JP7226763B2 - Agent for reducing drug resistance in cancer stem cells, inhibitor for metastatic potential in cancer stem cells, and method for predicting risk of metastatic recurrence of cancer - Google Patents
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本発明は、癌幹細胞における薬物耐性の低減剤や、癌幹細胞における転移能の抑制剤や、癌の転移性再発リスクを予測する方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to agents for reducing drug resistance in cancer stem cells, agents for suppressing metastatic potential in cancer stem cells, and methods for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer.
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma：HCC)を含む肝癌 (hepatoma)は、治癒切除にもかかわらず再発率の高い癌である。この再発率の高さは、肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発に加えて、血行性転移による原発巣除去後の術後肝内再発の2つがあるためである。患者QOLにおいて癌の発生防止が第一であり、外科手術後は再発を怖れずに安心して暮らせる術後補助療法が求められるが、肝癌においては標準的な術後補助療法は確立出来ていない。なお、肝細胞癌においては、遺伝子の解析により発症又は再発を予測する技術が開発されている（特許文献1-3参照）。
Hepatoma, including hepatocellular carcinoma (HCC), is a cancer with a high recurrence rate despite curative resection. This high recurrence rate is due to two factors: de novo recurrence due to hepatitis virus infection and postoperative intrahepatic recurrence after removal of the primary tumor due to hematogenous metastasis. Preventing the occurrence of cancer is the first priority in patient QOL, and postoperative adjuvant therapy is required so that patients can live with peace of mind without fear of recurrence after surgery. However, no standard postoperative adjuvant therapy has been established for liver cancer. For hepatocellular carcinoma, techniques have been developed for predicting the onset or recurrence of hepatocellular carcinoma by genetic analysis (see
近年、自己複製能、多分化能、造腫瘍能、再発、転移能、又は治療抵抗性などを持つ癌の根本ともいえる癌幹細胞（cancer stem cells：CSC）の存在が報告され、癌幹細胞をターゲットとする新たな癌治療の概念が報告されている。一方、癌幹細胞の研究の困難な点は、癌組織中の癌幹細胞の割合が少ないため、多くの癌幹細胞を用いた研究を行うことが難しかった。そこで本発明者らは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子－１（NSF-1）を添加した培地を用いた消化器系癌幹細胞の増殖方法（特許文献4参照）を提案した。これによって、CSCの特性を有するがん幹細胞様細胞(cancer stem-like cells; CSLC)を効率的に得ることが出来るようになった。 In recent years, the existence of cancer stem cells (CSCs), which can be said to be the root of cancer with self-renewal, pluripotency, tumorigenicity, recurrence, metastasis, or resistance to treatment, has been reported, and cancer stem cells are targeted. A new cancer treatment concept has been reported. On the other hand, the difficulty in researching cancer stem cells is that the percentage of cancer stem cells in cancer tissues is small, making it difficult to conduct research using many cancer stem cells. Therefore, the present inventors have developed a method for growing gastrointestinal cancer stem cells using a serum-free basal medium for animal cell culture supplemented with nerve survival factor-1 (NSF-1) (see Patent Document 4). proposed. This has made it possible to efficiently obtain cancer stem-like cells (CSLC) having CSC characteristics.
また、癌治療において、癌細胞だけでなく癌幹細胞も治療標的とすることが重要である。しかしながら、癌幹細胞は癌細胞集団において極めて少数であるということだけでなく、癌細胞における不均一性(heterogeneity)と同様に、癌幹細胞においてもheterogeneityがあることが分かってきており、コンセプトに基づく癌治療法の開発は困難であった。これまでに、幾つかの癌幹細胞マーカーが報告されているが、これらの癌幹細胞マーカーを用いての癌幹細胞の選択では真に癌の再発又は転移の責任細胞を解析することは困難であった。 In cancer therapy, it is important to target not only cancer cells but also cancer stem cells. However, not only are cancer stem cells extremely rare in cancer cell populations, but it has also been found that there is heterogeneity in cancer stem cells as well as heterogeneity in cancer cells. Treatment development has been difficult. Although several cancer stem cell markers have been reported so far, it has been difficult to truly analyze the cells responsible for cancer recurrence or metastasis by selecting cancer stem cells using these cancer stem cell markers. .
ところで、癌幹細胞の中には、薬剤耐性を獲得しているものがあることが報告されている（非特許文献1参照）。したがって、治療によって大部分の癌細胞を除いても、ごく少数の癌幹細胞が生き残っていれば再発が起こりうることになり、これが癌においてしばしば再発が起きる理由の一つとして考えられている。したがって、癌幹細胞における抗癌剤耐性を弱めて癌細胞と同時に癌幹細胞も除去することができれば、癌の転移や再発の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。 By the way, it has been reported that some cancer stem cells have acquired drug resistance (see Non-Patent Document 1). Therefore, even if most cancer cells are removed by treatment, recurrence can occur if only a small number of cancer stem cells survive, and this is considered to be one of the reasons why cancer often recurs. Therefore, if the anticancer drug resistance in cancer stem cells can be weakened and the cancer stem cells can be removed at the same time as the cancer cells, it is expected to lead to the development of a therapeutic method that is also useful for preventing cancer metastasis and recurrence.
現在、肝癌において、de novo再発についてはインターフェロンのような抗ウイルス薬が考えられるが、転移性再発についてはバイオマーカーの開発が進んでいるものの、有効な治療法はない。また、転移性再発には薬物耐性を獲得した癌幹細胞が関与すると考えらえており、かかる薬物耐性を獲得した癌幹細胞に対する薬物耐性の低減剤の開発が求められている。そこで、本発明の課題は、肝癌転移性再発に特異的な遺伝子を同定して転移性再発リスクを予測する方法を提供すると共に、肝癌転移性再発の抑制に有効な癌幹細胞に対する薬物耐性の低減剤や癌幹細胞における転移能の抑制剤を提供することにある。 At present, antiviral agents such as interferon are considered for de novo recurrence of liver cancer, but there is no effective treatment for metastatic recurrence, although biomarkers are being developed. In addition, cancer stem cells that have acquired drug resistance are thought to be involved in metastatic recurrence, and there is a demand for the development of drug resistance-reducing agents for cancer stem cells that have acquired drug resistance. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of metastatic recurrence by identifying genes specific to metastatic recurrence of liver cancer, and to reduce drug resistance against cancer stem cells that are effective in suppressing metastatic recurrence of liver cancer. The purpose is to provide a drug and a metastatic potential inhibitor in cancer stem cells.
本発明者らは、自らが開発した独自の誘導法により、癌幹細胞の特性の一つである浮遊細胞塊（sphere）形成能を癌幹細胞の指標としてCSLCの機能的選択を行い、これによって得られた細胞群において、種々の抗癌剤に対する耐性が亢進するだけでなく、血行性肝転移能が亢進していることを免疫不全マウスにおける経門脈的肝転移モデルにおいて確認した。従来のCSCマーカーCD44v9によるソーティング法では得られる細胞数が少ないため、さらにDNA chip等の網羅的解析を行うことが困難であったが、本発明者らは癌幹細胞の性質を有する細胞を誘導することで、大量のCSLCを得ることが可能となり、RNA-seq解析 (mRNA)、DNA chip解析 (microRNA)を行った。さらに、癌幹細胞の性質の中でも再発・転移能に着目してヒト臨床検体でのRNA-seq解析結果も統合して解析することで、転移性肝内再発に特異的な遺伝子であるRAB3B遺伝子を同定し、本発明を完成した。なお、本発明者らが開発した方法による肝癌CSLCは、実験的に抗癌剤耐性と肝転移能亢進の両方を示すものの、従来の肝癌CSCマーカーであるCD133を発現していなかった。そのため、CD133をマーカーとしたソーティング法からは転移能・抗癌剤耐性能の両者を有する上記CSLCは得られていなかった。 The present inventors performed functional selection of CSLCs using a unique induction method developed by themselves, using the ability to form floating cell clusters (spheres), which is one of the characteristics of cancer stem cells, as an indicator of cancer stem cells. In immunodeficient mice, transportal vein liver metastasis model, we confirmed that not only resistance to various anticancer drugs but also hematogenous liver metastasis was enhanced in the cell group obtained. Since the number of cells obtained by the conventional sorting method using the CSC marker CD44v9 is small, it was difficult to perform comprehensive analysis such as DNA chip. As a result, we were able to obtain a large amount of CSLC, and performed RNA-seq analysis (mRNA) and DNA chip analysis (microRNA). Furthermore, by focusing on the recurrence and metastasis potential among the properties of cancer stem cells and integrating the results of RNA-seq analysis of human clinical specimens, we identified the RAB3B gene, a gene specific to metastatic intrahepatic recurrence. They identified it and completed the present invention. The liver cancer CSLC obtained by the method developed by the present inventors experimentally showed both anticancer drug resistance and enhanced liver metastasis potential, but did not express CD133, a conventional liver cancer CSC marker. Therefore, the above-mentioned CSLCs having both metastatic potential and anticancer drug resistance have not been obtained by the sorting method using CD133 as a marker.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の（I）又は（II）のいずれかを有効成分とする、癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（I）RAB3B遺伝子の発現を抑制する核酸分子；
（II）配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質に結合する抗体若しくは低分子化合物；
（２）癌幹細胞が、肝癌幹細胞であることを特徴とする上記（１）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（３）核酸分子がRAB3B遺伝子を標的とする二本鎖siRNA、microRNA、shRNA、アンチセンス核酸、及びリボザイムからなる群から選択される少なくとも１種の核酸分子であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（４）核酸分子がRAB3B遺伝子を標的とする二本鎖siRNAであることを特徴とする上記（３）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（５）薬物が、抗腫瘍性抗生物質、微小管阻害剤、プラチナ製剤、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、又はキナーゼ阻害剤であることを特徴とする上記（４）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（６）薬物が、ドキソルビシン、ドセタキセル、カルボプラチン、ボリノスタット、又はスニチニブであることを特徴とする上記（５）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（７）核酸分子がRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAであって、該microRNAがhas-miR-15a-5pであることを特徴とする上記（３）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（８）薬物が、抗腫瘍性抗生物質、微小管阻害剤、プラチナ製剤、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、キナーゼ阻害剤、又はトポイソメラーゼ阻害剤であることを特徴とする上記（７）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（９）薬物が、ドキソルビシン、ドセタキセル、カルボプラチン、ボリノスタット、スニチニブ又はイリノテカンであることを特徴とする上記（８）記載の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤。
（１０）以下の（I）又は（II）のいずれかを有効成分とする、癌幹細胞における転移能の抑制剤。
（I）RAB3B遺伝子の発現を抑制する核酸分子；
（II）配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質に結合する抗体若しくは低分子化合物；
（１１）癌幹細胞が、肝癌幹細胞であることを特徴とする上記（１０）記載の癌幹細胞における転移能の抑制剤。
（１２）被検者から採取した生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を指標として、癌の転移性再発リスクを予測する方法。
（１３）癌が肝癌であることを特徴とする上記（１２）記載の癌の転移性再発リスクを予測する方法。
（１４）生体試料が、原発肝腫瘍組織又は血液であることを特徴とする上記（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）上記（１２）～（１４）のいずれか記載の方法に用いるためのキットであって、以下の（I）又は（II）を含むキット。
（I）被検者から採取した生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物；
（II）被検者から採取した生体試料中のmRNAがコードするタンパク質の発現量を検出するための抗体、又はそれらの標識物；
（１５）配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質のアミノ酸配列のうち、連続する5-50個のアミノ酸からなるペプチドを有効成分とする癌ペプチドワクチン。
That is, the present invention is as follows.
(1) An agent for reducing drug resistance in cancer stem cells, comprising either (I) or (II) below as an active ingredient.
(I) a nucleic acid molecule that suppresses the expression of the RAB3B gene;
(II) an antibody or low-molecular-weight compound that binds to the RAB3B protein shown in SEQ ID NO: 1;
(2) The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (1) above, wherein the cancer stem cells are liver cancer stem cells.
(3) The above (1), wherein the nucleic acid molecule is at least one nucleic acid molecule selected from the group consisting of double-stranded siRNA, microRNA, shRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme targeting the RAB3B gene. ) or the agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (2).
(4) The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (3) above, wherein the nucleic acid molecule is a double-stranded siRNA targeting the RAB3B gene.
(5) The cancer stem cell according to (4) above, wherein the drug is an antitumor antibiotic, a microtubule inhibitor, a platinum agent, a histone deacetylase (HDAC) inhibitor, or a kinase inhibitor. reducer of drug resistance in
(6) The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (5) above, wherein the drug is doxorubicin, docetaxel, carboplatin, vorinostat, or sunitinib.
(7) The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (3) above, wherein the nucleic acid molecule is a microRNA that targets the RAB3B gene, and the microRNA is has-miR-15a-5p.
(8) The above (7), wherein the drug is an antitumor antibiotic, microtubule inhibitor, platinum agent, histone deacetylase (HDAC) inhibitor, kinase inhibitor, or topoisomerase inhibitor. Agents for reducing drug resistance in cancer stem cells as described.
(9) The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells according to (8) above, wherein the drug is doxorubicin, docetaxel, carboplatin, vorinostat, sunitinib or irinotecan.
(10) An agent for suppressing the metastatic potential of cancer stem cells, comprising either (I) or (II) below as an active ingredient.
(I) a nucleic acid molecule that suppresses the expression of the RAB3B gene;
(II) an antibody or low-molecular-weight compound that binds to the RAB3B protein shown in SEQ ID NO: 1;
(11) The agent for suppressing the metastatic potential of cancer stem cells according to (10) above, wherein the cancer stem cells are liver cancer stem cells.
(12) the metastatic potential of cancer, using the expression level of the RAB3B gene mRNA in a biological sample collected from a subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of a microRNA targeting the RAB3B gene as an index; Methods for predicting recurrence risk.
(13) The method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer according to (12) above, wherein the cancer is liver cancer.
(14) The method according to (12) or (13) above, wherein the biological sample is primary liver tumor tissue or blood.
(15) A kit for use in the method according to any one of (12) to (14) above, the kit comprising (I) or (II) below.
(I) a primer pair or probe for detecting the expression level of RAB3B gene mRNA or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene in a biological sample collected from a subject, or a label thereof;
(II) an antibody for detecting the expression level of a protein encoded by mRNA in a biological sample collected from a subject, or a label thereof;
(15) A cancer peptide vaccine comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of 5 to 50 consecutive amino acids in the amino acid sequence of the RAB3B protein shown in SEQ ID NO:1.
本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤を用いることにより、癌幹細胞における薬物耐性を低減することが可能となる。また、本発明の癌幹細胞における転移能の抑制剤を用いることにより、癌幹細胞における転移能を低減することが可能となる。さらに、生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、又は前記mRNAがコードするタンパク質の発現量を指標とすることで、癌の転移性再発リスクを予測することが可能となる。 By using the agent for reducing drug resistance in cancer stem cells of the present invention, it is possible to reduce drug resistance in cancer stem cells. Moreover, by using the inhibitor of the metastatic potential of cancer stem cells of the present invention, it is possible to reduce the metastatic potential of cancer stem cells. Furthermore, the metastatic recurrence risk of cancer can be predicted by using the expression level of the RAB3B gene mRNA or the expression level of the protein encoded by the mRNA in the biological sample as an index.
本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤や、本発明の癌幹細胞における転移能の抑制剤としては、RAB3B遺伝子の発現を抑制する核酸分子又は前記RAB3B遺伝子がコードするタンパク質に結合する抗体若しくは低分子化合物であれば特に制限されず、ここで、「RAB3B」(Entrez Gene ID:5865, mRNA: NM_002867.3, protein: NP_002858.2)は、Rasスーパーファミリーに属し、炎症反応に依存して誘導されることや、下垂体培養細胞において分泌顆粒の細胞内輸送の過程に関与していることが知られている。 The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells of the present invention and the agent for suppressing metastatic potential in cancer stem cells of the present invention include a nucleic acid molecule that suppresses the expression of the RAB3B gene, an antibody that binds to the protein encoded by the RAB3B gene, or an antibody that binds to the protein encoded by the RAB3B gene. It is not particularly limited as long as it is a molecular compound. Here, "RAB3B" (Entrez Gene ID: 5865, mRNA: NM_002867.3, protein: NP_002858.2) belongs to the Ras superfamily and is induced depending on the inflammatory response. It is known to be involved in the process of intracellular transport of secretory granules in cultured pituitary cells.
また、本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法としては、被検者から採取した生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を指標として、癌の転移性再発リスクを予測する方法であれば特に制限されず、ここで、「転移性再発」とは、主として血行性転移による原発巣除去後の術後再発であり、除去手術後1年若しくは2年以内の早期再発である。具体的には微小転移巣、例えば肝内微小転移巣や、血液からの遺残癌細胞の再増殖による再発であり、de novoによる再発、例えば肝炎ウイルス感染を素地とするde novoによる再発と区別されるものである。なお、上述の血行性転移による原発巣除去後の術後肝内再発を以下「転移性肝内再発」ともいう。 Further, as a method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention, the expression level of RAB3B gene mRNA, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the RAB3B gene in a biological sample collected from a subject. It is not particularly limited as long as it is a method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer using the expression level of the target microRNA as an index. Postoperative recurrence, early recurrence within 1 or 2 years after removal surgery. Specifically, micrometastases such as intrahepatic micrometastases and recurrence due to regrowth of residual cancer cells from the blood are distinguished from de novo recurrence, such as de novo recurrence based on hepatitis virus infection. It is what is done. In addition, postoperative intrahepatic recurrence due to hematogenous metastasis after removal of the primary tumor is hereinafter also referred to as "metastatic intrahepatic recurrence".
さらに、本発明の癌ペプチドワクチンとしては、配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質のアミノ酸配列のうち、連続する5-50個、好ましくは9-25のアミノ酸からなるペプチドを有効成分とする癌ペプチドワクチンであればよく、かかる癌ペプチドワクチンは、癌ペプチドワクチン療法に用いることができる。 Furthermore, the cancer peptide vaccine of the present invention comprises, as an active ingredient, a peptide consisting of 5 to 50, preferably 9 to 25 consecutive amino acids in the amino acid sequence of the RAB3B protein shown in SEQ ID NO: 1. Such a cancer peptide vaccine can be used for cancer peptide vaccine therapy.
上記「RAB3B遺伝子の発現を抑制する核酸分子」としてはRAB3B遺伝子の発現を抑制できるかぎり特に制限されず、RAB3B遺伝子の転写を抑制するものや、RAB3B遺伝子を破壊するものや、RAB3B遺伝子の翻訳を抑制するものを挙げることができ、RAB3B遺伝子の全長又は部分配列を標的とする二本鎖siRNA、microRNA、shRNA、RAB3B遺伝子を標的とするguide RNA、アンチセンス核酸、リボザイム等を挙げることができる。二本鎖siRNAとしては、例えば配列番号2に示されるセンス配列と配列番号3に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNA、又は配列番号4に示されるセンス配列と配列番号5に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRNAを挙げることができ、Cas9タンパク質をゲノムに標的化させるguide RNA配列としては配列番号10に示されるguide RNA配列を挙げることができ、microRNAとしては配列番号6に示されるhas-miR-15a-5p(microRNA database（http://www.mirbase.org/）ID:MIMAT0000068)や、has-miR-15a-5pの塩基配列と少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつRAB3B遺伝子を標的としてRAB3B遺伝子の発現を抑制できるRNAを挙げることができる。なお、配列番号2における3’末端のtt(tはチミン)、配列番号3における3’末端のcc(cはシトシン)、配列番号4における3’末端のtt、配列番号5における3’末端のgg(gはグアニン)はRNAをヌクレアーゼから保護するためのオーバーハング配列である。 The "nucleic acid molecule that suppresses the expression of the RAB3B gene" is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the RAB3B gene. Examples thereof include double-stranded siRNAs, microRNAs, shRNAs, guide RNAs targeting the RAB3B gene, antisense nucleic acids, ribozymes, and the like, which target the full-length or partial sequences of the RAB3B gene. As the double-stranded siRNA, for example, an siRNA formed from the sense sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 3, or the sense sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 5 The guide RNA sequence for targeting the Cas9 protein to the genome includes the guide RNA sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the microRNA shown in SEQ ID NO: 6. at least 85%, preferably 90% or more , more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more identity, and can target the RAB3B gene and suppress the expression of the RAB3B gene. tt (t is thymine) at the 3' end of SEQ ID NO: 2, cc (c is cytosine) at the 3' end of SEQ ID NO: 3, tt at the 3' end of SEQ ID NO: 4, and tt at the 3' end of SEQ ID NO: 5 gg (g is guanine) is an overhang sequence to protect RNA from nucleases.
上記「RAB3Bタンパク質に結合する抗体」としては、配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質に結合する抗体であれば特に制限されず、RAB3Bタンパク質に特異的に結合する抗体であることが好ましく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等の抗体であってもよく、また、この中には、F(ab’)2、Fab、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2等の抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。 The "antibody that binds to the RAB3B protein" is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to the RAB3B protein shown in SEQ ID NO: 1, preferably an antibody that specifically binds to the RAB3B protein, a monoclonal antibody, Antibodies such as polyclonal antibodies, human antibodies, chimeric antibodies , and humanized antibodies may also be used. Also included are antibody fragments that consist of a portion of an antibody.
上記「RAB3Bタンパク質に結合する低分子化合物」としては、RAB3Bタンパク質に結合する低分子の化合物であればよく、ゲニステイン(Genistein)等のチロシンキナーゼ (tyrosine kinase) 阻害剤を挙げることができ、かかる低分子化合物は、公知の方法によりスクリーニングして得ることができ、天然の化合物であっても又は人工の化合物のいずれであっても良い。上記スクリーニング方法としては、例えば、RAB3Bタンパク質又はその部分ペプチドと被検低分子化合物を接触させて、RAB3Bタンパク質又はその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を調べ、RAB3Bタンパク質又はその部分ペプチドと結合する化合物を選択する方法を挙げることができる。 The above-mentioned "low-molecular-weight compound that binds to RAB3B protein" may be a low-molecular-weight compound that binds to RAB3B protein, and includes tyrosine kinase inhibitors such as Genistein. A molecular compound can be obtained by screening by a known method, and may be either a natural compound or an artificial compound. As the screening method, for example, the RAB3B protein or its partial peptide is contacted with a test low-molecular-weight compound, the binding activity between the RAB3B protein or its partial peptide and the test compound is examined, and binding to the RAB3B protein or its partial peptide is performed. A method of selecting a compound to be used can be mentioned.
上記「癌幹細胞における薬物耐性」とは、癌幹細胞が薬物に対して抵抗性を有し、薬剤が効かない、又は効きにくくなる状態を意味する。具体的には、薬剤が抗癌剤の場合には、癌幹細胞が抗癌剤による細胞障害活性に対して抵抗性を有し、抗癌剤を投与しても癌幹細胞の生存率が下がりにくくなることをいう。 The above-mentioned "drug resistance in cancer stem cells" means a state in which cancer stem cells have resistance to drugs, and drugs do not work or become less effective. Specifically, when the drug is an anticancer drug, cancer stem cells are resistant to the cytotoxic activity of the anticancer drug, and the survival rate of cancer stem cells is less likely to decrease even when the anticancer drug is administered.
上記「癌幹細胞における転移能」とは、癌幹細胞として原発巣より遊離して脈管浸潤し、足場非依存的に脈管内にて生存し、転移巣における腫瘍形成および癌細胞への分化による腫瘍増大までの一連の能力を意味する。肝癌における臨床像としては血行性転移による肝内転移に相当する。 The above-mentioned "metastatic potential in cancer stem cells" means that cancer stem cells are released from the primary tumor and infiltrate the blood vessel, survive in the blood vessel in an anchorage-independent manner, and form tumors in metastatic lesions and differentiate into cancer cells. Means a series of abilities up to augmentation. The clinical picture of liver cancer corresponds to intrahepatic metastasis due to hematogenous metastasis.
上記「癌幹細胞」における癌、又は上記「癌ペプチドワクチン」における癌としては、固形癌でも血液癌でもよく、肝癌（肝細胞癌、又は胆管細胞癌）、膵臓癌、胃癌、食道癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、膣癌、頸部癌、子宮癌、腎臓癌、脾臓癌、肺癌、気管癌、気管支癌、大腸癌（直腸癌、又は結腸癌）、小腸癌、胆嚢癌、胆道癌、精巣癌、卵巣癌等の癌や、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織の癌のほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病を挙げることができる。 The cancer in the above "cancer stem cells" or the cancer in the above "cancer peptide vaccine" may be solid cancer or blood cancer, liver cancer (hepatocellular carcinoma or cholangiocarcinoma), pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, adenocarcinoma. , Squamous cell carcinoma, Adenosquamous cell carcinoma, Undifferentiated carcinoma, Large cell carcinoma, Small cell carcinoma, Skin cancer, Breast cancer, Prostate cancer, Bladder cancer, Vaginal cancer, Cervical cancer, Uterine cancer, Kidney cancer, Spleen cancer, Lung cancer , tracheal cancer, bronchial cancer, colon cancer (rectal cancer or colon cancer), small intestine cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, ovarian cancer, bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, blood vessels In addition to tissue and hematopoietic tissue cancer, sarcoma such as chondrosarcoma, Ewing sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant schwannoma, osteosarcoma, and soft tissue sarcoma, hepatoblastoma, medulloblastoma, nephroblastoma, and neuroblastoma , pancreatoblastoma, pleuropulmonary blastoma, retinoblastoma, germ cell tumor, lymphoma, and leukemia.
上記「薬物」としては、ドキソルビシン、イダルビジン、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、ドセタキセル、ビンクリスチン等の微小管阻害剤、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン等のプラチナ製剤、ボリノスタット等のヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、スニチニブ、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、イリノテカン、エトポシド等のトポイソメラーゼ阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等の免疫制御薬を挙げることができ、抗腫瘍性抗生物質、微小管阻害剤、プラチナ製剤、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、キナーゼ阻害剤、又はトポイソメラーゼ阻害剤を好適に挙げることができる。また、核酸分子としてRAB3B遺伝子を標的とする二本鎖siRNAを用いる場合にはドキソルビシン、ドセタキセル、カルボプラチン、ボリノスタット、又はスニチニブを挙げることができ、核酸分子としてRAB3B遺伝子を標的とするguide RNAを用いる場合には５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、ドセタキセル、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、イリノテカン、スニチニブ、又はソラフェニブを好適に挙げることができ、核酸分子としてRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAを用いる場合にはドキソルビシン、ドセタキセル、カルボプラチン、ボリノスタット、スニチニブ又はイリノテカンを好適に挙げることができる。 Examples of the above-mentioned "drug" include antitumor antibiotics such as doxorubicin, idaruvidin and mitomycin C, microtubule inhibitors such as docetaxel and vincristine, platinum agents such as carboplatin, cisplatin and oxaliplatin, histone deacetylases such as vorinostat. (HDAC) inhibitors, kinase inhibitors such as sunitinib, imatinib, gefenib, erlotinib, afatinib, dasatinib, trametinib, topoisomerase inhibitors such as irinotecan and etoposide, calcineurin inhibitors such as cyclosporine and tacrolimus, cyclophosphamide, bendamustine, Alkylating drugs such as iosfamide and dacarbazine; antimetabolites such as pentostatin, fludarabine, cladribine, methotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine and enocitabine; molecular targeted drugs such as rituximab, cetuximab and trastuzumab; proteasome inhibitors such as bortezomib drugs, hormone therapy drugs such as tamoxifen and bicardamide, immunoregulatory drugs such as interferon, nivolumab and pembrolizumab, antitumor antibiotics, microtubule inhibitors, platinum agents, histone deacetylase (HDAC) inhibitors agents, kinase inhibitors, or topoisomerase inhibitors. In addition, when a double-stranded siRNA targeting the RAB3B gene is used as the nucleic acid molecule, doxorubicin, docetaxel, carboplatin, vorinostat, or sunitinib can be used, and when using a guide RNA targeting the RAB3B gene as the nucleic acid molecule. Suitable examples include 5-fluorouracil, doxorubicin, docetaxel, histone deacetylase (HDAC) inhibitors, irinotecan, sunitinib, or sorafenib. When using microRNA targeting the RAB3B gene as the nucleic acid molecule, Preference may be given to doxorubicin, docetaxel, carboplatin, vorinostat, sunitinib or irinotecan.
本発明の癌幹細胞の薬物耐性の低減剤又は癌幹細胞における転移能の抑制剤には、薬学的に許容される添加剤を含有してもよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。 The agent for reducing drug resistance of cancer stem cells or the agent for suppressing metastatic potential of cancer stem cells of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives. Saline solutions, cell culture media, dextrose, water for injection, glycerol, ethanol and combinations thereof, stabilizers, solubilizers and surfactants, buffers and preservatives, tonicity agents, bulking agents, and lubricants. be able to.
本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤又は癌幹細胞における転移能の抑制剤は、当業者に既知の方法を用いて、癌の治療を必要とする被検体に投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。 The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells or the agent for suppressing metastatic potential in cancer stem cells of the present invention can be administered to a subject in need of cancer treatment using methods known to those skilled in the art. including intravenous, intratumoral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intramedullary, intracardiac, intraarticular, intrasynovial, intracranial, intrathecal, and subarachnoid (cerebrospinal fluid) injection into the
本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤又は癌幹細胞における転移能の抑制剤の投与量は、癌の種類、位置、重症度、治療を受ける被検体の年齢、体重及び状態等に応じて適宜調整できるが、好ましくは、１回の投与において体重1kgあたりRAB3B遺伝子の発現を抑制する核酸分子として0.01μg-1000μg、好ましくは0.1μg-100μgを挙げることができ、配列番号1に示されるRAB3Bタンパク質に結合する抗体若しくは低分子化合物として0.01μg-100μg、好ましくは0.1μg-10μgを挙げることができる。 The dose of the agent for reducing drug resistance in cancer stem cells or the agent for suppressing metastatic potential in cancer stem cells of the present invention is appropriately determined according to the type, location, severity of cancer, age, body weight, condition, etc. of the subject to be treated. 0.01 μg-1000 μg, preferably 0.1 μg-100 μg can be mentioned as a nucleic acid molecule that suppresses the expression of the RAB3B gene per 1 kg of body weight, although it can be adjusted, and the RAB3B protein shown in SEQ ID NO: 1 0.01 μg to 100 μg, preferably 0.1 μg to 10 μg can be used as an antibody or low-molecular-weight compound that binds to .
投与する幹細胞における薬物耐性の低減剤又は癌幹細胞における転移能の抑制剤は、1日4回、3回、2回又は1回、1日おき、2日おき、3日おき、4日おき、5日おき、週1回、7日おき、8日おき、9日おき、週2回、月1回又は月2回独立して投与する方法を挙げることができる。 The drug resistance reducing agent in stem cells to be administered or the metastatic potential suppressing agent in cancer stem cells is administered 4 times, 3 times, 2 times or 1 time, every other day, every 2 days, every 3 days, every 4 days, Methods of independently administering every 5 days, once a week, every 7 days, every 8 days, every 9 days, twice a week, once a month or twice a month can be mentioned.
本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤は、該薬物と併用して用いることこができる。前記「該薬物と併用して用いる」方法としては、該薬物を用いて処理し、その後本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤を用いる方法や、本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤と該薬物を同時に用いる方法や、本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤を用いて処理し、その後該薬物を用いる方法を挙げることができ、該薬物を用いて処理し、その後本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤を用いる方法を好適に挙げることができる。また、本発明の癌幹細胞における薬物耐性の低減剤と該薬物と併用した場合には、薬物の治療効果がより向上すると共に、該薬物の投与回数又は投与量を減らすことで、該薬物による副作用を低減させることが可能となる。 The agent for reducing drug resistance in cancer stem cells of the present invention can be used in combination with the drug. The method of "used in combination with the drug" includes a method of treating with the drug and then using the drug resistance-reducing agent in cancer stem cells of the present invention, or a method of using the drug resistance-reducing agent in cancer stem cells of the present invention. and a method of using the drug at the same time, a method of treating with the agent for reducing drug resistance in cancer stem cells of the present invention, and then using the drug, and a method of treating with the drug and then using the drug of the present invention. A preferred example is a method using a drug resistance-reducing agent in cancer stem cells. In addition, when the agent for reducing drug resistance in cancer stem cells of the present invention is used in combination with the drug, the therapeutic effect of the drug is further improved, and side effects due to the drug can be reduced by reducing the administration frequency or dosage of the drug. can be reduced.
上記癌の転移性再発リスクを予測する方法における「生体試料」としては、原発肝腫瘍組織、細胞等の非液性試料や、血液、血清、唾液等の液性試料、原発肝腫瘍組織、原発肝腫瘍組織周辺の非癌部組織を例示することができ、原発肝腫瘍組織又は血液であることを好適に例示することができる。なお、転移生再発は血行性転移でもあることから、上記細胞として血液中の循環癌細胞を用いてもよい。また、上記原発肝腫瘍組織は、被検者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。 The "biological sample" in the method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer includes non-liquid samples such as primary liver tumor tissue and cells, liquid samples such as blood, serum and saliva, primary liver tumor tissue, primary Non-cancerous tissue around the liver tumor tissue can be exemplified, and primary liver tumor tissue or blood can be preferably exemplified. Metastatic recurrence is also hematogenous metastasis, so circulating cancer cells in the blood may be used as the cells. In addition, the primary liver tumor tissue may be a frozen tissue that has been frozen after being collected from the subject, or a pathological tissue that has been subjected to histopathological processing. Examples of tissue include formalin-fixed tissue, formalin-fixed paraffin-embedded tissue, and the like.
本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法において、RAB3B遺伝子のmRNAの発現量を検出する方法としては、RAB3B遺伝子のmRNAの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよい。具体的には、(1)被検者から採取された生体試料中のtotal RNAを抽出・精製し、RAB3B遺伝子のmRNAに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法、(2)被検者から採取された生体試料中の細胞におけるtotal RNAを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、かかるcDNAを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的PCR法、リアルタイムPCR法等の定量PCR法で検出する方法、(3)被検者から採取された生体試料中のtotal RNAを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）等でcDNAをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体等で間接的にcDNAを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチック等のハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、RAB3B遺伝子のcDNAに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法、(4)被検者から採取された生体試料中のtotal RNAを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、cDNAを制限酵素よって切断し、アダプター配列を結合した後、これらを鋳型DNAとしたPCRを行い、それぞれのPCR産物をキャピラリー電気泳動により展開し、得られたPCR産物由来のピークを検証するHiCEP法等の方法、等を挙げることができる。なお、RAB3B遺伝子のmRNAやcDNAの配列情報は、例えばRAB3B遺伝子名を基に、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)のデータベースで検索することにより得ることができる。 In the method of predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention, any method for detecting the expression level of the RAB3B gene mRNA may be any method that can specifically detect part or all of the RAB3B gene mRNA. can be any method. Specifically, (1) a method of extracting and purifying total RNA in a biological sample collected from a subject and detecting it by Northern blotting using a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the mRNA of the RAB3B gene. (2) Extracting and purifying total RNA in cells in a biological sample collected from a subject, synthesizing cDNA using reverse transcriptase, and using a primer pair that specifically amplifies the cDNA. , Competitive PCR, real-time PCR, and other methods of detection by quantitative PCR; After that, the cDNA was labeled with biotin, digoxigenin, etc., and the cDNA was indirectly labeled with a fluorescent substance-labeled avidin, which has a high affinity for biotin, or an antibody that recognizes digoxigenin. (4) a method of detecting with a microarray using a probe consisting of a base sequence complementary to cDNA of the RAB3B gene immobilized on a support that can be used for hybridization such as glass, silicon, plastic, etc.; After extracting and purifying total RNA in biological samples collected from examiners and synthesizing cDNA using reverse transcriptase, the cDNA is cleaved with restriction enzymes, ligated with adapter sequences, and these are used as template DNA. A method such as the HiCEP method in which PCR is performed, each PCR product is developed by capillary electrophoresis, and the peak derived from the obtained PCR product is verified. The sequence information of mRNA and cDNA of the RAB3B gene can be obtained, for example, by searching the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) database based on the name of the RAB3B gene. can.
本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法において、RAB3B遺伝子のmRNAがコードするタンパク質の発現量を検出する方法としては、RAB3B遺伝子のmRNAがコードするタンパク質（以下、「RAB3Bタンパク質」という）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、RAB3Bタンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法や、RAB3Bタンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法を挙げることができる。なお、RAB3Bタンパク質のアミノ酸配列情報は、例えばRAB3Bタンパク質名を基に、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースで検索することにより得ることができる。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention, as a method for detecting the expression level of the protein encoded by the mRNA of the RAB3B gene, the protein encoded by the mRNA of the RAB3B gene (hereinafter referred to as "RAB3B protein") Any method may be used as long as it can specifically detect part or all of the RAB3B protein, specifically, an immunoassay method using an antibody that specifically recognizes the RAB3B protein, or RAB3B Mass spectrometry that detects peptides that make up proteins can be mentioned. The amino acid sequence information of the RAB3B protein can be obtained, for example, by searching the database of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) based on the name of the RAB3B protein.
本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法において、RAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を検出する方法としては、RAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよい。具体的には、(1)被検者から採取された生体試料中の細胞におけるtotal RNAを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、かかるcDNAを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的PCR法、リアルタイムPCR法等の定量PCR法で検出する方法、(2)被検者から採取された生体試料中のtotal RNAを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）等でcDNAをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体等で間接的にcDNAを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチック等のハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、RAB3B遺伝子のcDNAに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention, the method for detecting the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene can specifically detect part or all of the microRNA targeting the RAB3B gene. Any method may be used as long as it is a method. Specifically, (1) a primer that extracts and purifies total RNA in cells in a biological sample collected from a subject, synthesizes cDNA using reverse transcriptase, and then specifically amplifies the cDNA. A method of detecting by quantitative PCR method such as competitive PCR method and real-time PCR method using pairs, (2) extracting and purifying total RNA in the biological sample collected from the subject, using reverse transcriptase After synthesizing cDNA, the cDNA is labeled with biotin, digoxigenin, etc., and indirectly labeled with avidin, which has a high affinity for biotin labeled with a fluorescent substance, or an antibody that recognizes digoxigenin. After labeling the cDNA, it is immobilized on a support such as glass, silicon, plastic, etc. that can be used for hybridization. A method of detecting with a microarray using a probe consisting of a base sequence complementary to the cDNA of the RAB3B gene, etc. can be mentioned.
本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法における癌の転移性再発リスクの予測は、被検者から採取された生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を測定することによって行うことができる。肝癌の場合で例えると、以下の方法（I）－(III)を挙げることが出来る。 Prediction of the risk of metastatic recurrence of cancer in the method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention is based on the expression level of mRNA of the RAB3B gene in a biological sample collected from a subject, and the amount of protein encoded by the mRNA. It can be performed by measuring the expression level or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene. Taking the case of liver cancer as an example, the following methods (I) to (III) can be mentioned.
方法（I）
事前に摘除手術後5年以上再発無し肝癌患者と、摘除手術後1年又は2年以内転移性再発有り肝癌患者それぞれ2検体以上、好ましくは4検体以上、より好ましくは5検体以上、さらに好ましくは10検体以上から採取された生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を測定し、かかる発現量の中央値又は平均値等を算出し、前記中央値又は平均値等を基にカットオフ値を定める。次いで被検者から採取された生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を測定し、被検者から採取された生体試料中のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量と前記カットオフ値とを比較することで、被検者における肝癌の転移性再発リスクを予測することが可能である。
Method (I)
2 samples or more, preferably 4 samples or more, more preferably 5 samples or more, more preferably 5 samples or more, more preferably 5 samples or more from patients with liver cancer without recurrence for 5 years or more after resection and patients with metastatic recurrence within 1 year or 2 years after surgery Measure the expression level of the RAB3B gene mRNA, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of the microRNA that targets the RAB3B gene in biological samples collected from 10 or more specimens, and obtain the median expression level Alternatively, an average value or the like is calculated, and the cutoff value is determined based on the median value or average value or the like. Next, the expression level of the RAB3B gene mRNA in the biological sample collected from the subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of the microRNA targeting the RAB3B gene is measured and collected from the subject. By comparing the expression level of mRNA in the biological sample obtained, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene and the cutoff value, the liver cancer in the subject It is possible to predict the risk of metastatic recurrence.
被検者から採取された生体試料中のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量がカットオフ値以上であれば、被検者の肝癌の転移性再発リスクが高い、或いは被検者における肝癌治療の予後が悪い（予後不良）と予測することができる。一方、被検者から採取された生体試料中のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量がカットオフ値未満であれば、被検者の肝癌の転移性再発リスクが低い、或いは被検者における肝癌治療の予後がよい（予後良好）と予測することができる。 If the expression level of mRNA in the biological sample collected from the subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene is greater than or equal to the cutoff value, the subject's It can be predicted that the risk of metastatic recurrence of liver cancer is high, or that the prognosis of liver cancer treatment in a subject is poor (poor prognosis). On the other hand, if the expression level of mRNA in the biological sample collected from the subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene is less than the cutoff value, the subject It can be predicted that the risk of metastatic recurrence of liver cancer in a subject is low, or that the prognosis of liver cancer treatment in the subject is good (good prognosis).
方法（II）
被検者の手術摘出標本を用いて、非癌部RAB3B mRNA発現量にする癌部RAB3B mRNA発現量の比を求め、かかる非癌部RAB3B mRNA発現量に対する癌部RAB3B mRNA発現量の比を用いることで、被検者における肝癌の転移性再発リスクを予測することが可能である。カットオフ値は、好ましくは発現比1.0、より好ましくは1.5、さらに好ましくはReceiver operating characteristic曲線におけるYouden indexによって定めた1.16である。また、事前にHCC患者2検体以上、好ましくは4検体以上、より好ましくは5検体以上、さらに好ましくは10検体以上から採取された生体試料中の癌部及び非癌部それぞれのRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を測定し、非癌部RAB3B mRNA発現量にする癌部RAB3B mRNA発現量の比を求め、かかる発現量の比の中央値又は平均値等を算出し、前記中央値又は平均値等を基にカットオフ値を定めても良い。
Method (II)
Using a surgically resected specimen of a subject, the ratio of the cancer RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level is determined, and the ratio of the cancer RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level is used. Thus, it is possible to predict the risk of metastatic recurrence of liver cancer in a subject. The cut-off value is preferably an expression ratio of 1.0, more preferably 1.5, even more preferably 1.16 determined by the Youden index in the Receiver operating characteristic curve. In addition, mRNA of the RAB3B gene of each cancerous and non-cancerous part in a biological sample collected in advance from 2 or more, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 or more specimens from HCC patients The expression level, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene is measured, and the ratio of the cancerous RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level is determined, and such expression A median value or average value of the ratio of amounts may be calculated, and the cutoff value may be determined based on the median value, average value or the like.
被検者の非癌部RAB3B mRNA発現量に対する癌部RAB3B mRNA発現量の比がカットオフ値以上であれば、被検者の肝癌の転移性再発リスクが高い、或いは被検者における肝癌治療の予後が悪い（予後不良）と予測することができる。一方、被検者の非癌部RAB3B mRNA発現量に対する癌部RAB3B mRNA発現量の比がカットオフ値未満であれば、被検者の肝癌の転移性再発リスクが低い、或いは被検者における肝癌治療の予後がよい（予後良好）と予測することができる。 If the ratio of the cancer RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level of the subject is greater than or equal to the cutoff value, the risk of metastatic recurrence of liver cancer in the subject is high, or the liver cancer treatment in the subject Poor prognosis can be predicted. On the other hand, if the ratio of the cancerous RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level in the subject is less than the cutoff value, the risk of metastatic recurrence of liver cancer in the subject is low, or liver cancer in the subject It can be predicted that the prognosis of treatment is good (good prognosis).
方法（III）
被検者から採取された生体試料中のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量、及び、摘除手術後5年以上再発無し肝癌者と、摘除手術後1年又は2年以内転移性再発有り肝癌患者それぞれ2検体以上、好ましくは4検体以上、より好ましくは5検体以上、さらに好ましくは10検体以上から採取された生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量とを組み合わせた判別式をロジスティック回帰分析等の統計解析により構築して予測する方法を挙げることができる。
Method (III)
Expression level of mRNA in biological samples collected from subjects, expression level of protein encoded by said mRNA, or expression level of microRNA targeting RAB3B gene, and liver cancer patients without recurrence for 5 years or more after resection surgery and RAB3B in biological samples collected from 2 or more, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 or more patients with metastatic recurrent liver cancer within 1 or 2 years after resection surgery A method of constructing and predicting a discriminant combining the expression level of the mRNA of a gene, the expression level of a protein encoded by the mRNA, or the expression level of a microRNA targeting the RAB3B gene by statistical analysis such as logistic regression analysis. can be mentioned.
なお、上記方法（I）-(III)に示す肝癌の転移性再発リスクの予測方法において、RAB3B遺伝子のmRNA、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量の代わりに、RAB3B遺伝子のmRNA、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量と相関又は逆相関の関係にあるセルフリーDNA又はセルフリーRNAの発現量を測定してもよい。 In the method for predicting the risk of metastatic recurrence of liver cancer shown in the above methods (I)-(III), instead of the expression level of the RAB3B gene mRNA or microRNA targeting the RAB3B gene, the RAB3B gene mRNA, The expression level of cell-free DNA or cell-free RNA, which is correlated or inversely correlated with the expression level of protein encoded by mRNA or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene, may be measured.
本発明の癌の転移性再発リスクを予測する方法に用いるためのキットとしては、
（I）被検者から採取した生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物；
（II）被検者から採取した生体試料中のmRNAがコードするタンパク質の発現量を検出するための抗体、又はそれらの標識物；
を含んでいれば特に制限されず、上記キットには、必要と目的に応じた緩衝液、pH調製剤、反応容器、癌の転移性再発リスクを予測するための説明書等をさらに備えたものであってもよい。
As a kit for use in the method for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer of the present invention,
(I) a primer pair or probe for detecting the expression level of RAB3B gene mRNA or the expression level of microRNA targeting the RAB3B gene in a biological sample collected from a subject, or a label thereof;
(II) an antibody for detecting the expression level of a protein encoded by mRNA in a biological sample collected from a subject, or a label thereof;
is not particularly limited as long as it contains, and the kit further includes a buffer solution, a pH adjuster, a reaction vessel, and an instruction manual for predicting the risk of metastatic recurrence of cancer according to the need and purpose. may be
上記キットにおけるプライマー対としては、RAB3B遺伝子又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAから合成されるcDNAの上流及び下流の配列の一部とストリンジェントな条件下でアニーリングしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ、かかるcDNAとアニーリングする部位、増幅するcDNAの長さ等は、DNAの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。 The primer pair in the above kit is a complementary primer pair that can anneal under stringent conditions with part of the upstream and downstream sequences of the cDNA synthesized from the RAB3B gene or microRNA targeting the RAB3B gene. , the length of the primer sequence, the site to be annealed with the cDNA, the length of the cDNA to be amplified, etc. can be appropriately selected in consideration of the amplification efficiency and specificity of the DNA.
上記キットにおけるプローブとしては、RAB3B遺伝子、又はかかる遺伝子から合成したcDNAの一部若しくは全部とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。 If the probe in the kit is a probe that hybridizes under stringent conditions with the RAB3B gene or part or all of the cDNA synthesized from such gene, the length of the probe, the hybridizing site, etc. It can be appropriately selected in consideration of efficiency and specificity of hybridization.
上記ストリンジェントな条件としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは100%の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である65℃、1×SSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）、0.1%SDS、又は0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。 The above-mentioned stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. More preferably, DNAs with 100% identity hybridize to each other and DNAs with lesser identities do not hybridize to each other, or conditions for normal Southern hybridization washing at 65° C. and 1×SSC. Hybridization conditions can include a salt concentration equivalent to a solution (the composition of a 1× SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), 0.1% SDS, or 0.1×SSC and 0.1% SDS.
上記プローブ又は上記プライマー対は当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。上記プローブ又は上記プライマー対を用いて定量PCR法又はマイクロアレイ法を行うことにより、RAB3B遺伝子のmRNAの発現量又はRAB3B遺伝子を標的とするmicroRNAを測定することが可能となる。 The probe or primer pair can be obtained by chemical synthesis or the like using a method well known in the art. By performing a quantitative PCR method or a microarray method using the above probes or the above primer pairs, it is possible to measure the expression level of the mRNA of the RAB3B gene or the microRNA that targets the RAB3B gene.
上記キットにおける抗体としては、mRNAがコードするタンパク質に結合する抗体であればよく、mRNAがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体であることが好ましく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等の抗体であってもよく、また、この中には、F(ab’)2、Fab、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2等の抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、上記キットには、上記mRNAがコードするタンパク質に結合する抗体を検出するための、蛍光物質、酵素等の標識物をコンジュゲートした2次抗体を含めることができる。 The antibody in the above kit may be an antibody that binds to a protein encoded by mRNA, preferably an antibody that specifically binds to a protein encoded by mRNA, such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a human antibody, or a chimeric antibody. , It may be an antibody such as a humanized antibody, and among these, an antibody fragment consisting of a part of an antibody such as F (ab') 2, Fab, diabody, Fv, ScFv, Sc (Fv) 2 is also included. The kit can also contain a secondary antibody conjugated with a label such as a fluorescent substance or an enzyme for detecting an antibody that binds to the protein encoded by the mRNA.
上記キットにおけるプライマー対、プローブ、又は抗体における標識物としては、ビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)、32P等を具体的に挙げることができる。 Specific examples of the primer pair, probe, or label in the antibody in the kit include biotin, green fluorescent protein (GFP), horseradish peroxidase (HRP), 32P, and the like. .
本発明の癌ペプチドワクチンは、癌ペプチドワクチン療法に用いることができ、かかる癌ペプチドワクチンを癌患者に投与することで、投与した癌患者における癌細胞に対する細胞傷害活性を誘導することが可能となる。より具体的には、(a)AB3Bタンパクのアミノ酸配列全長に対して、T細胞におけるMHC-class IやMHC-class IIに対して親和性の高いペプチド配列をIEDB Analysis Resourceにあるプログラム (http://tools.immuneepitope.org/main/tcell/)等によって予測したRAB3Bペプチド、好ましくは、(b)上記(a)によって予測したRAB3Bペプチドの中からin vitro affinity assayによる親和性の高さによって選択したRAB3Bペプチド、より好ましくは、(c)上記(b)によって選択したRAB3Bペプチドの中からProteasomal cleavage効率やTAP transport親和性も考慮して選択したRAB3Bペプチド、さらに好ましくは、(d）上記(b)又は(c)によって選択したRAB3Bペプチドの中からELISpot assay等によりT細胞の活性化を確認したRAB3Bペプチドを、担癌患者において癌摘出手術の術前あるいは術後、若しくは術前及び術後に免疫賦活化剤と共に投与することで、担癌患者自身の免疫細胞におけるRAB3B発現細胞に対する細胞障害活性を誘導することにより、RAB3B高発現癌細胞を除去することが可能である。 The cancer peptide vaccine of the present invention can be used for cancer peptide vaccine therapy, and by administering such a cancer peptide vaccine to cancer patients, it is possible to induce cytotoxic activity against cancer cells in the administered cancer patients. . More specifically, (a) peptide sequences with high affinity for MHC-class I and MHC-class II in T cells were extracted from the full-length AB3B protein amino acid sequence using the IEDB Analysis Resource program (http: //tools.immuneepitope.org/main/tcell/), etc., preferably (b) selected from among the RAB3B peptides predicted by (a) above based on high affinity by in vitro affinity assay RAB3B peptides, more preferably (c) RAB3B peptides selected by (b) above in consideration of proteasomal cleavage efficiency and TAP transport affinity, more preferably (d) above (b ) or RAB3B peptides selected by (c), which have been confirmed to activate T cells by ELISpot assay, etc., in cancer-bearing patients before or after cancer removal surgery, or before and after surgery When administered together with an immunopotentiating agent, it is possible to eliminate cancer cells with high RAB3B expression by inducing cytotoxic activity against RAB3B-expressing cells in cancer-bearing patients' own immune cells.
上記癌ペプチドワクチンは、RAB3Bタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する方法や、通常の液相法や固相法によるペプチド合成方法によって得ることができる。得られたペプチドワクチンは、必要に応じてイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、アフィニティークロマトグラフィー等のペプチド化学の分野で汎用されている方法を適宜組み合わせて精製することができる。 The above-mentioned cancer peptide vaccine can be obtained by a method of treating RAB3B protein with a proteolytic enzyme, or a peptide synthesis method by a conventional liquid-phase method or solid-phase method. The resulting peptide vaccine is purified by appropriately combining methods commonly used in the field of peptide chemistry, such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), and affinity chromatography, as necessary. be able to.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
（SK-HEP-1細胞株からの浮遊細胞塊の誘導）
本発明者らが以前開示した癌幹細胞誘導法(上記特許文献4)を用い、肝癌由来の肝癌細胞株SK-HEP-1より、浮遊細胞塊（sphere）形成能を有する癌幹細胞を誘導した。具体的には以下に示すとおりである。
[Example 1]
(Induction of floating cell mass from SK-HEP-1 cell line)
Using the cancer stem cell induction method previously disclosed by the present inventors (
まず、低分化型肝細胞癌由来の肝癌細胞株であるSK-HEP-1細胞株の生細胞数をトリパンブルー染色より計測し、1.0×10５個／mlとなるように以下に示すNSC（neural survival factor-1）含有無血清培地（以下、「NSF含有無血清培地」ともいう）に懸濁した後、ベントキャップタイプフラスコ（BDファルコン社製）又は超低接着表面フラスコ カントネック ベントキャップ（Corning社製）に播種し、37℃、5%CO2条件下で培養した。培養後7日目には、SK-HEP-1細胞株由来の癌幹細胞様細胞塊のうち浮遊した細胞塊の細胞（以下、「SK-sphere」ともいう）を誘導した。NSC含有無血清培地は、以下の成分A、B、及びCからなるものを作製して用いた。 First, the number of viable cells of the SK-HEP-1 cell line, which is a liver cancer cell line derived from poorly differentiated hepatocellular carcinoma, was measured by trypan blue staining, and the number of NSCs shown below was adjusted to 1.0×10 5 cells/ml ( neural survival factor-1) containing serum-free medium (hereinafter also referred to as "NSF-containing serum-free medium"), then vent cap type flask (manufactured by BD Falcon) or ultra-low adhesion surface flask Kantneck vent cap ( Corning) and cultured under conditions of 37°C and 5% CO 2 . On the 7th day after culturing, among the cancer stem cell-like cell clusters derived from the SK-HEP-1 cell line, cells in floating cell clusters (hereinafter also referred to as "SK-spheres") were induced. An NSC-containing serum-free medium was prepared and used which consisted of components A, B, and C below.
（１）成分A
DMEM/F12（シグマ－アルドリッチ社製社製） 86mL
1M Hepes（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 900μL
Antibiotic/antimycotic liquid(100倍濃度) 900μL
30% グルコース 1.7mL
（２）成分B
DMEM/F12培地（シグマ－アルドリッチ社製） 8.6mL
30%グルコース（シグマ－アルドリッチ社製） 200μL
トランスフェリン（シグマ－アルドリッチ社製）10mg+H2O 200μL
インスリン（シグマ－アルドリッチ社製） 2.5mg+0.1N HCl 100μL(先にインスリンを溶解) +H2O 900μL(溶解後に加える) 計1mL
プトレシン（Alexis Biochemicals社製） 19.33mg
0.3mM 亜セレン酸ナトリウム（シグマ－アルドリッチ社製） 10μL
2mM プロゲステロン（シグマ－アルドリッチ社製） 1μL
（３）成分C
200μg/mL ヒトEGF（シグマ－アルドリッチ社製） 10μL
4μg/mL Basic FGF（和光純薬工業社製） 500μL
1mg/mL ヘパリン（シグマ－アルドリッチ社製） 200μL
10μg/mL LIF（ケミコン社製） 100μL
NSF-1（50倍濃度）（カンブレックス社製） 2mL（最終濃度；2%［w/v］）
60mg/mL Ｎ－アセチルシステイン（N-acetylcysteine）（シグマ－アルドリッチ社製） 100μL
(1) Component A
DMEM/F12 (manufactured by Sigma-Aldrich) 86mL
1M Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 900μL
Antibiotic/antimycotic liquid (100x concentration) 900μL
30% glucose 1.7mL
(2) Component B
DMEM/F12 medium (manufactured by Sigma-Aldrich) 8.6mL
30% glucose (manufactured by Sigma-Aldrich) 200 μL
Transferrin (manufactured by Sigma-Aldrich) 10mg + H 2 O 200μL
Insulin (manufactured by Sigma-Aldrich) 2.5 mg + 0.1
Putrescine (manufactured by Alexis Biochemicals) 19.33mg
0.3 mM sodium selenite (manufactured by Sigma-Aldrich) 10 μL
2mM progesterone (manufactured by Sigma-Aldrich) 1μL
(3) Component C
200 μg/mL human EGF (manufactured by Sigma-Aldrich) 10 μL
4 μg/mL Basic FGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 500 μL
1mg/mL heparin (manufactured by Sigma-Aldrich) 200μL
10 μg/mL LIF (manufactured by Chemicon) 100 μL
NSF-1 (50x concentration) (manufactured by Cambrex) 2 mL (final concentration; 2% [w/v])
60mg/mL N-acetylcysteine (manufactured by Sigma-Aldrich) 100μL
なお、ここでは約100mLの無血清培地を作製する場合の組成を記載している。また、無血清培地は、成分A、B及びCをそれぞれ個別に作製した後、混合して作製した。 Here, the composition for preparing about 100 mL of serum-free medium is described. A serum-free medium was prepared by preparing components A, B and C separately and then mixing them.
（SK-HEP-1細胞株の培養）
SK-HEP-1細胞株を1.0×10５個/mLとなるように10%ウシ胎児血清（FBS:fetal bovine serum）を含むDMEM培地（以下、単に「血清含有DMEM培地」という）に懸濁した後、培養シャーレに播種し、37℃、5% CO2条件下で3日間培養した。血清含有DMEM培地で培養したSK-HEP-1細胞株（以下、「SK-HEP-1」ともいう）は培養シャーレに接着する接着性の癌細胞株である。
(Culture of SK-HEP-1 cell line)
SK-HEP-1 cell line was suspended in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) (hereinafter simply referred to as "serum-containing DMEM medium") at 1.0×10 5 cells/mL. After that, it was seeded in a culture petri dish and cultured for 3 days under conditions of 37°C and 5% CO 2 . The SK-HEP-1 cell line (hereinafter also referred to as "SK-HEP-1") cultured in serum-containing DMEM medium is an adhesive cancer cell line that adheres to culture dishes.
（HuH7細胞株の培養）
高分化型肝細胞癌由来の細胞株であるHuH7細胞株を、上記NSC含有無血清培地、又は上記血清含有DMEM培地で培養した。具体的には、HuH7細胞株を1.0×105個/mLとなるように上記NSC含有無血清培地又は上記血清含有DMEM培地に懸濁した後、培養シャーレに播種し、37℃、5%CO2条件下でそれぞれ7日間又は3日間培養した。上記NSC含有無血清培地及び上記血清含有DMEM培地で培養したHuH7細胞株（それぞれ、以下「HuH7/NSC」、「HuH7/DMEM」ともいう）はいずれも培養シャーレに接着し、浮遊細胞塊は形成されなかった。したがって、NSC含有無血清培地を用いたとしても、低分化型肝癌由来のSK-HEP-1細胞株を培養した場合には浮遊細胞塊を形成するのに対し、低分化型肝癌由来のHuH7細胞株を培養した場合には浮遊細胞塊を形成しないことが明らかとなった。なお、本発明者らにより、上記非特許文献4により、NSC含有無血清培地を用いたとしても、低分化型肝癌由来のHLE細胞株を培養した場合には浮遊細胞塊を形成するのに対し、低分化型肝癌由来のHep3B細胞株を培養した場合には浮遊細胞塊を形成しないことも明らかにされている。
［実施例２］
(HuH7 cell line culture)
The HuH7 cell line, which is a well-differentiated hepatocellular carcinoma-derived cell line, was cultured in the NSC-containing serum-free medium or the serum-containing DMEM medium. Specifically, after suspending the HuH7 cell line in the NSC-containing serum-free medium or the serum-containing DMEM medium to 1.0 × 10 5 cells / mL, seeding in a culture petri dish, 37 ° C., 5% CO Cultured for 7 days or 3 days under two conditions, respectively. Both the HuH7 cell lines cultured in the NSC-containing serum-free medium and the serum-containing DMEM medium (hereinafter also referred to as "HuH7/NSC" and "HuH7/DMEM" respectively) adhered to the culture petri dish, and floating cell masses were formed. it wasn't. Therefore, even when using an NSC-containing serum-free medium, when SK-HEP-1 cell line derived from poorly differentiated liver cancer is cultured, floating cell masses are formed, whereas HuH7 cells derived from poorly differentiated liver cancer It was found that when the strain was cultured, no floating cell clusters were formed. According to the present inventors, according to
[Example 2]
実施例1で得られたSK-sphereが血行性肝転移能を有するかどうかを、以下のモデル実験により調べた。まず、実施例1で得られたSK-sphere及びSK-HEP-1細胞をAccumax (Innovative Cell Technologies社製), Accutase (Innovative Cell Technologies社製), Tripsin-EDTA (Gibco社製)を用いて細胞を解離した後に、血球計算板等を用いて細胞濃度を計算し、PBS若しくはHank's平衡塩溶液を用いて1×103 and 1×104 cells/50 μLの細胞懸濁液を調製した。これら細胞懸濁液50 μL (1×103 or 1×104 cells) を2%イソフルランにて麻酔下の免疫不全マウスNOD-Rag1null IL2r null double mutant mice (NRG mice) の脾臓に27Gの注射針を用いて注入した後に脾臓は摘出した。上記処置8週間後にマウスを開腹し肝腫瘍形成を確認した。結果を図１に示す。図１中、(a)、(b)は1×103 cells注入群、(c)、(d)は1×104 cells注入群である。 Whether or not the SK-spheres obtained in Example 1 have the potential for hematogenous liver metastasis was examined by the following model experiments. First, SK-sphere and SK-HEP-1 cells obtained in Example 1 were treated with Accumax (manufactured by Innovative Cell Technologies), Accutase (manufactured by Innovative Cell Technologies), and Tripsin-EDTA (manufactured by Gibco). was dissociated, the cell concentration was calculated using a hemocytometer or the like, and a cell suspension of 1×10 3 and 1×10 4 cells/50 μL was prepared using PBS or Hank's balanced salt solution. 50 μL of these cell suspensions (1×10 3 or 1×10 4 cells) were injected at 27G into the spleen of NOD-Rag1 null IL2r null double mutant mice (NRG mice) anesthetized with 2% isoflurane. The spleen was excised after injection using a needle. Eight weeks after the above treatment, the mice were subjected to laparotomy to confirm liver tumor formation. The results are shown in FIG. In FIG. 1, (a) and (b) are the 1×10 3 cells injection group, and (c) and (d) are the 1×10 4 cells injection group.
その結果、図1に示すように、1×103 cells注入群においてSK-HEP-1と比較してSK-sphereでの有意な肝腫瘍形成率（図中のFrequency）が観察された。また、1×104 cells注入群においてSK-HEP-1と比較してSK-sphereでの肝腫瘍形成率に有意差は見られなかったが、明らかな肝腫瘍形成量の増大を認めた。したがって、実施例1で得られたSK-sphereが血行性肝転移能を有することが確認された。 As a result, as shown in FIG. 1, a significant liver tumor formation rate (Frequency in the figure) was observed in SK-sphere compared with SK-HEP-1 in the group injected with 1×10 3 cells. In addition, in the 1×10 4 cells injection group, no significant difference was observed in the liver tumor formation rate with SK-sphere compared with SK-HEP-1, but a clear increase in the amount of liver tumor formation was observed. Therefore, it was confirmed that the SK-sphere obtained in Example 1 has hematogenous liver metastasis potential.
［実施例３］
（転移性肝内再発に特異的な遺伝子の同定）
実施例1で得られたSK-sphere、SK-HEP-1、HuH7/NSC、HuH7/DMEMそれぞれの肝細胞癌由来細胞、及び摘除手術後5年以上肝内再発無しHCC患者（HCC without IHR(≧5year)）若しくは摘除手術後1年以内転移性肝内再発ありHCC患者（HCC with IHR(≦1year)）からの摘除標本における癌部組織及び周辺非癌部組織のmRNA発現を解析することで、原発巣除去後の転移性肝内再発に特異的な遺伝子の同定を行った。
[Example 3]
(Identification of genes specific to metastatic intrahepatic recurrence)
SK-sphere, SK-HEP-1, HuH7/NSC, and HuH7/DMEM hepatocellular carcinoma-derived cells obtained in Example 1, and HCC patients without intrahepatic recurrence for more than 5 years after resection (HCC without IHR ( ≧5 years)) or metastatic intrahepatic recurrence within 1 year after resection surgery (HCC with IHR(≦1 year)). , identified genes specific to metastatic intrahepatic recurrence after removal of the primary tumor.
（mRNAの抽出）
miRNeasy（QIAGEN社製）を用いて、実施例１で作製したSK-sphere、SK-HEP-1、HuH7/NSC、HuH7/DMEMそれぞれの癌由来細胞株、及び摘除手術後5年以上肝内再発無しHCC患者（HCC without IHR(≧5year)）及び摘除手術後1年以内転移性肝内再発有りHCC患者（HCC with IHR(≦1year)）からの摘除原発巣標本（それぞれn=5）における癌部組織からtotal RNAを抽出した。
(mRNA extraction)
SK-sphere, SK-HEP-1, HuH7/NSC, and HuH7/DMEM cancer-derived cell lines prepared in Example 1 using miRNeasy (manufactured by QIAGEN), and intrahepatic recurrence more than 5 years after resection surgery Cancer in resected primary tumor specimens (n=5 each) from HCC patients without HCC (HCC without IHR (≧5 years)) and HCC patients with metastatic intrahepatic recurrence within 1 year after resection (HCC with IHR (≦1 year)) Total RNA was extracted from the partial tissue.
（mRNAの発現解析）
TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold LT Sample Prep kit（イルミナ社製）及びNextSeq500（イルミナ社製）を用いて、そのプロトコルに従ってribosomal RNA除去後にRNAシークエンスを行い、26,475遺伝子の網羅的なmRNA発現解析を行った。NextSeq 500より得られたfastqファイルからcutadaptによるデータトリミング、FastQCによるクオリティ確認を経てSTARによるhg38ヒトリファレンスゲノムへのマッピングを行った。26,475遺伝子それぞれにおけるリードカウント数について、R softwareにおけるTCCパッケージを用いて正規化及び群間比較を行った。群間比較に先立って正規化後に何れの分においても発現量が低い(read count = 10)遺伝子は除外した。発現変動遺伝子 (Differentially expressed Genes; DEGs) の検出にはGLM LRT法を用いた。解析にあたっては、(a)SK-sphereとSK-HEP-1、(b)SK-sphereとHuH7/NSC、(c)HCC with IHR(≦1year) vs HCC without IHR(≧5year)におけるmRNAの発現量を比較して、転移性肝内再発有り群及びSK-sphereに共通して発現亢進を示す遺伝子候補を選択した。選択基準は（Fold-change）2.0、q値〈0.05）とした。q値は、FDR多重検定（multiple-testing correction）により算出した。
(mRNA expression analysis)
Using TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold LT Sample Prep kit (manufactured by Illumina) and NextSeq500 (manufactured by Illumina), RNA sequencing was performed after removal of ribosomal RNA according to the protocol, and comprehensive mRNA expression analysis of 26,475 genes. did After data trimming by cutadapt and quality confirmation by FastQC, the fastq files obtained from
（MA plot解析）
さらに、上記それぞれの発現量解析の結果を統合してMA plot解析(SK-sphere vs SK-HEP-1及びShort-DFS(Disease-free survival)vs Long-DFS in Tumor)を行い、SK-sphere及び転移性肝内再発有り群に共通して発現亢進を示す遺伝子の探索を行った。肝癌におけるDFSは無再発生存期間を意味し、RFS (relapse-free survival) と同義である。上記遺伝子の探索手法の概略を図2に、MA plot解析の結果を図3及び4に示す。図3及び4中、横軸はSK-sphereとSK-HEP-1での総カウント数 (mRNAの発現量に相当)又はShort-DFSとLong-DFSでの総カウント数のLog2値、縦軸はSK-sphere/SK-HEP-1又はShort-DFS/Long-DFS発現比のLog2値を表す。
(MA plot analysis)
Furthermore, MA plot analysis (SK-sphere vs SK-HEP-1 and Short-DFS (Disease-free survival) vs Long-DFS in Tumor) was performed by integrating the results of each expression level analysis above, and SK-sphere And the group with metastatic intrahepatic recurrence was searched for genes showing increased expression in common. DFS in liver cancer means relapse-free survival and is synonymous with RFS (relapse-free survival). FIG. 2 shows an outline of the above gene search method, and FIGS. 3 and 4 show the results of MA plot analysis. In Figures 3 and 4, the horizontal axis is the total count (corresponding to the mRNA expression level) in SK-sphere and SK-HEP-1 or the Log2 value of the total count in Short-DFS and Long-DFS, and the vertical axis. represents the Log2 value of the SK-sphere/SK-HEP-1 or Short-DFS/Long-DFS expression ratio.
図4に示すMA plot解析により、転移性肝内再発有り群及びSK-sphereに共通して発現亢進を示す遺伝子、すなわち、原発巣除去後の術後転移性肝内再発に特異的な遺伝子の候補として図4の矢印のスポットに位置するsmall GTPaseをコードする遺伝子RAB3Bを同定した。 The MA plot analysis shown in Fig. 4 revealed genes showing increased expression in common in the group with metastatic intrahepatic recurrence and SK-sphere, that is, genes specific to postoperative metastatic intrahepatic recurrence after removal of the primary tumor. As a candidate, RAB3B, a gene encoding a small GTPase located at the spot indicated by the arrow in FIG. 4, was identified.
［実施例４］
（mRNA発現レベルの比較及び生存曲線解析）
１．RNA－シークエンス
実施例３におけるmRNAの発現解析によるSK-sphere、SK-HEP-1、HuH7/NSC、HuH7/DMEMそれぞれの癌由来細胞株からのRAB3B ｍRNA発現をまとめたグラフを図5A(a)に示す。図5A(a)に示すように、SK-sphereはSK-HEP-1と比較して2.3倍もRAB3BのmRNAが発現していることが明らかとなった。一方、HuH7においては、培養条件にかかわらずRAB3BのmRNA発現レベルはSK-HEP-1におけるRAB3BのmRNA発現レベルよりも低かった。
[Example 4]
(Comparison of mRNA expression levels and survival curve analysis)
1. RNA-sequencing Fig. 5A(a) shows a graph summarizing RAB3B mRNA expression from cancer-derived cell lines of SK-sphere, SK-HEP-1, HuH7/NSC, and HuH7/DMEM by mRNA expression analysis in Example 3. shown in As shown in FIG. 5A(a), it was revealed that RAB3B mRNA was expressed 2.3 times more in SK-sphere than in SK-HEP-1. On the other hand, in HuH7, the RAB3B mRNA expression level was lower than that in SK-HEP-1 regardless of the culture conditions.
２．定量PCR
定量PCRによりSK-sphere、SK-HEP-1、HuH7/NSC、HuH7/DMEMそれぞれの癌由来細胞株、及び摘除手術後5年以上肝内再発無しHCC患者（HCC without IHR(≧5year)）若しくは摘除手術後1年以内転移性肝内再発有りHCC患者（HCC with IHR(≦1year)）からの摘除標本（それぞれn=5）における癌部組織からのRAB3B mRNA発現量を解析した。定量PCR解析は、以下の方法で行った。
2. quantitative PCR
SK-sphere, SK-HEP-1, HuH7/NSC, and HuH7/DMEM cancer-derived cell lines by quantitative PCR, and HCC patients without intrahepatic recurrence for more than 5 years after resection (HCC without IHR (≧ 5 years)) or We analyzed the RAB3B mRNA expression level from the cancer tissue in resected specimens (n = 5 each) from HCC patients with metastatic intrahepatic recurrence within 1 year after resection (HCC with IHR (≤ 1 year)). Quantitative PCR analysis was performed by the following method.
まず、miRNeasy（QIAGEN社製）を用いてtotalRNAを抽出及び精製し、さらにPrimeScript T reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa Bio社製）を用いてゲノムDNA除去後にcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、LightCycler 480 Probe Master（Roche Diagnostics社製）、Universal ProbeLibrary（Roche Diagnostics社製）、及びLightCycler480 System II（Roche Diagnostics社製）を用いて定量PCRを行った。その後の統計学的解析は、R softwareを用いて行った。P値は、漸近計算した対応のないｔ－検定（unpaired t-test）により算出した。結果を図5A(b)、(c)、図5Bに示す。図5A(c)は図5A(b)のSK-HEP-1、SK-sphereのウエスタンブロットの結果である。RAB3Bに対する抗体にはAnti-RAB3B Mouse monoclonalantibody (ab55655, abcam社製)を用いた。 First, total RNA was extracted and purified using miRNeasy (manufactured by QIAGEN), and cDNA was synthesized after removal of genomic DNA using PrimeScript T reagent Kit with gDNA Eraser (manufactured by Takara Bio). Using the synthesized cDNA as a template, quantitative PCR was performed using LightCycler 480 Probe Master (manufactured by Roche Diagnostics), Universal ProbeLibrary (manufactured by Roche Diagnostics), and LightCycler 480 System II (manufactured by Roche Diagnostics). Subsequent statistical analysis was performed using R software. P-values were calculated by asymptotically calculated unpaired t-test. The results are shown in FIGS. 5A(b), (c) and 5B. FIG. 5A(c) is the result of Western blotting of SK-HEP-1 and SK-sphere in FIG. 5A(b). Anti-RAB3B Mouse monoclonalantibody (ab55655, manufactured by abcam) was used as an antibody against RAB3B.
図5A(b)、図5Bに示すように、RAB3Bは親株と比較してSK-sphereにてmRNA発現が有意に2.9倍上昇し、かつ臨床検体において5年以上肝内再発無しと比較して術後1年以内転移性肝内再発有りにおいてmRNA発現が有意に9.5倍上昇していた。さらに非癌部と比較して癌部でのmRNA発現が3.7倍高かった。HuH7においても通常培養下と比較して浮遊細胞塊誘導条件下での発現亢進を認めるが、その発現レベルはSK-HEP-1よりも低いことが明らかとなった。また、図5A(c)に示すように、タンパク質レベルでRAB3Bがsphereで発現が亢進していることが確認された。図5A(b)、(c)、図5Bの結果より、RAB3Bの発現が浮遊細胞塊形成や転移性肝内再発に関与することが明らかとなった。また、かかる結果により、RAB3B遺伝子は転移性肝内再発のバイオマーカーとなることも明らかとなった。 As shown in Figure 5A(b) and Figure 5B, RAB3B showed a significant 2.9-fold increase in mRNA expression in the SK-sphere compared to the parental strain, and compared to no intrahepatic recurrence in clinical specimens for more than 5 years. mRNA expression was significantly increased 9.5 times in patients with metastatic intrahepatic recurrence within 1 year after surgery. Furthermore, mRNA expression was 3.7 times higher in cancerous areas than in non-cancerous areas. In HuH7, the expression level was lower than that in SK-HEP-1, although the expression was elevated under floating cell mass-inducing conditions compared to normal culture. Moreover, as shown in FIG. 5A(c), it was confirmed that the expression of RAB3B was enhanced in the sphere at the protein level. The results shown in FIGS. 5A(b), (c), and 5B demonstrate that RAB3B expression is involved in formation of floating cell masses and metastatic intrahepatic recurrence. These results also revealed that the RAB3B gene serves as a biomarker for metastatic intrahepatic recurrence.
３．生存曲線解析
術後無再発生存期間解析として、上記RAB3B mRNA発現に基づいてHCC患者20例の群分けを行い、Kaplan-Meier生存曲線及びLog-Rank検定によるP値を示した。結果を図5Cに示す。群分けのカットオフ値として、非癌部におけるRAB3B mRNA発現量に対する癌部RAB3B mRNA発現量の比が1.0, 1.16, 1.5 , 2.0としたものをそれぞれ図5C(a)-(d)に示す。カットオフ値1.16はReceiver operating characteristic曲線におけるYouden indexを用いて得た。また、Cox回帰解析からのハザード比 (HR) 及びP値を各グラフの左下に記した。
3. Survival curve analysis As a postoperative recurrence-free survival analysis, 20 HCC patients were grouped based on the above RAB3B mRNA expression, and P values obtained by Kaplan-Meier survival curve and Log-Rank test were shown. The results are shown in Figure 5C. Figure 5C (a) to (d) show the cutoff values for grouping, where the ratio of the RAB3B mRNA expression level in the cancerous area to the RAB3B mRNA expression level in the non-cancerous area was 1.0, 1.16, 1.5, and 2.0, respectively. A cut-off value of 1.16 was obtained using the Youden index in the receiver operating characteristic curve. Hazard ratios (HR) and P values from Cox regression analysis are also shown at the bottom left of each graph.
図5Cに示すように、被検者から採取された生体試料中のRAB3B mRNAの発現量を測定し、非癌部RAB3B mRNA発現量にする癌部RAB3B mRNA発現量の比がカットオフ値より高ければ無再発生存期間が短く、カットオフ値より低ければ無再発生存期間が長いことが明らかとなった。したがって、非癌部RAB3B mRNA発現量にする癌部RAB3B mRNA発現量の比を求めることによって、癌の転移性再発を含む術後肝内再発リスクを予測することができることが明らかとなった。 As shown in FIG. 5C, the expression level of RAB3B mRNA in a biological sample collected from a subject is measured, and if the ratio of the cancerous RAB3B mRNA expression level to the non-cancerous RAB3B mRNA expression level is higher than the cutoff value. It was found that recurrence-free survival is short if the dose is lower than the cutoff value, and that recurrence-free survival is long if the dose is lower than the cutoff value. Therefore, it was clarified that postoperative intrahepatic recurrence risk including metastatic recurrence of cancer can be predicted by determining the ratio of cancer RAB3B mRNA expression level to non-cancerous RAB3B mRNA expression level.
［実施例５］
（siRNAによるノックダウン解析）
SK-HEP-1細胞に対して、Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific社製) を用いてreverse transfection法により以下のsiRNAsをトランスフェクションした。siRNAとして、配列番号2(Sense 5’ to 3’: GCUUCAUUCUGAUGUAUGAtt)に示されるセンス配列と配列番号3（Antisense 5’ to 3’: UCAUACAUCAGAAUGAAGCcc)に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRAB3B#1、又は、配列番号4(Sense 5’ to 3’: GCUAUGCUGAUGACACGUUtt))に示されるセンス配列と配列番号5（Antisense 5’ to 3’: AACGUGUCAUCAGCAUAGCgg)に示されるアンチセンス配列とから形成されるsiRAB3B#2の塩基配列、及びコントロールsiRNA (siNegaCont: Silencer（登録商標） Select Negative Control No.1 siRNA; Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。Reverse transfection法には以下の条件を適用した。1x105 cells/ 5nM each siRNA/1 μL Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent/ 1mL Opti-MEM I Reduced Serum培地 (Thermo Fisher Scientific社製)。結果を図6(a)、(b)、図7、図8に示す。
[Example 5]
(Knockdown analysis by siRNA)
SK-HEP-1 cells were transfected with the following siRNAs by the reverse transfection method using Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
図6(a)、(b)に示すように、RAB3B遺伝子発現を、siRNA（siRAB3B#1,#2）を用いてノックダウンしたところ、RAB3Bが遺伝子レベル (移入3日後) でもタンパク質レベル (移入4日後) でも発現が抑制されていることが確認された。また、図7に示すように、SK-HEP-1株においてRAB3B遺伝子発現を、siRNA（siRAB3B#1,#2）を用いてノックダウンしたところ、浮遊細胞塊誘導条件下では「浮遊細胞塊」から「接着性の細胞」への転換が見られた。さらに、図8に示すように、コントロール(siNegaCont)と比較してsiRNAによるRAB3Bノックダウン株（siRAB3B#1,#2）では接着細胞数／浮遊細胞塊細胞数比が2倍以上上昇していた。このことから、RAB3B遺伝子の発現を抑制することで、癌幹細胞における接着性(adherent)誘導、換言すれば、幹細胞性（stemness）解除を誘導することができることが明らかとなった。なお、細胞における接着性が誘導されれば、血中で浮遊状態での生存がしづらく、転移能が低下すると考えられている。
As shown in Figures 6(a) and (b), when RAB3B gene expression was knocked down using siRNA (
［実施例６］
（抗癌剤に対する感受性解析－１）
上記実施例5の結果を踏まえて、SK-HEP-1細胞株をNSC含有無血清培地又は血清含有DMEM培地で培養し、RAB3B遺伝子の発現をsiRNAによりノックダウンした場合の抗癌剤感受性を解析した。抗癌剤としては、ドキソルビシン（Dxorubicin）、ドセタキセル（Docetael）、カルボプラチン（Carboplatine）、ボリノスタット（ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤（Suberoylanilide hydroxamic acid:SAHA））、スニチニブ(Sunitinib)、イリノテカン（Irinotecan）を用いた。抗癌剤感受性はMTS（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）アッセイ（上記非特許文献１）と同様の方法により評価した。簡潔に述べると、実施例5に示す条件にてReverse transfectionを行い、96-well plateに50μL (5,000 cells)/well播種し、翌日にDMEM培地又はNSC培地と交換した。培地交換後1日又は2日後に抗癌剤含有培地を添加し、さらに24時間後にMTS試薬を添加し、その2時間後に吸光度を測定した。細胞の培養は37℃、5%CO2条件下で行った。試薬製造者の指示に従い、MTS染料の吸収を測定することにより、細胞の増殖を評価した。吸収は、Wallac 1420 ARVOsx Multilabel Counter (Perkin-Elmer社製)を用いて行った。実験は2回の独立系で、夫々、4穴複製からの値を用いた。
[Example 6]
(Sensitivity analysis for anticancer drugs-1)
Based on the results of Example 5 above, the SK-HEP-1 cell line was cultured in an NSC-containing serum-free medium or a serum-containing DMEM medium, and anticancer drug sensitivity was analyzed when RAB3B gene expression was knocked down with siRNA. Anticancer agents include Dxorubicin, Docetaxel, Carboplatine, Vorinostat (histone deacetylase (HDAC) inhibitor (Suberoylanilide hydroxamic acid: SAHA)), Sunitinib, and Irinotecan. Using. Anticancer drug sensitivity is determined by MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) assay (
抗癌剤未添加、ドキソルビシン（Dxorubicin）、ドセタキセル（Docetael）、カルボプラチン（Carboplatine）、ボリノスタット（SAHA）、スニチニブ(Sunitinib)、イリノテカン（Irinotecan）添加時の結果をそれぞれ図9A-Gに示す。 Figures 9A to 9G show the results when no anticancer drug was added, and when doxorubicin, docetaxel, carboplatine, vorinostat (SAHA), sunitinib, and irinotecan were added.
図9Aに示すように、RAB3B遺伝子の発現をノックダウンした場合において抗癌剤未添加時には有意な細胞増殖への影響は示さなかった。すなわち、siRNAによるRAB3B遺伝子の発現を抑えることだけでは、癌幹細胞の生存を抑制する効果は見られないことが確認された。一方、図9B-G示すように、RAB3B遺伝子の発現をノックダウンすると共に各抗癌剤を投与することによって、通常培養条件下でも抗癌剤ドキソルビシン（Dxorubicin）、ドセタキセル（Docetael）、カルボプラチン（Carboplatine）、ボリノスタット（SAHA）、スニチニブ(Sunitinib)に対する感受性が増加しており、浮遊細胞塊誘導条件下においても癌幹細胞様細胞として獲得した抗癌剤耐性の減弱が見られた。抗癌剤耐性に対する変化はドキソルビシンに対する効果が最も著明であった。したがって、抗癌剤を投与する際に、RAB3B遺伝子の発現を抑制する物質をさらに投与することで、癌幹細胞における薬物耐性を低減すること、換言すれば、癌幹細胞における抗癌剤感受性を増加させることが明らかとなった。
［実施例７］
As shown in FIG. 9A, when the expression of the RAB3B gene was knocked down, there was no significant effect on cell proliferation in the absence of the anticancer drug. That is, it was confirmed that simply suppressing the expression of the RAB3B gene by siRNA did not have the effect of suppressing the survival of cancer stem cells. On the other hand, as shown in FIG. 9B-G, by knocking down the expression of the RAB3B gene and administering each anticancer drug, the anticancer drug doxorubicin, docetaxel, carboplatin, vorinostat SAHA), increased sensitivity to sunitinib, and attenuated anticancer drug resistance acquired as cancer stem cell-like cells was observed even under floating cell mass induction conditions. Changes in anticancer drug resistance were most pronounced for doxorubicin. Therefore, it is clear that the drug resistance in cancer stem cells is reduced, in other words, the anticancer drug sensitivity in cancer stem cells is increased by further administering a substance that suppresses the expression of the RAB3B gene when administering an anticancer drug. became.
[Example 7]
（SK-sphere特異的microRNAの探索）
microRNAは配列依存的に複数の遺伝子発現を制御するnon-coding RNAである。近年、microRNAは細胞内だけでなく、エクソソーム小胞に内包され細胞外に分泌されることも知られるようになった。すなわち、microRNAは細胞内における一つの遺伝子発現制御だけでなく、他の細胞における遺伝子発現をも制御しうる。まず、SK-HEP-1とSK-sphereにおける培地中のRNA濃度を調べたところ、SK-sphereはSK-HEP-1と比較してRNA濃度が上昇していた（図10(a)）。そのため、CSLCにおいてはmicroRNAによって癌微小環境や周辺細胞の制御が考えられた。
(Search for SK-sphere-specific microRNA)
MicroRNAs are non-coding RNAs that regulate multiple gene expression in a sequence-dependent manner. In recent years, it has become known that microRNAs are not only intracellularly, but also encapsulated in exosome vesicles and secreted extracellularly. That is, microRNAs can control not only one gene expression within a cell, but also gene expression in other cells. First, when the RNA concentration in the medium of SK-HEP-1 and SK-sphere was examined, the RNA concentration of SK-sphere was higher than that of SK-HEP-1 (Fig. 10(a)). Therefore, microRNAs are thought to regulate the tumor microenvironment and surrounding cells in CSLC.
そこで、SK-sphere特異的microRNAの探索を行った。microRNAの発現解析は3D-Gene miRNA Labeling kit及び3D-Gene Human miRNA Oligo Chip（東レ社製）を用いて行った。サンプルとしてSK-HEP-1、SK-sphere及びSK-sphereの培養上清を用い、ハイブリダイゼーションシグナルの相対蛍光強度をそれぞれの中央値を指標として標準化した後に、それぞれにおけるmicroRNAの発現量を比較し、Log2 Ratio及びFisher比を求めた。その結果、SK-sphere特異的microRNAとしてhas-miR-15a-5p (MIMAT0000068)を同定した。SK-HEP-1、SK-sphere及びSK-sphereの培養上清それぞれの発現量の結果を図10(b)に示す。 Therefore, we searched for SK-sphere-specific microRNAs. MicroRNA expression analysis was performed using 3D-Gene miRNA Labeling kit and 3D-Gene Human miRNA Oligo Chip (manufactured by Toray Industries, Inc.). SK-HEP-1, SK-sphere, and SK-sphere culture supernatant were used as samples, and after standardizing the relative fluorescence intensity of the hybridization signal using each median value as an index, the microRNA expression levels in each were compared. , Log2 Ratio and Fisher ratio were determined. As a result, we identified has-miR-15a-5p (MIMAT0000068) as an SK-sphere-specific microRNA. FIG. 10(b) shows the expression levels of SK-HEP-1, SK-sphere, and SK-sphere culture supernatants.
図10(b)において、has-miR-15a-5pはSK-HEP-1と比較してSK-sphereにて発現が低下し、SK-sphere培養上清における発現割合も低いmicroRNAであることが明らかとなった。興味深いことに、has-miR-15a-5pはRAN3B mRNAを標的とするということは配列上からは予測されていないが、図10(c)に示すように、has-miR-15a-5のmimic RNA(mirVana miRNA mimic, Thermo Fisher Scientific社製, mature miRNA Sequence; UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG（配列番号7）, stem loop sequence; CCUUGGAGUAAAGUAGCAGC ACAUAAUGGUUUGUGGAUUU UGAAAAGGUGCAGGCCAUAU UGUGCUGCCUCAAAAAUACA AGG（配列番号8)の移入によってRAB3BのmRNA発現抑制が観察された。has-miR-15a-5のmimic RNAの移入は以下の条件下でのReverse transfection法により行った；1x105 cells/ 10nM each RNA/ 1μL Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent/ 1mL Opti-MEM I Reduced Serum培地 (Thermo Fisher Scientific社製)。コントロールRNA (cont-RNA) としてmirVana miRNA Mimic, Negative Control No. 1 (Thermo Fisher Scientific社製)を同濃度用いた。 Fig. 10(b) shows that has-miR-15a-5p is a microRNA whose expression is lower in SK-sphere compared to SK-HEP-1, and the expression rate in SK-sphere culture supernatant is also low. It became clear. Interestingly, has-miR-15a-5p is not sequence-predicted to target RAN3B mRNA, but as shown in Fig. 10(c), mimic RNA (mirVana miRNA mimic, manufactured by Thermo Fisher Scientific, mature miRNA Sequence; UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG (SEQ ID NO: 7), stem loop sequence; CCUUGGAGUAAAGUAGCAGC ACAUAAUGGUUUGUGGAUUU UGAAAAGGUGCAGGCCAUAU UGUGCUGCCUCAAAAAAUACA AGG (SEQ ID NO: 8) was observed to suppress RAB3B mRNA expression. Transfection of has-miR-15a- 5 mimic RNA was performed by the reverse transfection method under the following conditions; Fisher Scientific) As a control RNA (cont-RNA), mirVana miRNA Mimic, Negative Control No. 1 (Thermo Fisher Scientific) was used at the same concentration.
［実施例８］
（抗癌剤に対する感受性解析－２）
SK-HEP-1細胞株をNSC含有無血清培地又は血清含有DMEM培地で、has-miR-15a-5のmimic RNA又はコントロールRNAを加えて培養し、実施例６と同様の方法で抗癌剤感受性を解析した。抗癌剤としては、ドキソルビシン（Dxorubicin）、ドセタキセル（Docetael）、カルボプラチン（Carboplatine）、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤（Suberoylanilide hydroxamic acid:SAHA）、スニチニブ(Sunitinib)、イリノテカン（Irinotecan）を用いた。結果を図11A-Fに示す。
[Example 8]
(Sensitivity analysis for anticancer drugs -2)
SK-HEP-1 cell line was cultured in NSC-containing serum-free medium or serum-containing DMEM medium with the addition of has-miR-15a-5 mimic RNA or control RNA, and anticancer drug sensitivity was determined in the same manner as in Example 6. Analyzed. As anticancer agents, doxorubicin, docetaxel, carboplatine, histone deacetylase (HDAC) inhibitor (Suberoylanilide hydroxamic acid: SAHA), sunitinib, and irinotecan were used. The results are shown in Figures 11A-F.
図11A-Fに示すように、has-miR-15a-5のmimic RNAの移入によって抗癌剤ドキソルビシン（Dxorubicin）、ドセタキセル（Docetael）、カルボプラチン（Carboplatine）、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤（Suberoylanilide hydroxamic acid:SAHA）、スニチニブ(Sunitinib)、イリノテカン（Irinotecan）に対する感受性が増加することが明らかとなった。 As shown in Figures 11A-F, the transfer of has-miR-15a-5 mimic RNA resulted in the anticancer drugs Dxorubicin, Docetaxel, Carboplatin, and histone deacetylase (HDAC) inhibitor Suberoylanilide. hydroxamic acid (SAHA), sunitinib, and irinotecan.
［実施例９］
（CRISPR/Cas9によるノックアウト解析）
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術を用いて、SK-HEP-1株を親株としてmono-allelic RAB3B knock-out株を樹立した。ゲノム編集にはCas9 mRNA及び配列番号9に示す(-)鎖配列（GTTTCACCCGCTTCTCGTGA）及び続くCGGをそれぞれ標的配列及びPAM配列とし、配列番号10に示す配列 (GUUUCACCCGCUUCUCGUGA guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu) をguide RNAとして合成し、guide RNAをlipofectamine RNAi Max（Thermo Fisher Scientific社製）によりSK-HEP-1細胞株に移入した後にsingle cell cloningを行った。得られたcloneからgenome DNAを抽出し、サンガーシーケンスにより変異導入を確認した。上記guide RNAとCas9 mRNAを用いてゲノム編集を行うことで、図12に示されるように、SK-HEP-1細胞株におけるgenome DNA中のPAM配列に隣接する標的配列に二本鎖切断が起こり、結果として配列番号１に示されるRAB3Bのアミノ酸配列が、配列番号11に示されるアミノ酸配列へと変異したクローンが得られた。
[Example 9]
(Knockout analysis by CRISPR/Cas9)
A mono-allelic RAB3B knock-out strain was established from the SK-HEP-1 strain as the parent strain using genome editing technology using CRISPR/Cas9. For genome editing, Cas9 mRNA and the (-) strand sequence (GTTTCACCCGCTTCTCGTGA) shown in SEQ ID NO: 9 and the following CGG were used as the target sequence and PAM sequence, respectively, and the sequence shown in SEQ ID NO: 10 (GUUUCACCCGCUUCUCGUGA guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaaaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu) was synthesized as a guide RNA. Single cell cloning was performed after transferring RNA into SK-HEP-1 cell line using lipofectamine RNAi Max (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Genome DNA was extracted from the obtained clone, and mutation introduction was confirmed by Sanger sequencing. By performing genome editing using the above guide RNA and Cas9 mRNA, as shown in Figure 12, a double-strand break occurs in the target sequence adjacent to the PAM sequence in the genome DNA of the SK-HEP-1 cell line. As a result, a clone was obtained in which the amino acid sequence of RAB3B shown in SEQ ID NO: 1 was mutated to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
HuH-7細胞株、上記で樹立したmono-allelic RAB3B knock-out細胞株(RAB3B-KO8細胞株)及びSK-HEP-1細胞株それぞれを血清含有DMEM培地（normal）又はNSC含有無血清培地（NSC）で培養し、RAB3B発現を確認した結果を図13に示す。図13(a)は上記それぞれの細胞株においてRNA-seq解析からのRAB3B mRNA発現を示す。RAB3B-KO8細胞株ではsphere誘導のNSC培地においてもSK-HEP-1よりも低い発現レベルであった。また、図13(b)は上記それぞれの細胞株においてウエスタンブロット解析からのRAB3Bタンパク発現及び内部標準としてvalosin containing protein (VCP) 発現を示す。normal培地とsphere誘導のNSC培地の両方において、SK-HEP-1と比較してRAB3B-KO8細胞株におけるRAB3B発現低下を認めた。 HuH-7 cell line, the above-established mono-allelic RAB3B knock-out cell line (RAB3B-KO8 cell line) and SK-HEP-1 cell line, respectively, serum-containing DMEM medium (normal) or NSC-containing serum-free medium ( NSCs) were cultured, and the results of confirming RAB3B expression are shown in FIG. Figure 13(a) shows RAB3B mRNA expression from RNA-seq analysis in each of the above cell lines. In the RAB3B-KO8 cell line, the expression level was lower than that of SK-HEP-1 even in sphere-induced NSC medium. In addition, FIG. 13(b) shows RAB3B protein expression from Western blot analysis and valosin containing protein (VCP) expression as an internal standard in each of the above cell lines. In both normal medium and sphere-induced NSC medium, RAB3B expression was decreased in RAB3B-KO8 cell line compared to SK-HEP-1.
次に、SK-HEP-1細胞株及び上記で樹立したmono-allelic RAB3B knock-out (RAB3B-KO8)株の形態を調べた。結果を図14に示す。図14(a)はSK-HEP-1細胞株を血清含有DMEM培地（normal）で培養した場合、図14(b)はRAB3B-KO8細胞株を血清含有DMEM培地（normal）で培養した場合、図14(c)はSK-HEP-1細胞株をsphere誘導のNSC培地（NSC）で培養した場合、図14(d)はRAB3B-KO8細胞株をsphere誘導のNSC培地（NSC）で培養した場合である。図14(d)に示すように、RAB3B-KO8細胞株ではsphere形成の著しい抑制が観察された。 Next, the morphology of the SK-HEP-1 cell line and the mono-allelic RAB3B knock-out (RAB3B-KO8) line established above was examined. The results are shown in FIG. Figure 14 (a) is when the SK-HEP-1 cell line is cultured in serum-containing DMEM medium (normal), Figure 14 (b) is when the RAB3B-KO8 cell line is cultured in serum-containing DMEM medium (normal), Figure 14(c) shows the SK-HEP-1 cell line cultured in sphere-induced NSC medium (NSC), and Figure 14(d) shows the RAB3B-KO8 cell line cultured in sphere-induced NSC medium (NSC). is the case. As shown in FIG. 14(d), significant suppression of sphere formation was observed in the RAB3B-KO8 cell line.
さらに、レスキュー実験として、RAB3B-KO8細胞株にpcDNA3.1(-) vector 、又はpRAB3B（pcDNA3.1(-) vectorにRAB3Bをクローニングしたもの）をlipofectamine 3000を用いて移入した後に、抗生物質G418により薬剤選択を行った。得られた、pcDNA3.1(-) vectorのみのmock移入株とpRAB3B移入株をそれぞれsphere誘導のNSC培地にて7-24日間のsphere誘導処置を行い、顕微鏡下にて観察した結果を図15に示す。図15に示すように、pRAB3B移入株におけるsphere形成能の回復が見られた。上記結果から、RAB3Bがsphere形成能に関与していることが確認された。
Furthermore, as a rescue experiment, pcDNA3.1(-) vector or pRAB3B (a clone of RAB3B in pcDNA3.1(-) vector) was transfected into the RAB3B-KO8 cell
（癌幹細胞における転移性）
免疫不全マウスNOD-Rag1null IL2r null double mutant mice (NRG mice)へ細胞を脾臓注入することによって、肝腫瘍形成頻度を調べた。HBSSに懸濁した1000個のSK-HEP-1細胞株又はRAB3B-KO8細胞株をマウス脾臓に注射し、脾臓を摘出したうえで閉腹し、8週後に肝腫瘍の有無を確認した。培地は血清含有DMEM培地（normal）又はsphere誘導のNSC培地（NSC）を用いた。結果を図16に示す。図中、yesは肝腫瘍有りのマウスの数、noは肝腫瘍無しのマウスの数である。また、上段がSK-HEP-1細胞株を注射した場合、下段がRAB3B-KO8細胞株を注射した場合である。図16に示すように、SK-HEP-1細胞株ではsphere誘導のNSC培地にて7日間処置すると肝腫瘍形成頻度が向上していたが、RAB3B-KO8細胞株ではsphere誘導のNSC培地にて7日間処置しても肝腫瘍形成頻度の向上は認められなかった。すなわち、RAB3B-KO8細胞株は癌幹細胞における転移性が抑制されていることが明らかとなった。
(Metastasis in cancer stem cells)
Hepatic tumor formation frequency was examined by splenic injection of cells into immunodeficient NOD-Rag1 null IL2r null double mutant mice (NRG mice). 1000 SK-HEP-1 cell lines or RAB3B-KO8 cell lines suspended in HBSS were injected into the mouse spleen, the spleen was removed and the abdomen was closed, and the presence or absence of liver tumors was confirmed after 8 weeks. A serum-containing DMEM medium (normal) or a sphere-induced NSC medium (NSC) was used as the medium. The results are shown in FIG. In the figure, yes is the number of mice with liver tumors, and no is the number of mice without liver tumors. In addition, the upper row shows the injection of the SK-HEP-1 cell line, and the lower row shows the injection of the RAB3B-KO8 cell line. As shown in Fig. 16, the SK-HEP-1 cell line was treated with sphere-induced NSC medium for 7 days, whereas the RAB3B-KO8 cell line was treated with sphere-induced NSC medium to increase the frequency of liver tumor formation. No improvement in liver tumorigenesis was observed after 7 days of treatment. That is, it was revealed that the RAB3B-KO8 cell line has suppressed metastasis in cancer stem cells.
［実施例１０］
（抗癌剤に対する感受性解析－３）
実施例６同様に、RAB3B-KO8細胞株を用いてMTSアッセイにより抗癌剤に対する感受性解析を行った。SK-HEP-1細胞株又はRAB3B-KO8細胞株を、各抗癌剤に24時間暴露後の生存率を調べた結果を図17に示す。培地は血清含有DMEM培地（normal）又はsphere誘導のNSC培地（NSC）を用いた。図17に示すように、NSC培地においてSK-HEP-1細胞株と比較してRAB3B-KO8細胞株での抗癌剤耐性の有意な減弱が認められた。したがって、RAB3B遺伝子の発現を抑制することで、癌幹細胞における抗癌剤耐性を低減することが可能であることが確認された。
[Example 10]
(Sensitivity analysis for anticancer drugs -3)
As in Example 6, the RAB3B-KO8 cell line was used to analyze sensitivity to anticancer drugs by MTS assay. FIG. 17 shows the results of examining the survival rate of the SK-HEP-1 cell line or RAB3B-KO8 cell line after exposure to each anticancer agent for 24 hours. A serum-containing DMEM medium (normal) or a sphere-induced NSC medium (NSC) was used as the medium. As shown in FIG. 17, significant attenuation of anticancer drug resistance was observed in the RAB3B-KO8 cell line compared with the SK-HEP-1 cell line in the NSC medium. Therefore, it was confirmed that it is possible to reduce anticancer drug resistance in cancer stem cells by suppressing the expression of the RAB3B gene.
［実施例１１］
（細胞周期における影響）
SK-HEP-1細胞株又はRAB3B-KO8細胞株を70%エタノールにより固定した後に、RNase処理及びPIによるDNA標識を行い、フローサイトメーターを用いた、各細胞周期における細胞集団の割合を求めた。結果を図18に示す。図18に示すように、SK-HEP-1株ではNSC培地でのsphereを誘導によってG0/G1期停止が見られたのに対して、RAB3B-KO8細胞株ではnormal培地での培養によるS期の増加とNSC培地でのsphereを誘導によるG2/M期停止が観察された。したがって、癌幹細胞においてRAB3B遺伝子の発現を抑制することで、G0/G1期停止が解除されることが確認された。
[Example 11]
(Effect on cell cycle)
After fixing the SK-HEP-1 cell line or RAB3B-KO8 cell line with 70% ethanol, RNase treatment and DNA labeling with PI were performed, and the percentage of cell population in each cell cycle was determined using a flow cytometer. . The results are shown in FIG. As shown in Figure 18, the SK-HEP-1 strain was arrested in the G0/G1 phase by inducing spheres in NSC medium, whereas the RAB3B-KO8 cell line was arrested in the S phase by culturing in normal medium. and G2/M phase arrest by induction of spheres in NSC medium was observed. Therefore, it was confirmed that G0/G1 phase arrest was released by suppressing the expression of the RAB3B gene in cancer stem cells.
［実施例１２］
（ABCG2タンパク質の発現）
RAB3Bを標的とする薬物耐性の原理を検討する中で、多剤耐性を担う薬剤排出ポンプとして働くABCG2タンパクの発現に着目し、かかるABCG2タンパクの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を図19に示す。図19に示すように、RAB3B-KO8細胞株ではABCG2陽性細胞割合が減少していた。したがって、癌幹細胞においてRAB3B遺伝子の発現を抑制することで、癌細胞における薬剤排出機能が低減し、その結果薬物耐性が低減していることが明らかとなった。
[Example 12]
(Expression of ABCG2 protein)
While investigating the principle of drug resistance targeting RAB3B, we focused on the expression of the ABCG2 protein, which functions as a drug efflux pump responsible for multidrug resistance, and analyzed the expression of the ABCG2 protein by flow cytometry. Figure 19 shows the results. show. As shown in FIG. 19, the ratio of ABCG2-positive cells was decreased in the RAB3B-KO8 cell line. Therefore, it was clarified that suppressing the expression of the RAB3B gene in cancer stem cells reduces the drug efflux function in cancer cells, resulting in reduced drug resistance.
Claims (6)
次いで被検者から採取された生体試料中のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はhas-miR-15a-5pの発現量を測定して前記カットオフ値と比較し、
前記mRNAの発現量又は前記mRNAがコードするタンパク質の発現量が前記カットオフ値以上、若しくは前記has-miR-15a-5pの発現量が前記カットオフ値未満であれば、前記被検者の肝癌の転移性肝内再発リスクが高いとの予測を補助し、
前記mRNAの発現量又は前記mRNAがコードするタンパク質の発現量が前記カットオフ値未満、若しくは前記has-miR-15a-5pの発現量が前記カットオフ値以上であれば、前記被検者の肝癌の転移性肝内再発リスクが低いとの予測を補助する方法。 RAB3B gene mRNA in biological samples collected from at least 2 specimens of liver cancer patients without intrahepatic recurrence for 5 years or more after resection and 2 specimens from patients with metastatic intrahepatic recurrence within 1 or 2 years after resection. measuring the expression level, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of has-miR-15a-5p, and determining a cutoff value based on the expression level,
Next, the expression level of the RAB3B gene mRNA in the biological sample collected from the subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of has-miR-15a-5p is measured to determine the cutoff value. compare and
If the expression level of the mRNA or the expression level of the protein encoded by the mRNA is greater than or equal to the cutoff value, or if the expression level of has-miR-15a-5p is less than the cutoff value, the liver cancer of the subject to help predict the high risk of metastatic intrahepatic recurrence in
If the expression level of the mRNA or the expression level of the protein encoded by the mRNA is less than the cutoff value, or if the has-miR-15a-5p expression level is greater than or equal to the cutoff value, the liver cancer of the subject A method to help predict that the risk of metastatic intrahepatic recurrence is low.
非癌部のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はhas-miR-15a-5pの発現量に対する癌部のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又はhas-miR-15a-5pの発現量の比を求め、かかる発現量の比を基にカットオフ値を定め、
次いで被検者から採取された生体試料中の非癌部のRAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又は非癌部のhas-miR-15a-5pの発現量を測定し、前記非癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又は前記非癌部のhas-miR-15a-5pの発現量に対する前記癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量、又は前記has-miR-15a-5pの発現量の比を求めて前記カットオフ値と比較し
前記非癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量に対する前記癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量の比が前記カットオフ値以上、若しくは、前記非癌部の前記has-miR-15a-5pの発現量に対する前記癌部の前記has-miR-15a-5pの発現量の比が前記カットオフ値未満であれば、前記被検者の肝癌の転移性肝内再発リスクが高いとの予測を補助し、
前記非癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量に対する前記癌部の前記RAB3B遺伝子のmRNAの発現量、前記mRNAがコードするタンパク質の発現量の比が前記カットオフ値未満、若しくは、前記非癌部の前記has-miR-15a-5pの発現量に対する前記癌部の前記has-miR-15a-5pの発現量の比が前記カットオフ値以上であれば、前記被検者の肝癌の転移性肝内再発リスクが低いとの予測を補助する方法。 Expression level of RAB3B gene mRNA, expression level of protein encoded by said mRNA, or has-miR-15a- Measure the expression level of 5p,
Expression level of mRNA of RAB3B gene in non-cancerous part, expression level of protein encoded by said mRNA, or expression level of mRNA of RAB3B gene in cancerous part relative to expression level of has-miR-15a-5p, said mRNA encoded Determine the expression level of the protein or the ratio of the expression level of has-miR-15a-5p, determine the cutoff value based on the ratio of the expression level,
Next, the expression level of the RAB3B gene mRNA in the non-cancerous part of the biological sample collected from the subject, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of has-miR-15a-5p in the non-cancerous part is measured. measured, and the expression level of the RAB3B gene mRNA in the non-cancerous part, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the expression level of has-miR-15a-5p in the non-cancerous part, and the RAB3B in the cancerous part The expression level of the mRNA of the gene, the expression level of the protein encoded by the mRNA, or the ratio of the expression level of the has-miR-15a-5p is calculated and compared with the cutoff value to determine the expression level of the RAB3B gene in the non-cancer part. The expression level of mRNA, the ratio of the expression level of the RAB3B gene mRNA in the cancerous part to the expression level of the protein encoded by the mRNA, and the expression level of the protein encoded by the mRNA is the cutoff value or more, or the non- If the ratio of the has-miR-15a-5p expression level in the cancerous part to the has-miR-15a-5p expression level in the cancerous part is less than the cutoff value, metastasis of liver cancer in the subject to assist in predicting the high risk of intrahepatic recurrence,
The ratio of the expression level of the RAB3B gene mRNA in the cancerous part and the expression level of the protein encoded by the mRNA to the expression level of the RAB3B gene mRNA in the non-cancerous part and the expression level of the protein encoded by the mRNA is described above. If the ratio of the has-miR-15a-5p expression level in the cancerous lesion to the has-miR-15a-5p expression level in the non-cancerous lesion is less than the cutoff value or greater than the cutoff value and a method for assisting prediction that the subject has a low risk of metastatic intrahepatic recurrence of liver cancer.
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