JP7229222B2 - 核酸薬物複合体およびその用途 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／９５５，６９０号の利益を主張し、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は核酸薬物複合体に関し、特に抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸薬物複合体およびその用途に関する。
関連技術の説明
プログラム死－１（programmed death-1，ＰＤ－１）はＴ細胞発現を活性化する共刺激分子であり、免疫システムにおいて負の調節（negative regulation）を行って、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害することができる。ＰＤ－Ｌ１はＰＤ－１のリガンド（ligand）であり、免疫抑制性を備え、いくつかの非リンパ組織の血管内皮系の抗原発現細胞、例えば樹状細胞（dendritic cell，ＤＣ）、マクロファージ（macrophage）およびＢ細胞に発現し得る。さらに、ＰＤ－Ｌ１は多くの腫瘍細胞、間質細胞および免疫細胞にも発現するため、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合をブロックすると免疫反応が有効に強化され、かつ抗腫瘍効果が生じる。抗ＰＤ－１抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体により調節される免疫チェックポイント阻害療法（checkpoint blockade immunotherapy）はすでに臨床治療において応用されている。
また、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（CpG oligodeoxynucleotide，ＣｐＧ ＯＤＮ）は、強力な免疫活性化効果を有する一連のデオキシヌクレオチドであり、多種の免疫細胞を有効に活性化すると共に、免疫反応を誘発することができ、顕著な抗がん作用を有する。しかし、現在、腫瘍内注射（intratumoral injection，ＩＴ）が安全かつ有効にＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを投与する投薬方式であるが、このことによりＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが適用できる適応症が制限されてしまう。
現在の免疫療法は、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとの併用など多種の薬剤を併用する方式を用いて行われることが多いが、薬剤の併用は多くの潜在的なリスクを生じる可能性があり、また患者の負担ともなり得る。よって、有効な抗がん作用を有し、かつ単独投与できる免疫療法の開発は、医薬分野が取り組んでいる研究課題の１つである。
本開示のいくつかの実施形態により、核酸薬物複合体を提供し、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列、およびＴＬＲ－９を活性化できるＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含み、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列はＴＬＲ９レセプターに結合する。ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は第１のフラグメントおよび第２のフラグメントからなり、かつ抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列は第１のフラグメントと第２のフラグメントとの間に挿入される。
本開示のいくつかの実施形態により、前記核酸薬物複合体の用途を提供し、それはがんを治療する薬剤を作製するのに用いられる。
本開示のいくつかの実施形態により、前記核酸薬物複合体および医薬上許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。
[本発明1001]
核酸薬物複合体であって、
ＰＤ－Ｌ1に結合する抗ＰＤ－Ｌ1アプタマーの核酸配列と、
ＴＬＲ9レセプターに結合してＴＬＲ9を活性化するＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と、を含み、
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が第1のフラグメントおよび第2のフラグメントからなり、前記抗ＰＤ－Ｌ1アプタマーの核酸配列が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第1のフラグメントと前記第2のフラグメントとの間に挿入されている、核酸薬物複合体。
[本発明1002]
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と配列番号：10から23のうちの任意の1つで示される核酸配列とが少なくとも85％の類似性を有する、本発明1001の核酸薬物複合体。
[本発明1003]
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が配列番号：10から23のうちの任意の1つからなる、本発明1002の核酸薬物複合体。
[本発明1004]
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第1のフラグメントの長さと前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第2のフラグメントの長さとの比の範囲が1：15から15：1である、本発明1001の核酸薬物複合体。
[本発明1005]
前記第1のフラグメントの長さと前記第2のフラグメントの長さとの比の範囲が1：10から10：1である、本発明1004の核酸薬物複合体。
[本発明1006]
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の長さが、15個のヌクレオチドから40個のヌクレオチドである、本発明1001の核酸薬物複合体。
[本発明1007]
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がホスホロチオエート結合（phosphorothioate bond）を含む、本発明1001の核酸薬物複合体。
[本発明1008]
前記ホスホロチオエート結合の数が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の70％から100％を占める、本発明1007の核酸薬物複合体。
[本発明1009]
前記ホスホロチオエート結合の数が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の80％から100％を占める、本発明1008の核酸薬物複合体。
[本発明1010]
配列番号：29から34のうちの任意の1つで示される核酸配列からなる、本発明1001の核酸薬物複合体。
[本発明1011]
本発明1001から1010のうちいずれかの核酸薬物複合体の用途であって、がんを治療する薬剤を作製するのに用いる用途。
[本発明1012]
前記がんには、結腸がん、乳がん、肺がん、すい臓がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺がん、膀胱がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、血液がん、大腸がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がんまたは神経膠腫が含まれる、本発明1011の用途。
[本発明1013]
本発明1001から1010のうちいずれかの核酸薬物複合体および医薬上許容されるキャリアを含む医薬組成物。
[本発明1014]
がんを治療するのに用いられ、かつ静脈内（intravenous）注射、腫瘍内注射（intratumoral）または皮下注射（subcutaneous）により投薬される、本発明1013の医薬組成物。
[本発明1015]
本発明1013または1014の医薬組成物を含むキット。
本開示の特徴、または利点がより明瞭かつ分かり易くなるよう、以下に好ましい実施形態を挙げると共に、添付の図面を対応させて、詳細に説明していく。
本開示のいくつかの実施例により、フローサイトメトリーを用いサンプルｕｎｓｔａｉｎｅｄ（陰性対照群）、ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０５、ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０７、ＡｐｔＰＤＬ１－１Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－２ＡおよびＡｐｔＰＤＬ１－３Ａに対し、ＰＤ－Ｌ１結合親和性の分析を行った結果を示している。 本開示のいくつかの実施例により、フローサイトメトリーを用いてサンプルＡｐｔＰＤＬ１－Ａ４、ＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＰＢＳ＊）、ＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＳＥＬＥＸ）（陽性対照群）、ＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ （ＳＥＬＥＸ，６００ｎＭ）（陽性対照群）およびＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳに対し、ＰＤ－Ｌ１結合親和性の分析を行った結果を示している。 本開示のいくつかの実施例により、図１Ａおよび図１Ｂでフローサイトメトリーを用いて検出した実験結果の定量的データを示している。 本開示のいくつかの実施例により、ＥＬＩＳＡ技術を用いてサンプルｃｅｌｌ ｏｎｌｙ（陰性対照群）、４５ｍｅｒ、ｎ０５、ｎ０７、１Ａ、２Ａ、３ＡおよびＡ４に対しＰＤ－Ｌ１結合親和性の分析を行った結果を示している。 本開示のいくつかの実施例により、ＨＥＫ２９３マウスＴＬＲ９レポーティングシステムを用いてサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ、ＡｐＤＣ５－ＰＳ、ＡｐＤＣ５－７ＰＳ、ＰＤＬ１－ＣｐＧ３０－ＰＳ、ＰＤＬ１－ＣｐＧ２９－９ＰＳおよびＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂに対しＴＬＲ９活性化能の分析を行った結果を示している。 本開示のいくつかの実施例により、ＨＥＫ２９３マウスＴＬＲ９レポーティングシステムを用いてサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ、ＡｐＤＣ５－ＰＳ、ＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ、ＡｐＤＣ－Ａ２１Ａ、ＡｐＤＣ－Ｂ２１Ｂ及びＡｐＤＣ－Ａ３３Ｂに対しＴＬＲ９活性化能の分析を行った結果を示している。 図６Ａから図６Ｄは、本開示のいくつかの実施例による核酸薬物複合体の二次構造の概略図を示している。 本開示のいくつかの実施例により、４Ｔ１マウス乳腺がん同系腫瘍モデルを用い、サンプルＶｅｈｉｃｌｅ（陰性対照群）、ＰＤＬ１ ｍＡｂ、ＡｐｔＰＤＬ１＋ＣｐＧおよびＡｐＤＣ５－ＰＳ投与によるマウス腫瘍体積および生存率に対する影響を分析した結果を示している。 本開示のいくつかの実施例により、４Ｔ１マウス乳腺がん同系腫瘍モデルを用い、サンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳおよびＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ投与によるマウス腫瘍体積に対する影響を分析した結果を示している。
以下に、本開示の実施形態による核酸薬物複合体について詳細に説明する。以下の記載は、本開示のいくつかの実施形態の異なる態様を実施するために、多数の異なる実施形態または例を提示するものであるという点を理解しなければならない。以下に述べる特定の構成要素および配置の方式は、本開示のいくつかの実施形態を簡単かつ明瞭に表したものに過ぎない。当然に、これらは単に例示に用いられるだけであり、本開示の限定ではない。
別に定義しない限り、本明細書で使用する全ての用語（技術および科学用語を含む）は、本開示が属する技術分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。また、これらの用語は例えば通常使用する辞書に定義されている用語であり、関連技術および本開示の背景または上下の文脈と一致する意味に解釈されなければならず、理想化された、または過度に厳密な方式で解釈されてはならないということが、理解され得る。本開示の内容がより容易に理解されるよう、以下に用語の定義を提供する。
用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書中で交換可能に用いることができ、意味するところは任意の長さを有するヌクレオチドポリマーであり、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオシドは、プリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）もしくはその誘導体）またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）もしくはウラシル（Ｕ）もしくはその誘導体）塩基と糖の結合からなる。ＤＮＡ中の４種のヌクレオシド単位（または塩基）はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、およびチミジンオキシアデノシンと称される。ＲＮＡ中の４種のヌクレオシド単位（または塩基）は、アデノシン、グアノシン、ウリジン、およびシチジンと称される。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。
用語「ＣｐＧ」および「ＣＧ」は、本明細書中で交換可能に用いることができ、意味するところは、ホスホジエステル結合で隔てられたシトシンおよびグアニンである。本開示の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは１つまたは複数の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド（oligodeoxynucleotide，ＯＤＮ）である。
用語「プログラム死リガンド－１」は、「ＰＤ－Ｌ１」、「分化抗原群２７４（cluster of differentiation 274，CD274）」または「Ｂ７相同体－１（B7 homolog-1，B7-H1）」とも称され、意味するところは、ヒトにおいてＣＤ２７４遺伝子によりコードされるタンパク質である。ヒトＰＤ－Ｌ１は４０ｋＤａ １型膜貫通タンパク質であり、その主な作用は免疫システムの抑制にある。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上のレセプターＰＤ－１に結合して、活性化または抑制を調節する。ＰＤ－Ｌ１はまた、共刺激細胞ＣＤ８０（Ｂ７－１）に対し顕著な親和性を有する。ＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のレセプターＰＤ－１との結合によりシグナルが伝達され得るが、このシグナルはＴ細胞レセプターにより調節されるＩＬ－２産生およびＴ細胞増殖の活性化を抑制することのできるものである。ＰＤ－Ｌ１はチェックポイント（checkpoint）とみなすことができ、かつその腫瘍中における増加は、Ｔ細胞により調節される抗腫瘍反応を抑制するのを助ける。本開示の実施形態によれば、ＰＤ－Ｌ１は哺乳動物由来のＰＤ－Ｌ１、例えばヒト由来のＰＤ－Ｌ１であってよい。
用語「がん」とは、哺乳動物における細胞集団の調節されない細胞成長により特徴付けられる生理学的状態のことを指す。用語「腫瘍」とは、過度な細胞成長または増殖により生じたあらゆる組織腫瘤のことを指し、前がん病変を含む良性（非がん性）または悪性（がん性）腫瘍を包含する。
用語「免疫反応」は、先天性免疫系および後天性免疫系に由来する反応を含み、それは細胞により調節される免疫反応または体液性免疫反応を含む。免疫反応は、Ｔ細胞およびＢ細胞反応、ならびに免疫系由来のその他の細胞、例えばナチュラルキラー（natural killer，ＮＫ）細胞、単球細胞、マクロファージ等の反応を含む。
また、用語「治療」とは、診断された病理学的な症状または疾患を治癒、緩和、症状の軽減および／もしくは進行停止させる治療手段、ならびに目的の病理学的な症状または疾患の発症を予防および／または緩和する予防手段を指す。よって、治療が必要な個体には、すでに疾患に罹っている者、疾患に罹り易い者、および疾患の予防がなされる者が含まれ得る。本開示の実施形態によれば、がんまたは腫瘍を有する患者が以下の状況のうち１つまたは複数を示せば、個体の治療が成功したことになる：免疫反応の向上、抗腫瘍反応の向上、免疫細胞の細胞溶解活性の向上、免疫細胞による腫瘍細胞殺傷の増加、がん細胞の数の減少もしくは完全な非存在；腫瘍サイズの減小；周囲器官へのがん細胞の浸潤の抑制もしくは非存在；腫瘍もしくはがん細胞の転移の抑制もしくは非存在；がん増殖の抑制もしくは非存在；１つもしくは複数の具体的ながんに関連する症状の緩解；致死率および死亡率の低減；生活の質の改善；腫瘍形成性の低減；またはがん幹細胞の数または出現頻度の低減等。
本開示のいくつかの実施形態により核酸薬物複合体を提供し、それはＰＤ－Ｌ１に結合する抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー（aptamer）の核酸配列と、ＴＬＲ９（Toll-like receptor 9）レセプターに結合するＣｐＧオリゴヌクレオチド配列とを含み、かつ抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列はＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントと第２のフラグメントとの間に挿入される。本開示の実施形態により提供される新規な核酸薬物複合体は、ＴＬＲ－９を活性化できるＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとを結合し、腫瘍標的性および多重免疫調節性を有し、静脈内注射により全身投与することができ、かつ単独での投与が可能であり、複数の薬剤を併用する免疫療法に取って代わり得るものである。
いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列と配列番号：１から９のうちの任意の１つで示される配列とは、少なくとも８５％の類似性、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有していてよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーは、配列番号：１から９のうちの任意の１つで示される核酸配列からなる。いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列中のヌクレオチドが対になって特定の二次構造が生じ、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーは、かかる二次構造とＰＤ－Ｌ１とが結合することで、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合部位をブロックすることができ、これにより抗腫瘍の免疫反応を維持または強化することができる。
いくつかの実施形態によれば、核酸薬物複合体は、前記の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列およびＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含み、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列はＴＬＲ９レセプターに結合することができ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列はＴＬＲ９を強力に活性化して、インターフェロン（interferoｎ）の産生を促し、抗腫瘍または抗ウィルス等の免疫反応を誘発することができる。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド（oligodeoxynucleotide, ＯＤＮ）である。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列とは、少なくとも８５％の類似性を有していてよく、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有していてよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、第１のフラグメントおよび第２のフラグメントからなるものであってよい。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントおよび第２のフラグメントは、配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列から選ばれたものである。
換言すると、いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが共に構成する配列と、配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列とは、少なくとも８５％の類似性、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有していてよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントおよび第２のフラグメントは、配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列を共に構成する、つまり、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列である。
なお、本開示の実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントと第２のフラグメントとの間に挿入されて、核酸薬物複合体に腫瘍標的性および多重免疫調節性を同時に備えさせることができるという点に留意されたい。いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列およびＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、リンカー（linker）を介して連結することができる。いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列およびＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、さらなるリンカーを設計することなく連結することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントの長さとＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第２のフラグメントの長さとの比は約１：１５から１５：１、または約１：１０から１０：１であり、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントの長さとＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第２のフラグメントの長さとの比は約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１または２：１であってよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の長さ（つまり、第１のフラグメントの長さおよび第２のフラグメントの長さを合わせた長さの合計）の範囲は約１５個のヌクレオチドから４０個のヌクレオチド、または約２０個のヌクレオチドから３５個のヌクレオチド、または約２０個のヌクレオチドから３０個のヌクレオチドであり、例えば、約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個のヌクレオチドであってよいが、これに限定はされない。
また、いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、１つまたは複数の非メチル化ＣｐＧモチーフ（motif）を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中のＣｐＧモチーフは８５％から１００％が非メチル化のものであってよく、例えば、約８８％、９０％、９２％、９５％、９８％等が非メチル化のものであってよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中のＣｐＧモチーフの全てが非メチル化のものであってよい。また、いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、修飾されたホスホジエステル結合（phosphodiester bond）、例えばホスホロチオエート結合（phosphorothioate bond）を含み、これにより核酸薬物複合体が生体内の酵素に分解されるリスクを低減し、核酸薬物複合体の安定性を高めることができる。いくつかの実施形態によれば、ホスホロチオエート結合の数が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の約７０％から１００％、または約８０％から１００％を占めていてよく、例えば８５％、９０％または９５％であり得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中の全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっていてよい。
いくつかの実施形態によれば、核酸薬物複合体の核酸配列と配列番号：２９から３４のうちの任意の１つで示される配列とは少なくとも８５％の類似性を有し、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有していてよいが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、核酸薬物複合体は、配列番号：２９から３４のうちの任意の１つで示される核酸配列からなる。
詳細には、配列番号：２９の核酸配列は、配列番号：１の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーおよび配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が組み合わさってなり、配列番号：１の核酸配列が配列番号：１０の核酸配列の間に挿入されてよく、配列番号：１０は１５個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつ配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっていてよい。
配列番号：３０の核酸配列は、配列番号：２の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー、および配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と９６％の類似性を有する配列（５末端に２個のＴを加え、３末端の２個目のＡをＴに変えたもの）が組み合わさってなり、配列番号：２の核酸配列は配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と９６％の類似性を有する配列の間に挿入されてよく、この配列が１７個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつこの配列において５末端および３末端に位置する２つのホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合となっていてよい。
配列番号：３１の核酸配列は、配列番号：３の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーおよび配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が組み合わさってなり、配列番号：３の核酸配列は配列番号：１０の核酸配列の間に挿入されてよく、配列番号：１０が１５個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつ配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっていてよい。
配列番号：３２の核酸配列は、配列番号：３の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーおよび配列番号：２２のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が組み合わさってなり、配列番号：３の核酸配列は配列番号：２２の核酸配列の間に挿入されてよく、配列番号：２２が１５個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつ配列番号：２２のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっていてよい。
配列番号：３３の核酸配列は、配列番号：３の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーおよび配列番号：２３のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が組み合わさってなり、配列番号：３の核酸配列は配列番号：２３の核酸配列の間に挿入されてよく、配列番号：２３が１５個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつ配列番号：２３のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合が修飾されてホスホロチオエート結合となっていてよい。
配列番号：３４の核酸配列は、配列番号：７の抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーおよび配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が組み合わさってなり、配列番号：７の核酸配列は配列番号：１０の核酸配列の間に挿入されてよく、配列番号：１０が１５個のヌクレオチドを有する第１のフラグメントと１５個のヌクレオチドを有する第２のフラグメントとに分けられ、かつ配列番号：１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっていてよい。
さらに、いくつかの実施形態によれば、前述の核酸薬物複合体は、がんを治療する薬剤を作製するのに用いることができる。また、いくつかの実施形態によれば、医薬組成物を提供し、それは前述した核酸薬物複合体および医薬上許容されるキャリアを含み、この医薬組成物はがんの治療に用いることができる。例えば、いくつかの実施形態によれば、有効量の前述した核酸薬物複合体を含む医薬組成物を、必要とする個体に投与することができる。いくつかの実施形態によれば、個体には哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、オラウータンまたはヒト等が含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、前記個体はヒトであり得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、静脈内（intravenous）注射、腫瘍内注射（intratumoral）および皮下注射（subcutaneous）により投薬することができるが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、前記医薬組成物は、静脈内（intravenous）注射により投薬を行うことができる。
いくつかの実施形態によれば、前述のがんには、結腸がん、乳がん、肺がん、すい臓がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺がん、膀胱がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、血液がん、大腸がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がんまたは神経膠腫が含まれ得るが、これに限定はされない。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は溶液または懸濁液の形式を呈していてよい。あるいは、医薬組成物は脱水固形物（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された固形物）であり得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は無菌、かつ個体に対して無毒性であり得る。さらに、いくつかの実施形態によれば、前述の医薬上許容されるキャリアには、賦形剤、可溶化剤、緩衝剤、安定剤または防腐剤が含まれ得るが、これに限定はされない。
例えば、賦形剤は溶媒を含んでいてよく、いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は水性媒体を溶媒として含んでいてよい。水性媒体には、例えば、滅菌水、食塩溶液、リン酸緩衝食塩水またはリンゲル溶液（Ringer's solution）が含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、可溶化剤は、凍結または噴霧乾燥時および/または保存時に核酸薬物複合体を安定させ、かつその分解を防止するのを助ける保護剤である。可溶化剤には例えば、糖（単糖、二糖および多糖）、例として蔗糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトールまたはグルコースが含まれ得るが、これに限定はされない。さらに、いくつかの実施形態によれば、緩衝剤は、ｐＨ値を調整して、核酸薬物複合体の加工、保存等の時に分解が生じるのを防止することができる。緩衝液には例えば塩、例として酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩が含まれ得るが、これに限定はされない。緩衝液にはまた、例えばアミノ酸、例として、アルギニン、グリシン、ヒスチジンまたはリジンが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、安定剤には例えば、右旋糖、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロールまたはマンニトールが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、防腐剤には例えば、抗酸化剤または抗菌剤が含まれ得るが、これに限定はされない。
また、本開示のいくつかの実施形態によりキットを提供し、それは、前述した医薬組成物および使用方法が記載された説明書を含む。医薬組成物を含むキットは適した包装がなされている。いくつかの実施形態によれば、キットは、医薬組成物を投与するのに用いる装置（例えば、注射器および注射針、噴霧器、または乾燥粉末吸入装置等）をさらに含んでいてよい。
本開示の上述およびその他の目的、特徴、ならびに長所がより明瞭かつ分かり易くなるよう、以下にいくつかの実施例および比較例を挙げて詳細に説明するが、これらは本開示の内容を限定するものではない。
実施例１：生体外（in vitro）ＰＤ－Ｌ１結合親和性試験－フローサイトメトリー分析
トリプシン（trypsin）を用い、マウスＰＤ－Ｌ１（ｍＰＤ－Ｌ１）を発現するＣＴ－２６細胞、およびヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を収集し、沈殿させて、洗浄し、約２×１０５個の細胞を１００μＬの細胞染色緩衝液（ＢＳＡ緩衝液、ＢＤ）中に再懸濁させた。次いで、１００ｎｍｏｌのＡｌｅｘａ６４７で標識された抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーサンプル（Ａｌｅｘａ６４７で標識されたアプタマーを含む本開示における全ての核酸配列はいずれもIntegrated DNA Technologiesに委託してカスタム合成した）を加え、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーサンプルと細胞の懸濁液を遮光して氷上で６０分培養し、細胞染色緩衝液中で単回洗浄した後、細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Becton Dickinson，Oxford，UK）を用いて分析を行った。
フローサイトメトリーの分析結果は図１Ａおよび図１Ｂに示すとおりであり、図中のサンプルｕｎｓｔａｉｎｅｄは染色されていない細胞を表し、陰性対照群（negative control）とすることができ；図中のサンプルＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０５、ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０７、ＡｐｔＰＤＬ１－１Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－２Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－３ＡおよびＡｐｔＰＤＬ１－Ａ４は、配列番号：４、５、６、７、８および９で示される抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーをそれぞれ表し、これらの濃度はいずれも１００ｎＭであり；サンプルＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＰＢＳ＊）は配列番号：２４で示される抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを表し、それは細胞染色緩衝液中で調製されたのではなく、調節されたＰＢＳ緩衝液（カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有するＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）、１．３３ｍＭのＫＣｌ添加）中で調製されたもので、濃度は１００ｎＭであり、かつ、ＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒは既知の対照配列とすることができ；サンプルＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＳＥＬＥＸ）は、ＳＥＬＥＸ技術によりスクリーニングして得られた配列番号：２４で示される抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを表し、濃度は１００ｎＭであり、陽性対照群（positive control）とすることができ；サンプルＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＳＥＬＥＸ，６００ｎＭ）は、ＳＥＬＥＸ技術によりスクリーニングして得られた配列番号：２４で示される抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを表し、陽性対照群（positive control）とすることができ；サンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳは、ＰＤ－Ｌ１と親和しない核酸配列を表し、陰性対照群とすることができる。
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、サンプルＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０５、ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０７、ＡｐｔＰＤＬ１－１Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－２Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－３Ａ、ＡｐｔＰＤＬ１－Ａ４およびＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＰＢＳ＊、ＳＥＬＥＸ、６００ｎＭ）はいずれも右にシフトするピークを示し、これらがいずれもＰＤ－Ｌ１に対して結合親和性を有することを表す。
図２を参照されたい。図２は、図１Ａおよび図１Ｂのフローサイトメトリーの実験結果の定量的データを示しており、図２に示されるように、ＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ（配列番号：１０）に比べ、サンプルＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０５（配列番号：４）、ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０７（配列番号：５）、ＡｐｔＰＤＬ１－１Ａ（配列番号：６）、ＡｐｔＰＤＬ１－２Ａ（配列番号：７）、ＡｐｔＰＤＬ１－３Ａ（配列番号：８）、ＡｐｔＰＤＬ１－Ａ４（配列番号：９）およびＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ（ＰＢＳ＊、ＳＥＬＥＸ、６００ｎＭ）（配列番号：２４）のほぼ全てがＰＤ－Ｌ１結合親和性の向上を示した。
実施例２：生体外ＰＤ－Ｌ１結合親和性試験－細胞結合分析
ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１×１０４細胞／１００μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Corning）中に播種し、４８時間培養した。培地を除去した後、室温下、５０μｌ／ウェルの４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde，PFA）の入ったリン酸緩衝食塩水（phosphate-buffered saline，PBS）で細胞を１０分固定した。ＰＦＡを除去した後、１００μｌのＰＢＳに入った０．１Ｍグリシンを各ウェルに加え、残留したＰＦＡをクエンチ（quench）した。その後、９６ウェルプレートを室温で１０分培養した。次いで、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、室温下でＳｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（ScyTek Laboratories Inc）を用い６０分ブロックした。異なる濃度のＡｌｅｘａ６４７標識抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーサンプル（ＰＢＳ中に混合されている）を用い、デュプリケート（duplicate）のウェル中で染色を行い、３７℃で４５分培養した。その後、ＰＢＳを用いて細胞を４回洗浄し、酵素免疫アッセイリーダー（ELISA plate reader，Tecan，Mannedorf，Switzerland）を用い、励起波長６７０ｎｍ、発光波長７２０ｎｍで蛍光強度を測定した。
ＥＬＩＳＡの分析結果は図３に示すとおりであり、図中のサンプルｃｅｌｌ ｏｎｌｙはＰＤ－Ｌ１を発現しない細胞を表し、陰性対照群とすることができ；図中のサンプル４５ｍｅｒ、ｎ０５、ｎ０７、１Ａ、２Ａ、３ＡおよびＡ４はそれぞれ配列番号：２４、４、５、６、７、８および９で示される抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを表し、サンプルの濃度はいずれも７００ｎｍであって、調節されたＰＢＳ緩衝液（カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有するＤＰＢＳ、１．３３ｍＭのＫＣｌ添加）中で調製されたものである。
図３に示されるように、サンプル４５ｍｅｒ（ＡｐｔＰＤＬ１－４５ｍｅｒ，配列番号：２４）、ｎ０７（ＡｐｔＰＤＬ１－ｎ０７，配列番号：５）、１Ａ（ＡｐｔＰＤＬ１－１Ａ，配列番号：６）、２Ａ（ＡｐｔＰＤＬ１－２Ａ，配列番号：７）、３Ａ（ＡｐｔＰＤＬ１－３Ａ，配列番号：８）およびＡ４（ＡｐｔＰＤＬ１－Ａ４，配列番号：９）はいずれも蛍光強度が高く、ＰＤ－Ｌ１に結合親和性を有していた。
実施例３：核酸薬物複合体のＴＬＲ９活性化能分析－ＨＥＫ２９３マウスＴＬＲ９レポーティングシステム
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞（InvivoGen）を完全ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地で培養した。ＤＭＥＭ中には１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ、３０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよび１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（いずれもInvivoGen）が補充してあった。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞は分泌性胎盤アルカリホスファターゼ（secreted alkaline phosphatase，SEAP）レポーティングシステムを含み、このシステムとＴＬＲ９とが作用した後、測色の変化（colorimetric change）が生じる。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出混合物（ＳＥＡＰ検出に用いる細胞培地，InvivoGen）をＳＥＡＰの存在を検出するのに用いた。ＳＥＡＰは、ＮＦ－κＢが活性化することによるＴＬＲ９シグナル伝達に関連する。検出混合物は、細胞成長に用いる栄養物および呈色基質を含み、ＳＥＡＰによって加水分解されると、色の変化を生じるものである。マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞（InvivoGen）が６０～８０％の培養密度（confluency）に達したら、それを収集して遠心分離し、検出混合物中に再懸濁させた。細胞（７２ ０００）を９６ウェルプレート（１８０μｌ）の各ウェル中に播種した。次いで、細胞と、２０μｌのＰＢＳ（未刺激；陰性対照群とした）、ＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ（陽性対照群とした）またはＰＢＳ中の異なる濃度の核酸薬物複合体サンプルとを、デュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）のウェル内で組み合わせて処理し、３７℃下、５％ＣＯ２中で２４時間培養した。マルチモードプレートリーダー（multimode plate reader）（Tecan，Infinite（商標）M200 PRO，Mannedorf，Switzerland）を用い、分光光度計で６２０ｎｍから６５５ｎｍの波長においてプレートを読み取った。
ＴＬＲ９活性化能に対する分析結果は図４に示すとおりであり、図中のサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳは配列番号：１０（抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーに連結していない）に対応しており、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合はいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっており；サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳは配列番号：２５に対応し、それはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における５末端に連結している態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっており、それは例えば、図６Ｂに示される構造（このうち、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の位置関係が理解し易くなるよう、ＡおよびＢはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の第１のフラグメントおよび第２のフラグメントの位置を概略的に表している）を有し；サンプルＡｐＤＣ５－７ＰＳは配列番号：２６に対応し、それはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における５末端に連結している態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中の一部のホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは例えば、図６Ｄに示される構造を有し；サンプルＰＤＬ１－ＣｐＧ３０－ＰＳは配列番号：２７に対応し、それはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における３末端に連結している態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合となっており、それは例えば、図６Ｃに示される構造を有し；サンプルＰＤＬ１－ＣｐＧ２９－９ＰＳは配列番号：２８に対応しており、それはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における３末端に連結している態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中の一部のホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは例えば、図６Ｄに示される構造を有し；サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂは配列番号：３１に対応しており、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入されている態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは例えば、図６Ａに示される構造を有する。
図４の結果により、得られたサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ（配列番号：１０）のＥＣ５０値は２．０９ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳ（配列番号：２５）のＥＣ５０値は２．４８ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ５－７ＰＳ（配列番号：２６）のＥＣ５０値は７２．２３ｎＭ、サンプルＰＤＬ１－ＣｐＧ３０－ＰＳ（配列番号：２７）のＥＣ５０値は２．３６ｎＭ、サンプルＰＤＬ１－ＣｐＧ２９－９ＰＳ（配列番号：２８）のＥＣ５０値は１４８．８２ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ（配列番号：３１）のＥＣ５０値は０．７７ｎＭであった。その他のサンプルに比べ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ（配列番号：３１）のＥＣ５０値は最も低く、ＴＬＲ９活性化能が向上されている。
このことからわかるように、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における５末端または３末端に連結している態様に比べ、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入された核酸薬物複合体は、より優れたＴＬＲ９活性化能を備える。また、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中の一部のホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合となっている態様は相補的な二本鎖構造を形成し易く、かかる態様の核酸薬物複合体のＴＬＲ９活性化能は低くなる。
次いで、図５を参照されたい。図５は、別の実施形態における核酸薬物複合体のＴＬＲ９活性化能に対する分析結果を示しており、その実験内容は図４とほぼ同じである。図５中のサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳは配列番号：１０（抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーに連結していない）に対応しており、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており；サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳは配列番号：２５に対応し、それはＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列における５末端に連結している態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは例えば、図６Ｂに示される構造を有し；サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂは配列番号：３１に対応し、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入されている態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは例えば、図６Ａに示される構造を有し；サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ａは配列番号：３２に対応し、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入されている態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは図６Ａに示されるのと類似する構造を有するが、フラグメントＡおよびフラグメントＢの配列は同じであり；サンプルＡｐＤＣ－Ｂ２１Ｂは配列番号：３３に対応し、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入されている態様を表し、かつＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっており、それは図６Ａに示されるのと類似する構造を有するが、フラグメントＡおよびフラグメントＢの配列は同じであり；サンプルＡｐＤＣ－Ａ３３Ｂは配列番号：３０に対応し、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入された態様を表し、かつオリゴヌクレオチド配列中の一部のホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合になっている。
図５の結果により、得られたサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳ（配列番号：１０）のＥＣ５０値は２．１ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳ（配列番号：２５）のＥＣ５０値は５．５ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ（配列番号：３１）のＥＣ５０値は１．３ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ａ（配列番号：３２）のＥＣ５０値は０．６ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ－Ｂ２１Ｂ（配列番号：３３）のＥＣ５０値は０．６ｎＭ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ３３Ｂ（配列番号：３０）のＥＣ５０値は１６３８０ｎＭであった。
サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳ（配列番号：２５）に比べ、抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入されているサンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂ（配列番号：３１）、ＡｐＤＣ－Ａ２１Ａ（配列番号：３２）およびＡｐＤＣ－Ｂ２１Ｂ（配列番号：３３）のＥＣ５０値は比較的低く、つまり、ＴＬＲ９活性化能が改善されていた。また、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中の一部のホスホジエステル結合のみが修飾されてホスホロチオエート結合になっている態様に比べ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列における全てのホスホジエステル結合がいずれも修飾されてホスホロチオエート結合になっている態様も、ＴＬＲ９活性化能により優れていた。
実施例４：核酸薬物複合体の動物モデル生体内（in vivo）抗腫瘍効果分析
４Ｔ１マウス乳腺がん同系腫瘍モデル（syngeneic tumor model）を用い、生体内抗腫瘍治療効果の研究を行った。４Ｔ１（５×１０５細胞）をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下移植した。キャリパー（caliper）で腫瘍の大きさを測り、次の式によりそれを腫瘍体積に変換した；Ｖ＝ＬＳ２／２（ただし、Ｌは最長直径、Ｓは最短直径）。マウスをランダムにグループ分けし（ｎ＝４～５）、腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３時に達した時に投薬を行った。抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（PDL1 mAb，InVivoPlus anti-mouse PD-L1，BioXCell）を週に２回腹膜内（intraperitoneally）注射した。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（配列番号：１０）および抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー（配列番号：１）（併用形式、ＡｐｔＰＤＬ１＋ＣｐＧと標識）、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとＣｐＧオリゴヌクレオチド配列とがコンジュゲートした核酸薬物複合体（配列番号：２５）（ＡｐＤＣ５－ＰＳ）を週に２回静脈注射した。腫瘍増殖阻害（tumor growth inhibition，TGI）のパーセンテージから抗腫瘍効果を判断した。ＴＧＩの計算方法は、［１－（治療群の最終腫瘍体積－初期腫瘍体積）／（Ｖｅｈｉｃｌｅ群の最終腫瘍体積－初期腫瘍体積）］×１００％とした。
図７に示される結果によれば、サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳ（配列番号：２５）で処理した腫瘍体積は明らかに小さく、その抗腫瘍効果はＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを併用した（ＡｐｔＰＤＬ１＋ＣｐＧ）態様よりも優れており、また抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）を単独で注射した態様よりも優れていた。さらに、サンプルＡｐＤＣ５－ＰＳを注射したマウスの生存率も明らかに高まっており、腫瘍細胞接種から２５日後にも１００％の生存率であった。
さらに、図８は、別の実施形態における核酸薬物複合体の抗腫瘍効果分析結果を示しており、その実験内容は図７とほぼ同じである。図８中のサンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳは配列番号：１０（抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーに連結していない）に対応しており；サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂは配列番号：３１に対応しており、それは抗ＰＤ－Ｌ１アプタマー配列がＣｐＧオリゴヌクレオチド配列中に挿入された態様である。図８に示されるように、サンプルＣｐＧ－Ｌ０－ＰＳに比べ、サンプルＡｐＤＣ－Ａ２１Ｂは抗腫瘍効果により優れており、薬効が改善されていた。
上述したように、本開示の実施形態により提供される新規な核酸薬物複合体は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーとを結合させたものであり、腫瘍標的性および免疫チェックポイント阻害活性を備えることで、核酸薬物複合体の腫瘍における蓄積および腫瘍微小環境の免疫細胞毒性効果が高まり得ると共に、多種類の免疫細胞の活性化を刺激する能力を備えることで、腫瘍微小環境の免疫細胞活性化および凝集が高まり得る。また、本開示の実施形態により提供される核酸薬物複合体は、単にＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーを合わせて使用するよりも、抗腫瘍薬効に優れる。
本開示の実施形態およびその長所を上のように開示したが、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、本開示の精神および範囲を逸脱せずに、変更、置換および修飾を加えることができるという点が理解されなければならない。さらに、各クレームは個別の実施形態を構成し、かつ本開示の保護範囲は各クレームおよび実施形態の組み合わせも含む。本開示の保護範囲は、添付の特許請求の範囲で定義されたものが基準となる。

Claims (12)

  1. 核酸薬物複合体であって、
    ＰＤ－Ｌ１に結合する抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列と、
    ＴＬＲ９レセプターに結合してＴＬＲ９を活性化するＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と、を含み、
    前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が第１のフラグメントおよび第２のフラグメントからなり、前記抗ＰＤ－Ｌ１アプタマーの核酸配列が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第１のフラグメントと前記第２のフラグメントとの間に挿入されており、
    前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第１のフラグメントの長さと前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の前記第２のフラグメントの長さとの比が１：１０から１０：１の範囲にあり、かつ
    前記第１のフラグメントと前記第２のフラグメントの長さの合計が、１５個のヌクレオチドから４０個のヌクレオチドである、核酸薬物複合体。
  2. 前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列と配列番号：１０から２３のうちの任意の１つで示される核酸配列とが少なくとも９６％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸薬物複合体。
  3. 前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が配列番号：１０から２３のうちの任意の１つからなる、請求項２に記載の核酸薬物複合体。
  4. 前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がホスホロチオエート結合（phosphorothioate bond）を含む、請求項１に記載の核酸薬物複合体。
  5. 前記ホスホロチオエート結合の数が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の７０％から１００％を占める、請求項４に記載の核酸薬物複合体。
  6. 前記ホスホロチオエート結合の数が前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列のホスホジエステル結合の数の８０％から１００％を占める、請求項５に記載の核酸薬物複合体。
  7. 配列番号：２９から３４のうちの任意の１つで示される核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸薬物複合体。
  8. 請求項１から７のうちいずれか１項に記載の核酸薬物複合体を含む、がんを治療するための医薬組成物。
  9. 前記がんには、結腸がん、乳がん、肺がん、すい臓がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺がん、膀胱がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、血液がん、大腸がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がんまたは神経膠腫が含まれる、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 請求項１から７のうちいずれか１項に記載の核酸薬物複合体および医薬上許容されるキャリアを含む医薬組成物。
  11. がんを治療するのに用いられ、かつ静脈内（intravenous）注射、腫瘍内注射（intratumoral）または皮下注射（subcutaneous）により投薬される、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 請求項１０または１１に記載の医薬組成物を含むキット。
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