JP7216995B2 - 胸腺癌バイオマーカー及び胸腺腫瘍の予後予測マーカー - Google Patents

Description

本明細書には、胸腺癌バイオマーカーの検出方法、胸腺癌のバイオマーカー、胸腺癌のバイオマーカーを検出するための検査試薬、及び胸腺癌の検出装置が開示される。また、本明細書には、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法、胸腺腫瘍の予後予測マーカー、胸腺腫瘍の予後予測マーカーを検出するための検査試薬、及び胸腺腫瘍の予後予測装置が開示される。

胸腺癌は、病理組織診断において胸腺腫との鑑別が難しい癌である。胸腺癌と良性の胸腺腫との鑑別にはＣＤ５又はｃ－Ｋｉｔ（ＣＤｌ１７）などの発現が用いられている（非特許文献１）。

Chan JKC，Strobel P，Marx A，et .la Thymic carcinomas. In Travis WD，Br ambilla E，Bu rke AP，et al (Eds): WHOC lassification of Tumors of Lung，Pl eura，T hymus and Heart (4th edition). IARC: Lyon 2015. p212-6. Miettinen Ml, Lasota J. KIT (CDl17): a review on expression in normal and neoplastic tissues, and mutations and their clinicopathologic correlation. Appllmmunohistoehem Mol Morphol. 2005, Sep;13(3):205-20.

しかし、ＣＤ５又はｃ－ｋｉｔは胸腺癌の約２０％程度では発現せず、稀に胸腺腫でも発現する。また、ＣＤ５又はｃ－ｋｉｔは肥満細胞や造血幹細胞など正常組織にも発現が認められる。したがって、ＣＤ５及びｃ－ｋｉｔは検出率の高い胸腺癌のバイオマーカーであるとはいえない。

また、胸腺腫瘍では、胸腺癌と胸腺腫は共に悪性腫瘍である。胸腺癌と胸腺腫の病理組織学上の違いはｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃと呼ばれる胸腺本来の形態的特徴の有無とされている。胸腺腫は、ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃが認められ、腫瘍組織内に胸腺本来の形態を含む。これに対して、胸腺癌はｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃが認められないことが一般的である。しかし、胸腺癌と胸腺腫は、形態学的特徴による鑑別が困難な場合がある。

そこで、本発明は胸腺癌を検出すること、及び胸腺癌のバイオマーカーを提供することを課題とする。また、本発明は胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測すること、及び胸腺腫瘍の予後予測マーカーを提供することを課題とする。

本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、ＰＲＡＭＥが胸腺癌のバイオマーカー、並びに胸腺腫瘍の予後予測マーカーになり得ることを見出した。
本開示は、以下の態様を含む。
項１．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、胸腺癌バイオマーカーの検出方法。
項２．ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であると決定する工程をさらに含む、項１に記載の検出方法。
項３．ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、項１又は２に記載の検出方法。
項４．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法。
項５．ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記被検体の予後が不良であると決定する工程をさらに含む、項４に記載の検出方法。
項６．ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、項４又は５に記載の検出方法。
項７．胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして使用する方法。
項８．胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用する方法。
項９．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
項１０．被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして検出するため検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
項１１．ＰＲＡＭＥからなる、胸腺癌のバイオマーカー。
項１２．ＰＲＡＭＥからなる、胸腺腫瘍の予後予測マーカー。
項１３．処理部を備える、胸腺癌の検出装置であって、前記処理部は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないことを示すラベルを出力する、
予後予測装置。
項１４．処理部を備える、胸腺腫瘍の予後予測装置であって、前記処理部は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検体の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検体の予後が良好であることを示すラベルを出力する、予後予測装置。

胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することにより、胸腺癌を検出することができる。胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することにより、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測することができる。

胸腺癌の検出システム１０００、及び胸腺腫瘍の予後予測装置２０００の概観図の一例を示す。 胸腺癌の検出装置１０、及び胸腺腫瘍の予後予測装置２０のブロック図の一例を示す。 胸腺癌の検出装置１０の動作の一例を示す。 胸腺腫瘍の予後予測装置２０の動作の一例を示す。 ｎＣｏｕｎｔｅｒによる解析結果を示す。 Ａは、組織学的に分類された腫瘍タイプにおけるＰＲＡＭＥの陽性率を示す。Ｂは、胸腺癌、胸腺腫タイプＢ１、胸腺腫タイプＢ２、及び胸腺腫タイプＢ３組織のＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。 胸腺癌のＣＤ５、ｃ－Ｋｉｔ及びＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。 胸腺腫タイプＡのＣＤ５、ｃ－Ｋｉｔ及びＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。 胸腺腫タイプＢ１のＣＤ５、ｃ－Ｋｉｔ及びＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。 胸腺腫タイプＢ２のＣＤ５、ｃ－Ｋｉｔ及びＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。 胸腺腫タイプＢ３のＣＤ５、ｃ－Ｋｉｔ及びＰＲＡＭＥの免疫染色画像を示す。

１．用語の説明
ＰＲＡＭＥは、ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａと呼ばれる抗原の一種であり、精巣以外の正常組織での発現は認められないことが報告されている。ＰＲＡＭＥは、ＣＴ１３０、ＭＡＰＥ、ＯＩＰ－４、ＯＩＰ４とも呼ばれ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにＧｅｎｅ ＩＤ：２３５３２で登録されている遺伝子から発現される。ＰＲＡＭＥからなるバイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡが含まれる。また、バイオマーカーには、前記遺伝子から発現されるタンパク質、又はｍＲＮＡの他、そのバリアントも含む。

胸腺腫瘍は、胸腺に存在する細胞に由来する腫瘍である限り制限されない。胸腺腫瘍には、胸腺癌、胸腺腫、胸腺内分泌腫瘍等が含まれ得る。胸腺癌と胸腺腫は共に悪性腫瘍である。

胸腺癌は、臨床的には胸腺癌は胸腺腫より悪性度が高く、予後も不良とされている。言い換えると、胸腺癌は他の癌と同様に遠隔転移を起こしやすい、成長も早い、及び／又は術後再発を起こしやすい等の臨床的特徴を有する。このため、胸腺癌の場合には、手術により腫瘍を切除した後、放射線治療や化学療法を行うことが必要となる。一方、胸腺腫はゆっくり成長する、遠隔転移を起こさない、及び／又は再発したとしても胸腔内の局所再発である等の臨床的特徴を有する。このため、胸腺腫の場合には、再発時、再度手術で切除することにより根治を望むことが可能とされている。

胸腺癌には、扁平上皮癌、類基底細胞癌、粘液表皮癌、リンパ上皮癌、明細胞癌等が含まれ得る。好ましくは、扁平上皮癌である。胸腺腫には、胸腺腫タイプＡ、胸腺腫タイプＡＢ、胸腺腫タイプＢ１、胸腺腫タイプＢ２、及び胸腺腫タイプＢ３等が含まれ得る。

胸腺腫瘍は、胸腺に存在していても良いが、リンパ節、静脈、動脈、脳、副腎、肝臓、胸膜、肺、骨等に存在していてもよい。また、胸腺腫瘍は、初発であっても再発であってもよい。好ましくは、初発である。
被検体は、胸腺腫瘍を有する者である限り制限されない。

本開示において、「予後」は、被検体の帰趨を意図する。被検体の帰趨は、その被検体が有する胸腺腫瘍の影響による帰趨である。予後が不良とは、腫瘍が遠隔転移を起こしやすい、及び／又は再発しやすく、結果的に前記胸腺腫瘍を有する被検体を腫瘍死させる可能性が高いことを意図する。この場合、腫瘍の外科的切除のみならず、放射線治療や化学療法を行う必要がある。予後が良好とは、腫瘍が遠隔転移や浸潤を起こさず、限局的であり、腫瘍の成長が遅く、前記胸腺腫瘍を有する被検体を腫瘍死させる可能性が低いことを意図する。

２．バイオマーカー及びその検出方法
本開示のある態様は、胸腺癌のバイオマーカー及びその検出方法に関する。前記検出方法は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出することを含む。すなわち、胸腺腫瘍の腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥタンパク質又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡは、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であるか否かを決定するためのバイオマーカーとして検出することができる。また、胸腺腫瘍の腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥタンパク質又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡは、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良であるか否かを決定するためのバイオマーカー（胸腺腫瘍の予後予測マーカー）として検出することができる。

胸腺腫瘍内のＰＲＡＭＥの検出は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織を用いて行う限り制限されない。胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織は、例えば、原発巣又は転移巣からの手術による切除又は生検、内視鏡下における切除又は生検、胸水からの分離等により採取することができる。腫瘍組織であるか、正常組織であるかの判定は、肉眼的所見、顕微鏡観察等で行うことができる。また、細胞増殖能を指標として腫瘍組織であるか否かを判定してもよい。細胞増殖能を指標として腫瘍組織であるか否かを判定する場合には、例えば検査対象組織のＢｒｄＵやＫｉ－６７タンパク質のラベリングインデックスが正常組織と比較して高い場合に、前記検査対象組織が腫瘍組織である可能性が高いと判定することができる。

被検体から採取された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織は、ＰＲＡＭＥの検出方法に応じて前処理される。

胸腺腫瘍内のＰＲＡＭＥは、タンパク質として、又はｍＲＮＡとして検出することができる。

ＰＲＡＭＥをタンパク質として検出する方法として、免疫染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法を挙げることができる。また、ＰＲＡＭＥをｍＲＮＡとして検出する方法として、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む）、マイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ等の公知の方法を挙げることができる。

胸腺腫瘍組織を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、胸腺腫瘍組織をホルマリン、及びパラホルムアルデヒド等の公知の固定液で固定してから、パラフィン包埋ブロックを作製する。あるいは、胸腺腫瘍組織を固定してから、あるいは固定せずに、ＯＣＴコンパウンド（登録商標）等の凍結ブロック作製用の樹脂に包埋し、凍結ブロックを作製する。次に、作製したパラフィン包埋ブロック、又は凍結ブロックを薄切して組織切片を作製し、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに供する。ここで、ブロックに包埋されている胸腺腫瘍組織は、腫瘍部のみであっても良いが例えば正常部位等を含んでいてもよい。

胸腺腫瘍細胞を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、細胞をスライドグラスに塗抹又は収集し、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及びエタノール等で固定する。

ＰＲＡＭＥをタンパク質としてウエスタンブロッティング等で検出する場合には、前処理として、胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織を所定の溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーで溶解されたサンプルを検査サンプルとする。

ＰＲＡＭＥをｍＲＮＡとしてＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ等で検出する場合には、前処理として、胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。また、必要に応じて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写を行い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成しても良い。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを検査サンプルとする。

免疫染色又はウエスタンブロッティングによってＰＲＡＭＥを検出するための一次抗体は、ＰＲＡＭＥを検出できる限り制限されない。例えば、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ 社製のＡｎｔｉ－ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＲ Ｐｏｗｅｒｅｄ ｂｙ Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＰＡ０４５１５３）、ＡＮＴＩ－ＭＡＰＥ（Ｃ－ＴＥＲＭＩＮＡＬ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１３０６５１５）、Ａｎｔｉ－ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１４０１５９０）、Ａｎｔｉ－ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， ｂｕｆｆｅｒｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＡＢ１４０７２２２）、Ａｎｔｉ－ＰＲＡＭＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＡＢ２１０８３００）等を挙げることができる。ＰＲＡＭＥと結合した一次抗体は、一次抗体と結合する酵素標識二次抗体と、前記酵素と基質の反応により検出することができる。免疫染色を行う場合には、脱パラフィン及び浸水処理を行った後に、組織切片をトリプシン等のタンパク分解酵素で処理してから、免疫染色を行ってもよい。

ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに使用するプローブの作製方法は公知である。また、市販のプローブを使用してもよい。

ＲＴ－ＰＣＲに使用するプライマー（定量的ＲＴ－ＰＣＲの場合にはプローブを含んでいても良い）は市販されているものを使用することができる。また、マイクロアレイも市販されているものを使用することができる。

ＲＮＡ－Ｓｅｑは、次世代シーケンサー（例えば、イルミナ社製）等を使用して、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡのリード数を得ることができる。

免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによってＰＲＡＭＥを検出する場合、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションが施された組織標本を顕微鏡、又はスライドスキャナ等を使ってヒトが観察することにより、ＰＲＡＭＥの有無を検出することができる。組織標本内の腫瘍細胞内に免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションのシグナルが確認された場合に、ＰＲＡＭＥが検出されたと判定（決定）することができる。細胞内にＰＲＡＭＥを有する腫瘍細胞が組織標本内の腫瘍部に１つでも検出された場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定しても良い。あるいは、例えば、顕微鏡、又はスライドスキャナの所定の区画に存在している腫瘍細胞の個数を１００％とした時に、細胞内にＰＲＡＭＥを有する腫瘍細胞が１０％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１％以上存在している場合に「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。

ウエスタンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＴ、ＲＮＡ－Ｓｅｑによって、ＰＲＡＭＥを検出する場合、腫瘍細胞又は腫瘍組織から抽出されたサンプルにおいてＰＲＡＭＥが検出された場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。あるいは、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルと正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量を比較して、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量よりも高値を示す場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプルにおけるＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量と同程度である場合に、「ＰＲＡＭＥが検出されていない」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陰性である」と決定してもよい。ここで、「高値を示す」とは、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上高い値を示す場合を例示できる。「同程度」とは、０．８倍から１．１倍程度を例示できる。また、ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量を比較する前に、各検査サンプル中のタンパク質量、又はＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ、β_２－ミクログロブリン、β－アクチン等のハウスキーピング遺伝子由来のタンパク質量又はｍＲＮＡ量で正規化してもよい。タンパク質量は質量、又は濃度で表されても良いが、基質の発光強度等で表されても良い。ｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡのコピー数又はリード数であっても良いが、蛍光強度等で表されてもよい。

別の態様として、あらかじめＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量の基準値をあらかじめ決定しておき、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも高い場合に、「ＰＲＡＭＥが検出された」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陽性である」と決定してもよい。また、腫瘍細胞又は腫瘍組織に由来する検査サンプル中のＰＲＡＭＥタンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも低い場合に、「ＰＲＡＭＥが検出されない」又は、「ＰＲＡＭＥの発現が陰性である」と決定してもよい。基準値は、ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値である限り制限されず、公知の方法により決定することができる。ＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）曲線、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により決定することもできる。また、基準値として、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、第一四分位数等を例示できる。

胸腺癌バイオマーカーの検出方法は、さらにＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であると決定する工程を含んでいてもよい。あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合に、胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではない決定する工程を含んでいてもよい。また、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であると決定することに変えて、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺腫細胞ではないと決定してもよい。また、胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないと決定することに変えて、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺腫細胞であると決定してもよい。

また、胸腺癌バイオマーカーの検出方法は、胸腺腫瘍細胞内にＰＲＡＭＥが検出されたか否かに応じて、必要な治療方法を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、腫瘍の外科的切除に加えて、放射線治療及び／又は化学療法の適用を行うことを決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、腫瘍の外科的切除後経過観察を行うと決定しても良い。さらに、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、術後５年間経過観察を行うと決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、術後１０年間経過観察を行うと決定してもよい。

胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法は、さらにＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良であると決定する工程を含んでいてもよい。あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合に、胸腺腫瘍を有する被検体の予後が良好であると決定する工程を含んでいてもよい。

また、胸腺腫瘍の予後予測マーカーの検出方法は、胸腺腫瘍細胞内にＰＲＡＭＥが検出されたか否かに応じて、必要な治療方法を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、腫瘍の外科的切除に加えて、放射線治療及び／又は化学療法の適用を行うことを決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、腫瘍の外科的切除後経過観察を行うと決定しても良い。さらに、ＰＲＡＭＥが検出された場合には、術後５年間経過観察を行うと決定してもよい。また、ＰＲＡＭＥが検出されなかった場合には、術後１０年間経過観察を行うと決定してもよい。

３．検査試薬
本開示の別の態様は、被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺癌のバイオマーカーとして検出するため検査試薬に関する。また、前記検査試薬は、胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するために使用されうる。

検査試薬は、ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬及び／又はＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。

ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬は、少なくともＰＲＡＭＥタンパク質の一部に結合可能な一種又は複数の抗体（例えば、一次抗体）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ等であってもよい。
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。

検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β－メルカプトエタノール、ＤＴＴ等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。

ＰＲＡＭＥと結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。ＰＲＡＭＥと結合する抗体はマイクロプレート、磁気ビーズ等に固定されていてもよい。

ＰＲＡＭＥタンパク質検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＰＲＡＭＥと結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。

ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬は、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡの全体又は一部とハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、プライマー、及び／又はプローブとしての機能を有する検出用の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることが好ましい。検出用核酸の長さは、特に制限されない。

検出用核酸が、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーであれば、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは５０ ｍｅｒ以下であり、より好ましくは３０ ｍｅｒ以下であり、さらに好ましくは、１５～２５ ｍｅｒ程度である。プライマーには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。

また、ＲＴ－ＰＣＲには、プライマーの他にＰＣＲ産物のリアルタイムの定量のために使用される、ＰＣＲ反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブもＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列を含む、５～２０ ｍｅｒ程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。

検出用核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは１００ ｍｅｒ程度であり、より好ましくは６０ ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、２０～３０ ｍｅｒ程度である。キャプチャープローブには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。さらにキャプチャープローブは、チップに固定化されていることが好ましい。

検出用核酸が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブである場合、検出用核酸は、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡとハイブリダイズする配列が、１５～１００ ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドであってもよく、１００ ｍｅｒを超えるポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブには、ジゴキシゲニン、蛍光色素等の標識物質が結合されうる。プローブには、ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。

ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットに核酸増幅試薬（耐熱性ＤＮＡであってもポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ等を含む）、逆転写酵素等を含んでいてもよい。核酸増幅試薬には、必要に応じてＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）等の色素が含まれていてもよい。マイクロアレイによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡ又はＰＲＡＭＥ ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットにハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡを検出する場合には、検査キットに、プロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。

４．胸腺癌の検出装置及び胸腺腫瘍の予後予測装置
４－１．胸腺癌の検出装置の構成
本開示の一実施形態は胸腺癌の検出システム１０００及び胸腺癌の検出装置１０に関する。

図１は、胸腺癌の検出システム１０００の概観図であり、胸腺癌の検出システム１０００は一態様として、胸腺癌の検出装置１０の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。

図２に、胸腺癌の検出装置１０のブロック図を示す。胸腺癌の検出装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。

胸腺癌の検出装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部１０２と補助記憶部１０４とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。記憶部は、前記測定値や基準値を揮発性に、又は不揮発性に記憶する。

処理部１０１は、胸腺癌の検出装置１０のＣＰＵである。処理部１０１は、ＧＰＵであってもよい。処理部１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、胸腺癌の検出装置１０が機能する。

ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。処理部１０１はＭＰＵ１０１としてもよい。ＲＯＭ１０３は、胸腺癌の検出装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや胸腺癌の検出装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。

主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。

補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。

通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて胸腺癌の検出装置１０が保存又は生成する情報を、分析装置５ａ，５ｂ又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介して分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器と通信を行ってもよい。

入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。

入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、胸腺癌の検出装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、胸腺癌の検出装置１０の外部から接続されても、胸腺癌の検出装置１０と一体となっていてもよい。

出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。

出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、分析装置５ａ，５ｂから送信される測定結果及び胸腺癌の検出装置１０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。

メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。

記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、又はＤＶＤ－ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ－ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。

処理部１０１は、胸腺癌の検出装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに胸腺癌の検出装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。

また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、胸腺癌の検出装置１０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。

胸腺癌の検出システム１０００は一カ所に設置されている必要はなく、胸腺癌の検出装置１０と分析装置５ａ，５ｂが別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。また、胸腺癌の検出装置１０は、入力部１１１や出力部１１２を省略した操作者を必要としない装置であってもよい。

分析装置５ａは、タンパク質の量又は濃度を測定するための装置であり、試料置き場５１と、反応部５２と、検出部５３とを備える。試料置き場５１にセットされた細胞溶解液は、反応部５２に設置された抗原捕捉用抗体が固相されたマイクロプレートに分注されインキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出抗体がマイクロプレートに分注され、インキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体を検出するための基質がマイクロプレートに分注され、マイクロプレートが検出部５３に移動され、基質が反応して発生したシグナルが測定される。

また、分析装置５ａの別態様は、マイクロアレイ解析によるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロアレイチップ上に分注し、ハイブリダイゼーションを行い、洗浄した後、検出部５３に移動させシグナルを検出する。

さらに、分析装置５ａの別態様は、ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロチューブ内に分注し、続いて定量的ＰＣＲ用試薬をマイクロチューブ内に分注する。反応部５２でＰＣＲ反応を行いながら、検出部５３でチューブ内のシグナルを検出する。

分析装置５ｂは、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法によってｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、配列解析部５４を備える。ＲＮＡ－Ｓｅｑ用の反応を行ったサンプルを配列解析部５４にセットし、配列解析部５４内で、塩基配列の解析を行う。

分析装置５ｂは、ウエスタンブロッティングによりタンパク質量を測定するための全自動ウエスタンブロッティング装置であり、化学発光シグナル検出部５４を備える。溶解バッファーで溶解された胸腺腫瘍細胞又は胸腺腫瘍組織のサンプルを自動ウエスタンブロッティング装置の所定の位置にセットし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、メンブレンへのブロッティング、抗体反応、化学発光を行い、化学発光シグナル検出部５４にて解析を行いシグナル強度を定量化する。

分析装置５ａ、及び５ｂは、有線又は無線によって胸腺癌の検出装置１０に接続されている。分析装置５ａは、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして胸腺癌の検出装置１０に送信する。同様に、分析装置５ｂは、ｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして胸腺癌の検出装置１０に送信する。これにより、胸腺癌の検出装置１０は、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値を、演算処理可能なデジタルデータとして取得することができる。

４－２．胸腺腫瘍の予後予測装置の構成
本開示の一実施形態は胸腺腫瘍の予後予測システム２０００及び胸腺腫瘍の予後予測装置２０に関する。

図１は、胸腺腫瘍の予後予測システム２０００の概観図であり、胸腺腫瘍の予後予測システム２０００は一態様として、胸腺腫瘍の予後予測装置２０の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。

図２に、胸腺腫瘍の予後予測装置２０のブロック図を示す。胸腺腫瘍の予後予測装置２０の構成は胸腺癌の検出装置１０と同様である。したがって、上記４－１．の説明は、ここに援用できる。この場合、処理部１０１、主記憶部１０２、ＲＯＭ１０３、補助記憶部１０４、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８、バス１０９、入力部１１１、出力部１１２、記憶媒体１１３を、処理部２０１、主記憶部２０２、ＲＯＭ２０３、補助記憶部２０４、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０５、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０６、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０７、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）２０８、バス２０９、入力部２１１、出力部２１２、記憶媒体２１３と読み替えるものとする。分析装置５ａ，５ｂは、胸腺癌の検出装置１０と同様である。

４－３．胸腺癌の検出装置の動作
図３に胸腺癌の検出装置１０の動作例のフローチャートの一例を示す。
胸腺癌の検出装置１０の処理部１０１は、オペレータが入力部１１１から処理開始の入力を行うことにより、胸腺癌を検出するための処理を開始する。ステップＳ１１において、処理部１０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をＰＲＡＭＥの測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＰＲＡＭＥの発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されたか否か）を入力部１１１から入力し、処理部１０１がこの入力をＰＲＡＭＥの測定値として取得してもよい。

次に処理部１０１は、ステップＳ１２において、記憶部に記憶されているＰＲＡＭＥの基準値と、ステップＳ１１で取得した測定値とを比較する。

処理部１０１は、ステップＳ１３において、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合には、ステップＳ１４（ＹＥＳ）に進み、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。また、ステップＳ１３において、取得した測定値が基準値よりも低い場合に、ステップＳ１５（ＮＯ）に進み、胸腺腫瘍が胸腺癌ではないと決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。胸腺癌である決定した場合には、ラベルには、「胸腺癌である」、又は「胸腺癌を示唆する」ことを示す情報が含まれる。「胸腺癌を示唆する」情報には、「胸腺腫ではないことを示唆する」ことが含まれ得る。胸腺癌ではないと決定した場合には、ラベルには、「胸腺癌ではない」、又は「胸腺癌ではないことを示唆する」ことを示す情報が含まれる。「胸腺癌ではないことを示唆する」情報には、「胸腺腫であることを示唆する」ことが含まれ得る。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。

基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。

４－４．胸腺腫瘍の予後予測装置の動作
図３に胸腺腫瘍の予後予測装置２０の動作例のフローチャートの一例を示す。
胸腺腫瘍の予後予測装置２０の処理部２０１は、オペレータが入力部２１１から処理開始の入力を行うことにより、胸腺癌を検出するための処理を開始する。ステップＳ２１において、処理部２０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥのタンパク質量、又はＰＲＡＭＥのｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をＰＲＡＭＥの測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＰＲＡＭＥの発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、ＰＲＡＭＥが検出されたか否か）を入力部２１１から入力し、処理部２０１がこの入力をＰＲＡＭＥの測定値として取得してもよい。

次に処理部２０１は、ステップＳ２２において、記憶部に記憶されているＰＲＡＭＥの基準値と、ステップＳ２１で取得した測定値とを比較する。

処理部２０１は、ステップＳ２３において、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合には、ステップＳ２４（ＹＥＳ）に進み、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後が不良である決定し、決定結果を示すラベルを出力部２１２に出力する（ステップＳ２６）。また、ステップＳ２３において、取得した測定値が基準値よりも低い場合に、ステップＳ２５（ＮＯ）に進み、胸腺腫瘍を有する被検体の予後が良好であると決定し、決定結果を示すラベルを出力部２１２に出力する（ステップＳ２６）。予後が不良であると決定した場合には、ラベルには、「予後不良」、又は「予後不良を示唆する」ことを示す情報が含まれる。予後が良好であると決定した場合には、ラベルには、「予後良好」、又は「予後良好を示唆する」ことを示す情報が含まれる。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。

基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。

以下に実施例を示して本開示についてより詳細に説明するが、本開示は実施例に限定して解釈されるものではない。

今回の検討は、ヘルシンキ宣言に基づいて学校法人関西医科大学の倫理委員会の承認を得て行った。

１．腫瘍組織
関西医科大学附属病院において切除された胸腺癌（扁平上皮癌）12例、胸腺腫と82例を検討に使用した。

２．nCounterによる胸腺癌バイオマーカーの網羅的解析
胸腺癌及び胸腺腫に発現しているmRNAの比較をデジタルカウント遺伝子発現解析nCounter（登録商標） Analysis system (NanoString Technologies, WA, USA)を使用して行った。解析はタカラバイオ株式会社に依頼した。

３．免疫染色
外科的に切除された組織サンプルをホルマリン固定し、組織標本を作製した。組織標本は、固定した組織サンプルをすべてパラフィン包埋し、薄切切片を作製し、ヘマトキシリン－エオジン染色及び免疫染色に供した。

免疫染色は、自動染色装置(Discovery, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を使用し、装置添付のプロトコールにしたがって行った。PRAMEを染色するための一次抗体として、Anti-PRAME antibody produced in rabbit Prestige AntibodiesR Powered by Atlas Antibodies, affinity isolated antibody, buffered aqueous glycerol solution (HPA045153, SIGMA-ALDRICH )を使用した。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体を使用し、発色にはジアミノベンチジン（DAB）を使用した。

４．統計解析
統計解析には、JMP Start Statistics version 14 (Statistical Discovery Software; SAS Institute, Cary, NC, USA)を使用した。有意差検定は、胸腺癌と胸腺腫との間で行った。

５．結果
５－１．nCounter
図５に示すように、nCounterによる解析において、胸腺癌と胸腺腫の間で特に優位な発現差が認められたのは、KitとPRAMEであった。

５－２．免疫染色による評価
組織学的に胸腺癌、胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプAB、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、胸腺腫タイプB3、他の胸腺腫、又は胸腺のう胞に分類された組織について、PRAMEの免疫染色を行い、PRAMEの陽性率を比較した。図６Aに結果を示す。また、図６Bに胸腺癌、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3のPRAMEの免疫染色画像を示す。

図６Aに示すように、PRAMEは、胸腺癌では、検討を行った12例すべてにおいて陽性となり、陰性となった例は認められなかった。これに対して、胸腺腫では、全82例中、胸腺腫タイプABの3例、及び胸腺腫タイプB3の2例においてPRAMEが陽性となったのみで、他はすべて陰性であった。胸腺腫タイプB3と胸腺癌の間の陽性率の有意差検定ではp=0.000035となり有意差が認められた。また、図６Bに示すように、胸腺癌では、PRAMEが細胞内にびまん性に強く染色されるのに対して、胸腺腫タイプABの3例、及び胸腺腫タイプB3の2例では、染色強度は低く、染色性も限局的であった。このことから、PRAMEは、胸腺癌細胞に強発現することが示された。

また、図７に胸腺癌のCD5、c-Kit及びPRAMEの免疫染色画像を示す。胸腺癌では、CD5、c-Kit及びPRAMEが強く染色されていた。また図８から図１１には、それぞれ胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3のCD5、c-Kit及びPRAMEの免疫染色画像を示す。これまで胸腺癌のマーカーとして報告されていたCD5は、胸腺腫タイプA、胸腺腫タイプB1、胸腺腫タイプB2、及び胸腺腫タイプB3の腫瘍細胞にも陽性シグナルが検出された。c-Kit (CD117)は非特許文献１においても胸腺癌のマーカーであることが示されている。しかし、非特許文献１によれば、胸腺癌におけるc-Kitの陽性率は78％であり、すべての胸腺癌を検出できるマーカーではないことが知られている。これに対してPRAMEは、検討した胸腺癌すべてで陽性となり、好適な胸腺癌のバイオマーカーであることが示された。また、胸腺癌は、他の悪性腫瘍と同様に、遠隔転移を起こす、再発する等の性質を有するため、胸腺癌を有する被検体の予後は一般的に不良である。上記結果は、PRAMEが、胸腺腫瘍を有する被検体の予後予測メーカーとしても使用可能であることを示していると考えられる。

Claims (14)

1. 被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、胸腺癌バイオマーカーの検出方法。
2. ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記胸腺腫瘍が胸腺癌であることを示唆する、請求項１に記載の検出方法。
3. ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、請求項１又は２に記載の検出方法。
4. 被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥを検出する工程を含む、前記被検体の予後を予測する予後予測マーカーの検出方法。
5. ＰＲＡＭＥが検出された場合に、前記被検体の予後が不良であることを示唆する、請求項４に記載の検出方法。
6. ＰＲＡＭＥの検出が、腫瘍組織の免疫染色によって行われる、請求項４又は５に記載の検出方法。
7. 胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして使用する方法。
8. 胸腺腫瘍の細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用する方法。
9. 被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、胸腺癌のバイオマーカーとして検出するための検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
10. 被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内に存在するＰＲＡＭＥを、前記胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬であって、前記検査試薬は、ＰＲＡＭＥを検出するための抗体、又は核酸を含む、検査試薬。
11. ＰＲＡＭＥからなる、胸腺癌のバイオマーカー。
12. ＰＲＡＭＥからなる、胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するための予後予測マーカー。
13. 処理部を備える、胸腺癌の検出装置であって、
    前記処理部は、
    被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、
    取得した測定値を、基準値と比較し、
    取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記胸腺腫瘍細胞が胸腺癌細胞ではないことを示すラベルを出力する、
    予後予測装置。
14. 処理部を備える、胸腺腫瘍を有する被検体の予後を予測するための予後予測装置であって、
    前記処理部は、
    被検体から採取された胸腺腫瘍細胞内のＰＲＡＭＥの測定値を取得し、
    取得した測定値を、基準値と比較し、
    取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、前記被検体の予後が不良であることを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、前記被検体の予後が良好であることを示すラベルを出力する、予後予測装置。

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