JP7200180B2 - 小ペプチドを含む細胞培養培地 - Google Patents
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Description
細胞培養培地は、制御された人工的なインビトロ環境下において細胞を維持し増殖させるのに必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の栄養素配合、pH、および浸透圧は、細胞型、細胞密度、および使用する培養システムなどのパラメータに従って異なる。
本発明の組成物は、一つには、システインおよびチロシンの限られた溶解度および安定性によって生じる問題を回避しつつ、最大の細胞増殖および/またはタンパク質もしくはウイルス産生を支援するシステインおよびチロシンの濃度を含む細胞培養培地、濃縮培地、または濃縮供給補充物に関する。1つの局面において、培地、濃縮供給補充物、または濃縮培地は無血清組成物であってよい。1つの局面において、組成物は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清構成成分を含み得る。さらなる局面において、ヒト血清アルブミンは、組換え供給源に由来する、いくつかの好ましい事例ではコメ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどの植物供給源、または真菌供給源、または酵母もしくは当技術分野で用いられることが周知であるその他の同等の微生物に由来する組換え体(r-ヒト血清アルブミン)であってよい(異物不含培養)。別の局面において、培地、濃縮供給補充物、または濃縮培地はタンパク質不含組成物であってよい。さらに別の局面において、培地、濃縮供給補充物、または濃縮培地は、タンパク質加水分解物不含組成物であってよく、さらにタンパク質加水分解物の一部を含まなくてよい。特定の局面において、培地、濃縮供給補充物、または濃縮培地は、無血清で、タンパク質不含で、かつタンパク質加水分解物不含である組成物であってよい。好ましい局面において、これらの組成物は、既知組成であり、無血清であり、タンパク質不含であり、かついかなるタンパク質加水分解物もおよびその一部も含まない、構成成分を含み得る。特定の態様において、1つもしくは複数の小ペプチドまたは1つもしくは複数のジペプチドを有する細胞培養培地、濃縮培地、または細胞培養供給補充物はさらに、以下のうちの1つまたは複数を含まない:脂質、加水分解物もしくはその一部、または増殖因子。
[本発明1001]
少なくとも1つの小ペプチドを含む細胞培養培地であって、該ペプチドが少なくとも2つのアミノ酸を含み、該アミノ酸の少なくとも1つがシステインまたはチロシンである、細胞培養培地。
[本発明1002]
前記小ペプチドの残りのアミノ酸の少なくとも1つが、アラニン、グリシン、セリン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択される、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1003]
前記小ペプチドの残りのアミノ酸の少なくとも1つが、アラニンまたはグリシンである、本発明1002の細胞培養培地。
[本発明1004]
前記小ペプチドの少なくとも1つが、X-チロシン、X-システイン、チロシン-X、およびシステイン-X、もしくはそれらの塩からなる群より選択されるジペプチドであり、かつXが、アラニン、グリシン、セリン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択され、かつ/または、1つもしくは複数の該小ペプチドのN末端アミノ酸が遊離アミノ基を有する、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1005]
Xがアラニンまたはグリシンである、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1006]
液体である、本発明1001~1005のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1007]
乾燥粉末または粒状乾燥粉末である、本発明1001~1005のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1008]
炭水化物、およびアミノ酸またはその塩をさらに含む、本発明1001~1007のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1009]
前記炭水化物がヘキソースである、本発明1008の細胞培養培地。
[本発明1010]
前記アミノ酸またはその塩が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンのうちの1つまたは複数である、本発明1008または1009の細胞培養培地。
[本発明1011]
ビタミン、塩、緩衝剤、または無機元素をさらに含む、本発明1001~1010のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1012]
脂質、加水分解物もしくはその一部、または増殖因子を含まない、本発明1001~1011のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1013]
タンパク質を含まない、本発明1001~1012のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1014]
2×または2×超の配合物として濃縮される、本発明1001~1013のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1015]
1つまたは複数の前記ジペプチドが、アラニルチロシンおよび/またはアラニルシステインおよび/またはアラニルシスチン二量体である、本発明1004~1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1016]
1つまたは複数の前記ジペプチドが、約1 g/L~約16 g/Lの濃度で存在する、本発明1004~1006または1008~1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1017]
1つまたは複数の前記ジペプチドが、約2.5 g/L~約8.5 g/Lの濃度で存在する、本発明1004~1006または1008~1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1018]
2~8℃で保存された前記液体が、12ヵ月超の間沈殿物のない状態のままである、本発明1006または1008~1017のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1019]
細胞を培養する方法であって、
該細胞の培養を支援する条件下で、細胞培養基礎培地と該細胞を接触させる段階、および
本発明1001~1018のいずれかの濃縮供給物または濃縮培地を、該細胞培養基礎培地に補充する段階
を含む方法。
[本発明1020]
前記細胞培養基礎培地に、2日目以降に前記濃縮供給物または前記濃縮培地を補充する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞培養基礎培地への前記濃縮供給物または前記濃縮培地の補充を、細胞培養の開始後0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、または5日目のいずれかから行い、かつ、その後13日目または14日目まで毎日補充する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞培養基礎培地への補充が、該細胞培養基礎培地の全出発量の約1~10%または約5~20%である、本発明1019~1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記細胞が、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、藻類細胞、または魚類細胞である、本発明1019~1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記細胞が免疫グロブリンまたはその断片を産生する、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記細胞が、3000 mg/L超の免疫グロブリンまたはその断片を産生する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
炭水化物、および少なくとも1つのアミノ酸またはその塩と、1つまたは複数の小ペプチドを混合する段階を含む、細胞培養培地を調製する方法であって、1つまたは複数の該小ペプチドがそれぞれシステインまたはチロシンを含む方法。
[本発明1027]
システインまたはチロシン以外の、1つまたは複数の前記小ペプチドのアミノ酸が、アラニン、グリシン、セリン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸より選択される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
システインまたはチロシン以外の、1つまたは複数の前記小ペプチドのアミノ酸が、アラニンまたはグリシンである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
1つまたは複数の前記小ペプチドが、X-チロシン、X-システイン、チロシン-X、もしくはシステイン-X、またはそれらの塩より選択される1つまたは複数のジペプチドであり、Xが、アラニン、グリシン、セリン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、アルギニン、またはグルタミン酸より選択され、かつ1つまたは該ジペプチドのN末端アミノ酸が遊離アミノ基を有する、本発明1026の方法。
[本発明1030]
Xがアラニンまたはグリシンである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記炭水化物がグルコースである、本発明1026~1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
少なくとも1つの前記アミノ酸またはその塩が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンのうちの1つまたは複数である、本発明1026~1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記細胞培養培地が、ビタミン、塩、緩衝剤、または無機元素をさらに含む、本発明1026~1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記細胞培養培地が、脂質、加水分解物もしくはその一部、または増殖因子を含まない、本発明1026~1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記細胞培養培地がタンパク質を含まない、本発明1026~1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記細胞培養培地が2×または2×超の配合物として濃縮される、本発明1026~1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
1つまたは複数の前記ジペプチドが、アラニルチロシンおよび/またはアラニルシステインである、本発明1029~1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
1つまたは複数の前記ジペプチドが、約1 g/L~約16 g/Lの濃度で前記細胞培養培地中に存在する、本発明1029~1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
1つまたは複数の前記ジペプチドが約2.5 g/L~約8.5 g/Lの濃度で存在する、本発明1029~1037のいずれかの方法。
[本発明1040]
2~8℃で保存された前記細胞培養培地が、12ヵ月超の間沈殿物のない状態のままである、本発明1029~1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地を解析するための方法であって、該培地中において、システインまたはチロシンを含む短いペプチドの存在または非存在を判定する段階を含む方法。
[本発明1042]
質量分析(LCMS)、キャピラリー電気泳動、およびHPLCを含む群より選択される手法によって解析を行う、無血清で、タンパク質不含で、加水分解物不含である細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地を解析するための本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記短いペプチドが2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸を含む、無血清で、タンパク質不含で、加水分解物不含である細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地を解析するための本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記短いペプチドがジペプチドである、培地を解析するための本発明1041の方法。
[本発明1045]
前記CHO細胞がウイルスを産生する、本発明1023の方法。
[本発明1046]
前記ウイルスが、組換えウイルスまたはウイルス様粒子(VLP)である、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記ウイルスが、アデノウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、または操作されたそれらのウイルス誘導体である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記VLPが核酸を保有する、本発明1046の方法。
[本発明1049]
前記核酸がRNAである、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記ヘキソースが、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびマルトースからなる群より選択される、本発明1009の細胞培養培地。
[本発明1051]
システインまたはチロシンを含む小ペプチドを含み、無血清で、タンパク質不含で、かつ/または加水分解物不含である、細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地。
[本発明1052]
前記小ペプチドが2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸を含む、本発明1051の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地。
[本発明1053]
組換えタンパク質の産生を支援する、本発明1001の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地。
[本発明1054]
前記組換えタンパク質が免疫グロブリンまたはその断片である、本発明1053の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地。
[本発明1055]
本発明1001の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地と、細胞とを含む、組成物。
[本発明1056]
細胞培養培地中で組換えタンパク質を作製する方法であって、
本発明1001の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地と、細胞を接触させる段階;ならびに
該細胞の増殖および/または該組換えタンパク質の発現に適した条件下で、該細胞を培養する段階
を含む方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の容器を含む、インビトロで細胞を培養するためのキットであって、第1容器が、少なくとも1つのジペプチドを含む本発明1001の培地を含み、かつ該培地が、培養中の該細胞の増殖、および/または組換えタンパク質の発現を支援する、キット。
[本発明1058]
前記培養が懸濁培養であるかまたは接着培養である、本発明1057のキット。
[本発明1059]
前記増殖が高密度増殖である、本発明1057のキット。
[本発明1060]
本発明1001の細胞培養培地、濃縮供給物、または再構成された培地中でウイルスまたはウイルス粒子を作製する方法であって、本発明1001の細胞培養培地中で組換え細胞を培養する段階を含み、該培地が、該ウイルスまたは該ウイルス粒子の発現に適した条件下で該細胞の増殖を支援する、方法。
[本発明1061]
本発明1056の方法によって産生された、組換えタンパク質。
[本発明1062]
本発明1060の方法によって産生された、ウイルスまたはウイルス粒子。
[本発明1063]
ウイルスまたは組換えタンパク質を産生するための、本発明1001の細胞培養培地、濃縮供給物または再構成された培地の使用。
[本発明1064]
本発明1026の方法によって作製された、培養培地、濃縮供給物または再構成された培地。
[本発明1065]
前記小ペプチドが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドのいずれかである、本発明1001または1064の細胞培養培地。
[本発明1066]
前記小ペプチドが少なくとも約2~10アミノ酸長である、本発明1001または1064の細胞培養培地。
[本発明1067]
前記小ペプチドが少なくとも約10アミノ酸長である、本発明1001または1064の細胞培養培地。
[本発明1068]
流加培養中に前記補充を行う、本発明1022の方法。
これより、様々な例示的態様について詳細に言及する。以下の詳細な説明は、読者に本発明の特定の態様、特徴、および局面の詳細をより十分に理解してもらうために提供されており、本発明の範囲の限定であると解釈されるべきでないことを理解されたい。
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載する。
本開示は、細胞培養培地中での、ジペプチドを含む小ペプチドの使用に関する。本出願人らは、チロシンおよびシステインなどの特定のアミノ酸の所望の濃度を含む細胞培養培地の調製が、チロシンの低溶解度およびシステインの低安定性のために不可能なままであることを見出した。チロシンおよびシステインの溶解度および安定性の問題は、水性細胞培養培地中でチロシンまたはシステインの所望の濃度よりも低い濃度を用いることによって対処したが、これにより、細胞培養中に栄養素が使用されるという理由で、それらは最適な細胞増殖および/またはタンパク質産生の律速アミノ酸となる。チロシンおよびシステインの所望の濃度よりも低い濃度を用いることで、許容可能な水性保存期間、溶解度、および安定性をもたらすことができるが、所望の生産性を達成するためには、例えば流加培養システムにおいて、細胞培養補充中により大量の培地を添加することも必要となり得る。その上、システムの化学量論的な平衡、pH、および/または浸透圧も再調整される必要があるため、これは望ましくない。
細胞培養培地は多くの成分から構成され、これらの成分は培養培地ごとに異なる。上記のとおり、細胞培養培地は、完全な配合物、すなわち細胞を培養するために補充を必要としない細胞培養培地であってよく、不完全な配合物、すなわち補充を必要とする細胞培養培地であってよいか、または不完全な配合物を補充し得るか、もしくは完全な配合物である場合には培養もしくは培養結果を改善し得る補充物であってよい。
細胞培養培地成分は典型的に、炭水化物、アミノ酸、塩、微量元素、およびビタミンを含む。哺乳動物細胞に関しては、細胞培養培地中で用いられる主要な炭水化物は、5~25 nMで日常的に補充されるグルコースである。Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, 51 (Sadettin Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006)を参照されたい。グルコースに加えて、ガラクトース、フルクトース、もしくはマンノース、またはこれらの組み合わせなどの任意のヘキソースも使用され得る。加えて、哺乳動物はまた主要なエネルギー源としてグルタミンを使用し得る。グルタミンは、他のアミノ酸よりも高い濃度で含まれる場合が多い(2~8 mM)。しかしながら、上記のとおり、グルタミンは自発的に分解してアンモニアを形成し得、ある種の細胞株はアンモニアをより速く産生し、これは毒性がある。したがって、細胞培養培地中の毒性アンモニアの蓄積を減少させるために、グルタミンの代替物としてグルタミン酸およびグルタミンジペプチドが使用されている。
アミノ酸は、培養細胞の代謝機能を維持するために、細胞培養培地中で重要である。細胞培養培地は典型的に、必須アミノ酸(すなわち、哺乳動物によってインビボで通常合成されないアミノ酸)およびある種の非必須アミノ酸を含む。非必須アミノ酸は典型的に、細胞株が該アミノ酸を合成することができない場合、または細胞株が最大の増殖を支援するのに十分な量の該アミノ酸を産生することができない場合に、細胞培養培地中に含められる。例示的なアミノ酸には、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンが含まれる。
塩は、等張状態を維持し、浸透圧の不均衡を妨げるために、細胞培養培地に添加される。標準的な哺乳動物細胞培養培地の浸透圧は約 300 mOsm/kgであるが、多くの細胞株はこの値のおよそ10%の変動を許容し得る。いくつかの昆虫細胞培養物の浸透圧は300 mOsm/kgよりも高い傾向があり、これは300 mOsm/kgよりも0.5%、1%、2~5%、5~10%、10~15%、15~20%、20~25%、25~30%高くてよい。細胞培養培地中で最も一般的に使用される塩には、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、S04 2-、P04 3-、およびHC03 -(例えば、CaCl2、KCl、NaCl、NaHC03、Na2HP04)が含まれる。したがって、特定の細胞型を培養するための細胞培養培地の所望の浸透圧はまた、当技術分野で公知の方法を用いて当業者によって経験的に決定され得る。
全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 2005/0287666に記載されているとおり、血清中に微量で存在するその他の無機元素を細胞培養培地中に含めることができる。それらには、Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、およびNiが含まれる。それほど頻繁ではないが、細胞培養培地に添加されているその他の無機元素には、Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb、およびZrが含まれる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。それらは、CaCl2、Fe(N03)3、MgCl2、MgS04、MnCl2、NaCl、NaHC03、Na2HP04などの塩、ならびにセレン、バナジウム、および亜鉛などの微量元素のイオンの形態で提供され得る。これらの微量元素は、様々な形態で、好ましくはNa2Se03、NH4V03などの塩の形態で提供され得る。これらの無機塩および微量元素は、例えばSigma(Saint Louis, Missouri)から商業的に入手することができる。
ビタミンは典型的に、補助因子として細胞によって使用される。各細胞株のビタミン要求は大きく異なるが、細胞培養培地が血清をほとんど含まない場合、または細胞を高密度で増殖させる場合には、一般的に余分のビタミンが必要とされる。例示的なビタミンには、ビオチン、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、D-Ca++-パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、A、B6、B12、C、D3、E、K、およびp-アミノ安息香酸(PABA)が含まれる。
凝固した血液の上清である血清は、細胞の増殖および/または生産性を促進する構成成分を提供するために、細胞培養培地地中で使用され得る。これらの血清構成成分には、接着因子、微量栄養素(例えば、微量元素)、増殖因子(例えば、ホルモン、プロテアーゼ)、および保護エレメント(例えば、抗毒素、抗酸化物質、抗プロテアーゼ)が含まれる。血清は、ウシまたはウマを含む様々な動物源から入手可能である。細胞培養培地中に含める場合、血清は典型的には5~10%の濃度で添加される。特定の細胞培養培地は無血清である。
血清の非存在下または血清低減培地中での細胞増殖を促進するために、以下のポリペプチドのうちの1つまたは複数を細胞培養培地に添加することができる:例えば、酸性FGFおよび塩基性FGFを含む線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ならびにTGFαおよびTGFβを含むトランスフォーミング増殖因子(TGF)、インターロイキン1、2、6、顆粒球刺激因子、白血病抑制因子(LIF)などの任意のサイトカイン。
1つまたは複数の脂質を細胞培養培地に添加することもできる。血清は典型的に、脂肪酸(例えば、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸、および/または各炭素原子が分枝状もしくは非分枝状である、12個、14個、16個、18個、20個、もしくは24個の炭素原子の脂肪酸)、リン脂質、レシチン(ホスファチジルコリン)、およびコレステロールなどの脂質を含む。あるいは、これらの脂質のうちの1つまたは複数を、無血清培地中に補充物として含めることもできる。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、MDCK、マウス上皮、およびその他の腎臓細胞株などのある種の足場依存性細胞の増殖を促進し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールは、無血清培地中でヒト線維芽細胞の増殖を促進する。エタノールアミンおよびコレステロールもまた、ある種の細胞株の増殖を促進することが示されている。特定の態様において、細胞培養培地は脂質を含まない。
ウシ血清アルブミン(BSA)またはトランスフェリンなどの1つまたは複数の担体タンパク質を細胞培養培地に添加することもできる。担体タンパク質は、ある種の栄養素または微量元素の輸送に役立ち得る。BSAは典型的には、水溶液中で不溶性である、リノール酸およびオレイン酸などの脂質担体として用いられる。加えて、BSAはまた、Fe、Cu、およびNiなどのある種の金属の担体としても役立ち得る。タンパク質不含配合物では、シクロデキストリンなどの、BSAの非動物由来代替物が脂質輸送体として使用され得る。トランスフェリンは、細胞膜を介した鉄の輸送に関与する。場合によっては、下流の治療用途のために生成される産物にとって望ましい(例えば、異物不含(XF)培養においてなど)細胞の培養には、ヒト血清アルブミンが必要である場合がある。他の例では、組換えヒト血清アルブミンが、細胞を培養するための細胞培養培地中で使用され得る。特定の事例では、細胞の動物起源不含(AOF)培養を提供するために、組換えヒト血清アルブミンは、コメ、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、さらには酵母などのような植物、藻類、または真菌供給源に由来し得る。タンパク質不含配合物では、トランスフェリンは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 98/08934に記載されているとおり、三価鉄および/もしくは二価鉄塩と、またはその全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 2007/0254358に記載されているとおり、ヒドロキシピリジン誘導体と置換され得る。加えて、タンパク質不含配合物では、インスリンは、亜鉛、バナジウム、またはその他の適切な二価塩と置換され得る。
足場依存性細胞の基材への接着を促進するのを助けるために、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロネクチンなどの1つまたは複数の接着タンパク質を細胞培養培地に添加することもできる。
細胞培養培地は任意に、1つまたは複数の緩衝剤を含み得る。適切な緩衝剤には、N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸](HEPES)、MOPS、MES、リン酸、炭酸水素、および細胞培養適用において使用するのに適したその他の緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な緩衝剤は、培養される細胞に対する実質的な細胞毒性なしに緩衝能力を提供するものである。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養の技術分野における通常の技術の範囲内である。
ポリアニオン化合物またはポリカチオン化合物は、細胞が凝集するのを防ぎ、懸濁液中で細胞の増殖を促進し得る。その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 98/08934を参照されたい。例示的なポリアニオン化合物には、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ペント酸ポリ硫酸、プロテオグリカンなどのようなポリスルホン化化合物またはポリ硫酸化化合物が含まれる。
バッチ間の変動、高タンパク質含量、汚染(例えば、ウイルス、マイコプラズマ、プリオン)のリスク、限られた利用能、および高コストを含む、血清に関連した潜在的問題により、無血清培地の作製が推進された。さらに、血清が補充された培地中で増殖された細胞において見られる発現のレベルと比較して、無血清培地中で増殖された細胞から、組換えタンパク質発現のレベルの向上が得られ得る(Battista, P. J. et al., Am. Biotech Lab. 12: 64-68 (1994))。
無血清培地は、血清を含む細胞培養培地と比較して少量のタンパク質を含む。しかしながら、無血清培地は、アルブミン、フェチュイン、様々なホルモン、およびその他のタンパク質を含む様々な動物由来構成成分のうちの1つまたは複数をなお含み得る。タンパク質の存在により、組換えタンパク質の精製は困難になり、時間を要し、かつ高価になり、また産物の収量および/または純度の減少をもたらし得る。したがって、1つの態様において、細胞培養培地はタンパク質不含である。
細胞の流加培養は典型的には、高い産物濃度および容積生産性を目的として、細胞濃度を増加させるためおよび培養寿命を延ばすために、タンパク質などの生体分子の産業生産に用いられる。流加培養は、基礎培地への、グルコース、アミノ酸などの、細胞によってすぐに利用される栄養素を含み得る供給物の形態の、1つまたは複数の栄養素の制御された添加を含む。栄養素は、栄養素の枯渇および副産物の蓄積を妨げようとすることによって細胞培養物の増殖を制御するのに、pH、浸透圧、およびCO2濃度などの重要なパラメータを、最適な産物発現のために細胞増殖を促進するかまたは細胞死を最小限にするレベル内に制御するのに役立つ。Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, 349-386 (Sadettin Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006)を参照されたい。その場合でさえ、流加培養は、最終的に細胞生存度と適合しない高濃度の阻害性代謝物および高浸透圧をもたらす場合が多い。
本明細書に記載されるシステインおよびチロシン含有小ペプチドまたはジペプチドを含む培地は、様々な細胞を培養するために使用することもできる。本明細書に記載される培養培地および供給物を用いて増殖される細胞は、古細菌を含む任意の原核生物、藻類、酵母、真菌、植物、昆虫、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはマウスまたはヒトに由来し得る。1つの態様において、培地は、植物細胞、または哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞、もしくは鳥類細胞などの動物細胞を含む真核細胞を培養するために用いられる。
本明細書に記載される培養培地によって支援される細胞は、研究者によって決定される実験条件に従って培養することができる。以下の例は、ある種の哺乳動物細胞の培養に有用な培養条件の少なくとも1つの機能的セットを実証する。しかしながら、所与の動物細胞型の最適なプレーティングおよび培養条件は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得ることが理解されるべきである。本明細書に記載される細胞培養培地を用いた日常的な単層培養条件に関して、細胞は、接着因子なしで培養容器の表面上にプレーティングすることができる。あるいは、容器を天然、組換え、または合成の接着因子またはペプチド断片(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなど、またはそれらの天然もしくは合成の断片)で予めコーティングすることもでき、それらは、例えば、Life Technologies, Corp.(Carlsbad, CA)、R&D Systems, Inc.(Rochester, Minnesota)、Genzyme(Cambridge, Massachusetts)、およびSigma(St. Louis, Missouri)から市販されている。細胞はまた、予め形成されたコラーゲンゲルまたは合成生体高分子材料などの天然または合成の三次元支持基質内または該基質上に播種することもできる。懸濁培養に関しては、細胞を典型的には、本明細書に記載される培養培地中に懸濁し、スピナーフラスコ、潅流装置、またはバイオリアクターなどの、懸濁液中での細胞の培養を容易にする培養容器中に導入する。Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, 156-174 (Sadettin Ozturk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006)を参照されたい。場合によっては、培地および懸濁細胞のいくらかのレベルの撹拌が必要である。撹拌は、培養中の培地構成成分の変性および細胞の剪断を回避するように、最小限にされ得る。
懸濁培養または単層培養における細胞の培養に加えて、本培地は、哺乳動物細胞からウイルスを産生させる方法において使用することもできる。そのような方法は、(a) ウイルスによる細胞の感染を促進するのに適した条件下で、細胞(例えば、哺乳動物細胞)をウイルスと接触させる段階;および(b) 細胞によるウイルスの産生を促進するのに適した条件下で、本明細書に記載される小ペプチドまたはジペプチド含有細胞培養培地中で該細胞を培養する段階を含む。細胞は、培養培地中での細胞の培養前、培養中、または培養後のいずれかに、ウイルスと接触させることができる。哺乳動物細胞にウイルスを感染させるための最適な方法は当技術分野で周知であり、当業者によく知られている。本明細書に記載される培養培地中で培養されたウイルス感染哺乳動物細胞は、本明細書に記載される細胞培養培地以外の細胞培養培地中で培養された細胞よりも高いウイルス力価(例えば、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍、または1000倍高い力価)を生じることが予測され得る。
本培養培地はまた、上記の細胞、好ましくは哺乳動物細胞、および特に懸濁液中で増殖された哺乳動物細胞から、組換えタンパク質を産生させる方法において使用することもできる。本培養培地は、哺乳動物細胞の迅速で高密度の懸濁培養を提供するため、本方法によって組換えタンパク質の産生向上が容易になる。タンパク質とは、全長タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、切断タンパク質産物、架橋タンパク質産物、タグ化ペプチドまたはタンパク質などのいずれかを意味する。タンパク質とはまた、組換えタンパク質、変異タンパク質、操作されたタンパク質、キメラタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、活性タンパク質、プロセシングされたタンパク質などを含む、天然および改変タンパク質のすべての型を意味する。タンパク質は細胞もしくは細胞株によって天然で発現されてもよいし、または細胞株が、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の標準的な遺伝子操作法を用いて、これを発現するように操作されてもよい。結果として得られたタンパク質またはペプチドは、所望のレベルの純度まで精製または単離され得る。本発明の培地および/または供給物組成物を用いて産生または発現され得るタンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片には、ラミニン、フィブロネクチン、インテグリンなどのような細胞外タンパク質、カスパーゼ、プロテアーゼ、スブチリシン、キナーゼ、RNAse、DNAseなどのような酵素、インスリン、PTHrPなどのようなペプチドホルモン、膜タンパク質、受容体、核タンパク質、小胞体タンパク質などを含む細胞内タンパク質、抗体、抗体の重鎖または軽鎖などの抗体断片、抗原結合部位またはモチーフ、キメラ抗体などが含まれるが、これらに限定されない。キメラ抗体は、種/種キメラまたはクラス/クラスキメラであってよい。本発明の組成物および培地/供給物を用いて産生され得る発現されたタンパク質またはポリペプチドは、治療における下流の用途のために外来性作用物質を含まない動物起源不含タンパク質を産生するために、植物細胞などの非動物細胞株において発現されるヒトまたは哺乳動物由来タンパク質配列であってよい。
本明細書に記載される小ペプチドおよびジペプチドは、酸加水分解、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動(Brown et al., J. Chrom. (1994) A, 661: 279-285)、HPLC(van Wandelen et al., J. Chrom. (1997) A, 763: 11-22)、または質量分析を含むがこれに限定されない、アミノ酸および/または小ペプチドを検出するための、当技術分野で公知の任意の技法を用いて検出することができる。アミノ酸組成物および濃縮物のクロマトグラフィー解析のためのペプチドの酸加水分解は、当技術分野で周知である。酸加水分解の前と後のアミノ酸ピークのクロマトグラフィープロファイルの比較から、培地、供給物、または補充物中のアミノ酸の組成および濃度、ならびにひいては小ペプチドが示され得る。例えば、培地中の小ペプチド内にチロシンが存在する場合には、その濃度は培地試料の酸加水分解物中で(例えば、チロシンピーク高および/またはピークの領域)、酸加水分解の前の同一培地試料のピーク高/領域と比較して増加する。
ジペプチドであるアラニルチロシン(AlaTyr)およびアラニルシステイン(ジスルフィド二量体、[AlaCys]2を形成する)を含む例示的な細胞培養培地を調製した。具体的には、グルコースおよび濃縮アミノ酸の混合物を含む水性細胞培養基礎培地に、ジペプチドであるアラニルチロシンおよびアラニルシステインを乾燥粉末として添加し、溶解するまで混合した。アラニルチロシンは、約4.0 g/Lの濃度で細胞培養培地に添加した。アラニルシステインは、約3.0 g/Lの濃度で細胞培養培地に添加した。水中で観察されるジペプチドの溶解度は、AlaTyrについては約15.4 g/L、AlaCysについては>100 g/L、および[AlaCys]2二量体については約8.7 g/Lであった。比較として、水中でのL-チロシンの溶解度は、20℃で約0.38 g/Lである。遊離のL-システインは容易に酸化されてシスチンになる。塩酸L-システインは酸性水溶液中でかなり安定しているが、中性またはアルカリ性水溶液中では、これはまた好気的酸化によりL-シスチンに変換される。水中でのL-シスチンの溶解度は、25℃で約0.11 g/Lであった。
細胞培養基礎培地CD FortiCHO(商標)(Invitrogen Cat. No. A-1148301およびCustom Stock A-11437DK;Life Technologies Corp.、Carlsbad, CA)中で増殖され、グルコース(CD FortiCHO(商標)+グルコース;図1:黒四角の曲線
およびフォワードスラッシュのバー
)、または低レベルのシステインもしくはチロシンを含む濃縮アミノ酸混合物で、グルコースの混合物+実施例1に記載されるジペプチド(DP)含有培養培地もしくは供給物(CD FortiCHO(商標)+aa+DP供給物FP2およびFP3;図1を参照されたい:(FP2) 黒丸の曲線
および白いバー
;(FP3) 黒菱形の曲線
およびバックワードスラッシュのバー
)のいずれかで補充された、IgG産生CHO細胞を用いて、統合流加試験を行った。図1中の「aa」は、低レベルのシステインおよびチロシンを含む濃縮アミノ酸混合物とグルコースの混合物を指す。
Claims (14)
- 細胞を供給物と共に培養するためのインビトロの方法であって、
(i)細胞および細胞培養培地を提供する段階;
(ii)(a)アラニン-システインを含む、6つまたはそれより少ないアミノ酸を有するペプチド;および
(b)アラニン-チロシンを含む、6つまたはそれより少ないアミノ酸を有するペプチド
を含む供給物を添加する段階であって、該ペプチドの少なくとも1つがジペプチドである、段階;ならびに
(iii)該ペプチドが、該供給物が存在しない場合の細胞培養と比較して、細胞増殖、生細胞密度、タンパク質産生、およびウイルス産生からなる群より選択される細胞培養の性能の向上を支援する条件下で、該細胞を該供給物と共に培養する段階
を含む、前記インビトロの方法。 - 残りのアミノ酸が、20種のアミノ酸のいずれかから選択される、請求項1記載のインビトロの方法。
- 残りのアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、単一の供給物、既知組成供給物、タンパク質加水分解物不含供給物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、液体、乾燥粉末、または粒状乾燥粉末である、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が再構成時にpH6~8を有する、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- ペプチドが1 g/L~16 g/Lの濃度で存在する、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 2~8℃で保存された場合に、液体が12ヵ月超の間沈殿物のない状態のままである、請求項5記載のインビトロの方法。
- ペプチドが、非動物細胞株において発現された動物起源不含ペプチドである、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、流加培養、バイオリアクター、または発酵槽に添加される、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 細胞が、昆虫細胞、線虫細胞、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、BHK細胞、AE-1細胞、SP2/0細胞、LS.1細胞、PerC6細胞、およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、炭水化物、少なくとも1つのアミノ酸もしくはその塩、ビタミン、塩、緩衝剤、無機元素、または非動物細胞株において発現された動物起源不含ペプチドのうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、1×培地に対して濃縮される、請求項1または2記載のインビトロの方法。
- 供給物が、乾燥粉末培地または凝集粉末である、請求項5記載のインビトロの方法。
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