JP7203367B2 - Gene transfer vectors for mammalian cells - Google Patents
Gene transfer vectors for mammalian cells Download PDFInfo
- Publication number
- JP7203367B2 JP7203367B2 JP2017239819A JP2017239819A JP7203367B2 JP 7203367 B2 JP7203367 B2 JP 7203367B2 JP 2017239819 A JP2017239819 A JP 2017239819A JP 2017239819 A JP2017239819 A JP 2017239819A JP 7203367 B2 JP7203367 B2 JP 7203367B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- vector
- protein
- foreign gene
- egfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 225
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 155
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims description 26
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 127
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 81
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 80
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 54
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 54
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 54
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 26
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 18
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 4
- 101000888841 Homo sapiens Glutamine synthetase Proteins 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 122
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 83
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 60
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 51
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 27
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 101000941879 Homo sapiens Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 Proteins 0.000 description 23
- 101100234553 Arabidopsis thaliana KO gene Proteins 0.000 description 21
- 102100032693 Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 Human genes 0.000 description 21
- 101100326503 Oryza sativa subsp. japonica CYP701A7 gene Proteins 0.000 description 21
- 101100326504 Oryza sativa subsp. japonica CYP701A8 gene Proteins 0.000 description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 21
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 20
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 16
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 12
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 11
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100031934 Adhesion G-protein coupled receptor G1 Human genes 0.000 description 2
- 101710096372 Adhesion G-protein coupled receptor G1 Proteins 0.000 description 2
- 241000288950 Callithrix jacchus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 101001041236 Mus musculus Ornithine decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000288938 Nycticebus coucang Species 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 101150005099 Adgrg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000002927 Cardiofaciocutaneous syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001040800 Homo sapiens Integral membrane protein GPR180 Proteins 0.000 description 1
- 101100021877 Homo sapiens LRRK2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 241000282596 Hylobatidae Species 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 101150081013 LRRK2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001416138 Leontopithecus rosalia Species 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 241001139947 Mida Species 0.000 description 1
- 101100510267 Mus musculus Klf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150075879 PLA2G6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000017955 Regucalcin Human genes 0.000 description 1
- 108050007056 Regucalcin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001779 embryotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000238 embryotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Images
Description
本発明は、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターに関し、本発明によると、該ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを使用することにより、非ヒト哺乳動物初期胚等に遺伝子を導入して、ヒト疾患モデル動物として利用できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出し、また、スクリーニング用外来遺伝子導入細胞を調製することができる。 The present invention relates to a piggyBac transposon vector for introducing foreign genes into mammalian cells. According to the present invention, genes can be introduced into early non-human mammalian embryos or the like by using the vector and piggyBac transposases. Thus, transgenic non-human mammals that can be used as human disease model animals can be produced, and foreign gene-introduced cells for screening can be prepared.
遺伝子導入法は、インビボやインビトロにおいて遺伝子やタンパク質の機能を研究する上で重要な手法であり、ヒトの疾患に関与する遺伝子を非ヒト動物に導入することによりノックイン非ヒト動物を作出すること、ヒトの疾患に関与する遺伝子の非ヒト動物における相同遺伝子をノックアウトすることによりノックアウト非ヒト動物を作出すること等の遺伝子操作により非ヒトトランスジェニック動物を作出し、これらの動物をヒト疾患モデル動物として利用することが広く行われている。とりわけ、マウスは、遺伝子ノックアウト・ノックイン技法の適用が容易な動物であり、ヒト疾患モデルマウスとして広く用いられている。 Gene transfer is an important method for studying the functions of genes and proteins in vivo and in vitro. Non-human transgenic animals are created by genetic engineering such as knocking out homologous genes in non-human animals of genes involved in human diseases to create knockout non-human animals, and these animals are used as human disease model animals. It is widely used. In particular, mice are animals to which gene knockout/knockin techniques can be easily applied, and are widely used as human disease model mice.
しかしながら、げっ歯類と霊長類の間には、解剖学的相違、疾病に対する感受性の相違、認知機能の相違等があるため、ヒト疾患モデルマウスを用いて得られた結果をそのままヒトへ適用することは困難な場合がある。そこで、ヒトに近い霊長類をヒト疾患モデル動物として用いて、霊長類における共通のメカニズムに関わる、神経、臓器の再生医療に関する研究や脳の高次機能に関する分野の研究を行うことにより、より精度の高い有効性の評価を行うことが期待されている。モデルマウスの作出においては、遺伝子導入の成否を問わず母親の胎内に戻し、得られた多数の産子について遺伝子導入が行われているか否かを確認することが常法として行われているが、霊長類のモデル動物においては、外来遺伝子の初期胚への導入効率が低いうえに、倫理的観点から、少数の動物を長期飼育して最大の情報収集を得ることや、動物自体の福祉向上及び苦痛の軽減・排除が求められている。また、かかるトランスジェニック動物の作出においては、受精卵が胚盤胞に達する数日間のうちに遺伝子が導入されたか否かを判別する必要があり、インビトロでの細胞実験のように長期間の培養が必要な抗生物質の耐性遺伝子のマーカーとして利用は好ましくないとされる。 However, since rodents and primates have anatomical differences, susceptibility to diseases, and cognitive functions, the results obtained using human disease model mice should be directly applied to humans. can be difficult. Therefore, by using primates, which are similar to humans, as human disease model animals, we will conduct research on regenerative medicine for nerves and organs, which is related to common mechanisms in primates, and research on higher functions of the brain. It is expected to evaluate the high efficacy of In the production of model mice, regardless of the success or failure of gene transfer, the common practice is to return the mice to their mother's womb and confirm whether or not gene transfer has occurred in a large number of the offspring obtained. In primate model animals, the efficiency of introducing foreign genes into early embryos is low. and pain relief and elimination. In addition, in the production of such transgenic animals, it is necessary to determine whether or not the gene has been introduced within a few days when the fertilized egg reaches the blastocyst. It is not preferable to use it as a marker for resistance genes of antibiotics that require .
これまで、外来遺伝子を霊長類のゲノムＤＮＡに導入する方法としては、げっ歯類同様受精卵注入用ＤＮＡ断片等の受精卵注入用ＤＮＡベクターをマイクロインジェクションする方法や、受精卵に注入する極細ピペットを用いて、顕微鏡下で未受精卵子に***と一緒に目的外来遺伝子を注入するＩＣＳＩ－Ｔｒ（intracytoplasmic sperm injection mediated transgenesis）法や、霊長類動物初期胚をスクロース処理して囲卵腔の容積を増加させ、初期胚の囲卵腔にプロモーターに作動可能に連結したヒト外来遺伝子を含むレンチウイルスベクターを注入して外来遺伝子を導入することによりヒト疾患モデル霊長類動物を作出する方法（例えば、特許文献１等参照）が提案されてきたが、マイクロインジェクションやＩＣＳＩ－Ｔｒ法による場合は、その成功率は５％程度といわれており、また、ウイルスベクターとしてレンチウイルスベクターを用いた場合においても、その成功率は２０％程度にとどまっているとされる。また、かかるレンチウイルスベクター法は、８．５ｋｂ以上の外来遺伝子の導入が困難であるとされており、より大きな遺伝子を挿入することができる方法の開発が望まれている。
So far, methods for introducing foreign genes into the genomic DNA of primates include microinjection of a DNA vector for injection of fertilized eggs such as a DNA fragment for injection of fertilized eggs, as well as a method of microinjection of a DNA fragment for injection of fertilized eggs, and an ultrafine pipette for injection into fertilized eggs. using the ICSI-Tr (intracytoplasmic sperm injection mediated transgenesis) method, in which target foreign genes are injected into unfertilized oocytes together with sperm under a microscope, and sucrose treatment of early primate embryos to reduce the volume of the perivitelline space. A method for producing a human disease model primate animal by introducing a foreign gene by injecting a lentiviral vector containing a human foreign gene operably linked to a promoter into the perivitelline space of an early embryo (for example,
一方、トランスポゾンは、Ｂ．マクリントックにより最初に明らかにされた染色体上を移動する遺伝子であり、このトランスポゾンに関して、トウモロコシの種子や植物体に含まれるアントシアニン遺伝子や、胚乳の黄色デンプンの遺伝子などの発現を変化させる制御遺伝子が、一つの染色体から他の染色体に移動していることが知られている。 On the other hand, the transposon is B. It is a gene that moves on the chromosome first clarified by McClintock. Regarding this transposon, the control gene that changes the expression of the anthocyanin gene contained in maize seeds and plants and the yellow starch gene in endosperm is It is known to migrate from one chromosome to another.
なかでも、鱗翅目昆虫ウイルス由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃは、腫瘍発生リスクを高めることがなく、ヒト・マウス・ラット由来細胞で使用できることが知られており、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを用いてカイコ染色体へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモデルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定に伝わることも確認されている（例えば、非特許文献１参照）。 Among them, piggyBac, a transposon derived from a lepidopteran insect virus, is known to be usable in cells derived from humans, mice, and rats without increasing the risk of tumor development. A method of introducing and expressing the protein encoded by the foreign gene has been studied using the jellyfish green fluorescent protein as a model, and it has also been confirmed that the gene is stably transmitted to offspring by mating (see, for example, Non-Patent Document 1). ).
また、少なくとも１．５ｋｂのインサートを有するｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを細胞のゲノムＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法（例えば、特許文献２参照）が提案されているが、マウス生殖細胞系におけるｐｉｇｇｙＢａｃ転移の検討においては、トランスポゾンドナープラスミドとトランスポゼーズヘルパープラスミドの前核同時注入を行った場合の、トランスジェニックマウスにおける転移の解析において、創始系統の３４．８％（６２／１８４）がＰＢ［Ａｃｔ－ＲＦＰ］一重陽性であり、０．５％（１／１８４）がＡｃｔ－ＰＢアーゼ一重陽性であり、２．７％（５／１８４）が二重陽性であったことが示されており、１００％のトランスジェニック動物の取得率とはほど遠い状況であるといえる。 In addition, a method has been proposed for producing a transgenic non-human vertebrate containing a piggyBac-like transposon with an insert of at least 1.5 kb and containing cellular genomic DNA (see, for example, Patent Document 2). In the study of piggyBac transfer, 34.8% (62/184) of the founder lines showed PB in analysis of transfer in transgenic mice when pronuclear co-injection of transposon donor and transposase helper plasmids was performed. It was shown that [Act-RFP] was single positive, 0.5% (1/184) were Act-PBase single positive and 2.7% (5/184) were double positive. Therefore, it can be said that the acquisition rate of transgenic animals is far from 100%.
本発明の課題は、より高度な機能に関連する遺伝子のトランスジェニック非ヒトモデル動物を作出するために、従来よりも大きい遺伝子を非ヒト動物細胞に導入することができ、かつ、トランスジェニック動物の取得率を１００％に近い値とする遺伝子導入手段を提供することにある。 In order to create transgenic non-human model animals of genes related to higher functions, the object of the present invention is to introduce genes larger than conventional ones into non-human animal cells, and to produce transgenic animals. It is an object of the present invention to provide a gene introduction means that makes the acquisition rate close to 100%.
上述のとおり、従来は、トランスポゾンを使用しても目的のトランスジェニック動物を取得できる確率は非常に低いものであった。その理由の一つとして、例えば、蛍光タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを導入することを目的として、トランスポゾンを含むプラスミドを細胞に注入した場合、宿主細胞のゲノムＤＮＡに導入する目的とされた蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入されないときでも、注入してしばらくは、細胞質や核内で蛍光タンパク質が蛍光を発するため、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された細胞を決定するためには、相当期間にわたり細胞の培養・増殖を継続することが必要であり、細胞が受精卵である場合には、適切な時期に蛍光タンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された細胞を仮親等へ移植することは困難であった。 As described above, conventionally, the probability of obtaining the desired transgenic animal using a transposon was extremely low. One of the reasons for this is that, for example, when a plasmid containing a transposon is injected into a cell for the purpose of introducing genomic DNA encoding a fluorescent protein, the fluorescent protein intended to be introduced into the genomic DNA of the host cell Even when the encoding DNA is not introduced into the genomic DNA, the fluorescent protein emits fluorescence in the cytoplasm or nucleus for a while after injection. In this method, it is necessary to continue culturing and growing the cells for a considerable period of time, and if the cells are fertilized eggs, the cells in which the fluorescent protein-encoding DNA has been introduced into the genomic DNA at an appropriate time are called pseudoparents. It was difficult to transplant to
例えば、従来のpiggyBac Transposon Vector Systemを用いた場合には、長期的に培養した場合に、結果的にＧＦＰが発現し続けている安定株を得ることはできる可能性があるが、ピューロマイシンの薬剤選抜によりＧＦＰ陽性株が得られているともいえ、ソーティングでＧＦＰ陽性細胞を選んできても、ピューロマイシンをかけなければそのうちＧＦＰ陰性の細胞がでてくることが予想される。しかし、より短期間で遺伝子導入細胞を選別できることが可能になれば、染色体への遺伝子導入前（エピソーマルな発現）と後での発現の違いを見たり、短期的な培養をする細胞や胚の遺伝子導入選別に特に有効となる。 For example, when using the conventional piggyBac Transposon Vector System, it may be possible to obtain stable strains that continue to express GFP when cultured for a long period of time. It can be said that GFP-positive strains have been obtained by selection, and even if GFP-positive cells are selected by sorting, it is expected that GFP-negative cells will eventually appear unless puromycin is applied. However, if it becomes possible to select gene-introduced cells in a shorter period of time, it will be possible to see the difference in expression before and after gene introduction to chromosomes (episomal expression), and to examine short-term cultured cells and embryos. It is particularly effective for gene introduction selection.
本発明者らは、外来タンパク質をコードするＤＮＡを宿主のゲノムＤＮＡに導入するために、５’末端側の末端逆位配列（ＩＴＲ；inverted terminal repeats）を含む５’末端側ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列と、３’末端側の末端逆位配列を含む３’末端側ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列との間に、哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと該プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスポゾン領域と、哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡの下流かつＩＴＲ配列の上流に判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを作動可能に連結したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを用いて検討を行った。上記外来タンパク質としてＧＦＰ（（Green Fluorescent Protein）を用い、判定用蛍光タンパク質としてＫＯ（Kusabira-Orange：クサビラオレンジ）を用いたトランスポゾンベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとともに、ヒト２９３Ｔ細胞に注入したところ、５日目ごろまでに判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞において、上記ＧＦＰをコードするＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに導入されていることを見いだした。 In order to introduce DNA encoding a foreign protein into host genomic DNA, the present inventors have found that a 5'-end piggyBac transposon sequence containing a 5'-end inverted terminal repeats (ITR), Encodes a foreign protein promoter DNA that functions in mammalian cells and a foreign protein operably linked downstream of the promoter DNA between the 3'-end piggyBac transposon sequence containing the terminal inverted sequence on the 3'-end side and a piggyBac transposon vector in which DNA encoding a fluorescent protein for detection is operably linked downstream of a promoter DNA for detection that functions in mammalian cells and upstream of an ITR sequence, and piggyBac transposases was examined using When a transposon vector using GFP ((Green Fluorescent Protein) as the foreign protein and KO (Kusabira-Orange) as the fluorescent protein for determination was injected into human 293T cells together with piggyBac transposase, 5 It was found that the DNA encoding the GFP was introduced into the genomic DNA of the cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination rapidly decreased by about the third day.
同様の検討をマウスの受精卵や霊長類の受精卵について行ったところ、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを注入後、２４時間までに上記ＫＯの蛍光が急速に減衰し、ＧＦＰが発現し続けている細胞において、上記外来タンパク質であるＧＦＰをコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入されていることを確認した。また、トランスジェニック非ヒトモデル動物の作出において、ＫＯの蛍光が急速に減衰し、ＧＦＰが発現している胚を選択し、トランスポゾン注入後９６～１２０時間に仮親へ移植することにより、ＧＦＰをコードする遺伝子が受精卵細胞のゲノムに組み込まれたトランスジェニック非ヒトモデル動物の作出の成功率が飛躍的に上昇した。これまで、外来遺伝子が導入された細胞の選択は、不可能ではないもののその確率は低く、実験者の勘やノウハウに頼ることも多いものであったが、かかる方法を用いることにより、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択できる確率が顕著に高くなったことを確認して、本発明を完成するに至った。 A similar study was conducted on mouse fertilized eggs and primate fertilized eggs, and it was found that the fluorescence of the above KO rapidly attenuated by 24 hours after the injection of the piggyBac transposon vector, and in cells that continued to express GFP, It was confirmed that the DNA encoding the foreign protein GFP was introduced into the genomic DNA. In addition, in the production of transgenic non-human model animals, embryos in which KO fluorescence rapidly decays and GFP is expressed are selected and transplanted into foster mothers 96 to 120 hours after transposon injection to encode GFP. The success rate of producing transgenic non-human model animals in which the gene for fertilization is integrated into the genome of fertilized egg cells has increased dramatically. Until now, although it is not impossible to select cells into which a foreign gene has been introduced, the probability of doing so has been low, and it has often relied on the intuition and know-how of the experimenter. The inventors have confirmed that the probability of selecting cells in which the fluorescence of a fluorescent protein is rapidly attenuated as cells into which an exogenous gene has been introduced is remarkably increased, leading to the completion of the present invention.
すなわち、本発明は以下の特許請求の範囲に記載された事項により特定される。
［１］（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含む、哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターであって；
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域が、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡ、及び（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が、（ｂ１）５’末端側と３’末端側とに付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。
［２］蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質が、蛍光標識タンパク質に加えて、さらに１又は２以上の目的タンパク質を含むことを特徴とする上記［１］記載のベクター。
［３］外来遺伝子導入判定領域が、さらに（ａ３）タンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のベクター。
［４］外来遺伝子導入判定領域の蛍光タンパク質が発する蛍光と蛍光標識タンパク質が発する蛍光が補色の関係にあることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載のベクター。
［５］上記［１］～［４］いずれか記載のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキット。
［６］以下の（イ）～（ニ）の工程を備える外来遺伝子導入細胞を選択する方法。
（イ）上記［１］～［４］いずれか記載の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された外来遺伝子導入細胞として選択する工程；
［７］外来遺伝子導入細胞が受精卵であることを特徴とする上記［６］記載の方法。
［８］上記［７］記載の方法により選択された外来遺伝子導入受精卵を非ヒト哺乳類動物仮母に移植し、産子を取得する工程を含むことを特徴とする非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法。
［９］上記［８］記載の方法により作出された非ヒト哺乳類トランスジェニック動物から得られた、外来遺伝子を有し、生殖能・受精能を有する非ヒト哺乳類トランスジェニック動物細胞。
That is, the present invention is specified by the matters described in the following claims.
[1] A vector for introducing foreign genes into mammalian cells, comprising (A) a foreign gene introduction determination region and (B) a piggyBac transposon region;
The (A) foreign gene introduction determination region encodes (a1) a determination promoter DNA that functions in mammalian cells, and (a2) a determination fluorescent protein operably linked downstream of the determination promoter DNA. A pair of piggyBac transposon sequences recognized by piggyBac transposases, wherein the (B) piggyBac transposon region is added to (b1) the 5′ end side and the 3′ end side, and between the transposon sequences (b2) a foreign protein promoter DNA that functions in mammalian cells; A vector for introducing a foreign gene characterized by
[2] The vector according to [1] above, wherein the foreign protein containing the fluorescently labeled protein further contains one or more target proteins in addition to the fluorescently labeled protein.
[3] The vector according to [1] or [2] above, wherein the foreign gene introduction determination region further comprises (a3) a DNA encoding a protein destabilizing peptide.
[4] The vector according to any one of [1] to [3] above, wherein the fluorescence emitted by the fluorescent protein in the foreign gene introduction determination region and the fluorescence emitted by the fluorescent labeling protein are in a complementary color relationship.
[5] A foreign gene transfer vector kit comprising the piggyBac foreign gene transfer vector according to any one of [1] to [4] above and piggyBac transposases.
[6] A method for selecting foreign gene-introduced cells comprising the following steps (a) to (d).
(b) the step of preparing the foreign gene transfer vector according to any one of [1] to [4] above;
(b) preparing mammalian cells;
(C) Step of injecting the foreign gene transfer vector prepared in (B) above and piggyBac transposase into cells;
(d) a step of selecting cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination by the vector for introducing the foreign gene is rapidly attenuated as foreign gene-introduced cells into which the foreign gene has been introduced;
[7] The method according to [6] above, wherein the foreign gene-introduced cell is a fertilized egg.
[8] A non-human mammal transgenic animal characterized by including the step of transplanting a foreign gene-introduced fertilized egg selected by the method described in [7] above into a non-human mammal foster mother and obtaining offspring. How to produce.
[9] A non-human mammalian transgenic animal cell having foreign gene and fertility/fertility, obtained from the non-human mammalian transgenic animal produced by the method described in [8] above.
本発明の哺乳動物細胞への外来遺伝子導入用ベクターとしては、（Ａ）外来遺伝子導入判定領域及び（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域を含むベクターであって、かつ、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ（トランスポゾン転移酵素）を使用することにより、公知のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン転移機構を利用して哺乳動物細胞（宿主細胞）ゲノムへの外来遺伝子ＤＮＡの組み込みを行うことができるベクターであり、上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域は、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡと、（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとを含み、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域は、（ｂ１）５’末端側と３’末端側に付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質とを含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする領域であれば特に制限されず、上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域は、前記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域の上流又は下流に位置することができる。なお、本発明のｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターは、該ｐｉｇｇｙＢａｃ外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを備える外来遺伝子導入用ベクターキットとして使用されることもできる。 The vector for introducing a foreign gene into mammalian cells of the present invention is a vector containing (A) a foreign gene introduction determination region and (B) a piggyBac transposon region, and containing a piggyBac transposase (transposon transferase). It is a vector that can integrate foreign gene DNA into the genome of mammalian cells (host cells) by using the known piggyBac transposon transfer mechanism, and the above (A) foreign gene introduction determination region is (a1) a promoter DNA for determination that functions in mammalian cells; and (a2) a DNA encoding a fluorescent protein for determination operably linked downstream of the promoter DNA for determination; The transposon region consists of (b1) a pair of piggyBac transposon sequences recognized by piggyBac transposases added to the 5′ end side and the 3′ end side, and (b2) placed between the transposon sequences in mammalian cells. A region characterized by containing DNA encoding a foreign protein comprising a functional foreign protein promoter DNA and (b3) a fluorescently labeled protein operably linked downstream of the foreign protein promoter DNA is particularly restricted. However, the (B) piggyBac transposon region can be positioned upstream or downstream of the (A) foreign gene introduction determination region. The piggyBac foreign gene introduction vector of the present invention can also be used as a foreign gene introduction vector kit comprising the piggyBac foreign gene introduction vector and piggyBac transposases.
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン転移機構によると、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが、上記（Ｂ）のトランスポゾン領域に存在する一対のトランスポゾン配列を認識して、トランスポゾン配列のＴＴＡＡ配列において、外来遺伝子ＤＮＡ配列を含む領域を切り取り、切り取られた外来遺伝子のＤＮＡを非ヒト哺乳動物（宿主）の細胞のゲノムＤＮＡにおけるＴＴＡＡ配列領域に挿入することにより、宿主細胞のゲノムＤＮＡに外来遺伝子を導入することができる。 According to the piggyBac transposon transfer mechanism, the piggyBac transposase recognizes a pair of transposon sequences present in the transposon region of (B) above, cuts out the region containing the foreign gene DNA sequence in the TTAA sequence of the transposon sequence, A foreign gene can be introduced into the genomic DNA of a host cell by inserting the excised DNA of the foreign gene into the TTAA sequence region in the genomic DNA of the non-human mammalian (host) cell.
本発明において哺乳動物細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ等とともに、サル、マーモセット等の非ヒト霊長類動物、ヒトの細胞を例示することができる。 Examples of mammalian cells in the present invention include cells from mice, rats, rabbits, cats, dogs, pigs, cows, etc., as well as non-human primates such as monkeys and marmosets, and human cells.
また、安楽殺を防ぐことがコスト的にまた倫理的に強く要求されているという点で、非ヒト霊長類モデル動物の作出を目的として本発明のキットを用いる場合においては、上記哺乳動物細胞としては、テナガザル等のテナガザル科の霊長類、アカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル（Macaca fascicularis）等のオナガザル科に属する霊長類、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ピグミーマーモセット（Cebuella pygmaea)、ワタボウシパンシェ(Satuinus oedipus)、アカテタマリン（Sauinaus midas）、ゴールデンライオンタマリン（Leontopithecus rosalia）等のマーモセット科に属する霊長類、スローロリス(Nycticebus coucang)等のロリス科に属する霊長類などの霊長類動物を特に挙げることができるが、１歳半で性的に成熟し、１回の出産につき２～３匹の産子を取得でき、妊娠期間が平均１５０日で、授乳中も妊娠可能であるため年に２回の出産が可能であるマーモセット科の霊長類動物が好ましく、小型で育種が容易であるという点で、コモンマーモセットが特に好ましい。 In addition, in view of the fact that there is a strong need to prevent euthanasia in terms of cost and ethics, when using the kit of the present invention for the purpose of producing a non-human primate model animal, the above-mentioned mammalian cells are primates of the family Gibbon, such as gibbons; edipus), Acatetamarin (Sauinaus midas), Golden Lion Tamarin (Leontopithecus rosalia) and other primates belonging to the Marmosetidae family, and slow loris (Nycticebus coucang) and other primates belonging to the Lolithidae family. , reach sexual maturity at 1.5 years of age, produce 2 to 3 offspring per litter, have an average gestation period of 150 days, and are able to conceive during lactation, giving birth twice a year. A primate of the marmoset family is preferred, and the common marmoset is particularly preferred because of its small size and ease of breeding.
本発明における哺乳動物の細胞（宿主細胞）としては、本発明の効果を奏することができる細胞であれば特に制限されないが、一細胞である受精卵；かかる受精卵が１回以上体細胞***した２細胞期の胚、４細胞期の胚、８細胞期の胚、桑実胚及び／又は胚盤胞期等の初期胚；多能性幹細胞を好ましく挙げることができるが、モザイク胚の発生を防ぎ、単一胚から発生した疾患メカニズムの研究や創薬のための優れた疾患モデル動物を作出できる点で一細胞の、受精卵や多能性幹細胞が好ましい。 The mammalian cell (host cell) in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell capable of exhibiting the effects of the present invention. Early embryos such as 2-cell stage embryos, 4-cell stage embryos, 8-cell stage embryos, morula and/or blastocyst stage; One-cell fertilized eggs and pluripotent stem cells are preferred in that they can be prevented and excellent disease model animals can be created for research on disease mechanisms developed from a single embryo and for drug discovery.
上記一細胞である受精卵としては、***が卵子内に進入し、***の核と卵子の核が融合する受精より形成された、体細胞***により成長可能な一細胞を挙げることができ、さらに詳細には、体内受精後に体外へ採取（採卵）された体内受精による受精卵や、体外受精による受精卵や、これらの受精卵を凍結保存後解凍した受精卵を挙げることができる。 The fertilized egg, which is the single cell, includes a single cell capable of growing by somatic cell division, which is formed by fertilization in which a sperm enters the egg and the nucleus of the sperm and the nucleus of the egg fuse. Specifically, fertilized eggs obtained by internal fertilization that are collected outside the body (egg collection) after internal fertilization, fertilized eggs obtained by in vitro fertilization, and fertilized eggs obtained by freezing and then thawing these fertilized eggs can be mentioned.
上記多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、骨髄由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞等の間葉系幹細胞、さらには、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; ｉＰＳ細胞））を挙げることができ、通常、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）を例示することができるが、マーモセットでは、さらにＮａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８が必要であることも知られている。 Examples of the pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells) isolated from early embryos, and embryonic germ cells (EG cells) isolated from embryonic primordial germ cells ( For example, Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95:13726-31) and germline stem cells (GS cells) isolated from the testis immediately after birth (for example, Nature. 2008, 456:344- 9), mesenchymal stem cells such as bone marrow-derived stem cells and adipose tissue-derived stem cells, and even somatic cells such as skin cells by introducing multiple genes into somatic cells to induce dedifferentiation, Induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells; iPS cells) having pluripotency similar to ES cells) can be mentioned, usually by introducing Oct3/4 gene, Klf4 gene, c-Myc, Sox2 gene (Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106), but marmosets are also known to require Nanog and Lin28.
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとしては、鱗翅目（Lepidopteran）に属するイラクサギンウワバ（Trichopulsia ni）に感染する核多角体病ウイルス由来のトランスポゾンを挙げることができ、さらにその改変体を含めることができる。 Examples of the piggyBac transposon include a nuclear polyhedrosis virus-derived transposon that infects Trichopulsia ni belonging to the order Lepidopteran, and further includes variants thereof.
上記一対のトランスポゾン（ＴＲ）配列としては、ＴＴＡＡ配列を両端に有する、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する、５’末端側及び３’末端側に存在する一対のＩＴＲであれば特に制限されず、一対のトランスポゾン配列の一般式としては、５’末端側のトランスポゾン配列が、ＴＴＡＡに続くｎ個の塩基配列からなる相補的な二本鎖
５’－ＴＴＡＡＸ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－ＡＡＴＴＹ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’である場合に、
３’末端側のトランスポゾン配列は、以下のＴＴＡＡの上流のｍ個の塩基配列からなる相補的な二本鎖
５’－ＹｍＹｍ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１ＴＴＡＡ－３’
３’－ＸｍＸｍ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１ＡＡＴＴ－５’
（ただし、ｎ又はｍ個の塩基は、適当数の任意の塩基を挟んで存在することもでき、ｎ≠ｍ又はｎ＝ｍである）
として示すことができる。
The pair of transposon (TR) sequences is not particularly limited as long as it is a pair of ITRs present at the 5′ end and 3′ end that are recognized by piggyBac transposase and have TTAA sequences at both ends. As a general formula for the transposon sequence of , the transposon sequence on the 5' end side is a complementary double-stranded 5'-TTAAX 1 X 2 . . . . . . Xn - 1Xn-3'
3′-AATTY 1 Y 2 . . . . . . Y n−1 Y n −5′,
The transposon sequence on the 3' end side is a complementary double-stranded 5'-Y m Y m-1 . . . . . . Y 2 Y 1 TTAA-3′
3′-X m X m-1 . . . . . . X 2 X 1 AATT-5'
(However, n or m bases can be present with an appropriate number of arbitrary bases in between, and n≠m or n=m)
can be shown as
具体的なトランスポゾン配列としては、配列番号１に示される３１３塩基からなる５’末端側のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列（５’ＴＲ）や、配列番号２に示される２３５塩基からなる３’末端側のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列（３’ＴＲ）を例示することができる。各ＴＲ配列の詳細としては、５’ＴＲのＴＴＡＡの下流に位置する１３塩基のＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡ（配列番号３）のＩＴＲ及び３塩基挟んでさらにその下流に位置する１９塩基のＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ（配列番号４）のＩＴＲを含む配列と、３’ＴＲのＴＴＡＡの上流に位置する１３塩基ＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧ（配列番号５）のＩＴＲ及び３１塩基挟んでさらにその上流に位置する１９塩基のＣＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＧＣＡ（配列番号６）のＩＴＲを含む配列を例示することができ、５’ＴＲと３’ＴＲとに挟まれているとが目的遺伝子が切り貼りされうるという、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズによるトランスポゾンの遺伝子導入作用を奏する配列である限りにおいて、上記例示された一対のトランスポゾン配列の一又は二以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含めることもできる。 Specific transposon sequences include a 5′-end piggyBac transposon sequence (5′TR) consisting of 313 bases shown in SEQ ID NO: 1, and a 3′-end piggyBac transposon consisting of 235 bases shown in SEQ ID NO: 2. A sequence (3'TR) can be exemplified. Details of each TR sequence include the ITR of 13 bases CCCTAGAAAGATA (SEQ ID NO: 3) located downstream of TTAA of 5'TR and the 19 bases TGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 4) located further downstream across 3 bases. Including a sequence containing an ITR, an ITR of 13 bases TATCTTTTCTAGGG (SEQ ID NO: 5) located upstream of the TTAA of the 3'TR, and an ITR of 19 bases CATGCGTCAATTTTACGCA (SEQ ID NO: 6) located further upstream across 31 bases. As long as it is a sequence that can exemplify the sequence and that the target gene can be cut and pasted between the 5'TR and 3'TR, and that the sequence exerts the transposon gene introduction action by the piggyBac transposon and the piggyBac transposase. can also include a nucleotide sequence in which one or two or more nucleotides of the above-exemplified pair of transposon sequences are deleted, substituted, or added.
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域における、（ａ１）判定用プロモーターＤＮＡとしては、哺乳動物細胞で機能するプロモーターＤＮＡであれば特に制限されず、ＣＡＧ（ニワトリβアクチン）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ１α（エロンゲーションファクター１α）プロモーター等の哺乳動物細胞由来のプロモーターや、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ポリオーマウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター等のウイルスプロモーター、ＥＯＳ (Early Transposon promoter and Oct-4 (Pou5f1) and Sox2 enhancers)などを例示することができるが、ＣＡＧプロモーターやＣＭＶプロモーターが好ましい。 The (a1) judging promoter DNA in the (A) foreign gene introduction judging region is not particularly limited as long as it is a promoter DNA that functions in mammalian cells. Kinase) promoter, mammalian cell-derived promoters such as EF1α (elongation factor 1α) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, retrovirus promoter, polyoma virus promoter, adeno Viral promoters such as viral promoters, and EOS (Early Transposon promoter and Oct-4 (Pou5f1) and Sox2 enhancers) can be exemplified, but CAG promoter and CMV promoter are preferred.
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域における、（ａ２）判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとしては、前記（ａ１）のプロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記蛍光タンパク質としては、３９５ｎｍ前後の励起光を照射することにより緑色の蛍光を発するＧＦＰ、４８０～５００ｎｍ前後の励起光を照射することにより高感度緑色蛍光タンパク質を発するＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、５００～５３０ｎｍ前後の励起光を照射することにより黄色の蛍光を発するＹＦＰ、ＹＦＰの変異体であるＶｅｎｕｓ、５４０～５６０ｎｍ前後の励起光を照射することによりオレンジ色の蛍光を発するＫＯ１やＫＯ２等のＫＯ、４３０～４４０ｎｍ前後の励起光を照射することによりシアン色蛍光を発するＣｅｒｕｌｅａｎ等のＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）等を例示することができるが、遺伝子が発現している場合に長期間検出可能で、かつ胚発生を阻害しない点でＣｅｒｕｌｅａｎ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＫＯ等の蛍光タンパク質が好ましい。また、ルシフェラーゼ等の発光タンパク質も、ここでは便宜上、蛍光タンパク質に含めることができる。なお、ｈＫＯ（humanized Kusabira-Orange）は、マーモセットやマウス等においてもＫＯとしての効果を十分に奏することを本発明者らは確認している。 The DNA encoding the (a2) fluorescent protein for determination in the (A) foreign gene introduction determination region may be a DNA encoding a fluorescent protein operably linked downstream of the promoter DNA of (a1). Examples of the fluorescent protein include GFP, which emits green fluorescence when irradiated with excitation light at around 395 nm, and EGFP, which emits highly sensitive green fluorescent protein when irradiated with excitation light at around 480 to 500 nm ( Enhanced Green Fluorescent Protein), YFP that emits yellow fluorescence when irradiated with excitation light around 500-530 nm, Venus, a YFP mutant, that emits orange fluorescence when irradiated with excitation light around 540-560 nm KO such as KO1 and KO2 that emit, CFP (Cyan Fluorescent Protein) such as Cerulean that emits cyan fluorescence by irradiating excitation light around 430 to 440 nm can be exemplified, but if the gene is expressed Fluorescent proteins such as Cerulean, GFP, EGFP, and KO are preferred because they are detectable for a long period of time and do not inhibit embryogenesis. Luminescent proteins such as luciferase can also be included in fluorescent proteins herein for convenience. The present inventors have confirmed that hKO (humanized Kusabira-Orange) exhibits sufficient effects as a KO in marmosets, mice, and the like.
本発明において、「作動可能に連結」とは、各ＤＮＡの配列が連続的に連結され、かつＤＮＡがタンパク質をコードしている場合、その読み枠が合っていることを意味し、各ＤＮＡの３’末端と、その下流のＤＮＡの５’末端とは、本発明の効果が得られる限り、直接連結していなくてもよいが、直接連結していることが好ましい。また、上記判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの下流に、ｍＲＮＡに安定性を付与し、翻訳を促進する作用を有するとされるポリＡ領域（ｐＡ）をさらに連結することもできる In the present invention, the term "operably linked" means that the sequences of each DNA are linked continuously and that the reading frames of the DNAs are in alignment when the DNAs encode proteins. The 3' end and the 5' end of the downstream DNA may not be directly linked as long as the effects of the present invention can be obtained, but they are preferably directly linked. In addition, a poly A region (pA), which is believed to impart stability to mRNA and promote translation, can be further ligated downstream of the DNA encoding the fluorescent protein for determination.
（Ａ）の外来遺伝子導入判定領域においては、さらに（ａ３）前記（ａ１）のプロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結しているタンパク質不安定化ペプチドをコードするＤＮＡ；をさらに含むことができる。タンパク質不安定化ペプチドの作用により、上記判定用蛍光タンパク質をより速く分解させることができる。 The foreign gene introduction determination region of (A) may further comprise (a3) a DNA encoding a protein destabilizing peptide operably linked downstream of the promoter DNA of (a1). Due to the action of the protein destabilizing peptide, the fluorescent protein for determination can be degraded more quickly.
本発明におけるタンパク質不安定化ペプチドとしては、標的とするタンパク質に融合することにより、かかるタンパク質の生体内における半減期を短縮する作用を有するペプチドであれば特に制限されず、かかる半減期を短縮する作用としては、標的とするタンパク質を含む融合タンパク質のペプチダーゼに対する感受性が高まり、標的とするタンパク質がペプチダーゼによってより速やかに分解されるため、結果として標的とするタンパク質の半減期を短縮させる作用を挙げることができる。かかるタンパク質不安定化ペプチドは、判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれにおいても融合することができ、リンカー配列などを介して融合することもできる。 The protein destabilizing peptide in the present invention is not particularly limited as long as it has the effect of shortening the in vivo half-life of the protein when fused to the target protein, and shortens the half-life. The action is to increase the sensitivity of the fusion protein containing the target protein to peptidases, and the target protein is more rapidly degraded by the peptidase, resulting in the action of shortening the half-life of the target protein. can be done. Such protein destabilizing peptides can be fused to either the N-terminal side or the C-terminal side of the DNA encoding the fluorescent protein for determination, and can also be fused via a linker sequence or the like.
上記タンパク質不安定化ペプチドのアミノ酸配列としては、タンパク質分解シグナルとして作用するＰ；プロリン、Ｅ；グルタミン酸、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニンを多く含むＰＥＳＴ配列や、ウラシル透過酵素等短寿命タンパク質のＣ末端領域由来の配列、ＣＬ１配列を挙げることができる。具体的には配列番号７に示されるｄ２ＰＥＳＴ配列、配列番号８に示されるｄ４ＰＥＳＴ配列や、これらのペプチド配列の１又は２以上のアミノ酸が置換、付加、欠失若しくは挿入され、かつ前記ペプチドと実質的に同一のタンパク質不安定化活性を有するペプチド配列を例示することができる。ここで、ｄｎＰＥＳＴ配列の「ｄｎ」は、タンパク質分解時間を示し、ｎの値がより小さいとより早く分解することを示す。また蛍光タンパク質のＣ末端にＰＥＳＴドメインが存在するマウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）の一部を融合させて構築した不安定化蛍光タンパク質（クロンテック社製）等の市販品を用いることもできる。 The amino acid sequences of the protein destabilizing peptides include P; proline, E; glutamic acid, S; serine, T; A region-derived sequence, CL1 sequence can be mentioned. Specifically, the d2PEST sequence shown in SEQ ID NO: 7, the d4PEST sequence shown in SEQ ID NO: 8, and one or more amino acids of these peptide sequences are substituted, added, deleted, or inserted, and the peptide and the substantial Peptide sequences having essentially the same protein destabilizing activity can be exemplified. Here, "dn" in the dnPEST sequence indicates the protein degradation time, with smaller values of n indicating faster degradation. Commercially available products such as destabilized fluorescent protein (manufactured by Clontech) constructed by fusing a portion of mouse ornithine decarboxylase (MODC) having a PEST domain at the C-terminus of a fluorescent protein can also be used.
上記一対のトランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）外来タンパク質プロモーターＤＮＡとしては、哺乳動物細胞で機能するプロモーターＤＮＡ配列であれば特に制限されず、前記判定用プロモーターＤＮＡとして例示されたプロモーターを挙げることができ、プロモーター干渉によりいずれかのタンパク質の発現が顕著に低下するということがない限りにおいて、前記判定用プロモーターのＤＮＡと同一の配列を有するＤＮＡでも異なる配列を有するＤＮＡでもよい。 The (b2) foreign protein promoter DNA placed between the pair of transposon sequences is not particularly limited as long as it is a promoter DNA sequence that functions in mammalian cells. As long as the promoter interference does not significantly reduce the expression of any protein, the DNA may have the same sequence as or a different sequence from the DNA of the promoter for determination.
上記一対のトランスポゾン配列間に配置された（ｂ３）外来タンパク質をコードするＤＮＡとしては、上記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記外来タンパク質としては、蛍光標識タンパク質のほか、宿主のインタクトな機能を変更することができる目的タンパク質を挙げることができ、外来タンパク質の構成としては、例えば、１）蛍光標識タンパク質、２）蛍光標識タンパク質と１又は２以上の目的タンパク質、３）１又は２以上の目的タンパク質等を含む構成を例示することができる。 The (b3) foreign protein-encoding DNA placed between the pair of transposon sequences may be any DNA encoding a foreign protein containing a fluorescence-labeled protein operably linked downstream of the foreign protein promoter DNA. The foreign protein is not particularly limited, and includes fluorescently labeled proteins as well as target proteins capable of altering the intact functions of the host. 2) a fluorescently labeled protein and one or more target proteins; and 3) one or two or more target proteins.
上記目的タンパク質の遺伝子としては、上記蛍光タンパク質以外のタンパク質であって、パーキンソン病の原因遺伝子とされる変異型αシヌクレイン遺伝子やＬＲＲＫ２（Homo sapiens leucine rich repeat kinase 2）の変異遺伝子、ＣＦＣ症候群原因遺伝子ＢＲＡＦの変異遺伝子、神経原性筋萎縮症の原因とされるＣａ非依存性グループ６ホスホリパーゼＡ２（Ｐｌａ２ｇ６）をコードするＤＮＡの変異遺伝子等遺伝子が過剰発現することが疾病の起因となる遺伝子や、ハンチントン病の原因遺伝子であるＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎ遺伝子、若年性成人発症型糖尿病の原因遺伝子であるＨＮＦ１αＰ２９１ｆｓｉｎｓＣ、レギュカルチンタンパク質等を例示することができる。 Examples of the target protein gene include a protein other than the above fluorescent protein, such as a mutant α-synuclein gene that is considered to be a causative gene of Parkinson's disease, a mutated gene of LRRK2 (Homo sapiens leucine rich repeat kinase 2), and a CFC syndrome causative gene. BRAF mutated gene, mutated gene of DNA encoding Ca-independent group 6 phospholipase A2 (Pla2g6), which is considered to cause neurogenic muscular atrophy, and other genes whose overexpression causes diseases, Huntington's disease causative gene Huntingtin gene, juvenile maturity onset diabetes causative gene HNF1αP291fsinsC, regucalcin protein and the like can be exemplified.
上記ＬＲＲＫ２の遺伝子としては、NCBI Reference Sequence: NM_198578.3に示されるHomo sapiens leucine rich repeat kinase 2, mRNAの９２３９ｂｐの塩基配列で表すことができる遺伝子を例示することができる。
Examples of the LRRK2 gene include Homo sapiens leucine
上記ＬＲＲＫ２の変異遺伝子としては、ＬＲＲＫ２をコードするＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部が欠損、他の塩基配列が挿入又は他の塩基配列と置換等することによりＬＲＲＫ２が不活化されたパーキンソン病の原因となる遺伝子を挙げることができ、具体的には、ＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基に置換されている変異タンパク質をコードする変異遺伝子（配列番号９）を挙げることができる。 As the mutated gene of LRRK2, the cause of Parkinson's disease in which LRRK2 is inactivated by deletion of at least a part of the base sequence of the DNA encoding LRRK2, insertion of another base sequence, or substitution with another base sequence. Specifically, a mutated gene (SEQ ID NO: 9) encoding a mutated protein in which the 2019th glycine residue of LRRK2 is substituted with a serine residue can be exemplified.
かかる変異遺伝子を宿主の非ヒト哺乳動物のゲノムＤＮＡに導入することにより、パーキンソン病モデル非ヒト哺乳動物を作出することができる。 A Parkinson's disease model non-human mammal can be produced by introducing such a mutated gene into the genomic DNA of a host non-human mammal.
上記外来タンパク質プロモーターＤＮＡとしては、前記判定用プロモーターＤＮＡにおいて例示されたプロモーターを挙げることができる。また、非ヒト哺乳動物を作出する場合においては、前記ＥＯＳ等、胚では機能するが、成体では機能しなくなるプロモーターＤＮＡ１の下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質をコードするＤＮＡ（第一発現カセット）と、成体で機能するプロモーターＤＮＡ２の下流に作動可能に連結された目的タンパク質を含む外来遺伝子ＤＮＡ（第二発現カセット）を備えるトランスポゾン領域の構成とすると、胚においては蛍光標識タンパク質が発現している細胞を選択することができ、かつ、成体においては、蛍光標識タンパク質が発現しない非ヒト哺乳動物を作出できる点で優れている。
Examples of the foreign protein promoter DNA include the promoters exemplified in the promoter DNA for determination. In the case of producing non-human mammals, DNA encoding a fluorescence-labeled protein operably linked downstream of
上記蛍光標識タンパク質としては、前記判定用蛍光タンパク質において例示されている蛍光タンパク質から選択することができるが、判定用蛍光タンパク質における判定が効率的にまた迅速に行われるために、目視により又はＦＡＣＳ等の手段により蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質とを区別することができるように、判定用蛍光タンパク質が発する蛍光の波長とは異なる波長を発する蛍光標識タンパク質であることが必要であり、上記判定用蛍光タンパク質の色と補色の関係又は補色に近い関係にある色の蛍光タンパク質を蛍光標識タンパク質として選択して、蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質の好ましい組合せとして用いると、より容易に蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質とを目視にて区別することができる点で好ましい。 The fluorescently labeled protein can be selected from the fluorescent proteins exemplified in the fluorescent protein for determination. It is necessary that the fluorescence-labeled protein emits a wavelength different from that emitted by the fluorescent protein for determination so that the fluorescence-labeled protein can be distinguished from the fluorescent protein for determination by the means of When a fluorescent protein having a complementary color or a complementary color to the fluorescent protein for determination is selected as a fluorescent-labeled protein and used as a preferred combination of the fluorescent-labeled protein and the fluorescent protein for determination, fluorescent labeling becomes easier. It is preferable in that the protein can be visually distinguished from the fluorescent protein for determination.
上記蛍光標識タンパク質と前記判定用蛍光タンパク質の具体的な組合せとしては、緑色の蛍光を発するＥＧＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、緑色の蛍光を発するＧＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、オレンジの蛍光を発するクサビラオレンジと緑色の蛍光を発するＥＧＦＰ、オレンジの蛍光を発するクサビラオレンジと緑色の蛍光を発するＧＦＰ、黄色の蛍光を発するＹＦＰとシアン蛍光を発するＣＦＰ、シアン色蛍光を発するＣＦＰと黄色の蛍光を発するＹＦＰ、シアン系蛍光を発するＣＦＰとオレンジの蛍光を発するクサビラオレンジ、オレンジの蛍光を示すクサビラオレンジとシアン系蛍光を発するＣＦＰ等の組合せ、また、これらの蛍光タンパク質と発光タンパク質ルシフェラーゼなどの各組合せを例示することができる。 Specific combinations of the fluorescently labeled protein and the fluorescent protein for determination include EGFP that emits green fluorescence and Kusabira Orange that emits orange fluorescence, GFP that emits green fluorescence and Kusabira Orange that emits orange fluorescence, Wedge orange that emits orange fluorescence and EGFP that emits green fluorescence, Wedge orange that emits orange fluorescence and GFP that emits green fluorescence, YFP that emits yellow fluorescence and CFP that emits cyan fluorescence, and CFP that emits cyan fluorescence Combinations of CFP and YFP that emits yellow fluorescence, CFP that emits cyan fluorescence and Kusabira Orange that emits orange fluorescence, and combinations of CFP that emits cyan fluorescence and CFP that emits orange fluorescence, and these fluorescent proteins and the photoprotein luciferase can be exemplified.
本発明における外来遺伝子含有ベクターの構成としては、例えばＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモータ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲ（図１（ａ））を含む構成を挙げることができるが、本発明における効果を奏する限りにおいて制限されず、他に例えば、ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＣＭＶプロモーター－ｈＫＯ１－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモーター－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲ（図１（ｂ））や、ＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶプロモーター－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲやＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＣＭＶ－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲ、ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＡＧプロモーター－目的タンパク質をコードするＤＮＡ－２Ａ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲや、ＣＭＶ１プロモーター－Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ｈｇｐｒ５６－ｅＧＦＰ－ルシフェラーゼ－Ｉｎｓ－ＥＯＳ－ｈＫＯ１－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲを含むベクターを挙げることができる。 The configuration of the foreign gene-containing vector in the present invention includes, for example, a configuration containing CMV-hKO1d2PEST-polyA-PB5'TR-CMV promoter-EGFP-polyA-PB3'TR (Fig. 1(a)). is not limited as long as the effect in the present invention is exhibited, and other examples include CMV promoter-hKO1-d2PEST-polyA-CMV promoter-hKO1-d2PEST-polyA-PB5'TR-CMV promoter-EGFP-polyA- PB3'TR (FIG. 1(b)), CMV-hKO1d2PEST-PB5'TR-CMV promoter-EGFP-PB3'TR and CMV-hKO1d2PEST-CMV-hKO1d2PEST-PB5'TR-CMV-EGFP-PB3'TR, CMV 1 promoter-hKO1d2PEST-polyA-PB5'TR-CAG promoter-DNA encoding the target protein-2A-EGFP-polyA-PB3'TR and CMV 1 promoter-Cerulean-d2PEST-polyA-PB5'TR-hgpr56 -eGFP-luciferase-Ins-EOS-hKO1-polyA-PB3'TR.
本発明におけるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ（タンパク質）そのものの他、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列を含む環状又は直鎖状のベクターや、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ（ｐｉｇｇｙＢａｃｍＲＮＡ）やｃＤＮＡ等のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現物を便宜上含めることができるが、発現がより早いことを期待でき、また、トランスポゼーズ自体がゲノムに組み込まれることは好ましくないため、一過性の発現のみで留めることが望まれる点で、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡを好適に挙げることができる。 The piggyBac transposase in the present invention includes the piggyBac transposase (protein) itself, a circular or linear vector containing a DNA sequence encoding the piggyBac transposase, and a DNA encoding the piggyBac transposase. A piggyBac transposase expression product such as transcribed mRNA (piggyBacmRNA) or cDNA can be included for convenience, although faster expression can be expected and it is undesirable for the transposase itself to integrate into the genome. , piggyBac transposase mRNA can be preferably mentioned in that it is desired that only transient expression be achieved.
上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現物を調製する方法としては、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡを含む環状ベクターを従来公知の方法により調製する方法や、かかる環状ベクターを適当な制限酵素を用いて直鎖状ベクターとして調製する方法や、かかる環状ベクター又は直鎖状ベクターを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズのコード領域を含むｍＲＮＡを作製する方法、又は大腸菌等によりタンパク質として発現させることにより組換ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズを調製する方法を例示することができる。 Examples of the method for preparing the above-mentioned piggyBac transposase expression product include a method for preparing a circular vector containing DNA encoding the piggyBac transposase by a conventionally known method, and a method for linearizing such a circular vector using an appropriate restriction enzyme. A method of preparing a circular vector, a method of producing mRNA containing the coding region of piggyBac transposase with T7 RNA polymerase using such a circular vector or linear vector as a template, or a method of expressing as a protein in Escherichia coli or the like. A method for preparing piggyBac transposases can be exemplified.
本発明におけるトランスポゾンを用いる哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡへの外来遺伝子導入の態様は、ランダム挿入変異誘発系であり、受精卵の雄性前核もしくは受精卵の雌性前核又は受精卵細胞質に本発明におけるベクターキットを注入することにより、ヘミ接合体変異を創出することができる。 An embodiment of introducing a foreign gene into the genomic DNA of mammalian cells using a transposon in the present invention is a random insertion mutagenesis system, and the Hemizygous mutations can be created by injecting vector kits.
本発明において、外来遺伝子導入細胞を選択する方法としては、以下の（イ）～（ニ）の工程を備える方法を例示することができ、かかる方法は、上記本発明の外来遺伝子導入用ベクターキットを用いて行うことが好ましい。
（イ）外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）哺乳類動物の細胞を調製する工程；
（ハ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを細胞に注入する工程；
（ニ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択する工程；
上記外来遺伝子導入細胞を選択する方法は、外来遺伝子導入細胞の選択確率を向上させる方法でもある。
In the present invention, the method for selecting foreign gene-introduced cells can be exemplified by a method comprising the following steps (a) to (d). It is preferable to use
(b) the step of preparing a foreign gene introduction vector;
(b) preparing mammalian cells;
(C) Step of injecting the foreign gene transfer vector prepared in (B) above and piggyBac transposase into cells;
(d) a step of selecting cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination by the vector for introducing a foreign gene is rapidly attenuating as cells into which the foreign gene has been introduced;
The above method for selecting foreign gene-introduced cells is also a method for improving the selection probability of foreign gene-introduced cells.
上記（イ）の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程において、上記外来遺伝子導入用ベクターを作製する方法としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、Gatewayクローニングシステムを用いることができる。Gatewayクローニングシステムは、λファージが大腸菌染色体へ侵入する際に関与する部位特異的組換えシステムに基づくものであり、Gatewayシグナル（ａｔｔ）を用いることによって、発現ベクターの構築を容易にしたものである。ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２配列を有するドナーベクターと目的遺伝子の両端にａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２配列を付加したものとの間で反応（ＢＰ反応）させることにより、目的遺伝子が組み込まれたエントリーベクター（両端にａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２配列を有する）を作製し、次いで、このエントリーベクターと発現に必要なプロモーターが組み込まれたデスティネーションベクター（ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２配列を付加）と組みかえ反応（ＬＲ反応）することにより、目的遺伝子が挿入されたベクター（発現ベクター）を作製する方法である。具体的には、例えば、Add gene社より購入したトランスポゾン領域の入ったデスティネーションベクターであるＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖを用いることができ、また、ＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖにおけるプロモーターを改変し、及び／又は、Gateway部分を変更したベクターを使用することができる。また、Medical Research Council国立研究所（ＵＫ）が供給するＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いてＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖとプロモーターとＧＦＰが入っているエントリーベクターを作製することも可能である。また、胚の発生能を低下させることのないベクターを用いて作製する方法が好ましい。 In the step of preparing the vector for introducing a foreign gene in (b) above, conventionally known methods can be used as a method for preparing the vector for introducing a foreign gene. For example, the Gateway cloning system can be used. . The Gateway cloning system is based on the site-specific recombination system involved in the invasion of the λ phage into the E. coli chromosome, and facilitates the construction of expression vectors by using the Gateway signal (att). . By reacting (BP reaction) between a donor vector having attP1 and attP2 sequences and a target gene with attB1 and attB2 sequences added at both ends, an entry vector with the target gene integrated (attL1 and attL2 sequences at both ends ) is prepared, and then the target gene is inserted by recombination reaction (LR reaction) with this entry vector and a destination vector (adding attR1 and attR2 sequences) in which promoters necessary for expression are incorporated. This is a method for preparing a vector (expression vector). Specifically, for example, PB-CA-rtTAAdv, which is a destination vector containing a transposon region purchased from Add Gene, can be used, and the promoter in PB-CA-rtTAAdv is modified and/or , a vector with a modified Gateway part can be used. The KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector supplied by the Medical Research Council National Laboratory (UK) can also be used to generate an entry vector containing PB-CA-rtTAAdv, promoter and GFP. In addition, a method using a vector that does not impair the developmental potential of the embryo is preferred.
上記（ロ）の哺乳類動物の細胞を調製する工程において、従前公知の方法を用いて前記哺乳動物の細胞を調製することができ、非ヒト霊長類動物については、体外受精の方法や受精卵の採取の方法として、特開２０１２－１２５４１０やＷＯ２００９／０９６１０１に記載されている方法を例示することができる。 In the step of preparing mammalian cells in (b) above, the mammalian cells can be prepared using a conventionally known method. As a collection method, the methods described in JP-A-2012-125410 and WO2009/096101 can be exemplified.
上記（ハ）の細胞に外来遺伝子導入用ベクターと上記トランスポゼーズを注入する工程において、細胞に、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとともに注入する方法としては、外来遺伝子を細胞のゲノムに導入できる方法であれば特に制限されないが、例えば、外来遺伝子含有ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターもしくはトランスポゼーズベクターを鋳型として作製したｍＲＮＡと、ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Thermo Scientific社製）もしくは生理食塩水とを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてリポフェクションする；マイクロインジェクションにより注入する；エレクトロポレーションする；等の方法を挙げることができ、細胞にベクターを注入する場合は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとをｏｐｔｉ－ＭＥＭ溶液を用いてリポフェクションする方法を好ましく挙げることができ、受精卵に注入する場合は、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡとを生理食塩水を用いてマイクロインジェクションする方法を好適に挙げることができ、ニューロスフィアに注入する場合は、外来遺伝子含有ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン環状ベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡとをエレクトロポレーションする方法を好適に挙げることができる。 In the step of injecting the foreign gene introduction vector and the transposase into the cells of (c) above, as a method of injecting the foreign gene-containing piggyBac transposon vector into the cells together with the piggyBac transposase, the foreign gene is introduced into the genome of the cell. Although not particularly limited as long as it can be introduced into the system, for example, mRNA prepared using a foreign gene-containing vector and a piggyBac transposase vector or a transposase vector as a template, opti-MEM (manufactured by Thermo Scientific) or physiological saline and lipofection using Lipofectamine; injection by microinjection; electroporation; is preferably lipofected using an opti-MEM solution, and when injected into fertilized eggs, the foreign gene-containing piggyBac transposon circular vector and transposase mRNA are microinjected using physiological saline. A preferred method is electroporation of a foreign gene-containing piggyBac transposon circular vector and a transposase mRNA in the case of injection into neurospheres.
上記外来遺伝子含有ベクターを上記トランスポゼーズとともに注入する上記細胞の個所としては、本発明の効果を奏することができる部位であれば特に制限されないが、モザイク胚の発生を最小限とするために一細胞期の受精卵の雄性前核、雌性前核、細胞質等に注入することが好ましく、マイクロインジェクションの場合は、雄性前核が雌性前核と比較してより大きいため注入しやすいという操作性の点で、雄性前核注入を好適に挙げることができる。雄性前核とは、受精卵で形成される***由来の核であって、受精卵の端部で形成された後、受精卵の中心部へ移動し、雌性前核と融合して、子の核が作られる。上記溶液の注入量としては、受精卵中の上記注入部位の体積を満たす程度であればよく、例えばマーモセットの受精卵中の注入個所が雄性前核である場合、１～１０ｐＬが好ましく、２～８ｐＬがより好ましく、３～７ｐＬがさらに好ましく、４～６ｐＬが特に好ましい。また、マイクロインジェクションにより細胞質に注入した場合でもトランスポゼーズの作用により外来遺伝子をゲノムＤＮＡへ導入することが可能であるため、前核が小さく注入が難しいマーモセット等の霊長類などには細胞質注入が有効である。 The site of the cell into which the foreign gene-containing vector is injected together with the transposase is not particularly limited as long as it can exhibit the effects of the present invention. It is preferable to inject into the male pronucleus, female pronucleus, cytoplasm, etc. of cell-stage fertilized eggs. In this regard, male pronuclear injection can be preferably mentioned. The male pronucleus is a sperm-derived nucleus formed in a fertilized egg. After being formed at the end of the fertilized egg, it moves to the center of the fertilized egg and fuses with the female pronucleus to produce the offspring. nucleus is made. The amount of the solution to be injected may be sufficient to fill the volume of the injection site in the fertilized egg. 8 pL is more preferred, 3 to 7 pL is even more preferred, and 4 to 6 pL is particularly preferred. In addition, even if the foreign gene is injected into the cytoplasm by microinjection, it is possible to introduce the foreign gene into the genomic DNA by the action of transposase. It is valid.
上記（ニ）の外来遺伝子が導入された細胞を選択する工程としては、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を選択する工程であれば特に制限されず、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞としては、細胞内に注入された外来遺伝子含有ベクターのトランスポゾン配列をトランスポゼーズが認識して切り取ることにより、トランスポゾン領域が宿主細胞のゲノムＤＮＡに挿入される一方、挿入されなかった外来遺伝子導入判定領域における判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの発現による蛍光強度が、トランスポゼーズにより切り取られなかったベクターにおける判定用蛍光タンパク質の蛍光強度と比較して顕著に小さくなることを挙げることができる。具体的には、ヒト２９３Ｔ細胞の場合は、トランスポゾン領域が宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後５日目までは判定用蛍光タンパク質が発現し、１５日目までに徐々に減衰するのに対し、宿主細胞に導入されたときは、ベクター注入後５日目までに判定用蛍光タンパク質の蛍光がほぼ消滅する。また、マウス受精卵の場合は、トランスポゾン領域が宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後胚盤胞の段階に至る４日目から５日目まで判定用蛍光タンパク質が発現するのに対し、宿主細胞に導入されたときはベクター注入後１日目（２４時間）までに判定用蛍光タンパク質の蛍光が、蛍光顕微鏡を用いた目視において確認できなくなる。霊長類の受精卵の場合は、宿主細胞に導入されなかったときはベクター注入後胚盤胞の段階に至る１０日目まで判定用蛍光タンパク質が発現し、宿主細胞のゲノムに導入されたときはベクター注入後１日目（２４時間）までに判定用蛍光タンパク質の蛍光が、蛍光顕微鏡を用いた目視において確認できなくなる。したがって、外来遺伝子の導入を行った場合、判定用蛍光タンパク質の蛍光が、ベクター注入後７２時間以降、好ましくは４８時間以降、より好ましくは３６時間以降、さらに好ましくは２４時間以降等、早期に消失した細胞が、外来遺伝子導入が行われた細胞であると判定することができる。しかし、かかる判定用蛍光タンパク質の蛍光の減衰速度の加速化についてのメカニズムについてはいまだ明らかになっていない。
The step of selecting cells into which the exogenous gene has been introduced in (d) above is not particularly limited as long as it is a process of selecting cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination is rapidly attenuated. For cells with rapidly decaying fluorescence, the transposase recognizes and excises the transposon sequence of the foreign gene-containing vector injected into the cell, while the transposon region is inserted into the genomic DNA of the host cell. , the fluorescence intensity due to the expression of the DNA encoding the determination fluorescent protein in the foreign gene introduction determination region that was not inserted is significantly smaller than the fluorescence intensity of the determination fluorescent protein in the vector that was not excised by transposase. can be mentioned. Specifically, in the case of human 293T cells, when the transposon region was not introduced into the host cells, the fluorescent protein for determination was expressed until 5 days after vector injection, and gradually decreased by 15 days. On the other hand, when introduced into host cells, the fluorescence of the fluorescent protein for judgment almost disappears by
上記（ニ）の外来遺伝子が導入された細胞を選択する工程において、外来遺伝子が上記蛍光標識タンパク質を含む場合には、外来遺伝子が宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞においては細胞の増殖に伴い蛍光標識タンパク質による蛍光が徐々に強くなる一方で、判定用蛍光タンパク質の蛍光は急速に減衰する。他方、外来遺伝子が宿主細胞に導入されない場合は、判定用蛍光タンパク質と蛍光標識タンパク質は暫時蛍光が持続するが、二種類の蛍光が増強することはなく徐々に減衰し、やがて消滅する。したがって、判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰した細胞を選択することにより、蛍光標識タンパク質のみを使用する場合よりも、本発明の判定用蛍光タンパク質外来遺伝子を併用する本発明のキットを用いて遺伝子の導入を行う方が、外来遺伝子が導入された細胞の選択率は顕著に高くなる。 In the step of selecting cells into which the exogenous gene has been introduced in (d) above, when the exogenous gene contains the fluorescence-labeled protein, when the exogenous gene is introduced into the host cell, cell proliferation in the host cell While the fluorescence from the fluorescent-labeled protein gradually becomes stronger along with the increase, the fluorescence from the fluorescent protein for determination rapidly attenuates. On the other hand, when the exogenous gene is not introduced into the host cell, the fluorescent protein for determination and the fluorescent labeling protein continue to emit fluorescence for a while, but the two types of fluorescence gradually attenuate without increasing and eventually disappear. Therefore, by selecting cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination is rapidly attenuated, it is possible to use the kit of the present invention in combination with the foreign gene for the fluorescent protein for determination of the present invention rather than using only the fluorescently labeled protein. Gene transfer markedly increases the selection rate of cells into which the exogenous gene has been introduced.
上記蛍光強度の具体的な判定方法としては、蛍光顕微鏡による目視やＦＡＣＳによるフローサイトメトリー解析により行うことができる。目視の場合は、倒立型蛍光顕微鏡により、例えば、感度４００露光時間・１秒、又はこれと同等の効果を有する条件で観察した場合に、目視で蛍光が認められると判断することができる。 As a specific method for determining the fluorescence intensity, visual observation using a fluorescence microscope or flow cytometry analysis using FACS can be performed. In the case of visual observation, it can be determined that fluorescence is visually observed when observed with an inverted fluorescence microscope under conditions having a sensitivity of 400 exposure time/1 second, or equivalent effects.
前記非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を作出する方法としては、採取した受精卵を子宮に戻し産子を取得する方法であれば特に制限されず、マウスの場合はゲノムＤＮＡに外来遺伝子が導入されたと判断される受精卵を、非ヒト哺乳類動物仮母として、偽妊娠マウス等の仮親マウスの卵管や子宮へ移植し、出産直前に帝王切開又は自然分娩を行い、新生子マウスを得、さらに里子操作を行うことにより、トランスジェニックマウスを得る方法を例示することができる。また、非ヒト霊長類動物の場合は、例えば、特開２０１２－１２５４１０やＷＯ２００９／０９６１０１に記載されている方法により体内に受精卵を戻し、トランスジェニックマーモセット等のトランスジェニック非ヒト霊長類動物を得ることができる。 The method of producing the non-human mammal transgenic animal is not particularly limited as long as it is a method of returning the collected fertilized eggs to the uterus to obtain offspring, and in the case of mice, it is determined that a foreign gene has been introduced into the genomic DNA. The fertilized egg obtained is transplanted into the fallopian tube or uterus of a pseudopregnant mouse or other foster mother mouse as a non-human mammalian animal foster mother, and Caesarean section or natural delivery is performed immediately before birth to obtain a neonatal mouse. can exemplify a method of obtaining a transgenic mouse. In the case of non-human primates, for example, the fertilized eggs are returned to the body by the methods described in JP-A-2012-125410 and WO2009/096101 to obtain transgenic non-human primates such as transgenic marmosets. be able to.
トランスジェニックマーモセットの作出においては、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズを体外受精後１５～２時間のマーモセット受精卵の細胞質にマイクロインジェクションした後、マイクロインジェクション後４－５日（９６～１２０時間）目に６細胞期から１６細胞期まで発生した胚のうち、判定領域の蛍光タンパク質の蛍光が急速に（例えばマイクロインジェクション後２４時間までに）減衰し、蛍光標識タンパク質の発現が安定している細胞を仮親へ移植することが好ましい。 In the production of transgenic marmosets, a PB transposon-containing circular vector and piggyBac transposases were microinjected into the cytoplasm of fertilized marmoset eggs 15-2 hours after in vitro fertilization, and then 4-5 days (96-120 hours) after microinjection. ) Among embryos that developed from the 6-cell stage to the 16-cell stage, the fluorescence of the fluorescent protein in the judgment region rapidly decays (e.g., by 24 hours after microinjection), and the expression of the fluorescently labeled protein is stable. It is preferred to transplant the cells into a foster parent.
上記非ヒト霊長類ランスジェニック動物細胞に、外来遺伝子が導入されているかどうかは、例えば、各外来タンパク質をコードするＤＮＡに対応するプライマーセットを用いてＰＣＲ法により、確認することができる。 Whether or not a foreign gene has been introduced into the non-human primate transgenic animal cell can be confirmed, for example, by PCR using a primer set corresponding to the DNA encoding each foreign protein.
外来遺伝子が導入されたトランスジェニック動物について後代検定を行うことにより、外来タンパク質の発現が確認された非ヒト哺乳類トランスジェニック動物を得ることができ、かかる動物から生殖能及び／又は受精能を有する非ヒト哺乳類トランスジェニック動物細胞を得ることができる。 By performing a progeny test on the transgenic animal into which the foreign gene has been introduced, it is possible to obtain a non-human mammal transgenic animal in which the expression of the foreign protein has been confirmed, and from such an animal, a non-human mammal having reproductive ability and / or fertility Human mammalian transgenic animal cells can be obtained.
前記外来遺伝子導入細胞を選択する方法により選択された外来遺伝子導入細胞は、導入された外来遺伝子に因る疾病を改善するための薬剤をスクリーニングするためのスクリーニング用細胞として使用することもできる。 Foreign gene-introduced cells selected by the method for selecting foreign gene-introduced cells can also be used as screening cells for screening drugs for ameliorating diseases caused by introduced foreign genes.
例えば、外来遺伝子としてＬＲＲＫ２の変異遺伝子を導入した外来遺伝子導入細胞は、パーキンソン病の治療薬をスクリーニングするための細胞として用いることができる。例えば、ＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基となる変異により、ＬＲＲＫ２のもつセリン／スレオニンリン酸化活性が過剰にはたらくことでパーキンソン病の原因となっていることが示されており、かかるＬＲＲＫ２変異をもつ神経幹細胞では継代に依存してさまざまな基質が過剰にリン酸化されて、核膜の変形など表現型の原因になっている可能性があるとされている。したがって、継代を重ねた上記ＬＲＲＫ２変異を有する神経幹細胞であって、核膜の変形など表現型がある細胞について、被検物質を培地に添加することにより核膜の変形がレスキューされた場合に、当該被検物質をパーキンソン病治療薬の候補物質としてピックアップすることができる。 For example, foreign gene-introduced cells into which an LRRK2 mutant gene has been introduced as a foreign gene can be used as cells for screening therapeutic agents for Parkinson's disease. For example, it has been shown that a mutation in which the 2019th glycine residue of LRRK2 becomes a serine residue causes Parkinson's disease due to excessive serine / threonine phosphorylation activity of LRRK2. In neural stem cells with LRRK2 mutation, it is possible that passage-dependent hyperphosphorylation of various substrates may be the cause of phenotypes such as deformation of the nuclear membrane. Therefore, for neural stem cells having the above-mentioned LRRK2 mutation that have been passaged repeatedly and have a phenotype such as deformation of the nuclear membrane, when the deformation of the nuclear membrane is rescued by adding a test substance to the medium, , the test substance can be picked up as a candidate substance for a therapeutic agent for Parkinson's disease.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
［ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞への外来遺伝子導入］
ＫＯ／ＥＧＦＰ－ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクター（Medical Research Council(UK)社製）とを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入することを試みた。なお、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３細胞にＳＶ４０Ｔが導入された細胞である。
[Example 1]
[Foreign gene introduction into human embryonic kidney 293T cells]
Using a KO/EGFP-piggybac (PB) transposon-containing circular vector and a piggyBac transposase vector (manufactured by Medical Research Council (UK)), the DNA encoding the EGFP protein was transfected into the genomic DNA of human embryonic kidney 293T cells. tried to introduce it into The human embryonic kidney 293T cells are cells obtained by introducing SV40T into 293 cells, which are human fetal-derived kidney epithelial cells.
（ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞の調製）
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（Riken BioResource Center 社製）を１０％加熱不活化ウシ胎児血清と１％の抗真菌性抗生物質溶液（antibiotic-antimycotic solution）とを添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中において増殖させた。
(Preparation of human embryonic kidney 293T cells)
Human embryonic kidney 293T cells (manufactured by Riken BioResource Center) in DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 1% antibiotic-antimycotic solution grown inside.
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの作製］
（外来遺伝子導入判定領域の調製）
判定用プロモーターＤＮＡとして、配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；さらにもう一度配列番号１０に示される判定用プロモーターであるＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ；判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している蛍光タンパク質としてのｈＫＯ１をコードする、配列番号１１に示されるＤＮＡ配列；ｈＫＯ１に作用するタンパク質不安定化配列をコードするＤＮＡとして、配列番号７に示されるｄ２ｐｅｓｔ；をコードするＤＮＡ；及び配列番号１２に示されるポリＡのＤＮＡ配列；を順次連結することにより上記外来遺伝子導入判定領域とした。
[Preparation of circular vector containing KO/EGFP-PB transposon]
(Preparation of Foreign Gene Introduction Judgment Region)
CMV 1 promoter DNA, which is the promoter for determination shown in SEQ ID NO: 10, as the promoter DNA for determination; d2pest shown in SEQ ID NO: 7 as a DNA encoding a protein destabilizing sequence that acts on hKO1; CMV 1 promoter DNA that is a judgment promoter shown in SEQ ID NO: 10 once again; DNA sequence shown in SEQ ID NO: 11, encoding hKO1 as a fluorescent protein operably linked downstream; d2pest, shown in SEQ ID NO: 7, as DNA encoding a protein destabilizing sequence that acts on hKO1; and the DNA sequence of poly A shown in SEQ ID NO: 12;
上記ＰＥＳＴ配列の必要性については２９３Ｔ細胞を用いて事前検討を行った。外来遺伝子導入判定領域の判定用蛍光タンパク質としてＫＯを用い、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域の蛍光標識タンパク質としてＧＦＰを用いた場合、ＰＥＳＴ配列がないとＫＯの蛍光が強いまま、ＧＦＰのフィルターに漏れこみ、判定が困難になる場合があることを確認した。用いるプロモーターの種類により、ＧＦＰの発現強度が違うため、各種ベクター毎にＫＯｄ４ＰＥＳＴ又はＫＯｄ２ＰＥＳＴを選択することが好ましいことを確認している（データ示さず）。以下の検討では、ＫＯｄ２ＰＥＳＴを用いて行うこととした。 The necessity of the above PEST sequence was examined in advance using 293T cells. When KO was used as a fluorescent protein for determination of the foreign gene introduction determination region and GFP was used as a fluorescence-labeled protein for the piggyBac transposon region, the strong fluorescence of KO leaked into the GFP filter without the PEST sequence, resulting in poor determination. I know it can be difficult. Since the expression intensity of GFP differs depending on the type of promoter used, it has been confirmed that it is preferable to select KOd4PEST or KOd2PEST for each vector (data not shown). In the following examination, we decided to use KOd2PEST.
（ＰＢトランスポゾン領域の調製）
次いで、Ｐｉｇｇｙｂａｃ（ＰＢ）トランスポゾンの５’末端のＤＮＡ配列であるＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）と、ＰＢトランスポゾンの３’末端のＤＮＡ配列ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）とが、一対の逆向き反復配列を構成しているＰＢトランスポゾン領域を含む環状ベクターを作製した。
(Preparation of PB transposon region)
Next, PB5'TR (SEQ ID NO: 1), which is the DNA sequence at the 5' end of the Piggybac (PB) transposon, and PB3'TR (SEQ ID NO: 2), the DNA sequence at the 3' end of the PB transposon, are paired in opposite directions. A circular vector containing the PB transposon region made up of repeats was constructed.
上記ＰＢトランスポゾン領域内の非ヒト霊長類動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡとして、配列番号１３に示されるＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ；上記ＣＭＶ２プロモーターの下流に作動可能に連結された外来タンパク質をコードするＤＮＡとして配列番号１４に示されるＥＧＦＰ遺伝子をコードするＤＮＡ；及び配列番号１２に示されるポリＡのＤＮＡ配列；を用いることにより、ＰＢ５’ＴＲＤＮＡ、ＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ、ポリＡＤＮＡ、ＰＢ３’ＴＲＤＮＡ、を５’末端から順次含むＥＧＦＰ含有ＰＢトランスポゾン領域とした。 CMV 2 promoter DNA shown in SEQ ID NO: 13 as the foreign protein promoter DNA that functions in non-human primate animal cells within the PB transposon region; encodes a foreign protein operably linked downstream of the CMV 2 promoter DNA encoding the EGFP gene shown in SEQ ID NO: 14; and the DNA sequence of poly A shown in SEQ ID NO: 12 ; , PB3'TRDNA, and the EGFP-containing PB transposon region sequentially from the 5' end.
（ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの構成）
ＰＢ－ＣＡ－ｒｔＴＡＡｄｖにおけるプロモーターを改変したディスティネーションベクターをバックボーンとして、ＣＭＶ－ｈＫＯとＣＭＶ－ＧＦＰ（エントリーベクターにのったもの）を挿入した ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＭＶ２プロモーター－ＥＧＦＰ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクター（配列番号１６）の具体的な構成は、以下のとおりである。
(Construction of circular vector containing KO/EGFP-PB transposon)
CMV 1 promoter-hKO1d2PEST-CMV 1 promoter-hKO1d2PEST-PB5' in which CMV-hKO and CMV-GFP (on the entry vector) were inserted with the destination vector in which the promoter in PB-CA-rtTAAdv was modified as the backbone. A specific construction of the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector (SEQ ID NO: 16), including the TR- CMV2 promoter-EGFP-PB3'TR construction, is as follows.
判定用のＣＭＶ１プロモーターＤＮＡ配列（配列番号１０）：
配列番号１６の第１９７８番から第２５６６番、及び第３５５１番から第４１３９番までの塩基配列；
ｈＫＯ１（配列番号１１）：
配列番号１６の第２５８４番から第３２３７番、及び第４１５７番から第４８１０番までの塩基配列；
ｄ２ＰＥＳＴ（配列番号７）：
配列番号１６の第３２４４番から第３３６７番、及び第４８１７番から第４９４０番までの塩基配列；
ポリＡ（配列番号１２）：
配列番号１６の第３３７１番から第３４９１番、及び第４９４４番から第５０６４番までの塩基配列；
ＰＢ５’ＴＲ（配列番号１）：
配列番号１６の第５１９４番から第５５０６番までの塩基配列；
ＣＭＶ２プロモーターＤＮＡ（配列番号１３）：
配列番号１６の第５５７２番から第６１００番までの塩基配列；
ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）：
配列番号１６の第６１２４番から第６８４１番までの塩基配列；
ＰＢ３’ＴＲ（配列番号２）：
配列番号１６の第７６０６番から第７８４０番までの塩基配列；
CMV 1 promoter DNA sequence for determination (SEQ ID NO: 10):
Nucleotide sequences from 1978th to 2566th and 3551st to 4139th of SEQ ID NO: 16;
hKO1 (SEQ ID NO: 11):
Nucleotide sequences from 2584th to 3237th and 4157th to 4810th of SEQ ID NO: 16;
d2PEST (SEQ ID NO: 7):
Nucleotide sequences from 3244th to 3367th and 4817th to 4940th of SEQ ID NO: 16;
Poly A (SEQ ID NO: 12):
Nucleotide sequences from 3371st to 3491st and from 4944th to 5064th of SEQ ID NO: 16;
PB5'TR (SEQ ID NO: 1):
Nucleotide sequence from 5194th to 5506th of SEQ ID NO: 16;
CMV2 promoter DNA (SEQ ID NO: 13):
Nucleotide sequence from 5572nd to 6100th of SEQ ID NO: 16;
DNA sequence encoding EGFP (SEQ ID NO: 14):
Nucleotide sequence from 6124th to 6841st of SEQ ID NO: 16;
PB3'TR (SEQ ID NO:2):
Nucleotide sequence from 7606th to 7840th of SEQ ID NO: 16;
（ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターの作製）
上記ＰＢトランスポゾン領域における一対の逆向き反復配列を認識するトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターをMedical Research Council (UK)から購入した。かかるベクターには、ＣＭＶ３プロモーターＤＮＡ配列（配列番号１７）の下流に、上記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズをコードするＤＮＡ配列として、Yusa et al, PNAS 2011に記載があり、Medical Research Council国立研究所（ＵＫ）が供給するＨｙＰＢａｓｅ（hyperactive piggybac transposase）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１８）、及びポリＡ（配列番号１２）が組み込まれている。
(Preparation of piggyBac transposase expression vector)
A piggyBac transposase expression vector containing a DNA sequence encoding a transposase that recognizes a pair of inverted repeats in the PB transposon region was purchased from the Medical Research Council (UK). Such vectors include those described by Yusa et al, PNAS 2011 as the DNA sequence encoding the piggyBac transposase downstream of the CMV3 promoter DNA sequence (SEQ ID NO: 17), and the Medical Research Council National Laboratory (UK A DNA sequence (SEQ ID NO: 18) encoding HyPBase (hyperactive piggybac transposase) supplied by A.P.A.) and poly A (SEQ ID NO: 12) are incorporated.
（２９３Ｔ細胞へのコトランスフェクション）
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、合計１μｇ／ｍｌを上記２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした（Ｄａｙ０）。ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をネガティブコントロールとした。トランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてＫＯ１とＧＦＰを、倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７１型、オリンパス社製；カメラＤＰ７３ 感度４００露光時間・１秒）で経時的に観察した。結果を図２の（ａ１）及び（ｂ１）に示す。ＥＧＦＰとｈＫＯ１のＦＡＣＳ解析も行った。結果を図２の（ａ２）及び（ｂ２）に示す。
(Co-transfection into 293T cells)
The KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and the piggyBac transposase circular vector were co-transfected into the 293T cells at a concentration ratio of 2:1 (Day 0). 293T cells transfected with the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector alone served as a negative control. For 293T cells after transfection, EGFP was detected using an excitation light of 488 nm, and KO1 and GFP were detected using an excitation light of 548 to 584 nm. seconds) was observed over time. The results are shown in (a1) and (b1) of FIG. FACS analysis of EGFP and hKO1 was also performed. The results are shown in (a2) and (b2) of FIG.
（結果）
図２（ａ１）及び（ａ２）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰ（緑）とｈＫＯ１（オレンジ）の発現が開始された。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の両方が強く発現していることが、ＥＧＦＰとｈＫＯ１の蛍光の目視観察（ａ１）及びＦＡＣＳ解析（ａ２）から確認できる。しかし、Ｄａｙ１５では、ＥＧＦＰによる蛍光とｈＫＯ１による蛍光のいずれもがほとんど消滅した。
(result)
As is clear from FIGS. 2(a1) and (a2), in the negative control cells to which only the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector was added, the expression of EGFP (green) and hKO1 (orange) was initiated on
したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターが添加されず、トランスポゾン含有環状ベクターにおいて、トランスポゾン領域が切り出されない場合は、ＥＧＦＰとＫＯが共発現する状態が少なくともＤａｙ５までは続くこと、その後Ｄａｙ１５までには、ｈＫＯ１、ＥＧＦＰいずれの発現も消失することが確認された。図２（ａ２）のＦＡＣＳデータから明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターを添加しなかった細胞においては、ＥＧＦＰが導入された細胞は、ほぼなかった。２９３Ｔ細胞はランダムインテグレーションしやすいので、ＥＧＦＰもしくはｈＫＯ１のみ導入される細胞が存在する可能性があるが、その可能性を加味しても、ＥＧＦＰが導入された細胞はなかったといえる。
Therefore, when the piggyBac transposase vector is not added and the transposon region is not excised in the transposon-containing circular vector, the state in which EGFP and KO are co-expressed continues at least until
一方、図２（ｂ１）及び（ｂ２）から明らかなとおり、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとをコトランスフェクトした細胞（ｂ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が観察できるが、Ｄａｙ５では、上記（ａ）細胞と比較して、ＧＦＰの緑色蛍光が強く、ＫＯ１のオレンジ色蛍光の強度は小さいことから、ＥＧＦＰのみが発現している細胞が存在することと、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方を発現している細胞とが混在していることが確認された。したがって、トランスポゼーズの作用によりＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＧＦＰの発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＫＯ１の発現は５日目ごろまでに急速に減衰することが確認された。Ｄａｙ１５においては、ＫＯ１の蛍光は観察されずＥＧＦＰのみが発現している細胞が多く観察され、ＥＧＦＰを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
On the other hand, as is clear from FIGS. 2(b1) and (b2), in the cells (b cells) co-transfected with the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and the piggyBac transposase circular vector, EGFP and KO1 expression can be observed, but on
［実施例２］
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
ＥＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウス胚のゲノムＤＮＡへ挿入することを試みた。外来遺伝子含有ベクターとして、配列番号１６の第４１２番目と８０６５番目の塩基をＦｓｐＩで制限酵素処理することにより切断し、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを直鎖状にしたＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いた。また、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現ベクタ－を直鎖状にしたものを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡを作製した。
[Example 2]
[EGFP introduction into mouse embryos using KO/EGFP-PB transposon-containing linear vector]
An attempt was made to insert the DNA encoding the EGFP protein into the genomic DNA of C57BL/6 mouse embryos. As a foreign gene-containing vector, bases 412 and 8065 of SEQ ID NO: 16 were cleaved by restriction enzyme treatment with FspI, and the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector was linearized. A PB transposon-containing linear vector was used. Using the linearized piggyBac transposase expression vector as a template, piggyBac transposase mRNA was prepared with T7 RNA polymerase.
（マウス胚におけるトランスポゼーズの有無についての検討）
上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとを、マイクロマニピュレータ（Leica社）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした場合の倒立型蛍光顕微鏡による観察の結果を図３（ａ）に示す。また、上記直鎖ベクターをマイクロインジェクションしたが、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡをマイクロインジェクションしなかった場合についても図３（ｂ）に示す。図３（ｃ）では、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されたと推定される細胞について、マイクロインジェクション後２４、４８、７２、９６時間後の細胞の様子を示す。なお、図中〇印のＮＣは、マイクロインジェクションを行っていない、ネガティブコントロールである。
(Examination of the presence or absence of transposases in mouse embryos)
Observation with an inverted fluorescence microscope when the linear vector containing the KO/EGFP-PB transposon and the piggyBac transposase mRNA were microinjected into the male pronucleus of a mouse embryo using a micromanipulator (Leica). The results are shown in FIG. 3(a). FIG. 3(b) also shows the case where the linear vector was microinjected but the piggyBac transposase mRNA was not microinjected. FIG. 3(c) shows the state of cells presumed to have EGFP inserted into their genomic DNA at 24, 48, 72 and 96 hours after microinjection. NCs marked with ◯ in the figure are negative controls without microinjection.
（結果）
図３（ａ）及び（ｃ）から明らかなとおり、トランスポゾン機構が作用して、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された細胞（図３（ａ）の四角白矢印で示した緑色の細胞）においては、ＥＧＦＰの緑色蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始めたのに対し、ＫＯ１（オレンジ）は初めからほとんど発現することなかった。ＥＧＦＰ単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図３（ｃ））。したがって、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入された場合、ゲノムＤＮＡに挿入されなかったＫＯ１は、ｄ２ｐｅｓｔの作用により予想されるＫＯ１の不安定化よりも急速に不活化されることが予想された。一方、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに挿入されなかった場合、ＥＧＦＰとＫＯ１は、Ｄａｙ４まで共発現していた（図３（ｂ））。
(result)
As is clear from FIGS. 3(a) and (c), in cells in which the transposon mechanism acts and EGFP is inserted into the genomic DNA (green cells indicated by square white arrows in FIG. 3(a)), Green fluorescence of EGFP began to be expressed after 24 hours (Day 1), whereas KO1 (orange) was hardly expressed from the beginning. After 96 hours (Day 4), development progressed to blastocyst while EGFP single fluorescence persisted (Fig. 3(c)). Therefore, when EGFP was inserted into the genomic DNA, KO1 that was not inserted into the genomic DNA was expected to be inactivated more rapidly than the destabilization of KO1 expected by the action of d2pest. On the other hand, when EGFP was not inserted into genomic DNA, EGFP and KO1 were co-expressed until Day 4 (Fig. 3(b)).
したがって、はじめからＫＯ１が発現しない、又はマイクロインジェクション後７２時間までにＫＯ１が発現しなくなった胚において、目的遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入された可能性が大きいと考えることができた。 Therefore, it was highly likely that the target gene was inserted into the genomic DNA in embryos in which KO1 was not expressed from the beginning or in which KO1 was not expressed by 72 hours after microinjection.
［実施例３］
［ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いたマウス胚へのＥＧＦＰ導入］
上記直鎖ベクターを用いた検討において、予想よりも胚発生率が低かったため、トランスポゾン含有直鎖ベクターよりも胚毒性が低いといわれているトランスポゾン環状ベクターを用いてマウス胚へのマイクロインジェクションを試みた。
[Example 3]
[EGFP introduction into mouse embryos using KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector]
In the study using the above linear vector, the embryo development rate was lower than expected, so we tried microinjection into mouse embryos using a transposon circular vector, which is said to be less toxic to embryos than a transposon-containing linear vector. .
ＥＧＦＰをコードするＤＮＡの、マウス胚のゲノムＤＮＡへの導入を試みた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来受精卵５１個について、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクター２ｎｇ／μＬと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ１ｎｇ／μＬとを、生理食塩水で溶解し、マウス胚雄性前核にマイクロインジェクションした。また、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来受精卵４９個について、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクター２ｎｇ／μＬと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ１ｎｇ／μＬとを生理食塩水で溶解し、マウス胚雄性前核にマイクロインジェクションした。結果を図４（ａ）（直鎖ベクターの場合）及び（ｂ）（環状ベクターの場合）に示す。 An attempt was made to introduce DNA encoding EGFP into the genomic DNA of mouse embryos. For 51 C57BL/6 mouse-derived fertilized eggs, 2 ng/μL of the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and 1 ng/μL of mRNA prepared from the piggyBac transposase vector were dissolved in physiological saline, and the mouse embryos were pre-male. microinjected into the nucleus. Further, for 49 fertilized eggs derived from C57BL/6 mice, 2 ng/μL of KO/EGFP-PB transposon-containing linear vector and 1 ng/μL of mRNA prepared from piggyBac transposase vector were dissolved in physiological saline, and mouse embryos were obtained. It was microinjected into the male pronucleus. The results are shown in Figures 4(a) (for linear vectors) and (b) (for circular vectors).
図４（ａ）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有直鎖ベクターを用いた場合には、緑色やオレンジ色の蛍光の発現が早く強く確認でき、蛍光を発現した胚は４３個中４２個と高い割合であった。しかし、オレンジを発現した胚が２１個と多く、さらに胚盤胞（９６時間）まで発生が進んだ胚は４個のみであった。図４（ａ）の９６ｈの図から明らかなとおり、胚盤胞まで発生が進んだ胚４個のうち、ＧＦＰの蛍光があり、ＫＯの蛍光はなかった胚は２個であり、かかる２個の胚において、目的のＧＦＰ遺伝子が細胞の遺伝子に導入されたと判断した。なお、他の２個については、ＧＦＰ、ＫＯいずれの蛍光もなかった。赤丸はネガティブコントロール（ＮＣ）である。一方、図４（ｂ）から明らかなとおり、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いた場合には、蛍光発現が確認できる時期が遅くなり、かつ発現量が小さくなるものの、胚盤胞に達した胚は、９６時間で４１個中１４個であり、胚盤胞率が高くなった。また、ＥＧＦＰの緑色光を発現し、ＫＯの発現が見られない胚は３１個であり、ＥＧＦＰの発現率はやや低くなるものの、ＫＯの発現は全く見られなかった。 As is clear from FIG. 4(a), when the KO/EGFP-PB transposon-containing linear vector was used, the expression of green or orange fluorescence could be confirmed quickly and strongly, and fluorescence was expressed in 43 embryos. It was a high percentage of 42 pieces. However, 21 embryos expressed orange, and only 4 embryos further developed to blastocyst (96 hours). As is clear from the diagram at 96h in FIG. 4(a), among the four embryos that had developed to the blastocyst, two embryos had GFP fluorescence and no KO fluorescence. It was determined that the GFP gene of interest had been introduced into the cell's gene in the embryo. For the other two, neither GFP nor KO fluorescence was observed. Red circles are negative controls (NC). On the other hand, as is clear from FIG. 4(b), when the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector was used, the time at which fluorescence expression could be confirmed was delayed and the expression level was small, but the The number of embryos reached was 14 out of 41 at 96 hours, indicating a high blastocyst rate. In addition, 31 embryos expressed EGFP green light but no KO expression. Although the EGFP expression rate was slightly low, KO expression was not observed at all.
以上の結果より、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターを用いると、蛍光発現が確認できる時期が遅くなり、かつ発現量が小さくなるが、胚毒性が低く、かつＥＧＦＰのゲノムＤＮＡへの導入率が高くなったので、環状ベクターを用いることが好ましいと判断した。 From the above results, when the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector is used, the time at which fluorescence expression can be confirmed is delayed and the expression level is small, but the embryo toxicity is low and the EGFP introduction rate into the genomic DNA is low. was higher, it was decided that the use of circular vectors would be preferable.
［実施例４］
（トランスジェニックマウスの作製）
マウスの受精卵にマイクロインジェクション法により上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡとを注入することによりトランスジェニックマウスを作製した。受精卵としては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスとＣ３Ｈ系マウスとの交配によって得られるＢ６Ｃ３系統の交雑系マウスＢ６Ｃ３Ｆ１受精卵を用いた。上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡ（濃度比２：１）を受精後１０時間の受精卵の雄性前核もしくは細胞質に注入し、胚盤胞までマウス体外培養用培地であるｍＷＭ培地（アークリソース株式会社製）中で３７℃のインキュベーターで培養した。胚盤胞まで発生が進んだ各胚について倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、緑色蛍光のみが観察された胚を選別して（color selection＋）、もしくは蛍光発現による選別をせずに（color selection－）、非ヒト哺乳類動物仮母として、偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮に移植し、自然分娩もしくは帝王切開により新生子マウスを取得した。新生子マウスは、里子操作を行うことにより、離乳期（weaning）まで産子を育てた。
[Example 4]
(Generation of transgenic mice)
Transgenic mice were produced by injecting the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and the mRNA produced from the piggyBac transposase vector into mouse fertilized eggs by microinjection. As the fertilized egg, a B6C3F1 fertilized egg of a B6C3 strain hybrid mouse obtained by mating a C57BL/6 (B6) mouse and a C3H mouse was used. The mRNA (concentration ratio 2:1) prepared from the circular vector containing the KO/EGFP-PB transposon and the piggyBac transposase vector was injected into the male pronucleus or cytoplasm of the fertilized
出生後２～３週間の間に、上記産子の尻尾を５ｍｍほど切り取り、マウスゲノムＤＮＡを抽出した。ＥＧＦＰ又はＫＯを特異的に検出することができる、以下に示す各プライマーセットを用いてＰＣＲ法によりトランスジェニックマウスの獲得率を調査した。結果を以下の表１に示す。 Two to three weeks after birth, the tail of the offspring was cut off by about 5 mm, and mouse genomic DNA was extracted. Using each primer set shown below, which is capable of specifically detecting EGFP or KO, the acquisition rate of transgenic mice was investigated by the PCR method. The results are shown in Table 1 below.
ＥＧＦＰ：
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（フォワードプライマー）（配列番号１９）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２０）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（フォワードプライマー）（配列番号２１）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号２２）
EGFP:
5′-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-3′ (forward primer) (SEQ ID NO: 19)
5′-GCTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3′ (reverse primer) (SEQ ID NO: 20)
KO:
5′-GAGGGCCTGAGCTGGGAGA-3′ (forward primer) (SEQ ID NO: 21)
5′-CACCAGCCTGTGGCCGATGA-3′ (reverse primer) (SEQ ID NO: 22)
（結果１－Ｎｕｃｌｅａｒ １ｎｇ／μＬ・蛍光確認あり（＋））
９２個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核に５ｐＬマイクロインジェクションした胚盤胞（９６時間）に達した胚６６個（７５．０％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、５５個（８３．３％）であった。そのうち３９個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は５匹であり、離乳した産子は３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰを発現していた。しかしながら、そのうち１匹は、ＫＯについても発現していた。これは、ランダムインテグレーションが理由であると考えられる。以上より胚盤胞（９６時間）にＥＧＦＰによる蛍光が確認された胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
(Result 1-
For 92 fertilized eggs, 66 embryos (75.0 %), 55 (83.3%) showed green fluorescence and no expression of KO by visual observation using a microscope. Of these, 39 embryos were transplanted into the uterus of pseudopregnant mice (ICR strain), and 5 offspring were obtained, and 3 offspring were weaned. All three mice expressed EGFP. However, one of them also expressed for KO. This is believed to be due to random integration. From the above, when the blastocyst embryo in which EGFP fluorescence was confirmed in the blastocyst (96 hours) was transplanted into the mother, the ratio of transgenic mice into which EGFP was introduced was 100% among the obtained mice. rice field.
（結果２－Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ３ｎｇ／μＬ・蛍光確認あり（＋））
９５個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核期の細胞質に５ｐＬマイクロインジェクションした。胚盤胞（９６時間）に達した胚６４個（８５．３％）のうち、顕微鏡を用いた目視により緑色蛍光が認められ、かつ、ＫＯの発現は認められなかったものは、２７個（４２．２％）であった。そのうち２６個の胚を偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植して得られた新生子は３匹であり、離乳した産子も３匹であった。この３匹はいずれもＥＧＦＰが発現していたが、ＫＯの発現は認められなかった。したがって、ＥＧＦＰによる蛍光が確認され、かつＫＯの発現は認められなかった胚盤胞の胚を母体へ移植した場合、得られたマウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は１００％であった。
(Result 2-Cytoplasm 3 ng/μL, fluorescence confirmed (+))
For 95 fertilized eggs, 5 pL of a 3 ng/μL transposon vector-transposase mRNA mixture (2:1) was microinjected into the cytoplasm of the male pronuclear stage. Of the 64 embryos (85.3%) that reached blastocyst (96 hours), 27 (85.3%) showed green fluorescence visually with a microscope and did not express KO. 42.2%). Of these, 26 embryos were transplanted into the uterus of pseudopregnant mice (ICR strain), and 3 offspring were obtained, and 3 offspring were weaned. All three animals expressed EGFP, but no expression of KO was observed. Therefore, when blastocyst embryos in which EGFP fluorescence was confirmed and KO expression was not observed were transplanted into mothers, the ratio of EGFP-introduced transgenic mice among the obtained mice was 100%. there were.
（結果３－Ｎｕｃｌｅａｒ １ｎｇ／μＬ・蛍光確認なし（－））
７０個の受精卵について、１ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は５０％であった。
(Result 3-
For 70 fertilized eggs, microinjection of 1 ng/μL of transposon-vector-transposase mRNA mixture (2:1) into the male pronucleus resulted in all pseudoblastic embryos without fluorescence confirmation. As a result of transplantation into the uterus of pregnant mice (ICR strain), the ratio of EGFP-introduced transgenic mice among the neonatal mice obtained was 50%.
（結果４－Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ３ｎｇ／μＬ・蛍光確認なし（－））
７４個の受精卵について、３ｎｇ／μＬのトランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を前核期の細胞質にマイクロインジェクションした場合に、胚盤胞に達した胚について蛍光確認することなくすべて偽妊娠マウス（ＩＣＲ系）の子宮へ移植した結果、得られた新生子マウスのうちＥＧＦＰが導入されたトランスジェニックマウスの割合は８１．８％であった。
(Result 4-Cytoplasm 3 ng/μL, no fluorescence confirmation (-))
For 74 fertilized eggs, microinjection of 3 ng/μL of transposon-vector-transposase mRNA mixture (2:1) into pronuclear-stage cytoplasm without fluorescence confirmation for embryos that reached blastocyst. As a result of transplantation into the uterus of all pseudopregnant mice (ICR strain), the ratio of EGFP-introduced transgenic mice among the neonatal mice obtained was 81.8%.
（まとめ）
以上のとおり、トランスポゾンベクター・トランスポゼーズｍＲＮＡ混合物（２：１）を雄性前核又は雄性前核期の細胞質にマイクロインジェクションし、胚盤胞において蛍光の有無を確認し、胚盤胞にＫＯの発現が消失し、ＥＧＦＰが発現している胚を選択するとＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたトランスジェニックマウスの産生率は顕著に高くなり、今回の検討では、１００％という値を得た。特に、前核が小さく、注入が困難な動物種には、トランスポゾンベクターとトランスポゼーズｍＲＮＡの細胞質注入が有効であることが示された。
(summary)
As described above, the transposon vector/transposase mRNA mixture (2:1) was microinjected into the male pronucleus or male pronuclear stage cytoplasm, and the presence or absence of fluorescence was confirmed in the blastocysts. When embryos in which EGFP expression is lost and EGFP is expressed are selected, the production rate of transgenic mice in which EGFP is introduced into the genomic DNA is remarkably increased, and in this study, a value of 100% was obtained. In particular, cytoplasmic injection of transposon vector and transposase mRNA was shown to be effective in animal species that have small pronuclei and are difficult to inject.
［実施例５］
（後代検定）
上記で得られたＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスについて後代検定を行った。実施例４で取得された、雄性前核にトランスポゾンとトランスポゼーズを注入した胚由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス２匹と、前核期受精卵の細胞質にトランスポゾンとトランスポゼーズｍＲＮＡを注入した受精卵由来で、ＥＧＦＰの発現が確認されたマウス３匹、ファウンダーＢ６Ｃ３マウスのＦ１を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと掛け合わせた結果を以下の表２に示す。
[Example 5]
(Progeny test)
A progeny test was performed on the transgenic mice expressing EGFP obtained above. Transposon and transposase mRNA in the cytoplasm of two mice obtained in Example 4, derived from embryos in which transposons and transposases were injected into the male pronucleus, and in which EGFP expression was confirmed, and pronuclear stage fertilized eggs. Table 2 below shows the results of crossing F1 of 3 mice, founder B6C3 mice, founder B6C3 mice derived from fertilized eggs injected with EGFP, and C57BL/6J mice.
（結果）
上記表２のとおり、野生型マウスと掛け合わせることにより、Ｎｕｃｌｅａｒ３のＦ１系統（雄性前核期に注入）を除いて、ＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入されたＦ１マウスを取得することができた。したがって、上記ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクターより作製したｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることにより細胞に導入されたＥＧＦＰをコードするＤＮＡは、生殖細胞においても発現し次世代に伝達することが確認された。
(result)
As shown in Table 2 above, by crossing with wild-type mice, F1 mice in which EGFP was introduced into the genomic DNA could be obtained, except for the F1 strain of Nuclear3 (injected at the male pronuclear stage). Therefore, DNA encoding EGFP introduced into cells by microinjection of mRNA prepared from the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and the piggyBac transposase vector is also expressed in germ cells and transmitted to the next generation. It was confirmed that
［実施例６］
［トランスジェニックマーモセット作出］
実中研において飼育管理しているコモンマーモセットからＥＧＦＰをコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニックマーモセットを作出した。
[Example 6]
[Generation of transgenic marmosets]
A transgenic marmoset into which a DNA encoding EGFP was introduced was produced from a common marmoset bred and managed at CIEA.
３ｎｇ／μＬのＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡ（２：１）を体外受精後１７時間のマーモセット受精卵の細胞質にマイクロインジェクションした。Ｂｌａｓｔ ａｓｓｉｓｔ培地（ORIGIO社製）にて３７℃にて培養した。ＧＦＰとＫＯは倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にて発現の観察を続け、マイクロインジェクション後４－５日（９６～１２０時間）目に６細胞期から１６細胞期まで発生した胚で、ＥＧＦＰの緑蛍光のみを発現している３０個を１９匹の仮親へ移植し３匹妊娠（１５．８％）し、そのうち１匹が出産し、仔１と仔２の２匹（６．７％）の産仔を獲得した。一方マイクロインジェクション後６－７日（１４４～１６８時間）目に桑実胚から胚盤胞まで発生した胚で、緑蛍光のみを発現している１９個を１２匹の仮親へ移植したところ４匹妊娠（３３．３％）したが全て流産した。流産の理由は明らかではないが、胚盤胞になるまで何度も蛍光観察をしたためＵＶ照射によるダメージがあった可能性も考えられる。
3 ng/μL of KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector and piggyBac transposase mRNA (2:1) were microinjected into the cytoplasm of fertilized marmoset eggs 17 hours after in vitro fertilization. It was cultured at 37° C. in a Blast assist medium (manufactured by ORIGIO). The expression of GFP and KO was continuously observed under an inverted fluorescence microscope (manufactured by Olympus), and EGFP was detected in embryos that developed from the 6- to 16-cell stage 4-5 days (96-120 hours) after microinjection. 30 cells expressing only green fluorescence were transplanted into 19 foster mothers, 3 became pregnant (15.8%), one of them gave birth, and 2
上記得られた個体について、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡが導入されたか否かを確認するために、産仔である仔１と仔２の体組織よりＲＮＡを抽出し、ＥＧＦＰ又はＫＯを特異的に検出する以下のプライマーセットを用いてＲＴ－ＰＣＲ法によりｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇした。内在性コントロールとしてはβ－アクチンを、ネガティブコントロールとしては野生型マーモセットの皮膚より作製したｃＤＮＡを使用してＲＴ－ＰＣＲで比較した。
In order to confirm whether or not DNA encoding EGFP has been introduced into the individuals obtained above, RNA is extracted from the body tissue of
１０μＬのＰＣＲ混合液は、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ９．０］，５０ｍＭのＫＣｌ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０μＭの各プライマーセット、及び１．０ＵのＫＯＤ－ＰＬＵＳ－ＮＥＯポリメラーゼを混合することにより作製された。９４℃にて２分の加熱処理；９８℃にて１０秒、６３℃にて３０秒のアニーリング、６８℃にて３０秒の伸長を１サイクルとして３０サイクル；の条件で増幅処理を行った。各プライマーセットは以下のとおりであった。ＲＴ－ＰＣＲの結果を図５に示す。 10 μL of the PCR mix contains 1×PCR buffer (10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 50 mM KCl), 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs, 10 μM of each primer set, and 1. It was made by mixing 0U of KOD-PLUS-NEO polymerase. Amplification was carried out under the following conditions: heat treatment at 94°C for 2 minutes; 30 cycles of 10 seconds at 98°C, annealing at 63°C for 30 seconds, and elongation at 68°C for 30 seconds. Each primer set was as follows. Results of RT-PCR are shown in FIG.
ＥＧＦＰ：
５’－ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’（配列番号１９）（フォワードプライマー）
５’－ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡ－３’（配列番号２０）（リバースプライマー）
ＫＯ：
５’－ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２１）（フォワードプライマー）
５’－ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡ－３’（配列番号２２）（リバースプライマー）
β－アクチン：
５’－ＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴ－３’（配列番号２３）（フォワードプライマー）
５’－ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧ－３’（配列番号２４）（リバースプライマー）
EGFP:
5′-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-3′ (SEQ ID NO: 19) (forward primer)
5′-GCTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3′ (SEQ ID NO: 20) (reverse primer)
KO:
5′-GAGGGCCTGAGCTGGGAGA-3′ (SEQ ID NO: 21) (forward primer)
5′-CACCAGCCTGTGGCCGATGA-3′ (SEQ ID NO: 22) (reverse primer)
β-actin:
5′-TGGACTTCGAGCAGGAGAT-3′ (SEQ ID NO: 23) (forward primer)
5′-CCTGCTTGCTGATCCACATG-3′ (SEQ ID NO: 24) (reverse primer)
（結果）
図５において、左から、野生型（ネガティブコントロール）、仔１と仔２それぞれの胎盤、仔１と仔２それぞれの毛根、仔１と仔２それぞれの皮膚、仔１と仔２それぞれの血液のＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。仔１と仔２それぞれの胎盤、仔２の毛根と仔１と仔２それぞれの血液において、ＥＧＦＰが発現し、かつＫＯを発現していないことが確認された。なお、仔１と仔２の皮膚・仔１の毛根において、発現がなかったが、ファウンダー個体自体は通常モザイクであること、組織によってプロモーターの発現量が若干異なること等が理由として考えられる。
(result)
In FIG. 5, from the left, wild type (negative control), placentas of
［実施例７］
［目的遺伝子導入実験－１］
哺乳類のゲノムＤＮＡに挿入する目的遺伝子として、パーキンソン病の原因となるＬＲＲＫ２の２０１９番目のグリシン残基がセリン残基である変異体（ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ））（以下、「変異ＬＲＲＫ２」ともいう）を選択した。蛍光発現レポーターであるＥＧＦＰをコードする遺伝子ＤＮＡと、その上流の上記変異ＬＲＲＫ２をコードする遺伝子ＤＮＡとを２Ａで接合し、さらにその上流に非ヒト霊長類動物細胞で機能するＣＡＧプロモーターを連結した領域をＰＢトランスポゾンによる挿入領域とした。ＰＢ５’ＴＲの上流の外来遺伝子導入判定領域を付加した、ＣＭＶ１プロモーター－ｈＫＯ１ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ＣＡＧプロモーター－ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）－２Ａ－ＥＧＦＰ－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲの構成を含む変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃ環状ベクター（図６）を作製した。
[Example 7]
[Target gene transfer experiment-1]
As a target gene to be inserted into mammalian genomic DNA, a mutant (LRRK2 (G2019S)) in which the 2019th glycine residue of LRRK2 that causes Parkinson's disease is a serine residue (hereinafter also referred to as "mutant LRRK2"). Selected. A region in which the gene DNA encoding EGFP, which is a fluorescent expression reporter, and the gene DNA encoding the mutated LRRK2 upstream thereof are spliced with 2A, and the CAG promoter that functions in non-human primate animal cells is linked upstream thereof. was used as the insertion region by the PB transposon. CMV 1 promoter-hKO1d2PEST-polyA-PB5'TR-CAG promoter-LRRK2(G2019S)-2A-EGFP-polyA-PB3'TR configuration with the addition of the foreign gene introduction determination region upstream of PB5'TR A mutated LRRK2-containing PiggyBac circular vector (Fig. 6) was generated.
実施例１と同様の手順で、ＫＯ／ＥＧＦＰ－ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターの代わりに上記変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃ環状ベクターを用い、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとともにヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションした。トランスフェクト後の２９３Ｔ細胞について、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてＫＯ１とＥＧＦＰを、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で経時的に観察した。結果を図７の（ａ）及び（ｂ）に示す。 By the same procedure as in Example 1, the mutant LRRK2-containing PiggyBac circular vector was used instead of the KO/EGFP-PB transposon-containing circular vector, and co-transfected into human embryonic kidney 293T cells together with the piggyBac transposase circular vector. For the 293T cells after transfection, EGFP was observed using an excitation light of 488 nm, and KO1 and EGFP were observed using an excitation light of 548 to 584 nm with an inverted fluorescent microscope (manufactured by Olympus) over time. The results are shown in FIGS. 7(a) and 7(b).
（結果）
図７（ａ）から明らかなとおり、変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃベクターのみを添加した（Ｄａｙ０）ネガティブコントロール細胞（ａ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が開始した。Ｄａｙ５においても、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方が強く発現していることが確認できる。しかし、Ｄａｙ１０においては、ＥＧＦＰによる蛍光とＫＯによる蛍光のいずれもが、ほとんど消滅した。
(result)
As is clear from FIG. 7(a), expression of EGFP and KO1 started on
一方、図７（ｂ）から明らかなとおり、上記変異ＬＲＲＫ２含有ＰｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズｍＲＮＡとをコトランスフェクトした（Ｄａｙ０）細胞（ｂ細胞）においては、Ｄａｙ１にＥＧＦＰとＫＯ１の発現が観察できるが、Ｄａｙ５では、上記（ａ）細胞と比較して、ＥＧＦＰの緑色蛍光が強く、ＫＯ１のオレンジ色蛍光の強度が小さい細胞（青矢印）があることから、ＥＧＦＰのみが発現している細胞（白矢印）が存在することと、ＥＧＦＰとＫＯ１の両方を発現している細胞とが混在していることが確認された。したがって、トランスポゼーズの作用によりＥＧＦＰがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＧＦＰの発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＫＯ１の発現は急速に（Ｄａｙ５ごろまでに）減衰することが確認された。Ｄａｙ１０においては、ＫＯ１の蛍光は観察されずＥＧＦＰのみが発現している細胞が多く観察され、ＬＲＲＫ２変異体遺伝子ＤＮＡとＥＧＦＰを含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
On the other hand, as is clear from FIG. 7(b), the expression of EGFP and KO1 was observed on
［実施例８］
［目的遺伝子導入実験－２］
（マウスニューロスフェアへの外来遺伝子導入）
哺乳類のゲノムＤＮＡに大型の遺伝子を挿入する目的遺伝子として以下のベクターを作製した。まず、神経幹細胞や神経前駆細胞で選択的に活性を有することが知られているG protein-coupled receptor 56（ｇｐｒ５６）ミニマムプロモーター（配列番号２５）（Bae et al., Science 2014等）の下流に蛍光レポーター遺伝子であるＥＧＦＰと発光レポーターであるLuciferase２を接合した（第二発現カセット）。しかし、上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚では活性をもたないため、導入部分を胚で選別しうるマーカーとして胚で活性を有するＥＯＳプロモーターとレポーター遺伝子ｈＫＯ１の第一発現カセットを第二発現カセットの下流に配置し、２つのカセットをインシュレーターで結合してＰＢトランスポゾンによる挿入領域（ＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域）とした。ＰＢ３’の上流の判定領域には挿入領域で使用していない青色蛍光を発現するＣｅｒｕｌｅａｎ（配列番号１５）をｄ２ＰＥＳＴと接合して、ＣＭＶプロモーター下に配置し、ＣＭＶ１プロモーター－Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｄ２ＰＥＳＴ－ポリＡ－ＰＢ５’ＴＲ－ｈｇｐｒ５６－ｅＧＦＰ－ルシフェラーゼ－Ｉｎｓ－ＥＯＳ－ｈＫＯ１－ポリＡ－ＰＢ３’ＴＲを含む図８に示すＰＢトランスポゾン環状ベクターを作製した。なお、上記Ｉｎｓは、インシュレーターを意味する。この実験ではＰｉｇｇｙＢａｃ トランスポゾン領域がプロモーターと外来タンパク質を各々含む２つのカセットを有するため、カセット間の干渉を防ぐために使用されている。
[Example 8]
[Target gene transfer experiment-2]
(Foreign gene introduction into mouse neurospheres)
The following vector was constructed as a target gene for inserting a large gene into mammalian genomic DNA. First, downstream of the G protein-coupled receptor 56 (gpr56) minimum promoter (SEQ ID NO: 25) (Bae et al., Science 2014, etc.), which is known to have selective activity in neural stem cells and neural progenitor cells A fluorescence reporter gene, EGFP, and a luminescence reporter, Luciferase2, were ligated (second expression cassette). However, since the gpr56 minimum promoter has no activity in embryos, the EOS promoter, which has activity in embryos, and the first expression cassette of the reporter gene hKO1 are placed downstream of the second expression cassette as markers that can select the introduced portion in embryos. The two cassettes were bound with an insulator to form an insertion region (PiggyBac transposon region) by the PB transposon. In the determination region upstream of PB3′, Cerulean (SEQ ID NO: 15) that expresses blue fluorescence and is not used in the insertion region is conjugated with d2PEST, placed under the CMV promoter, and CMV 1 promoter-Cerulean-d2PEST-poly A PB transposon circular vector shown in FIG. 8 containing A-PB5'TR-hgpr56-eGFP-luciferase-Ins-EOS-hKO1-polyA-PB3'TR was constructed. In addition, the above Ins means an insulator. In this experiment, the PiggyBac transposon region has two cassettes, each containing a promoter and a foreign protein, and is used to prevent interference between the cassettes.
上記外来遺伝子導入判定領域にＣｅｒｕｌｅａｎを配置し、トランスポゾン領域にｇｐｒ５６ミニマムプロモーターを搭載したＰＢトランスポゾン環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズベクター（Medical Research Council(UK)社製）とを用いて、ｈｇｐｒ５６ｅ１ｍ－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２（第二発現カセット）とＥＯＳ－ｈＫＯ１（第一発現カセット）とをコードするＤＮＡをマウスニューロスフェアのゲノムＤＮＡに導入することを試みた。 hgpr56e1m-EGFP using a PB transposon circular vector with a gpr56 minimum promoter in the transposon region, and a piggyBac transposase vector (Medical Research Council (UK)). - An attempt was made to introduce DNA encoding Luciferase2 (second expression cassette) and EOS-hKO1 (first expression cassette) into the genomic DNA of mouse neurospheres.
（マウスニューロスフェアの形成）
マウス胎仔脳線条体をｂＦＧＦ (basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)及びＢ２７を添加したＭＨＭ培地（Murayama et al., J Neurosci Res 2002）中において、浮遊培養法によって神経幹細胞・神経前駆細胞を増殖させてニューロスフェア形成させた。
(Formation of mouse neurospheres)
Neural stem cells/nerves were cultured by floating culture method in MHM medium supplemented with bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) and B27 (Murayama et al., J Neurosci Res 2002). Progenitor cells were expanded to form neurospheres.
（マウスニューロスフェアへのコトランスフェクション）
上記ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターを搭載したＰＢトランスポゾン含有環状ベクターと、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ環状ベクターとを濃度比２：１にて、上記マウスニューロスフェアにエレクトロポレーションした（Ｄａｙ０）。トランスポゼーズを加えず、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみをトランスフェクトしたニューロスフェアをネガティブコントロールとした。トランスフェクト後のニューロスフェアについて、励起光４５２ｎｍを用いてＣｅｒｕｌｅａｎを、励起光４８８ｎｍを用いてＥＧＦＰを、励起光５４８～５８４ｎｍを用いてｈＫＯ１を、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で経時的に観察した。また、Ｄａｙ５のニューロスフェアにBeetle Luciferin, Potassium Salt（Promega社製）を添加し、ルシフェラーゼの発現をＩＶＩＳ Spectrum In Vivo Imaging System（パーキンエルマー社製）で観察した結果を図９に示す。
(Co-transfection into mouse neurospheres)
The PB transposon-containing circular vector carrying the gpr56 minimum promoter and the piggyBac transposase circular vector were electroporated into the mouse neurosphere at a concentration ratio of 2:1 (Day 0). Neurospheres transfected with only the PB transposon-containing circular vector without the addition of transposase served as a negative control. The neurospheres after transfection were examined over time with an inverted fluorescence microscope (manufactured by Olympus) for Cerulean using an excitation light of 452 nm, EGFP using an excitation light of 488 nm, and hKO1 using an excitation light of 548-584 nm. Observed. In addition, Beetle Luciferin and Potassium Salt (manufactured by Promega) were added to neurospheres on
（結果）
図９から明らかなとおり、ＰＢトランスポゾン含有環状ベクターのみを添加したネガティブコントロール細胞（図９（ａ））においては、Ｄａｙ１とＤａｙ５において判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎと挿入領域のＫＯが同一細胞で発現していたのに対し、トランスポゼーズを導入した区では、Ｄａｙ５に判定領域のＣｅｒｕｌｅａｎの発現が見られない細胞でＫＯが発現している細胞が見られた。一方ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターに接合したＥＧＦＰの発現はどちらの区でも観察されなかったものの、その下流のルシフェラーゼの発光がトランスポゼーズを導入した区でのみ観察された。
(result)
As is clear from FIG. 9, in the negative control cells to which only the PB transposon-containing circular vector was added (FIG. 9(a)), the determination region Cerulean and the insertion region KO were expressed in the same cells on
したがって、トランスポゼーズの作用によりｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳ－ｈＫＯ１をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入された場合、ＥＯＳプロモーターが活性を持つ細胞においては、ｈＫＯ１の発現が安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＣｅｒｕｌｅａｎの発現は急速に（５日目ごろまでに）減衰することが確認された。また、トランスポゼーズをコトランスフェクションした区でのみ神経幹細胞や神経前駆細胞で活性を持つｇｐｒ５６下の発光レポーターの発現が観察されたことより、トランスポゾン領域が、ニューロスフェアのゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。 Therefore, when DNA encoding gpr56-EGFP-Luciferase2 and EOS-hKO1 is introduced into genomic DNA by the action of transposase, hKO1 expression is stabilized and enhanced in cells in which the EOS promoter is active. , confirmed that the expression of Cerulean that was not introduced into the genomic DNA rapidly declined (by about day 5). In addition, expression of a luminescence reporter under gpr56, which is active in neural stem cells and neural progenitor cells, was observed only in the section co-transfected with transposase, indicating that the transposon region was introduced into the genomic DNA of neurospheres. was confirmed.
［実施例９］
上記ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳ－ｈＫＯ１含有ｐｉｇｇｙＢａｃベクター７μｇ／μＬとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズ発現用ベクターから作製したｍＲＮＡ３．５μｇ／μＬを実施例１と同様にマイクロマニピュレータ（Leica社製）を用いて、マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクションした。胚発生過程における蛍光発現の変化を倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製）により観察し、結果を図１０に示す。
[Example 9]
3.5 μg/μL of the mRNA prepared from the gpr56-EGFP-Luciferase2 and EOS-hKO1-containing piggyBac vector 7 μg/μL and the piggyBac transposase expression vector were prepared using a micromanipulator (manufactured by Leica) in the same manner as in Example 1. It was microinjected into the male pronucleus of mouse embryos. Changes in fluorescence expression during embryogenesis were observed with an inverted fluorescence microscope (manufactured by Olympus), and the results are shown in FIG.
（結果）
図１０から明らかなとおり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン機構が作用して、ｇｐｒ５６－ＥＧＦＰ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ２とＥＯＳーｈＫＯ１がゲノムＤＮＡに挿入された胚（白矢印で示したオレンジの胚）においては、ｈＫＯ１のオレンジ蛍光は２４時間後（Ｄａｙ１）から発現し始め、Ｃｅｒｕｌｅａｎの青色蛍光はＤａｙ１に弱く観察されたが（赤矢印で示した青色の胚）、その後発現は消失し、ｈＫＯ１単独蛍光が持続したまま９６時間後（Ｄａｙ４）に胚盤胞まで発生が進むことが確認された（図１０）。したがって、トランスポゼーズの作用によりＰＢトランスポゾンによる挿入領域がゲノムＤＮＡに導入された場合、ｈＫＯ１の発現は安定・増強する一方で、ゲノムＤＮＡに導入されなかったＰＢ３’の上流のＣｅｒｕｌｅａｎの発現は急速に減衰することが確認された。Ｇｐｒ５６ミニマムプロモーターは胚で活性を持たないためＥＧＦＰとＬｕｃ２はマウス胚で観察されないが、同一ＰＢトランスポゾン挿入領域に搭載している、胚で活性を持つＥＯＳ－ｈＫＯの発現が確認できたことより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域がマウス胚ゲノムＤＮＡに導入されたことが確認された。
(result)
As is clear from FIG. 10, in embryos in which the piggyBac transposon mechanism acts and gpr56-EGFP-Luciferase2 and EOS-hKO1 are inserted into the genomic DNA (orange embryos indicated by white arrows), orange fluorescence of hKO1 is Expression began 24 hours later (Day 1), and weak blue fluorescence of Cerulean was observed on Day 1 (blue embryos indicated by red arrows). It was confirmed that development proceeded to the blastocyst on (Day 4) (Fig. 10). Therefore, when the insertion region by the PB transposon is introduced into the genomic DNA by the action of the transposase, the expression of hKO1 is stable and enhanced, while the expression of Cerulean upstream of PB 3', which has not been introduced into the genomic DNA, is rapidly expressed. was confirmed to attenuate to Since the Gpr56 minimum promoter has no activity in embryos, EGFP and Luc2 are not observed in mouse embryos. It was confirmed that the piggyBac transposon region had been introduced into mouse embryonic genomic DNA.
Claims (8)
上記（Ａ）外来遺伝子導入判定領域が、（ａ１）哺乳動物細胞で機能する判定用プロモーターＤＮＡ、及び（ａ２）前記判定用プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結している判定用蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含み、
上記（Ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン領域が、（ｂ１）５’末端側と３’末端側とに付加されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズが認識する一対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン配列、及び、該トランスポゾン配列間に配置された（ｂ２）哺乳動物細胞で機能する外来タンパク質プロモーターＤＮＡと、（ｂ３）前記外来タンパク質プロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結された蛍光標識タンパク質を含む外来タンパク質をコードするＤＮＡを含む
ことを特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。 A vector for introducing foreign genes into mammalian cells, comprising (A) a foreign gene introduction determination region and (B) a piggyBac transposon region;
The (A) foreign gene introduction determination region encodes (a1) a determination promoter DNA that functions in mammalian cells, and (a2) a determination fluorescent protein operably linked downstream of the determination promoter DNA. containing DNA that
The (B) piggyBac transposon region is arranged between a pair of piggyBac transposon sequences recognized by the piggyBac transposases added to the (b1) 5′ end side and the 3′ end side and the transposon sequences ( b2) a foreign protein promoter DNA that functions in mammalian cells; and (b3) a DNA encoding a foreign protein containing a fluorescence-labeled protein operably linked downstream of the foreign protein promoter DNA. A vector for gene transfer.
（イ）請求項１～４いずれか記載の外来遺伝子導入用ベクターを準備する工程；
（ロ）上記（イ）で準備した外来遺伝子導入用ベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼーズとを哺乳動物細胞（ヒト受精卵、ヒトＥＧ細胞、ヒトＧＳ細胞を除く）に注入する工程；
（ハ）外来遺伝子導入用ベクターによる判定用蛍光タンパク質の蛍光が急速に減衰している細胞を外来遺伝子が導入された細胞として選択する工程； A method for selecting foreign gene-introduced cells comprising the following steps (a) to (c).
(b) a step of preparing the foreign gene introduction vector according to any one of claims 1 to 4;
(b) a step of injecting the foreign gene introduction vector prepared in (a) above and piggyBac transposase into mammalian cells (excluding human fertilized eggs, human EG cells, and human GS cells) ;
(c) a step of selecting cells in which the fluorescence of the fluorescent protein for determination by the vector for introducing a foreign gene is rapidly attenuating as cells into which the foreign gene has been introduced;
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017239819A JP7203367B2 (en) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Gene transfer vectors for mammalian cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017239819A JP7203367B2 (en) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Gene transfer vectors for mammalian cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019103471A JP2019103471A (en) | 2019-06-27 |
| JP7203367B2 true JP7203367B2 (en) | 2023-01-16 |
Family
ID=67062272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017239819A Active JP7203367B2 (en) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Gene transfer vectors for mammalian cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7203367B2 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003018992A (en) | 2001-06-28 | 2003-01-21 | Inst Of Physical & Chemical Res | Pael receptor, pael receptor expression cell and animal, amd method for screening drug for parkinson disease |
| JP2003527864A (en) | 2000-03-21 | 2003-09-24 | マイノス バイオシステムズ リミテッド | Methods for producing transgenic organisms using transposons |
| JP2004267001A (en) | 2000-08-16 | 2004-09-30 | Kansai Tlo Kk | Transgenic mammal, method for preparing the same, and method for elucidating genetic function using the same |
| JP2005512602A (en) | 2002-01-09 | 2005-05-12 | マイノス バイオシステムズ リミテッド | Inducible transposition in transgenic organisms using transposon vectors |
| JP2008545375A (en) | 2005-05-14 | 2008-12-18 | フダン ユニバーシテイ | PiggyBac as a tool for genetic manipulation and analysis of vertebrates |
| WO2016148253A1 (en) | 2015-03-18 | 2016-09-22 | 小野薬品工業株式会社 | Method for producing naïve pluripotent stem cells |
-
2017
- 2017-12-14 JP JP2017239819A patent/JP7203367B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003527864A (en) | 2000-03-21 | 2003-09-24 | マイノス バイオシステムズ リミテッド | Methods for producing transgenic organisms using transposons |
| JP2004267001A (en) | 2000-08-16 | 2004-09-30 | Kansai Tlo Kk | Transgenic mammal, method for preparing the same, and method for elucidating genetic function using the same |
| JP2003018992A (en) | 2001-06-28 | 2003-01-21 | Inst Of Physical & Chemical Res | Pael receptor, pael receptor expression cell and animal, amd method for screening drug for parkinson disease |
| JP2005512602A (en) | 2002-01-09 | 2005-05-12 | マイノス バイオシステムズ リミテッド | Inducible transposition in transgenic organisms using transposon vectors |
| JP2008545375A (en) | 2005-05-14 | 2008-12-18 | フダン ユニバーシテイ | PiggyBac as a tool for genetic manipulation and analysis of vertebrates |
| WO2016148253A1 (en) | 2015-03-18 | 2016-09-22 | 小野薬品工業株式会社 | Method for producing naïve pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Guang-Hui Liu et al.，Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.，Nature，2012年10月17日，Vol.491, No.7425，p.603-607，doi: 10.1038/nature11557 |
| Huali Su et al.，piggyBac transposon-mediated transgenesis in the apicomplexan parasite Eimeria tenella.，PLoS One，2012年06月29日，Vol.7, Issue 6，e40075，doi: 10.1371/journal.pone.0040075 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019103471A (en) | 2019-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200017882A1 (en) | Engineering of humanized car t-cell and platelets by genetic complementation | |
| EP2262898B1 (en) | Es cell-derived mice from diploid host embryo injection | |
| Khattak et al. | Germline transgenic methods for tracking cells and testing gene function during regeneration in the axolotl | |
| US20170280692A1 (en) | Organ regeneration method utilizing blastocyst complementation | |
| US20140201858A1 (en) | Methods for site-specific genetic modification in stem cells using xanthomonas tal nucleases (xtn) for the creation of model organisms | |
| JP2017513510A (en) | Multigene editing in pigs | |
| JP2020108409A (en) | lincRNA-DEFICIENT NON-HUMAN ANIMALS | |
| WO2012158985A2 (en) | Methods for site-specific genetic modification in spermatogonial stem cells using zinc finger nuclease (zfn) for the creation of model organisms | |
| US20050198701A1 (en) | Method of generating new fluorescent fish by breeding transgenic fluorescent fish with fish with different phenotype and new fluorescent fish generated therefrom | |
| KR20180100303A (en) | Composition and method for chimeric embryo-assist organ generation | |
| US20190254266A1 (en) | Engineering of Humanized Kidney by Genetic Complementation | |
| JP7203367B2 (en) | Gene transfer vectors for mammalian cells | |
| JP6407507B2 (en) | A model animal that visualizes neurodegenerative disease-related proteins in neurons | |
| WO2017175745A1 (en) | Method for producing genetically modified animal employing reproductive cell-deficient animal | |
| JP4845073B2 (en) | Method for producing reconstructed fertilized egg and method for producing transgenic embryo using the same | |
| JP7071749B2 (en) | Application of pluripotent stem cells with modified differentiation potential to animal production | |
| JP6876434B2 (en) | Method for producing transgenic animal having T cell receptor specific to fluorescent protein | |
| JP2018191579A (en) | Production method of lung | |
| JP4271120B2 (en) | Y chromosome labeled transgenic non-human animal | |
| WO2018207736A1 (en) | Method for introducing polynucleotide to male germ cell or sertoli cell | |
| KR20240004489A (en) | Methods and means for regulated gene expression | |
| JPWO2008062904A1 (en) | Methods that enable stable expression of transgenes | |
| Yan | High efficiencies of gene delivery and gene targeting in embryonic stem cells of the fish medaka as a lower vertebrate model | |
| Khattak et al. | Tatiana Sandoval-Guzmán, Kristyna Hradlikova, Annett Duemmler, Ryan Kerney, 3 and Elly M. Tanaka |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201026 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20201026 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201109 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20201109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201026 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201109 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211026 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211223 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220426 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220705 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220825 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221018 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221121 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221213 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7203367 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |