JP7201223B2 - 多能性幹細胞から、内胚葉系細胞を選択的に誘導する方法 - Google Patents

Description

本願は、多能性幹細胞から特定の内胚葉系の細胞への分化に深く関与する胚体内胚葉サブタイプを選択的に誘導することによって、多能性幹細胞から前方前腸および後方前腸、および中後腸を選択的に誘導する方法に関する。本願はまた、前方前腸、後方前腸および中後腸のいずれかよりさらに所望の内胚葉系細胞を選択的に誘導する方法に関する。

ヒト胚性幹細胞（hESC）またはヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）などの、ヒト多能性幹細胞（hPSC）は、膵臓、肝臓、肺および小腸などの内胚葉系臓器を構成する細胞に分化し得ることが、近年報告されている（非特許文献５－７、１４、１７、１８、２１、２５、２７）。これらの報告において、ヒト多能性幹細胞は、原始線条（PS）を経て胚体内胚葉細胞に誘導され、その後、各種内胚葉系細胞へと誘導される。ヒト多能性幹細胞からの胚体内胚葉細胞誘導は、２つの既知の胚体内胚葉マーカー遺伝子、SOX17およびFOXA2の発現により確認できるとされている。

脊椎動物の発生において、胚体内胚葉細胞は２つの異なる集団、前方胚体内胚葉細胞（Anterior Definitive Endoderm）および後方胚体内胚葉細胞(Posterior Definitive Endoderm)に分類されることが知られている。これらの細胞はさらに、胚の前後軸に沿ってパターン形成され、それぞれ別個の細胞へと分化されると示唆されている（非特許文献２８）。

胚体内胚葉細胞は、原始線条細胞を経て形成される（非特許文献１、２０、２３）。原始線条の形成は、胚体内胚葉の分化に不可欠なステップであり、原始線条の形成がなければ、胚体内胚葉の形成に欠陥が生じるとされている（非特許文献３、２６）。マウス胚を用いた予定運命地図の実験から、胚体内胚葉の前駆細胞が、T-box転写因子、 Eomesodermin （Eomes）を発現する前方原始線条細胞内に認められることが示されている（非特許文献４、１０、２３）。前方胚体内胚葉細胞および後方胚体内胚葉細胞が、異なる発生段階の原始線条に由来することを示唆する報告がある（非特許文献１３）。

これまで、表１に示すような種々の方法を用いてヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導することが報告されている。

FBS:ウシ胎児血清、WNT3A：Wingless-type MMTV integration site family, member 3A、BMP:骨形成タンパク質、FGF:繊維芽細胞増殖因子、PI3K阻害剤: イノシトールリン脂質3キナーゼ阻害剤。

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本願は哺乳動物の多能性幹細胞から特定の内胚葉系細胞へ分化する胚体内胚葉サブタイプへ選択的に誘導する方法を提供することを目的とする。本願はまた、多能性幹細胞を各胚体内胚葉サブタイプを経て前方前腸および後方前腸、および中後腸を選択的に誘導する方法を提供することを目的とする。本願はさらに、多能性幹細胞から所望の内胚葉系細胞へ選択的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。

本願は、多能性幹細胞から、前期および後期発生段階の前方原始線条細胞（Anterior Primitive Streak, APS）を分化させ、３つの異なるタイプの胚体内胚葉細胞サブポピュレーション：前方胚体内胚葉の前方ドメイン（Anterior domain of Anterior Definitive Endoderm, AADE）細胞、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（Posterior domain of Anterior Definitive Endoderm, PADE）細胞、および後方胚体内胚葉（Posterior Definitive Endoderm, PDE）細胞へ選択的に分化させる方法を提供する。本願はさらにこれらの胚体内胚葉細胞集団からそれぞれ後方前腸(Posterior Foregut, ＰＦＧ）細胞、前方前腸(Anterior Foregut, ＡＦＧ）細胞ならびに中後腸（Midhindgut, ＭＨＧ）細胞からなる群から選ばれる原腸（Gut Tube, ＧＴ）細胞を誘導する方法を提供する。

即ち、本願は多能性幹細胞から前方胚体内胚葉の前方ドメイン（ＡＡＤＥ）細胞、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（ＰＡＤＥ）細胞、および後方胚体内胚葉（ＰＤＥ）細胞からなる群から選ばれる胚体内胚葉細胞のサブポピュレーションへと選択的に誘導する方法であって、以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む方法を提供する：
（ｉ）多能性幹細胞をアクチビンＡとＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で培養して、前期前方原始線条細胞または後期前方原始線条細胞を得る工程、および
（ｉｉ）得られた前期前方原始線条細胞、または後期前方原始線条細胞を、アクチビンＡを含み、かつＢＭＰ阻害剤を含む、または含まない培地中で培養して、前方胚体内胚葉の前方ドメイン細胞、前方胚体内胚葉の後方ドメイン細胞または後方胚体内胚葉細胞を得る工程。

本願はさらに前方胚体内胚葉の前方ドメイン（ＡＡＤＥ）細胞、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（ＰＡＤＥ）細胞、および後方胚体内胚葉（ＰＤＥ）細胞からなる群から選ばれる胚体内胚葉細胞のサブポピュレーションを、刺激因子を含まない培地にて培養する工程を含む、前方前腸(ＡＦＧ）細胞、後方前腸（ＰＦＧ）細胞および中後腸（Midhindgut, ＭＨＧ）細胞からなる群から選ばれる原腸（ＧＴ）細胞へと誘導する方法を提供する。

本願は、多能性幹細胞から３つのパターンの胚体内胚葉細胞を経て前方前腸細胞および後方前腸細胞並びに中後腸細胞を誘導する方法を提供する。前方前腸は中耳、胸腺、甲状腺、気管、肺および食道へと分化され、後方前腸は胃、十二指腸、膵臓および肝臓へと分化され、中後腸細胞は小腸および大腸へと分化されることが知られている。即ち、本願の方法にてヒト多能性幹細胞から所望の細胞への分化誘導を選択的かつ確実に行うことが可能となる。

本願の方法により得られる前方前腸細胞、後方前腸細胞または中後腸細胞から、更に分化誘導して各内胚葉系の臓器を構成する細胞を得る方法もまた、本願に含まれる。

胚体内胚葉（DE）の分化および、DEから誘導される内胚葉系細胞の差異につながるパターン形成の、2つの仮説モデルを示す。 ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）から、前方原始線条（APS）およびDEを経て、後期原腸（LGT）へ分化誘導する2つの分化方法（方法1および2）の概略図。 hiPSCセルライン585A1を2つの分化方法により、胚体内胚葉（DE)に分化させた。DEマーカーであるSOX17およびFOXA2について免疫染色を行った。3回の独立した実験の代表的な画像を示す。スケールバー、100μm。 hiPSCセルライン585A1を2つの分化方法により、後期原腸（LGT）に分化させた。肝芽細胞のマーカーであるAFPについて免疫染色を行った。3回の独立した実験の代表的な画像を示す。スケールバー、100μm。 ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）から、前方原始線条（APS）、胚体内胚葉（DE）および原腸（GT）を経て後期原腸（LGT）へ分化誘導する２つの手順（方法AおよびB）の概略図。 hiPSCから２つの方法で誘導された原腸（GT）段階の細胞の、HNF1β、HNF4αおよびSOX2について免疫染色を行った。またその後誘導された後期原腸（LGT）段階の細胞の、SOX2およびAFPについての免疫染色を行った。スケールバー100μm。 方法Bによりヒト人工多能性幹細胞から分化誘導した場合の、各分化段階におけるSOX2 mRNA発現についてのqRT-PCR解析結果。APS：前方原始線条、AFG：前方前腸、LAFG：後期原腸の前方前腸領域。 hiPSC由来後期原腸（LGT）細胞を、ALB（+）肝細胞様細胞に分化させた。スケールバー、100μm。 hiPSC由来後期原腸（LGT）細胞を、NKX2.1（+）肺胞前駆細胞に分化させた。スケールバー、100μm。 原始線条（PS）および2種類の胚体内胚葉（DE）の各マーカーの遺伝子発現を示すヒートマップ。 ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）の、後期原腸の前方前腸領域（LAFG）および後期原腸の後方前腸領域（LPFG）それぞれへの分化についての主成分分析（PCA）。 前方胚体内胚葉の前方ドメイン（AADE）と、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（PADE）の遺伝子発現プロファイルの違いを示すヒートマップ。APS：前方原始線条、AFG：前方前腸、PFG：後方前腸。 BRACHYURY、EOMESおよびCDX2について、前期および後期前方原始線条（APS）細胞の免疫染色を行った。スケールバー、100μm。 SOX17およびFOXA2（B）について、２種類の胚体内胚葉細胞の免疫染色を行った。スケールバー、100μm。AADE：前方胚体内胚葉の前方ドメイン、PDE：後方胚体内胚葉 HNF1β、HNF4αおよびCDX2について、原腸（GT）段階細胞の免疫染色画像。スケールバー、100μm。PFG：後方前腸、MHG：中後腸 様々な分化段階における、CDX2 mRNA発現のqRT-PCRによる解析結果。LAPS:後期前方原始線条、PDE:後方胚体内胚葉、MHG：中後腸、LMHG:後期原腸の中後腸領域（A）－（C）の数値は、3回の独立した実験のデータを、平均値±S.E.M.（n=3）として表す。 hiPSCからの、3つの胚体内胚葉（DE）系列への分化手順。各段階で、細胞を特徴付けるマーカー遺伝子を各ステージの下部に示した。 前方胚体内胚葉の前方ドメイン（AADE）、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（PADE）および後方胚体内胚葉（PDE）が、それぞれ後方前腸（PFG）、前方前腸（AFG）および中後腸（MHG）を生じさせる。APS：前方原始線条、GT：原腸。

初期胚発生に必要不可欠な、異なる誘導因子のセットを用いるいくつかの分化プロトコールが、ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導するために提案されている（表１）。誘導された胚体内胚葉細胞の共通の特徴の1つは、分化方法にかかわらず、2つのマーカー遺伝子、SOX17およびFOXA2を発現していることである。以下に示す試験より、多能性幹細胞から胚体内胚葉への誘導方法をコントロールすることによって、前方前腸、後方前腸および中後腸細胞へとさらに分化される胚体内胚葉の３つのサブポピュレーションを選択的に誘導することを可能とした（図５Ａ）。

ニワトリの発生過程において、Brachyury（+）Eomes（+）細胞がHamburger Hamilton （HH）のステージ3から5の間、APSに存在することが知られている（A Chicken Embryo Gene Expression Database; http://geisha.arizona.edu/geisha（2016.03.03確認）。2つのBMPアンタゴニスト、NogginおよびChordinの原始結節（node）における発現が、HHのステージ4から認められる。それゆえ、HHステージ4以降のEomes（+）APSは、NogginおよびChordinに影響を受けていると想定した。

前方原始線条から胚体内胚葉への誘導ステップにおけるBMP阻害剤を添加することにより、前方前腸には分化するが後方前腸には分化しない胚体内胚葉細胞サブポピュレーション（Posterior domain of Anterior Definitive Endoderm, PADE細胞）を誘導し、一方、BMP阻害剤が含まれなかった場合は、後方前腸に分化するDE細胞サブポピュレーション（Anterior domain of Anterior Definitive Endoderm, AADE細胞)を誘導することを確認した(図２）。従って、ヒトiPS細胞から産生されたAADEは、原始結節においてNogginおよびChordinが発現される前に形成される将来後方前腸領域となる細胞であり、一方PADEは、原始結節からNogginおよびChordinの影響下で形成される将来前方前腸領域となる細胞である。ヒトiPS細胞由来の後方胚体内胚葉（Posterior Definitive Endoderm、PDE）は、後期APSから誘導され、中後腸細胞へと分化する（図５Ｂ）。

本願明細書および請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹（ES）細胞（J.A. Thomson et al. （1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. （1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. （1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall （1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞（T. Wakayama et al. （2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. （2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. （2007）, Nature, 450:497-502）、***幹細胞（「GS細胞」）（M. Kanatsu-Shinohara et al. （2003） Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. （2004）, Cell, 119:1001-1012）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）（Y. Matsui et al. （1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. （1992）, Nature, 359:550-551）、人工多能性幹（iPS）細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka （2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. （2007）, Cell, 131:861-872; J. Yu et al. （2007）, Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 （2008）；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。本願においてはヒト多能性幹細胞が用いられる。

本願の方法において用いられる多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養してもよく、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。より好ましくは、単一細胞の状態に分離して培養する。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase（TM）およびAccumax（TM）（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。

本願の方法の各工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO₂含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO₂濃度は、好ましくは約2～5％である。

本願の工程（i）は、多能性幹細胞をアクチビンA、およびGSK3阻害剤を含む培地で培養する工程である。
工程（i）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へアクチビンＡを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo Fisher Scientific）、N2サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、B27サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質、あるいはその他の通常動物培養用培地に添加される１つ以上の物質を含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントとウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地である。

工程（i）に使用される培地は、さらにROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 （2000）；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 （2000）参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 （1997）参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645（2008）参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 （2007）またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 （2002）参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52（4）: 319-324 （2003）参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。

ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから500μM、さらに好ましくは、5μMから200μM、例えば約10μMである。なお、本願明細書および請求の範囲において、数値に付随して「約」という場合、数値の±３０％、または±２０％、もしくは±１０％の値まで含むものとする。

アクチビンAとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。

アクチビンAの培地中の濃度は、通常０．1から200ng/ml、例えば5から150ng/ml、好ましくは80から120ng/ml特に好ましくは約100ng/mlである。

GSK3阻害剤とは、GSK－3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK－3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-（2,4-ジクロロフェニル）-4-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK－3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK－3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021 （6-[2-[4-（2,4-Dichlorophenyl）-5-（4-methyl-1H-imidazol-2-yl）
pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile） が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。

工程（i）において、前期前方原始線条（Early APS）細胞を得るためには比較的低濃度のGSK3β阻害剤を用いる。「比較的低濃度」とは、以下に説明する後期前方原始線条(Late APS)を誘導する場合より低濃度であることを意味する。CHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は、1μMから4μM未満、例えば1.5μMから3.5μM、好ましくは約3μMとすればよい。

前期前方原始線条が生成したことは、細胞がBRACHYURY、EOMESを発現し、CDX2を発現していないことによって確認することができる。

工程（i)において、後期前方原始線条（Late APS)細胞を得るためには、比較的高濃度のGSK3β阻害剤を用いる。GSK３β阻害剤としてCHIR99021を用いる場合、後期前方原始線条（Late APS)細胞を得るための培地中の濃度は、４μM以上、例えば４μMから１５μM、好ましくは約８μMとすればよい。

後期前方原始線条細胞が生成したことは、細胞がBRACHYURY、EOMESおよびCDX2を発現することによって確認することができる。

工程（i）の培養日数は、１２時間～３６時間、例えば約1日間とすればよい。
工程（i）のGSK 3β阻害剤の濃度の違いによって、多能性幹細胞は前期前方原始線条細胞（比較的低濃度のGSK3β阻害剤の存在下で培養）または後期前方原始線条細胞（比較的高濃度のGSK3β阻害剤の存在下で培養）へと誘導される。

工程（ii）においては、工程（i)で得られた細胞をアクチビンＡを含み、BMP阻害剤を含むまたは含まない培地中で培養する。
工程（ii）に用いられる基礎培地としては、工程（i）と同様の公知の動物培養用基礎培地から適宜選択すればよい。工程（i）および（ii）で基礎培地は同一であっても相違していてもよい。例えば基礎培地としてRPMI1640にウシ胎児血清を加えた培地を基礎培地として、ここへアクチビンAを添加すればよい。アクチビンＡの種類および量としては、工程（i）と同一でよい。

BMP阻害剤は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin 6-[4-（2-piperidin-1-yl-ethoxy）phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine、その誘導体 （P. B. Yu et al. （2007）, Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. （2008）, Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. （2008）, PLoS ONE, 3（8）:e2904）およびLDN-193189（4-（6-（4-（piperazin-1-yl）phenyl）pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）が例示され、好適にはLDN-193189が用いられる。

BMP阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は例えば100-1000nM、300-700nM、例えば約500nMとすればよい。
工程（ii）の培養期間は36時間から60時間、例えば約2日間とすればよい。
工程（ii）において、3種類の胚体内胚葉細胞のサブポピュレーションを選択的に得ることができる。即ち、
（１）前期前方原始線条細胞を、アクチビンAとBMP阻害剤の存在下で培養した場合には、前方胚体内胚葉の後方ドメイン（PADE）細胞が得られる。
（２）前期前方原始線条細胞を、アクチビンAが存在するが、BMP阻害剤が存在しない条件下で培養した場合には、前方胚体内胚葉の前方ドメイン（AADE）細胞が得られる。
（３）後期前方原始線条細胞を、アクチビンAが存在するが、BMP阻害剤が存在しない条件下で培養した場合には、後方胚体内胚葉（PDE)細胞が得られる。
いずれの胚体内胚葉細胞も、SOX17およびFOXA2を発現する。

本願は、工程（ii)で得られたPADE細胞、AADE細胞、またはPDE細胞を、分化誘導因子を含まない培地中で培養する工程（iii)を含む、前方前腸（AFG)細胞、後方前腸（PFG)細胞、または中後腸（MHG)細胞を得る方法をさらに提供する。

本工程にて用いられる基礎培地は工程（i）に記載したものより適宜選択すればよい。基礎培地として、例えばIMEM Zinc Option培地が例示される。基礎培地にはアクビチン、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤その他分化誘導因子としての物質を添加せずに用いる。なお、使用する基礎培地には上記工程（i）にて列記した物質その他通常動物細胞培養用培地に添加される物質を１つ以上含んでいてもよい。工程（iii）の培養期間は3-8日、例えば約6日とすればよい。
工程（iii）によって、PADE細胞は前方前腸（AFG）細胞へ、AADE細胞は後方前腸（PFG)細胞へ、およびPDＥ細胞は中後腸（MHG）細胞へと誘導される。

即ち、本願は下記３つの態様を含む：
1 第1の態様
ヒト多能性幹細胞から前方胚体内胚葉の後方ドメイン細胞を経て前方前腸細胞を製造する方法であって、以下の工程（i－１）から（iii－１）を含む方法：
（i－１）多能性幹細胞をアクチビンＡと比較的低濃度のGSK3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、および
（ii－１）前記工程（i－１）で得られた細胞をアクチビンＡおよびBMP阻害剤を含む培地中で培養する工程、および
（iii－１）前記工程（ii－１）で得られた細胞を、分化誘導因子を含まない培地中で培養する工程。

２ 第２の態様
ヒト多能性幹細胞から前方胚体内胚葉の前方ドメイン細胞を経て後方前腸細胞を製造する方法であって、以下の工程（i－２）から（iii－２）を含む方法：
（i－２）多能性幹細胞をアクチビンＡと比較的低濃度のGSK3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、
（ii－２）前記工程（i－２）で得られた細胞をアクチビンＡを含む培地中で培養する工程、および
（iii－２）前記工程（ii－２）で得られた細胞を、分化誘導因子を含まない培地中で培養する工程。

３ 第3の態様
多能性幹細胞から後方胚体内胚葉細胞を経て中後腸細胞を製造する方法であって、以下の工程（i－３）から（iii－３）を含む方法：
（i－３）多能性幹細胞をアクチビンＡと比較的高濃度のGSK3β阻害剤を含む培地中で培養する工程、および
（ii－３）前記工程（i－３）で得られた細胞を、アクチビンＡを含む培地中で培養する工程、および
（iii－３）前記工程（ii－３）で得られた細胞を、分化誘導因子を含まない培地中で培養する工程。

AFG細胞は中耳、胸腺、甲状腺、気管、肺および食道を構成する細胞へと分化される。PFGは胃、十二指腸、膵臓および肝臓を構成する細胞へと分化される。およびMHGは小腸および大腸を構成する細胞へと分化されることが知られている。各細胞ヘ分化誘導する方法は知られており、当業者は公知の方法から適宜選択することができる。本願の方法にて得られる各細胞を、さらに分化誘導して上記細胞を得る方法もまた、本願に含まれる。

以下実施例に基づき本願を更に詳細に説明する。
１. 材料および方法
１.1. 細胞培養
フィーダーフリー培養物を得るために、hiPSC（585A1細胞）（Okita K et al., 2011, Kajiwara M et al., 2012）を、製造元の指示に従い、Essential 8 培地（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で維持した。通例の継代培養のために、hiPSCコロニーを、0.5 mM EDTA（Wako, Osaka, Japan）を用いて酵素法により分離し、10μM Y-27632 （Wako）を添加することで1:100の割合に分けた。

1.2. 前方原始線条（APS）への分化
80%のコンフルエントに培養したhiPSCコロニーを、0.5 mM EDTAにより、酵素法で単一細胞に分離した。当該細胞を、前期APS誘導のためには100 ng/ml recombinant human/mouse/rat アクチビンAおよび3μM CHIR99021 （Axon Medchem, Groningen, Netherlands）を添加した、および、後期APS誘導のためには、100 ng/ml アクチビンA および8μM CHIR99021を添加した、2%（vol/vol）のB27サプリメント （GFR-B27, Growth Factor Reduced, Thermo Fisher Scientific）、50 U/mlペニシリン/ストレプトマイシン（P/S, Thermo Fisher Scientific）および、10μM Y-27632を含む、RPMI 1640 培地 （NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan）に再懸濁し、Matrigel（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）でコートしたプレートに9×10⁴ cells/cm²で播種して、１日間培養した。

1.3. 胚体内胚葉（DE）への分化
前期APSからDE細胞への分化
AADE細胞への誘導のためには2%（vol/vol）B27サプリメント(GFR-B27）、50 U/ml P/Sおよび100 ng/mlアクチビンAを添加したRPMI 1640培地で、PADE細胞への誘導のためには100 ng/ml アクチビンAおよび 500 nM LDN193189 （Axon Medchem）を添加したRPMI 1640培地で、２日間培養することにより、前期APSから前方胚体内胚葉の前方ドメイン（AADE）細胞または前方胚体内胚葉の後方ドメイン（PADE）へと誘導した。
後期APSからDE細胞への分化
後期APS細胞を2%（vol/vol）B27サプリメント(GFR-B27）、50 U/ml P/Sおよび100 ng/ml アクチビンAを添加したRPMI 1640培地で2日間培養して、後方胚体内胚葉（PDE）細胞へ誘導した。

1.4. 原腸 （Gut Tube, GT）細胞および後期原腸（Late Gut Tube, LGT）細胞への分化
GT細胞誘導のために、３つのタイプのDE細胞（AADE、PADEおよびPDE）を、Improved MEM Zinc Option （iMEM） 培地（Thermo Fisher Scientific）で３日間培養した。その後、GT細胞を、同じ培地を用いて３日間培養してLGT細胞へ分化させた。

1.5. 肝臓および肺系列細胞への分化
得られたLGT細胞を、既報の分化プロトコール（Kajiwara M et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109, 12538-12543, Gotoh S et al., 2014, Stem Cell Reports 3, 394-403.）に従い、肝細胞様細胞および肺胞上皮前駆細胞にさらに分化させた。
肝細胞様細胞への分化
1.4で得たhiPSC由来LGT細胞を、20 ng/mL組換えヒト肝細胞増殖因子 （HGF; PeproTech, Rocky Hill, NJ）および20 ng/mL組換えヒトオンコスタチンM （OsM; PeproTech）を含有する肝細胞培養培地で６日間培養して、肝細胞様細胞への分化を誘導した。
肺胞上皮前駆細胞への分化
1.4で得たhiPSC由来のLGT細胞を、1×B27および N2 サプリメント （Thermo Fisher Scientific）、50 U/ml P/S、0.05 mg/ml L-アスコルビン酸 （Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan）、0.4 mM モノチオグリセロール（Wako）、100 ng/ml 組換えヒト骨形成タンパク質（BMP）4 （R&D Systems）、0.5μＭ 全トランス型レチノイン酸 （ATRA; Sigma-Aldrich）および3.5μＭ CHIR99021を含有する、Glutamaxを添加したDMEM/F12培地 （Thermo Fisher Scientific）で、４日間培養した。

1.6. 免疫染色
細胞を、4% パラホルムアルデヒド（PFA）/PBSを用いて、20分間、4℃で固定した。PBSで洗浄後、細胞を5% 正常ロバ血清（Funakoshi, Tokyo, Japan）/PBST （PBS/0.1% Triton X-100）を用いて、1時間、室温でブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、サンプルと共に一晩、4℃でインキュベートした。PBSで3回洗浄後、細胞を、二次抗体と共に、1時間、室温でインキュベートした。本研究で用いた二次抗体には、Alexa Fluor 488-、546-または647-結合の、抗マウス、ウサギ、またはヤギIgGロバ抗体が含まれ、1:200希釈で用いた。核染色のために、Hoechst 33342三塩酸塩三水和物（Thermo Fisher Scientific）を、1:200希釈で用いた。用いた一次抗体を表２に示す。

1.7. RT-PCRおよび、リアルタイム定量RT-PCR （qRT-PCR）
全RNAを、RNeasyキット（Qiagen, Tokyo, Japan）を用いて、製造元の推奨に従い単離し、続いて、標準的プロトコール（Mae S et al., 2013）を用いてcDNA合成を行った。端的には、第一鎖cDNAを、１μｇの全RNAから、ReverTra Ace （TOYOBO, Osaka, Japan）を用いて合成した。当該cDNAサンプルを、サーマルサイクラー（Veriti 96-well Thermal Cycler, Applied Biosystems, Waltham, MA）を用いたPCR増幅に供し、Ex-Taq PCR キット（Takara, Shiga, Japan）を用いて、製造元の指示に従い、PCRを行った。PCRサイクルは以下の通りであった：ハウスキーピング遺伝子β-ACTINに対して、初期変性を94℃で2.5分間、続いて、94℃で30秒間、60℃で1分間、72℃で30秒間を25サイクル、および最終伸長反応を72℃で10分間行った。他の遺伝子に対しては、初期変性を94℃で2.5分間、続いて、94℃で30秒間、58℃－50℃で30－60秒間、72℃で30秒間を30－40サイクル、および最終伸長反応を72℃で10分間で行うサイクルで行った。qPCRを、Step One Plus Real-Time PCR System （Applied Biosystems）および SYBR Green PCR Master Mix （Takara）を用いて行った。変性を95℃で30秒間行い、続いて、95℃で5秒間、60℃で30秒間を24サイクル行った。製造元が推奨するように、遺伝子発現レベルのデータを解析し、β-ACTINの遺伝子発現レベルにキャリブレーションするために、閾値サイクル法（threshold cycle method）を用いた。PCR反応は、各サンプルに対し、三連で行った。用いたプライマーの配列を表３に示す。

1.8. RNA塩基配列決定
培養細胞から100ngの全RNAを、製造元の指示に従い、KAPA stranded mRNA-seq Kits （KAPA Biosystems, Woburn, MA）を用いたライブラリ調製に供した。当該ライブラリを、HiSeq2500の100サイクルのSingle-Readモードにおいて、塩基配列決定した。全ての配列読み取りデータを、CASAVA 1.8.2パイプラインにおけるBCL2FASTQ Conversion Software 1.8.4を用いて、FASTQフォーマットで抽出した。配列読み取りデータを、遺伝子発現値のTophat v2.0.14. Calculationを用いて、2014年4月25日にダウンロードしたhｇ19参照遺伝子にマッピングし、RPKMforgenes （10th December 2012）により補正（normalization）を行い、発現レベルをlog₂ （RPKM+1）で表した。遺伝子発現のヒートマップを、R 3.2.1のgplotsライブラリのheatmap.2関数により、作成した。組織および細胞サンプルの遺伝子発現のTwo-way階層的クラスタリングを、R3.2.1のhclust関数を用いて実行した。

2. 結果
2.1.異なる分化プロトコールにより、異なるタイプの胚体内胚葉（Definitive Endoderm, DE)細胞が生成されることを確認した
胚体内胚葉細胞集団の特徴を示す２つのモデルが存在する：1）DE細胞は、任意の内胚葉系細胞ヘ分化可能な単一細胞タイプの多能性内胚葉前駆細胞である（図１Ａ、左）、２）DE細胞は、複数のタイプの系列決定内胚葉前駆細胞集団を含有し得る（図１Ａ、右）。本発明者らは、DE細胞が単一タイプの多能性内胚葉前駆細胞であるとすれば、異なる分化プロトコールで誘導されたDE細胞であっても、一様に内胚葉系の細胞、例えば後期原腸（LGT）段階のαフェトプロテイン（AFP）（＋）細胞、すなわち肝芽細胞へ分化され得ると仮定した。

この仮説を調べるために、我々は、肝系列細胞の既報の誘導プロトコール（Takebe, T. et al., 2014, Nat Protoc 9, 396-409.）を改変することにより、hiPSCから、AFP（+）細胞への、直接分化方法を開発した。アクチビンAおよびCHIR99021で処理し、続いてアクチビンA単独で処理することによるAPSの誘導は、SOX17（+）FOXA2（+）DE細胞（図１Ｂ方法１、図１Ｃ上図）を非常に効率的に誘導した。さらに、BMP4および繊維芽細胞増殖因子２（FGF2）による処理により、DE細胞からLGT段階のAFP（+）細胞を生成した（図１Ｄ上図）。

BMPなどの外因性の中胚葉分化シグナルを除去することにより、および、BMPアンタゴニストであるnoggin、またはBMP受容体阻害剤であるLDN193189を用いて内因性BMPを中和することにより、DE細胞が、APS細胞から誘導され得ることが報告されている（非特許文献１１）。我々は、アクチビンAおよびLDN193189による処理によっても、APS細胞からSOX17（+）FOXA2（+）DE細胞が確実に生成されることを確認した（図１Ｂ方法２、図１Ｃ下図）。しかしながら、後者の細胞は、BMP4とFGF2による処理によってAFP（+）細胞に分化させることはできなかった（図１Ｄ下図）。これらのデータは、異なるプロトコールを用いてhiPSCから誘導されたDE細胞の、AFP陽性の後期原腸の前腸領域細胞への分化能が異なることを示す。即ち、種々の内胚葉系細胞へ分化する運命は、DE段階で既に制限されていることを示し、図１Ａ右に示すモデル図が正しいことが判った。

2.2. 2つのDE細胞サブタイプの分化指向性
DE細胞サブポピュレーションの分化可能性が、特定の内胚葉系細胞に制限されているかどうかを調べるために、図１Ｂの2つの方法によって産生されたDEサブポピュレーションを、誘導因子を添加することなくさらに３～６日間培養して分化させた（図２Ａ）。３日間培養後に、方法Aの細胞は、GT細胞の後方前腸領域のマーカーである、HNF1βおよびHNF4α陽性細胞に分化した。GT細胞の前方前腸領域のマーカーであるSOX2を発現する細胞はほとんど存在しなかった（図２Ａ、２Ｂ上図）。HNF1β（+）HNF4α（+）細胞を更に培養したところ、LGT段階のAFP（+）細胞に分化した（図２Ｂ上図）。

この結果は、方法Aで誘導されたDE細胞が、外因性の誘導因子を添加することなく、後期原腸の後方前腸領域の細胞、即ち肝芽細胞に分化することを示している。一方、方法Bの細胞は、LGT段階ではSOX2（+）であり、後期原腸の前方前腸領域の細胞へと分化した。HNF1β、HNF4αおよびAFPは陰性であった（図２Ｂ下図）。各段階でのSOX2 mRNA発現についてのqRT-PCR解析により確認した（図２Ｃ）。これらの結果は、特定の内胚葉系列へ将来分化する可能性は、DE段階にすでに制限されていることを示唆している。

インビトロにおけるhiPSC由来LGT細胞の発生能を評価するために、方法AまたはBで産生されたLGT細胞から、既報の方法（非特許文献６および７）を用いて、肝細胞様細胞および肺胞上皮前駆細胞への分化を誘導した。方法Aで誘導されたhiPSC由来LGT細胞が、ALBUMIN（ALB）（+）細胞に分化したが、NKX2.1（+）の腹側前方前腸細胞には分化しないことを確認した（図２Ｄ、２Ｅ上図）。対照的に、方法Bで誘導されたLGT細胞は、AFP（+）またはALB（+）細胞に分化することなく、NKX2.1（+）細胞へと分化した（図２Ｄ、２Ｅ下図）。これらの結果は、方法Aで誘導されたDE細胞が、GTおよびLGT細胞の後方前腸領域を生じる前方胚体内胚葉の前方ドメイン（AADE）細胞であり、一方、方法Bで誘導されたDE細胞が、GTおよびLGT細胞の前方前腸領域に分化する前方胚体内胚葉の後方ドメイン（PADE）細胞であることを、示唆している。

2.3. AADEとPADEの遺伝子発現プロファイルの比較
上記結果は、異なるプロトコールで生成されるDE細胞が、それぞれ特定の内胚葉系への分化能を有することを示唆している。DE細胞の2つのタイプ、AADEおよびPADE細胞、並びにそれらから派生するGTおよびLGT細胞の間の、遺伝子発現パターンの違いを明らかにするために、RNA配列決定解析を行った。その結果、AADEおよびPADE細胞の間の、周知のPSおよびDEマーカーの発現レベルにほとんど違いはなかった（図３Ａ）。主成分分析（PCA）によってもまた、AADEおよびPADE細胞の間において、相対的に同様な遺伝子発現プロファイルを確認した（図３Ｂ）。しかしながら、AADEおよびPADE細胞集団の間で、異なって発現された273の遺伝子を同定した（図３Ｃおよび表４）。これらのデータは、AADEおよびPADEは、周知のDEおよびPSマーカーに対して同様の発現パターンを有するが、これらのDEサブポピュレーションを区別できる候補マーカーが存在することを示唆している。

2.4.後期前方原始線条(late APS)、後方胚体内胚葉(PDE)および中後腸(MHG)細胞の誘導方法の確立
中後腸細胞への制限された分化能を有するPDE細胞の新規分化プロトコールを確立するために、hiPSCからのAPSへの分化をさらに調べた。中胚葉サブタイプへのパターン形成は、PSにおける中胚葉誘導のタイミングと相関するとの報告から（非特許文献１５）、DEパターン形成もまた、APSにおけるDE細胞分化のタイミングに対応するであろうと仮定した。この仮定のもと、100 ng/mlのアクチビンAおよび3μＭのCHIR99021で処理することにより誘導されたhiPSC由来APS細胞の特徴を調べた（図２Ａ）。免疫染色により、これらの細胞はAPSマーカーBRACHYURYおよびEOMES陽性であるが、後期原始線条のマーカーであるCDX2に対して陽性の細胞はほとんどなかった（図４Ａ上図）。これらのデータは、100 ng/mlのアクチビンAおよび3μＭのCHIR99021による処理により、hiPSCが前期APS細胞に分化されることを示している。そこで、後期原始線条への分化プロトコール（非特許文献１５）を改変することにより、hiPSCから後期APS細胞を分化させる新規の方法を開発した。100ng/mlのアクチビンAおよび8μMのCHIR99021の存在下で1日間培養を行った。得られた細胞の免疫染色により、BRACHYURY（+）EOMES（+）CDX2（+）である後期APS細胞が生成していることを確認した（図４Ａ下図）。

後期APS細胞からDE細胞誘導のため、さらに100ng/mlのアクチビンAの存在下でさらに2日間培養したところ、得られた細胞はSOX17（+）FOXA2（+）陽性であり、胚体内胚葉細胞が生成していることを確認した（図４Ｂ下図）。外因性の誘導因子を添加することなくさらに3日間培養した。得られた細胞の内胚葉系への発生能を調べ、中後腸マーカーである、HNF1β、HNF4αおよびCDX2に対して陽性に染色される分化した細胞を見出した（図４Ｃ下図）。これらの発見はまた、CDX2 mRNA発現についてのqRT-PCR解析により確認した。対照的に、hiPSCから前期APSおよびAADEを経て生み出されたGT細胞のhiPSC由来後方前腸領域は、GT細胞のCDX2（+）中後腸領域に分化しなかった（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ上図）。これらの結果は、PDE細胞を介した、hiPSCから中後腸細胞への効率的な分化方法は、後期APS細胞を生成することによって確立され得ること、および、DEサブタイプへのパターン形成が、APSにおけるDE誘導のタイミングと相関していることを、示唆している（図５Ａ）。

以上の結果より、胚体内胚葉細胞が複数のサブタイプを含有し、それぞれが特定の内胚葉系列へ分化することを確認した（図５Ｂ）。また多能性幹細胞から、それぞれの胚体内胚葉細胞のサブタイプを選択的に誘導する方法を確立した（図５Ａ）。

Claims (8)

1. 多能性幹細胞から前方前腸（ＡＦＧ）細胞へと選択的に誘導する方法であって、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む方法：
   （ｉ）多能性幹細胞をアクチビンＡと、１μＭから４μＭ未満のＣＨＩＲ９９０２１と同等の活性を有する比較的低濃度のＧＳＫ３β阻害剤とを含む培地中で培養して前期前方原始線条細胞を得る工程、
   （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた前期前方原始線条細胞をアクチビンＡおよびＢＭＰ阻害剤を含む培地中で培養して前方胚体内胚葉の後方ドメイン（ＰＡＤＥ）細胞を得る工程、および
   （ｉｉｉ）得られた前方胚体内胚葉の後方ドメイン（ＰＡＤＥ）細胞を分化誘導因子を含まない培地中で培養して前方前腸（ＡＦＧ）細胞を得る工程。
2. 前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ－１９３１８９である、請求項１記載の方法。
3. 多能性幹細胞から後方前腸（ＰＦＧ）細胞へと選択的に誘導する方法であって、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む方法：
   （ｉ）多能性幹細胞をアクチビンＡと、１μＭから４μＭ未満のＣＨＩＲ９９０２１と同等の活性を有する比較的低濃度のＧＳＫ３β阻害剤とを含む培地中で培養して前期前方原始線条細胞を得る工程、
   （ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた前期前方原始線条細胞を、アクチビンＡを含む培地中で培養して前方胚体内胚葉の前方ドメイン（ＡＡＤＥ）細胞を得る工程、および
   （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた前方胚体内胚葉の前方ドメイン（ＡＡＤＥ）細胞を分化誘導因子を含まない培地中で培養して後方前腸（ＰＦＧ）細胞を得る工程。
4. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１であり、培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度が約３μＭである、請求項１～３いずれかに記載の方法。
5. 多能性幹細胞から中後腸（ＭＨＧ）細胞へと選択的に誘導する方法であって、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む方法：
   （ｉ）多能性幹細胞をアクチビンＡと、４μＭ以上のＣＨＩＲ９９０２１と同等の活性を有する比較的高濃度のＧＳＫ３β阻害剤とを含む培地中で培養して後期前方原始線条細胞を得る工程、
   （ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた後期前方原始線条細胞を、アクチビンＡを含む培地中で培養して後方胚体内胚葉（ＰＤＥ）細胞を得る工程、および
   （ｉｉｉ）得られた後方胚体内胚葉（ＰＤＥ）細胞を分化誘導因子を含まない培地中で培養して、中後腸（ＭＨＧ）細胞を得る工程。
6. 前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１であり、培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度が４μＭ以上である、請求項５記載の方法。
7. 培地中における前記ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が約８μＭである、請求項６記載の方法。
8. 多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞である、請求項１～７何れかに記載の方法。

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