JP7207661B2 - Platinum TALENを用いたT細胞受容体の完全置換技術 - Google Patents
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Description
(項目1) DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該DNA結合ドメインと該機能ドメインは、35~55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、組成物。
(項目2) 前記DNA結合ドメインと前記機能ドメインは、40~50のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該DNA結合ドメインは、34のアミノ酸からなる16~20のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~5の自然数であり、
該DNA結合ドメインの由来は、TALEである、前記項目に記載の組成物。
(項目3) 前記機能ドメインがDNA切断ドメインである、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目4) 前記DNA結合ドメインがTCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目5) 前記DNA結合ドメインが、TRAC エクソン1、TRBC1 エクソン1、またはTRBC2 エクソン1に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目6) 前記DNA結合ドメインが、配列番号80の核酸配列、配列番号81の核酸配列、配列番号82の核酸配列、配列番号83の核酸配列、配列番号84の核酸配列、または配列番号85の核酸配列に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目7) 前記ポリペプチドをコードする前記核酸を含む発現ベクターを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目8) 前記ポリペプチドをコードする前記核酸を、mRNAの形で含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目9) 前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程を含む、TCR遺伝子を編集する方法。
(項目10) 前記DNA結合ドメインがTCRα遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程と、
前記DNA結合ドメインがTCRβ遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程と
を含む、前記項目に記載の方法。
(項目11) 前記TCR遺伝子の編集が、内因性TCR遺伝子の除去である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目A1) 外因性TCR遺伝子を前記細胞に導入する工程をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目A1-1) 前記導入する工程が、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)を介して前記外因性TCR遺伝子を前記細胞のゲノムにノックインすることを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目A1-2) 前記導入する工程が、前記外因性TCR遺伝子をコードするベクターを前記細胞に導入することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目A2) 前記外因性TCRが、NY-ESO-1に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目A3) 前記項目のいずれかに記載の方法により作製された、TCR改変T細胞。
(項目A4) 対象においてがんを処置するための、前記項目のいずれかに記載のTCR改変T細胞を含む組成物。
(項目A5) 前記がんが、NY-ESO-1陽性のがんである、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(項目12) DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数であり、
該組成物は、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物。
(項目12A) 前記項目のいずれか1つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組成物。
(項目13) 機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とし、
ここで、該DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、組成物。
(項目13A) 前記項目のいずれか1つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組成物。
(項目14) DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、TCR遺伝子を編集するための組み合わせ物であって、
ここで、該DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、組み合わせ物。
(項目14A) 前記項目のいずれか1つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組み合わせ物。
(項目15) DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、該DNA結合ドメインと該機能ドメインは、35~55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数であり、
該DNA結合ドメインがTCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子に特異的に結合する、
ポリペプチド。
(項目15A) 前記項目のいずれか1つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載のポリペプチド。
(項目16) 前記DNA結合ドメインと前記機能ドメインは、40~50のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該DNA結合ドメインは、34のアミノ酸からなる16~20のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~5の自然数であり、
該DNA結合ドメインの由来は、TALEである、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目17) 前記機能ドメインがDNA切断ドメインである、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目18) 前記DNA結合ドメインが、TRAC エクソン1、TRBC1 エクソン1、またはTRBC2 エクソン1に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目19) 前記DNA結合ドメインが、配列番号80の核酸配列、配列番号81の核酸配列、配列番号82の核酸配列、配列番号83の核酸配列、配列番号84の核酸配列、または配列番号85の核酸配列に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目20) 前記DNA結合ドメインが、配列番号86のアミノ酸配列、配列番号87のアミノ酸配列、配列番号88のアミノ酸配列、配列番号89のアミノ酸配列、配列番号90のアミノ酸配列、または配列番号91のアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
(項目21) 前記項目のいずれかに記載のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸。
(項目22) 前記項目のいずれかに記載の組成物または前記項目のいずれかに記載の組み合わせ物と、
内因性TCR遺伝子の変異を確認する手段、および/または内因性TCR遺伝子の除去を確認する手段と
を備える、TCR遺伝子を編集するためのキット。
(項目23) 前記項目のいずれかに記載の組成物または前記項目のいずれかに記載の組み合わせ物と、
外因性TCR遺伝子を導入する手段、および/または遺伝子が導入された細胞を検出する手段と
を備える、TCR遺伝子を編集するためのキット。
(項目24) 内因性TCR遺伝子を外因性TCR遺伝子で置換するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目25) TCR改変制御性T細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目25A) 前記項目のいずれか1つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載のキット。
(項目B1) NY-ESO-1に対する特異性を有する外因性TCRを発現するTCR改変T細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目X) 目的の外因性TCRを含む細胞の細胞集団であって、該細胞集団において、該目的の外因性TCR以外の外因性TCRを含む細胞の割合が10%未満である、細胞集団。
(項目X1) 前記外因性TCRは、NY-ESO-1に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の細胞集団。
(項目X2) 前記項目のいずれかに記載の細胞集団を作出する方法であって、
細胞から内因性TCRを除去する工程と、
前記外因性TCRをコードする核酸を該内因性TCRが除去された該細胞に導入する工程と
を含む、方法。
(項目X2-1) 前記導入する工程が、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)を介して前記外因性TCR遺伝子を前記細胞のゲノムにノックインすることを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目X2-2) 前記導入する工程が、前記外因性TCR遺伝子をコードするベクターを前記細胞に導入することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目X3) 前記外因性TCRはNY-ESO-1に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の方法。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および/または基本的技術内容を適宜説明する。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参照して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
本発明の1つの局面において、DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物が提供される。DNA結合ドメインと機能ドメインとは別個に提供されてもよい。そのため、本発明の1つの実施形態においては、DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物が提供される。あるいは、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物が提供される。さらなる実施形態においては、DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、TCR遺伝子を編集するための組み合わせ物が提供される。本発明におけるゲノム編集酵素は、好ましくはTALENであり、より好ましくはPlatinum TALENである。
ある認識配列に対応するPlatinum TALENは、予め用意したか、または新たに作製したベクターライブラリー中のベクターを組み合わせて、Platinum TALENをコードする核酸を調製することによって製造することができる。例えば、Platinum TALENの作製キット(Platinum Gate TALEN Kit、http://www.addgene.org/kits/yamamoto-platinumgate/)を用いて所望の認識配列に対応するPlatinum TALENを製造することができる。新規にPlatinum TALENのベクターセットを立ち上げる場合、図20に示される作製スキームに従って製造することができる。
(2.2.1 内因性TCRの除去の機構)
本発明の改変TALENは、内因性TCRを除去するために用いることができる。以下、内因性TCRの除去について説明する。
本開示のゲノム編集酵素(改変TALENともいう。)は、TCR遺伝子を標的とするように設計され得る。したがって、DNA結合ドメインは、TCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子に特異的に結合し得る。TCR遺伝子上でDNA結合ドメインが結合する部分については、例えば、TRAC エクソン1、TRBC1 エクソン1、またはTRBC2 エクソン1などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記のとおり、DNA結合ドメインは、各モジュールに存在するRVDを選択することで、所望の配列に対して特異性を有するように設計することが可能であり、本明細書に開示される任意の標的配列に対して、当業者は特異的なDNA結合ドメインを設計することができる。
のような配列を標的として設計することができる。本明細書の実施例2において、このような位置を標的としたDNA結合ドメインを有するゲノム編集酵素によって内因性TCR遺伝子を除去することができたことが実証されている。なお、各標的配列の左端のTの塩基は、TALEのN末ドメイン(DNA結合リピートの外側の領域)によって認識されるTである。このTの塩基は、「DNA結合リピートの認識配列」としては含まれないと考えられるが、「TALENの標的配列」としては含まれると考えられる。
1つの局面では、本開示の改変TALENは、内因性TCR遺伝子を除去する工程を含む、抗原に特異的な制御性T細胞を生産する方法に用いることができる。例えば、本開示は、抗原に特異的な制御性T細胞を生産する方法であって、エフェクターT細胞ドナーにおける該抗原に特異的なエフェクターT細胞集団において、TCRレパトアを測定する工程であって、非バイアス的にTCR遺伝子を増幅することを含む、工程と、該エフェクターT細胞集団におけるTCRαおよびTCRβの対を同定する工程と、該同定されたTCRαおよびTCRβの対が、抗原に対する親和性を有するかを確認する工程と、該同定されたTCRαおよびTCRβの対におけるTCRαの核酸配列の全部または一部およびTCRβの核酸配列の全部または一部をクローニングする工程と、改変TALENを用いて制御性T細胞の内因性TCR遺伝子を除去する工程と、該制御性T細胞に、該クローニングされたTCRαの核酸配列の全部または一部およびTCRβの核酸配列の全部または一部を導入する工程であって、該TCRαおよび該TCRβが対になって発現されるように導入する工程とを含む、方法を提供する。
本開示の1つの局面において、本開示の改変TALENは、T細胞の内因性TCR遺伝子を改変する方法において用いることができる。この方法は、好ましくは、内因性TCRが発現されないようにT細胞を改変する工程を含み得る。
本開示の改変TALENを用いる際に、T細胞亜集団の組成の分析を行いうる。
本開示の改変TALENは、TCRレパトア解析で得られた情報に基づいてTCRを改変する際に用いることができる。
(1-1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する工程;
(1-2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1-3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1-4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第1のTCRのC領域特異的プライマーは、該TCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
(1-5)(1-4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う工程であって、該第2のTCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;および
(1-6)(1-5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列を第3のTCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第3のTCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;
を包含し得る。この方法の具体的な詳細はWO2015/075939に記載されており、当業者はこの文献および本明細書の実施例等を適宜参照して解析を実施することができる。
本開示の改変TALENは、TCRペア同定を行い、所望のTCRを導入する際においても利用することができる。
本開示の改変TALENは、高機能TCRの提供において使用することができる。
本開示の1つの実施形態において、本開示の改変TALENは、TCRをT細胞に導入する工程を含む方法において使用することができる。T細胞は、好ましくは制御性T細胞である。本開示の改変TALENは、内因性TCRの影響を排除することができるため、かかる方法において用いるのに好適である。本開示の一部の実施形態において、TCRをT細胞に導入する工程を含む方法において使用するための改変TALENを含む組成物が提供される。
TCR導入ベクターに応用されているミスペアリング回避既存技術としては、例えば、
1)Cysの導入(Blood.109:2331, 2007.)
2)Leucin zipper (Proc Natl Acad Sci. 91:11408, 1994.)
3)2A配列を用いたα・β鎖の均等発現(必要に応じてコドン最適化) (J Mol Med 88:1113, 2010)
4)特定のN-glycosylation部位の除去(J Exp Med. 206:463, 2009.)
5)マウス等の細胞内ドメイン使用(Cancer Res. 66:8878, 2006;J Immunol. 184:6223,2010)
6)単鎖TCRの使用(α-β-Constant)(Blood. 115:5154, 2010)
などが存在する。
本開示の1つの実施形態では、目的の外因性TCRを含む細胞の細胞集団であって、当該目的の外因性TCR以外の外因性TCRを含む細胞の割合が低減されている細胞集団が提供される。本発明の細胞集団において、目的の外因性TCR以外の外因性TCRを含む細胞の割合は、例えば、約20%、約15%、約12%、約10%、約7%、約5%、約3%、約2%または約1%未満であるか、本発明の細胞集団は、目的の外因性TCR以外の外因性TCRを含む細胞を実質的に含まない。目的の外因性TCRの非限定的な例としては、NY-ESO-1に対する特異性を有するものが挙げられる。
このほか、本開示の改変TALENは、T細胞の特異性を操作するのに有用である。本開示の改変TALENを用いてミスペアリング/オフターゲットが生じないように外因性TCRを発現するように操作されたT細胞を養子免疫療法等に利用することができる。
本開示において、TCR遺伝子を編集するためのキットもまた提供される。キットは、本開示の改変TALENを含む組成物または組み合わせ物と、内因性TCR遺伝子の変異を確認する手段、および/または内因性TCR遺伝子の除去を確認する手段とを備え得る。
(概要)
本実施例は、免疫学的に優勢なクローンは高アフィニティクローンであることおよびかかるクローンの同定・クローニングの方法を実証することを目的とする。
[ドナーサンプル]
本実施例は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行われ、ヒトサンプルを用いる全ての実験は、広島大学の倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従ってなされた。書面による同意を提供した5人の健康なドナーから、末梢血単核細胞(PBMC)を得た。全てのドナーをCMV血清状態についてスクリーニングし、そして、高解像度Luminex法を用いて、HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1および-DPB1アレルについてジェノタイピングした。PBMCを、標準Ficoll勾配分離プロトコルを使用して単離し、そして、液体窒素中で保管した。
細胞表面分子の発現を、以下の蛍光標識モノクローナル抗体(mAb)を用いて決定した:アロフィコシアニン(APC)コンジュゲートもしくはフルオロセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲート抗CD8、アロフィコシアニン-hilite7(APC-H7)コンジュゲート抗CD3、フィコエリスリン-cyanine7(PE-Cy7)コンジュゲート抗CD45ROmAb、brilliant violet 510(BV510)コンジュゲート抗CD62LmAb、brilliant violet 421(BV421)コンジュゲート抗CD197mAb、APCコンジュゲート抗CD95およびAPCコンジュゲート抗TCRαβ。これらの抗体は、BD Bioscience (San Jose, CA)から購入した。CMV pp65特異的T細胞を、フィコエリスリン(PE)コンジュゲートHLA-A*02-ペプチドテトラマーと、Kuzushima, K. et al. Tetramer-assisted identification and characterization of epitopes recognized by HLA A*2402-restricted Epstein-Barr virus-specific CD8+ T cells. Blood 101, 1460-1468 (2003)に記載されるように反応させた。テトラマーのMHC-I上のCD8結合部位はインタクトであった。本発明者らは、HLA-A*02拘束性CMVpp65ペプチド(NLVペプチド)のNLVPMVATV(配列番号2)配列をモデル抗原として選択した。MHCテトラマー染色を室温で15分間行い、その後、細胞表面染色を、4℃で30分間行った。全ての実験で用いたテトラマーの濃度は、系列希釈実験を除いて、10μg/mlであった。非特異的テトラマー染色を、ネガティブコントロールテトラマー(HLA-A2-HIV(KLTPLCVTL(配列番号3))テトラマー-PE)を用いてチェックした。
PBMCおよびソートしたCD8+T細胞は、10% AB血清、2mmol/l L-グルタミンおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するX-VIVO20(Lonza, Walkersville, MD)中で培養した。Bリンパ芽球細胞株(B-LCL)は、10% FBS、2mmol/l L-グルタミンおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI1640(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)中で培養した。全ての細胞は、5%CO2含有雰囲気中、37℃で加湿インキュベーター内で培養した。
CD8マイクロビーズを用いて、PBMCからCD8+T細胞を単離した。CD4+ T-cell isolation kit(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いて、残りの細胞から、CD4+T細胞を除去した。残りのCD4/CD8ダブルネガティブ細胞を、抗原提示細胞(APC)として使用した。放射線照射(35Gy)後、APCを、室温で2時間NLVペプチドに曝露し、IL-2およびIL-7を含有するCTL培地中で、等数のCD8+T細胞と共培養した。合成NLVペプチドは、GenScript(Piscataway, NJ)から購入した。培地の半分を、各週2回交換した。
アダプターライゲーションPCRを用いた非バイアス的遺伝子増幅法およびNGSを用いた網羅的TCレパトア解析は、簡潔には以下のとおり行った。総RNAをPBMC(5×106)、またはソートされたT細胞から抽出し、ポリ(T)18およびNotI部位を含むBSL-18Eプライマーを用いてcDNAに変換した。その後、二本鎖(ds)DNAを合成し、T4 DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて平滑末端化した。P10EA/P20EAアダプターをdsDNAの5’末端にライゲーションし、次いで、NotIで切断した。アダプターおよびプライマーを除去した後、TRA定常領域特異的プライマーまたはTRB定常領域特異的プライマーと、P20EAとを用いてPCRを行った。第2のPCRを、同一のPCR条件を用いて、定常領域特異的P20EAプライマーによって行った。第2のPCRの産物を、Illumina Miseqプラットフォームを用いる高スループットシーケンシングのために用いた。低クオリティスコアの配列を除去した後、TCRレパトア分析を、Repertoire Genesis Incorporation (Ibaraki, Japan)によって作成されたバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて行った。個々の手順のさらなる詳細は、下記の項目に記載される。
RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、Manufacturer’s instructionに従って、総RNAをPBMCまたはソートしたT細胞から抽出した。RNA量および純度を、Agilent 2200 TapeStation(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて測定した。1μgの総RNAを、Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてcDNAに変換した。cDNA合成には、ポリ(T)18およびNotI部位を含むBSL-18Eプライマーを用いた。cDNAの合成後、Escherichia coli DNA polymerase I(Invitrogen)、E. coli DNA Ligase(Invitrogen)およびRNase H(Invitrogen)を用いて二本鎖(ds)cDNAを合成した。dscDNAの末端は、T4 DNA polymerase(Invitrogen)を用いて平滑末端化した。dscDNAの5’末端にP10EA/P20EAアダプターをライゲーションし、次いで、NotIで切断した。MinElute Reaction Cleanup kit(Qiagen)によるアダプターおよびプライマーの除去後、TCRα鎖定常領域特異的プライマー(CA1)またはTCRβ鎖定常領域特異的プライマー(CB1)のいずれかと、P20EAとのプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃(30秒)、55℃(30秒)および72℃(1分)を20サイクルであった。第2のPCRを、CA2またはCB2のいずれかと、P20EAとのプライマーにより、同一のPCR条件を用いて行った。
NGSのためのアンプリコンは、第2のPCRの産物から、P20EAプライマーおよび融合タグプライマー(表1)を用いて調製した。融合タグプライマーは、Aアダプター配列(CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC(配列番号34))、4塩基のシーケンスキー(TCAG)、および分子同定(MID)タグ配列(10ヌクレオチド)を含んだ。TCR定常領域特異的配列は、Manufacturer’s instructionに従って設計した。PCR増幅の後、アンプリコンを、アガロースゲル電気泳動を用いて評価した。不完全フラグメントまたはプライマーは、Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter, Brea, CA)を用いて、Manufacturer’s instructionに従って除去した。精製したアンプリコンの量は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて定量した。異なる融合タグプライマーにより10サンプルから得られた各アンプリコンを、等モル濃度で混合した。エマルジョンPCR(emPCR)を、アンプリコン混合物を用いて、GS Junior Titanium emPCR Lib-L kit(Roche 454 Life Sciences, Branford, CT)により、Manufacturer’s instructionに従って行った。
全ての配列リードは、そのMIDタグ配列に従って分類した。人工的に付加した配列(タグ、アダプターおよびキー)および低クオリティスコアの配列を、454 Sequencing Systemとともに提供されているソフトウェアを用いて配列リードの量末端から除去した。残りの配列を、TCRα配列のTRAVおよびTRAJ、ならびにTCRβ配列のTRBVおよびTRBJの割り当てに使用した。配列の割り当ては、ImMunoGeneTics Information System(IMGT)データベース(http://www.imgt.org)から利用可能であるリファレンス配列(54のTRAV、61のTRAJ、65のTRBVおよび14のTRBJ遺伝子(偽遺伝子およびオープンリーディングフレーム(ORF)リファレンス配列を含む)のデータセットにおける、最も高いパーセント同一性を有するものを決定することによって行った。データ処理、割り当て、およびデータ集約は、Repertoire Genesis Incorporation(Osaka, Japan)によって独自に開発されたレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis, RG)を用いて自動的に行った。RGは、まずBLASTNおよびIMGTデータセットを用いてTRVおよびTRJアレルをクエリに割り当てる。クエリおよびリファレンス配列の間の同一性をこのステップで算出した。感度および正確性を増加させるパラメータ(E値閾値、ミニマムカーネル、高スコアセグメントペア(HSP)スコア)wp、各レパトア解析について最適化した。次いで、RGは、クエリのCDR3領域を、翻訳されるリーディングフレームを検討することにより推定する。次いで、RGは、TRV-CDR3-TRJパターンの分布を算出し、グラフィック(例えば、TRV-TRJ使用ヒストグラムやCDR3長分布チャート)を生成する。これらのステップは、クエリの入力後自動で行われた。
CDR3領域の翻訳されたヌクレオチド配列は、IMGT命名法に従って、保存されているCys104から、保存されているPhe118またはGly119の範囲にわたった。ユニーク配列リード(USR)は、TRV、TRJおよび他の配列リードのCDR3ドメインの演繹アミノ酸配列に対して0%の同一性として定義した。RGソフトウェアは、自動的に各サンプル中の同一のUCRのコピー数をカウントし、次いで、コピー数の順にそれらをランク付けた。TRAV、TRAJ、TRBVおよびTRBJ遺伝子の配列リードのパーセンテージ頻度を算出した。
単一の細胞によって発現されるCMV NLV特異的TCRαβ対を同定および特徴付けるため、本発明者らは、以下のとおり改変したhTEC10システム(Kobayashi, E. et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat. Med. 19, 1542-1546 (2013).、Hamana, H., Shitaoka, K., Kishi, H., Ozawa, T. & Muraguchi, A. A novel, rapid and efficient method of cloning functional antigenspecific T-cell receptors from single human and mouse T-cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 474, 709-714 (2016).)を用いた。CD8/NLVテトラマーダブルポジティブ細胞を、96ウェルPCRプレートの各ウェルにソートした。マルチプレックスRT-PCRを用いて、cDNAを合成・増幅した。TCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする配列を増幅するために用いた遺伝子特異的プライマーは、IMGTデータベース(http://www.imgt.org/)から得られたリーダーペプチド配列から設計した。PCR反応については、以下の「TCRAおよびTCRB対のRT-PCR分析」で詳述する。TCRレパトア分析を、IMGT/V-Quest tool(http://www.imgt.org/)を用いて行った。
RT-PCRは、0.1μlの40U/μl RNase Inhibitor(NEB, Ipswich, MA)、0.1μlの200U/μl PrimeScript II RTase(TaKaRa, Otsu, Japan)、0.4μlのプライマー混合物、0.025μlの2.5U/μl PrimeStar HS DNA Polymerase(TaKaRa)、0.4μlの2.5mM dNTPおよび2.5μlの5×PrimeStar GC buffer(TaKaRa)を含有する反応混合物中で行った。DEPC処置したH2Oを加え、最終体積を5μlにした。RT反応は、45℃で40分間行い、その後、以下のPCR反応を行った:98℃で1分間、その後、98℃で10秒、55℃で5秒、および72℃で1分を30サイクル。PCR反応物は、水で10倍に希釈し、その後のネステッドPCRのためのテンプレートDNAとして用いた。TCRAおよびTCRBの増幅のためのネステッドPCRは、異なる96ウェルPCRプレートで行った。反応混合物は、第1のPCR反応からの2μlのDNAテンプレート、0.4μlの10μMのそれぞれの特異的プライマーセット(TCRαについてA-ADおよびA-RV2プライマー、TCRβについてB-ADおよびB1-RV2プライマー、B2-RV2プライマー)、0.1μlの2.5U/μl PrimeSTAR HS DNA Polymerase、1.6μlの2.5mM dNTP、10μlの5×PrimeSTAR GC Buffer、0.1μlの2.5U/μlおよびH2O(最終体積20μlまで添加)を含んだ。PCRサイクルは、以下のとおりであった:98℃で1分間、その後、98℃で10秒、55℃で5秒、および72℃で1分間を35サイクル。TCRAおよびTCRBのPCR産物を、サンガーシーケンシングで分析した。
1)上記クローニングされた各TCRαβペア遺伝子(CMVpp65 NLVPMVATV : NLV特異性)をTCRαβ欠損 Jurkat cellにレトロウイルスベクター(pMXs-IRES GFP)を用いて遺伝子導入した。
結果は、図1および図2に示される。ドナーV001およびV004について、図1に示されるクロノタイプを有するT細胞クローンが、抗原特異的なクロノタイプとして同定された。非常に少数のクローンによって抗原特異的なクローンの集団が構成されていることが見出された。
上記実施例1における[高スループットNGSを用いたTCRレパトアの半定量的解析]の工程を、異なるシーケンサ(Miseq, Illumina)を用いて、以下の手順で行った。
RNA~二本鎖DNA合成までは実施例1と同一工程で行った。PCRは1st PCR、2nd PCRまで同一工程で、それ以降をMiseq用のPCR(Tag PCRとIndex PCR)として行った。試薬の変更点として、次世代シーケンスのPCR酵素として推奨されるKAPA HiFi HotStart ReadyMixを使用した。
※ヒトTCRαβの2遺伝子を解析するための流れを記載する。
1サンプル分の試薬量を示す。
10μLの2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mixを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
7.6μLのDW(DNA専用、ボトル)を、それぞれαもしくはβチューブに加える。0.2μL 10μM P20EA primerを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
0.2μL 10μM CA1 primerをαチューブに、0.2μLの10μM CB1 primerをβチューブに加える。
αもしくはβ液が入ったチューブに、各dsDNAサンプルを2μLずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定(プログラム名:KAPA20、条件は95℃ 3min、20cycles(98℃ 20sec、65℃ 30sec、72℃ 1min)、72℃ 2min、最後、12℃ forever)を選択する。
1サンプル分の試薬量を示す。
10μLの2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mixを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
6μLのDWを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
1μLの10μM P20EA primerを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
1μLの10μM CA2 primerをαチューブに、1μLの10μM CB2 primerをβチューブに加える。
αもしくはβの1stPCR産物を、それぞれのαもしくはβPCR用2ndPCRチューブに2μLずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定(プログラム名:KAPA20、条件は95℃ 3min、20cycles(98℃ 20sec、65℃ 30sec、72℃ 1min)、72℃ 2min、最後、12℃ forever)を選択する。
3-2-10:サンプル操作8(AMpure 精製1)
本工程ではBECKMAN COULTER社のAgencourt AMPure XPを用いる。
AMPure XPビーズを均一になる迄よく混和し、8μLをチューブ分注する。
10μLの2ndPCR産物をAMPure XPビーズを分注したチューブに加え、MM-Separater M96(マグネットプレート)にセットし、磁気ビーズを集める。
上清を除去し、70%エタノールを200 μLでリンス、MM-Separater M96にセットし、磁気ビーズを集める。
上清を完全に除去し、30μLのDW(DNA用、ボトル)分注し、ボルテックスする。MM-Separator M96にセットして磁気ビーズを集める。
上清を25μL回収する。
3-2-11:サンプル操作9(Tag PCR)
10μLの2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mixを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
4.2μLのDW(DNA専用、ボトル)を、それぞれαもしくはβチューブに加える。0.4μL 10μM P22EA-ST1-R primerを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
0.4μL 10μM CA-ST1-R primerをαチューブに、0.4μL の10μM CB-ST1-R primerをβチューブに加える。
αもしくはβ試薬混合液が入ったチューブに、各2ndPCR精製済みサンプルを5μLずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定(プログラム名:KAPA20、条件は95℃ 3min、20cycles(98℃ 20sec、65℃ 30sec、72℃ 1min)、72℃ 2min、最後、12℃ forever)を選択する。
3-2-14:サンプル操作11(AMpure精製2)※
※本項の操作は、プロトコール「3-2-10:サンプル操作8(AMpure 精製1)」と同一である。
3-2-15:サンプル操作12(Index PCRに必要なシートの作成)
3-2-15-1:要点
Index PCRは各サンプルにインデックス配列、およびP5/P7配列(フローセルに結合する部分)を付加するために行うものである。
予めサンプルとプライマーの並び順(マトリックス)を決め、Illumina Experiment Managerでサンプルシートを作成する。
インデックスプライマーはイルミナの既製品(Nextera XT Index Kit v2 Set A)を用いる。
3-2-16:サンプル操作13(Index PCR)
本手順書では1サンプル分の試薬量を示す。
10μLの2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mixをチューブに加える。
4μLのDW(DNA用、ボトル)を、チューブに加える。
PCR8連チューブに14μL分注していく。
2μLずつNプライマーを分注していく。
2μLずつSプライマーを分注していく。
Tag PCR精製済みサンプルを所定のチューブに2μLずつ分注していく。
サーマルサイクラーより該当する設定(プログラム名:INDEX12、条件は95℃ 3min、12cycles(95℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃ 30sec)、72℃ 5min、最後、4℃ forever)を選択する。
3-2-17:サンプル操作14(電気泳動と評価2)
※TCR遺伝子の場合はおよそ650bpとなる。
1.5%アガロースゲル調製し、染色はAtlas ClearSightを用いる。
泳動槽にゲルを設置し、4μLのindex PCR産物を100bp DNAラダー、10x Dyeとともに電気泳動(100Vで30分間)し、UVトランスイルミネーターやデジカメを用いて増幅結果を評価する。
※著しく薄い場合は、プロトコール「3-2-16:サンプル操作13(Index PCR)」に戻り、PCR条件を変更する(15サイクルに増やす)必要がある。
3-3-3:サンプル操作1(QubitによるDNA濃度測定)
Index PCR産物を用いてDW(DNA用、ボトル)で10倍希釈する。
Qubit dsDNA HS Assay kitに付属のdyeを、付属のbufferで200倍希釈する。
500μL専用チューブ2本(Standard用)に190μL、検体用は198μLのdye希釈液を加える。
dye希釈液190μLを加えた500μL専用チューブ(2本)に、Qubit dsDNA HS Assay kitに付属のStandard#1、Standard#2を、それぞれ10μL加える。
dye希釈液198μLを加えた500μL専用チューブ(10本)に、Index PCR産物を2μL加える。
Qubitを起動し、測定モード「dsDNA」を選択、続いて「High Sensitivity」を選択する。
測定画面に移動し、一番下の「Read standards」を選択する。
順番にStandard#1、Standard#2を測定し、値として「数十」、「数万」になることを確認する。
検体のインプット量を2μL設定し、測定する。
※測定範囲が0.1~50ng/μLであるため、レンジを超えた場合は希釈して測定を再度行う。
測定結果をもとに、複数の検体(通常Miseqのシーケンスでは50~60検体を同時に測定する)から等量のDNA量が混合できるように別チューブに分注し、プール検体とする。
3-2-18:サンプル操作15(AMpure精製3)
※本項の操作は、プロトコール「3-2-10:サンプル操作8(AMpure 精製1)」と操作は同一であるが、プール検体の液量に合わせて調整する。
3-3-3:サンプル操作1(QubitによるDNA濃度測定と希釈)と同様の操作となる。
Miseqでシーケンスに用いる検体濃度は4nM(650bpの場合は1.72ng)であるため、測定後に指定濃度まで希釈する。
3-3:MiSeqシーケンス解析
3-3-4:サンプル操作2(Phi-X、DNAライブラリーの変性)
5μLの0.2N-NaOHと、5μLの4nMに調製されたプール検体(DNA)を混合する
5μLの0.2N-NaOHと、5μLの4nMに調製されたPhiX(シーケンス安定化試薬、ランダムな塩基が入っている)を混合する。
それぞれにHyb-Bufferを分注し、最終濃度が10pM、DNA:PhiX=4:1(PhiXが20%)になるように混合、最終調製する。
シーケンス解析ではイルミナ社のMiseqを用い、主なシーケンス試薬はMiSeq Reagent Kit v3(600サイクル)MS-102-3003を使用する。操作方法は、解凍した試薬カセットに、最終調整した検体を指定されたウェルに分注し、機器にセットする。
以下にプライマー配列等の情報を記載する。
実施例1における[シングルセルソーティングおよびRT-PCR]、[TCRAおよびTCRB対のRT-PCR分析]の部分を以下のような手順で行うことも可能である。本手順は、Drop-Seq法を改良し、高効率にTCRペア遺伝子を決定するGene Capture Drop-SeqTM法として開発されたものである。TCR特異的オリゴビーズの作製法とGene Capture Drop-SeqTM法を用いたシングルセルTCRペア遺伝子決定法が記載される。本手順のさらなる詳細は、羊土社「実験医学・別冊」シングルセル解析プロトコール(2017年10月10日号)に記載されており、当該文献は、その全体が本明細書において参考として援用される。
(機器)
□ ドロマイトバイオ社製シングルセルRNA-Seqシステム(図19A)
(Pポンプ3台、流量計3セット、細胞撹拌機、デジタル顕微鏡、シングルセルRNA-Seqチップ)
□ MiSeqシーケンサ(イルミナ社)
□ Qubit 3.0フルオロメーター(サーモフィッシャー サイエンティフィック社)
1.ビーズオリゴ作成
□ TE 10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA
□ TE/TW 10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、0.1% Tween20
□ TE/SDS 10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、0.5% SDS
□ Bst反応停止液 100mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM EDTA、0.1% Tween20
□ NaOH洗浄液 I 150mM NaOH、0.5% Brij35P
□ NaOH洗浄液 II 100mM NaOH、0.5% Brij35P
□ 中和緩衝液 100mM NaCl、100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、0.1% Tween20
□ オリゴ固相化ビーズ(カスタム合成、Chemgene社)1 (図19B)
□ 合成DNA
□ Bst 3.0 DNA Polymerase(NEB)
□ Exonuclease I(NEB)
□ 血清培地 RPMI1640(和光純薬)、10%FCS、ペニシリン・ストレプトマイシン(和光純薬)、50μM 2-メルカプトエタノール
□ ACK溶解緩衝液 0.15M NH4Cl、0.01M KHCO3、0.1mM
Na2EDTA、pH7.2~7.4
□ 70μm セルストレイナー(コーニング社)
□ MACS分離用磁気装置(ミルテニー バイオテク社)
□ CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail(ミルテニー バイオテク社)
□ Anti-Biotin MicroBeads(ミルテニー バイオテク社)
□ MACS LSカラム(ミルテニー バイオテク社)
□ MACS緩衝液 PBS、2mM EDTA、0.5% BSA
□ 100μm フィルター
□ 40μm フィルター
□ 細胞溶解液 200mM Tris-HCl(pH7.5)、6%フィコールPM400(GEヘルスケア社)、0.2%サルコシル(20% N-Lauroylsarcosine sodium salt、シグマ アルドリッチ社)、20mM EDTA、1.5M Betaine、0.2 ×SSC、5% DMSO
□ 1M DTT
□ 細胞用緩衝液 PBS、0.01% BSA
□ Droplet Generator オイル for EvaGreen(バイオラッド社)
□ パーフルオロオクタノール (PFO、シグマ アルドリッチ社)
□ 6×SSC
□ Superscript IV (サーモフィッシャー サイエンティフィック社)□ 10mM dNTPs(プロメガ社)
□ RNasin(登録商標) Plus RNase Inhibitor(プロメガ社)
□ KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPAバイオサイセンス社)
□ TSOオリゴ:GTCGCACGGTCCATCGCAGCAGTCACAGG(lG)、lG:LNAオリゴ(配列番号40)
□ TSO PCRプライマー:GTCGCACGGTCCATCGCAGCAGTC(配列番号41)
□ SMART PCRプライマー:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(配列番号42)
□ TSO_TAGプライマー:GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGTCGCACGGTCCATCGCAGCAGTC(配列番号43)
□ SMART_TAGプライマー:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(配列番号44)
□ Nextera XT Index Kit v2 SetA(illumina社)
□ Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter社)
□ EB緩衝液(5mM Tris-HCl、pH8.5)
□ Qubit dsDNAアッセイキット(サーモフィッシャー サイエンティフィック社)
Tリンパ腫細胞株(EL-4)
マウス脾臓細胞(C57BL/6)
1. オリゴビーズの作成
(1) ChemGene社より入手したカスタムオリゴビーズ(10μmoleスケール)を30mLのTE/TWに懸濁し、1,000g、1分間遠心を行って洗浄する(2回繰り返し)。ビーズの洗浄および回収は、緩衝液に懸濁した後に1,000g、1分間の遠心により容易に回収できる。スイングロータを用い、ビーズを吸い込まないよう慎重に緩衝液を除去する
(2) ビーズ数を血球計数盤を用いてカウントする(図19C)。500,000ビーズ/mLになるようにTE/TW溶液で懸濁し、冷蔵保存する。TE/TW中で長期間冷蔵保存できる。ChemGene社製ビーズはトヨパールHWを使用しており、ビーズは約30μm径である。
(3) ビーズ懸濁液1mL(500,000ビーズ)をエッペンドルフチューブに分取し、1,000g、1分間遠心する。
(4) 500μLの1×Isothermal緩衝液(NEB社)に懸濁し、1,000g、1分間遠心する(次のエクステンション反応用緩衝液での前洗浄を行うため)。
(5) 次のオリゴエクステンション反応液を準備し、(4)のビーズに加える。
(6) 85℃、2分間保温した後、60℃、20分間保温する。
(7) 2μL Bst 3.0ポリメレース(800U/μL)を添加し、60℃、1時間30分間、加温ローテーターで反応する。酵素反応中にビーズが沈降するため、均一な反応を保つため加温ローテーターの使用が望まれる。
(8) 1mLのBst反応停止液を加え、30分間インキュベートし、1,000g、1分間遠心する(2回繰り返す)。
(9) エキソヌクレアーゼI処理をおこなうため、1mLの1×エキソヌクレアーゼ緩衝液を加え前洗浄し、1,000gで1分間遠心する(未反応のビーズ結合オリゴを除去するため、一本鎖DNAを分解処理する)。
(10) 次のエキソヌクレアーゼI反応液を調製し、ビーズを懸濁する。
(11) 終濃度1U/μLになるように2.5μL エキソヌクレアーゼI(20U/μL)を加え、37℃、45分間、加温ローテーターで反応させる。
(12) 1mLのTE/SDSに懸濁し、1,000g、1分間遠心する(2度繰り返す)。
(13) 1mLのNaOH洗浄液Iに懸濁し、1,000g、1分間遠心する(アルカリ洗浄によりビーズに結合する二本鎖DNAを変性して、一本鎖DNAプローブにする)。
(14) 1mLのNaOH洗浄液IIに懸濁し、1,000g、1分間遠心する(2度繰り返す)。
(15) 1mLのTE/TWに懸濁し、1,000g、1分間遠心する(2度繰り返す)。最終的に、5×105ビーズ/mLとなるようにTE/TWに懸濁し、使用するまで冷蔵保存する。
<マウスT細胞株>
(1) 血清培地で培養したマウスTリンパ腫細胞株を800g、5分間遠心、細胞を回収する。
(2) 10mLの血清培地で洗浄する。
(3) 10mLの血清培地に懸濁し、75μmセルストレイナーを通してろ過する。細胞を血球計数盤でカウントする。
(1) マウス(C57BL/6、6週齢)を解剖し、脾臓を摘出する。細胞の調製は、細胞のダメージを軽減するため、できるだけシングルセル分離直前に行う。
(2) 10mLの血清培地を含む培養皿上で、スライドグラスのフロスト部を使って脾臓を軽くすりつぶす。
(3) 15mL遠沈管に血清培地を移し、デブリスが沈降するのを待つ。
(4) 上清を別の遠沈管に移し、800g、5分間遠心する。
(5) 上清を除いた後、2mL ACK溶解緩衝液を加え懸濁し、室温2分間放置して、赤血球を壊す。
(6) 10mLの血清培地を加え溶血を止め、800g、5分間遠心する。
(7) 10mLの血清培地に懸濁し、75μmセルストレイナーを通してろ過する。細胞を血球計数盤でカウントする。
(1) 1×108細胞溶液を分取し、800g、5分間遠心する。
(2) 10mLの氷冷MACS緩衝液に懸濁した後、800g、5分間遠心する。
(3) 400μLのCD8α+ T Cell Biotin-Antibody Cocktailを加え、氷上5分間静置する。
(4) 300μLのMACS緩衝液を加え、次いで200μLのAnti-Biotin Microbeadsを加え、氷上で10分間静置する。
(5) その間、LSカラムを磁気分離装置に装着し、3mLのMACS緩衝液を加え、カラムを再生する。
(6) 1mLの細胞懸濁液をLSカラムにロードし、通過画分(flow-through)を集める。
(7) さらに、3mLのMACS緩衝液を加え、すべての通過画分を回収する。
(8) 6mLの血清培地を加え、800g、5分間遠心する。
(9) 10mLの血清培地を加え、800g、5分間遠心する。
(10) 4mL血清培地を加え、細胞をカウントする。
3-1.ドロマイトバイオ社シングルセル分離装置のセットアップ(微細繊維の混入がラインを詰まらせる原因になるので、埃などが落ちないように実験台を清潔にし、クリーンルーム用無塵ワイパー等を用いるとよい。)
(1) コンプレッサーを起動し、PCと制御用専用ソフト(Mitos Flow Control Center)を起動する
(2) 各ラインの接合を確認するともに、マイクロスコープ下で流路がモニタで確認できるようマイクロチップを装着する
(3) Pポンプ内のボトルに、ろ過滅菌水およびコントロールオイルをセットする。ラインに入れるすべての試薬はあらかじめフィルターろ過をしておく。界面活性剤を含むEvaGreen Droplet Oilは高価なため、試行時にはNovec7700やFC40(スリーエム社)を用いるとよい。
(4) 細胞用ラインおよびビーズ用ラインは流速40μL/分に、オイル用ラインは200μL/分にセットし、テストフローを実施する。流速を変えることでドロップレットサイズを調整できる。本条件では85μm程度であるが、30μL/分(細胞)、30μL/分(ビーズ)、166μL/分(オイル)では100μm径程度に調整できる。
(5) マイクロスコープにてドロップレットが問題なく形成されていることを確認する。
(6) 1.5×105ビーズを分取し、1,000g、1分間遠心し、ペレットダウンする。
(7) 500μLの溶解緩衝液を加え、ビーズを前洗浄し、1,000g、1分間遠心する。
(8) 500μLの溶解緩衝液を加え、3×105ビーズ/mLに調整する。
(9) 70umフィルターでろ過した後、1mLシリンジで吸引する。
(10) 500μLのサンプルループにビーズを注入するためバルブを切り替え、シリンジを転倒混和しながらが、ゆっくりとビーズを注入する。ビーズが沈殿しないようにシリンジを転倒混和しながら操作する。
(11) ビーズラインの流速は40μL/分にセットし、バルブは閉めた状態でスタンバイする。
(12) 血清培地に懸濁した1×106細胞を分取し、800g、5分間遠心する。
(13) 10mL PBS/BSAに懸濁し、800g、5分間遠心する。
(14) 3×105細胞/mLになるようにPBS/BSAに懸濁し、70μmフィルターでろ過した後にPポンプ内にボトルをセットする。細胞が劣化しないよう氷冷する。(15) スターラーバーで攪拌しながら、流速40μL/分でRUNする。
(16) コントロールオイルが入ったボトルを取り出し、ドロップレット用Droplet Generation Oil for EvaGreenをPポンプ内に設置する。
(17) 流速を200μL/分にセットし、オイルが流れドロップレットが形成されていることを確認する。
(18) マイクロチップから出るドロップレットを回収するため、アウトプットラインをチューブにセットする。
(19) ビーズラインを開放し、マイクロチップ内にビーズを流す。モニタ画面を見ながら、ビーズが流れ、ドロップレットが形成されていることを確認する(図19D)。この条件で4,000/秒のドロップレットが形成され、20ドロップレットのうち1つにビーズが封入される。
(20) 15分から20分間ドロップレットを回収する。モニタ画面上でビーズがなくなったことを確認する。回収したドロップレット溶液は、上層ドロップレット、下層オイルの2層が確認できる。
(1) ドロップレットをチューブに回収し、下層のオイルを除去する。チップの先でオイルを吸い取ることで除去する。以降の操作はできるだけ迅速に行う。
(2) 上層(白色)のドロップレットをすべて8連マイクロチューブに分注する。
(3) ドロップレットを75℃2分、65℃から50℃まで30秒間隔で1℃温度を下げていきアニーリングを行う。完了後、氷上で保管する。
(4) すべてのドロップレットを50mLコニカルチューブに移し、冷却した10mLの6×SSC溶液を加える。
(5) 500μLのパーフルオロオクタノール(PFO)を加え、激しくボルテックスする。
(6) 1,000gで1分間遠心し、上清を慎重に除去する。ビーズは白色の層を形成する。6×SSC中でビーズが浮き上がることがあるので注意する。ビーズが沈降しない場合は、再度遠心するか、25μmフィルターで回収することができる。同時に、底部にたまったオイル層(透明)も除去する。
(7) 10mLの6×SSCを加え、激しくボルテックスした後、再度1,000g、1分間遠心する。上清を慎重に取り除き、ビーズを洗浄する(2度繰り返す)。
(8) 白色ビーズをエッペンドルフチューブに移し、1,000g、1分間遠心し、上清を除去する。
(1) ビーズペレットに100μLの5×RT緩衝液を加え、1,000g、1分間遠心して前洗浄する。
(2) 次の逆転写反応液を調製し、ビーズに加える。
(3) 2μLのSuperScript IV(200U/μL)を加え、ヒートローテーターで1時間30分間、50℃で保温する。
(4) 100μLのTE/SDS溶液を加え、1,000g、1分間遠心して上清を除去する。
(5) 100μLのTE/TW溶液を加え、1,000g、1分間遠心して上清を除去する(2度繰り返す)。
(6) 100μLの1×エキソヌクレアーゼ緩衝液を加え、1,000g、1分間遠心して前洗浄する。
(7) 次のエキソヌクレアーゼ反応液をビーズに加える。
(8) 1μLのエキソヌクレアーゼ(20U/μL)を添加し、37℃で30分間ヒートローテーターで保温する。
(9) 100μLのTE/SDS溶液を加え、1,000g、1分間遠心して上清を除去する(2度繰り返す)。
(10) 100μLのTE/TW溶液を加え、1,000g、1分間遠心して上清を除去する(2度繰り返す)。
(1) 100μLのDWを加え、1,000g、1分間遠心して上清を除去する。
(2) 次のプレPCR反応液を調製し、ビーズに加える
(3) 15μLのPCR産物に12μLのAmpureビーズを加え、室温5分静置する。
(4) マグネットプレート上で室温2分間静置し、上清を除去する。
(5) 200μLの70%エタノールで洗浄する(2度繰り返す)。
(6) 完全に70%エタノールを除去した後、1分間ドライアップする。
(7) 15μLのEB緩衝液(5mM Tris-HCl、pH8.5)を添加して、ボルテックスして1分間静置する
(8) マグネットプレート上で室温2分間静置し、上清を新しいチューブに回収する
(9) 次のPCR反応液を調製し、2μLの精製したプレPCR反応液を加え、次のサイクルでPCRを行う。
(10) PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動で確認する。
(11) (3)~(8)同様のAmpureビーズによる精製によりPCR産物を回収する。
(12) INDEXタグ付加用PCR反応液を調製し、2μLの精製したPCR反応液を加え、次のサイクルでPCRを行う。
(13) (3)~(8)同様のAmpureビーズによる精製によりPCR産物を回収する。
(14) INDEX PCR用のPCR反応液を調製する。2μLの精製したタグPCR反応液を加え、次のサイクルでPCRを行う。
(15) (3)~(8)同様のAmpureビーズによる精製によりPCR産物を回収する。
(16) 精製したINDEX PCR産物について、Qubit dsDNAアッセイキットを用いてQubit3.0フルオロメーターにてDNA量を測定する。
(17)4pMになるようにPCR産物を希釈し、30万から100万リードを目標にMiSeqにてシーケンスを実施する。
シーケンスデータのマウスTCRリファレンス配列によるV,D,J領域配列のアサインメント、リード集計などの解析はRepertoire Genesis社が開発したレパトア解析用専用ソフトウェアにより行われた。入手可能なTCR解析ソフトとしては、MiXCRやIMGTが提供するHighVQuestなどが知られており、それらのソフトウェアを用いることもできる。リード配列間のバーコードマッチングはRのBiostringsや類似のパッケージを用いて行うことができる。
実施例1-1で用いたフローサイトメーターによるソーティング後の解析と、実施例1-3に記載されたドロップレットベースの手法とは、目的によって使い分けることができる。高機能TCRを見出すことが目的であれば、高々数百個以内のシングルセル解析が対費用効果的にも優れており、低頻度に存在するTCRを(ナイーブ分画のTCRやshared TCRなど)網羅的に解析することが目的であれば、費用はかかるものの、ドロップレットによる解析が有利であると考えられる。
(概要)
本実施例では、TCR遺伝子を標的としたゲノム編集による内因性TCR遺伝子の完全な除去を実証する。
[Platinum TALENの作製]
Platinum TALENの作製キット(Platinum Gate TALEN Kit、http://www.addgene.org/kits/yamamoto-platinumgate/)を用いて、製造者のプロトコール(http://www.addgene.org/kits/yamamoto-platinumgate/#protocols-and-resources)に従い、内因性TCR遺伝子を標的とするPlatinum TALENを作製した。
(1)TRAあるいはTRB遺伝子切断用のLeft(L)-TALENとRight(R)-TALENのプラスミドをSmaIで30℃x2時間処理した。
(2)Proteinase Kで50℃x20分処理したのち、QIAGEN PCR Purification Kitにて精製した。
(3)mMESSAGE MACHINE T7 Kit(Life technologies)、続いてpoly(A) Tailing Kit(Life technologies)にてmRNAを合成しLiCl沈殿法で精製(Manufacture’s instructionの通り)した。
(1)Jurkat細胞を、RPMI1640+ 10%FBS+ 2mmol/l L-Glutamin+ 1% penicillin/streptomycin で3日間培養した。
(2)以下の手順により、TCRα遺伝子を標的にする場合には、TALEN-TCR-alpha2_L19(TCRα-L-TALEN) mRNAおよびTALEN-TCR-alpha2_R19(TCRα-R-TALEN) mRNAそれぞれ10μgずつを、TCRβ遺伝子を標的にする場合にはTALEN-TCR-beta1_L19(TCRβ1-L-TALEN) mRNAおよびTALEN-TCR-beta1_R19(TCRβ1-R-TALEN) mRNAの対、またはTALEN-TCR-beta3_L19(TCRβ3-L-TALEN) mRNAおよびTALEN-TCR-beta3_R19(TCRβ3-R-TALEN) mRNAの対を培養Jurkat細胞に導入(SE CellLine 4D-NucleofectorTM X Kit
S))した。
(2-1)Jurkat細胞5×105~1×106cellを遠心(400G、10分、室温)により細胞ペレットにした。
(2-2)1反応あたりNucleofector SE solution 16.4μlにSupplement 3.6μlを加え合計20μlのNucleofector solutionで細胞ペレットを懸濁した。
(2-3)TCRα遺伝子標的用あるいはTCRβ遺伝子標的用TALEN mRNA
の対をそれぞれ10μgずつ添加した。
(2-4)Amaxa 4D-Nucleofector(プログラム:プログラム:CL-120)を用いてNucleofectionを行った。
Jurkat細胞にTALEN mRNAを導入後にFACSで確認されたCD3陰性分画が出現しているのを確認した。CD3陰性分画をソーティングした細胞はFACSでTCR(内因性)も陰性となっていることを確認した。FACSで得られたCD3の発現強度は、FACS解析ソフト(Flow Jo)で解析した。
(1)抽出したゲノムDNAを用いてPCRを行った。PCRは最終濃度1xバッファー、200μM dNTP、0.4μM プライマー、2.5~5ng DNA、Excellent Taq HS(アプロサイエンス)の反応混合物中で、94℃ 10分の後、94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分を30サイクルし、さらに72℃ 5分の反応を行った。
(2)プライマー配列は以下の通りであった。
(3)1% agarose ゲルで電気泳動し、DNAをGel Extraction kit(QIAGEN)を用いて抽出した。
(4)抽出したDNAを200~250ngを95℃ 5分加熱した後、室温に戻して再アニーリングした。
(5)T7 Endonuclease Iを加え、37℃で30分処理した。その後2%ゲルで電気泳動して確認した。
結果は、図3に示される。それぞれのTCR遺伝子を標的としたゲノム編集により、各内因性TCR遺伝子がノックアウトされたことが理解される。また、図4には、T7E1アッセイの結果を示しており、図4から、TCR遺伝子のノックアウトがゲノム編集によるものであることが理解される。
(概要)
本実施例では、システイン変異TCR導入ベクターを用いて、ミスペアリングを生じずにTCR遺伝子をT細胞に発現させることができることを実証する。また、実施例2で実証した内因性TCR遺伝子の除去と併せてTCR遺伝子の導入を行い、導入TCRのみを発現するT細胞を作出できることを実証する。
(1)T細胞をCD3/28ビーズで刺激し、X-VIVO20+ 10%AB serum+ 2mmol/l L-Glutamin+ 1% penicillin/streptomycin で3日間培養した。
(2)Amaxa 4D-Nucleofectorを用いて、以下の手順によりTCRα-L-TALEN mRNAとTCRα-R-TALEN mRNAを培養T細胞に導入(P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit S)した。
(2-1)T細胞5×105~1×106cellを遠心(400G、10分、室温)により細胞ペレットにした。
(2-2)1反応あたりNucleofector P3 solution 16.4μlにSupplement 3.6μlを加え合計20μlのNucleofector solutionで細胞ペレットを懸濁した。
(2-3)TCRα-L-TALEN mRNA、TCRα-R-TALEN mRNAをそれぞれ10μgずつ添加した。
(2-4)Nuceofection(プログラム:EO-115)を行った。
(2-5)再び培養を継続した。
(2-6)Nucleofectionの3日後にTCR遺伝子の切断効率をフローサイトメトリーによるCD3およびTCRαまたはβの発現喪失で確認した。
(3)CD3陰性分画をマグネットソーティングあるいはFACS(AriaII)により回収した。
(4)(3)で得られたCD3陰性T細胞に、下記で詳述する手順に従って、目的のTCR遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。
(5)翌日にFACSでTCR陽性CD3陽性分画が出現していることを確認した。
(6)CD3陽性分画をマグネットソーティングあるいはFACS(AriaII)により回収した。
(7)(6)で得られたCD3陽性T細胞に(2)と同じ手法でTCRβ3-L-TALEN mRNAとTCRβ3-R-TALEN mRNAを導入した。
(8)CD3陰性分画をマグネットソーティングあるいはFACS(AriaII)により回収した。
(9)(8)で得られたCD3陰性T細胞に再度同様の手順により目的のTCR遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。
(10)CD3陽性分画が出現していることを確認しマグネットソーティングあるいはFACS(AriaII)により回収した。
上記手順中のTCR遺伝子の導入は、以下の手順で行った。
Day1:
(1)PLAT-GPを10cmデッシュにまき70%コンフルエントにした。
(2)OPTI-MEMI 1.4mlにベクター10μg、VSV-G 5μgを加え室温5分静置した。
(3)OPTI-MEMI 1.4mlにLipofectamine2000を50μl加え室温5分静置した。
(4)上記の(2)と(3)を混合し室温20分静置した。
(5)(4)の混合液をPLAT-GPの培養液に加え48時間培養した。
(1)PLAT-GPから上清を回収し遠心(1500 rpm x5 min, 4℃)した。
(2)上清を0.45μMフィルターに通してさらに遠心(6000G x16 hr, 4℃)した。
培養中のTCR欠損T細胞を、24wellプレートに5×105/wellとなるように分注した。
(1)Day 4-1(2)の遠心tubeの上清を除きペレットをX-VIVO20
500μlで懸濁し、ウイルス液を作成した。
(2)前日に分注したTCR欠損細胞の培地にウイルス液を加えて遠心(2000 rpm x30 min, 32℃)した後、24時間培養を継続した。翌日に生細胞中のGFP陽性細胞(フローサイトメトリー)の比率により感染効率を確認した。
(1)pMXs-IRES-GFPベクターをBamHIとNotIで切断した。
(2)各結合部にoverlap配列が来るようプライマーをデザインした。具体的には以下のとおり:
(3)各断片を(2)のプライマーを用いてPCRで増幅した。
(4)(1)と(3)で得られた断片を精製した。
(1)の断片(ベクター)を25ng/μlとなるよう精製した。
(2)の断片(Vα、Cα、Vβ、Cβ)がそれぞれ10ng/μlとなるよう精製した。
(5)Gibson assembly reaction (NEB, Gibson Assembly Master Mix, Manufacture’s Instruction通り)を行った。Gibson Assembly Master Mix 5μlにベクター 1μl、Vα0.75μl、Vβ0.75μl、Cα0.75μl、Cβ0.75μlを加えて50℃ 1時間。
(6)(5)の反応液を4倍希釈しコンピテントセル(JM109)に形質転換した。
(7)MiniprepでDNAを精製しシーケンスで確認した。
導入ベクターとしては、pMXs-IRES-GFP Retroviral Vector(Cell Biolabs, Inc.)をバックボーンとして用いた。ベクターの模式図は図5に示されている。導入しようとするTCRβ鎖のV領域と、TCRβ鎖の定常領域(Cβ)と、P2A配列と、導入しようとするTCRα鎖のV領域と、TCRα鎖の定常領域(Cα)を、この順にpMXs-IRES-GFP Retroviral Vectorの導入配列部分に組み込んで使用した。このようなベクターの作製については、Incorporation of Transmembrane Hydrophobic Mutations in the TCR Enhance Its Surface Expression and T Cell Functional Avidity Astar Haga-Friedman, Miryam Horovitz-Fried and Cyrille J. Cohen J Immunol 2012; 188:5538-5546; Prepublished online 27 April 2012に記載されている。
健常者末梢血に存在するCMVpp65 QYD抗原特異的CD8+T細胞からhTEC10を用いてQYD特異的TCRαβ遺伝子を取得し、導入遺伝子として用いた。
導入を行ったT細胞のQYD抗原に対する結合性を測定し、TCRの導入を確認した。Treg(QYD-Treg)の抗原特異性があるかをQYDテトラマー染色で確認した。
制御性T細胞に対して導入を行った結果は、図5および6に示される。フローサイトメトリー分析の結果から、改変後のT細胞において、導入されたTCRのみが発現されていることが理解される。
(概要)
実施例3の手法に従って作製した抗原特異的制御性T細胞の性質を以下のとおり評価した。
実施例3の手法に従って作製した抗原特異的制御性T細胞、ポリクローナル制御性T細胞およびTCRノックアウト制御性T細胞と、対照(CD25が陰性のCD4陽性T細胞分画)を下記の抗体で染色し、FACSで測定し蛍光強度をFACS解析ソフト(flow jo)で解析し、TCRを置換したTregとポリクローナルTreg(TCR置換前)の性質に差がないかを検証した。
抗体:Anti-human CD25 antibody、Anti-human CD127 antibody、Anti-human FoxP3 antibody、Anti-human CTLA-4 antibody、Anti-human HELIOS antibody。
実施例3でTCR置換によって得られたTreg(QYD-Treg)がQYDペプチド抗原を認識し増殖するかを確認した。より詳細には、以下のとおりである。
(1)QYD-Tregを遠心によりペレットにPBS 1mlで懸濁した。
(2)1μLのCell trace violetを加え(Invitrogen, CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, cat#C34557 )、37℃で20分暗所で静置した。
(3)PBSで2回洗浄(300G, 10min, 室温)した。
(4)ペプチドパルスした抗原提示細胞とcell trace voletで標識したQYD-Tregの細胞数が1:1となるようにT cell培地中(X-VIVO20+ 10%AB serum+ 2mmol/l L-Glutamin+ 1% penicillin/streptomycin)で混合し96wellプレート内で5日間培養した。
(5)FACSでCell trace violetの蛍光強度が減弱しQYD-Tregが***していることを確認した。
TCR置換によって得られたTreg(QYD-Treg)がQYD-Teffの抗原特異的増殖を抑制するかを確認した。より詳細には、以下のとおりである。
Miltenyi CD8 マイクロビーズ, ヒト(130-045-201)を使用Miltenyi CD4+ T Cell アイソレーションキット, ヒト(130-096-533)を使用:
(1)末梢血50mLからFicoll-Paque PREMIUMでPBMCsを分離し、遠心(400G, 10min, 室温)により細胞ペレットを作成した。
(2)ペレットを80μLのMACS Bufferで懸濁し、20μLのCD8 MicroBeadsを加えた。
(3)4℃で15分静置した。
(4)MACS Bufferで洗浄した(300G, 10 min, 室温)。
(5)計500μLとなるようにMACS Bufferを加え、Magnetic separationによりCD8-の分画を回収し遠心(400G, 10min, 室温)により細胞ペレットを作成した。
(6)ペレットを40μLのMACS Bufferで懸濁し、10μLのT Cell Biotin-Antibody Cocktailを加えた。
(7)4℃で5分静置した。
(8)30μLのMACS Bufferと20μLのCD4+T Cell MicroBead Cocktailを添加した
(9)4℃で10分静置した。
(10)合計500μLとなるようにMACS Bufferを加え、Magnetic separationによりCD4-の分画を回収(CD4-8-T細胞となっている)した。
(1)A.で回収したCD4-8- cellを1mlのX-XIVO20で懸濁した。
(2)ペプチド(ここではQYDPVAALF:QYD(配列番号92))を1μMとなるよう加えた。
(3)室温で2時間静置した。
(4)35Gyのγ線照射を行った。
(1)QYD-TCRを遺伝子導入したCD8+ T cell(QYD-T eff)を遠心によりペレットにPBS 1mlで懸濁した。
(2)1μLのCell trace violetを加え(Invitrogen,
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, cat#C34557 )、37℃で20分暗所で静置した。
(3)PBSで2回洗浄した(300G, 10min, 室温)。
(4)B.の工程でペプチドパルスした抗原提示細胞とcell trace violetで標識したQYD-Teffの細胞数が2:1となるようにT cell 培地中(X-VIVO20+ 10%AB serum+ 2mmol/l L-Glutamin+ 1% penicillin/streptomycin) で混合し96 wellプレートにまいた。
(5)C.(4)の各wellにTreg(所望のTCRが導入されたTreg,)の細胞数を調整し、CD8+ T cellとの細胞数の比が16:1、8:1、4:1、2:1、1:1となるように加えた。
(6)5、7日目にFACSで各細胞比率の条件でのcell trace violetの蛍光強度を測定しQYD-Teffの増殖抑制を確認した。
(概要)
本実施例は、本発明の方法に従って製造した抗原特異的制御性T細胞が自己免疫疾患への応用可能性を有することを、in vitroで実証することを目的とする。
(1)健常者の検体から、hTEC10を用いてMART-1特異的TCRαβペア遺伝子をクローニングする。
(2)Platinum TALENにより、制御性T細胞のTCRゲノムを編集し、内因性TCRの発現を排除する。
(3)ゲノム編集後の制御性T細胞を増殖させる。
(4)増殖させた制御性T細胞へクローニングしたTCRαβペア遺伝子を導入する。
(5)TCR遺伝子を導入した制御性T細胞と共培養することによる、MART-1抗原特異的なエフェクターT細胞などのMART-1抗原への応答性の変化を評価する。
2人の健常者の検体から、hTEC10を用いて18種類以上のMART-1特異的TCRαβペア遺伝子をクローニングすることが可能である。これらのMART-1特異的TCRのMART-1に対する結合性を評価し、最も高機能なTCRを選択するとともに、該TCRの遺伝子を導入したMART-1抗原特異的Tregの作成が可能であり、自己免疫疾患のモデル抗原としてのMART-1抗原に対する免疫応答を、上記のTCR置換Tregが抑制する。
(概要)
本実施例では、in vivoでの抗原特異的制御性T細胞の自己免疫疾患への応用可能性の実証を目的として、製造した抗原特異的制御性T細胞による免疫抑制を動物モデルで示す。本実施例の概要は、図16に示される。
以下のマウスおよび自己抗原を用いて、以下のモデル疾患への応用可能性を検証する。モデルマウス:NOD(non-obese diabetic)マウス
モデル自己抗原:GAD65
モデル疾患:I型糖尿病
(1)7日齢のNODマウスにGAD65由来のペプチド抗原p546(30μg)を出生後7日目、9日目、11日目に経鼻的に投与する。
(2)(1)の方法で免疫した4週齢の雌マウスから、H-2Kd/p546テトラマーを用いてp546反応性エフェクターCD8+T細胞(p546-Teff)をフローサイトメトリーで分離する。
(3)p546-TeffのTRAV、TRBVを次世代シーケンサーで網羅的に同定し、高頻度クロノタイプの存在を確認した後、単一細胞クローニングによりペア同定する。(4)上記の(1)-(3)の過程によって同定されたp546抗原反応性TCR(p546-TCReffを、内因性TCRの発現を欠いたマウスT細胞株にレトロウイルスベクターを用いて導入し、それらの機能的階層性を決定する。
(5)4週齢の雄NODマウスの脾・リンパ節・末梢血より、ビーズカラム法によってCD4+CD25+制御性T細胞を分離し、Platinum TALENを用いてTCRをノックアウトする。
(6)(4)の過程によって得られた高機能p546-Teff-TCRの候補を、TCRをノックアウトしたCD4+CD25+制御性T細胞に導入する(p546-Teff-TCR発現Treg)。
(7)Mockベクターを導入したTregおよびp546-TCReffを導入したTregを抗CD3/CD28抗体およびIL-2存在下に増幅し、I型糖尿病を発症したNODマウスに輸注し、膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が得られるかを比較する。
Mockベクターを導入したTregを輸注したNODマウスにおいては、膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が見られないが、p546-TCReffを導入したTregを輸注したNODマウスにおいては膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が見られる。
(概要)
マウスTCR切断用にPlatinum TALENを作成し、レポータープラスミドを用いたアッセイ法(SSAアッセイ)により切断活性を評価した。
マウスTCR切断用に、3種類のPlatinum TALEN(TRA2-TALEN、TRB1-TALEN、TRB2-TALEN)を作成した。
マウスTRA2-TALEN、マウスTRB1―TALEN、マウスTRB2-TALENは、それぞれ、マウスのTRA遺伝子Cα2領域、TRB遺伝子Cβ1領域、TRB遺伝子Cβ2領域内に切断部位を含むように設計した。それぞれの標的配列は、
マウスTRA2-TALEN:左側TCTGCCTGTTCACCGACT(配列番号130)および右側AATGTGCCGAAAACCATGGA(配列番号131)、
マウスTRB1―TALEN:左側TGACTCCACCCAAGGTCTCC(配列番号132)および右側AAAAGCAGAGATTGCAAACA(配列番号133)、
マウスTRB2-TALEN:左側TGTGCTTGGCCAGGGGCTTC(配列番号134)および右側GGAGCTGAGCTGGTGGGTGA(配列番号135)
であった。Platinum TALENの調製手順は、(実施例2:内因性TCRの除去)の[Platinum TALENの作製]に従った。
結果を図28に示す。Zinc finger nucleaseコントロール(pSTL-ZFA36/ZFA36)の切断活性を1とする時、マウスTRA2-TALEN, マウスTRB1-TALEN, マウスTRB2-TALENの標的切断部位に対する活性は、それぞれ3.09倍、3.79倍、3.41倍であることがわかる。pSTLはZFA36の陰性コントロールであり、TRA2, TRB1, TRB2はそれぞれTALEN非存在下のレポーターのみの陰性コントロール、TRA2-TALEN/ZFA36, TRB1-TALEN/ZFA36, TRB2-TALEN/ZFA36はそれぞれレポーター遺伝子がZFA36の場合の陰性コントロールである。
本発明の方法に用いるために、以下のようなコンポーネントの1つまたは複数を含む製品を提供する。
(概要)
本実施例において、本明細書に記載の方法に従って、がん抗原特異的TCRを発現するT細胞を作出し、当該細胞の殺細胞活性を検証した。
標的エピトープとして、HLA-A*0201-restricted NY-ESO-1157-165(SLLMWITQC)(配列番号115)を選択した。かかるエピトープに特異性を有するTCRとして、可変領域の各セグメントにおいて以下の構成を有する1G4 TCRを用いた。
(1)1G4 TCRのVαカセット、Vβカセットを準備した(各塩基配列は下記)。
(2)pMXs-IRES-GFPベクターをBamHIとNotIで切断した。
(3)各結合部にoverlap配列が来るようプライマーをデザインした。具体的には以下のとおり:
(4)各断片を(3)のプライマーを用いてPCRで増幅した。
(5)(2)と(4)で得られた断片を精製した。
(2)の断片(ベクター)を25ng/μlとなるよう精製した。
(4)の断片(Vα、Cα、Vβ、Cβ)がそれぞれ10ng/μlとなるよう精製した。
(6)Gibson assembly reaction (NEB, Gibson Assembly Master Mix, Manufacture’s Instruction通り)を行った。Gibson Assembly Master Mix 5μlにベクター 1μl、Vα0.75μl、Vβ0.75μl、Cα0.75μl、Cβ0.75μlを加えて50℃ 1時間。
(7)(6)の反応液を4倍希釈しコンピテントセル(JM109)に形質転換した。
(8)MiniprepでDNAを精製しシーケンスで確認した。
以下の手順で細胞への1G4 TCRの導入を行った。TCR-null Jurkat細胞は、Miyama et al. Sci Rep 2017に記載される手順に基づき、CRISPR系を用いて作出した。primary T細胞は、ドナー末梢血から分離したT細胞を使用した。なお、TCR-null Jurkat細胞の作製過程でのCD3発現の変化については、図21に示している。
(1)PLAT-GPを10cmデッシュにまき70%コンフルエントにした。
(2)OPTI-MEMI 1.4mlにpMXs-IRES-1G4ベクター10μg、VSV-G 5μgを加え室温5分静置した。
(3)OPTI-MEMI 1.4mlにLipofectamine2000を50μl加え室温5分静置した。
(4)上記の(2)と(3)を混合し室温20分静置した。
(5)(4)の混合液をPLAT-GPの培養液に加え48時間培養した。
(1)PLAT-GPから上清を回収し遠心(1500 rpm x5 min, 4℃)した。
(2)上清を0.45μMフィルターに通してさらに遠心(6000G x16hr,
4℃)した。
培養中のTCR-null Jurkat細胞あるいはprimary T細胞を、24wellプレートに5×105/wellとなるように分注した。
(1)Day4-1-(2)の遠心tubeの上清を除きペレットをX-VIVO20
500μlで懸濁し、ウイルス液を作成した。
(2)前日に分注したTCR-null Jurkat細胞あるいはprimary T細胞の培地にウイルス液を加えて遠心(2000 rpm x30min, 32℃)した後、24時間培養を継続した。翌日に生細胞中のGFP陽性細胞(フローサイトメトリー)の比率により感染効率を確認した。
以下に示す手順により、作出したがん抗原特異的TCRを発現するT細胞の殺細胞活性を検証した。
B-LCL 2X106を24wellプレートに準備し、50μlの51CrとNY-ESO-1エピトープペプチド(SLLMWITQC(配列番号115))(最終濃度1ng/μl)を加え1時間培養した。
RPMI1640にて2回洗浄(300G, 10 min, 4℃)した。
SLLペプチド添加B-LCLを1X104/100μl RPMI1640に調整した。
同様にエピトープペプチドを添加していないB-LCL 1X104/100μl RPMI1640をコントロール用に調整した。
培養中のNY-ESO-1 SLL特異的TCR-Tを、最終的にエフェクター(NY-ESO-1 SLL特異的TCR-T):ターゲット(B-LCL)比が30:1、10:1、3:1、1:1になるように細胞数を調整(3X105/100μl RPMI1640、1X105/100μl RPMI1640、3X104/100μl RPMI1640、1X104/100μl RPMI1640)し、96wellプレートに分注した。
ポジティブコントロールとして、Triton X-100 100μlを96wellプレートに分注した。
ネガティブコントロールとして、RPMI1640 100μlを96wellプレートに分注した。
2.で準備した96wellプレートの各wellに1.で準備したB-LCLを100μl分注し4時間培養した。
各wellから100μlの上清をとってマイクロチューブに移し、各wellの上清中に放出された51Crのガンマ値をガンマカウンターで計測した。
{(各wellのガンマ値)-(ネガティブコントロールのガンマ値)}/(ポジティブコントロールのガンマ値)の計算式により、各wellのポジティブコントロールに対する殺細胞効果の割合(%lysis)を計算しグラフ化した。
TCR-null Jurkat細胞およびprimary T細胞への1G4 TCRの導入結果は、それぞれ図22および図23に示される。図22左図において、導入したTCRの発現効率は46.2%であり、図22右図において、SLLペプチドテトラマーへの結合能を有するTCR導入細胞の割合は46.8%であった。これらの双方で同様の効率が得られていることから、TCR-null Jurkat細胞に導入し、発現させたTCRのほぼ全てがSLLペプチドを認識していること、すなわち、ミスペアリングなく発現していることが示される。このことは、ゲノム編集を行ったT細胞に対して、pMXベクターが適合性であることを示している。primary T細胞については6.28%の導入効率であった(図23)。
(概要)
本発明の改変T細胞は、TAL-PITCh法によって、ウイルスベクターを用いずに作出することができる。
TAL-PITCh法を用いた内在性TCR欠損NY-ESO-1特異的T細胞の作成
以下に記載される手順に従って、内在性TCR欠損NY-ESO-1特異的T細胞を作成した。
(1)TRAあるいはTRB遺伝子切断用のLeft(L)-TALENとRight(R)-TALENのプラスミドをSmaIで30℃x2時間処理する。
(2)Proteinase Kで50℃x20分処理したのち、QIAGEN PCR
Purification Kitにて精製する。
(3)mMESSAGE MACHINE T7 Kit(Life technologies)、続いてpoly(A) Tailing Kit(Life technologies)にてmRNAを合成しLiCl沈殿法で精製(Manufacture’s instructionの通り)する。
TAL-PITChベクターは、TRA遺伝子切断用のLeft(L)-TALENとRight(R)-TALENで導入遺伝子の両端を切断され、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)修復により目的遺伝子がTRA遺伝子切断部位に組み込まれるように設計する(図24;四角で囲まれた部分がマイクロホモロジー配列を示す)。TRA遺伝子切断部位に目的遺伝子が組み込まれた後は、両端にTALEN結合部位が存在するも、切断部位までの十分なスペースがないためDNA二重鎖切断(DSB)は起こらない(図25)。TAL-PITChベクターは、TRA遺伝子の両アレルが切断されたことをフローサイトメトリーで確認するためEGFPを組み込んだベクターとmKate2を組み込んだベクターを準備する(図24および25ではEGFPを組み込んだベクターを示す)。臨床応用の際には選択マーカーとしてEGFP、mKate2をそれぞれCD20、CD34に置き換えたベクターを作成する。
(1)末梢血T細胞をCD3/28ビーズで刺激し、X-VIVO20+ 10%AB serum+ 2mmol/l L-Glutamin+ 1% penicillin/streptomycin で3日間培養する。
(2)Amaxa 4D-Nucleofectorを用いてTCRβ-L-TALEN
mRNAとTCRβ-R-TALEN mRNAを培養T細胞に導入する(P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit S)。
1)T細胞5×105~1×106cellを遠心(400G、10分、室温)により細胞ペレットにする.
2)1反応あたりNucleofector P3 solution 16.4μlにSupplement 3.6μlを加え合計20μlのNucleofector solutionで細胞ペレットを懸濁する。
3)TCRβ-L-TALEN mRNA、TCRβ-R-TALEN mRNAをそれぞれ10μgずつ添加する。
4)Nuceofection(プログラム:EO-115)を行う。
5)再び培養を継続する。
6)Nucleofectionの3日後にTCR遺伝子の切断効率をフローサイトメトリーによるCD3およびTCRαβの発現喪失で確認する。
(3)CD3陰性分画をマグネットソーティングあるいはFACS(AriaII)により回収する。
(1)2.で得られたTRB遺伝子切断T細胞をCD3/28ビーズで刺激し、X-VIVO20+10%AB serum+2mmol/l L-Glutamin+1% penicillin/streptomycinで3日間培養する。
(2)Amaxa 4D-Nucleofectorを用いてTCRα-L-TALEN
mRNAとTCRα-R-TALEN mRNAおよび2種類のTAL-PITChベクター(1G4-EGFPと1G4-mKate2)を培養T細胞に導入する(P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit S)。
1)T細胞5×105~1×106 cellを遠心(400G、10分、室温)により細胞ペレットにする.
2)1反応あたりNucleofector P3 solution 16.4μlにSupplement 3.6μlを加え合計20μlのNucleofector solutionで細胞ペレットを懸濁する。
3)TCRα-L-TALEN mRNA、TCRα-R-TALEN mRNA、1G4-EGFP TAL-PITChベクターおよび1G4-mKate2 TAL-PITChベクターをそれぞれ10μgずつ添加する。
4)Nuceofection(プログラム:EO-115)を行う。
5)再び培養を継続する。
6)Nucleofectionの3日後に1G4-EGFPおよび1G4-mKate2の導入効率をフローサイトメトリーによるEGFPおよびmKate2の発現で確認する。
(3)EGFPとmKate2がともに陽性である分画をFACS(AriaII)により回収する。
図27に示されるように、1G4TCRを発現する細胞集団を得ることができた。TAL-PITCh法によって、ウイルスベクターを用いずに内在性TCR欠損NY-ESO-1特異的T細胞を作出することができることが理解される。NY-ESO-1特異的TCRに換えて、所望の外因性TCRを導入することによって、所望の抗原特異性を有するTCRを発現する内在性TCR欠損T細胞をウイルスベクターを用いずに作出することができる。
以下に示す方法によって、作出細胞を限界希釈法等によってクローン化した後、全ゲノムシーケンシングを行い、細胞の特性を評価することができる。
1. 1.5mlマイクロチューブの底にQIAGEN Protease 20μlをピペッティング。
2. このマイクロチューブにPBS 200μlに懸濁した1X105個のT細胞を添加。
3. サンプルに200μlのBuffer ALを添加。
4. 56℃で10分間インキュベート。
5. 1.5mlマイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集する。
6. サンプルにエタノール200μlを添加し、15秒間ボルテックスした後、1.5mlマイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集する。
7. ステップ6の混合液をQIAamp Mini Spin Columnにアプライする。蓋を閉めて6,000xgで1分間遠心分離する。QIAamp Mini Spin Columnを新しい2mlコレクションチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。
8. QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW1を添加する。蓋を閉めて6,000xgで1分間遠心分離する。QIAamp Mini Spin Columnを新しい2mlコレクションチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。
9. QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW2を添加する。蓋を閉めて20,000xgで3分間遠心分離。
10. QIAamp Mini Spin Columnを新しい1.5mlマイクロチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。QIAamp Mini Spin Columnを開き、200μl精製水を添加。室温(20℃)で1分間インキュベートした後、6,000xgで1分間遠心しDNAを抽出する。
1. 1μgの高分子量DNAをBioruptor Pico(Diagenode, Belgium)で平均300bp程度に断片化処理し、Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)で処理後の状態を確認する。
2. 断片化後のDNAにエンドリペア、A-テーリング、インデックスアダプターライゲーションを行い、Agentcourt AMPure XP beads(Beckman Coulter, USA)で純化する。
3. 調整済みDNAライブラリーのサイズと濃度をAgilent Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)とBio-Rad real time PCR systemで品質確認する。
4. DNAライブラリーのシーケンスをmanufacture’s instructionにしたがってHiSeq Xten(Illumina, USA)で行い、Q30%以上かつカバレージ30xで得られたユニークリードの配列に基づき、全ゲノム配列を決定する。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本発明は、日本国特許庁に2017年10月10日に出願された特願2017-197010および日本国特許庁に2018年9月7日に出願された特願2018-167954に対して優先権主張を伴うものであり、それらの内容の全体が本明細書において参考として援用される。
配列番号2:HLA-A*02拘束性CMVpp65ペプチド
配列番号3:HLA-A2-HIV
配列番号4:BSL-18Eプライマー
配列番号5:P20EAプライマー
配列番号6:P10EAプライマー
配列番号7:CA1プライマー
配列番号8:CA2プライマー
配列番号9:CB1プライマー
配列番号10:CB2プライマー
配列番号11:HuVaFプライマー
配列番号12:HuVbFプライマー
配列番号13:B-P20EAプライマー
配列番号14:MID1
配列番号15:MID2
配列番号16:MID3
配列番号17:MID4
配列番号18:MID5
配列番号19:MID6
配列番号20:MID7
配列番号21:MID8
配列番号22:MID10
配列番号23:MID11
配列番号24:MID15
配列番号25:MID16
配列番号26:MID17
配列番号27:MID18
配列番号28:MID19
配列番号29:MID20
配列番号30:MID21
配列番号31:MID22
配列番号32:MID23
配列番号33:MID24
配列番号34:Aアダプター配列
配列番号35:P22EA-ST1-Rプライマー
配列番号36:Tag-1プライマー
配列番号37:Tag-2プライマー
配列番号38:CA-ST1-R
配列番号39:CB-ST1-R
配列番号40:TSOオリゴ
配列番号41:TSO PCRプライマー
配列番号42:SMART PCRプライマー
配列番号43:TSO_TAGプライマー
配列番号44:SMART_TAGプライマー
配列番号45:オリゴビーズ中のSMART配列
配列番号46:TALEN-TCR-alpha2_L19 プラスミド全長
配列番号47:TALEN-TCR-alpha2_R19 プラスミド全長
配列番号48:TALEN-TCR-beta1_L19 プラスミド全長
配列番号49:TALEN-TCR-beta1_R19 プラスミド全長
配列番号50:TALEN-TCR-beta3_L19 プラスミド全長
配列番号51:TALEN-TCR-beta3_R19 プラスミド全長
配列番号52:TALEN-TCR-alpha2_L19 TALENコーディング配列
配列番号53:TALEN-TCR-alpha2_L19 TALENアミノ酸配列
配列番号54:TALEN-TCR-alpha2_R19 TALENコーディング配列
配列番号55:TALEN-TCR-alpha2_R19 TALENアミノ酸配列
配列番号56:TALEN-TCR-beta1_L19 TALENコーディング配列
配列番号57:TALEN-TCR-beta1_L19 TALENアミノ酸配列
配列番号58:TALEN-TCR-beta1_R19 TALENコーディング配列
配列番号59:TALEN-TCR-beta1_R19 TALENアミノ酸配列
配列番号60:TALEN-TCR-beta3_L19 TALENコーディング配列
配列番号61:TALEN-TCR-beta3_L19 TALENアミノ酸配列
配列番号62:TALEN-TCR-beta3_R19 TALENコーディング配列
配列番号63:TALEN-TCR-beta3_R19 TALENアミノ酸配列
配列番号64:TCR-alpha2-f プライマー
配列番号65:TCR-alpha2-r プライマー
配列番号66:TCR-beta1-c1-f プライマー
配列番号67:TCR-beta1-c1-r プライマー
配列番号68:TCR-beta1-c2-f プライマー
配列番号69:TCR-beta1-c2-r プライマー
配列番号70:Vαクローニング用フォワードプライマー
配列番号71:Vαクローニング用リバースプライマー
配列番号72:Cαクローニング用フォワードプライマー
配列番号73:Cαクローニング用リバースプライマー
配列番号74:Vβクローニング用フォワードプライマー
配列番号75:Vβクローニング用リバースプライマー
配列番号76:Cβクローニング用フォワードプライマー
配列番号77:Cβクローニング用リバースプライマー
配列番号78:導入用TCRα定常領域
配列番号79:導入用TCRβ定常領域
配列番号80:α2Lの標的配列
配列番号81:α2Rの標的配列
配列番号82:β1Lの標的配列
配列番号83:β1Rの標的配列
配列番号84:β3Lの標的配列
配列番号85:β3Rの標的配列
配列番号86:TALEN_α2L結合ドメイン
配列番号87:TALEN_α2R結合ドメイン
配列番号88:TALEN_β1L結合ドメイン
配列番号89:TALEN_β1R結合ドメイン
配列番号90:TALEN_β3L結合ドメイン
配列番号91:TALEN_β3R結合ドメイン
配列番号92:QYDペプチド
配列番号93~110:ヒトTRAまたはTRBのCDR3配列の例
配列番号111~113:Platinum TALENのDNA結合モジュールのアミノ酸配列の例
配列番号114:Zhang TALENのDNA結合モジュールのアミノ酸配列の例
配列番号115:HLA-A*0201-restricted NY-ESO-1157-165
配列番号116:1G4 TCRA CDR3
配列番号117:1G4 TCRB CDR3
配列番号118:1G4 TCRのVαカセット
配列番号119:1G4 TCRのVβカセット
配列番号120~129:図24および25中の塩基配列
配列番号130:マウスTRA2-TALEN左側の標的配列
配列番号131:マウスTRA2-TALEN右側の標的配列
配列番号132:マウスTRB1―TALEN左側の標的配列
配列番号133:マウスTRB1-TALEN右側の標的配列
配列番号134:マウスTRB2―TALEN左側の標的配列
配列番号135:マウスTRB2-TALEN右側の標的配列
Claims (23)
- DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、TCR遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該DNA結合ドメインと該機能ドメインは、35~55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数であり、前記機能ドメインがDNA切断ドメインであり、前記DNA結合ドメインが、配列番号86のアミノ酸配列、配列番号87のアミノ酸配列、配列番号88のアミノ酸配列、配列番号89のアミノ酸配列、配列番号90のアミノ酸配列、または配列番号91のアミノ酸配列を含む、組成物。 - 前記DNA結合ドメインと前記機能ドメインは、40~50のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該DNA結合ドメインは、34のアミノ酸からなる16~20のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~5の自然数であり、
該DNA結合ドメインの由来は、TALEである、請求項1に記載の組成物。 - 前記DNA結合ドメインがTCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子に特異的に結合する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記DNA結合ドメインが、TRAC エクソン1、TRBC1 エクソン1、またはTRBC2 エクソン1に特異的に結合する、請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記DNA結合ドメインが、配列番号80の核酸配列、配列番号81の核酸配列、配列番号82の核酸配列、配列番号83の核酸配列、配列番号84の核酸配列、または配列番号85の核酸配列に特異的に結合する、請求項1~4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドをコードする前記核酸を含む発現ベクターを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドをコードする前記核酸を、mRNAの形で含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物を細胞に導入する工程を含む、TCR遺伝子を編集する方法(但し、ヒト体内で行われる方法を除く)。
- 前記DNA結合ドメインがTCRα遺伝子に特異的に結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物を細胞に導入する工程と、
前記DNA結合ドメインがTCRβ遺伝子に特異的に結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物を細胞に導入する工程と
を含む、請求項8に記載の方法。 - 前記TCR遺伝子の編集が、内因性TCR遺伝子の除去である、請求項8または9に記載の方法。
- 外因性TCR遺伝子を前記細胞に導入する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記外因性TCRが、NY-ESO-1に対する特異性を有する、請求項11に記載の方法。
- DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、TCR遺伝子を編集するための組み合わせ物であって、
ここで、該DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数であり、前記機能ドメインがDNA切断ドメインであり、前記DNA結合ドメインが、配列番号86のアミノ酸配列、配列番号87のアミノ酸配列、配列番号88のアミノ酸配列、配列番号89のアミノ酸配列、配列番号90のアミノ酸配列、または配列番号91のアミノ酸配列を含む、組み合わせ物。 - DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、該DNA結合ドメインと該機能ドメインは、35~55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~10の自然数であり、xは、1~40の自然数であり、yは、1~40の自然数であり、xとyは、異なる自然数であり、前記機能ドメインがDNA切断ドメインであり、前記DNA結合ドメインが、配列番号86のアミノ酸配列、配列番号87のアミノ酸配列、配列番号88のアミノ酸配列、配列番号89のアミノ酸配列、配列番号90のアミノ酸配列、または配列番号91のアミノ酸配列を含み、
該DNA結合ドメインがTCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子に特異的に結合する、
ポリペプチド。 - 前記DNA結合ドメインと前記機能ドメインは、40~50のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該DNA結合ドメインは、34のアミノ酸からなる16~20のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n-3番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-2番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n-1番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおける4番目のアミノ酸と32番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1~5の自然数であり、
該DNA結合ドメインの由来は、TALEである、請求項14に記載のポリペプチド。 - 前記DNA結合ドメインが、TRAC エクソン1、TRBC1 エクソン1、またはTRBC2 エクソン1に特異的に結合する、請求項14または15に記載のポリペプチド。
- 前記DNA結合ドメインが、配列番号80の核酸配列、配列番号81の核酸配列、配列番号82の核酸配列、配列番号83の核酸配列、配列番号84の核酸配列、または配列番号85の核酸配列に特異的に結合する、請求項14~16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項14~17のいずれか1項に記載のポリペプチドの全部をコードする核酸。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物または請求項13に記載の組み合わせ物と、
内因性TCR遺伝子の変異を確認する手段、および/または内因性TCR遺伝子の除去を確認する手段と
を備える、TCR遺伝子を編集するためのキット。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物または請求項13に記載の組み合わせ物と、
外因性TCR遺伝子を導入する手段、および遺伝子が導入された細胞を検出する手段と
を備える、TCR遺伝子を編集するためのキット。 - 内因性TCR遺伝子を外因性TCR遺伝子で置換するための、請求項20に記載のキット。
- TCR改変制御性T細胞を製造するための、請求項19~21のいずれか1項に記載のキット。
- NY-ESO-1に対する特異性を有する外因性TCRを発現するTCR改変T細胞を製造するための、請求項20または21に記載のキット。
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