を治療的に許容可能な賦形剤と混合して、治療組成物を生成することを含み得る。混合される胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。 The cholangiocyte population can be mixed with other reagents such as buffers, carriers, diluents, preservatives and/or pharmaceutically acceptable excipients. Suitable reagents are described in more detail below. The methods described herein can include mixing a population of cholangiocytes with a therapeutically acceptable excipient to produce a therapeutic composition. The mixed cholangiocytes can be in the form of organoids, sub-organoid aggregates or individual cells.

幾つかの実施形態では、胆管細胞は、治療において有用であり得る。治療用途のために、胆管細胞は、好ましくは臨床グレードの細胞である。治療に使用するための胆管細胞の集団は、好ましくは本明細書に記載される初代胆管細胞から、化学的に定義された増殖培地を使用して生成される。胆管細胞は、特定の用途に応じて、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。 In some embodiments, cholangiocytes may be useful in therapy. For therapeutic use, the cholangiocytes are preferably clinical grade cells. A population of cholangiocytes for therapeutic use is preferably generated from the primary cholangiocytes described herein using a chemically defined growth medium. Bile duct cells may be in the form of organoids, sub-organoid aggregates or individual cells, depending on the particular application.

増殖された胆管細胞の集団は、個体へと移植、注入又はその他の方法で投与され得る。適切な技術は、当該技術分野においてよく知られている。 The expanded population of cholangiocytes can be transplanted, infused or otherwise administered to an individual. Suitable techniques are well known in the art.

増殖された胆管細胞の集団は自系であり得る。すなわち、胆管細胞は、後に投与されるのと同じ個体から当初得られた初代胆管細胞から増殖されたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とは同じである）。レシピエント個体に投与するのに適した増殖された胆管細胞の集団は、個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備することと、上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖された胆管細胞の集団を生成することとを含む方法によって生成され得る。 The population of expanded cholangiocytes can be autologous. That is, the cholangiocytes are expanded from primary cholangiocytes originally obtained from the same individual that is subsequently administered (ie, the donor and recipient individuals are the same). An expanded population of cholangiocytes suitable for administration to a recipient individual can be obtained by providing an initial population of primary cholangiocytes obtained from the individual, expanding said population of cholangiocytes, and administering and generating an expanded population of cholangiocytes of.

増殖された胆管細胞の集団は同種異系であり得る。すなわち、初代胆管細胞は、胆管細胞が後に投与される個体と異なる個体から当初得られたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とは異なる）。ドナー個体及びレシピエント個体は、拒絶反応及びその他の望ましくない免疫効果を避けるためにＨＬＡ適合され得る。レシピエント個体に投与するのに適した増殖された胆管細胞の集団は、ドナー個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備することと、上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖された胆管細胞の集団を生成することとを含む方法によって生成され得る。幾つかの実施形態では、増殖された集団は、ＨＬＡ等の免疫原性抗原の発現を低減又は不活性化させるように操作され得る。 The population of expanded cholangiocytes can be allogeneic. That is, the primary cholangiocytes are originally obtained from a different individual than the individual to whom the cholangiocytes are subsequently administered (ie, the donor and recipient individuals are different). Donor and recipient individuals can be HLA-matched to avoid rejection and other undesirable immune effects. An expanded population of cholangiocytes suitable for administration to a recipient individual can be obtained by preparing an initial population of primary cholangiocytes obtained from a donor individual, expanding the above population of cholangiocytes, and administering. and generating an expanded population of cholangiocytes for. In some embodiments, the expanded population can be engineered to reduce or inactivate the expression of immunogenic antigens such as HLA.

幾つかの好ましい実施形態では、増殖された胆管細胞の集団は、生体適合性の足場と混合され得る。 In some preferred embodiments, the expanded cholangiocyte population can be mixed with a biocompatible scaffold.

生体適合性の足場に、上記のように増殖された胆管細胞が播種され得る。例えば、個別の胆管細胞又は胆管細胞のオルガノイドに満たない集成体が、足場上若しくは足場中に注入され得るか、又は製造過程の間に足場中に混合され得る。次いで、胆管細胞を含む足場は、胆管細胞が足場に定着するように増殖培地中で培養され得る。胆管細胞は足場内で増殖し、オルガノイドへと集成し、その後に多層上皮へと集成し得る。 A biocompatible scaffold can be seeded with cholangiocytes expanded as described above. For example, individual cholangiocytes or sub-organoid aggregates of cholangiocytes can be injected onto or into the scaffold or mixed into the scaffold during the manufacturing process. The scaffold containing cholangiocytes can then be cultured in growth medium such that the cholangiocytes colonize the scaffold. Bile duct cells can proliferate within the scaffold and assemble into organoids and subsequently into multilayered epithelium.

適切な生体適合性の足場としては、ハイドロゲル、例えばフィブリン、キトサン、グリコサミノグリカン類、絹、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン等の糖タンパク質、又はキチン等の多糖、又はセルロースコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、高密度化コラーゲン、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、生物有機ゲル（bio-organic gels）及び合成ポリマーハイドロゲル、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ハイドロゲル、架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh社、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、ポリエステル、可溶性ガラス繊維、多孔質ポリスチレン及び単離された天然ＥＣＭ足場、例えば脱細胞化された胆嚢及び胆管の足場（Engitix Ltd社、英国、ロンドン）が挙げられ得る。足場は生分解性であり得る。 Suitable biocompatible scaffolds include hydrogels such as fibrin, chitosan, glycosaminoglycans, silk, fibrin, fibronectin, elastin, collagen, glycoproteins such as fibronectin, or polysaccharides such as chitin, or cellulose collagen; Collagen/laminin, densified collagen, alginate, agarose, complex protein hydrogels such as basement membrane extracts, bio-organic gels and synthetic polymer hydrogels such as polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone (PCL) hydrogels, crosslinked dextran and PVA hydrogels (e.g. Cellendes Gmbh, Reutlingen, Germany), inert matrices such as porous polystyrene, polyester, soluble glass fibers, porous polystyrene and monolayers. Released native ECM scaffolds, such as decellularized gallbladder and bile duct scaffolds (Engitix Ltd, London, UK) may be mentioned. A scaffold can be biodegradable.

足場のサイズ又は形状は、意図される用途に依存する。適切な足場形状としては、例えば、パッチ、シート並びに最大で例えば１０ｍｍ～１２ｍｍの直径を有する直管及び分岐管を含む管が挙げられ得る。 The scaffold size or shape depends on the intended use. Suitable scaffold shapes may include, for example, patches, sheets and tubes, including straight tubes and branched tubes having diameters up to, for example, 10 mm to 12 mm.

生体適合性の足場内で培養される本明細書に記載されるように生成された胆管細胞は、機能的胆管上皮へと組織化する。定着された足場は、胆管上皮の１つ以上の特性を示し得る。例えば、定着された足場は、胆汁耐性であり得て、上記の機能的特性の１つ以上を示し得る。胆管細胞が定着した足場は、例えば治療又はスクリーニングで使用するための人工胆管上皮組織として有用であり得る。 Bile duct cells produced as described herein cultured within a biocompatible scaffold organize into a functional biliary epithelium. An anchored scaffold can exhibit one or more characteristics of a biliary epithelium. For example, the anchored scaffold can be bile resistant and can exhibit one or more of the functional properties described above. Scaffolds populated with cholangiocytes may be useful as engineered biliary epithelial tissue, for example for use in therapy or screening.

本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離された胆管細胞の集団を提供する。該集団は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。 Another aspect of the invention provides an isolated population of cholangiocytes produced by the methods described herein. The population may be in the form of organoids, sub-organoid aggregates or clusters, or individual cells.

本明細書に記載されるように作製された胆管細胞の集団は、その他の細胞型を実質的に有し得ない。例えば、該集団は、増殖培地中での培養後に７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の胆管細胞を含み得る。集団における胆管細胞の存在又は割合は、上記のように胆管マーカーの発現によって測定され得る。 A population of cholangiocytes produced as described herein may be substantially free of other cell types. For example, the population can comprise 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more cholangiocytes after culture in growth medium. The presence or proportion of cholangiocytes in a population can be determined by expression of cholangiocytes markers as described above.

好ましくは、胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分にその他の細胞型を含まない。必要に応じて、胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドは、ＦＡＣＳを含む任意の適切な技術によって精製され得る。 Preferably, the population of cholangiocytes is sufficiently free of other cell types that purification is not required. If desired, the cholangiocyte population or cholangiocyte organoids can be purified by any suitable technique, including FACS.

幾つかの実施形態では、胆管細胞は、異種タンパク質、例えばＧＦＰ等のマーカータンパク質若しくは酵素を発現し、及び／又は１つ以上の内因性タンパク質、例えば免疫原性に関連するタンパク質の発現を低減する若しくは妨げるように操作され得る。例えば、胆管細胞は、異種タンパク質、内因性タンパク質の発現を抑制するサプッレサーＲＮＡ、又は内因性タンパク質を不活性化させる部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクションされ得る。幾つかの実施形態では、胆管細胞は、遺伝子欠陥を修正するように操作され得る。例えば、ＣＦＴＲ遺伝子中の欠陥は、嚢胞性線維症を伴う個体に由来する胆管細胞において修正され得る。他の実施形態では、胆管細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）等の免疫原性抗原を除去するように操作され得る。これは、同種異系の使用のための低免疫原性細胞又は非免疫原性細胞を作製するのに有用であり得る。 In some embodiments, the cholangiocytes express a heterologous protein, e.g., a marker protein or enzyme such as GFP, and/or reduce expression of one or more endogenous proteins, e.g., proteins associated with immunogenicity. or can be manipulated to interfere. For example, cholangiocytes can be transfected with vectors containing nucleic acids encoding heterologous proteins, suppressor RNAs that suppress expression of endogenous proteins, or site-specific nucleases that inactivate endogenous proteins. In some embodiments, cholangiocytes can be engineered to correct genetic defects. For example, a defect in the CFTR gene can be corrected in cholangiocytes from individuals with cystic fibrosis. In other embodiments, cholangiocytes can be engineered to remove immunogenic antigens such as human leukocyte antigens (HLA). This can be useful to generate low or non-immunogenic cells for allogeneic use.

本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法による胆管細胞を含む足場を提供する。適切な足場は、先に記載されている。 Another aspect of the invention provides a scaffold comprising cholangiocytes according to the methods described herein. Suitable scaffolds have been previously described.

本発明の別の態様は、例えば治療に使用するための、本明細書に記載の方法により生成される胆管細胞が定着した足場を含む人工胆管上皮組織を提供する。胆管細胞に加えて、人工組織は、間質細胞及び／又は内皮細胞等のその他の細胞を含み得る。 Another aspect of the invention provides an engineered biliary epithelial tissue comprising a scaffold populated with cholangiocytes produced by the methods described herein, eg, for use in therapy. In addition to cholangiocytes, the engineered tissue may contain other cells such as stromal and/or endothelial cells.

本発明の態様はまた、溶液又は生体適合性の足場において本明細書に記載されるように生成される胆管細胞を含む医薬組成物、医薬、薬物又はその他の組成物並びにそのような胆管細胞を薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、担体又は生分解性の足場と、任意に１種以上のその他の成分とを混合することを含む医薬組成物の作製方法にも及ぶ。 Aspects of the invention also include pharmaceutical compositions, medicaments, drugs or other compositions comprising cholangiocytes produced as described herein in a solution or biocompatible scaffold and such cholangiocytes. Also extends to a method of making a pharmaceutical composition comprising admixing a pharmaceutically acceptable excipient, vehicle, carrier or biodegradable scaffold, and optionally one or more other ingredients.

本発明により増殖される胆管細胞を含む医薬組成物は、１種以上の追加成分を含み得る。医薬組成物は、胆管細胞に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、保存剤、安定化剤、酸化防止剤又は当業者によく知られるその他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、胆管細胞の活性を妨害すべきではない。担体又はその他の材料の厳密な性質は、投与経路に依存することとなる。 A pharmaceutical composition comprising cholangiocytes expanded according to the present invention may comprise one or more additional ingredients. Pharmaceutical compositions, in addition to cholangiocytes, may contain pharmaceutically acceptable excipients, carriers, buffers, preservatives, stabilizers, antioxidants or other materials well known to those of skill in the art. Such materials should be non-toxic and should not interfere with cholangiocyte activity. The precise nature of the carrier or other material will depend on route of administration.

液体医薬組成物は、一般的に水、鉱油（petroleum）、動物油若しくは植物油、鉱物油又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくはその他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類が含まれ得る。 Liquid pharmaceutical compositions generally include a liquid carrier such as water, petroleum, animal or vegetable oils, mineral oil or synthetic oil. Physiological saline solution, tissue or cell culture media, dextrose or other saccharide solution, or glycols such as ethylene glycol, propylene glycol or polyethylene glycol may be included.

組成物は、パイロジェンフリーでありかつ適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形で存在し得る。当業者は、例えば塩化ナトリウム、リンゲル注射液又は乳酸加リンゲル注射液等の等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することが可能である。組成物は、人工脳脊髄液を使用して調製され得る。 The compositions can be in the form of parenterally acceptable aqueous solutions that are pyrogen-free and have suitable pH, isotonicity and stability. Those of relevant skill in the art are well able to prepare suitable solutions using, for example, isotonic vehicles such as Sodium Chloride, Ringer's Injection, or Lactated Ringer's Injection. Compositions may be prepared using artificial cerebrospinal fluid.

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成された胆管細胞の集団をそれを必要とする個体に投与することを含む、胆管障害又は肝疾患の治療方法を提供する。 Another aspect of the invention provides a method of treating a biliary disorder or liver disease comprising administering a population of cholangiocytes produced as described herein to an individual in need thereof.

本発明の別の態様は、個体へと本明細書に記載されるように生成される胆管細胞の集団を投与することを含む胆管障害又は肝疾患の治療方法においてそれを必要とする個体に使用するための上記集団を提供する。 Another aspect of the invention is use in an individual in need thereof in a method of treating a biliary disorder or liver disease comprising administering to the individual a population of cholangiocytes produced as described herein. provide the above population for

本発明の別の態様は、胆管障害又は肝疾患の治療において使用するための医薬の製造における、本明細書に記載されるように生成される胆管細胞の集団の使用を提供する。 Another aspect of the invention provides use of a population of cholangiocytes produced as described herein in the manufacture of a medicament for use in treating biliary disorders or liver disease.

胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。 Bile duct cells can be in the form of organoids, sub-organoid aggregates or clusters, or individual cells.

胆管障害は、個体における胆管組織が損傷、欠陥又はその他には機能不全に陥っている状態、例えば胆管への損傷若しくは胆管の破壊、胆管の異常又は胆管の欠如を特徴とする障害である。胆管障害としては、胆管組織損傷、虚血性狭窄、外傷性胆管損傷及び胆管症、例えば遺伝性、発達性、自己免疫性及び環境誘発性の胆管症、例えば嚢胞性線維症関連胆管症、薬物誘発性胆管症、アラジール症候群、多発性嚢胞性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ＡＩＤＳ関連胆管症、胆管消失症候群、胆管癌、突発性成人胆管減少症等の胆管減少症、術後胆管合併症、胆管閉鎖症、並びに肝外胆管又は肝内胆管のその他の障害が挙げられ得る。 Bile duct disorders are disorders characterized by damaged, defective or otherwise dysfunctional bile duct tissue in an individual, such as damage to or disruption of the bile ducts, abnormalities of the bile ducts, or absence of bile ducts. Bile duct disorders include biliary tissue damage, ischemic strictures, traumatic cholangiopathies and cholangiopathies, such as hereditary, developmental, autoimmune and environmentally induced cholangiopathies, such as cystic fibrosis-associated cholangiopathies, drug-induced cholangiopathy, Alagille syndrome, polycystic liver disease, primary biliary cirrhosis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), AIDS-related cholangiopathy, vanishing bile duct syndrome, cholangiocarcinoma, idiopathic adult bile duct loss cholangiopenia such as dysentery, postoperative biliary complications, biliary atresia, and other disorders of the extrahepatic or intrahepatic bile ducts.

幾つかの実施形態では、増殖された胆管細胞の集団は、溶液において個体に投与され得る。胆管細胞の集団の溶液での投与は、例えば肝疾患、胆管減少症、例えば虚血性胆管減少症、先天性胆管減少症、例えばアラジール症候群、代謝性胆管減少症、複合病、例えば肝内ＰＳＣ及びＰＢＣ、薬物誘発性胆管減少症、胆管消失症候群、並びに肝内胆管系を冒す状態の治療において有用であり得る。 In some embodiments, an expanded population of cholangiocytes can be administered to an individual in solution. Administration of a population of cholangiocytes in solution is useful for, e.g., liver diseases, cholangopenia such as ischemic cholangopenia, congenital cholangopenia such as Alagille's syndrome, metabolic cholangopenia, complex diseases such as intrahepatic PSC and It may be useful in the treatment of PBC, drug-induced cholangopenia, vanishing bile duct syndrome, as well as conditions affecting the intrahepatic biliary system.

他の実施形態では、胆管細胞の集団は、生体適合性の足場内で個体に投与され得る。例えば、胆管細胞が定着した足場が個体に投与され得る。足場における胆管細胞の集団の投与は、例えば胆管閉鎖症、胆管狭窄、外傷性又は医原性の胆管損傷及び肝外胆管系を冒す状態の治療において有用であり得る。 In other embodiments, a population of cholangiocytes can be administered to an individual within a biocompatible scaffold. For example, a scaffold populated with cholangiocytes can be administered to an individual. Administration of populations of cholangiocytes in scaffolds can be useful, for example, in the treatment of biliary atresia, biliary strictures, traumatic or iatrogenic biliary injury and conditions affecting the extrahepatic biliary system.

溶液中又は足場中の胆管細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術により患者へと移植され得る（例えば、Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7、Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201-202、Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124、Freed, C.R.,(1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555、Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439-41）。特に、細胞懸濁液は、患者の胆管、胆嚢、門脈、肝実質、腹腔又は脾臓に注射又は注入され得る。胆管細胞の懸濁液は、静脈内、腹腔内、又は内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）若しくは経皮的胆管造影（ＰＴＣ）を介して投与され得る。胆管細胞が定着した足場は、外科移植により個体に投与され得る。 Bile duct cells in solution or scaffold can be transplanted into the patient by any technique known in the art (e.g. Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201-202; Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124; Freed, C.R., (1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555; Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439-41). In particular, the cell suspension can be injected or infused into the patient's bile duct, gallbladder, portal vein, liver parenchyma, peritoneal cavity or spleen. Bile duct cell suspensions can be administered intravenously, intraperitoneally, or via endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) or percutaneous cholangiography (PTC). A scaffold populated with cholangiocytes can be administered to an individual by surgical implantation.

本発明による組成物の投与は、好ましくは「予防的有効量」又は「治療的有効量」（場合に応じて、予防が治療とみなされる場合がある）でなされ、その際、この量は個体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量並びに投与の速度及び時間的経過は、治療対象の性質及び重症度に依存することとなる。治療の処方、例えば投与量の決定等は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。 Administration of a composition according to the invention is preferably in a "prophylactically effective amount" or a "therapeutically effective amount" (where prevention may be considered treatment, as the case may be), wherein this amount is administered to an individual. sufficient to show benefit to The actual amount administered, and rate and time-course of administration, will depend on the nature and severity of what is being treated. Prescription of treatment, eg decisions on dosage etc., is within the responsibility of general practitioners and other medical doctors.

胆管細胞を含む組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療される状態に応じて同時に又は逐次に投与され得る。 Compositions comprising cholangiocytes can be administered alone or in combination with other treatments, either simultaneously or sequentially depending on the condition being treated.

本発明の他の態様は、患者の薬物への感受性を決定するための、本明細書に記載されるように増殖される胆管細胞の使用に関する。方法は、
（ｉ）疾患状態、例えば胆管障害又は肝疾患を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
（ｉｉｉ）本明細書に記載される方法により生成される増殖された胆管細胞の集団を治療化合物と接触させることと、
（ｉｖ）前記胆管細胞に対する前記治療化合物の効果を測定することと、
を含み得て、前記胆管細胞の疾患表現型の改善は、前記個体が前記治療化合物に感受性があることの指標である。 Another aspect of the invention relates to the use of cholangiocytes grown as described herein for determining a patient's sensitivity to a drug. The method is
(i) providing an isolated population of primary cholangiocytes from an individual with a disease state, such as cholangiopathy or liver disease;
(ii) culturing said population in a growth medium comprising an epidermal growth factor (EGF), a canonical Wnt signaling inhibitor, and a non-canonical Wnt/PCP signaling enhancer to induce a disease phenotype; producing a population of expanded cholangiocytes exhibiting
(iii) contacting the expanded cholangiocyte population produced by the methods described herein with a therapeutic compound;
(iv) measuring the effect of said therapeutic compound on said cholangiocytes;
wherein amelioration of the disease phenotype of said cholangiocytes is indicative that said individual is susceptible to said therapeutic compound.

胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、胆管細胞が以下に記載される１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力、又は胆管細胞が（ｉ）移植後の非ヒト動物モデルへの生着、（ｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの胆管の形成、（ｉｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの疾患表現型のレスキュー、（ｉｖ）移植後の非ヒト動物モデルの生存の延長、（ｖ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの細胞機能の維持、（ｖｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの胆管減少症の回復、及び（ｖｉｉ）非ヒト動物モデルにおける移植後の血清肝機能マーカーの改善の１つ以上を発揮する能力は、治療化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。 The proliferation, growth, viability or bile acid resistance of cholangiocytes, the ability of cholangiocytes to perform one or more of the cellular or organoid functions described below, or the ability of cholangiocytes to perform (i) a post-transplantation non-human animal model (ii) formation of bile ducts in vivo in non-human animal models; (iii) rescue of disease phenotypes in vivo in non-human animal models; (iv) post-transplantation of non-human animal models (v) maintenance of cell function in vivo in non-human animal models; (vi) restoration of cholangiopenia in vivo; and (vii) post-transplant serum liver function markers in non-human animal models. The ability to exert one or more improvements in can be measured in the presence of the therapeutic compound as compared to its absence.

疾患表現型を有する増殖された胆管細胞が、治療化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が個体における疾患に対して改善効果を有することの指標である。 An increase in the ability of expanded cholangiocytes with a disease phenotype to perform one or more of these functions in the presence of a therapeutic compound compared to the absence of that compound indicates that the compound is effective against disease in an individual. It is an index of having an improvement effect.

上記のように生成される分離された胆管細胞の集団は、試験化合物と胆管細胞の相互作用のモデリング、例えば毒性スクリーニング、胆管障害のモデリング、又は潜在的な治療効果を有する化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。 Isolated populations of cholangiocytes generated as described above are useful in modeling interactions between test compounds and cholangiocytes, such as toxicity screening, modeling of cholangiopathies, or screening of compounds with potential therapeutic effects. could be.

幾つかの実施形態では、胆管細胞は、健康な一次組織から取得され得る。他の実施形態では、胆管細胞は、胆管疾患を伴うドナー由来の一次組織から取得され得て、疾患表現型を示し得る。 In some embodiments, cholangiocytes can be obtained from healthy primary tissue. In other embodiments, cholangiocytes may be obtained from primary tissue from a donor with cholangiopathy and exhibit a disease phenotype.

本発明の別の態様は、疾患モデリング及び胆管障害の病因の研究のための、正常な患者又は胆管障害を伴う患者に由来する胆管細胞の集団の使用を提供する。 Another aspect of the invention provides the use of populations of cholangiocytes derived from normal patients or patients with biliary disorders for disease modeling and studies of the etiology of biliary disorders.

モデリング及びスクリーニングに使用するための胆管細胞は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）、オルガノイドに満たないクラスター又は例えば胆管細胞オルガノイドの破壊により生成された個別の細胞（胆管細胞）の形であり得る。 Bile duct cells for use in modeling and screening can be in the form of organoids (cholangiocyte organoids), clusters of less than organoids or individual cells (cholangiocytes) generated, for example, by disruption of cholangiocyte organoids.

化合物のスクリーニング方法は、
本明細書に記載される方法により生成される胆管細胞の集団を試験化合物と接触させることと、
上記胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対する上記胆管細胞の効果を測定することと、
を含み得る。 The compound screening method includes:
contacting a population of cholangiocytes produced by the methods described herein with a test compound;
measuring the effect of the test compound on the cholangiocytes and/or the effect of the cholangiocytes on the test compound;
can include

胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、又は胆管細胞が１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。 Bile duct cell proliferation, growth, viability or bile acid resistance, or the ability of cholangiocytes to perform one or more cellular or organoid functions can be measured in the presence of a test compound as compared to its absence. .

増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の減少は、化合物が毒性効果を有することの指標であり、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の増加は、化合物が胆管細胞に対して改善効果を有することの指標である。 A decrease in proliferation, growth, viability, or the ability to exert one or more cellular or organoid functions is an indication that the compound has a toxic effect and is indicative of growth, viability, or one or more cellular or organoid functions. is an indication that the compound has an ameliorative effect on cholangiocytes.

幾つかの実施形態では、胆管細胞は、胆管腫瘍に由来し得て、腫瘍由来細胞の増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力に対する試験化合物の効果が測定され得る。 In some embodiments, the cholangiocytes can be derived from a cholangiocarcinoma, and the effect of a test compound on the proliferation, growth, viability, or ability of the tumor-derived cells to perform one or more cellular or organoid functions is measured. can be

遺伝子発現は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。例えば、１つ以上の胆管マーカー遺伝子の発現が測定され得る。発現の複合的な減少は、化合物が毒性効果を有するか、又は胆管細胞の機能的状態を変更し得ることの指標である。遺伝子発現は、例えばＲＴ－ＰＣＲにより核酸レベルで測定され得るか、又は例えばＥＬＩＳＡ等の免疫学的技術により、若しくは活性アッセイによりタンパク質レベルで測定され得る。シトクロムｐ４５０アッセイ、例えば発光、蛍光又は発色アッセイは、当該技術分野においてよく知られており、商業的供給業者から入手可能である。 Gene expression can be measured in the presence of the test compound compared to its absence. For example, expression of one or more biliary marker genes can be measured. A compound decrease in expression is an indication that the compound may have a toxic effect or alter the functional state of the cholangiocytes. Gene expression can be measured at the nucleic acid level, eg, by RT-PCR, or at the protein level, eg, by immunological techniques such as ELISA, or by activity assays. Cytochrome p450 assays, such as luminescent, fluorescent or chromogenic assays, are well known in the art and available from commercial suppliers.

幾つかの実施形態では、胆管疾患のためのリスク遺伝子座又は胆管疾患、例えば上記の疾患に関連する遺伝子の発現が測定され得る。 In some embodiments, the expression of risk loci for biliary tract disease or genes associated with biliary tract disease, such as those listed above, can be measured.

胆管細胞による試験化合物の代謝、分解又は破壊が測定され得る。幾つかの実施形態では、試験化合物及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量又は濃度の変化が、連続的に又は１つ以上の時点で経時的に測定又は計測され得る。例えば、試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加が測定又は計測され得る。幾つかの実施形態では、試験化合物及び／又は代謝産物の量又は濃度の変化速度が測定され得る。試験化合物又は代謝産物の量を計測するための適切な技術としては、質量分析法が挙げられる。 Metabolism, degradation or destruction of the test compound by cholangiocytes can be measured. In some embodiments, changes in the amount or concentration of a test compound and/or metabolites of said test compound can be measured or measured continuously or over time at one or more time points. For example, a decrease in the amount or concentration of a test compound and/or an increase in the amount or concentration of a metabolite of said test compound can be measured or measured. In some embodiments, the rate of change in amount or concentration of a test compound and/or metabolite can be measured. Suitable techniques for measuring the amount of test compound or metabolite include mass spectrometry.

これは、試験化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期、毒性、有効性又はその他のｉｎ ｖｉｖｏでの特性の測定において有用であり得る。 This may be useful in determining in vivo half-life, toxicity, efficacy or other in vivo properties of test compounds.

胆管細胞の１つ以上の機能は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定及び／又は計測され得る。例えば、胆管細胞がＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答又はＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性又はセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答、フォルスコリン誘発腫脹（Dekkers et al Nat Med 2013; 19:939-45）、胆汁抵抗性、重炭酸塩分泌、内腔の保全性（すなわち、該化合物は、密着結合を破壊し、オルガノイドの内腔を崩壊させる）、オルガノイドの腔内外への化合物の移動、及び腔内の細菌の存在又は生存率の１つ以上を発揮する能力が測定及び／又は計測され得る。胆管細胞が胆管細胞オルガノイドへと集成する能力も測定され得る。 One or more functions of cholangiocytes can be measured and/or measured in the presence of a test compound compared to its absence. For example, cholangiocytes may be affected by MDR1 function, bile acid mobilization, VEGF, acetylcholine or ATP responses, CFTR-mediated chloride transport, GGT activity, ALP activity or secretin or somatostatin responses, forskolin-induced swelling (Dekkers et al Nat). Med 2013; 19:939-45), bile resistance, bicarbonate secretion, luminal integrity (i.e., the compound disrupts tight junctions and disrupts the organoid lumen), organoid intraluminal and extraluminal The ability to exert one or more of the migration of a compound to the cavity and the presence or viability of bacteria within the cavity can be measured and/or measured. The ability of cholangiocytes to assemble into cholangiocyte organoids can also be measured.

胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の減少は、その化合物が胆管上皮に対して毒性効果を有することの指標である。胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が胆管誘発効果を有する（例えば、その化合物は胆管上皮の活性を促進する）ことの指標である。 A decrease in the ability of cholangiocytes to perform one or more of these functions in the presence of the test compound compared to its absence is indicative that the compound has a toxic effect on the biliary epithelium. . An increase in the ability of cholangiocytes to perform one or more of these functions in the presence of a test compound compared to its absence indicates that the compound has a cholangiogenic effect (e.g. activity).

本発明の別の態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞オルガノイドの生成のためのキットを提供する。 Another aspect of the invention is for the production of cholangiocyte organoids comprising a growth medium comprising epidermal growth factor (EGF), a non-canonical Wnt/PCP signaling enhancer, and a canonical Wnt signaling inhibitor. provides a kit for

適切な増殖培地は、先により詳細に記載されている。 Suitable growth media are described in more detail above.

キットは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の足場マトリックスを更に含み得る。足場マトリックスは、増殖培地の一部として提供され得るか又は別個に提供され得る。 The kit may further include a scaffolding matrix such as Matrigel™. A scaffolding matrix may be provided as part of the growth medium or may be provided separately.

増殖培地は、脱イオンされ蒸留された水中で配合され得る。増殖培地は、典型的には、コンタミネーションを防ぐために、例えば紫外光、加熱、照射又は濾過によって使用前に滅菌される。１種以上の培地は、貯蔵又は輸送のために凍結（例えば、約－２０℃又は－８０℃で）され得る。１種以上の培地は、コンタミネーションを防ぐために１種以上の抗生物質を含有し得る。 Growth media can be formulated in deionized and distilled water. Growth media are typically sterilized prior to use, for example by ultraviolet light, heat, irradiation or filtration, to prevent contamination. One or more media can be frozen (eg, at about -20°C or -80°C) for storage or shipping. One or more media may contain one or more antibiotics to prevent contamination.

キットは、初代胆組織から初代胆管細胞を分離するためのブラシ又はスクレイパー等の試料採取器を更に有し得る。キットは、組織試料から胆管細胞を機械的に分離するためのプレート又は容器と、組織破片から細胞を分離するための遠心分離管とを更に有し得る。 The kit may further comprise a sampler such as a brush or scraper for separating primary cholangiocytes from primary bile tissue. The kit may further comprise plates or containers for mechanically separating cholangiocytes from tissue samples and centrifuge tubes for separating cells from tissue debris.

キットは、細胞の抽出前に組織を保存するための保存培地を更に有し得る。適切な培地としては、ＵＷ溶液（例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標））並びに生存促進性サイトカイン及び／又はＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。 The kit may further comprise storage medium for preserving tissue prior to cell extraction. Suitable media include UW solutions (eg Vivaspin™) and Williams E medium supplemented with pro-survival cytokines and/or Rock inhibitors.

キットは、洗浄培地を更に有し得る。適切な洗浄培地としては、ＥＧＦ及びＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられ得る。 The kit may further have wash media. Suitable wash media may include Williams E medium supplemented with EGF and Rock inhibitor.

キットは、ＲＯＣＫ阻害剤等の生存促進性サイトカインを更に有し得る。 The kit may further comprise a pro-survival cytokine such as a ROCK inhibitor.

キットは、プレートヒーターを更に有し得る。 The kit may further have a plate heater.

キットは、冷凍保存溶液を更に有し得る。適切な冷凍保存培地は、先に記載されている。 The kit may further have a cryopreservation solution. Suitable cryopreservation media are described above.

１つ以上の培地は、１倍配合物又はそれより濃縮された配合物、例えば２倍～２５０倍濃縮された培地配合物であり得る。１倍配合物では、培地中の各成分は、細胞培養を目的とする濃度、例えば上記の濃度である。濃縮された配合物では、１つ以上の成分が、細胞培養を目的とする濃度よりも高い濃度で存在する。濃縮された培養培地は、当該技術分野においてよく知られている。培養培地は、既知の方法、例えば塩沈殿又は選択的濾過を使用して濃縮され得る。濃縮された培地は、使用のために水（好ましくは、脱イオンされ蒸留された）又は任意の適切な溶液、例えば生理食塩水溶液、水性緩衝液若しくは培養培地で希釈され得る。 The one or more media can be a 1-fold formulation or a more concentrated formulation, such as a 2-fold to 250-fold concentrated media formulation. In a 1× formulation, each component in the medium is at concentrations intended for cell culture, such as the concentrations described above. In concentrated formulations, one or more components are present at concentrations higher than those intended for cell culture. Concentrated culture media are well known in the art. The culture medium can be concentrated using known methods such as salt precipitation or selective filtration. The concentrated medium can be diluted with water (preferably deionized and distilled) or any suitable solution such as saline solution, aqueous buffer or culture medium for use.

キット中の１つ以上の培地は、気密封止された容器中に収容され得る。気密封止された容器は、培養培地の輸送又は貯蔵につき、コンタミネーションを防ぐために好ましい場合がある。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、ジャー、バイアル又はバッグ等の任意の適切な容器であり得る。 One or more media in the kit may be contained in a hermetically sealed container. Hermetically sealed containers may be preferred for transportation or storage of culture media to prevent contamination. The container can be any suitable container such as a flask, plate, bottle, jar, vial or bag.

本発明の別の態様は、初代胆管細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖のための、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地の使用を提供する。 Another aspect of the invention is a growth medium comprising epidermal growth factor (EGF), a non-canonical Wnt signaling enhancer, and a canonical Wnt signaling inhibitor for the in vitro expansion of primary cholangiocytes. provide use.

本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態を提供する。 Other aspects and embodiments of the present invention refer to the aspects and embodiments described above with the term "comprising" replaced by the term "consisting of" and "essentially It provides the aspects and embodiments described above with the term "comprising" replaced by the term "consisting essentially of".

本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。 It is understood that this application discloses all combinations of any of the above aspects and above-described embodiments with each other unless the context requires otherwise. Similarly, the present application discloses all combinations of preferred and/or optional features alone or with any other aspect, unless the context requires otherwise.

上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。 Variations of the above embodiments, further embodiments and variations thereof will become apparent to those of ordinary skill in the art upon reading this disclosure and as such are within the scope of the invention.

本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。 All documents and sequence database entries referred to herein are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes.

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。 As used herein, “and/or” is to be understood as specific disclosure with or without the other of each of the two specified features or components. For example, "A and/or B" is used as specific disclosure of each of (i) A, (ii) B, and (iii) A and B, whether each is individually recited herein. be understood as

ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また上に記載される図面を参照して解説する。 Certain aspects and embodiments of the invention will now be described by way of example and with reference to the drawings described above.

実験
１．方法
１．１ 初代胆管組織
初代胆組織（胆管又は胆嚢）を、移植のために臓器が摘出される死亡した臓器ドナーから取得した。ドナーの家族からインフォームドコンセントを得た後に、臓器摘出手術の間に胆嚢又は胆管の一部を切除した（ＲＥＣ受付番号：１２／ＥＥ／０２５３、ＮＲＥＳ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｅａｓｔ ｏｆ Ｅｎｇｌａｎｄ－Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｒａｌ及び１５／ＥＥ／０１５２ ＮＲＥＳ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｅａｓｔ ｏｆ Ｅｎｇｌａｎｄ－Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｏｕｔｈ）。 Experiment 1. Method 1.1 Primary Bile Duct Tissue Primary bile tissue (bile duct or gallbladder) was obtained from deceased organ donors from whom organs were removed for transplantation. Part of the gallbladder or bile duct was removed during organ extraction surgery after obtaining informed consent from the donor's family (REC accession number: 12/EE/0253, NRES Committee East of England-Cambridge Central and 15/EE). /0152 NRES Committee East of England-Cambridge South).

１．２ 初代胆管細胞の分離
切除した胆管セグメントを１０ｃｍのプレートに置き、ウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）で１回洗浄した。切除した胆管セグメントの壁に沿って縦方向の切開を行い、内腔を露出させ、１０ｍｌ～１５ｍｌのウィリアムＥ培地を加えて、組織を覆った。培地中に浸しながら、外科用ブレードを使用して内腔上皮をスクレイピングした。上清を収集し、組織及びプレートをウィリアムＥ培地で２回～３回洗浄して、全ての残りの細胞を採取した。上清及び洗浄液を、４４４ｇで４分間遠心分離した。ペレットをウィリアムＥで洗浄し、再遠心分離し、上清を廃棄した。 1.2 Isolation of Primary Bile Duct Cells Excised bile duct segments were placed in 10 cm plates and washed once with Williams E medium (Gibco, Life Technologies). A longitudinal incision was made along the wall of the excised bile duct segment to expose the lumen and 10-15 ml of Williams E medium was added to cover the tissue. A surgical blade was used to scrape the luminal epithelium while submerged in the medium. Supernatants were collected and tissues and plates were washed 2-3 times with Williams E medium to harvest any remaining cells. The supernatant and washings were centrifuged at 444g for 4 minutes. The pellet was washed with William E, re-centrifuged and the supernatant discarded.

切除した胆嚢を１５ｃｍのプレートに置き、切除した胆嚢の壁に沿って縦方向の切開を行い、内腔をウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）で１回洗浄した。上記の方法に従って、胆管細胞を分離及び採取した。 The excised gallbladder was placed on a 15 cm plate, a longitudinal incision was made along the wall of the excised gallbladder, and the lumen was washed once with Williams E medium (Gibco, Life Technologies). Bile duct cells were isolated and harvested according to the methods described above.

ブラッシングによる分離のために、切除された胆管セグメントを１０ｃｍのプレートに置き、ＥＲＣＰブラシを使用して挿管した。内腔を１０回～２０回ブラッシングし、４０ｍｌ～５０ｍｌのウィリアムＥ培地が入ったファルコンチューブ中で数回ブラシを洗浄することにより細胞を採取した。 For isolation by brushing, the excised bile duct segment was placed in a 10 cm plate and intubated using an ERCP brush. Cells were harvested by brushing the lumen 10-20 times and washing the brush several times in a Falcon tube containing 40-50 ml of William's E medium.

１．３ ＥＣＯの作製及び培養
分離された初代胆管細胞を４４４ｇで４分間遠心分離し、６６％のｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences社、カタログ番号：３５６２３７）と、３３％のウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）に１０ｍＭのニコチンアミド（Sigma-Aldrich社）、１７ｍＭの重炭酸ナトリウム（Sigma Aldrich社）、０．２ｍＭの２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩（Sigma-Aldrich社）、６．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、１４ｍＭのグルコース（Sigma-Aldrich社）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Invitrogen社）、ＩＴＳ＋プレミックス（BD Biosciences社）、０．１μＭのデキサメタゾン（R&D Systems社）、２ｍＭのグルタマックス（Invitrogen社）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン当たりに１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（R&D Systems社）、５００ｎｇ／ｍｌのＲ－スポンジン（R&D Systems社）及び１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ－１（R&D Systems社）が補充されたものとの混合物に再懸濁した。細胞懸濁液を、２４ウェルプレートフォーマットにおいて、ｍａｔｒｉｇｅｌの小さなドームが各ウェルの中心に形成されるように５０μｌ／ウェルで播種し、その後にそれが固化するまで１０分～３０分にわたり３７℃でインキュベートした。添加物を含むウィリアムＥ培地１ｍｌを加えた。培養培地は４８時間毎に交換した。 1.3 Preparation and Culturing of ECO Isolated primary cholangiocytes were centrifuged at 444 g for 4 minutes and mixed with 66% matrigel (BD Biosciences, catalog number: 356237) and 33% Williams E medium (Gibco, Life Technologies), 10 mM nicotinamide (Sigma-Aldrich), 17 mM sodium bicarbonate (Sigma-Aldrich), 0.2 mM 2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt (Sigma-Aldrich),6. 3 mM sodium pyruvate (Invitrogen), 14 mM glucose (Sigma-Aldrich), 20 mM HEPES (Invitrogen), ITS+premix (BD Biosciences), 0.1 μM dexamethasone (R&D Systems), 2 mM Glutamax (Invitrogen), 100 U/ml penicillin per 100 μg/ml streptomycin, 20 ng/ml EGF (R&D Systems), 500 ng/ml R-spondin (R&D Systems) and 100 ng/ml DKK- 1 (R&D Systems Inc.) was resuspended in a mixture. The cell suspension is seeded at 50 μl/well in a 24-well plate format such that a small dome of matrigel is formed in the center of each well and then incubated at 37° C. for 10-30 minutes until it solidifies. incubated. 1 ml of Williams E medium with supplements was added. Culture medium was changed every 48 hours.

細胞を分離させるために、ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を加えることにより４℃で３０分間消化した。得られた細胞懸濁液を採取し、４４４ｇで４分間遠心分離し、ウィリアムＥ培地で１回洗浄し、上記のように６６％のｍａｔｒｉｇｅｌ及び添加物を含む３３％のウィリアムＥ培地中で再懸濁した。 To detach the cells, matrigel was digested for 30 minutes at 4° C. by adding Cell Recovery Solution (Corning). The resulting cell suspension was harvested, centrifuged at 444 g for 4 minutes, washed once with Williams E medium, and resuspended in 33% Williams E medium with 66% matrigel and supplements as above. Suspended.

全ての実験は、別段の定めがない限り２０代継代のＥＣＯを使用して実施した。 All experiments were performed using passage 20 ECO unless otherwise specified.

１．４ 細胞系統識別
各ＥＣＯ系統に対応するドナーのデモグラフィックデータを以下の表に示す。取得後に、ＥＣＯ系統を、その核型を元のドナーの性別と整合させることにより確認した。それらの系統を定期的に試験して、マイコプラズマのコンタミネーションについて陰性であることを確かめた。 1.4 Cell Lineage Identification Donor demographic data corresponding to each ECO lineage is shown in the table below. After acquisition, ECO strains were confirmed by matching their karyotype to the sex of the original donor. The lines were tested periodically to ensure that they were negative for mycoplasma contamination.

Figure 0007232201000001
Figure 0007232201000001

１．５ 免疫蛍光、ＲＮＡ抽出、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＩＦ、ＲＮＡ抽出及びＱＰＣＲを、Sampaziotis F.ら（Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275）に記載されるように実施した。 1.5 Immunofluorescence, RNA extraction, and quantitative real-time PCR
IF, RNA extraction and QPCR were performed as described by Sampaziotis F. et al. (Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275).

全てのＱＰＣＲデータは、別段の定めがない限り、４つの独立したＥＣＯ系統の中央値、四分位範囲（ＩＱＲ）及び範囲（最小から最大まで）として表される。値はハウスキーピング遺伝子のヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）を基準とする。 All QPCR data are expressed as median, interquartile range (IQR) and range (minimum to maximum) of 4 independent ECO lines unless otherwise specified. Values are based on the housekeeping gene hydroxymethylvilane synthase (HMBS).

全てのＩＦ画像は、Zeiss社のＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡又はZeiss社のＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を使用して取得した。Ｉｍａｇｅｊ １．４８ｋソフトウェア（Wayne Rasband、ＮＩＨＲ、米国、http://imagej.nih.gov/ij）を画像処理のために使用した。 All IF images were acquired using a Zeiss Axiovert 200M inverted microscope or a Zeiss LSM 700 confocal microscope. Imagej 1.48k software (Wayne Rasband, NIHR, USA, http://imagej.nih.gov/ij) was used for image processing.

１．６ マイクロアレイ
マイクロアレイ分析用のＲＮＡを、３つの異なるＥＣＯ系統（ｎ＝３）から収集した。ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ（BMG Labtech社、英国、アリスバーリー）及びＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Agilent Technologies社、英国、チードル）を使用して、ＲＮＡを濃度及び品質について評価した。マイクロアレイ実験を、ケンブリッジ大学のＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで、ＨｕｍａｎＨＴ－１２ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Illumina社、英国、チェスターフォード）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、２００ｎｇの総ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Life Technologies社、英国、ペイズリー）を使用して製造業者の使用説明書に従って線形増幅させた。得られたｃＲＮＡの濃度、純度及び完全性を、ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって計測した。最後に、ｃＲＮＡをＨｕｍａｎＨＴ－１２ ｖ４ ＢｅａｄＣｈｉｐに一晩ハイブリダイズさせた後に、洗浄し、染色し、そしてＢｅａｄ Ａｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒ（Illumina社）を使用してスキャンした。生データを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｕｍｉパッケージ（Du P et al.; Bioinformatics 2008 24：1547-8）を使用してＲにロードし、比較される群に応じてサブセットに分割した。所与の比較に関係する試料のみが使用される。次いで、サブセットをIllumina社からの検出ｐ値を使用してフィルタリングして、非発現プローブを除去した。全ての試料にわたって、強度値がネガティブコントロールと統計的に有意に異ならない（Ｐ＞０．０１）プローブを、分析から除去した。フィルタリング後に、データをｌｕｍｉからの分散安定化変換（Lin et al., Nucliec Acids Res. 2008, 36）を使用して変換した後に、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化を使用して正規化することで、アレイ間の技術的変動を除去した。ｌｉｍｍａパッケージ（Smyth GK, Stat Appl Genet Mol Biol 2004 3）を使用して、多重検定のために偽発見率（ＦＤＲ）補正を使用して補正された結果との比較を行った。最後にデータの品質を、群内の試料間での相関と一緒に評価した。 1.6 Microarray RNA for microarray analysis was collected from three different ECO strains (n=3). RNA was assessed for concentration and quality using SpectroStar (BMG Labtech, Aylesbury, UK) and Bioanalyser (Agilent Technologies, Cheadle, UK). Microarray experiments were performed at Cambridge Genomic Services, University of Cambridge, using the Human HT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina, Chesterford, UK) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 200 ng of total RNA was linearly amplified using the Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Life Technologies, Paisley, UK) according to the manufacturer's instructions. The concentration, purity and integrity of the resulting cRNA were measured by SpectroStar and Bioanalyzer. Finally, cRNA was hybridized to Human HT-12 v4 BeadChips overnight before being washed, stained and scanned using a Bead Array Reader (Illumina). Raw data were loaded into R using Bioconductor's lumi package (Du P et al.; Bioinformatics 2008 24:1547-8) and divided into subsets according to the groups to be compared. Only samples relevant to a given comparison are used. The subset was then filtered using detection p-values from Illumina to remove non-expressed probes. Probes whose intensity values were not statistically significantly different (P>0.01) from the negative control across all samples were removed from the analysis. After filtering, the data were transformed using a variance-stabilizing transform from lumi (Lin et al., Nucliec Acids Res. 2008, 36), followed by normalization using quantile normalization, resulting in Removed technical variations. Comparisons were made using the limma package (Smyth GK, Stat Appl Genet Mol Biol 2004 3) with results corrected using false discovery rate (FDR) correction for multiple testing. Finally, data quality was assessed along with correlations between samples within groups.

ＥＣＯの総合的な転写「シグネチャ」に相当するＨＥＰとＥＣＯとの間で発現が異なるプローブを、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（ＭａｘＱｕａｎｔ）を使用してユークリッド階層クラスタリングのために選択した。種々の条件にわたるｌｏｇ２正規化プローブ発現値の標準スコア（ｚ－スコア）を計算し、この分析のために使用した。ヒートマップ及び主成分分析（ＰＣＡ）プロットは、ＭａｘＱｕａｎｔ Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（Tyanova S et al., Nat. Methods 2016 13:731-40）を使用して作成した。NIAID／NIHのＤａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ） ｖ６．８（Huang D.W. et al., Nat. Protoc. 2008, 4:44-57）を使用して、機能的アノテーション及び遺伝子オントロジー解析をＰＣとＥＣＯとの間で発現が異なる遺伝子に対して行った（図１ｄ）。 Probes differentially expressed between HEP and ECO representing an overall transcriptional 'signature' of ECO were selected for Euclidean hierarchical clustering using Perseus software (MaxQuant). A standard score (z-score) of log2-normalized probe expression values across various conditions was calculated and used for this analysis. Heatmaps and principal component analysis (PCA) plots were generated using MaxQuant Perseus software (Tyanova S et al., Nat. Methods 2016 13:731-40). Functional annotation and gene ontology analysis were performed using the NIAID/NIH Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.8 (Huang D.W. et al., Nat. Protoc. 2008, 4:44-57). It was performed for genes with differential expression between PC and ECO (Fig. 1d).

１．７ ウェスタン分析
総タンパク質を、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｉｏｎ Ｘ－１００並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤）を用いて抽出した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社）によって製造業者の使用説明書に従って測定した。１％のβ－メルカプトエタノールを含む１×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファーを添加することによりウェスタンブロットのために試料を調製し、９５℃で５分間インキュベートした。タンパク質（２５μｇ）を、４％～１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Invitrogen社）により分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad社）に転写した。タンパク質を、ホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）（Cell Signalling Technology社）、活性β－カテニン（Millipore社）、総β－カテニン（R&D社）、α－チューブリン（Sigma社）に特異的な抗体でプロービングした後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗マウス、抗ヤギ又は抗ウサギ二次抗体と一緒にインキュベートすることによって検出した。メンブレンを、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウェスタンブロッティング基質（Thermo Scientific社）を使用して製造業者の使用説明書に従って現像した。 1.7 Western Analysis Total protein was analyzed in lysis buffer (50 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Trition X-100 and proteases and Phosphatase inhibitor) was used for extraction. Protein concentration was determined by BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions. Samples were prepared for Western blotting by adding 1×NuPAGE LDS sample buffer containing 1% β-mercaptoethanol and incubating at 95° C. for 5 minutes. Proteins (25 μg) were separated by 4%-12% NuPAGE Bis-Tris protein gels (Invitrogen) and transferred to PVDF membranes (Bio-Rad). Proteins were specific for phospho-β-catenin (Ser33/37/Thr41) (Cell Signaling Technology), active β-catenin (Millipore), total β-catenin (R&D), α-tubulin (Sigma). After probing with a specific antibody, detection was performed by incubation with horseradish peroxidase anti-mouse, anti-goat or anti-rabbit secondary antibodies. Membranes were developed using Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) according to the manufacturer's instructions.

１．８ Ｒｈｏキナーゼ活性分析
Ｒｈｏキナーゼ活性を、市販のキット（Cell Biolabs社、ＳＴＡ－４１６）を使用して製造業者の使用説明書に従って計測した。 1.8 Rho Kinase Activity Assay Rho kinase activity was measured using a commercial kit (Cell Biolabs, STA-416) according to the manufacturer's instructions.

１．９ フローサイトメトリー分析
ＥＣＯオルガノイドを、Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を４℃で３０分間使用して採取し、４４４ｇで４分間遠心分離し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Gibco社）を使用して単一細胞に解離させた。細胞を４％のＰＦＡを使用して４℃で２０分間にわたり固定した。細胞染色及びフローサイトメトリー分析は、Sampaziotis F.ら（Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275）及びBertero A.ら（Genes Dev. 2015 29:702-17）に記載されるように実施した。 1.9 Flow Cytometry Analysis ECO organoids were harvested using Cell Recovery Solution (Corning) for 30 minutes at 4°C, centrifuged at 444g for 4 minutes, and analyzed using TrypLE™ Express (Gibco). were dissociated into single cells. Cells were fixed with 4% PFA for 20 minutes at 4°C. Cell staining and flow cytometric analysis were performed as described in Sampaziotis F. et al. (Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275) and Bertero A. et al. (Genes Dev. 2015 29:702-17). was carried out on

１．１０ 核型分析
ＥＣＯオルガノイドを、Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を使用して採取し、上記のように単一細胞に解離させ、ゼラチン被覆プレートに播種し、添加物を含むウィリアムＥ培地を使用して培養した。細胞がサブコンフルエントになったときに、通常は７２時間後に、培養物を、０．１μｇ／ｍｌのコルセミド（Ｋａｒｙｏｍａｘ（商標）、Gibco社）を含有する添加物を含むウィリアムＥ培地と一緒に３時間～４時間にわたりインキュベートした。次いで、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Gibco社）を３７℃で４分間～５分間使用して細胞を採取し、３４４ｇで５分間遠心分離し、５ｍｌのＫＣｌ低張液（０．０５５Ｍ）中で再懸濁した。懸濁液を３４４ｇで５分間再遠心分離し、３：１の１００％メタノール：氷酢酸溶液２ｍｌを加え、記載されるように（Campos P.B. et al., J. Vis. Exp 2009 4-7）スライドを調製した。 1.10 Karyotyping ECO organoids were harvested using the Cell Recovery Solution (Corning), dissociated into single cells as described above, plated on gelatin-coated plates, and supplemented with William E medium. cultured using When the cells were subconfluent, usually after 72 hours, cultures were plated for 3 hours with Williams E medium supplemented with 0.1 μg/ml colcemid (Karyomax™, Gibco). Incubated for 1 hour to 4 hours. Cells were then harvested using Trypsin-EDTA (0.05%) (Gibco) at 37° C. for 4-5 minutes, centrifuged at 344 g for 5 minutes and added to 5 ml of KCl hypotonic solution (0.055 M). ). The suspension was recentrifuged at 344 g for 5 min and 2 ml of a 3:1 100% methanol:glacial acetic acid solution was added, as described (Campos PB et al., J. Vis. Exp 2009 4-7). Slides were prepared.

１．１１ 比較ゲノムハイブリダイゼーション分析
ゲノムＤＮＡを、ＢｉｏＰｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen社）を使用して製造業者の使用説明書に従って標識し、試料をAgilent社のＳｕｒｅｐｒｉｎｔ Ｇ３ ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＧＨ ＩＳＣＡ ８ｘ６０Ｋヒトゲノムアレイに製造業者のプロトコルに従ってハイブリダイズさせた。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアを使用して分析した。 1.11 Comparative Genomic Hybridization Analysis Genomic DNA was labeled using the BioPrime DNA Labeling Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and samples were transferred to Agilent's Sureprint G3 unrestricted CGH ISCA 8x60K Human Genome Array according to the manufacturer's instructions. were hybridized according to the protocol of Data were analyzed using Agilent CytoGenomics software.

１．１２ ローダミン１２３輸送アッセイ
ローダミン１２３輸送アッセイは、Sampaziotis F.ら（Nat. Biotechnol. 2015, 1-11）に記載されるように実施し、画像をZeiss社のＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を使用して取得した。蛍光強度をオルガノイド内部と外部との間で計測し、内腔の蛍光を腔外空間のバックグラウンドに対して正規化した。各実験は３連で繰り返した。エラーバーは、標準偏差を表す。 1.12 Rhodamine 123 transport assay Rhodamine 123 transport assay was performed as described by Sampaziotis F. et al. (Nat. Biotechnol. 2015, 1-11) and images were obtained using a Zeiss LSM 700 confocal microscope. obtained. Fluorescence intensity was measured between the interior and exterior of the organoid, and luminal fluorescence was normalized to the extraluminal space background. Each experiment was repeated in triplicate. Error bars represent standard deviation.

１．１３ コリル－リジル－フルオレセイン輸送アッセイ
コリル－リジル－フルオレセイン（ＣＬＦ、Corning Incorporated社）による負荷を実現するために、ＥＣＯオルガノイドを５μＭのＣＬＦ中で分割し、３７℃で３０分間インキュベートした。Zeiss社のＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、ローダミン１２３輸送アッセイについて説明したように、オルガノイド内部と外部との間で蛍光強度を計測した。観察されたＣＬＦ蛍光強度の変化がオルガノイド内腔からのＣＬＦの能動的排出に続発することを裏付けるために、５μＭの非共役フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Sigma-Aldrich社）をコントロールとして用いて実験を繰り返した。蛍光強度測定は、ローダミン１２３輸送アッセイについて記載したように実施した。 1.13 Choryl-Lysyl-Fluorescein Transport Assay To achieve loading with cholyl-lysyl-fluorescein (CLF, Corning Incorporated), ECO organoids were split in 5 μM CLF and incubated at 37° C. for 30 minutes. Images were acquired using a Zeiss LSM 700 confocal microscope and fluorescence intensity was measured between the interior and exterior of the organoids as described for the rhodamine 123 transport assay. To confirm that the observed changes in CLF fluorescence intensity are secondary to active ejection of CLF from the organoid lumen, experiments were performed using 5 μM unconjugated fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich) as a control. repeated. Fluorescence intensity measurements were performed as described for the rhodamine 123 transport assay.

１．１４ ＧＧＴ活性
ＧＧＴ活性を、ＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）酵素アッセイキット（Bioo Scientific社）を使用して製造業者の使用説明書に基づいて３連で計測した。エラーバーは、標準偏差を表す。 1.14 GGT activity GGT activity was measured in triplicate using the MaxDiscovery™ γ-glutamyltransferase (GGT) enzyme assay kit (Bioo Scientific) according to the manufacturer's instructions. Error bars represent standard deviation.

１．１５ アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（Promega社）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。 1.15 Alkaline Phosphatase Staining Alkaline phosphatase was performed using the BCIP/NBT chromogenic substrate (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitroblue tetrazolium) (Promega) according to the manufacturer's instructions. bottom.

１．１６ セクレチン及びソマトスタチンへの応答
セクレチン及びソマトスタチンへの応答は、Sapazoits Fら（Biotechnol. 2015 1-11）に記載されるように評価した。 1.16 Responses to Secretin and Somatostatin Responses to secretin and somatostatin were assessed as described by Sapazoits F et al. (Biotechnol. 2015 1-11).

１．１７ 緑色蛍光タンパク質を発現するＥＣＯの作製
ＥＧＦＰを発現するＶＳＶ－Ｇ偽型の組み換えＨＩＶ－１レンチウイルス粒子を、３つのプラスミドをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）に一過性に同時トランスフェクションすることにより、最適化された第２世代パッケージングシステムを用いて作製した。ＥＧＦＰ発現は、コアＥＦ１αプロモーターの制御下にある。全てのプラスミドは、Didier Tronoからの寄贈であり、addgene社から取得した（ｐＷＰＴ－ＧＦＰ番号１２２５５、ｐｓＰＡＸ２番号１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ番号１２２５９）。オルガノイドのウイルス感染は、Koo, B-Kら（Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2013, 27 Unit 5A.6）に記載したように実施した。感染したＥＣＯを２代継代にわたり増殖させ、フローサイトメトリー分析について上記したように採取し、ＧＦＰ陽性細胞のためのフローサイトメトリーによるセルソーティングを実施した。ＧＦＰを発現する単一細胞を、本発明者らの標準的な播種法を使用して播種し、添加物を含むウィリアムＥ培地中で、完全に成長したＥＣＯオルガノイドに発達するまで１週間～２週間にわたり培養した。 1.17 Generation of ECO Expressing Green Fluorescent Protein VSV-G pseudotyped recombinant HIV-1 lentiviral particles expressing EGFP were transiently co-transfected with the three plasmids into HEK 293T cells (ATCC CRL-11268). It was produced using an optimized second generation packaging system by transfection. EGFP expression is under the control of the core EF1α promoter. All plasmids were a gift from Didier Trono and were obtained from addgene (pWPT-GFP#12255, psPAX2#12260, pMD2.G#12259). Viral infection of organoids was performed as described by Koo, BK et al. (Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2013, 27 Unit 5A.6). Infected ECOs were grown for two passages, harvested as described above for flow cytometric analysis, and flow cytometric cell sorting for GFP-positive cells was performed. Single cells expressing GFP were seeded using our standard seeding method and allowed to develop into fully grown ECO organoids for 1-2 weeks in Williams E medium with supplements. Cultured for a week.

１．１８ ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場の作製
密度５０ｍｇ／ｃｃを有する１ｍｍの厚さのポリグリコール酸（ＰＧＡ）足場を全ての実験のために使用した。細胞を播種する前に、ＰＧＡ足場を１ＭのＮａＯＨで１０秒間～３０秒間前処理して３回洗浄し、７０％のエタノール溶液で３０分間デコンタミネーションさせた後に、全てのエタノールが完全に蒸発するまで更に３０分間風乾させた。全ての足場は、Biomedical Structures社（Ｂｉｏｆｅｌｔ）から得た。 1.18 Preparation of ECO-coated PGA scaffolds A 1 mm thick polyglycolic acid (PGA) scaffold with a density of 50 mg/cc was used for all experiments. Before seeding the cells, the PGA scaffolds were pretreated with 1 M NaOH for 10-30 seconds, washed three times, and decontaminated with a 70% ethanol solution for 30 minutes before all ethanol was completely evaporated. It was allowed to air dry for an additional 30 minutes. All scaffolds were obtained from Biomedical Structures (Biofelt).

フローサイトメトリー分析について上記したように、ＥＣＯを採取して単一細胞へと解離させた。５～１０×１０６個の細胞を、添加物を含むウィリアムＥ培地１００μｌ中に再懸濁し、１ｃｍ２の足場表面積上に播種し、３７℃で３０分間～６０分間インキュベートして、細胞を足場に付着させた。それらの足場を、２４ウェルプレートのウェル中に入れて、培地が蒸発しないことを保証するためにこの期間の間に規則的な間隔で確認した。必要に応じて、添加物を含むウィリアムＥ培地１０μｌ～２０μｌを加えた。１時間後に、添加物を含むウィリアムＥ培地２ｍｌ～３ｍｌをウェルに加え、培地を週に２回交換した。 ECOs were harvested and dissociated into single cells as described above for flow cytometric analysis. 5-10×10 6 cells were resuspended in 100 μl of Williams E medium with supplements, seeded onto 1 cm 2 scaffold surface area and incubated at 37° C. for 30-60 minutes to allow cells to form scaffolds. attached to. The scaffolds were placed in wells of a 24-well plate and checked at regular intervals during this period to ensure that the medium did not evaporate. 10-20 μl of Williams E medium with supplements was added as needed. After 1 hour, 2-3 ml of William's E medium with supplements was added to the wells and the medium was changed twice a week.

１．１９ 高密度化コラーゲン管の作製
高密度化コラーゲン管は、新規アプローチを使用して製造した。漏斗状部品と底板とからなる３Ｄ印刷されたチャンバーを作製した。２５０μｍの太さの金属ワイヤを、漏斗の中心を通して送り底板中に取り付けた。２つの３Ｄ印刷された部品の間に吸収性のペーパータオルを詰め込んだ後に、それらを共に螺合させた。細胞を負荷したコラーゲンゲル溶液５ｍｇ／ｍＬを漏斗中に注ぎ込み、３７℃で３０分間にわたりゲル化させた。その後にネジを緩め、３Ｄ印刷されたチャンバーを３７℃で２時間～４時間置くことにより、コラーゲンゲルから水を抜き取った。こうして、乾燥段階の持続時間によって決定される２５０μｍの内腔及び３０μｍ～１００μｍの壁厚を有する細胞負荷された高密度化コラーゲン管が形成された。チャンバーから取り出したら、管の余分なコラーゲンを切り落とし、必要な長さに切断した。 1.19 Fabrication of Densified Collagen Tubes Densified collagen tubes were manufactured using a novel approach. A 3D printed chamber consisting of a funnel-shaped part and a bottom plate was fabricated. A 250 μm thick metal wire was attached through the center of the funnel and into the feed bottom plate. After stuffing an absorbent paper towel between the two 3D printed parts, they were screwed together. A 5 mg/mL cell-loaded collagen gel solution was poured into the funnel and allowed to gel at 37° C. for 30 minutes. Water was then drained from the collagen gel by unscrewing and placing the 3D-printed chamber at 37° C. for 2-4 hours. Cell-loaded, densified collagen tubes were thus formed with a lumen of 250 μm and wall thicknesses of 30 μm to 100 μm, determined by the duration of the drying step. Once removed from the chamber, the tubing was trimmed of excess collagen and cut to desired length.

１．２０ ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の培養
ＨＭＥＣ及び必要な組織培養消耗品は、Lonza社からキットとして購入し（カタログ番号ＣＣ－２５５１Ｂ）、細胞を供給業者の使用説明書に従って培養した。 1.20 Culture of Human Mammary Epithelial Cells (HMEC) HMEC and necessary tissue culture consumables were purchased from Lonza as a kit (catalog number CC-2551B) and cells were cultured according to the supplier's instructions.

１．２１ 動物実験
全ての動物実験は、英国内務省規制（英国内務省プロジェクトライセンス番号ＰＰＬ ８０／２６３８及びＰＰＬ ７０／８７０２）に従って実施した。Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びＮＫリンパ球を欠如する免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Shultz L.D. et al., J. Immunol. 2005 174:6477-6489）を、手順前後に食餌及び水の自由飲食にてインハウスで飼育した。約６週齢～８週齢の雄と雌とが混ざった動物を使用した。使用された全てのＥＣＯ構築物に、総胆管由来のＥＣＯを定着させた。 1.21 Animal Experiments All animal experiments were performed in accordance with UK Home Office regulations (UK Home Office Project License Nos. PPL 80/2638 and PPL 70/8702). Immunodeficient NOD. lacking B, T and NK lymphocytes. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) mice (Shultz LD et al., J. Immunol. 2005 174:6477-6489) were housed in-house with food and water ad libitum before and after the procedure. Mixed male and female animals of approximately 6-8 weeks of age were used. All ECO constructs used were populated with ECO from the common bile duct.

１．２２ 肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）マウスモデルの作製
肝外胆管損傷のモデルを作製するために、正中線開腹術を実施し、イソフルラン全身麻酔下でその基底部を前腹壁に連結する靭帯付着部を分割することにより、胆嚢をまずは授動させた。次いで、胆嚢の長さの２／３に沿って基底部からハルトマン嚢（胆嚢頸部）に向かって縦切開を行った。 1.22 Generation of Extrahepatic Bile Duct Injury (EHBI) Mouse Model To generate a model of extrahepatic bile duct injury, a midline laparotomy is performed and ligament attachments connecting its base to the anterior abdominal wall are performed under general isoflurane anesthesia. The gallbladder was activated first by dividing the segment. A longitudinal incision was then made along 2/3 of the length of the gallbladder from the base towards the Hartmann's capsule (gallbladder neck).

１．２３ ＥＨＢＩマウスにおける胆管再建
胆嚢を再建するために、約１×１ｍｍの寸法の足場セクション（ＥＣＯが播種される又はコントロールではＥＣＯは播種されない）を「パッチ」として縫合し、欠損部を４０倍率下で４箇所～６箇所の１０’０の非吸収性ナイロン結節縫合糸を使用して閉じた。開腹は、２層で５’０の吸収性Ｖｉｃｒｙｌ連続縫合糸により閉じた。動物にブプレノルフィン（ｔｅｍｇｅｓｉｃ ０．１ｍｇ／ｋｇ）鎮痛薬をボーラスとして投与し、完全に回復するまで個々のケージで１５分毎に観察した。 1.23 Bile Duct Reconstruction in EHBI Mice To reconstruct the gallbladder, scaffold sections measuring approximately 1×1 mm (either seeded with ECO or not seeded with ECO in controls) were sutured as a 'patch' and the defect was treated with 40 needles. It was closed using 4-6 10'0 non-absorbable nylon interrupted sutures under magnification. The laparotomy was closed with two layers of 5'0 absorbable running Vicryl suture. Animals were administered buprenorphine (temgesic 0.1 mg/kg) analgesic as a bolus and observed in individual cages every 15 min until complete recovery.

１．２４ 胆管置換
天然の総胆管を分割して、短いセグメントを切除した。定着された高密度化コラーゲン管を、分割された近位総胆管と遠位総胆管との間で１０’０のナイロン結節縫合糸を使用して端々吻合した。長さ５’０のナイロン縫合材料（直径１００μｍ）をコラーゲン管に挿入し、近位総胆管及び遠位総胆管へと送ることで、吻合の間の内腔の開通性を確保した。吻合が完了した後に、遠位胆管を通じて５’０の縫合糸を十二指腸に押し込み、十二指腸の切開部から取り出した後に、１０’０のナイロン結節縫合糸で閉じた。内腔の開通性は、移植の時点で光学顕微鏡検査及び５’０の非吸収性縫合糸による内腔の挿管によって評価した。細胞浸潤により管が完全に閉塞された場合に、移植は無益であるので断念された。これらの事象は、外科合併症ではなく構築物／管の障害とみなされるため、生存分析において打ち切らなかった。 1.24 Bile Duct Replacement The native common bile duct was divided and a short segment excised. The anchored densified collagen duct was anastomosed end to end using a 10'0 nylon interrupted suture between the divided proximal and distal common bile ducts. A 5′0 length of nylon suture material (100 μm diameter) was inserted into the collagen duct and advanced into the proximal and distal common bile duct to ensure patency of the lumen during the anastomosis. After the anastomosis was completed, a 5′0 suture was pushed into the duodenum through the distal bile duct and closed with a 10′0 nylon interrupted suture after removal from the duodenal incision. Luminal patency was assessed at the time of implantation by light microscopy and cannulation of the lumen with a 5'0 non-absorbable suture. Transplantation was futile and abandoned when the ducts were completely occluded by cellular infiltration. These events were not censored in survival analyses, as they were considered construct/vascular failure rather than surgical complications.

１．２５ 胆管結紮
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Jackson Laboratory社（メイン州、バーハーバー）から購入した。マウスを、オスロのリクショスピタレットにあるオスロ大学病院の動物施設の最小病棟に収容して飼育した。全ての実験は、８週齢から１２週齢の間の雄のマウスに対して行った。正中線開腹術を行い、総胆管を露出させ、肝胆管の接合部近くで結紮した。偽手術マウスには、結紮せずに同じ手順を行った。血清を５日後に採取した。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を、血清中でＡＤＶＩＡ １８００（Siemens社）を使用してノルウェー獣医学校の中央研究所で計測した。全ての動物実験はノルウェー食品***（プロジェクトライセンス番号ＦＯＴＳ ８２１０／１５）によって承認され、全ての動物は「実験動物の管理と使用に関する指針」（アメリカ国立衛生研究所出版、第８版、２０１１年）に沿って人道的管理を受けた。 1.25 Bile Duct Ligation C57BL/6 mice were purchased from Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me.). Mice were housed and bred in the minimal ward of the animal facility of Oslo University Hospital, Likshospitalet, Oslo. All experiments were performed on male mice between 8 and 12 weeks of age. A midline laparotomy was performed and the common bile duct was exposed and ligated near the hepatobiliary junction. Sham-operated mice underwent the same procedure without ligation. Serum was collected after 5 days. Alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) were measured in serum using an ADVIA 1800 (Siemens) at the central laboratory of the Norwegian Veterinary School. All animal experiments were approved by the Norwegian Food Safety Authority (project license number FOTS 8210/15) and all animals were evaluated in the "Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Institutes of Health publication, 8th edition, 2011). ) under humane management.

１．２６ 血液試料収集及び処理
動物を選択し屠殺する時点で終末麻酔下にて下大静脈から直接的に２３ｇの針を使用して採血し、更なる処理のために１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに移した。 1.26 Blood Sample Collection and Processing At the time of animal selection and sacrifice, blood was drawn using a 23 g needle directly from the inferior vena cava under terminal anesthesia and placed in 1.5 ml Eppendorf volumes for further processing. transferred to a tube.

血液試料を、ケンブリッジ大学のコアバイオケミカルアッセイ研究所（Core biochemical assay laboratory）（ＣＢＡＬ）によって通常通りに処理した。試料分析の全ては、Siemens社のＤｉｍｅｎｓｉｏｎ ＥＸＬアナライザーにおいてSiemens社により供給される試薬及びアッセイプロトコルを使用して実施した。 Blood samples were processed routinely by the Core biochemical assay laboratory (CBAL) at the University of Cambridge. All sample analyzes were performed on a Siemens Dimension EXL analyzer using reagents and assay protocols supplied by Siemens.

１．２７ 光学顕微鏡イメージング
切除された再建された胆嚢の光学顕微鏡画像は、Leica社のＭＺＦＬＩＩＩ蛍光解剖顕微鏡を使用して取得した。画像は５匹の動物の代表的なものである。 1.27 Light Microscopic Imaging Light microscopic images of resected reconstructed gallbladders were obtained using a Leica MZFLIII fluorescence dissecting microscope. Images are representative of 5 animals.

１．２８ 凍結切片及び組織学
切除した胆嚢を４％のＰＦＡ中で固定し、スクロース溶液に一晩浸し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、切片化するまで－８０℃で貯蔵した。クライオスタットミクロトームを使用して切片を１０μｍの厚さに切断し、更なる分析のために顕微鏡スライド上で封入した。 1.28 Cryosectioning and Histology Excised gallbladders were fixed in 4% PFA, immersed in sucrose solution overnight, embedded in optimal cutting temperature (OCT) compound, and stored at −80° C. until sectioning. bottom. Sections were cut at 10 μm thickness using a cryostat microtome and mounted on microscope slides for further analysis.

１．２９ ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
Ｈ＆Ｅ染色は、Sigma-Aldrich社の試薬を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、組織切片を水和し、マイヤーのヘマトキシリン液で５分間処理し（Sigma-Aldrich社）、温かい水道水で１５分間洗浄し、蒸留水中に３０秒間～６０秒間置いて、エオシン溶液（Sigma-Aldrich社）で３０秒間～６０秒間処理した。切片を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（商標）速硬性封入剤（Sigma-Aldrich社）を使用して封入した。組織学切片は、肝胆管組織学に特に関心を持つ独立した組織病理学者によって再調査された。 1.29 Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining H&E staining was performed using reagents from Sigma-Aldrich according to the manufacturer's instructions. Briefly, tissue sections were hydrated, treated with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes (Sigma-Aldrich), washed with warm tap water for 15 minutes, placed in distilled water for 30-60 seconds, and treated with eosin solution ( Sigma-Aldrich) for 30-60 seconds. Sections were dehydrated and mounted using Eukitt™ fast-hardening mounting medium (Sigma-Aldrich). Histological sections were reviewed by an independent histopathologist with a specific interest in hepatobiliary histology.

１．３０ ＴＵＮＥＬアッセイ
ＴＵＮＥＬアッセイは、市販のキット（abcam社、ａｂ６６１１０）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。 1.30 TUNEL Assay The TUNEL assay was performed using a commercially available kit (abcam, ab66110) according to the manufacturer's instructions.

１．３１ フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）胆管造影
ｉｎ ｓｉｔｕでのＦＩＴＣ胆管造影は、屠殺された動物において、付着肝葉を有しない胆嚢を解剖した後であるが肝外胆管系の外科的切離の前に行われた。遠位胆管に２３と１／２ゲージの針を挿管し、ＦＩＴＣを胆嚢に逆行的に注入し、蛍光顕微鏡下で撮像した。 1.31 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Cholangiography In situ FITC cholangiography was performed in sacrificed animals after dissection of the gallbladder without attached liver lobes, but after surgical dissection of the extrahepatic biliary system. done before. The distal bile duct was intubated with a 23½ gauge needle and FITC was retrogradely injected into the gallbladder and imaged under a fluorescence microscope.

１．３２ 磁気共鳴胆管膵臓造影（ＭＲＣＰ）
磁気共鳴胆管膵臓造影は、動物の屠殺後に実施した。ＭＲＣＰは、Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｅｃ ４７／４０システムを使用して４．７Ｔで実施した。緩和促進を伴う高速取得のシーケンスを、９．５ｍｓ間隔で４０エコーのエコートレイン長、１０００ｍｓの繰り返し時間、５．８４×４．１８×４．１８ｃｍ３の撮像視野と共に２５６×１８０×１８０のマトリックスにより使用することで、２３０μｍの等方性解像度が得られた。Bruker社により提供されるアクティブデカップリングされた４チャンネルマウス心臓アレイ（actively-decoupled four-channel mouse cardiac array）を撮像に使用した。 1.32 Magnetic Resonance Cholangiopancreatography (MRCP)
Magnetic resonance cholangiopancreatography was performed after animal sacrifice. MRCP was performed at 4.7T using a Bruker BioSpec 47/40 system. A sequence of fast acquisitions with relaxation enhancement was performed on a 256 × 180 × 180 matrix with an echo train length of 40 echoes at 9.5 ms intervals, a repetition time of 1000 ms, and an imaging field of view of 5.84 × 4.18 × 4.18 cm3 . obtained an isotropic resolution of 230 μm. An actively-decoupled four-channel mouse cardiac array provided by Bruker was used for imaging.

撮像された２番目のマウスについては、信号対雑音比をより高くして胆管の視覚化を改善するために、２次元シーケンスを、僅かに変更したパラメーター（１１ｍｓ間隔で２４の離れたエコーにより、１１０ｍｓの有効エコー時間が得られる；繰り返し時間５７４１ｍｓ；マトリックスサイズ２５６×２５６；撮像視野４．３３×５．３５ｃｍ２により、平面解像度１７０×２００μｍ２が得られる）で使用した。１５枚のスライスを、厚さ０．６ｍｍで肝臓及び胆嚢を通して冠状に取得した。この取得のために、ボリュームコイルを使用して、無線周波数の不均一性の影響を減らした。 For the second mouse imaged, the two-dimensional sequence was modified with slightly modified parameters (24 distant echoes with 11 ms An effective echo time of 110 ms is obtained; a repetition time of 5741 ms; a matrix size of 256×256; Fifteen slices were obtained coronally through the liver and gallbladder at a thickness of 0.6 mm. For this acquisition, a volume coil was used to reduce the effects of radio frequency inhomogeneities.

胆管及び胆嚢を検査するために、最大値投影法により画像を作成した。腫瘍成長を除外する構造イメージングを、２５°のフリップ角、１４ｍｓの繰り返し時間及び７ｍｓのエコー時間でＴ１加重３Ｄ ＦＬＡＳＨ（高速低角度励起）シーケンスを使用して実施した。マトリックスは５１２×２５６×２５６であり、撮像視野は５．１２×２．５６×２．５６ｃｍ３であり、最終的な等方性解像度は１００μｍであった。ＭＲＣＰ画像は、肝胆管放射線学に特に関心を持つ２人の独立した放射線学者によって再調査された。 Images were generated by maximum intensity projection to examine the bile ducts and gallbladder. Structural imaging, excluding tumor growth, was performed using a T1-weighted 3D FLASH (fast low angle excitation) sequence with a flip angle of 25°, repetition time of 14 ms and echo time of 7 ms. The matrix was 512 × 256 × 256, the imaging field was 5.12 × 2.56 × 2.56 cm3 , and the final isotropic resolution was 100 µm. The MRCP images were reviewed by two independent radiologists with a specific interest in hepatobiliary radiology.

１．３３ 統計分析
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。記述統計が適切でない小さなサンプルサイズの場合には、個々のデータ点をプロットした。２つの平均値を比較するために、両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性を計算した。本発明者らの値の正規分布は、適宜、ダゴスティーノ・ピアソンの総括的な正規性検定を使用して確認した。サンプル間の分散は、ブラウン・フォーサイス検定を使用して検定された。多群と参照群との比較のために、分散が等しい群間で多重比較のためにダネット補正を伴う一元配置分散分析を使用し、その一方で、分散が等しくない群には、多重比較のためにダンの補正を伴うクラスカル・ワリス検定を適用した。生存率は、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定を使用して比較した。反復数（ｎ）が与えられている場合に、これは、別段の定めがない限りＥＣＯ系統又は異なる動物の数を指す。 1.33 Statistical Analysis All statistical analyzes were performed using GraphPad Prism 6. For small sample sizes where descriptive statistics were not adequate, individual data points were plotted. Statistical significance was calculated using a two-tailed Student's t-test to compare two mean values. The normal distribution of our values was confirmed using the D'Agostino-Pearson global normality test when appropriate. Variance between samples was tested using the Brown-Forsythe test. One-way analysis of variance with Dunnett's correction for multiple comparisons between groups with equal variances was used for comparisons between multiple groups and the reference group, while groups with unequal variances were analyzed for multiple comparisons. We applied the Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for Survival rates were compared using the log-rank (Mantel-Cox) test. Where replicate numbers (n) are given, this refers to the number of ECO strains or different animals unless otherwise specified.

２．結果
２．１ ヒト肝外胆管細胞はオルガノイドとして成長し得る
本発明者らはまず、胆管系の内腔表面を覆う単層を形成する胆管上皮から初代胆管細胞を分離するための最適条件の特定に焦点を絞った（Kanno N. et al., Hepatology 2000 31:555-61）。本発明者らは、これらの細胞を回収するために、機械的スクレイピング並びにトリプシン又はコラゲナーゼ及び／又はディスパーゼによる酵素的消化を含む幾つかのアプローチを試験した（図１）。胆管内腔をブラッシング又はスクレイピングすることによる機械的解離は、酵素的消化と比較して生存率の改善を伴った（図１及び図２）。さらに、得られた細胞の大部分は、胆管マーカーＣＫ７及びＣＫ１９を共発現したが（９４．６％±２．４％、標準偏差；ｎ＝３）、間葉系細胞型からのコンタミネーションは検出されなかった。したがって、機械的解離は、肝外胆管細胞を採取するための最適な方法とみなされる。 2. Results 2.1 Human extrahepatic cholangiocytes can grow as organoids We first identified optimal conditions for isolating primary cholangiocytes from the biliary epithelium that forms the monolayer covering the luminal surface of the biliary system. (Kanno N. et al., Hepatology 2000 31:555-61). We tested several approaches to recover these cells, including mechanical scraping and enzymatic digestion with trypsin or collagenase and/or dispase (Fig. 1). Mechanical dissociation by brushing or scraping the bile duct lumen was associated with improved viability compared to enzymatic digestion (Figures 1 and 2). Furthermore, the majority of cells obtained co-expressed the bile duct markers CK7 and CK19 (94.6%±2.4%, standard deviation; n=3), whereas contamination from mesenchymal cell types was Not detected. Therefore, mechanical dissociation is considered the method of choice for harvesting extrahepatic cholangiocytes.

これらの細胞の維持及び成長のために適切な条件を見分けるために、ヒト人工多能性幹細胞由来の肝内胆管細胞の３Ｄ培養用に確立されたシステムを最適化した（Sampaziotis F. et al., Biotechnol. 2015 -11、Sampaziotis F. et al., Nat. Protoc. 12:814-827）。胆管細胞及び上皮オルガノイドの増殖に対応することが知られている多数の成長因子のスクリーニング（LeSage, G et al., Liver 2001 21:73-80、Huch M et al., Cell 2014 160:299-312）により、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｒ－スポンジン及びＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ－１）の組み合わせが、初代胆管細胞のオルガノイドへの成長を促進するのに十分であると特定された（図４）。 To discern suitable conditions for the maintenance and growth of these cells, we optimized an established system for 3D culture of human induced pluripotent stem cell-derived intrahepatic cholangiocytes (Sampaziotis F. et al. 2015-11, Sampaziotis F. et al., Nat. Protoc. 12:814-827). Screening of numerous growth factors known to support the proliferation of cholangiocytes and epithelial organoids (LeSage, G et al., Liver 2001 21:73-80; Huch M et al., Cell 2014 160:299- 312) identified that the combination of epidermal growth factor (EGF), R-spondin and Dickkopf-related protein 1 (DKK-1) is sufficient to promote the growth of primary cholangiocytes into organoids (Fig. 4).

Ｗｎｔ増強剤（Ｒ－スポンジン）及び阻害剤（ＤＫＫ－１）の両方について矛盾するとみられる要求のため、本発明者らは、ＥＣＯにおける古典的及び非古典的／ＰＣＰ Ｗｎｔ経路の活性の特性評価を行った。本発明者らの結果は、Ｒ－スポンジンで処理されたがＤＫＫ－１で処理されていない細胞と比較して、ＥＣＯにおけるβ－カテニンのリン酸化が高いことを裏付けており（図５）、これらの細胞において古典的ＷＮＴ経路の活性がより低いことを意味する。さらに、ＥＣＯは、Ｒ－スポンジンで処理されたがＤＫＫ－１で処理されていない細胞と比較して、より高いＲｈｏキナーゼ活性を示し（図６）、それはＥＣＯにおける非古典的／ＰＣＰシグナル伝達の増強と一致している。したがって、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達はＥＣＯ増殖を制御し、以前のオルガノイド培養条件（Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312）との顕著な違いが示される。 Due to the seemingly conflicting claims for both Wnt potentiators (R-spondin) and inhibitors (DKK-1), we sought to characterize the activity of the canonical and non-canonical/PCP Wnt pathways in ECO. did Our results confirm higher phosphorylation of β-catenin in ECO compared to cells treated with R-spondin but not with DKK-1 (Fig. 5). This means that the canonical WNT pathway is less active in these cells. Moreover, ECO exhibited higher Rho kinase activity compared to cells treated with R-spondin but not DKK-1 (Fig. 6), suggesting that non-canonical/PCP signaling in ECO consistent with augmentation. Thus, non-canonical Wnt signaling controls ECO growth, demonstrating marked differences from previous organoid culture conditions (Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312).

これらの条件下で、本発明者らは、３３歳から７７歳までの様々な死亡したドナーから８種類のＥＣＯ系統を得た。特に、胆嚢から分離された胆管細胞を使用するか、又は内腔をスクレイピングするのではなく内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）ブラシを使用して総胆管の胆管細胞を採取することにより、同様の結果が得られた（図７）。重要なことには、本発明者らのシステムは、生検組織又はソーティングされた胆管細胞からの肝内ＣＯ（ＩＣＯ）を得るためにも使用された（図２７）。したがって、ＣＯは、胆管系（肝内、肝外又は胆嚢）のどの領域からも得られ、周術期（解剖、スクレイピング又はコラゲナーゼ及びリベラーゼ等の酵素を使用する酵素的解離）アプローチ又は低侵襲性（ＥＲＣＰブラッシング、肝生検）アプローチを使用して採取され得る。 Under these conditions, we obtained eight ECO lines from various deceased donors aged 33 to 77 years. In particular, by using cholangiocytes isolated from the gallbladder or harvesting cholangiocytes of the common bile duct using an endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) brush rather than scraping the lumen. , gave similar results (Fig. 7). Importantly, our system was also used to obtain intrahepatic CO (ICO) from biopsied tissue or sorted cholangiocytes (Fig. 27). Therefore, CO can be obtained from any region of the biliary system (intrahepatic, extrahepatic or gallbladder) and either perioperative (dissection, scraping or enzymatic dissociation using enzymes such as collagenase and liberase) approaches or minimally invasive methods. (ERCP brushing, liver biopsy) approach.

２．２ ＥＣＯは、培養において主要な胆管マーカー及び機能を維持する
得られた細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれらの遺伝的安定性を維持しながら長期間（２０代継代）にわたり増殖された。電子顕微鏡検査により、繊毛、微絨毛及び密着結合を含む特徴的な微細構造的特徴の存在が明らかになり、一方で、ＱＰＣＲ及び免疫蛍光（ＩＦ）分析により、図８及び図２８に示されるように、サイトケラチン７（ＫＲＴ７又はＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９又はＣＫ１９）、肝細胞核因子１ベータ（ＨＮＦ１Ｂ）、ＧＧＴ、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ／ＳＬＣ１０Ａ２）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）及びＳＲＹ－ｂｏｘ ９（ＳＯＸ９）（Sampaziotis F. et al., Biotechnol. 2015 1-11）等の主要な胆管マーカーの発現が確立された。重要なことには、本発明者らの培養システムは、胆管細胞オルガノイドの増殖のみを可能にする。肝細胞等の他の肝細胞型は、肝マーカーの下方調節によって示されるように、成長しない（例えば、図２８を参照）。 2.2 ECO Maintains Key Bile Duct Markers and Functions in Culture The obtained cells were expanded for a long period of time (20 passages) while maintaining their genetic stability in vitro. Electron microscopy revealed the presence of characteristic ultrastructural features, including cilia, microvilli and tight junctions, while QPCR and immunofluorescence (IF) analysis revealed the presence of cilia, microvilli and tight junctions, as shown in FIGS. , cytokeratin 7 (KRT7 or CK7), cytokeratin 19 (KRT19 or CK19), hepatocyte nuclear factor 1 beta (HNF1B), GGT, secretin receptor (SCTR), sodium-dependent bile acid transporter (ASBT/SLC10A2) , cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and SRY-box 9 (SOX9) (Sampaziotis F. et al., Biotechnol. 2015 1-11). Importantly, our culture system only allows the growth of cholangiocyte organoids. Other hepatocyte types, such as hepatocytes, do not grow as indicated by down-regulation of hepatic markers (see, eg, Figure 28).

注目すべきことに、ＰＯＵ５Ｆ１又はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）ＬＧＲ－４／５／６等の幹細胞マーカー、アルブミン（ＡＬＢ）、α１－アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１又はＡ１ＡＴ）、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、インスリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）を含む非胆管系譜のマーカー、並びにＥＭＴマーカー（ビメンチン（ＶＩＭ）、ｓｎａｉｌファミリー転写リプレッサー１（ＳＮＡＩ１）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ４（Ｓ１００Ａ４））は検出されなかった。他方で、２０代継代した後に細胞の９８．１％±０．９％（標準偏差；ｎ＝３）は、ＣＫ７及びＣＫ１９を共発現し、それにより胆管細胞のほぼ均質な集団の存在が確認された。 Of note, stem cell markers such as POU5F1 or OCT4, NANOG, prominin 1 (PROM1), leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor (LGR) LGR-4/5/6, albumin (ALB), α1-anti Non-biliary lineage markers including trypsin (SERPINA1 or A1AT), keratin 18 (KRT18), pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1), insulin (INS) and glucagon (GCG), and EMT markers (vimentin (VIM), snail Family transcriptional repressor 1 (SNAI1) and S100 calcium binding protein A4 (S100A4)) were not detected. On the other hand, 98.1%±0.9% (standard deviation; n=3) of cells co-expressed CK7 and CK19 after 20 passages, indicating the presence of a nearly homogeneous population of cholangiocytes. confirmed.

トランスクリプトーム解析（図９）により、ＥＣＯが、多重継代にわたり安定した遺伝子発現プロファイルを維持し（１代継代（Ｐ１）対２０代継代（Ｐ２０）についてのピアソン相関係数ｒ＝０．９９）、主要な胆管マーカーを発現し、分離したての胆管細胞の近くでクラスター形成する（初代胆管細胞（ＰＣ）対２０代継代（Ｐ２０）についてのピアソン相関係数ｒ＝０．９２）が明らかになった。遺伝子オントロジー分析により、胆管上皮に特徴的な経路の濃縮が確認された。これは、肝外胆管系に由来する初代胆管細胞が、本来の特性を失うことなくｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖し得ることを裏付けている。胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）由来の細胞の単一細胞ＲＮＡシーケンシングにより、ＣＯが、特に主要組織適合性複合体分子等のマーカー及び細胞周期遺伝子の発現に関して、初代胆管細胞とは異なるトランスクリプトームシグネチャを示す（図３２及び図３３）ことが分かった。 Transcriptome analysis (Fig. 9) showed that ECO maintained a stable gene expression profile over multiple passages (Pearson correlation coefficient r = 0 for passage 1 (P1) vs. passage 20 (P20)). .99), expressing major cholangiocytes and clustering close to freshly isolated cholangiocytes (Pearson correlation coefficient r=0.92 for primary cholangiocytes (PC) vs passage 20 (P20)). ) was revealed. Gene ontology analysis confirmed the enrichment of pathways characteristic of the biliary epithelium. This confirms that primary cholangiocytes derived from the extrahepatic bile duct system can be expanded in vitro without losing their original properties. Single-cell RNA sequencing of cholangiocyte organoid (CO)-derived cells reveals that COs have a distinct transcriptomic signature from primary cholangiocytes, particularly with respect to the expression of markers such as major histocompatibility complex molecules and cell cycle genes. (FIGS. 32 and 33).

次いで、本発明者らは更に、長期培養（２０代継代）後のそれらの機能に焦点を絞ることによりＥＣＯの特性決定を行った。胆管上皮は、イオン、水及び胆汁酸の輸送を通じて胆汁の恒常性を調節する。ＥＣＯの分泌能力を、胆管細胞表面糖タンパク質多剤耐性タンパク質－１（ＭＤＲ１）のための蛍光性基質であるローダミン１２３を使用して調べた（図１０及び図１１）。ローダミン－１２３は、ＭＤＲ－１アンタゴニストのベラパミルの不存在下でのみＥＣＯ内腔に蓄積し、それによりＭＤＲ－１による能動的な分泌が確認された。胆汁酸の腔内排出は、蛍光性胆汁酸のコリン－リジル－フルオレセイン（ＣＬＦ）がＥＣＯから能動的に移出されたことを示すことによっても裏付けられた（図１２、図１３及び図３１）。さらに、ＥＣＯのＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、播種したての初代胆管細胞に匹敵した（図１４、図２９及び図３０）。ＥＣＯのセクレチン及びソマトスタチンへの応答も評価した。セクレチンは、水分泌を促進し、胆管内腔を拡張させるが、ソマトスタチンはセクレチンの効果を打ち消す。したがって、セクレチンに曝されたオルガノイドは、未処理のコントロールと比較してその直径を増大させたが、ソマトスタチンは、セクレチンの効果を阻害した（図１５）。 We then further characterized the ECOs by focusing on their function after long-term culture (20 passages). The biliary epithelium regulates bile homeostasis through the transport of ions, water and bile acids. The secretory capacity of ECO was examined using rhodamine 123, a fluorescent substrate for the cholangiocyte surface glycoprotein multidrug resistance protein-1 (MDR1) (Figures 10 and 11). Rhodamine-123 accumulated in the ECO lumen only in the absence of the MDR-1 antagonist verapamil, thereby confirming active secretion by MDR-1. Intraluminal excretion of bile acids was also supported by showing that the fluorescent bile acid choline-lysyl-fluorescein (CLF) was actively exported from ECO (Figs. 12, 13 and 31). Furthermore, ALP and GGT activities of ECO were comparable to freshly plated primary cholangiocytes (Figures 14, 29 and 30). Responses of ECO to secretin and somatostatin were also evaluated. Secretin promotes water secretion and dilates bile duct lumens, but somatostatin counteracts the effect of secretin. Thus, organoids exposed to secretin increased their diameter compared to untreated controls, whereas somatostatin inhibited the effect of secretin (Fig. 15).

したがって、本発明者らのデータは、ＥＣＯがそれらの機能的特性を長期培養後でさえも維持することを裏付けている。 Therefore, our data confirm that ECOs maintain their functional properties even after long-term culture.

２．３ ＥＣＯが定着した足場は、胆嚢壁を再建する
ＥＣＯの組織エンジニアリングのための可能性を評価するために、本発明者らは、組織再建に必要とされる構造的かつ機械的な支持物を提供するために通常使用されるポリグリコール酸（ＰＧＡ）の生分解性足場にそれらが定着する能力を調べた。実際、ＰＧＡは最も広く使用される合成ポリマーの１つである。それというのも、ＰＧＡは、周辺組織において炎症応答を誘発せず、生分解性であり、かつコラーゲン等の天然ポリマーと比較して、より柔軟で加工が容易であるからである。細胞のトラッキングを容易にするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＥＣＯを、ウイルス形質導入により作製した。得られた細胞をＰＧＡ足場に播種し、２４時間～４８時間後にＰＧＡ繊維に付着させ、足場がコンフルエントになるまで４週間成長させ続けた。注目すべきことに、２Ｄ条件で成長させた初代胆管細胞は、限られた増殖能力しか示さず（図１６）、足場に播種した場合にコンフルエンシーに達しなかった（図１７）ことから、ＥＣＯの増殖能力が、足場へのコロニー形成の成功に極めて重要であることを示唆している。定着されたＰＧＡ足場は、ピンセットで簡単に取り扱われ、手術用ブレードでより小さい部片へと分割された。足場に定着する細胞は、ＣＫ７及びＣＫ１９等の胆管マーカーの発現を保持し、上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーのＣＫ１９及びＶＩＭの形跡を示さず、ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性を含むそれらの機能的特性を維持した。したがって、ＥＣＯは、それらの機能性及びマーカー発現を維持しつつＰＧＡ足場に定着し、それにより胆管上皮に似た生体工学による組織を得ることができる。 2.3 ECO-coated scaffolds reconstruct the gallbladder wall. We investigated their ability to anchor to a biodegradable scaffold of polyglycolic acid (PGA), which is commonly used to provide products. In fact, PGA is one of the most widely used synthetic polymers. This is because PGA does not induce an inflammatory response in the surrounding tissue, is biodegradable, and is more flexible and easier to process than natural polymers such as collagen. ECOs expressing green fluorescent protein (GFP) were generated by viral transduction to facilitate cell tracking. The resulting cells were seeded onto the PGA scaffolds, allowed to attach to the PGA fibers after 24-48 hours, and continued to grow for 4 weeks until the scaffolds were confluent. Of note, primary cholangiocytes grown in 2D conditions displayed limited proliferative capacity (Fig. 16) and did not reach confluency when seeded on scaffolds (Fig. 17), indicating that ECO , suggest that the growth capacity of S. is crucial for successful colonization of scaffolds. The anchored PGA scaffold was briefly handled with forceps and divided into smaller pieces with a surgical blade. Cells that colonize the scaffold retain expression of biliary markers such as CK7 and CK19, show no evidence of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers CK19 and VIM, and demonstrate their functional properties, including ALP and GGT activity. maintained. Thus, ECOs can anchor to the PGA scaffold while maintaining their functionality and marker expression, thereby yielding a bioengineered tissue that resembles the biliary epithelium.

次いで、本発明者らは、肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）のマウスモデルにおいてＥＣＯが胆管上皮を修復する能力を定義することを決定した。胆管再建を必要とする胆管系壁の欠陥をシミュレートするために、健康なＮＳＧマウスの胆管系を、胆嚢壁における縦方向の切開によって損傷させた（図１８）。続いて、ＧＦＰ－ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場を、損傷した動物へと移植することにより胆嚢壁の手術による欠損を修復した。無細胞ＰＧＡ足場及びＧＦＰを発現する線維芽細胞が定着した足場をネガティブコントロールとして使用した。無細胞足場を受容した動物は手術の２４時間以内に死亡し（図１９）、死後検査により、胆汁漏出と一致する腹膜腔及び精嚢の黄色の色素沈着が明らかとなったが、一方で、線維芽細胞足場の群における全ての動物は、それらの胆嚢の再建に失敗し、胆嚢は胆汁の輸送又は貯蔵に不適合な線維化組織に置き換わった。対照的に、ＥＣＯを含む足場が移植された動物は、合併症なしで最大１０４日間生存し、選択して屠殺した。とりわけ、ＥＣＯ群において再建された胆嚢は、それらの天然の相当物の形態とそっくりに完全にリモデリングされた（図２０）。ＥＣＯ再建された胆嚢の組織学、ＩＦ及びＱＰＣＲ分析により、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ９、ＣＦＴＲ、及びＫｕ８０に対するヒト特異的エピトープ等の胆管マーカーを発現するＧＦＰ陽性ＥＣＯの組み込みが明らかになった。注目すべきことに、これらのＩＦ分析により、ビメンチンを発現するマウス間葉系細胞及びＣＤ３１を発現する内皮細胞が、再建された胆管上皮に存在することも判明し、こうして移植後に内因性細胞が足場にコロニー形成することが示される。 We then decided to define the ability of ECO to repair the biliary epithelium in a mouse model of extrahepatic bile duct injury (EHBI). To simulate a defect in the biliary wall requiring bile duct reconstruction, the biliary system of healthy NSG mice was injured by a longitudinal incision in the gallbladder wall (Fig. 18). Subsequently, surgical defects in the gallbladder wall were repaired by transplanting GFP-ECO-populated PGA scaffolds into injured animals. Cell-free PGA scaffolds and scaffolds populated with fibroblasts expressing GFP were used as negative controls. Animals that received acellular scaffolds died within 24 hours of surgery (Fig. 19), and postmortem examination revealed yellow pigmentation of the peritoneal cavity and seminal vesicles consistent with bile leakage, whereas All animals in the fibroblast scaffold group failed to reconstruct their gallbladders, which were replaced by fibrotic tissue incompatible with bile transport or storage. In contrast, animals implanted with scaffolds containing ECO survived up to 104 days without complications and were selected and sacrificed. Notably, the reconstructed gallbladders in the ECO group were completely remodeled to resemble the morphology of their natural counterparts (Fig. 20). Histology, IF and QPCR analysis of ECO-reconstructed gallbladders revealed integration of GFP-positive ECOs expressing bile duct markers such as human-specific epitopes for KRT19, KRT7, HNF1B, SOX9, CFTR, and Ku80. Of note, these IF analyzes also revealed that vimentin-expressing murine mesenchymal cells and CD31-expressing endothelial cells were present in the reconstructed bile duct epithelium, thus eliminating endogenous cells after transplantation. It is shown to colonize the scaffold.

さらに、本発明者らは、ＧＦＰ陽性／ビメンチン陽性／ＣＫ１９陰性の細胞の集団も特定し、こうしてＥＣＯがｉｎ ｖｉｖｏで、おそらくＥＭＴを通じて足場間質に寄与することも示唆される（図２１）。 Furthermore, we also identified a population of GFP-positive/vimentin-positive/CK19-negative cells, thus suggesting that ECO also contributes to the scaffold stroma in vivo, possibly through EMT (Fig. 21).

再建された胆嚢内腔の完全性及び胆管系との連続性を通じた胆汁へのその曝露を、臓器の摘出前に磁気共鳴胆管膵臓造影（ＭＲＣＰ）イメージングを使用して裏付け、ＦＩＴＣ胆管造影により更に確認した。死後の外科的検査及び移植１０４日後の全身磁気共鳴イメージングでは、腫瘍形成の形跡は認められず、ＩＦ分析では、隣接する肝組織におけるＧＦＰ陽性細胞が認められなかった。対照的に、線維芽細胞コントロールで再建された胆嚢は、胆嚢内腔の閉塞と、線維芽細胞特異的抗原Ｓ１００Ａ４を発現する線維芽細胞による内腔及び胆管上皮の置換とを示した。総合的に考えると、これにより、ＥＣＯがその生理的適所にコロニー形成して、合併症を起こすことなく胆管系の一部を再生する能力が裏付けられた。 The integrity of the reconstructed gallbladder lumen and its exposure to bile through its continuity with the biliary system was corroborated using magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP) imaging prior to organ removal and further by FITC cholangiography. confirmed. Postmortem surgical examination and whole-body magnetic resonance imaging 104 days after transplantation showed no evidence of tumor formation, and IF analysis revealed no GFP-positive cells in the adjacent liver tissue. In contrast, fibroblast control reconstructed gallbladders showed obstruction of the gallbladder lumen and replacement of the lumen and biliary epithelium by fibroblasts expressing the fibroblast-specific antigen S100A4. Taken together, this supported the ability of ECO to colonize its physiological niche and regenerate part of the biliary system without complications.

２．４ 生体工学による胆管は、天然のマウス胆管を置換する
胆嚢壁の再建は、ＥＣＯが損傷後の胆管上皮を修復する能力の原理証明を提供した。しかしながら、肝外胆管障害の大部分は、総胆管（ＣＢＤ）を冒す。したがって、本発明者らは、胆管置換手術に使用され得るＥＣＯが定着した管状の足場の作製に焦点を絞った。マウスＣＢＤの内径は約１００μｍであり、壁厚は５０μｍ未満であり、このため、機械的特性のためＰＧＡ足場を使用することができなかった。代わりに、本発明者らは、ＧＦＰを発現するＥＣＯが定着した（図２３）高密度化コラーゲン管状足場（図２２）を作製した。高密度化コラーゲンの使用により、外径が２５０μｍから６００μｍまでの範囲にあり、開存内腔を維持するのに十分な強度を有する構築物の作製が可能となった。とりわけ、コラーゲン足場に定着している細胞は、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ９及びＣＦＴＲ等の胆管マーカーの発現を維持し、ＧＧＴ酵素活性及びＡＬＰ酵素活性を示した。異なる起源の初代上皮細胞（ヒト乳腺上皮細胞；ＨＭＥＣ）は、同じ条件下で生存して高密度化コラーゲン管に十分に定着することができなかった。さらに、播種されたＨＭＥＣは、１０％（容量／容量）の胆汁溶液中で生存することができず、こうして胆汁耐性の生体工学による胆管を作製するためのＥＣＯの特有の能力が更に確認された。まとめると、これらの結果は、当初の特性を失うことなく、ＥＣＯが管状の高密度化コラーゲン足場に定着する能力を裏付けている。 2.4 Bioengineered Bile Ducts Replace Native Murine Bile Ducts Reconstruction of the gallbladder wall provided proof of principle for the ability of ECO to repair the biliary epithelium after injury. However, the majority of extrahepatic bile duct disorders affect the common bile duct (CBD). Therefore, we focused on creating an ECO-populated tubular scaffold that could be used for bile duct replacement surgery. Mouse CBD had an inner diameter of approximately 100 μm and a wall thickness of less than 50 μm, which precluded the use of PGA scaffolds due to their mechanical properties. Instead, we created a densified collagen tubular scaffold (Figure 22) populated with ECO expressing GFP (Figure 23). The use of densified collagen allowed the creation of constructs with outer diameters ranging from 250 μm to 600 μm and with sufficient strength to maintain a patent lumen. Notably, cells colonizing the collagen scaffolds maintained expression of bile duct markers such as KRT19, KRT7, HNF1B, SOX9 and CFTR, and exhibited GGT and ALP enzymatic activities. Primary epithelial cells of different origin (human mammary epithelial cells; HMEC) failed to survive and colonize densified collagen ducts well under the same conditions. Furthermore, seeded HMECs were unable to survive in a 10% (vol/vol) bile solution, thus further confirming the unique ability of ECO to create bile-resistant bioengineered bile ducts. . Taken together, these results support the ability of ECO to anchor into tubular densified collagen scaffolds without losing their original properties.

次いで、本発明者らは、ＮＧＳマウスの天然のＣＢＤを、上記のようなＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管からなる生体工学による管で置換することを決定した。天然のＣＢＤの中央部分を除去し、ＥＣＯが定着したコラーゲン管を近位胆管及び遠位胆管の残部に端々吻合した（図２４）。線維芽細胞が定着した管をネガティブコントロールとして使用した。胆管再建は、ＥＣＯが定着した管が移植された全ての動物で達成され、それらを移植後１ヶ月までの間追跡した。組織学及びＩＦ及びＱＰＣＲ分析により、開存内腔と共に、移植されたＧＦＰ陽性細胞による胆管上皮の形成が明らかとなり（図２５）、生着細胞によるＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＣＦＴＲ、ＳＯＸ９等の胆管マーカーの発現が確認されたが、マウス間質細胞及び内皮細胞の存在も示された。さらに、移植された管において移植１ヶ月後に最小限のアポトーシス及び増殖しか観察されなかったことから、再建された胆管上皮の安定性及び完全性が確認される。内腔開通性を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）胆管造影、ＭＲＣＰ及び血清胆汁鬱滞マーカーの計測によって更に確認した（図２６）。したがって、ＥＣＯが定着した管を受容した動物は、血清胆汁鬱滞マーカー（ビリルビン、ＡＬＰ）の上昇を示さず、イメージングにおいて開存内腔を示した。一方で、生体人工総胆管は、ｉｎ ｖｉｖｏでそのＡＬＰ活性を保持していた。対照的に、線維芽細胞が定着した全てのコラーゲン管は、内腔閉塞のために機能しなくなり、その結果、高い胆管圧及び吻合部位を通じた胆汁漏出が生じた。 We then decided to replace the native CBD of NGS mice with bioengineered tubes consisting of ECO-populated densified collagen tubes as described above. The central portion of the native CBD was removed and the ECO-populated collagen duct was anastomosed end-to-end to the rest of the proximal and distal bile ducts (Fig. 24). Fibroblast-populated tubes were used as negative controls. Bile duct reconstruction was achieved in all animals transplanted with ECO-populated ducts and they were followed for up to 1 month after transplantation. Histology and IF and QPCR analyzes revealed the formation of bile duct epithelium by transplanted GFP-positive cells, along with a patent lumen (Fig. 25), engrafting cells to form bile ducts such as KRT19, KRT7, HNF1B, CFTR, SOX9. Marker expression was confirmed, but the presence of mouse stromal and endothelial cells was also demonstrated. Furthermore, minimal apoptosis and proliferation was observed in the transplanted ducts one month after transplantation, confirming the stability and integrity of the reconstructed biliary epithelium. Luminal patency was further confirmed by fluorescein isothiocyanate (FITC) cholangiography, MRCP and measurement of serum cholestasis markers (Figure 26). Thus, animals that received ECO-colonized ducts showed no elevation of serum cholestasis markers (bilirubin, ALP) and exhibited a patent lumen on imaging. On the other hand, the bioartificial common bile duct retained its ALP activity in vivo. In contrast, all fibroblast-populated collagen ducts failed due to luminal obstruction, resulting in high bile duct pressure and bile leakage through the anastomosis site.

結論として、本発明者らの結果は、ＥＣＯが定着したコラーゲン管がｉｎ ｖｉｖｏで天然のＣＢＤを置換する能力を裏付けている。 In conclusion, our results support the ability of ECO-populated collagen ducts to replace native CBD in vivo.

さらに、本発明者らは、４、４'－メチレンジアニリン（ＭＤＡ）を投与することにより、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに胆管減少症を引き起こした。ＭＤＡ投与後の胆管損傷の存在を、Ｈ＆Ｅ染色によって確認した。次いで、ＲＦＰを発現するように操作されたヒトＥＣＯをマウスに注入し、生着及びＲＦＰを発現するＥＣＯによる新生胆管の形成を、免疫蛍光分析によって評価した。マウスにおける種々のサイズの新生胆管の形成及び胆管マーカー発現（例えば、ＫＲＴ１９）の保持が観察された。これらの実験は、本明細書に記載される増殖された胆管細胞の集団が、肝外胆管症に加えて、肝内胆管症等の肝臓を冒す疾患に対する細胞ベースの治療において有用であり得ることを裏付けている。 Furthermore, we caused cholangopenia in NOD-SCID mice by administering 4,4′-methylenedianiline (MDA). The presence of bile duct injury after MDA administration was confirmed by H&E staining. Human ECOs engineered to express RFP were then injected into mice, and engraftment and formation of new bile ducts by ECOs expressing RFP were assessed by immunofluorescence analysis. Formation of new bile ducts of varying sizes and retention of bile duct marker expression (eg, KRT19) in mice was observed. These experiments demonstrate that the expanded cholangiocyte populations described herein may be useful in cell-based therapies for diseases affecting the liver such as intrahepatic cholangiopathies, in addition to extrahepatic cholangiopathies. backed by

本明細書では、再生医療用途に適合する肝外胆管系及び肝内胆管系由来の初代ヒト胆管細胞の分離及び成長のための方法が開示されている。得られるＥＣＯ及びＩＣＯは、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＧＧＴ及びＣＦＴＲ等の主要な胆管マーカーを発現し、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、並びにセクレチン及びソマトスタチンへの応答を含むそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的特性を維持する。ＥＣＯ及びＩＣＯの組織エンジニアリング及び臨床応用への適性は、それらが生分解性足場に定着し、機能的胆管上皮へと組織化し、肝外胆管損傷のマウスモデルをレスキューする能力によって更に示される。 Disclosed herein are methods for the isolation and growth of primary human cholangiocytes from the extrahepatic and intrahepatic biliary systems that are compatible with regenerative medicine applications. The resulting ECO and ICO express key bile duct markers such as KRT7, KRT19, GGT and CFTR and maintain their in vitro functional properties including ALP activity, GGT activity, and response to secretin and somatostatin. do. The suitability of ECOs and ICOs for tissue engineering and clinical applications is further demonstrated by their ability to anchor on biodegradable scaffolds, organize into functional biliary epithelia, and rescue mouse models of extrahepatic bile duct injury.

本発明者らは、肝外胆管系及び肝内胆管系由来の上皮細胞が、それらの胆管細胞の転写シグネチャ及び機能的特性を維持しつつ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖及び成長し得ることを実証した。さらに、本発明者らの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでオルガノイドとして増殖された初代胆管細胞が、臓器再生の驚くべき特有の可能性を有することを示している。実際、本発明者らのシステムは、総胆管病理学の観点から再生医療用途のための最初の原理証明を提供する。罹患した総胆管をｉｎ ｖｉｔｒｏで生体工学によるＣＯ管で置換する能力は、小児肝移植のための主因となる胆管閉鎖症（Murray & Carithers, Hepatology 2005 41:1407-1432）又は移植後の最も一般的な合併症の１つである虚血性狭窄（Skaro AI et al., Surgery 2009 146:543-553）等の障害の管理に大きな影響を及ぼす。したがって、ＣＯが定着した足場は、胆管症の分野で高い臨床的関連性を有する新規システムとみなされる。 The inventors have demonstrated that epithelial cells from the extrahepatic and intrahepatic biliary systems can proliferate and grow in vitro while maintaining their cholangiocyte transcriptional signature and functional properties. Furthermore, our results show that primary cholangiocytes grown as organoids in vitro have a surprising and unique potential for organ regeneration. Indeed, our system provides the first proof-of-principle for regenerative medicine applications in terms of common bile duct pathology. The ability to replace diseased common bile ducts with bioengineered CO tubes in vitro has made bile duct atresia the leading cause for pediatric liver transplantation (Murray & Carithers, Hepatology 2005 41:1407-1432) or the most common post-transplantation disease. It has a major impact on the management of disorders such as ischemic stenosis (Skaro AI et al., Surgery 2009 146:543-553), which is one of the most common complications. Therefore, CO-colonized scaffolds are regarded as a novel system with high clinical relevance in the field of cholangiopathies.

肝外胆管上皮の研究は、長期培養と初代胆管細胞の大規模な増殖とにおける技術的課題により限定されている。ＥＣＯ及びＩＣＯの大規模な増殖のための能力がこの課題に対処する。実際、本発明者らは、１０５個の肝外胆管細胞から始めて、２０代継代後に１０２０個～１０２５個の細胞が生成され得ることを実証している。したがって、ＣＯは、細胞ベースの治療のための新しい細胞供給源に相当するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝外胆管系の生理学を研究し、その障害をモデリングするための特有のモデルシステムも提供する。 Studies of extrahepatic bile duct epithelium are limited by technical challenges in long-term culture and large-scale expansion of primary cholangiocytes. The ability for large-scale proliferation of ECOs and ICOs addresses this challenge. Indeed, we demonstrate that starting with 10 5 extrahepatic cholangiocytes, 10 20-10 25 cells can be generated after 20 passages. CO therefore not only represents a new cell source for cell-based therapies, but also provides a unique model system for studying the physiology of the extrahepatic biliary system and modeling its disorders in vitro. .

ヒト組織の入手は、初代細胞に基づくシステムにとって大きな制限となる。しかしながら、本発明者らは、ＥＣＯが総胆管からだけでなく、胆嚢からも取得され得ることを示している。胆嚢組織は容易に入手可能であり、肝臓移植及び実施される最も一般的な外科的処置の１つである胆嚢摘出術の後に通常は破棄される。さらに、手術を受けていない個体においては、総胆管に、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）等の侵襲が最小限の処置を使用して到達することができ、本発明者らは、組織学標本を取得するために通常行われるブラッシングによって胆管細胞を得ることができることを実証している。とりわけ、これらの種々の方法で得られたオルガノイド間に、形態的又は機能的な差異は観察されなかった。さらに、本発明者らのシステムの拡張可能性のため、少量の出発材料しか必要とされない。これらのアプローチは、組織の利用可能性の課題に効果的に対処し、自系細胞及び同種異系の細胞ベースの治療を可能にする。 The availability of human tissue is a major limitation for primary cell-based systems. However, the inventors have shown that ECO can be obtained not only from the common bile duct, but also from the gallbladder. Gallbladder tissue is readily available and is usually discarded after liver transplantation and cholecystectomy, one of the most common surgical procedures performed. Furthermore, in non-operated individuals, the common bile duct can be accessed using minimally invasive procedures such as endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP), and we demonstrate that cholangiocytes can be obtained by brushing, which is commonly performed to obtain histological specimens. Notably, no morphological or functional differences were observed between the organoids obtained by these different methods. Furthermore, due to the scalability of our system, only small amounts of starting material are required. These approaches effectively address the tissue availability issue and enable autologous and allogeneic cell-based therapies.

オルガノイドと成体幹細胞との間の関連にもかかわらず（Koo BK & Clevers H, Gastroent. 2014 147:289-302）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又は移植後のいずれにおいても本発明者らの実験の間に肝細胞マーカー又は膵マーカーの発現は観察されなかったことから、ＥＣＯの分化能はそれらの元となる系譜に限定されることが裏付けられる。さらに、成体幹細胞オルガノイドの増殖に極めて重要な古典的ＷＮＴシグナル伝達（Farin HF et al.; Gastroent. 2012, 143:1518-1529.e7）は、本発明者らの培養条件においてＤＫＫ－１の使用により遮断される。これらの観察は、本発明者らの培養システムが幹細胞集団を含まないこと示している。 Despite the association between organoids and adult stem cells (Koo BK & Clevers H, Gastroent. 2014 147:289-302), hepatic cells were isolated during our experiments either in vitro or after transplantation. No cell or pancreatic marker expression was observed, confirming that the differentiation potential of ECOs is restricted to their lineage of origin. Moreover, canonical WNT signaling, which is crucial for the proliferation of adult stem cell organoids (Farin HF et al.; Gastroent. 2012, 143:1518-1529.e7), is mediated by the use of DKK-1 in our culture conditions. blocked by These observations indicate that our culture system does not contain stem cell populations.

ｈＩＰＳＣは、殆ど全ての組織を生成することが可能な細胞の起源を提供するが、ｈＩＰＳＣ系統の最初の取得／特性評価には時間がかかり、その一方で、分化能力の変動は依然として課題であるとみなされる。ＥＣＯ及びＩＣＯは、２４時間足らずで非常に高い効率で取得され得て、当初の特性を失うことなく多重継代にわたり増殖され得る。したがって、ＣＯ及びＣＬＣは拡張可能性の点で同等であり、かつ利用の点で補完的であり、ＣＯの成熟した表現型は、組織修復の観点から再生医療用途に特有の利点を提供する。 Although hIPSCs provide a source of cells that can generate almost any tissue, initial acquisition/characterization of hIPSC lineages is time-consuming, while variation in differentiation potential remains a challenge. is considered. ECO and ICO can be obtained with very high efficiency in less than 24 hours and can be propagated over multiple passages without loss of original properties. Thus, CO and CLC are comparable in terms of scalability and complementary in terms of utilization, and the mature phenotype of CO offers unique advantages for regenerative medicine applications in terms of tissue repair.

要するに、本開示は、肝内及び肝外の初代胆管組織をｉｎ ｖｉｔｒｏ研究、疾患モデリング及び細胞ベースの治療用途のための新規プラットフォームとして使用するための新規手段を開拓する。 In sum, the present disclosure opens up new avenues for using intrahepatic and extrahepatic primary bile duct tissue as a novel platform for in vitro research, disease modeling and cell-based therapeutic applications.

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Claims (16)

初代胆管細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、
分離された初代胆管細胞の集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、Ｒ－スポンジンとを含む増殖培地中で培養することで、増殖された胆管細胞の集団を生成すること
を含む、
方法。 A method of growing primary cholangiocytes in vitro comprising :
A population of cholangiocytes proliferated by culturing the isolated population of primary cholangiocytes in a growth medium containing epidermal growth factor (EGF), a classical Wnt signaling inhibitor, and R-spondin to generate
including _
Method. 前記胆管細胞は、増殖培地中でオルガノイドを形成し、
任意に、当該方法が増殖された集団が個別の細胞を含むように胆管細胞オルガノイドを破壊することを更に含む、請求項１に記載の方法。 said cholangiocytes form organoids in growth medium;
2. The method of claim 1, wherein optionally the method further comprises disrupting the cholangiocyte organoids such that the expanded population contains individual cells. 前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ－１）である、請求項１又は２に記載の方法。 3. The method of claim 1 or 2, wherein the inhibitor of canonical Wnt signaling is Dickkopf-related protein 1 (DKK-1). 前記集団は、前記増殖培地中で３Ｄ培養において培養され、任意に、前記増殖培地は、（ａ）足場マトリックス、又は
（ｂ）足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）前記古典的Ｗｎｔ阻害剤及び（ｉｉｉ）Ｒ－スポンジンが補充された栄養培地を
更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 Said population is cultured in 3D culture in said growth medium, optionally said growth medium comprising (a) a scaffold matrix, or (b) a scaffold matrix and (i) EGF, (ii) said classical Wnt inhibitor A method according to any one of claims 1 to 3, further comprising a nutrient medium supplemented with an agent and (iii) R-spondin . 前記増殖された集団における前記胆管細胞は、
（ｉ）ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型を発現する、
（ｉｉ）ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、及び／又は
（ｉｉｉ）ＭＨＣ抗原を発現しない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 said cholangiocytes in said expanded population comprising:
(i) CK7, CK18, CK19, HNF1B, γ-glutamyltransferase (GGT), Jagged 1 (JAG1), NOTCH2, CFTR, SCR, SSTR2, apical salt-biliary transporter (ASBT), aquaporin 1 and anion exchanger expressing type 2,
(ii) ALP activity, GGT activity, MDR1-mediated secretion, physiological responses to secretin and somatostatin, bile acid export, CFTR-mediated chloride transport, physiological responses to ATP and acetylcholine, and proliferation in response to VEGF; A method according to any one of claims 1 to 4, which exhibits an increase and/or (iii) does not express MHC antigens. 前記胆管細胞は、前記増殖培地中で２０代以上の継代にわたり培養される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-5, wherein the cholangiocytes are cultured in the growth medium for 20 or more passages. 前記増殖された胆管細胞の集団を生体適合性の足場中へと播種することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 7. The method of any one of claims 1-6, comprising seeding the expanded population of cholangiocytes into a biocompatible scaffold. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法により生成される分離された胆管細胞の集団。 An isolated population of cholangiocytes produced by the method of any one of claims 1-7. （ｉ）前記胆管細胞は、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型を発現する、
（ｉｉ）前記増殖された集団における前記胆管細胞は、ＭＨＣ抗原を発現しない、及び／又は
（ｉｉｉ）前記胆管細胞は、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、請求項８に記載の集団。 (i) the cholangiocytes are CK7, CK18, CK19, HNF1B, γ-glutamyltransferase (GGT), Jagged 1 (JAG1), NOTCH2, CFTR, SCR, SSTR2, apical salt bile transporter (ASBT), aquaporin 1 and expressing anion exchanger type 2,
(ii) the cholangiocytes in the expanded population do not express MHC antigens, and/or (iii) the cholangiocytes exhibit physiological responses to ALP activity, GGT activity, MDR1-mediated secretion, secretin and somatostatin 9. The population of claim 8, which exhibits increased proliferation in response to , bile acid export, CFTR-mediated chloride transport, physiological responses to ATP and acetylcholine, and VEGF. 請求項８又は９に記載の胆管細胞の分離された集団を含む、生体適合性の足場。 A biocompatible scaffold comprising an isolated population of cholangiocytes according to claim 8 or 9. 胆管障害の治療において使用するための、請求項８又は９に記載の分離された胆管細胞の集団又は請求項１０に記載の足場。 11. An isolated population of cholangiocytes according to claim 8 or 9 or a scaffold according to claim 10 for use in the treatment of biliary disorders. 化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項８又は９に記載の分離された胆管細胞の集団又は請求項１０に記載の足場を試験化合物と接触させることと、
前記胆管細胞若しくは前記足場に対する前記試験化合物の効果及び／又は前記試験化合物に対する前記胆管細胞若しくは足場の効果を測定することと、
を含む、方法。 A method of screening a compound, comprising:
contacting the isolated population of cholangiocytes of claim 8 or 9 or the scaffold of claim 10 with a test compound;
measuring the effect of the test compound on the cholangiocytes or the scaffold and/or the effect of the cholangiocytes or scaffold on the test compound;
A method, including 増殖、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及び／又はソマトスタチン応答性、胆汁酸移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、並びにＡＴＰ応答性、アセチルコリン応答性及びＶＥＧＦ応答性のうちの１つ以上に対する前記試験化合物の効果を測定する、請求項１２に記載の方法。 one or more of proliferation, ALP activity, GGT activity, MDR1-mediated secretion, secretin and/or somatostatin responsiveness, bile acid export, CFTR-mediated chloride transport, and ATP responsiveness, acetylcholine responsiveness and VEGF responsiveness 13. The method of claim 12, wherein the effect of the test compound on 治療化合物への患者の感受性を決定する方法であって、
（ｉ）疾患状態を伴う個体由来の疾患表現型を有する分離された初代胆管細胞の集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、Ｒ－スポンジンとを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
（ｉｉ）疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を治療化合物と接触させることと、
（ｉｉｉ）前記胆管細胞に対する前記治療化合物の効果を測定することと、
を含み、
前記胆管細胞の疾患表現型の改善は、前記個体が前記治療化合物による治療に感受性があることの指標である、方法。 A method of determining a patient's susceptibility to a therapeutic compound comprising:
(i) an isolated population of primary cholangiocytes with a diseased phenotype from an individual with a diseased condition in a growth medium containing epidermal growth factor (EGF), a classical Wnt signaling inhibitor, and R-spondin ; culturing in to produce an expanded population of cholangiocytes exhibiting a disease phenotype;
(ii ) contacting an expanded population of cholangiocytes exhibiting a disease phenotype with a therapeutic compound;
( iii ) measuring the effect of said therapeutic compound on said cholangiocytes;
including
The method, wherein amelioration of the cholangiocyte disease phenotype is indicative that the individual is susceptible to treatment with the therapeutic compound. 上皮成長因子（ＥＧＦ）と、Ｒ－スポンジンと、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞オルガノイドの生成のためのキット。 A kit for the generation of cholangiocyte organoids comprising a growth medium containing epidermal growth factor (EGF), R-spondin , and a classical Wnt signaling inhibitor. 胆管細胞オルガノイドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成のための培養培地の使用であって、前記培養培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、Ｒ－スポンジンと、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む、使用。 Use of a culture medium for the in vitro generation of cholangiocyte organoids, said culture medium comprising epidermal growth factor (EGF), R-spondin , and a classical Wnt signaling inhibitor .
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