JP7197556B2 - がん治療のための染色体不安定性および下流サイトゾルｄｎａシグナル伝達をターゲティングする方法 - Google Patents

がん治療のための染色体不安定性および下流サイトゾルｄｎａシグナル伝達をターゲティングする方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，６６１号の出願日に対する優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
連邦政府の資金援助
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＣＡ１９７５８８およびＡＲＭＹ／ＭＲＭＣにより授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ－１６－１－０３１５の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
がんは、体の様々な部分における異常な細胞の制御されない成長である。現在、がんは、成功の度合いが異なる、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法等によって治療することができる。しかしながら、外科的療法では、広範囲に転移した腫瘍細胞を完全に除去することができない。放射線療法および化学療法は、急速に増殖する正常細胞の存在下でがん細胞を殺滅するのに十分な選択性を有しない。免疫療法は、主に、サイトカインまたは治療用がんワクチンの使用に限定されている。サイトカインは、深刻な毒性を引き起こす場合があり、ワクチンの継続使用は、免疫寛容につながる場合がある。
概要
以前より、サイトゾルＤＮＡに関する主要な懸念の１つが免疫反応を誘発することであった。しかしながら、本明細書に記載されるように、染色体不安定性は、サイトゾルＤＮＡを生成する可能性があり、それはがん細胞の転移の発生率および可能性を増加させる。本明細書でさらに説明されるように、染色体誤分離などの染色体不安定性、および小核はまた、がん細胞の発生率および転移の可能性も増加させる可能性がある。
記載された方法組成物は、増加した染色体不安定性レベル、増加したサイトゾルＤＮＡレベル、染色体誤分離、またはそれらの組み合わせを有する患者の治療に有用である。組成物および方法はまた、転移、制がん剤耐性、またはそれらの組み合わせを低減および／または阻害することができる。場合によっては、組成物および方法は、キネシン－１３の発現を調節するのに有用であり、組成物および方法は、染色体不安定性を低減することができる。
例えば、細胞内のＫｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、またはＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質の発現および／または活性を増加させることができる方法および組成物が、本明細書に記載されている。場合によっては、方法および組成物は、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２の発現および／または活性を増加させることができる。これらの方法はまた、哺乳動物細胞中のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することも含み得る。そのような組成物および方法は、転移性がんの発生および進行を含む、がんの進行を治療および阻害するのに有用である。
転移性がんを含むがんの治療に有用である新しい化合物の設計および開発のためのアッセイを含む、他の方法が本明細書に記載されている。
[本発明1001]
（ａ）培養培地中で試験化合物を転移性がん細胞試料と混合して、試験アッセイ物をもたらすこと、（ｂ）前記試験化合物が細胞と会合するのにまたは細胞に浸透するのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートすること、（ｃ）
●試験アッセイ物の値をもたらす、前記培養培地中、前記細胞中、またはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量または濃度、
●平均距離結果をもたらす、一連の前記細胞内の中心体間の距離、
●前記細胞の核へのＲＥＬＢ転座の量
を測定すること、ならびに（ｄ）
●基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値、
●基準距離よりも小さい平均距離結果、
●基準量よりも低い、前記細胞の核へのＲＥＬＢ転座の量
を有する試験化合物を選択し、それによって、染色体不安定性の治療に有効な試験化合物を生成すること
を含む、方法。
[本発明1002]
基準が、
ａ．試験化合物を含有しないアッセイ物混合物中のｃＧＡＭＰの量もしくは濃度、
ｂ．試験化合物を含有しないアッセイ物混合物内の転移性がん細胞中のセントロメア間の距離、または
ｃ．試験化合物を含有しないアッセイ物混合物内の転移性がん細胞の核へのＲＥＬＢ転座の量
である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記試料または培養培地をアルコールで抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
半純粋な（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｅ）試験試料の前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、1つ以上のＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、ｃＧＡＭＰのレベルを測定するための液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、本発明1001～1003または1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
治療用物質を同定するために前記試験化合物を動物モデルに投与することをさらに含む、本発明1001～1004または1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記治療用物質を患者に投与することをさらに含む、本発明1001～1005または1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
（ａ）患者から細胞試料または組織試料を得ること、（ｂ）前記試料由来の既知数または既知重量の細胞または組織から産生されたｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、基準ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｃ）前記試料由来の前記既知数または既知重量の細胞または組織を試験化合物と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｄ）前記試験アッセイ物中の前記ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｅ）任意に、ステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すこと、ならびに前記基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する任意の試験化合物を選択し、それによって、少なくとも1つの有効な試験化合物を同定することを含む、方法。
[本発明1009]
前記試料が転移性がん細胞または転移性組織を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記細胞試料または組織試料をアルコールで抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記細胞試料または組織試料をメタノールで抽出してメタノール抽出物を生成すること、および前記メタノール抽出物中の前記ｃＧＡＭＰを測定することをさらに含む、本発明1008、1009、または1010の方法。
[本発明1012]
半純粋な試験試料の前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、1つ以上のＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物または前記メタノール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、本発明1008～1011または1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記有効な試験化合物を動物がんモデルに投与することをさらに含む、本発明1008～1012または1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記有効な試験化合物を、患者にまたは得られた前記細胞試料もしくは組織試料が由来する患者に投与することをさらに含む、本発明1008～1013または1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
本発明1001～1014または1015のいずれかの方法により生成された有効な試験化合物。
[本発明1017]
ａ．細胞試料の1つ以上の細胞内に少なくとも10％の検出可能な染色体誤分離を有する、
ｂ．細胞試料の1つ以上の細胞内に少なくとも3％の検出可能な小核を有する、
ｃ．細胞試料の1つ以上の細胞内に検出可能なサイトゾル二本鎖ＤＮＡを有する、または
ｄ．細胞試料中もしくは体液試料中、少なくとも10％超のｃＧＡＭＰの濃度もしくは量を有する
前記細胞試料または体液試料を有する患者に、転移化学療法剤を投与することを含む、方法。
[本発明1018]
ａ．細胞試料の後期細胞中で染色体の15～20％が誤分離を呈している、
ｂ．細胞試料中の細胞の5～8％が小核を呈している、
ｃ．サイトゾル内の染色強度が、正常な非がん組織と比較して1倍～2倍増加している、または
ｄ．体液試料中のｃＧＡＭＰの濃度もしくは量が、非がん性体液試料よりも1倍～2倍大きい
患者に、転移化学療法剤を投与することを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記患者の細胞内または体液内の染色体誤分離、小核、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ、またはｃＧＡＭＰを定量化するために、前記患者由来の試料を経時的にモニタリングすることをさらに含む、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
前記転移化学療法剤が、1種類以上のキネシン－13タンパク質、1種類以上のＭＣＡＫタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む組成物である、本発明1017、1018、または1019の方法。
[本発明1021]
前記転移化学療法剤が組成物であり、前記組成物が、キネシン－13核酸、または、キネシン－13タンパク質をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを有する発現カセットを含む、本発明1017～1019または1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
（ａ）患者由来の試験試料中の以下の遺伝子：ＰＥＬＩ2、ＢＭＰ2、ＳＨＨ、ＴＮＳ4、ＲＡＢ3Ｂ、ＲＯＢＯ1、ＡＲＨＧＡＰ28、ＣＨＮ2、ＣＳＴ1、Ｆ13Ａ1、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ6Ｄ、Ｃ9ｏｒｆ152、ＮＨＳＬ2、ＧＴＦ2ＩＰ7、ＤＰＹＳＬ3、ＰＣＤＨ7、ＫＨＤＲＢＳ3、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ156、ＣＳＴ4、ＣＤ24、またはＦＧＦ5の発現レベルを定量化して、前記試験試料中の以下の遺伝子：ＰＥＬＩ2、ＢＭＰ2、ＳＨＨ、ＴＮＳ4、ＲＡＢ3Ｂ、ＲＯＢＯ1、ＡＲＨＧＡＰ28、ＣＨＮ2、ＣＳＴ1、Ｆ13Ａ1、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ6Ｄ、Ｃ9ｏｒｆ152、ＮＨＳＬ2、ＧＴＦ2ＩＰ7、ＤＰＹＳＬ3、ＰＣＤＨ7、ＫＨＤＲＢＳ3、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ156、ＣＳＴ4、ＣＤ24、またはＦＧＦ5の各々の定量化した発現レベルを生成すること、および（ｂ）各定量化した発現レベルがこれらの遺伝子の各々についての中央基準発現レベルよりも大きい場合、より長い無転移生存期間を前記患者に通知することを含む、方法。
[本発明1023]
前記遺伝子の各々についての前記中央基準発現レベルが、転移性がんを有する一連の患者由来の試料中のこれらの遺伝子の各々についての中央発現値である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記患者が乳がんを有する、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
ａ．細胞試料の1つ以上の細胞内に少なくとも10％の検出可能な染色体誤分離を有する、
ｂ．細胞試料の1つ以上の細胞内に少なくとも3％の検出可能な小核を有する、
ｃ．細胞試料の1つ以上の細胞内に検出可能なサイトゾル二本鎖ＤＮＡを有する、または
ｄ．細胞試料中もしくは体液試料中、少なくとも10％超のｃＧＡＭＰの濃度もしくは量を有する
前記細胞試料または体液試料を有する患者に投与するための組成物における化学療法剤の使用。
図１Ａ～１Ｍは、ヒト転移において染色体異常が広く認められることを示している。図１Ａは、対応させた原発性腫瘍（Ｐ）および脳転移（Ｍ）の加重ゲノム不安定性インデックス（ｗＧＩＩ）をグラフで示し、ｎ＝６１原発性腫瘍－転移対応対であり、箱は、２５～７５パーセンタイルにまたがり、バーは、１０～９０パーセンタイルにまたがり、有意性は、ウィルコクソン対応対符号付き順位検定を使用して試験した。ＲＣＣ、腎細胞がん。図１Ｂ－１は、転移と対応させた原発性***腫瘍との間のｗＧＩＩの差をグラフで示す。図１Ｂ－２は、転移と対応させた原発性肺腫瘍との間のｗＧＩＩの差をグラフで示す。図１Ｂ－３は、転移と対応させた腎細胞がん原発性腫瘍との間のｗＧＩＩの差をグラフで示す。図１Ｂ－４は、転移と対応させた原発性腫瘍との間のｗＧＩＩの差をグラフで示す。図１Ｃは、Ｍｉｔｅｌｍａｎデータベースに見られる原発性（Ｐ）***腫瘍（ｎ＝６３７）または転移（Ｍ、ｎ＝１３１）中のクローンの数（核型に基づく）をグラフで示す。図１Ｄは、原発性***腫瘍（ｎ＝９８３クローン）または転移（ｎ＝１８６クローン）に見られる１クローンあたりの染色体数のＬｏｇ２をグラフで示す。図１Ｅは、原発性***腫瘍（ｎ＝９８３クローン）または転移（ｎ＝１８６クローン）に見られる１クローンあたりの染色体異常の数をグラフで示す。図１Ｃ～１Ｅ 箱は、２５～７５パーセンタイルにまたがり、バーは、１０～９０パーセンタイルにまたがり、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図１Ｆは、後期を経ているホルマリン固定パラフィン包埋頭頸部扁平上皮がん細胞の画像を示す。矢印は、染色体誤分離の例を指す（スケールバー５μｍ）。図１Ｇは、臨床的に検出可能なリンパ節転移のある患者（Ｎ＋、ｎ＝２２患者）またはない患者（Ｎ－、ｎ＝１８患者）由来の腫瘍における染色体誤分離の証拠を呈する後期細胞のパーセンテージをグラフで示す。箱は、２５～７５パーセンタイルにまたがり、バーは、１０～９０パーセンタイルにまたがり、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図１Ｈは、対応させた原発性腫瘍のｗＧＩＩの関数としての脳転移の加重ゲノム不安定性インデックス（ｗＧＩＩ）をグラフで示す。赤線は、線形回帰を表す。図１Ｉは、原発性および転移性乳がんに由来し、図１Ｄ～１Ｅに描かれた試料中の所与のクローンの染色体の総数の関数として、１クローンあたりの染色体異常の数をグラフで示し、データポイントは、平均±標準偏差を表す。図１Ｊは、染色体誤分離の頻度の関数としてのＮ－またはＮ＋患者のパーセンテージ（ＣＩＮ－低およびＣＩＮ－高についてｎ＝２０患者）をグラフで示し、有意性は、フィッシャー直接検定を使用して試験した。図１Ｋは、様々なキネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の時間の関数としての細胞集密をグラフで示す。データポイントは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝４実験である。図１Ｌは、抗ＧＦＰ抗体、負荷対照として使用されるβ－アクチンを使用して染色された様々なＧＦＰタグ付きキネシン－１３タンパク質を発現する細胞の免疫ブロットを示す。図１Ｍは、微小管（ＤＭ１Ａ）、中心体（ペリセントリン）、およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について染色されたＭＣＡＫおよびｄｎＭＣＡＫを発現する細胞を示す（スケールバー５μｍ）。 図２Ａ～２Ｊは、染色体不安定性（ＣＩＮ）が、転移の駆動因子であることを示す。図２Ａは、抗セントロメアタンパク質（ＡＣＡ）およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について染色された後期細胞を示す（スケールバー５μｍ）。図２Ｂ－１は、対照細胞またはキネシン－１３タンパク質を発現する細胞における染色体誤分離の証拠を呈するＭＤＡ－ＭＢ－２３１後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、バーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝１５０細胞であり、３実験、有意性は、両側ｔ検定を使用して試験した。図２Ｂ－２は、対照細胞またはキネシン－１３タンパク質を発現する細胞における染色体誤分離の証拠を呈する後期Ｈ２０３０細胞のパーセンテージをグラフで示し、バーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝１５０細胞であり、３実験、有意性は、両側ｔ検定を使用して試験した。図２Ｃは、異なるキネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞による心臓内注射の５週間後に画像化された動物全体の光子フラックス（ｐ／ｓ）をグラフで示す。有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して検定し、１群あたりｎ＝７～１４マウスである。独立した４実験。図２Ｄは、異なるキネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞による心臓内注射の５週間後に画像化された動物全体の光量子束（ｐ／ｓ）の画像を示す。図２Ｅは、様々なレベルの染色体不安定性を伴うＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射したマウスの疾患特異的生存率をグラフで示す：ＣＩＮ－高（ｄｎＭＣＡＫ、左端のグラフは経時的な最小生存率を示す）、ＣＩＮ－中（対照、Ｋｉｆ２ａ、またはチューブリン；中央のグラフは経時的な中程度の生存率を示す）、またはＣＩＮ－低（ＭＣＡＫまたはＫｉｆ２ｂ、右端のグラフは経時的な最大生存率を示す）、ｎ＝ＣＩＮ－高のマウス１０匹、ＣＩＮ－中のマウス２３匹、およびＣＩＮ－低のマウス２０匹、対での有意性は、対数順位検定で試験した。図２Ｆ－１は、３０日間***させた親ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞＃２由来の代表的な核型（ＤＡＰＩ６０７バンディング）を示す。図２Ｆ－２は、３０日間***させた親ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞＃４由来の代表的な核型（ＤＡＰＩ６０７バンディング）を示す。図２Ｇは、３０日間***させた単一のＭＣＡＫ発現細胞に由来する細胞の代表的な核型（ＤＡＰＩ６０７バンディング）を示す。図２Ｈは、３０日間***させた単一のＫｉｆ２ａ発現細胞に由来する細胞の代表的な核型（ＤＡＰＩ６０７バンディング）を示す。図２Ｉは、ＣＩＮ－低（ＭＣＡＫ、各染色体の左のバー）またはＣＩＮ－中／高（対照、Ｋｉｆ２ａ、ｄｎＭＣＡＫ、各染色体の右のバー）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中の非クローン性（単一クローンの細胞の２５％未満に存在する）ネオ染色体の数をグラフで示す。「Ｍａｒ」は、従来のバンディングでは明確に同定できない構造的に異常な染色体を示し、バーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝クローン集団７つ由来細胞１４０個であり、有意性は、二元配置分散分析を使用して試験した。図２Ｊは、単一のＫｉｆ２ａ発現細胞に由来する同じクローン集団に属する６つの異なる細胞から採取した染色体の例を示し、２２番染色体と他の異なる染色体とが関与する収束転座を示す。 図３Ａ～３Ｍは、原発性腫瘍および転移における染色体不安定性（ＣＩＮ）の相反する役割を示す。図３Ａは、図３Ｂ～３Ｅに示された試料の収集方法を示す概略図であり、原本では、概略図の細胞の色は、図３Ｂ～３Ｅのバーの色と一致している。図３Ｂ－１は、ＥＲ乳がんサブタイプに属する転移適格患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から生じる後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、原発性腫瘍由来および肝転移由来の第１継代細胞における染色体誤分離の証拠を示す。図３Ｂ－２は、ＴＮＢＣ乳がんサブタイプに属する転移適格患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から生じる後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、原発性腫瘍由来および肝転移由来の第１継代細胞における染色体誤分離の証拠を示す。図３Ｃは、ＣＩＮ－低細胞から生じる後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、注射された細胞、原発性腫瘍に由来する、同じ動物の原発性腫瘍から生じる自然転移に由来する、および直接心臓内移植から得られた転移に由来する第１継代細胞における染色体誤分離の証拠を示す。図３Ｄは、ＣＩＮ培地（Ｋｉｆ２ａ）細胞から生じる後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、注射された細胞、原発性腫瘍に由来する、同じ動物の原発性腫瘍から生じる自然転移に由来する、および直接心臓内移植から得られた転移に由来する第１継代細胞における染色体誤分離の証拠を示す。図３Ｅは、ＣＩＮ－高（ｄｎＭＣＡＫ）細胞から生じる後期細胞のパーセンテージをグラフで示し、注射された細胞、原発性腫瘍に由来する、同じ動物の原発性腫瘍から生じる自然転移に由来する、および直接心臓内移植から得られた転移に由来する第１継代細胞における染色体誤分離の証拠を示す。図２Ｂ～２Ｅについて、バーは、平均±標準偏差を表し、ｎ＝１５０細胞であり、３回の独立した実験であり、＊ｐ＜０．０５であり、注射された株よりも高い誤分離率を有する試料を示し、＃ｐ＜０．０５であり、注射された株よりも低い誤分離率を有する試料を示し、＊＊ｐ＜０．０５であり、同じ動物からの転移と対応させた原発性腫瘍との間の有意差を示す、両側ｔ検定。ＳＴ ｍｅｔ、軟組織転移。図３Ｆは、ＣＩＮ－低（ＭＣＡＫおよびＫｉｆ２ｂ）とＣＩＮ－中／高（対照、Ｋｉｆ２ａ、およびｄｎＭＣＡＫ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞との間で差次的に発現される遺伝子の変化を示すボルケーノプロットを示す。右上の領域のデータポイント（２．６超のＬｏｇ２）は、その後に染色体不安定性（ＣＩＮ）シグネチャーを判定するために使用される遺伝子に対応する。図３Ｇは、ＴＡＶＡＺＯＩＥ転移（ＴＡＶＡＺＯＩＥ＿ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ）遺伝子セットの濃縮プロットである。図３Ｈは、患者のメタ分析においてＣＩＮシグネチャー遺伝子の高い（ＣＩＮ－高、下のグラフ線）または低い（ＣＩＮ－低、上のグラフ線）発現を有する患者の遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）のプロットを示す。図３Ｉは、１７１患者の検証コホートにおいてＣＩＮシグネチャー遺伝子の高い（ＣＩＮ－高、下のグラフ線）または低い（ＣＩＮ－低、上のグラフ線）発現を有する患者の遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）のプロットを示す。実施例１に記されるように、ＣＩＮシグネチャー遺伝子としては、ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、ＮＴＮ４が挙げられる。図３Ｊ～３Ｍは、染色体不安定性が転移の形成および維持を促進することを示す。図３Ｊ－１は、キネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射した動物全体の経時的な正規化光子量束プロットをグラフで示す。バーは、平均±標準誤差を表し、ｎ＝７～１４マウス／群である。図３Ｊ－２は、疾患負荷が生物発光を使用して追跡されたｄｎＭＣＡＫを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射したマウスの画像を示す。図３Ｊ－３は、Ｋｉｆ２ｂを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射したマウスの画像を示し、疾患負荷は、ＢＬＩを使用して追跡した。図３Ｋは、対照またはＭＣＡＫ発現Ｈ２０３０細胞を心臓内注射してから５週間後に画像化された動物全体の光子量束（ｐ／ｓ）を示す。有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。ＭＣＡＫ群ではｎ＝１０マウス、対照群では５マウスである。図３Ｌは、腫瘍切除の前（３３日目）および後（９０日目）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を同所移植したマウスの代表的なＢＬＩ画像を示す。９０日目にｄｎＭＣＡＫ発現細胞を移植したマウスにおいて、転移を検出することができる。図３Ｍは、様々なレベルの染色体不安定性を有するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を同所移植したマウスの遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）を示す。示されるように、ＣＩＮ－低細胞を受容した動物はすべて生存し（上のグラフ線）、一方でＣＩＮ－中細胞を受容した動物のほとんどが生存したが（中央のグラフ線）、ＣＩＮ－高細胞を受容した動物のほとんどが生存しなかった（下のグラフ線）。ｎ＝５～９マウス／群、対での優位性は、対数順位検定で試験した。 図４Ａ～４Ｈは、染色体不安定性が間葉系細胞形質をエンリッチ（ｅｎｒｉｃｈ）することを示す。図４Ａは、６，８２１個の細胞（列）の遺伝子発現ヒートマップ、および上皮間葉転換（ＥＭＴ、行）に関与する遺伝子を示す。黒い矩形は、間葉形質をエンリッチさせた遺伝子細胞クラスターを示す。図４Ｂは、教師なしＫ最近傍グラフ理論を使用して同定された１２個の亜集団とともに、６，８２１個のＭＣＡＫ、Ｋｉｆ２ｂ、およびｄｎＭＣＡＫ発現細胞のｔ－確率近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）投影を示す。ヒートマップは、各亜集団の差次的に発現された遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント解析から推定されるＦＤＲｑ＜０．０５の遺伝子セットの正規化したエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を示す。図４Ｃは、β－アクチン、ビメンチン、およびＤＮＡについて染色されたＭＣＡＫまたはｄｎＭＣＡＫを発現する細胞の代表的な画像を示す（スケールバー５０μｍ）。図４Ｄは、培養１８時間以内にコラーゲン膜を通って侵入した細胞の代表的な画像を示す。図４Ｅは、培養１８時間以内にコラーゲン膜を通って侵入した細胞の数をグラフで示す（図４Ｄを参照）。バーは、平均±標準誤差を表し、＊ｐ＜０．０５である。＊＊ｐ＜０．０１、両側マン・ホイットニー検定、ｎ＝１０高倍率視野、独立した２実験。図４Ｆは、バルクＲＮＡ発現データに基づいて異なるキネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の主成分分析（ＰＣＡ）プロットを示す。図４Ｇは、ＣＩＮ－低細胞（ＭＣＡＫおよびＫｉｆ２ｂ）と比較したＣＩＮ－中／高（対照、Ｋｉｆ２ａおよびｄｎＭＣＡＫ）において高度にエンリッチされたホールマーク（ＨＡＬＬＭＡＲＫ）遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）の結果を示す。図４Ｈは、正規化したエンリッチメントスコア対偽発見率（ＦＤＲ）のプロットを示す。 図５Ａ～５Ｉは、染色体不安定性細胞のサイトゾルＤＮＡからの細胞固有の炎症を示す。図５Ａは、発現モジュールおよびモジュール２と最も有意に相関したホールマーク遺伝子セットを示す遺伝子間相関ヒートマップを示す。ＮＥＳ、正規化したエンリッチメントスコア。図５Ｂは、キネシン－１３発現状態または重要な遺伝子シグネチャーの発現レベルのいずれかで標識された６，８２１個のＭＣＡＫ、Ｋｉｆ２ｂ、およびｄｎＭＣＡＫ発現細胞のｔＳＮＥ投影（上）を示す。重要な遺伝子シグネチャー間の単一細胞相関プロットを以下に示す。図５Ｃ－１は、ＡＣＡおよびＤＡＰＩで染色した細胞中の原核付近の小核の代表的な画像を示す（スケールバー５μｍ）。図５Ｃ－２は、様々なキネシン－１３タンパク質を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の小核のパーセンテージをグラフで示す。図５Ｃ－３は、様々なキネシン－１３タンパク質を発現するＨ２０３０細胞の小核のパーセンテージをグラフで示す。図５Ｃ－２および５Ｃ－３における箱は、中央値および四分位間範囲にまたがり、バーは、５～９５パーセンタイルにまたがり、ｎ＝６３８～１１２７細胞、１０高倍率視野、独立した３実験、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図５Ｄは、図３Ｃ～３Ｅで以前に描かれた原発性腫瘍および転移に由来する細胞における小核のパーセンテージをグラフで示す。バーは、中央値および四分位範囲を表し、ｎ＝１０原発性腫瘍および２８転移、５００～１５００細胞／試料、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図５Ｅは、すべての注射された細胞株ならびに原発性腫瘍および転移に由来する細胞における、染色体誤分離の証拠を呈する細胞のパーセンテージと、小核のパーセンテージとの間の相関をグラフで示す。図５Ｆは、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ抗体を使用）、または一本鎖ＤＮＡ（抗ｓｓＤＮＡ抗体を使用）について染色されたＭＣＡＫおよびｄｎＭＣＡＫ発現細胞を示す（スケールバー２０μｍ）。図５Ｇは、ＣＩＮ－中／高およびＣＩＮ－低ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＨ２０３０細胞における正規化したサイトゾル対核ＤＮＡ比をグラフで示す。バーは、平均±標準偏差を表し、有意差は両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図５Ｈは、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）、サイトゾルＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはＤｎアーゼ２（ＲＦＰレポーター）について染色された細胞を示し（スケールバー１０μｍ）、矢印は、Ｄｎアーゼ２発現細胞を示す。図５Ｉは、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）、サイトゾルＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはｍＣｈｅｒｒｙ－ラミンＢ２について染色された細胞を示し（スケールバー１０μｍ）、矢印は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ラミンＢ２発現細胞を示す。 図６Ａ～６Ｊは、サイトゾルＤＮＡへの細胞反応からの転移を示す。図６Ａは、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ）、サイトゾルＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、または抗ｃＧＡＳ抗体を使用して染色された細胞を示す（スケールバー５μｍ）。図６Ｂは、キネシン－１３タンパク質（またはラミンＢ２およびｄｎＭＣＡＫ）を発現する細胞にｃＧＡＳ局在化がある（ｃＧＡＳ＋）またはない（ｃＧＡＳ－）小核のパーセンテージをグラフで示し、ｎ＝４００細胞、４実験、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図６Ｃは、異なるキネシン－１３タンパク質またはＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡ（ｄｎＭＣＡＫ）、負荷対照として使用されるβ－アクチンを発現する細胞由来の溶解物の免疫ブロットを示す。図６Ｄは、ＣＩＮ－中／高細胞（対照、Ｋｉｆ２ａ、およびｄｎＭＣＡＫ）、ＣＩＮ－低細胞（Ｋｉｆ２ｂおよびＭＣＡＫ）またはＳＴＩＮＧ枯渇ｄｎＭＣＡＫ発現細胞（ＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡ）由来のリン酸化ｐ１００対総ｐ１００（上）およびｐ５２対ｐ１００（下）タンパク質レベルの正規化した比率を示す。バーは、平均±標準誤差を表し、＊ｐ＜０．０５であり、＊＊ｐ＜０．０１であり、両側マン・ホイットニー検定であり、ｎ＝４回の生物学的反復である。図６Ｅは、ＭＣＡＫ、ｄｎＭＣＡＫ発現細胞、ならびにＲｅｌＢおよびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について染色された対照またはＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡを発現する細胞を示し、矢印は、ＲｅｌＢ陽性核を指す（スケールバー２０μｍ）。図６Ｆは、低い（＜３０パーセンタイル）または高い（＞３０パーセンタイル）染色体不安定性遺伝子発現シグネチャーを有する乳がん患者におけるＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的遺伝子の平均ｚ－正規化した発現をグラフで示し、箱は、四分位間範囲にまたがり、バーは、１０～９０パーセンタイルにまたがり、有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。図６Ｇ－１は、対照ｓｈＲＮＡまたはＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡを発現する細胞を心臓内注射してから５週間後に画像化された動物全体の光子量束（ｐ／ｓ）をグラフで示す。有意性は、両側マン・ホイットニー検定を使用して試験した。対照群ではｎ＝９マウス、ＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡ群では１６マウス。図６Ｇ－２は、対照ｓｈＲＮＡまたはＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡを発現する細胞を心臓内注射してから５週間後に画像化された動物全体を示す。図６Ｈは、培養２４時間以内にコラーゲン膜を通って侵入した、ＤＮＡセンシングまたは非標準ＮＦ－κＢ経路におけるｓｈＲＮＡ標的遺伝子を発現する細胞の数をグラフで示す。バーは、平均±標準誤差を表し、＊＊ｐ＜０．０００１であり、両側マン・ホイットニー検定であり、ｎ＝１０の高倍率視野であり、２実験である。図６Ｉ～６Ｊは、単一細胞シーケンシングおよび集団検出を示す。図６Ｉは、図４Ｂに提示されたすべての亜集団の細胞組成を示す。図６Ｊは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）および染色体不安定性遺伝子（亜集団「Ｍ」）が豊富な細胞の亜集団における重要な転移および浸潤遺伝子の発現を、残りの亜集団と比較して示すバイオリンプロットを示し、亜集団は、教師なしＫ最近傍グラフ理論を使用して同定された。 図７Ａ～７Ｆは、染色体不安定性がウイルス様免疫反応を促進し、それが転移を促進すると同時に大量の免疫浸潤物を動員することを示す。図７Ａは、染色体不安定性がウイルス様免疫反応を促進し、それが大量の免疫浸潤物を促進することを示す。図７Ｂは、染色体不安定性（ＣＩＮ）がサイトゾルＤＮＡに対する腫瘍細胞固有の炎症反応を介した転移および腫瘍免疫浸潤に関連していることを示す概略図である。図７Ｃ－１は、創傷形成後３６時間の創傷領域の細胞の代表的な位相差画像を示す。図７Ｃ－２は、異なるキネシン－１３タンパク質を発現する細胞の幅に対する長さの比をグラフで示す。図７Ｃ－１および７Ｃ－２の場合、バーは、四分位範囲にまたがり、ｎ＝１００細胞、２実験、＊＊ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニー検定である。図７Ｄ－１は、β－カテニンまたはＤＮＡ（ＤＡＰＩ）で染色されたＭＣＡＫ（ＣＩＮ－低）を発現する代表的な細胞を示す（スケールバー３０μｍ）。図７Ｄ－２は、β－カテニンまたはＤＮＡ（ＤＡＰＩ）で染色されたｄｎＭＣＡＫ（ＣＩＮ－高）を発現する代表的な細胞を示す（スケールバー３０μｍ）。図７Ｅ－１は、キネシン－１３タンパク質を発現する細胞の創傷治癒アッセイの位相差画像を示す（スケールバー８００μｍ）。図７Ｅ－２は、創傷形成後２４時間および４５時間の創傷領域（０時間の時点に正規化）をグラフで示す。＊ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。図７Ｆ－１は、培養１８時間以内に８μｍの孔を含むポリカーボネート膜を通って侵入した細胞の画像を示す。図７Ｆ－２は、膜の底部から掻き取られた細胞の正規化された光学密度（Ｏ．Ｄ．）をグラフで示し、バーは、平均±標準誤差を表し、＊ｐ＜０．０５であり、両側ｔ検定であり、ｎ＝３の実験である。 図８Ａ～８Ｃは、染色体不安定性が、小核およびサイトゾルのｄｓＤＮＡを生成することを示す。図８Ａは、図３Ｃに描かれたＣＩＮ－低試料中の小核のパーセンテージをグラフで示す。図８Ｂは、図３Ｄに描かれたＣＩＮ－低試料中の小核のパーセンテージをグラフで示す。図８Ｃは、図３Ｅに描かれたＣＩＮ－低試料中の小核のパーセンテージをグラフで示す。図８Ａ～８Ｃについて、注射された細胞、原発性腫瘍に由来する、または転移（原発性腫瘍から生じるいくつかの自然転移、直接心臓内移植から得られるいくつかの転移）に由来する第１継代細胞。バーは、平均±標準誤差を表し、ｎ＝５００～１５００細胞／試料を含む１０高倍率視野、３実験、＊ｐ＜０．０５であり、注射された株よりも高い誤分離率を有する試料を示す。＃ｐ＜０．０５であり、注射された株よりも低い誤分離率を有する試料を示す。＊＊ｐ＜０．０５であり、同じ動物からの転移と対応させた原発性腫瘍との間の有意差を示す、両側ｔ検定である。 図９Ａ～９Ｍは、予後に対するサイトゾルＤＮＡセンシング経路の影響を示す。図９Ａは、対照ｓｈＲＮＡまたはＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡのいずれかを共発現するｄｎＭＣＡＫ発現細胞を注射したマウスの疾患特異的生存率をグラフで示す。対照群ではｎ＝９マウス、およびＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡ群では１６マウス。有意性は、対数順位検定で試験した。示されているように、ＳＴＩＮＧ ｓｈＲＮＡの発現によるＳＴＩＮＧ発現の低減は、ｄｎＭＣＡＫ発現細胞の生存率を増加させる。図９Ｂは、非標準ＮＦ－κＢの高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する乳がん患者の経時的な遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）をグラフで示す（ＮＦＫＢ２、ＲｅｌＢ、ＭＡＰ３Ｋ１４は、ＮＦ－κＢを正に調節し、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３は、ＮＦ－κＢを負に調節する）。示されているように、非標準ＮＦ－κＢのそのような調節因子のより低いレベルの発現は、生存率を向上させる。図９Ｃは、高レベルおよび低レベルのＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的を発現する乳がん患者の経時的な遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）をグラフで示す（ＰＰＡＲＧ、ＤＤＩＴ３、ＮＵＰＲ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＩＧＦＢＰ４、ＬＲＲＣ８Ｃ、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＭＡＦＫ、ＮＲＧ１、Ｆ２Ｒ、ＫＲＴ１９、ＣＴＧＦ、ＺＦＣ３Ｈ１は、ＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的を正に調節し、ＭＡＣＲＯＤ１、ＧＳＴＡ４、ＳＣＮ９Ａ、ＢＤＮＦ、ＬＡＣＴＢは負に調節する）。示されているように、そのようなＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的の下方調節は、生存率を向上させる。図９Ｄは、標準ＮＦ－κＢ（のレギュレーターの高レベルおよび低レベル（ＮＦＫＢ１、ＲｅｌＡ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６）を発現する乳がん患者の経時的な遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）をグラフで示す。示されているように、標準ＮＦ－κＢのそのような調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。図９Ｅは、インターフェロンシグナル伝達の高レベルおよび低レベルの調節因子（ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＴＢＫ１）を発現する乳がん患者の経時的な遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）をグラフで示す。示されているように、インターフェロンシグナル伝達のそのような調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。図９Ｆは、非標準ＮＦ－κＢの高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する乳がん患者の経時的な無再発生存率（ＲＦＳ）をグラフで示す。示されているように、非標準ＮＦ－κＢの調節因子のより低いレベルの発現は、生存率を向上させる。図９Ｇは、高レベルおよび低レベルのＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的を発現する乳がん患者の経時的な無再発生存率（ＲＦＳ）をグラフで示す。示されるように、わずかに高いレベルのＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的の発現は、生存率を幾分向上させる。図９Ｈは、標準ＮＦ－κＢの高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する乳がん患者の経時的な無再発生存率（ＲＦＳ）をグラフで示す。示されているように、標準ＮＦ－κＢの調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。図９Ｉは、インターフェロンシグナル伝達の高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する乳がん患者の経時的な無再発生存率（ＲＦＳ）をグラフで示す。示されているように、インターフェロンシグナル伝達の調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。図９Ｊは、非標準ＮＦ－κＢの高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する肺がん患者の経時的な無増悪生存率（ＰＦＳ）をグラフで示す。示されているように、非標準ＮＦ－κＢの調節因子の発現の低減は、生存率を向上させる。図９Ｋは、高レベルおよび低レベルのＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的を発現する肺がん患者の経時的な無増悪生存率（ＰＦＳ）をグラフで示す。示されているように、ＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－κＢ標的の発現の低減は、生存率を向上させる。図９Ｌは、標準ＮＦ－κＢの高レベルおよび低レベルの調節因子を発現する肺がん患者の経時的な無増悪生存率（ＰＦＳ）をグラフで示す。示されているように、標準ＮＦ－κＢの調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。図９Ｍは、高レベルおよび低レベルのインターフェロンシグナル伝達調節因子を発現する肺がん患者の経時的な無増悪生存期間（ＰＦＳ）をグラフで示す。示されているように、インターフェロンシグナル伝達の調節因子の発現の増加は、生存率を向上させる。 図１０Ａ～１０Ｂは、ｃＧＡＭＰの定量化を示す。図１０Ａは、ＬＣ－ＭＳにより検出され得るｃＧＡＭＰ遷移を示す。図１０Ｂは、標的ＬＣ－ＭＳメタボロミクスを使用した染色体不安定性尿トリプルネガティブ乳がん細胞（４Ｔ１）におけるｃＧＡＭＰの定量化をグラフで示す。示されているように、４Ｔ１細胞におけるｃＧＡＳのノックダウンは、ｃＧＡＭＰの存在量を低減する。
詳細な説明
本明細書に示されるように、ヒト転移は、それらの原発性腫瘍対応物と比較して、著しく染色体不安定性である。より具体的には、転移を開始する腫瘍細胞亜集団が染色体分離エラーの増加によってエンリッチするため、進行中の染色体分離エラー、ならびに小核またはサイトゾルＤＮＡの存在によって転移が予測される。逆に、染色体不安定性の低減は、非常に異数性であるが安定した細胞中でも、転移性の発生の永続的な抑制をもたらす。本明細書に記載される方法および組成物は、そのような染色体不安定性および転移性がんの検出、モニタリング、および治療に有用である。
がんの検出およびモニタリング
本明細書に示されるように、染色体不安定性は、対象ががんを有することを示すマーカーであり、染色体不安定性は、転移性がんを予測、検出、およびモニタリングするために特に有用である。ヒト固形腫瘍の大部分（６０～８０％）は、染色体不安定性を含む。したがって、がん、特に転移性がんを診断するための方法が、本明細書に記載されている。そのような方法は、転移性がんを含むがんを予測、検出、モニタリング、および治療することにおいて驚くほど効果的である。本明細書に記載される治療方法は、転移性がんを予測、検出、およびモニタリングするための方法と組み合わせることができる。
例えば、がん（転移性がんを含む）を予測、検出、およびモニタリングするための１つの方法は、対象から試料を得ること、ならびに試料内の細胞が染色体不安定性を呈するかどうかを検出および／または定量化することを含み得る。この方法はまた、対象の試料中で染色体不安定性が検出された場合に対象を治療することを含むことができる。
例えば、１つの方法は、検出可能なレベルの染色体不安定性を有する細胞または組織を有する対象の治療を開始または治療を変更することを含み、治療は、転移性がんの発生または進行を低減することができる作用物質の投与を含む。
本明細書で使用される場合、「試験試料を得ること」は、患者から組織または体液の試料を取り出すこと、患者から組織または体液の試料を受け取ること、医師から患者の組織または体液試料を受け取ること、患者の組織または体液試料を郵送で受け取ること、および／あるいは患者の組織または体液試料を保管装置（例えば、冷蔵庫もしくは冷凍庫）または施設から取り出すことを伴う。したがって、試験試料を得ることは、患者から試験試料を直接取り除くまたは受け取ることを伴い得るが、試験試料を得ることはまた、試験試料を医療従事者から、保管装置／施設から、医療施設からの輸送後の郵便配達サービスから、およびそれらの任意の組み合わせで間接的に受け取ることも含まれ得る。したがって、試験試料は、１つの場所から発送され、それが受け取られ、試験される別の場所に転送され得る。これらのアクティビティのうちのいずれか、またはアクティビティの組み合わせは、「試験試料を得ること」を伴う。試験試料は、体液試料または組織試料であり得る。例えば、試験試料は、がん細胞を含む疑いのある細胞試料であり得る。試料は、１つ以上の原発性腫瘍由来の細胞および／もしくは組織、原発性腫瘍から得られた腫瘍細胞、循環物（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）から精製された腫瘍細胞、転移性細胞試料、または転移性腫瘍から得られた細胞を含み得る。例えば、染色体不安定性の増加は、より攻撃的な疾患のマーカーであるため、試料には、確立された転移からの細胞を含めることができる。例えば、試料は、***組織または肺組織の（または、本明細書で言及される組織タイプのうちのいずれかの）組織生検であり得る。別の例では、いくつかのがんマーカー（例えば、ｃＧＡＭＰレベル）を検出して、がん（特に転移性がん）を予測、検出、またはモニタリングする場合、試料は、血液、血清、血漿、尿、腹水、リンパ液などの体液、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書で使用される場合、試料内の細胞が染色体不安定性を呈するかどうかを検出および／または定量化することは、試料の細胞中の小核、染色体誤分離、またはサイトゾル染色体ＤＮＡを検出および／または定量化することが含まれ得る。小核、染色体誤分離、サイトゾルＤＮＡ、またはそれらの組み合わせを検出および／または定量化することは、例えば、顕微鏡で細胞染色体を検査し、小核、染色体誤分離、サイトゾルＤＮＡ、またはそれらの組み合わせの数をカウントすることによって行うことができる。
場合によっては、細胞試料を固定および／または溶解することができる。後期細胞を分析用に選択することができる。場合によっては、染色体をプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で処理して、例えば、視覚化を向上させることができる。場合によっては、染色体を、染色体またはＤＮＡの可視化を促進する色素または標識抗体で染色することができる。使用できる色素の例としては、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色、キナクリン染色、ギムザ染色、および他の染色体染色またはＤＮＡ染色が挙げられる。
がん、特に転移性がんは、例えば、染色体の少なくとも１０％、または少なくとも１１％、または少なくとも１２％、または少なくとも１３％、または少なくとも１４％、または少なくとも１５％が誤分離を呈する場合に予測、検出され得るか、または進行している可能性がある。場合によっては、がん、特に転移性がんは、染色体の約１５～２０％が誤分離を呈する場合に予測、検出され得るか、または進行している可能性がある。
小核は、染色体誤分離よりも簡単に同定され得る。がん、特に転移性がんは、例えば、細胞の少なくとも３％、少なくとも４％、または少なくとも５％が小核を呈する場合に予測、検出され得るか、または進行している可能性がある。場合によっては、がん、特に転移性がんは、細胞の約５％～８％が小核を呈する場合に予測、検出され得るか、または進行している可能性がある。
場合によっては、任意の量のサイトゾルＤＮＡによってがんであることが示される。サイトゾルＤＮＡは、サイトゾル内（核内ではなく）のＤＮＡ（染色）によって検出され得る。サイトゾルＤＮＡを検出するには、任意の便利なＤＮＡ染色を使用することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡの染色を、サイトゾルＤＮＡを検出および定量化するために使用することができる。がん、特に転移性がんは、例えば、正常な非がん組織と比較してサイトゾル内の染色強度の１倍～２倍の増加が観察される場合、予測されてもよいか、検出されてもよいか、または進行していてもよい。比較に使用される正常な非がん組織は、同じ患者由来であってもよいか、または正常組織試料から得られた基準組織であってもよい。
環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）を検出および定量化するためのアッセイは、本明細書に記載されており、転移性がんを含むがん患者の同定に使用することができる。例えば、試料中の総ｃＧＡＭＰ濃度は、同じ患者から採取した基準正常組織または隣接する正常組織と比較した試料中のｃＧＡＭＰレベルを比較することにより、転移のマーカーとして使用することができる。ｃＧＡＭＰの１０％、または２０％、または３０％、または５０％、または７０％、または８０％、または９０％の増加は、転移性がんを含むがんを有する患者または発症するであろう患者を同定することができる。場合によっては、ｃＧＡＭＰが通常より１倍～２倍増加すると、転移性がんを含むがんを有する患者または発症するであろう患者を同定することができる。治療前および治療直後の試料のｃＧＡＭＰ濃度の増加は、腫瘍反応のマーカーである。ｃＧＡＭＰレベルの追加の１倍～２倍の変化の増加は、腫瘍反応を示す。
本明細書では、ｃＧＡＭＰをＣＩＮにより駆動されるがんおよび転移性疾患の新規代謝物バイオマーカーとして使用する、患者の転移性疾患を診断するための方法を記載する。ｃＧＡＭＰの測定は、転移性疾患を有する患者を正確かつ具体的に同定するための臨床モダリティとして機能し得る。患者試料（腫瘍、非がん組織、血液、血清、尿、および血漿）のｃＧＡＭＰの測定、およびその中のｃＧＡＭＰの相対的な有無はまた、臨床医ががんの攻撃性の推定診断、ならびに負の診断（例えば、正常または疾患の欠如）と相関し得るという情報を提供する場合がある。
加えて、経時的なｃＧＡＭＰのレベルの決定およびｃＧＡＭＰプロファイルの確立に基づいて、治療に対する患者の反応をモニタリングするための方法が、本明細書に記載されている。そのような方法は、対象においてｃＧＡＭＰプロファイルを生成し、対象から試料を得ること、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を使用してｃＧＡＭＰのレベルを測定すること、ならびに比較に基づいて、対象が転移性疾患を有するかどうかを示すプロファイルを生成することを含み得る。基準プロファイルは、転移性疾患を有しない健常対照対象の集団、限局性がん性疾患を有する対象の集団、および転移性疾患を有する対象の集団から得ることができる。
試料中で測定されたｃＧＡＭＰの濃度または量は、正常組織（必ずしも同じ患者由来ではない）の正常な基準値と、または入手可能な場合は隣接する正常組織中のｃＧＡＭＰレベルと比較することができる。例えば、診断または乳がんの後に***切除術を受けた患者の場合、正常な乳がんの試料（がんに関与していない）中のｃＧＡＭＰレベルの測定値を、基準値または対照値として使用することができる。あるいは、正常組織が入手できない患者の場合、例えば、非がん性***由来の基準保存正常組織を基準または対照として使用することができる。
プロファイルが確立されると、ｃＧＡＭＰレベルを基準ポイントとして使用して、未知の試料と詳細情報が求められている試料を比較および特性評価することができる。例えば、対照（例えば、上述の人口プロファイルから判定された、より早い時点または平均ｃＧＡＭＰレベルで対象から採取された試料）に対して減少したｃＧＡＭＰのレベル（少なくとも１０％以上、またはベースラインに対して１/１を上回るか、１/２を上回るか、もしくはそれ以上の減少）は、良好な治療転帰を示し得る。しかしながら、ｃＧＡＭＰのレベルの増加（少なくとも１０％以上、または１倍超の増加）は、転移性疾患の存在または可能性および不良な治療転帰を示し得る。
転移性疾患の判定は、基準対照レベルまたは個別の縦断的時点と比較したｃＧＡＭＰの測定レベルに基づいている。対照レベルは、転移性疾患を有しない対照対象、または治療の前後の対照対象におけるｃＧＡＭのレベルであることを示す。
前述の両方の実施形態では、バイオマーカーとしてのｃＧＡＭＰのレベルを測定することは、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用することを含み得る。
簡単に言えば、試料は、尿、血液、血漿、血清、および脳脊髄液から収集される。ある特定の実施形態では、試料はまた、腫瘍細胞または腫瘍に隣接する正常組織細胞も含む。収集されると、試料は、本明細書に記載されているように処理される。本発明の実施形態で使用するための非限定的な例示的処理ステップとしては、有機酸の抽出、カラム精製（例えば、アニオン交換精製）、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、およびアルコール処理（例えば、メタノールまたはエタノール）が挙げられる。
例えば、細胞試料由来の細胞を洗浄し、次いで液体窒素上で凍結させて、細胞の代謝状態を保つことができる。次いで、細胞を冷メタノール（－８０℃）中に収集する／掻き入れることができる。次いで、メタノール代謝物抽出物を、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ １７（６）：８２０－８２８（２０１５））に記載されているＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により精製することができる。流出液を乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏ中の７０％アセトニトリルで再構成することができる。再構成された流出液は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により分析することができる。
場合によっては、ｃＧＡＭＰの濃度または量について血清または培地を評価することができる。培養培地中の分泌ｃＧＡＭＰを検出／定量化するために、馴化培地のアリコートを収集し、８０：２０でメタノールと混合し、４℃で２０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離することができる。得られた上清を収集し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの前に－８０℃で保存してｃＧＡＭＰレベルを評価判定することができる。
全細胞に関連する代謝物を測定するために、培地を吸引し、細胞を、例えば非集密的な密度で採取することができる。
様々な異なる液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離方法を使用することができる。
各方法は、ネガティブエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、－３．０ｋＶ）により、注入された代謝物標準溶液で最適化されたＭＳパラメータを用いて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで動作するトリプル四極子質量分析計に連結することができる。
進行中の乳がん転移および／または乳がん転移を経る、もしくは生き残るであろう患者を同定する方法もまた、本明細書に記載されている。試験試料中の以下の遺伝子のうちの１つ以上の発現の減少は、進行中の乳がん転移および／または乳がん転移を経るであろう患者を同定することができる：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、またはＮＴＮ。
本明細書に記載されるように、これらの遺伝子ＰＲＥＤＩＣＴＳの発現の上昇は、乳がんにおける遠隔無転移生存率を増加させた。以下の遺伝子の発現の上昇は、染色体不安定性（ＣＩＮ）シグネチャーと称される：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、およびＮＴＮ４。したがって、無転移生存を有し得る患者を同定する方法もまた、本明細書に記載され、この方法は、患者試料中のＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５遺伝子のうちの１つ以上の発現を定量化して、患者のこれらの遺伝子のうちの１つ以上について測定した定量化された発現レベルを得ることを含む。場合によっては、この方法は、他の遺伝子ではなく、これらの遺伝子の発現レベルを測定することを伴い得る。
ＫＭ－Ｐｌｏｔｔｅｒデータベース（ｗｗｗ．ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍのウェブサイトを参照）に登録されたマイクロアレイ遺伝子発現データセットを、本明細書に記載の通り評価した。以下のマイクロアレイプローブを、各遺伝子に使用した（いくつかの遺伝子には複数の名前があり、別名は下記に列挙され得ることに留意されたい）：２１９１３２＿ａｔ（ＰＥＬＩ２）、２０５２８９＿ａｔ（ＢＭＰ２）、２０７５８６＿ａｔ（ＳＨＨ）、２３０３９８＿ａｔ（ＴＮＳ４）、２２７１２３＿ａｔ（ＲＡＢ３Ｂ）、２１３１９４＿ａｔ（ＲＯＢＯ１）、２２７９１１＿ａｔ（ＡＲＨＧＡＰ２８）、２１３３８５＿ａｔ（ＣＨＮ２）、２０６２２４＿ａｔ（ＣＳＴ１）、２０３３０５＿ａｔ（Ｆ１３Ａ１）、２０８１４６＿ｓ＿ａｔ（ＣＰＶＬ）、２２６４９２＿ａｔ（ＳＥＭＡ６Ｄ）、２０１４３１＿ｓ＿ａｔ（ＤＰＹＳＬ３）、２２８６４０＿ａｔ（ＰＣＤＨ７）、２０９７８１＿ｓ＿ａｔ（ｅｔｏｉｌｅ）、２１０９７２＿ｘ＿ａｔ（ＴＲＡ＠）、２２０１６９＿ａｔ（ＴＭＥＭ１５６）、２０６９９４＿ａｔ（ＣＳＴ４）、２６６＿ｓ＿ａｔ（ＣＤ２４）、２１０３１１＿ａｔ（ＦＧＦ５）、２００９４８＿ａｔ（ＭＬＦ２）。３６パーセンタイルのカットオフ値を使用して、３６パーセンタイルの最下位にある遺伝子を上回って遺伝子を累積発現した患者の無転移生存率が高くなるようにした。
第２のデータセットでは、次世代シーケンシングに由来する公的に登録された遺伝子発現データを使用し、中央発現値をカットオフ値として使用して、生存率が向上した患者を同定した。ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、およびＦＧＦ５の中央発現値より大きい発現値を有する患者は、生存率が向上していた。したがって、これらの遺伝子の各々についての発現レベルは、患者試料中で定量化することができ、これらの定量化された発現レベルは、これらの遺伝子の各々についての中央基準発現レベルと比較することができる。これらの遺伝子の各々についてのそのような中央基準発現レベルは、一連の転移性がんを有する患者の試料におけるこれらの遺伝子の各々についての中央発現値であり得る。
試験される試料は、乳がんを有する患者、例えば、検出可能な転移性乳がんを有しない患者、または重大な転移性乳がんを有しない患者由来であり得る。同様に、進行中の転移性乳がんを有する患者の一連の試料から中央基準発現レベルを得ることができる。
このタイプの分析では、使用する患者集団およびアッセイに応じて、２５パーセンタイル～７５パーセンタイルの範囲のカットオフ値を使用することが一般的である。
１番目と２番目の方法を使用しても同様の結果が得られた。
したがって、本明細書では、生存率が向上した患者を同定する方法について記載する。この方法は、原発性がんタイプ（例えば、原発性乳がん）を有する患者から試料を収集すること、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎシーケンシングの標準プロトコールによるＲＮＡ精製および調製（例えば、ウェブサイトｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｓｈｏｐ／ｓａｍｐｌｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｒｎａ／ｔｏｔａｌ－ｒｎａ／ｒｎｅａｓｙ－ｍｉｎｉ－ｋｉｔ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照）、ＲＴ－ＰＣＲ、ＮｅｘｔＧｅｎシーケンシングまたはマイクロアレイ法を使用して、相対または絶対ＲＮＡ発現レベルを判定すること、２３個の遺伝子の発現値を合計すること、このコホートにおいて、遠隔無転移生存率（ＤＭＦＳ）を予測するための最適なカットオフを判定すること、これを後続の患者の絶対的なカットオフとして使用することを含み得る。場合によっては、正常組織の基準対照（乳がんの場合は***組織、膵臓がんの場合は正常な膵臓等）を最適な較正に使用できることに留意されたい。
そのようにして得られた測定した定量化された発現レベルは、進行中の乳がん転移を有する患者のセットにおける対照、例えば、１つ以上の対応するＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５遺伝子の中央発現レベルまたは平均発現レベルと比較することができる。測定した定量化された発現レベルが対照レベルよりも大きい場合、患者は、無転移生存を有し得る。例えば、測定した定量化された発現レベルが対照レベルよりも大きい場合、無転移生存率が増加したそのような患者は、進行中の乳がん転移を有する患者の対照セットよりも少なくとも５ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１５ヶ月、少なくとも２０ヶ月、少なくとも２５ヶ月、少なくとも５０ヶ月、または少なくとも１００ヶ月長く生存し得る。
場合によっては、発現の減少または増加は、これらの遺伝子のうちの２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、１０個以上、または１１個以上、または１２個以上、または１３個以上、または１４個以上、または１５個以上、または１６個以上、または１７個以上、または１８個以上、または１９個以上、または２０個以上、または２１個以上、または２２個以上のものであり得る。本明細書で使用される場合、これらの遺伝子の発現の減少または増加は、対照と比較した前述の遺伝子の発現の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７５％、または少なくとも１００％の減少または増加であり得る。これらの遺伝子の発現のそのような減少または増加はまた、対照と比較して少なくとも１．２倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍の増加であり得る。そのような対照は、健常組織試料または非がん性組織試料であり得る。他の場合には、対照は、がん性または転移性組織であり得る。
治療方法
驚くべきことに、染色体不安定性によって与えられる前転移（ｐｒｏ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）表現型は、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する腫瘍細胞固有の炎症反応によって引き起こされる。環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）およびその下流エフェクターＳＴＩＮＧによるサイトゾルＤＮＡの感知は、非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化し、腫瘍細胞自律的に浸潤と転移を促進する。染色体不安定性と自然細胞炎症とのこの想定外の関連は、ゲノム的に不安定な腫瘍における治療的介入のための新たな道を提供する。したがって、本明細書に記載される治療方法は、特許によって保護されている試料中の細胞がサイトゾルＤＮＡ、小核、染色体誤分離、またはそれらの組み合わせのレベルの増加を呈するかどうかを同定するための方法を含み得る。本明細書に記載されるように、ｃＧＡＭＰのレベルの増加によって、がん、特に転移性がんであることも示される。サイトゾルＤＮＡ、小核、染色体誤分離、またはそれらの組み合わせのレベルが増加した患者は、その後、本明細書に記載されるように、または様々な他の治療方法によって治療することができる。
例えば、１つの方法は、
ａ．細胞試料の１つ以上の細胞内に少なくとも１０％、もしくは少なくとも１１％、もしくは少なくとも１２％、もしくは少なくとも１３％、もしくは少なくとも１４％、もしくは少なくとも１５％の検出可能な染色体誤分離を有する、
ｂ．細胞試料の１つ以上の細胞内に少なくとも３％、少なくとも４％、もしくは少なくとも５％の検出可能な小核を有する、
ｃ．細胞試料の１つ以上の細胞内に検出可能なサイトゾル二本鎖ＤＮＡを有する、または
ｄ．細胞試料中もしくは体液試料中、少なくとも１０％超、もしくは少なくとも２０％超、もしくは少なくとも３０％超、もしくは少なくとも５０％超、もしくは少なくとも７０％超、もしくは少なくとも８０％超、もしくは少なくとも９０％超のｃＧＡＭＰの濃度もしくは量を有する
細胞試料または体液試料を有する患者に転移化学療法剤を投与し、それによって患者の転移性がんを治療することを含み得る。
様々な化学療法剤を用いることができる。本明細書に記載される方法は、例えば、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、および／またはＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質を投与すること、ならびに任意に、ＡＢＣＣ４および／またはＡＢＣＧ２タンパク質を投与することを含み得る。本明細書に記載される方法は、導入遺伝子またはベクターにおけるＫｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、および／またはＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質の発現、および任意に、導入遺伝子またはベクターにおけるＡＢＣＣ４および／またはＡＢＣＧ２の発現を含み得る。この方法には、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することも含まれ得る。
例えば、細胞内のＫｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、またはＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質の発現および／または活性の増加を伴う方法および組成物が、本明細書に記載されている。そのような方法および組成物は、がんを治療するために有用である。これらの方法および組成物は、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、またはそれらの組み合わせの発現および／または活性の増加を含み得る。そのようなキネシン－１３タンパク質、ＡＢＣＣ４タンパク質、ＡＢＣＧ２タンパク質、またはそれらの組み合わせのアゴニストを使用して、これらのタンパク質の活性を増加させることができる。
本明細書に記載される方法および組成物はまた、哺乳動物細胞中のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することも含み得る。細胞は、インビトロ（例えば、培養中）またはインビボ（例えば、対象動物内）であり得る。
本明細書に記載される組成物および方法は、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、および／またはＫＩＦ１３Ａタンパク質などのキネシン－１３タンパク質の使用を含むことができる。組成物および方法はまた、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、ＫＩＦ１３Ａ、またはそれらの組み合わせなどのキネシン－１３をコードするキネシン－１３核酸の使用を含むことができる。組成物および方法はまた、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせの１種類以上の阻害物質を含み得る。そのような阻害物質の例としては、抗体または阻害性核酸（例えば、担体中または発現ベクターから発現される）が挙げられる。そのような組成物および方法は、転移性がんを含むがんの発生を治療および阻害するために有用である。
本明細書に記載されるように、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、および／またはＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質の活性および／またはレベルの増加、ならびにＡＢＣＣ４および／またはＡＢＣＧ２の活性および／またはレベルの増加は、転移性がんを含むがんの発生率および／または進行を低減することができる。ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現を低減することはまた、転移性がんを含むがんの発生率および／または進行を低減することもできる。
Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、ＫＩＦ１３Ａなどのキネシン－１３タンパク質および核酸、ならびにＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２タンパク質および核酸の配列、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２およびＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、およびＭＳＴ１は、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖの国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データが管理するデータベースから入手可能である。
例えば、１種類のキネシン－１３タンパク質は、Ｋｉｆ２ｂタンパク質であり、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１１５９４８）を有し得る。
Figure 0007197556000001
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＫｉｆ２ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０３２５５９）として以下に示される。
Figure 0007197556000002
Figure 0007197556000003
キネシン－１３タンパク質は、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃタンパク質であり、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＧ５０３０６．１）を有し得る。
Figure 0007197556000004
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヒトＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ２６４１１５．１）として以下に示される。
Figure 0007197556000005
Figure 0007197556000006
別のキネシン－１３タンパク質は、ＫＩＦ１３Ａタンパク質であり、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０７１３９６．４）を有し得る。
Figure 0007197556000007
Figure 0007197556000008
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヒトＫＩＦ１３Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２１１３．５）として以下に示される。
Figure 0007197556000009
Figure 0007197556000010
Figure 0007197556000011
Figure 0007197556000012
Figure 0007197556000013
ヒトＭＣＡＫタンパク質の配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６８３６．２）として以下に示される。
Figure 0007197556000014
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヒトＭＣＡＫタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６８４５．３）として以下に示される。
Figure 0007197556000015
Figure 0007197556000016
Figure 0007197556000017
ヒトＡＢＣＣ４タンパク質の配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ４１５６０．１）として以下に示される。
Figure 0007197556000018
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヒトＡＢＣＣ４タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０４１５６０．１）として以下に示される。
Figure 0007197556000019
Figure 0007197556000020
Figure 0007197556000021
ヒトＡＢＣＧ２タンパク質の配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＧ５２９８２．１）として以下に示される。
Figure 0007197556000022
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヒトＡＢＣＧ２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ０１７１６８．１）として以下に示される。
Figure 0007197556000023
Figure 0007197556000024
キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質および核酸は、配列変異を呈し得る。しかしながら、本明細書に示されるアミノ酸および核酸配列に対して１００％未満の配列同一性を有する変異体は、依然として同様の活性を有し得る。例えば、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する核酸を、本明細書に記載される組成物および方法において依然として使用することができる。
キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質は、染色体不安定性を呈し得る対象、またはがんに罹患している可能性がある、もしくはがんの発症が疑われ得る対象に投与することができる。同様に、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質をコードする発現かセットおよび／または発現ベクターは、染色体不安定性を呈し得る対象、またはがんに罹患している可能性がある、もしくはがんの発症が疑われ得る対象に投与することができる。
さらに、キネシン－１３タンパク質活性を増強するために、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２アゴニストを投与することができる。例えば、Ｋｉｆ２ｃ／ＭＣＡＫに特異的なＵＭＫ５７と称されるキネシン１３アゴニストは、染色体不安定性を呈し得る対象、またはがんに罹患している可能性がある、もしくはがんの発症が疑われる対象に投与することができる。ＵＭＫ５７の構造を以下に示し、ここでＸは、メチル（ＣＨ３）基である。
Figure 0007197556000025
場合によっては、様々な内因性核酸（ｍＲＮＡ）およびタンパク質の発現を阻害することができる。例えば、以下の発現は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することができる。
ヒトＳＴＩＮＧタンパク質配列の一例（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿９３８０２３ＸＰ＿２９１１２７）を以下に示す。
Figure 0007197556000026
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１９８２８２ ＸＭ＿２９１１２７）として以下に示される。
Figure 0007197556000027
Figure 0007197556000028
Figure 0007197556000029
ｃＧＡＳ（環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ）タンパク質は、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６１２４５０）を含み得る。
Figure 0007197556000030
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のヒトｃＧＡＳタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１３８４４１）として以下に示される。
Figure 0007197556000031
Figure 0007197556000032
ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２タンパク質は、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１３０９８６３ ＸＰ＿００５２６９９１７）を含み得る。
Figure 0007197556000033
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のヒトＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３２２９３４ ＸＭ＿００５２６９８６０）として以下に示される。
Figure 0007197556000034
Figure 0007197556000035
ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質は、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６５００）を含み得る。
Figure 0007197556000036
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のヒトＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６５０９）として以下に示される。
Figure 0007197556000037
Figure 0007197556000038
例えば、ＥＮＰＰ１タンパク質は、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６１９９．２）を含み得る。
Figure 0007197556000039
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のヒトＥＮＰＰ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６２０８．２）として以下に示される。
Figure 0007197556000040
Figure 0007197556000041
Figure 0007197556000042
Figure 0007197556000043
Figure 0007197556000044
例えば、ＬＴβＲタンパク質は、以下のヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ３６９４１．１）を含み得る。
Figure 0007197556000045
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヒトＬＴβＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３４２．２）として以下に示される。
Figure 0007197556000046
Figure 0007197556000047
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、およびＭＳＴ１タンパク質および核酸は、配列変異を呈し得る。しかしながら、本明細書に示されるアミノ酸および核酸配列に対して１００％未満の配列同一性を有する変異体は、依然として同様の活性を有し得る。例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～２４のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するＭＳＴ１タンパク質および核酸は、依然として本明細書に記載される組成物および方法で使用され得る。
発現システム
キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質をコードする核酸セグメント、ならびにＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１をコードする核酸、または任意のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１阻害性核酸を含む核酸セグメントを、任意の好適な発現システムに挿入することができるか、またはそれとともに用いることができる。キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質の治療有効量は、そのような発現システムから生成され得る。治療効果のあるＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸もまた、そのような発現システムから生成され得る。
核酸（または阻害性核酸）の組み換え発現は、プラスミドなどのベクターを使用して有用に達成される。ベクターは、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２タンパク質、またはＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、および／もしくはＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１などのタンパク質をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含み得る。別の例では、ベクターは、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、および／またはＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１阻害性核酸をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含み得る。
前記ベクターは、転写および翻訳に必要な他の要素も含み得る。本明細書で使用される場合、ベクターとは、外因性ＤＮＡを含む任意の担体を指す。したがって、ベクターは、外因性核酸を分解することなく細胞に輸送する作用物質であり、送達される細胞内で核酸の発現をもたらすプロモーターを含む。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。キンシン－１３、ＫＩＦ１３Ａ、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２を運搬する、コードする、および／または発現させるのに好適な様々な原核生物および真核生物の発現ベクター。ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、および／またはＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸を運搬する、コードする、および／または発現させるのに好適な様々な原核生物および真核生物の発現ベクターを用いることができる。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、様々なインビボおよびインビトロの状況で使用され得る。
発現カセット、発現ベクター、および前記カセット中または前記ベクター中の配列は、異種であり得る。本明細書で使用される場合、発現カセット、発現ベクター、調節配列、プロモーター、または核酸に関して使用される場合の「異種」という用語は、なんらかの方法で操作された発現カセット、発現ベクター、調節配列、または核酸を指す。例えば、異種プロモーターは、目的の核酸に天然に連結されていないか、細胞形質転換手順により細胞に導入されたプロモーターであり得る。異種核酸またはプロモーターとしてはまた、生物に固有であるが、なんらかの方法で改変された（例えば、異なる染色体上の位置に置かれた、突然変異した、複数の複製物に付加された、非天然プロモーターまたはエンハンサー配列に連結された等）核酸またはプロモーターが挙げられる。異種核酸は、ｃＤＮＡ形態を含む配列を含んでもよい。ｃＤＮＡ配列は、センス（ｍＲＮＡを産生する）またはアンチセンス配向（ｍＲＮＡ転写物に相補的なアンチセンスＲＮＡ転写物を産生する）のいずれかで発現させることができる。異種コード領域は、例えば、異種コード領域が、コード領域に天然に関連していないプロモーターなどの調節エレメントを含むヌクレオチド配列に接合している場合、または異種コード領域が、天然に見られない染色体の部分に関連している場合、内因性コード領域と区別することができる（例えば、コード領域によってコードされたタンパク質が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）。同様に、異種プロモーターは、それらが天然に連結されていないコード領域に連結されているプロモーターであり得る。
用いられ得るウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビス、および他のウイルスに関連するものが挙げられる。また、これらのウイルスの特性を共有し、それらをベクターとしての使用に好適なものにする任意のウイルスファミリーも有用である。用いられ得るレトロウイルスベクターとしては、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ－１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されるものが挙げられる。例えば、そのようなレトロウイルスベクターとしては、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、および望ましい特性を発現する他のレトロウイルスを挙げることができる。通常、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆方向末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計された場合、ウイルスは通常、初期遺伝子のうちの１つ以上が除去され、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルス核酸の代わりにウイルスゲノムに挿入される。
プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、転写終結配列、および他の要素を含む、様々な調節要素を発現カセットおよび／または発現ベクターに含めることができる。「プロモーター」は一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの１つまたは複数の配列である。例えば、プロモーターは、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／またはＡＢＣＧ２タンパク質をコードする核酸セグメントの上流にあり得る。別の例では、プロモーターは、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２および／もしくはＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ならびに／またはＭＳＴ１阻害性核酸セグメントの上流にあり得る。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含み、上流要素および反応要素を含み得る。「エンハンサー」は一般に、転写開始部位から一定の距離では機能せず、転写ユニットの５’または３’のいずれかにあり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内だけでなく、コード配列自体内に存在し得る。通常、それらは１０～３００の長さであり、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。プロモーターのようなエンハンサーはまた、多くの場合、転写の調節を仲介する反応要素を含む。エンハンサーは、多くの場合、発現の調節を判定する。
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与え得る転写終結のための配列も含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写されたユニットがｍＲＮＡのように処理され、輸送される可能性が高まることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物で使用することが好ましい。
キンシン－１３、ＫＩＦ１３Ａ、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２タンパク質の発現、または発現カセットもしくは発現ベクターからのＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、および／もしくはＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１阻害性核酸の発現は、原核細胞または真核細胞中で発現可能な任意のプロモーターによって制御することができる。使用され得る原核生物プロモーターの例としては、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る真核生物プロモーターの例としては、構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、およびＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびに調節可能なプロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、ＣＲＥにより調節される合成プロモーターなどの誘導性または抑制性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。細菌発現用のベクターとして、ｐＧＥＸ－５Ｘ－３が挙げられ、真核生物発現用としてはｐＣＩｎｅｏ－ＣＭＶが挙げられる。
前記発現カセットまたは発現ベクターは、マーカー産生物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産生物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、送達されたら発現されるかどうかを判定する。マーカー遺伝子としては、β－ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を挙げることができる。いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであり得る。そのような選択可能なマーカーが宿主細胞にうまく移されると、形質転換された宿主細胞は、選択的な圧力下に置かれれば生き残ることができる。選択的レジームには、広く使用されている２つの異なるカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異細胞株の使用に基づいている。第２のカテゴリーは、優性選択であり、これは任意の細胞タイプで使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは通常、薬物を使用して宿主細胞の増殖を停止させる。新規遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を運ぶタンパク質を発現し、選択を生き延びる。そのような優性選択の例は、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））という薬物を使用する。
遺伝子導入は、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体中の遺伝物質の直接導入を使用して、または細胞もしくはカチオン性リポソームなどの担体中の遺伝物質の導入を介して達成することができる。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法での使用に容易に適応可能である。導入ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために、または遺伝子を送達するための一般的な戦略の一部として、例えば組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として使用される任意のヌクレオチド構築物（例えばプラスミド）であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，（１９９３））。ウイルスベクター、化学トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含むトランスフェクションの適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって記載されている。
例えば、キネシン－１３関連（例えば、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、もしくはＫＩＦ１３Ａ）核酸分子、発現カセットおよび／もしくはベクター、ならびに／またはＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１阻害性核酸分子、発現カセットおよび／もしくはベクターは、カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、粒子衝撃等が挙げられるが、これらに限定されない任意の方法で細胞に導入され得る。細胞を培養で増殖させ、次いで、対象、例えばヒトなどの哺乳類に投与することができる。投与される細胞の量または数は変化し得るが、約１０６～約１０９細胞の範囲の量を使用することができる。細胞は、一般に生理食塩水または緩衝生理食塩水などの生理学的溶液中で送達される。細胞はまた、リポソーム、エキソソーム、または微小胞の集団などのビヒクル中で送達され得る。
場合によっては、トランスジェニック細胞は、キネシン－１３関連（例えば、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、もしくはＫＩＦ１３Ａ）核酸分子、発現カセットおよび／もしくはベクターを含む、ならびに／またはＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１阻害核酸を産生するエキソソームまたは微小胞を産生することができる。微小胞は、多種多様なタンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡの分泌を媒介し、隣接する細胞と相互作用し、それによって信号、タンパク質、脂質、および核酸を細胞から細胞に伝達することができる（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８６（１６）：１４３８３－１４３９５（２０１１）、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３（Ａｐｒｉｌ ２０１２）、Ｐｅｇｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７（１４）：６３２８－６３３３（２０１０）、ＷＯ／２０１３／０８４０００を参照。これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのような微小胞を産生する細胞を使用して、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、および／またはＮＦ－κＢ転写因子キネシン－１３関連（例えば、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、もしくはＫＩＦ１３Ａ）、ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１タンパク質、および／または阻害性核酸を発現させることができる。
任意にＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、および／またはＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸を発現することもできる、キネシン－１３タンパク質（例えば、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、もしくはＫＩＦ１３Ａ）を発現する異種発現カセットまたは発現ベクターを有するトランスジェニックベクターまたは細胞を、対象に投与することができる。異種発現カセットまたは発現ベクターを有するトランスジェニックベクターまたは細胞は、任意にＥＮＰＰ１を発現することもできる。トランスジェニック細胞によって産生されたエキソソームを使用して、キネシン－１３／ＭＣＡＫ核酸またはタンパク質（例えば、Ｋｉｆ２ｂ、ＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃ、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、および／もしくはＫＩＦ１３Ａ核酸またはタンパク質）を、対象における腫瘍およびがん細胞に送達することができる。トランスジェニック細胞によって産生されたエキソソームを使用して、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸を、対象における腫瘍およびがん細胞に送達することができる。
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせの阻害物質を含む方法および組成物は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせに対する抗体または阻害性核酸の使用を伴い得る。
阻害性核酸
以下の発現は、例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１をコードする核酸を特異的に認識する阻害性核酸の使用によって、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせで阻害することができる。
阻害性核酸は、細胞内またはストリンジェントな条件下でＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸にハイブリダイズするであろう少なくとも１つのセグメントを有し得る。阻害性核酸は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１をコードする核酸の発現を低減し得る。核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはそれらの組み合わせにハイブリダイズすることができる。阻害性核酸は、プラスミドベクターまたはウイルスＤＮＡに組み込まれてもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、環状でも直鎖状でもよい。
阻害性核酸は、長さが１３ヌクレオチドを超えるリボースヌクレオチドまたはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーである。阻害性核酸は、天然に存在するヌクレオチド、ホスホロチオレートなどの合成、修飾、または擬似ヌクレオチド、ならびにＰ３２、ビオチン、またはジゴキシゲニンなどの検出可能な標識を有するヌクレオチドを含み得る。阻害性核酸は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸の発現および／または活性を低減し得る。そのような阻害性核酸は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸のセグメントに完全に相補的であり得る。あるいは、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１シーケンスに対して、阻害性核酸配列にはある程度のばらつきが認められる。阻害性核酸は、細胞内条件下またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸にハイブリダイズすることができ、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸の発現を抑制するために十分に相補的である。細胞内条件とは、細胞、例えば動物または哺乳類細胞内で通常見られる温度、ｐＨ、および塩濃度などの条件を指す。そのような動物または哺乳類細胞の一例は、骨髄前駆細胞である。そのような動物または哺乳類細胞の別の例は、骨髄前駆細胞に由来するより分化した細胞である。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、本明細書において別の方法で認定されているストリンジェンシーの所望の程度に応じて、選択された配列の熱融点よりも約１℃～約２０℃低い範囲の温度を包含する。例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１コード配列に正確に相補的な連続したヌクレオチドのストレッチ ２、３、４、もしくは５個、またはそれ以上を含む阻害性オリゴヌクレオチドは、それぞれ隣接するコード配列と相補的ではない連続したヌクレオチドのストレッチによって分離されており、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸の機能を阻害し得る。一般に、連続するヌクレオチドの各ストレッチは、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、もしくは少なくとも８ヌクレオチド長、またそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的介在配列は、１、２、３、または４ヌクレオチド長であり得る。当業者は、センス核酸にハイブリダイズした阻害性核酸の計算された融点を容易に使用して、特定の標的核酸の発現を阻害するために許容されるミスマッチの程度を推定することができる。本発明の阻害性核酸としては、例えば、ショートヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸分子が挙げられる。
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１をコードする核酸の例を本明細書に示す。実施例１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～３６を含む阻害性核酸配列の例を提供する。図６および９も参照されたい。
阻害性核酸分子は、一本鎖または二本鎖（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））であってもよく、酵素依存的にまたは立体的遮断によって機能することができる。酵素依存的に機能する阻害性核酸分子としては、標的ｍＲＮＡを分解するためのＲＮアーゼＨ活性に依存する形態が挙げられる。これらには、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびホスホロチオエート分子、ならびにセンス－アンチセンス鎖対合による標的ｍＲＮＡ認識とそれに続くＲＮＡ誘導サイレンシング複合体による標的ｍＲＮＡの分解を伴う二本鎖ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡシステムが含まれる。ＲＮアーゼ－Ｈに依存しない立体遮断阻害性核酸は、標的ｍＲＮＡに結合し、他のプロセスを妨害することにより、遺伝子発現または他のｍＲＮＡ依存性細胞プロセスを干渉する。立体遮断阻害性核酸としては、２’－Ｏアルキル（通常、ＲＮアーゼ－Ｈ依存性アンチセンスを含むキメラ中）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびモルホリノアンチセンスが挙げられる。
例えば、低分子干渉ＲＮＡを使用して、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１翻訳を特異的に低減させることができ、それによりコードされたポリペプチドの翻訳が低減する。ＳｉＲＮＡは、転写後遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれると、ｓｉＲＮＡは、複合体を相同ｍＲＮＡ転写物に誘導することにより、相同内因性ｍＲＮＡ転写物の切断を媒介し、次いで複合体によって切断される。ｓｉＲＮＡは、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１ ｍＲＮＡ転写物の任意の領域と相同であり得る。相同性領域は、長さが３０ヌクレオチド以下、好ましくは２５ヌクレオチド未満、より好ましくは長さが約２１～２３ヌクレオチドであり得る。ＳｉＲＮＡは、通常二本鎖であり、例えば３’オーバーハングＵＵジヌクレオチドなどの２ヌクレオチド３’オーバーハングを有し得る。ｓｉＲＮＡを設計するための方法は、当業者に知られている。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８ （２００１）、Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１３：８３－１０６（２００３）を参照されたい。
ＩＭＧＥＮＥＸ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されているヘアピンｓｉＲＮＡを発現するためのｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＮｅｏベクターを使用して、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１発現を阻害するためのｓｉＲＮＡを生成することができる。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの構築は、ｍＲＮＡの標的領域の選択を伴い、これは試行錯誤のプロセスであり得る。しかしながら、Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、約８０％の時間で機能すると思われるガイドラインを提供した。Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２．２６（２）：ｐ．１９９－２１３。したがって、合成ｓｉＲＮＡの合成のために、標的領域は、好ましくは開始コドンの５０～１００ヌクレオチド下流で選択され得る。５’および３’非翻訳領域および開始コドンに近い領域は、調節タンパク質結合部位が豊富である可能性があるため、避ける必要がある。ｓｉＲＮＡは、ＡＡで開始できるため、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に３’ＵＵオーバーハングを有し、およそ５０％のＧ／Ｃ含有量を有する。合成ｓｉＲＮＡの配列の例は、５’－ＡＡ（Ｎ１９）ＵＵであり、ここでＮは、ｍＲＮＡ配列の任意のヌクレオチドであり、およそ５０％のＧ－Ｃ含有量でなければならない。選択された配列は、他の既知のコード配列との相同性を最小限に抑えるために、ヒトゲノムデータベース内の他の配列と比較することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを介したブラスト検索による）。
ＳｉＲＮＡは、化学合成され得る、インビトロ転写によって作製され得るか、またはｓｉＲＮＡ発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現され得る。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。ｓｉＲＮＡが発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現される場合、ｓｉＲＮＡをコードする挿入物は、ｓｉＲＮＡヘアピンに折り畳まれるＲＮＡ転写物として発現され得る。したがって、ＲＮＡ転写物は、ヘアピンのループならびに３’末端のＵのストリングを形成するスペーサー配列により、その逆相補的アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結されるセンスｓｉＲＮＡ配列を含み得る。ヘアピンのループは、任意の適切な長さ、例えば３～３０ヌクレオチド長、好ましくは３～２３ヌクレオチド長であってよく、
Figure 0007197556000048
を含む様々なヌクレオチド配列のものであってよい。ＳｉＲＮＡはまた、直接または導入遺伝子もしくはウイルスを介して導入された二本鎖ＲＮＡの切断によってインビボで産生されてもよい。一部の生物では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅が起こる場合がある。
短いヘアピンＲＮＡ ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸は、阻害性核酸の配列を含む発現ベクターまたは発現カセットからの発現などによる方法を使用して調製することができる。あるいは、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを使用する化学合成によって調製されてもよい。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、例えば、阻害性核酸の生物学的安定性を高めるように設計された、または阻害性核酸と標的ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１核酸との間に形成される二重鎖の細胞内安定性を高めるように設計された、修飾ヌクレオチドまたは非ホスホジエステル結合から作製される。
阻害性核酸は、利用可能な方法を使用して、例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１核酸、またはそれらの相補体の配列をコードする発現ベクターからの発現によって調製されてもよい。あるいは、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを使用する化学合成によって調製されてもよい。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１核酸は、例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１核酸の生物学的安定性を高める設計された、または阻害性核酸と他の（例えば、内因性）核酸との間に形成される二重鎖の細胞内安定性を高めるように設計された、修飾ヌクレオチドまたは非ホスホジエステル結合から作製される。
例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１核酸は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合を有するペプチド核酸であり得る。
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１核酸に用いることができる天然に存在するヌクレオチドとしては、リボースまたはデオキシリボースのヌクレオチドであるアデノシン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが挙げられる。ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１核酸で用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルクエシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルクレオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５オキシ酢酸、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
したがって、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子、ＲｅｌＢ核酸、ならびにＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸は、修飾ヌクレオチド、ならびにリボースおよびデオキシリボースヌクレオチドの組み合わせなどの天然ヌクレオチドを含み得る。阻害性核酸は、野生型と同じ長さであってもよい（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１６、１８、２０、２２、または２４）。ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２およびＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ核酸、ならびにＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸はまた、より長く、他の有用な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／もしくはＭＳＴ１核酸は、やや短い。例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、および／またはＭＳＴ１阻害性核酸は、５’または３’末端から、最大５ヌクレオチドが欠落し得る、または最大１０ヌクレオチドが欠落し得る、または最大２０ヌクレオチドが欠落し得る、または最大３０ヌクレオチドが欠落し得る、または最大５０ヌクレオチドが欠落し得る、または最大１００ヌクレオチドが欠落し得る核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１６、１８、２０、２２、または２４）を有するセグメントを含み得る。
抗体
抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、およびＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１の阻害物質として使用することができる。抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、およびＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１タンパク質の様々なエピトープに対して生じ得る。ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、およびＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１タンパク質のいくつかの抗体もまた、市販されている場合がある。しかしながら、本明細書に記載される方法および組成物による治療のために企図される抗体は、好ましくはヒトまたはヒト化抗体であり、それらの標的に対して高度に特異的である。
一態様では、本開示は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的に結合する単離された抗体の使用に関する。そのような抗体は、モノクローナル抗体であってよい。そのような抗体はまた、ヒト化抗体または完全ヒトモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、もしくはＭＳＴ１に結合する高親和性、またはＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、もしくはＭＳＴ１受容体の結合を阻害する能力などの、１つ以上の所望の機能特性を呈し得る。
本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、もしくはＭＳＴ１抗体、またはＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１抗体の組み合わせを含み得る。
本明細書で言及される「抗体」という用語は、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な相補系の最初の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片（例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１のドメイン）を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組み換え法を使用して、単一のタンパク質鎖として作製できる合成リンカーによって接合することができ、ＶＬ領域とＶＨ領域は対になって、一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１ファミリー分子などの他の抗原に対する相互反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されるハイブリドーマ（下記でさらに説明される）に対してトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）例えば、トランスフェクトーマからヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体などの、組み換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体を含む。そのような組み換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって組み換え抗体のＶＬおよびＶＨ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＬおよびＶＨ配列に由来し、関連するが、インビボでヒト抗体生殖系レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾された形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体とのコンジュゲートを指す。
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合、「ヒトＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的に結合する」抗体は、１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０－８Ｍ～１×１０－１０Ｍまたはそれ未満のＫＤで、ヒトＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に結合する抗体を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合、「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、本明細書で使用される場合、「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比率から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して判定することができる。抗体のＫＤを判定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、抗体は、ヒトＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に高い親和性で、例えば、１×１０－７Ｍ以下のＫＤで結合する。抗体は、以下の特徴のうちの１つ以上を呈し得る。
（ａ）１×１０－７Ｍ以下のＫＤでヒトＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、もしくはＭＳＴ１に結合すること、
（ｂ）ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、もしくはＭＳＴ１の機能もしくは活性を阻害すること、
（ｃ）がん（例えば、転移性がん）を阻害すること、または
（ｄ）それらの組み合わせ。
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、およびＲＩＡを含む、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に対する抗体の結合能力を評価するためのアッセイを使用することができる。抗体の結合動力学（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析などの当技術分野で知られている標準的なアッセイによって評価判定することができる。
各対象抗体がＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に結合し得ることを考えると、ＶＬおよびＶＨ配列を「混合および一致」させて、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に結合する他の結合分子を作製することができる。そのような「混合および一致」させた抗体の結合特性は、上記の結合アッセイを使用して試験し、実施例に記載されるアッセイにおいて評価判定することができる。ＶＬ鎖とＶＨ鎖とを混合および一致させると、特定のＶＨ／ＶＬ対形成由来のＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えることができる。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対形成由来のＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置換される。
したがって、一態様では、本発明は、
（ａ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的に結合する。
場合によっては、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインのみが、同族抗原に対する抗体の結合特異性を判定することができ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体が、予測可能に生成され得る。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，ＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ－４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを使用するヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）、Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）（親マウスＭＯＣ－３１抗ＥＧＰ－２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを使用する組み換え上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）抗体を記載する）、Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）（重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを使用するヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体のパネルを記載する）を参照されたい。したがって、場合によっては、混合および一致させた抗体またはヒト化抗体は、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１に特異的なＣＤＲ３抗原結合ドメインを含む。
小分子
ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢタンパク質、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１の小分子モジュレーターも利用可能である。例えば、ＳＫ４Ａ化合物は、ＥＮＮＰ１の特異的阻害物質である（Ａｒａｄ ｅｔ ａｌ．，ＳＡＴ００３７ Ａｎ ＥＮＰＰ１－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｃｔｏ－Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、ａｒｄ．ｂｍｊ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／７４／Ｓｕｐｐｌ＿２／６６２．１（２０１５）のウェブサイトを参照）。
さらに、以下の化合物（Ｌ５２４－０３６６）は、ＦＮ１４アンタゴニストである。
Figure 0007197556000049
創薬のためのアッセイ
候補化合物による治療に対する感受性について転移性腫瘍試料をスクリーニングするための方法もまた、本明細書に記載されている。具体的には、この方法は、染色体不安定性の増加を呈する細胞（例えば、ＣＩＮ変異体細胞）またはｃＧＡＭＰレベルが上昇した転移性細胞の増殖または生存を選択的に干渉する候補化合物を同定するためのアッセイステップを含むことができる。
染色体不安定性の増加を呈する細胞（例えば、ＣＩＮ変異体細胞）の増殖または生存率が、正常な対照細胞と比較して試験化合物の存在下で減少する場合、その試験化合物は、そのような増加した染色体不安定性を呈する細胞の成長および／または転移を低減するために有用である。
同様に、細胞または細胞集団のｃＧＡＭＰレベルが上昇している場合、その細胞または細胞集団はがん性であるか、がんを発症する。そのような細胞または細胞集団のｃＧＡＭＰレベルが、ｃＧＡＭＰ分泌細胞の以前のレベルと比較してｃＧＡＭＰのレベルの減少を呈する場合、その試験化合物は、ｃＧＡＭＰのレベルが上昇した細胞の成長および／または転移を低減するために有用である。
アッセイは、化合物が転移性がん細胞由来もしくはＣＩＮがん細胞由来または細胞株由来のｃＧＡＭＰレベルの減少を特異的に引き起こし得るかどうかを判定することを含み得る。化合物がレベルの減少を引き起こす場合、その化合物は、がんを治療するための治療薬としての適合性など、さらなる研究のために選択／同定することができる。例えば、本発明の特色である選択方法により同定された候補化合物は、例えば、動物モデルに化合物を投与することにより、腫瘍を標的とする能力またはがんを治療する能力についてさらに試験することができる。
評価される細胞としては、がんを有する患者（転移性がんを有する患者を含む）の細胞、既知のがんタイプもしくはがん細胞株の細胞、またはｃＧＡＭＰの過剰産生を呈する細胞を挙げることができる。これらの細胞タイプのうちのいずれかからのｃＧＡＭＰの産生を低減し得る化合物は、患者に投与することができる。
例えば、ある方法は、（ａ）患者から細胞試料または組織試料を得ること、（ｂ）試料由来の既知数または既知重量の細胞または組織から産生されたｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、基準ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｃ）試料由来の前記既知数または既知重量の細胞または組織を試験化合物と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｄ）試験アッセイ物中（細胞培地中または細胞中もしくは組織中）のｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｅ）任意に、ステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すこと、ならびに基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する試験化合物を選択することを含み得る。この方法は、例えば、試験化合物の毒性および／または有効性をさらに評価するために、動物モデルに試験化合物を投与することをさらに含み得る。場合によっては、この方法は、得られた細胞試料または組織試料が由来する患者に試験化合物を投与することをさらに含み得る。
例えば、別の方法は、ＫＩＦ２ＢおよびＫＩＦ２Ｃ／ＭＣＡＫアゴニストまたはアクチベーターの同定に有用なアッセイを含み得る。ＫＩＦ２ＢおよびＫＩＦ２Ｃ／ＭＣＡＫは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用して微小管ダイナミクスおよび染色体－動原体の付着を調節する、関連分子キネシンモータータンパク質である。ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫの過剰発現または過剰活性化の中心的な役割は、染色体不安定性（ＣＩＮ）を抑制することであり、それらをがん治療の魅力的な標的にする。ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫの強力なアクチベーターを同定および評価判定するために使用できるインビトロアッセイおよび画像化法を以下に記載する。
ＡＴＰ加水分解の反応速度の測定を使用して、ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫを活性化し、ＣＩＮを抑制する化合物をスクリーニングすることができる。このアッセイは、２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）が、無機リン酸の存在下で２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンに変換される場合に生じる吸光度シフト（３３０～３６０ｎｍ）に基づいている。この反応は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）によって触媒される。１分子の無機リン酸（Ｐｉ）は、不可逆反応で１分子の２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンを生じる。したがって、３６０ｎｍでの吸光度は、ＡＴＰアーゼ反応で生成されるＰｉの量に直接比例し、ＭＣＡＫ活性のプロキシとして使用することができる。
あるいは、ＡＤＰ産生はまた、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ ＬａｂｓからのＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰアッセイを使用してＭＣＡＫ活性についての読み出しとしてモニタリングすることもできる。このアッセイは、ＡＤＰを特異的に認識する抗体に結合した蛍光トレーサー（６３３ｎｍ）を置き換えるＡＤＰの能力に基づいている。トレーサーの置き換えは、６３３ｎｍのレーザー励起により測定される蛍光の減少を引き起こす。したがって、ＭＣＡＫの活性は、使用される薬物の濃度、産生されるＡＤＰ／蛍光強度の減少の量をプロットすることにより計算することができる。
以下は、ＭＣＡＫアクチベーターの効力を同定および評価判定するための方法の別の例である。ＭＣＡＫは、微小管の先端を結合し、微小管の解重合を促進することにより、微小管の長さを負に調節する。したがって、γ－チューブリン標識中心体間の距離は、細胞内のＭＣＡＫ活性についての間接的読み出しとして測定することができる。スピンドルの長さは、ＭＣＡＫ活性に反比例し、ＭＣＡＫ活性を促進する潜在的な化合物を評価するための代理として機能し得る。この方法は、ハイスループット画像化顕微鏡を使用することにより、化合物をスクリーニングするために適合させることができる。
化合物（例えば、本明細書に記載される任意の方法により同定されたトップヒット）は、有効性の読み出しとして、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて遅滞染色体、小核、または染色体誤分離を使用し、細胞ベースのアッセイで使用することができる。標識されたγ－チューブリンセントロメアを持つ染色体を有する細胞を使用することができる。あるいは、中心体のγ－チューブリンに結合する標識抗体をアッセイに使用することができる。
ＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）の阻害物質の効力を同定および評価判定するためのアッセイ方法もまた、本明細書に記載されている。ＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）は、非標準的なＮＦ－ｋＢシグナル伝達を仲介し、転移に関連している。したがって、ＮＩＫの阻害は、ＣＩＮ誘発性の炎症反応と転移を抑制する場合がある。ＮＩＫのキナーゼ機能の特異的阻害は、様々な化合物の効力を評価判定するアプローチを提供する。ＮＩＫ阻害を同定および評価判定するための２つの方法を以下に記載する。
ＡＤＰ産生は、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ ＬａｂｓからのＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰアッセイを使用してＭＣＡＫ活性についての読み出しとしてモニタリングすることができる。このアッセイは、ＡＤＰを特異的に認識する抗体に結合した蛍光トレーサー（６３３ｎｍ）を置き換えるＡＤＰの能力に基づいている。トレーサーの競合的置き換えは、６３３ｎｍのレーザー励起により測定される蛍光の減少を引き起こす。したがって、ＭＣＡＫの活性は、使用される薬物の濃度、産生されるＡＤＰ／蛍光強度の減少の量をプロットすることにより計算することができる。
ＮＩＫの阻害は、非標準ＮＦ－κＢ経路を直接阻害するアプローチを提供する。このアッセイは、高コンテンツの細胞画像化を使用するｐ５２の核移行（ＲＥＬＢ、非標準ＮＦ－ｋＢシグナル伝達）の定量化に依存している。ＲＥＬＢ核移行アッセイでは、細胞を異なる濃度の化合物で処理し、非標準ＮＦ－ｋＢシグナル伝達の強力なアクチベーターである拮抗性抗リンホトキシンβ受容体（ＬＴ－βＲ）抗体１００ｎｇ／ｍＬで刺激する。核へのＲＥＬＢ移行は、細胞質シグナル強度に対する核の比率により定量化される。ＲＥＬＢの核移行を選択的に阻害する強力な化合物が発見された。
そのように同定された化合物は、腫瘍を選択的に標的とするためまたはＣＩＮを特徴とするがんを治療するために有用であり得る。例えば、化合物は、ｃＧＡＭＰの過剰産生を呈する腫瘍またはがんのタイプを治療するために有用である。
「治療」または「治療する」とは、治療的治療、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。治療を必要とする人には、すでに障害を持っている人、障害を起こしやすい人、または障害が予防される人が含まれる。
治療の目的のための「対象」とは、ヒト、家畜および農場の動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳類または鳥として分類される任意の動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、動物固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍を含む。「腫瘍細胞」および「がん細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
「動物固形腫瘍」としては、頭頸部がん、肺がん、中皮腫、縦隔がん、肺がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、肝胆道系がん、小腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肛門がん、腎臓がん、尿道がん、膀胱がん、前立腺がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、婦人科器がん、卵巣がん、乳がん、内分泌系がん、皮膚中枢神経系がん、軟部組織および骨の肉腫、ならびに皮膚および眼内起源の黒色腫が挙げられる。さらに、微小転移性腫瘍、巨大転移性腫瘍、および再発がんなど、進行のあらゆる段階の転移性がんを治療することができる。
「血液悪性腫瘍」という用語は、成人または小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球性および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性白血病、形質細胞新生物、ならびにＡＩＤＳに関連するがんを含む。
本発明の方法および組成物を使用して、乳がん、肺がん、副腎皮質がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、頭頸部がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、カルチノイド腫瘍、慢性リンパ球性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛腫瘍、肝芽腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、網膜芽腫、または卵巣腫瘍を治療することもできる。原発性がん、転移性がん、再発がんなど、進行のあらゆる段階のがんを治療または検出することができる。場合によっては、転移性がんは治療されるが、原発性がんは治療されない。多くのタイプのがんに関する情報は、例えば、米国がん協会（ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）から、または、例えばＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃから見出され得る。
いくつかの実施形態では、治療されるがんおよび／または腫瘍は、乳がんまたは肺がんとして発生するものである。
転移性がんの治療または治療することは、がん細胞の遊走の低減または少なくとも１つの転移性腫瘍の確立の低減を含み得る。治療にはまた、咳、息切れ、喀血、リンパ節腫脹、肝臓肥大、悪心、黄疸、骨痛、骨折、頭痛、発作、全身性疼痛、およびそれらの組み合わせなどの転移性がんの複数の症状の緩和または減少も含まれる。治療は、がんを治癒する可能性があり、例えば、転移性がんを予防する、転移性腫瘍の形成および成長を実質的に排除する可能性、および／または転移性がん細胞の遊走を停止または阻害する可能性がある。
抗がん活性は、当業者に利用可能な方法を使用して、様々ながん（例えば、乳がん、肺がん、または前立腺がん）の進行を低減することができる。例えば、抗がん活性は、がん細胞の遊走を予防する本発明の作用物質の致死量（ＬＤ１００）または５０％有効量（ＥＤ５０）または５０％で成長を阻害する用量（ＧＩ５０）を同定することにより判定することができる。一態様では、例えば、原発性腫瘍部位から近位または遠位の部位でがん細胞マーカーの発現を検出することにより測定される場合、または転移を検出するための利用可能な方法を使用して評価判定される場合、抗がん活性は、がん細胞の遊走の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％を低減する作用物質の量である。
別の例では、免疫療法に対して腫瘍細胞を感作するために、染色体不安定性を促進する作用物質を投与することができる。染色体不安定性は、免疫チェックポイントの遮断と相乗作用するウイルス様反応を促進する。したがって、染色体不安定性を促進する作用物質を投与することにより、腫瘍細胞は、免疫系および様々な免疫療法に対してより敏感になり得る。
組成物
本発明はまた、化学療法剤を含む組成物に関する。そのような薬剤は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、発現カセットもしくは発現ベクター内）、小分子、本明細書に記載される方法により同定された化合物、またはそれらの組み合わせであり得る。組成物は、医薬組成物であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。
前記組成物は、任意の便利な形態で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するキンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２タンパク質もしくはポリペプチド、またはそのようなキンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２タンパク質もしくはポリペプチドの組み合わせを含み得る。他の実施形態では、組成物は、キンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２核酸、またはキンシン－１３、ＭＣＡＫ、ＡＢＣＣ４、および／もしくはＡＢＣＧ２タンパク質をコードする核酸セグメントを含む発現カセットを含み得る。例えば、核酸または発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２のうちのいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の化学療法剤（例えば、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、発現カセットまたは発現ベクター内）、小分子、本明細書に記載される方法により同定された化合物、またはそれらの組み合わせ）は、「治療有効量」で投与される。そのような治療有効量は、がんの少なくとも１つの症状の低減などの所望の生理学的効果を得るのに十分な量である。例えば、化学療法剤は、細胞転移を５％、もしくは１０％、もしくは１５％、もしくは２０％、もしくは２５％、もしくは３０％、もしくは３５％、もしくは４０％、もしくは４５％、もしくは５０％、もしくは５５％、もしくは６０％、もしくは６５％、もしくは％７０、もしくは８０％、もしくは９０％、０９５％、もしくは９７％、もしくは９９％、もしくは５％～１００％の任意の数値パーセンテージだけ低減することができる。がんの症状としては、腫瘍悪液質、腫瘍誘発性疼痛状態、腫瘍誘発性疲労、腫瘍成長、および転移の広がりを挙げることもできる。したがって、化学療剤はまた、腫瘍悪液質、腫瘍誘発性疼痛状態、腫瘍誘発性疲労、腫瘍成長、またはそれらの組み合わせを５％、もしくは１０％、もしくは１５％、もしくは２０％、もしくは２５％、もしくは３０％、もしくは３５％、もしくは４０％、もしくは４５％、もしくは５０％、もしくは５５％、もしくは６０％、もしくは６５％、もしくは％７０、もしくは８０％、もしくは９０％、０９５％、もしくは９７％、もしくは９９％、または５％～１００％の任意の数値パーセンテージだけ低減することができる。
所望の効果を達成するために、化学療法剤は、単回投与または分割投与として投与されてもよい。例えば、化学療法剤は、他の投与量が有益な結果を提供するかもしれないが、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１ｍｇ～約５００～７５０ｍｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ～約３００～５００ｍｇ、少なくとも約０．１ｍｇ～約１００～３００ｍｇ、または少なくとも約１ｍｇ～約５０～１００ｍｇの投与量で投与することができる。投与量は、限定されないが、投与のために選択された小分子、化合物、ペプチド、または核酸のタイプ、哺乳類の疾患、体重、体調、健康、および年齢を含む様々な要因に応じて変化するであろう。そのような因子は、動物モデルまたは当技術分野で利用可能な他の試験システムを使用する臨床医によって容易に判定することができる。
本発明による化学療法剤の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態に応じて、投与の目的が治療的または予防的であるかどうかに応じて、および熟練した開業医に知られている他の要因に応じて、単回投与、複数回投与、連続的または断続的様式であってもよい。本発明の化学療法剤および組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔を空けた用量であり得る。局所投与と全身投与の両方が考えられる。
組成物を調製するために、小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、および他の作用物質が合成されるか、そうでなければ得られ、必要または所望に応じて精製される。これらの小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、および他の作用物質は、薬学的に許容される担体に懸濁する、および／または凍結乾燥もしくは他の方法で安定化させることができる。小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、他の作用物質、およびそれらの組み合わせは、適切な濃度に調整し、任意に他の作用物質と組み合わせることができる。単位用量に含まれる所与の小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、および／または他の作用物質の絶対重量は、大きく異なり得る。例えば、約０．０１～約２ｇ、または約０．１～約５００ｍｇの少なくとも１つの分子、化合物、ポリペプチド、核酸、および／もしくは他の作用物質、または複数の分子、化合物、ポリペプチド、核酸、および／もしくは他の作用物質を投与することができる。あるいは、単位投与量は、約０．０１ｇ～約５０ｇ、約０．０１ｇ～約３５ｇ、約０．１ｇ～約２５ｇ、約０．５ｇ～約１２ｇ、約０．５ｇ～約８ｇ、約０．５ｇ～約４ｇ、または約０．５ｇ～約２ｇまで変化し得る。
本発明の化学療法剤の１日用量も同様に変化し得る。そのような１日用量は、例えば、約０．１ｇ／日～約５０ｇ／日、約０．１ｇ／日～約２５ｇ／日、約０．１ｇ／日～約１２ｇ／日、約０．５ｇ／日～約８ｇ／日、約０．５ｇ／日～約４ｇ／日、および約０．５ｇ／日～約２ｇ／日の範囲であり得る。
治療に使用する化学療法剤の量は、選択した特定の担体だけでなく、投与経路、治療中のがん状態の性質、患者の年齢および状態によっても変化することが理解されるであろう。最終的には、付添いの医療提供者が適切な投与量を判定することができる。さらに、薬学的組成物は、単一の単位剤形として製剤化することができる。
したがって、化学療法剤を含む１つ以上の好適な単位剤形は、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、および腹腔内を含む）、経口、直腸、真皮、経皮、胸腔内、肺内、および鼻腔内（呼吸器）経路を含む様々な経路で投与することができる。化学療法剤はまた、徐放用に製剤化することもできる（例えば、マイクロカプセル化を使用する、ＷＯ９４／０７５２９および米国特許第４，９６２，０９１号を参照）。製剤は、必要に応じて、個別の単位剤形で便利に提供することができ、製薬業界に周知の方法のうちのいずれかによって調製することができる。そのような方法は、化学療法剤を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微粉化固体担体、またはそれらの組み合わせと混合し、次いで、必要であれば、生成物を所望の送達システムに導入または成形するステップを含み得る。例えば、化学療法剤は、ナノ粒子、アルブミン、ポリアルキレングリコールなどの便利な担体に結合させるか、またはプロドラッグの形で供給することができる。化学療法剤、およびそれらの組み合わせは、担体と組み合わせることができ、かつ／またはリポソームなどの小胞にカプセル化することができる。
本発明の組成物は、水溶液、懸濁液、錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル、およびリポソームおよび成形ポリマーゲルなどの他の徐放性製剤を含む、多くの形態で調製することができる。阻害物質の投与は、水溶液または徐放性ビヒクルの非経口投与または局所投与も含み得る。
したがって、化学療法剤および／または他の作用物質は、経口剤形で時々投与することができるが、その経口剤形は、小分子、化合物、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、およびそれらの組み合わせが治療的有用性を提供する前に、小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、およびそれらの組み合わせを分解または破壊から保護するように製剤化することができる。例えば、場合によっては、小分子、化合物、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、および／または他の作用物質は、胃を通過した後に腸に放出されるように製剤化することができる。そのような製剤は、例えば、米国特許第６，３０６，４３４号およびその中に含まれる参考文献に記載されている。
液体薬学的組成物は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシル、使用前に水または他の好適なビヒクルで構成するための乾燥粉末の形態であり得る。そのような液体薬学的組成物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、または防腐剤などの従来の添加剤を含有し得る。薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。好適な担体としては、生理食塩水、カプセル化剤（例えば、リポソーム）、および他の材料が挙げられる。化学療法剤および／または他の作用物質は、担体の存在下または非存在下で、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）で製剤化することができる。担体が望ましい場合、担体は、薬学的製剤に含めることができるか、または乾燥形態、懸濁液、または便利な液体中の可溶性の濃縮された形態で包装された阻害物質に加えて、別々の容器に別々に包装することができる。
化学療法剤および／または他の作用物質は、非経口投与用（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による）に製剤化することができ、アンプル、事前充填シリンジ、小容量輸液容器、または防腐剤を追加した複数回投与容器中の単位剤形で提供することができる。
前記組成物はまた、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗菌剤、および／または防腐剤などの他の成分も含有し得る。使用できる追加の治療用物質の例としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、エチレンイミン、およびトリアゼンなどのアルキル化剤；葉酸拮抗薬、プリン類似体、およびピリミジン類似体などの代謝拮抗薬；アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、およびプリカマイシンなどの抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害物質；グルココルチコイド、エストロゲン／抗エストロゲン、アンドロゲン／抗アンドロゲン、プロゲスチン、および黄体形成ホルモン放出ホルモン拮抗薬、酢酸オクトレオチドなどのホルモン剤；エクテイナシジンまたはそれらの類似体および誘導体などの微小管破壊剤；パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、およびエポチロンＡ－Ｆ、またはそれらの類似体もしくは誘導体などの微小管安定化剤；ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサンなどの植物由来生成物；ならびにトポイソメラーゼ阻害物質；プレニル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害物質；ならびにヒドロキシウレア、プロカルバジン、ミトタン、ヘキサメチルメラミン、シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位錯体などの種々雑多な作用物質；ならびに生物学的反応調節剤、成長因子などの抗がん剤および細胞毒性剤として使用される他の薬剤；免疫調節剤、およびモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、放射線療法と併用することもできる。
本明細書は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは決して限定するものとして解釈されるべきではない。引用されたすべての参考文献（文献参照、発行された特許、この出願を通して引用されている公開された特許出願を含む）の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
実施例１：材料および方法
この実施例は、本発明の開発に用いられた材料および方法のうちのいくつかを記載する。
原発性－転移対応対のゲノム解析
対応させた原発性腫瘍および正常を有する６１個の脳転移からの全エクソームＤＮＡ配列データ（Ｂｒａｓｔｉａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５，１１６４－１１７７（２０１５））を、遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧＡＰ）からダウンロードし、記載の通り処理して（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，１４６３－１４６９（２０１６））、各試料の対立遺伝子特異的セグメント化ＤＮＡコピー数データを得た。腫瘍倍数性に対して異常として分類されたゲノムの割合を表す加重ゲノム不安定性インデックス（ｗＧＩＩ）は、記載の通り判定した（Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９４，４９２－４９６（２０１３））。
Ｍｉｔｅｌｍａｎデータベース分析
Ｍｉｔｅｌｍａｎデータベース（Ｍｉｔｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ／Ｍｉｔｅｌｍａｎ）におけるすべての入手可能な乳腺がん症例を分析した。原文献をレビューして、試料の供給源（原発性腫瘍または転移）を決定した。クローン核型が１つのレンジとして報告された場合、平均値をこのクローンに使用した。核型異常には、構造異常およびクローンの全体的な核型からの数値的逸脱が含まれていた。
ＨＮＳＣＣにおける染色体分離の分析
頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）の６０名の患者由来の原発性腫瘍標本を分析した（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５，４８９－５００（２００４））。４０名の患者は、高解像度顕微鏡分析に十分な質のヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）原発性腫瘍試料を有していた。分析は、前述のように後期を経ている間に固定された細胞に限定されていた（Ｂａｋｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７，７７０４－７７１１（２０１１）、Ｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ １２０，１７３３－１７４２（２０１４））。染色体誤分離は、後期中の残りの分離染色体間におけるヘマトキシリン染色の存在によって規定され、後期を経ている細胞のパーセンテージとして染色体誤分離の証拠とともに報告された。臨床リンパ節の状態は、リンパ節腫瘍の関与の臨床検査またはレントゲン写真の証拠によって明らかにされた（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５，４８９－５００（２００４））。
単一細胞核型分析
培養物を、最終濃度０．１μｇｍｌ－１のコルセミドで処理した。３７℃で４５分間インキュベートした後、培養物をトリプシン処理し、予め温めておいた０．０７５Ｍ ＫＣｌに再懸濁し、３７℃でさらに１０分間インキュベートし、メタノール－酢酸（３：１）で固定した。次いで、固定した細胞懸濁液をスライド上に落とし、２×ＳＳＣ中０．０８μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩで５分間染色し、退色防止溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）中でマウントした。中期スプレッドは、ＧｅｎＡＳＩ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃスイート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）を装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００落射蛍光顕微鏡を使用して捕捉した。各試料について、最低２０個の逆ＤＡＰＩ染色された中期細胞を完全に核型分析し、国際ヒト細胞遺伝学命名法（ＩＳＣＮ）２０１３に従って分析した。
細胞培養
細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した。腫瘍（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＨ２０３０）および２９３Ｔ細胞を、ペニシリン（５０Ｕｍｌ－１）およびストレプトアビジン（５０μｇｍｌ－１）の存在下、１０％ ＦＢＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。すべての細胞は、マイコプラズマ陰性であった。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞集密を測定した。
免疫蛍光顕微鏡検査
細胞固定および抗体染色は、記載の通り実施した（Ｂａｋｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６，５９９０（２０１５））。簡単に説明すると、細胞は、セントロメア、中心体、ｃＧＡＳ、ビメンチン、β－アクチン、もしくはα－チューブリンについて染色する場合は氷冷（－３０Ｃ）メタノールで１５分間固定されたか、またはＲｅｌＢ、ｐ６５、ＩＲＦ３、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＣｏｘＩＶ、またはβ－カテニンについて染色する場合は４％パラホルムで固定された。続いて、１％トリトンを使用して４分間、細胞を透過処理した。抗体情報については、表１を参照されたい。
（表１）免疫蛍光に使用された抗体
Figure 0007197556000050
サイトゾルｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ染色に使用される選択的な細胞膜透過処理のために、細胞を固定後５分間０．０２％サポニンで処理した。一本鎖（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＦＥＲＥＮ０３２１）および二本鎖（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－ＥＮ０７７１）固有のヌクレアーゼ処理では、細胞を０．０２％サポニンで２分間透過処理し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定する前に１０分間いずれかのヌクレアーゼで処理した。抗体染色中にＴＢＳ－ＢＳＡを遮断剤として使用した。ＤＡＰＩは、二次抗体と一緒に追加した。Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－Ｐ３６９６１）を用いて細胞をマウントした。
免疫ブロッティング
細胞をペレット化し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して測定し、２０～３０ｍｇの総タンパク質を各レーンに負荷した。タンパク質を勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。抗体情報については、表２を参照されたい。
（表２）免疫ブロットに使用された抗体
Figure 0007197556000051
図６Ｄに示される定量的比較のために、３回の生物学的反復由来の免疫ブロットを使用した。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪ（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊのウェブサイトを参照）を使用して得て、β－アクチン（負荷対照）に対して正規化して、バックグラウンドを差し引いた。比率は、対照細胞に対して正規化した。
ノックダウンおよび過剰発現の構築物
ルシフェラーゼ発現は、ｐＬＶＸプラスミド（ｔｄＴｏｍａｔｏを発現する）を使用して達成され、ルシフェラーゼを安定して発現する細胞は、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現について分類された。キネシン－１３の発現は、プラスミド（ｐＥＧＦＰ）のトランスフェクションまたはレンチウイルス（ｐＬｅｎｔｉ－ＧＩＩＩ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－２Ａ－Ｐｕｒｏ）の発現を使用して達成され、それぞれＧ４１８（０．５ｍｇｍｌ－１）またはピューロマイシン（５μｇｍｌ－１）を使用して細胞を選択した。Ｄｎアーゼ２の過剰発現は、ｐＬｅｎｔｉ－ＧＩＩＩ－ＣＭＶ－ＲＦＰ－２Ａ－Ｐｕｒｏプラスミドを使用して達成し、選択にはピューロマイシンを使用した。キネシン－１３またはラミンＢ２（ｐＱＣＸＩＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｌｍｎｂ２）構築物を含むプラスミドは、それぞれＣｏｍｐｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｔｚｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの厚意により提供された。ブラスチシジンを使用して、１０μｇｍｌ－１でｌｍｎｂ２発現細胞を選択した。すべての他のプラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍ）から購入した。ＳＴＩＮＧ、ＮＦＫＢ２、ＲｅｌＢ、およびｃＧＡＳの安定したノックダウンは、ｐＲＲＬ（ＳＧＥＰまたはＳＧＥＮ）プラスミド中のｓｈＲＮＡを使用して達成され、ＭＳＫＣＣ ＲＮＡ干渉コアから得られた。標的ごとに２～４つの異なるｓｈＲＮＡヘアピンをスクリーニングした。標的ｓｈＲＮＡ配列を表３に列挙する。
（表３）アンチセンスｓｈＲＮＡ配列
Figure 0007197556000052
動物研究
動物実験は、Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコールに従って実施した。疾患特異的生存について、パワー分析は、対照群における中央疾患特異的生存期間が３か月でありかつ総追跡期間が２５０日である場合、１群あたり１０匹のマウスが、８０％のパワーと９５％の信頼度で０．２未満または５超の相対ハザード比の差を検出するのに十分であることを示した。動物を無作為化する必要はなかった。研究者らは、群の割り当てについて盲検ではなかった。心臓内注射は、以前に記載されているように実施した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４９３－４９８（２０１６））。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１×１０５個の細胞（１００μｌのＰＢＳ中）を６～７週齢の雌の無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ株００２０１９）の左心室に注射した。次いで、マウスに直ちにＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇｋｇ－１）を注射し、ｔａｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｘｅｎｏｇｅｎ機器（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生物発光画像化（ＢＬＩ）に供し、腫瘍細胞の全身播種を確認した。ＢＬＩを使用して注射後５週目に転移負荷を測定し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウスの場合、ＢＬＩ画像を１～２週間ごとに最長１７週間にわたって撮影した。ＢＬＩ画像は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアｖ．２．５０を使用して分析した。マウスが死亡したかまたはＩＡＣＵＣプロトコールの下で安楽死の基準を満たし、かつ転移性疾患のレントゲン写真の証拠があったときに、疾患特異的な生存エンドポイントが満たされた。同所性腫瘍移植のために、５０μｌのＰＢＳ中の２．５×１０５個の細胞をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１で混合し、４番目の乳腺脂肪体に注射した。動物１匹あたり１つの腫瘍のみを移植した。原発性腫瘍は、最大寸法が約１．５ｃｍに達したときに外科的に励起し、最大３０週間にわたって１週間～３週間の間隔でＢＬＩ画像化を使用して、転移性播種を評価判定した。原発性腫瘍移植の部位以外でＢＬＩシグナルが見られたときに、遠隔無転移生存エンドポイントが満たされた。原発性腫瘍および転移から短期培養を誘導するために、麻酔した動物（イソフルラン）を画像化した後、屠殺した。その後、採取された臓器に対してエクスビボＢＬＩを行い、転移病変の正確な位置を画定した。その後、原発性腫瘍および転移を機械的に分離し、腫瘍細胞を選択するための選択培地を含むＤＭＥＭで培養した。１回の継代後に、その後のすべてのアッセイを実施した。
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）アッセイ
ヒト転移性乳がんのＰＤＸモデルは、ＩＲＢ承認プロトコール（ＭＳＫＣＣ ＩＲＢ ＃９７－０９４）の下で同意した患者から得られたばかりの外科的に切除された腫瘍標本を、雌性ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株００５５５７）に移植することによって良好に生成した。エストロゲン受容体陽性ＰＤＸは、骨に転移した乳がんに由来していた。トリプルネガティブＰＤＸは、炎症性乳がんを有する患者からの窩リンパ節転移から確立した。ＰＤＸは、最大３連続継代にわたって維持した。簡単に説明すると、得られたばかりの腫瘍組織標本を、マウスの乳腺脂肪体に直接移植するか、または、非必須アミノ酸（カタログ番号４１５０００１８ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含む無血清ＭＥＭ培地中で１～２ｍｍの小片に刻みＧＦＰ－ルシフェラーゼもしくはｐＵｌｔｒａ－Ｃｈｉｌｉ－Ｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４８６８８）のいずれかを発現するレンチウイルスベクターで形質導入し、続いてマウスに移植した。典型的には、生着後最初の１～３週間の間にＰＤＸ腫瘍の成長が明らかになり、腫瘍はさらに４～８週間成長し続けた。原発性腫瘍の成長および転移は、ＢＬＩまたはスペクトルＣＴ画像化を使用して追跡した。原発性腫瘍および転移の採取時に、原発性腫瘍ならびに肺および肝臓転移から直接原発細胞培養物を得た。簡単に説明すると、５００ｍｇの新鮮なバルク腫瘍組織を、１～２ｍｍ３サイズの小片に切り刻み、１～２時間にわたって細胞の剥離および分離のためにＡｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でインキュベートした。解離した組織を１００μｍの細胞ストレーナーで篩分けし、１２００ ＲＰＭで遠心分離することにより細胞をペレット化した。ペレットを洗浄し、３％ ＦＢＳを含む上記のＭＥＭ緩衝液に再懸濁する。１回の継代後、染色体誤分離について細胞を分析した。
ＲＮＡシーケンシングおよび分析
ＱＩＡＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ－７９６５４）およびＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ－７４１０６）を使用して、バルクＲＮＡを細胞から抽出し、ＨｉＳｅｑ２５００またはＨｉＳｅｑ４０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を使用してシーケンシングした。生のＦＡＳＴＱファイルの質を、ＦａｓｔＱＣでチェックし（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／のウェブサイトを参照）、次いでＳＴＡＲ（ｖ２．４．１ｄ、２パスモード）を使用してヒト基準ＧＲＣｈ３８にマッピングした（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９，１５－２１（２０１３））。遺伝子発現は、カフリンクス（ｖ２．２．１、デフォルトパラメータ）およびＨＴＳｅｑ（ｖ０．６．１）を使用して推定した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，５１１－５１５（２０１０）、Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１，１６６－１６９（２０１５））。差次的発現解析は、ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．１４．１）を使用して実施した（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４））。任意の教師なし分析の前に、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージを使用した分散安定化変換を使用して、発現カウントを変換した。すべてのカスタムコード、統計分析、および視覚化は、ＰｙｔｈｏｎまたはＲで実施した。Ｎｅｘｔｆｌｏｗを使用して、計算パイプラインの一部を管理した（ｎｅｘｔｆｌｏｗ．ｉｏのウェブサイトを参照）。
単一細胞ＲＮＡシーケンシング
細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁した。４００細胞／ｕｌ、９５％超の生存率の２１ｕｌの細胞懸濁液を、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォーム上に負荷して、バーコード化された単一細胞ＧＥＭを生成した。単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）ライブラリーは、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ仕様書（単一細胞３’試薬キットユーザーガイドＰＮ－１２０２３３、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って調製した。ＧＥＭの逆転写（ＲＴ）（５５℃で２時間、８５℃で５分間、４℃で保持）を、９６－ディープウェル反応モジュール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー内で実施した。ＲＴ後、ＧＥＭを破壊し、一本鎖ｃＤＮＡをＤｙｎａＢｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬キット（０．６×ＳＰＲＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製した。９６ディープウェル反応モジュールを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌサイクラーを使用して、ｃＤＮＡを１４サイクルにわたって増幅させた（９８℃で３分間、９８℃で１５秒間、６７℃で２０秒間、および７２℃で１分間×１４サイクル、７２℃で１分間、４℃で保持）。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡの質を分析した。得られたｃＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０機器（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して約２００ｂｐまでせん断し、０．６×ＳＰＲＩビーズを使用して洗浄した。この生成物は、端部が修復され、「Ａ」テールが付いており、キット中に提供されたアダプターに連結されている。各ライブラリーに固有の試料インデックスは、キットによって提供されるインデックスを使用したＰＣＲ増幅の１０サイクルを通じて導入した（９８℃で４５秒間、９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２０秒×１４サイクル、７２℃で１分間、４℃で保持）。２回のＳＰＲ精製の後、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量化（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してライブラリーを定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００において質を評価判定した。４つのライブラリーをプールし、ペアエンドリードフローセル上の１０ｐＭにおけるＨｉＳｅｑ２５００ラピッドモードでクラスター化し、９８サイクルＲ１、続いて１４ｂｐ Ｉ７インデックス（１０Ｘバーコード）、８ｂｐ Ｉ５インデックス（試料インデックス）、およびＲ２上の１０ｂｐ（ＵＭＩ）についてシーケンシングを行った。シーケンシング画像の一次処理は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのリアルタイム分析ソフトウェア（ＲＴＡ）を使用して行った。多重化解除および後処理は、メーカーの推奨に従って１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒパイプラインを使用して行った。単一細胞ＲＮＡシーケンシングデータ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）は、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒパイプラインを使用して、生リードから分子カウントアレイまでを処理した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４０４９（２０１７））。さらに、分析に対する実験的アーチファクトの影響を最小限に抑えるために、データを前処理して、小さい総分子数（ライブラリーサイズ）と低い複雑性と高いミトコンドリア含有量とを有しバイモーダルフィットにより同定される細胞を除外した。残りの細胞は、細胞内の各遺伝子の発現レベルを総ライブラリーサイズで除算し、次いですべての細胞の中央ライブラリーサイズでスケーリングすることによって正規化した。ライブラリーサイズにより正規化した後、主成分分析（ＰＣＡ）を実施して、ドロップアウトノイズの代入の拡散固有値を計算するときに生成された構築されたマルコフ行列の堅牢性を改善した（ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０１７））。主成分の数は、データの分散のおよそ８０％を保持するように選択され、ライブラリーサイズと非常に相関する最初の主成分を除外した。正規化されたカウント行列と非正規化されたカウント行列の両方の代入は、３のべき乗（累乗は重み付き最近傍の近似数に対応）を使用し、記載の通り２１個の最近傍セルに従って計算された遺伝子発現分布を用いて実施した（ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０１７））。Ｐｈｅｎｏｇｒａｐｈ（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６２，１８４－１９７（２０１５））を使用して亜集団を同定し、少なくとも１つの亜集団で差次的に発現された遺伝子を、各亜集団由来の対応させた分子および細胞カウントのランダムダウンサンプリングのためのブートストラップ法を使用したクラスカル・ウォリス順位統計によって同定した。ｔ－分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を使用して、上位５，１５０個の差次的に発現した遺伝子（クラスカル・ウォリス順位統計の偽発見率（ＦＤＲ）ｑ＜０．０５）によってサブセット化された、帰属カウント行列の最初の２０個の主成分に基づく亜集団構造を視覚化した。集団Ｍ対他の亜集団の重要な遺伝子シグネチャーの平均発現をｚ－正規化し、バイオリンプロットで視覚化した。すべての遺伝子シグネチャーは、実施例１の最後近くに注釈が付けられている。遺伝子シグネチャー間の相関は、細胞１個あたりのシグネチャー１つあたりのすべての遺伝子の平均発現によるスピアマン順位相関係数を使用して計算した。Ｗａｒｄの最小分散法は、差次的に発現した上皮－間葉移行（ＥＭＴ）遺伝子の正規化された発現により、階層的クラスター細胞に適用した。
患者の生存分析
生存分析に使用される遺伝子としては、ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５（任意にＮＴＮ４）が挙げられる（表５を参照）。
２つの独立したデータセットを使用して、生存マーカーを評価した。１つ目は、メタ分析（Ｇｙｏｒｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１２３，７２５－７３１（２０１０））および検証コホート（Ｈａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．３０５，１８７３－１８８１（２０１１））であった。メタ分析には、ＫＭ－Ｐｌｏｔｔｅｒデータベース（ｗｗｗ．ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）に登録された公的に利用可能なマイクロアレイ遺伝子発現データセットを使用し、各遺伝子に次のマイクロアレイプローブを用いた（一部の遺伝子には複数の名前があり、別名が下記に列挙され得ることに留意されたい）：２１９１３２＿ａｔ（ＰＥＬＩ２）、２０５２８９＿ａｔ（ＢＭＰ２）、２０７５８６＿ａｔ（ＳＨＨ）、２３０３９８＿ａｔ（ＴＮＳ４）、２２７１２３＿ａｔ（ＲＡＢ３Ｂ）、２１３１９４＿ａｔ（ＲＯＢＯ１）、２２７９１１＿ａｔ（ＡＲＨＧＡＰ２８）、２１３３８５＿ａｔ（ＣＨＮ２）、２０６２２４＿ａｔ（ＣＳＴ１）、２０３３０５＿ａｔ（Ｆ１３Ａ１）、２０８１４６＿ｓ＿ａｔ（ＣＰＶＬ）、２２６４９２＿ａｔ（ＳＥＭＡ６Ｄ）、２０１４３１＿ｓ＿ａｔ（ＤＰＹＳＬ３）、２２８６４０＿ａｔ（ＰＣＤＨ７）、２０９７８１＿ｓ＿ａｔ（ｅｔｏｉｌｅ）、２１０９７２＿ｘ＿ａｔ（ＴＲＡ＠）、２２０１６９＿ａｔ（ＴＭＥＭ１５６）、２０６９９４＿ａｔ（ＣＳＴ４）、２６６＿ｓ＿ａｔ（ＣＤ２４）、２１０３１１＿ａｔ（ＦＧＦ５）、２００９４８＿ａｔ（ＭＬＦ２）。メタ分析のコホートには、ＪｅｔＳｅｔ最良プローブセットを使用し、自動選択は、２５ｔｈ～７５ｔｈパーセンタイル間の最良カットオフに使用した。ＤＭＦＳデータが利用可能な検証コホートには（Ｈａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ３０５，１８７３－１８８１（２０１１））、データセットのｚ－正規化した発現データおよび中央値をカットオフとして使用した。対数順位検定を使用して、ＤＭＦＳ曲線を比較した。最初のデータセットでは、３６パーセンタイルであると判定された最良カットオフ値を使用して、３６パーセンタイルの最下位にあるものを上回る遺伝子の累積発現を有する患者の無転移生存率がより高くなるようにした。第２のデータセットでは、次世代シーケンシングから得られた公的に登録された遺伝子発現データを使用し、中央発現値をカットオフ値として使用して、同様の結果を得た。このタイプの分析では、使用する患者集団およびアッセイに応じて、２５パーセンタイル～７５パーセンタイルの範囲のカットオフ値を使用するのが一般的であるため、これを含める必要がある。
インビトロ浸潤および遊走アッセイ
浸潤および遊走／走化性アッセイには、それぞれＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ細胞浸潤（ＣＢＡ－１１０）および細胞遊走（ＣＢＡ－１００）キットを使用した。簡単に言えば、３×１０５個の細胞を無血清培地に懸濁し、膜の上面に置いた。血清を含む培地を底部に置き、コラーゲン膜の下面に侵入した細胞を染色し、１８～２４時間後にカウントした。走化性アッセイでは、定量化に比色法（ＯＤ ５６０ｎｍ）を使用した。スクラッチアッセイでは、細胞をマイトマイシンＣ（１０μｇｍｌ－１）で１時間処理し、９０％超の集密に達した後、１％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に置いた。創傷は、ｐ２００ピペットチップを使用して適用し、創傷の画像を直ちに撮影し、その後定期的な間隔で撮影した。ＩｍａｇｅＪは、創傷表面積の定量化に使用した。
サイトゾルＤＮＡの定量化
およそ１×１０７個の細胞を溶解し、ミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ－８９８７４）を使用して、核、サイトゾル、およびミトコンドリア画分を得た。プロテアーゼ阻害物質は、その後のＤＮＡ精製を可能にするために使用しなかった。ミトコンドリアを１２，０００×ｇで精製して、サイトゾル画分の汚染を最小限に抑えた。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ－６９５０６）を使用して、核、サイトゾル、ミトコンドリア画分からＤＮＡを単離し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ試薬を使用するＱｕｂｉｔ ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｄｓＤＮＡを定量化した。
データ利用可能性
すべてのＲＮＡシーケンシングデータは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｒａ）に受託された。単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータは、次のアクセッション番号で寄託された：ＳＲＰ１０４７５０。バルクＲＮＡｓｅｑデータは、次のアクセッション番号で寄託された：ＳＲＰ１０４４７６。ウェブサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ－ｔｒａｃｅ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｒａ／ｒｅｖｉｅｗ／ＳＲＰ１０４４７６＿２０１７０４２４＿１００９１７＿３ｄ５２２ｄｅａｆ８５５７７４５１ｃ０１９７４６５４ｂ３６ａｄ３のリンクにアクセスされたい。
生存を評価判定するためのＣＩＮ遺伝子発現シグネチャー： ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、（任意にＮＴＮ４）。タンパク質の配列およびこれらのタンパク質をコードする核酸の例を表５に示す。
（表５）ＣＩＮ遺伝子発現シグネチャー遺伝子
Figure 0007197556000053
Figure 0007197556000054
Figure 0007197556000055
Figure 0007197556000056
Figure 0007197556000057
Figure 0007197556000058
Figure 0007197556000059
Figure 0007197556000060
Figure 0007197556000061
ＣＩＮ反応性非標準ＮＦ－ｋＢシグネチャー：
Figure 0007197556000062
＊太字の遺伝子は抑制された（生存およびＴＣＧＡ分析では負の値を使用した）。
非標準ＮＦ－ｋＢ調節遺伝子：
Figure 0007197556000063
＊太字の遺伝子は抑制された（生存分析では負の値を使用した）。
標準ＮＦ－ｋＢ調節遺伝子：
ＮＦＫＢ１、ＲｅｌＡ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６。
インターフェロン調節遺伝子
ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＴＢＫ１
上皮間葉転換（ＥＭＴ）の調節因子：ＶＩＭ、ＺＥＢ２、ＳＮＡＩ２、ＺＥＢ１。
炎症遺伝子：
ＲＧＳ１６、ＤＥＮＮＤ５Ａ、ＢＴＧ２、ＳＴＡＴ３、ＩＦＩＴＭ３、ＣＤ４７、ＳＬＡＭＦ７、ＲＥＬ、ＢＣＬ６、ＩＬ１８ＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＰＤＥ４Ｂ、
ＩＬ８、ＰＳＭＥ２、Ｐ２ＲＸ４、ＩＦＩ４４、ＣＣＲ７、ＫＬＦ１０、ＡＤＲＭ１、ＫＬＦ９、ＮＦＩＬ３、ＣＮＰ、ＬＤＬＲ、ＨＥＳ１、ＨＬＡ－Ａ、ＰＡＲＰ９、ＮＵＢ１、ＳＴＡＴ２、ＶＩＰ、ＴＧＩＦ１、ＰＶＲ、ＭＯＶ１０、ＰＳＭＡ２、ＥＩＦ４Ｅ３、ＩＥＲ３、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＴＲＡＦＤ１、ＭＹＤ８８、ＶＡＭＰ５、ＴＲＩＭ１４、ＴＵＢＢ２Ａ、ＢＰＧＭ、Ｂ２Ｍ、ＨＲＨ１、ＰＳＭＢ９、ＬＡＴＳ２、ＰＴＰＮ６、ＤＣＢＬＤ２、ＰＳＭＢ８、ＩＬ１Ｒ１、ＰＳＭＢ２、ＳＱＳＴＭ１、ＰＴＸ３、ＩＴＧＡ５、ＥＤＮ１、ＳＬＣ３１Ａ１、ＳＡＭＨＤ１、ＰＮＰＴ１、ＣＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＳＯＣＳ１、ＲＥＬＢ、ＶＥＧＦＡ、ＡＲＬ４Ａ、ＤＵＳＰ５、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤ３８、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＰ１１０、ＰＬＡＵ、ＤＤＸ５８、ＰＳＭＥ１、ＴＲＡＦ１、ＳＰＳＢ１、ＴＤＲＤ７、Ｆ２ＲＬ１、ＥＰＳＴＩ１、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＮＩＮＪ１、ＲＮＦ１９Ｂ、ＬＩＦ、ＲＩＰＫ１、ＳＬＣ２Ａ６、ＩＲＦ７、ＰＴＡＦＲ、ＩＲＡＫ２、ＣＤ１４、ＩＴＧＢ８、ＳＣＡＲＦ１、ＫＩＦ１Ｂ、ＦＯＳＬ２、ＳＯＣＳ３、ＤＵＳＰ１、ＩＲＦ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＨＢＥＧＦ、ＣＸＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＡＨＲ、ＳＧＭＳ２、ＦＺＤ５、ＧＣＨ１、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＯＳＭＲ、ＲＳＡＤ２、ＡＰＯＬ６、ＩＣＯＳＬＧ、ＪＡＧ１、Ｇ０Ｓ２、ＧＥＭ、ＫＬＦ４、ＮＦＫＢ１、ＳＴＡＴ１、ＨＬＡ－Ｃ、ＩＦＩＨ１、ＬＹ６Ｅ、ＥＦＮＡ１、ＳＬＣ１６Ａ６、ＢＨＬＨＥ４０、ＴＲＩＭ２６、ＣＤ８２、ＣＹＢＢ、ＩＬ１５ＲＡ、ＧＡＢＢＲ１、ＲＥＬＡ、ＰＨＬＤＡ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＮＵＰ９３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＰＲＥ、ＩＦＩ２７、ＳＮＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＲＨＯＧ、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１、ＩＬ６、ＩＬ１５、ＲＡＦ１、ＣＣＬ２０、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＩＲＣ２、ＲＢＣＫ１、ＬＡＰ３、ＩＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＳＩＫ１、ＢＳＴ２、ＰＡＮＸ１、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＰＭＬ、ＣＤ４０、ＴＲＩＭ２１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＳＰＮ、ＴＸＮＩＰ、ＢＴＧ１、ＡＲＥＧ、ＫＹＮＵ、ＰＴＧＳ２、ＩＲＳ２、Ｃ３ＡＲ１、ＳＴＡＴ４、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＩＲＣ３、ＭＡＰ２Ｋ３、ＣＸＣＬ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＩＦＮＡＲ１、ＭＥＴ、ＮＲ４Ａ１、ＣＸＣＬ２、ＥＢＩ３、ＣＤ８３、ＤＮＡＪＢ４、ＣＡＳＰ７、ＰＨＬＤＡ１、ＮＬＲＣ５、ＩＬ１Ｂ、ＴＲＩＭ２５、ＩＥＲ５、ＲＮＦ２１３、ＩＬ１０、ＮＦＡＴ５、ＡＤＡＲ、ＰＮＰ、ＭＭＰ１４、ＩＣＡＭ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＤＣ４、ＡＢＣＡ１、ＤＵＳＰ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＥＲ２、ＨＥＲＣ６、ＢＭＰ２、ＩＬ７、ＩＳＧ２０、ＧＭＰＲ、ＰＳＥＮ１、ＸＡＦ１、ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＭＴＨＦＤ２、ＥＲＥＧ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＭＥＭ１４０、ＫＤＭ６Ｂ、ＣＸＣＬ１１、ＣＡＳＰ１、ＣＹＲ６１、ＩＲＦ９、ＧＢＰ２、ＡＤＭ、ＴＲＩＰ１０、ＰＴＧＥＲ２、ＭＥＴＴＬ７Ｂ、ＳＯＤ２、ＯＡＳ２、ＣＳＦ３、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＭＸＤ１、ＩＣＡＭ１、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＢＣＬ３、ＰＦＫＦＢ３、ＯＧＦＲ、ＳＲＩ、ＩＦＮＡＲ２、ＦＵＴ４、ＩＬ６ＳＴ、ＴＮＩＰ２、ＤＵＳＰ４、ＰＲＯＣＲ、ＴＬＲ２、ＯＡＳＬ、ＪＡＫ２、Ｃ１Ｓ、ＮＭＩ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＬＡＭＰ３、ＴＲＩＢ１、ＴＩＰＡＲＰ、ＩＦＩＴ３、ＧＦＰＴ２、ＩＦＩ３０、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＦＡＭ４６Ａ、ＥＬＦ１、ＵＰＰ１、ＮＯＤ１、ＣＣＬ５、ＦＯＳ、ＶＡＭＰ８、ＲＴＰ４、ＴＰＢＧ、ＩＬ２３Ａ、ＢＥＳＴ１、ＣＥＢＰＢ、ＴＮＦＳＦ１５、ＳＣＮ１Ｂ、Ｐ２ＲＹ２、ＳＴＡＴ５Ａ、ＣＨＳＴ２、ＨＩＦ１Ａ、ＺＦＰ３６、ＫＬＦ２、ＬＰＡＲ１、ＥＨＤ１、ＰＬＳＣＲ１、ＰＤＬＩＭ５、ＯＡＳ１、ＣＸＣＬ１０、ＪＵＮＢ、ＰＦＫＰ、ＣＤ２７４、ＣＤ５５、ＴＮＦＳＦ９、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＥＴＳ２、ＯＡＳ３、ＣＡＳＰ８、ＩＳＧ１５、ＷＡＲＳ、ＳＬＣ７Ａ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＰＡＲＰ１４、ＦＡＳ、ＳＡＭＤ９、ＥＩＦ１、ＣＤ７４、ＴＯＲ１Ｂ、ＰＴＰＮ２、ＭＡＲＣＫＳ、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＬＹＳＭＤ２、ＡＴＦ３、ＦＯＳＢ、ＰＳＭＢ１０、ＩＳＯＣ１、ＰＳＭＡ３、ＩＦＮＧＲ２、ＳＭＡＤ３、ＲＩＰＫ２、ＭＡＲＣＨ１、ＤＨＸ５８、ＩＬ４Ｒ、ＴＲＩＭ５、ＬＩＴＡＦ、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＮＬＲＰ３、ＩＴＧＢ３、ＣＩＩＴＡ、ＩＦＩＴＭ１、ＰＩＭ１、ＢＴＧ３、ＣＤ４４、ＰＬＫ２、ＤＲＡＭ１、ＦＰＲ１、ＲＨＯＢ、ＥＧＲ１、ＧＮＡＩ３、Ｃ１Ｒ、ＮＣＯＡ３、ＰＡＲＰ１２、ＡＢＩ１、ＲＣＡＮ１、ＥＭＰ３、ＩＲＦ２、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＬＡＭＢ３、ＭＹＣ、ＡＴＰ２Ｂ１、ＹＲＤＣ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＮＤＰ、ＭＣＬ１、Ｆ３、ＭＴ２Ａ、ＩＦＩ４４Ｌ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＭＡＦＦ、ＦＪＸ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＩＬ１８、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＴＬＲ１、ＣＥＢＰＤ、ＧＮＡ１５、ＣＳＦ２、ＳＰＨＫ１、ＩＦＩ３５、ＬＹＮ、ＰＮＲＣ１、ＩＲＦ５、ＩＦＩＴＭ２、ＢＡＮＫ１、ＡＸＬ、ＫＬＦ６、ＰＴＧＥＲ４、ＣＡＳＰ３、ＰＭＥＰＡ１、ＴＮＣ、ＺＢＴＢ１０、ＰＣＤＨ７、ＣＣＲＬ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＣＮＬ１、ＰＥＲ１、ＴＬＲ３、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＣＬＣＦ１、ＭＶＰ、ＣＦＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＴＰＮ１、ＵＳＰ１８、ＮＦＫＢ２、ＣＡＳＰ４、ＴＮＦＡＩＰ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＦＩＴ１、ＥＭＲ１、ＣＦＬＡＲ、ＤＤＸ６０、ＩＤＯ１、ＣＦＨ、ＩＦＩＴ２、ＮＣＯＡ７、ＩＮＨＢＡ、ＴＩＭＰ１、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＭＸ１、ＡＴＰ２Ｃ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＰＥＬＩ１、ＴＡＰＢＰ、ＧＢＰ４、ＣＣＮＤ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＧＫ１、ＺＮＦＸ１、ＲＡＰＧＥＦ６、ＣＣＬ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＵＢＡ７、ＨＡＳ２、ＪＵＮ、ＳＬＣ１１Ａ２、ＦＯＳＬ１、ＳＥＬＬ、ＰＬＡＵＲ、ＢＡＴＦ２、ＴＮＦＡＩＰ８、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＴＡＮＫ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＭＸ２、ＴＡＰ１。
遊走および運動性遺伝子：
ＣＡＬＤ１、ＣＡＶ２、ＥＧＦＲ、ＦＮ１、ＩＴＧＢ１、ＪＡＧ１、ＭＳＮ、ＭＳＴ１Ｒ、ＮＯＤＡＬ、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＡＣ１、ＳＴＡＴ３、ＴＧＦＢ１、ＶＩＭ。
実施例２：ヒト転移における増加した染色体不安定性
この実施例は、染色体不安定性がヒト転移に関連していることを示す実験を記載する。
染色体不安定性がヒト転移に関連するかどうかを調べるために、１３種類の腫瘍を含む６１個の原発性腫瘍の全エクソーム配列データを比較し、最近公開されたコホート由来のデータを使用して脳転移と対応させた（Ｂｒａｓｔｉａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５，１１６４－１１７７（２０１５））。これらのデータは、加重ゲノム整合性インデックス（ｗＧＩＩ）をゲノムプロキシとして使用して、染色体不安定性について再分析した。ｗＧＩＩは、平均腫瘍倍数性から逸脱するゲノムのパーセンテージを測定することにより、コピー数の不均一性を評価判定する（Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４９４，４９２－４９６（２０１３））。転移が、対応させた原発性腫瘍と比較してより高いｗＧＩＩスコアを有する可能性が高い、有意なバイアスがあった（図１Ａ～１Ｂ－１から１Ｂ－４、１Ｈ）。
第２のアプローチを使用して、染色体転座のＭｉｔｅｌｍａｎデータベースにアーカイブされた６３７個の原発性***腫瘍および１３１個の乳がん転移から核型情報を分析した（Ｍｉｔｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｗｅｂｓｉｔｅ ａｔ ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ／Ｍｉｔｅｌｍａｎ）。原発性***腫瘍は、単一細胞核型分析で明らかにされているように、より多くのクローンを含んでいたが、正常なほぼ二倍体（２ｎ）の核型に対して強い傾向を示した。一方、乳がんの転移に由来する試料は、三倍に近い（３ｎ）核型の有意なエンリッチメントを示し、平均して、原発性腫瘍と比較して１クローンあたり２倍多くの染色体異常を有していた（図１Ｃ～１Ｅ）。三倍体に近い核型は、染色体不安定性が最大化される収束最適化進化状態を表すと仮定されている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４１３－４２１（２０１２）、Ｌａｕｇｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２，８０９－８２０（２０１５）、Ｓｔｏｒｃｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２１，３８５９－３８６６（２００８））。したがって、染色体異常の数は、核型が２倍体～４倍体（４ｎ）の範囲の腫瘍試料で最も高かった（図１Ｉ）。
第３のアプローチを使用して、診断時のリンパ節転移に関する臨床データが得られた局所進行頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）を有する患者から採取した原発性腫瘍試料のデータを分析した（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５，４８９－５００（２００４））。染色体不安定性の動的な性質の尺度として、後期を経て固定された細胞の染色体分離の完全性を直接評価判定した（Ｂａｋｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７，７７０４－７７１１（２０１１））。通常分離している染色体間のクロマチンの存在は、染色体誤分離の証拠として見なされた（図１Ｆ）。リンパ節転移を伴う原発性腫瘍は、リンパ節拡散のない腫瘍と比較して、染色体誤分離率が高かった。同様に、腫瘍が高い染色体誤分離率を示した患者は、臨床的に関与するリンパ節転移を示す可能性が高かった（図１Ｆ、１Ｊ）。これらの３つの直交アプローチを使用して、染色体不安定性はヒト転移においてエンリッチされ、原発性腫瘍に存在する場合、より高い拡散の傾向に関連していると結論付ける。
実施例３：染色体不安定性は転移を促進する
染色体不安定性が転移に原因として関与しているかどうかを判定するために、本発明者らは、ヒトＴＮＢＣ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）および肺腺がん（Ｈ２０３０）の移植可能な腫瘍モデルにおける染色体誤分離の速度を変更するための遺伝的アプローチを考案した（Ｂａｋｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，２７－３５（２００９）、Ｂａｋｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６，５９９０（２０１５））。これらの高度に転移した腫瘍モデル由来の細胞は、それぞれ後期細胞の４７％と６７％の高い染色体不安定性の基礎率を示し、後期中の染色体分離エラーの証拠を示す（図２Ａ、２Ｂ－１～２Ｂ－２）。摂動のない染色体分離率を有するこれらの細胞は、ＣＩＮ－培地細胞と称される。これらの細胞中のＫｉｆ２ｂまたはＭＣＡＫ／Ｋｉｆ２ｃの過剰発現は、染色体分離エラー（ＣＩＮ－低細胞と称される）の大幅な抑制につながった。逆に、ＭＣＡＫ２４のドミナントネガティブ型（ｄｎＭＣＡＫ）の過剰発現は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中の染色体分離エラーのさらなる増加をもたらし、ＣＩＮ－高と称される（図２Ｂ－１～２Ｂ－２、図１Ｌ）。キネシン－１３タンパク質の過剰発現は、培養中の細胞増殖速度または細胞１個あたりの中心体の数を変えなかった（図１Ｋ、１Ｍ）。重要な対照として、Ｋｉｆ２ａが過剰発現した。Ｋｉｆ２ａは、動原体またはセントロメア局在ドメインを欠く微小管脱重合キネシン－１３タンパク質の第３のメンバーである（Ｅｍｓ－ＭｃＣｌｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１、２７６－２８２（２０１０））。Ｋｉｆ２ａ過剰発現は、Ｋｉｆ２ｂおよびＭＣＡＫに類似した間期微小管上で微小管解重合活性を示したにもかかわらず、染色体不安定性に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ－１および２Ｂ－２）。
親ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の核型分析は、染色体が不安定な細胞株から予想されるように、広く異数性（三倍体に近い）染色体含量を明らかにし、核型の著しい異質性ならびに染色体の異常を示した（図２Ｆ－１～２Ｆ－２）。これらの細胞の染色体不安定性の抑制は、ＣＩＮ－中またはＣＩＮ－高と比較してＣＩＮ－低細胞中のより少ないネオ染色体（非クローン構造異常を示す染色体）の存在によって証明されるように、単一細胞由来クローンの核型不均一性の低減につながった（図２Ｇ～２Ｉ）。例えば、２２番染色体は他の染色体と融合し、同じＫｉｆ２ａを発現するクローン集団内の異なる細胞内でユニークな染色体の組み合わせをもたらし（図２Ｊ）、染色体不安定性によって与えられる収束的核型の進化を示す。逆に、そのような事象は、ＣＩＮ－低クローンではまれであった。それにもかかわらず、ＣＩＮ－低細胞は、非常に異数性の核型を維持したが、これらの異常な核型を安定した方法で忠実に増殖させた（図２Ｇ、２Ｉ）。染色体的に安定な異数体細胞を染色体的に不安定な異数体の対応物と比較することにより、異数性とは無関係に、転移における染色体不安定性の役割を実験的に調べることができる。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を無胸腺マウスの左心室に直接注射して、全身播種を可能にした（図３Ｊ－１および３Ｊ－２、０日目）。次いで、生物発光レポーターアッセイを使用して、転移コロニー形成を追跡した。実験的に染色体誤分離率を変えると、転移コロニー形成に劇的な影響があり、これによりＣＩＮ－高細胞を宿したマウスは、注射後６０日以内に急速に広範囲の病気に陥り、脳、骨、肺、副腎、および軟部組織に転移が存在していた。逆に、ＣＩＮ－低細胞を注射したマウスは、著しく低い転移性腫瘍量を示し、中央生存期間は２０７日間で、一部は２９０日間超生存していた（図２Ｃ～２Ｅ、３Ｊ）。一部の動物では、ＣＩＮ－低転移が増減し、時には自然に消散したが、ＣＩＮ－高転移は複数の臓器に関与し、急速に進行して死に至り（図３Ｊ－１および３Ｊ－２）、転移の開始および維持における染色体不安定性の潜在的な役割を示す。肺腺がんＨ２０３０細胞の脳室内注射後、同様の結果が得られた（図３Ｋ）。
原発性腫瘍状況から始まる転移における染色体不安定性の役割を評価判定するために、乳腺脂肪体に同所性のＭＤＡ－ＭＢ－２３１注射を行い、その後、原発性腫瘍の外科的切除を行って転移播種の時間を確保した（図３Ｌ、実施例１で記載されている方法を参照）。ＣＩＮ－低、ＣＩＮ－中、およびＣＩＮ－高の両方の腫瘍は、触知可能な腫瘍を同様の比率で形成することができたため、染色体不安定性状態は、原発性腫瘍の移植効率を顕著に変えなかったが（図示せず）、ＣＩＮ－高細胞を同所性に注射したマウスは、ＣＩＮ－低腫瘍細胞を注射した動物と比較して有意に短い遠隔無転移生存（ＤＭＦＳ）（図３Ｍ）を示した。まとめると、これらの結果は、染色体不安定性が腫瘍転移における重要な因子であり、染色体不安定性を抑制することにより、非常に異常で異数性の細胞においても転移能を低減することを示す。
腫瘍播種中の染色体不安定性に関する選択ダイナミクスを評価するために、本発明者らは、注入された細胞中、ならびに原発性腫瘍または転移性コロニーに由来する細胞（継代１）中の染色体誤分離を評価判定した（図３Ｊ－１および３Ｊ－２）。この分析は、２つの乳がんサブタイプ：ＥＲ＋およびＴＮＢＣに属する２つの転移適格患者由来異種移植片（ＰＤＸ）において最初に実施した（実施例１を参照）。両方のＰＤＸ腫瘍モデルにおいて、同所移植された原発性腫瘍に由来する細胞は、同じ動物に由来する対応させた転移と比較して、低い染色体誤分離率を有していた（図３Ｂ）。次いで、この分析をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を使用して繰り返し、注入された細胞の染色体不安定性状態に関係なく、注射された細胞と比較して有意に高い染色体誤分離率を有する細胞に対して、転移の大部分がエンリッチされたことがわかった（図３Ｃ～３Ｅ）。逆に、ほとんどの原発性腫瘍に由来する細胞は、注射された細胞と比較して、染色体誤分離率が有意に低かった（図３Ｄ～３Ｅ）。ＣＩＮ－高細胞を乳腺脂肪体に注射すると（図３ｅ、左端のバー）、原発性腫瘍で染色体誤分離率が大幅に減少した後（図３Ｅ、「原発性」とラベル付けされたバー）、同じ動物において自然に発生する転移で再び増加した（図３Ｅ、「転移」とラベル付けされた対応するバー）。これらの結果は、染色体不安定性から生じる急速なゲノム可塑性の可能性を明らかにし、転移の進化中の高い染色体誤分離率に対する強い選択圧を示す。
実施例４：染色体不安定性は間葉形質をエンリッチする
染色体不安定性への反応における細胞変化を調べるために、ＣＩＮ－低、ＣＩＮ－中、およびＣＩＮ－高 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のバルクＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施し、ＣＩＮ－低をＣＩＮ－中／高と比較したときに、１，５８４個の差次的に発現された遺伝子を見出した（図３Ｆ）。遺伝子発現の主成分分析（ＰＣＡ）は、染色体不安定性の状態に応じて試料を正確に分離した（図４Ｆ）。遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）は、転移関連の遺伝子セットが、ＣＩＮ－低（図３Ｇ）と比較してＣＩＮ－中／高細胞で最も高度にエンリッチされていることを明らかにし、染色体誤分離が転移において観察されるものと同様の転写変化を誘導することを示す。実際、ＣＩＮ－低と比較してＣＩＮ－中／高の上位２３個の差次的に発現された遺伝子は、メタ分析（Ｇｙｏｒｆｆｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１２３，７２５－７３１（２０１０））ならびに検証コホート（Ｈａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ３０５，１８７３－１８８１（２０１１））（図３Ｈ～３Ｉ）において遠隔無転移生存（ＤＭＦＳ）を予測したときに、ヒト乳がん患者において高度に予測的であった。
高い発現予測が乳がんにおける遠隔無転移生存を増加させたこの一覧の２３個の遺伝子は、染色体不安定性（ＣＩＮ）シグネチャーと称され、ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、およびＮＴＮ４の高い発現を含む。そのような予測力は、腫瘍のサブタイプ、グレード、およびリンパ節の状態にわたって大部分が保たれていた。例えば、２３の遺伝子の染色体不安定性（ＣＩＮ）シグネチャーは、ＣＩＮ－低患者が、リンパ節転移陰性、リンパ節転移陽性、グレード２、グレード３、グレード１／２、グレード３、ＥＲ＋、ＥＲ－、およびＨｅｒ２＋乳がんを含む様々な乳がんを有するＣＩＮ－高患者と比較して、遠隔無転移生存率を増加させたことを正確に同定した。
上皮間葉（ＥＭＴ）転写プログラムもまた、ＣＩＮ中／高細胞中で高度にエンリッチされた（図４Ｇ）。染色体不安定性が細胞の不均一性にどのように影響するかをさらに理解するために、２つのＣＩＮ低ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株（Ｋｉｆ２ｂおよびＭＣＡＫ）および合計６，８２１個の細胞を含む１つのＣＩＮ－高細胞株（ｄｎＭＣＡＫ）においてビーズベースの分子バーコード技術（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６１，１１８７－１２０１（２０１５））を使用して、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した。単一細胞ライブラリーのサイズは、試料間で一貫していた。重要なＥＭＴ遺伝子を使用した単一細胞のクラスター化は、それらのＣＩＮステータスに基づいてほとんどの細胞を正常に分類し、ビメンチンおよびＺＥＢ１などの重要なＥＭＴ調節因子を含む間葉系マーカーが非常に豊富な細胞の画分を明らかにした。この画分は、主にＣＩＮ－高細胞を発現するｄｎＭＣＡＫで構成されていた（図４Ａ）。逆に、ＣＩＮ－低細胞は、上皮マーカーにおいて非常に豊富であった。
次いで、すべての遺伝子に基づく教師なしグラフベースのクラスタリング（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６２，１８４－１９７（２０１５））を用いて、偏りのない方法で内因性亜集団を同定した。上皮間葉転換（ＥＭＴ）および転移に関与する遺伝子の発現の増加を示す亜集団（亜集団「Ｍ」と称される）が同定され、染色体不安定性（ＣＩＮ）遺伝子シグネチャーについて同時にエンリッチされた。亜集団Ｍは、ＣＩＮ－低細胞のわずか６％と比較して、それぞれ全ｄｎＭＣＡＫ発現細胞の４５％を含んでいた（図４Ｂ、図６Ｉ～６Ｊ）。
これらの結果は、高解像度蛍光顕微鏡を使用して実験的に検証され、これによりｄｎＭＣＡＫを発現する細胞が、アクチン細胞骨格の再編成を示すより長い特徴（幅に対する長さの比によって定義される）を有することがわかった。それらはまた、びまん性ビメンチン染色およびＭＣＡＫ発現細胞の細胞間接合部からｄｎＭＣＡＫ発現細胞の細胞質および核へのβ－カテニンの局在の変化などの、間葉性特性を示した（図４Ｃ、図７Ｃ～７Ｄ）。したがって、高レベルの染色体不安定性を有する細胞は、遊走能力の増加を示し、インビトロでコラーゲン基底膜を通って有意により侵襲性であった（図４Ｄ、図７Ｅ～７Ｆ）。まとめると、これらの結果は、染色体不安定性が転移プロセスを促進する細胞自律的侵襲プログラムを促進することを示している。
実施例５：染色体不安定性により誘導される細胞内因性炎症
この実施例は、染色体不安定性が内因性炎症を誘発することを示す。
染色体不安定性反応経路をさらに明らかにするために、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して遺伝子間ピアソン相関分析を実行し、２つの大きな遺伝子モジュールを同定した。モジュール２は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）および多数の炎症経路に関与する遺伝子を含んでいた（図５Ａ）。
実施例１に記載されるように、ＥＭＴ遺伝子は、ＶＩＭ、ＺＥＢ２、ＳＮＡＩ２、およびＺＥＢ１を含む。炎症経路遺伝子としては、ＲＧＳ１６、ＤＥＮＮＤ５Ａ、ＢＴＧ２、ＳＴＡＴ３、ＩＦＩＴＭ３、ＣＤ４７、ＳＬＡＭＦ７、ＲＥＬ、ＢＣＬ６、ＩＬ１８ＢＰ、ＮＡＭＰＴ、ＰＤＥ４Ｂ、ＩＬ８、ＰＳＭＥ２、Ｐ２ＲＸ４、ＩＦＩ４４、ＣＣＲ７、ＫＬＦ１０、ＡＤＲＭ１、ＫＬＦ９、ＮＦＩＬ３、ＣＮＰ、ＬＤＬＲ、ＨＥＳ１、ＨＬＡ－Ａ、ＰＡＲＰ９、ＮＵＢ１、ＳＴＡＴ２、ＶＩＰ、ＴＧＩＦ１、ＰＶＲ、ＭＯＶ１０、ＰＳＭＡ２、ＥＩＦ４Ｅ３、ＩＥＲ３、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＴＲＡＦＤ１、ＭＹＤ８８、ＶＡＭＰ５、ＴＲＩＭ１４、ＴＵＢＢ２Ａ、ＢＰＧＭ、Ｂ２Ｍ、ＨＲＨ１、ＰＳＭＢ９、ＬＡＴＳ２、ＰＴＰＮ６、ＤＣＢＬＤ２、ＰＳＭＢ８、ＩＬ１Ｒ１、ＰＳＭＢ２、ＳＱＳＴＭ１、ＰＴＸ３、ＩＴＧＡ５、ＥＤＮ１、ＳＬＣ３１Ａ１、ＳＡＭＨＤ１、ＰＮＰＴ１、ＣＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＳＯＣＳ１、ＲＥＬＢ、ＶＥＧＦＡ、ＡＲＬ４Ａ、ＤＵＳＰ５、ＣＭＫＬＲ１、ＣＤ３８、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＰ１１０、ＰＬＡＵ、ＤＤＸ５８、ＰＳＭＥ１、ＴＲＡＦ１、ＳＰＳＢ１、ＴＤＲＤ７、Ｆ２ＲＬ１、ＥＰＳＴＩ１、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＮＩＮＪ１、ＲＮＦ１９Ｂ、ＬＩＦ、ＲＩＰＫ１、ＳＬＣ２Ａ６、ＩＲＦ７、ＰＴＡＦＲ、ＩＲＡＫ２、ＣＤ１４、ＩＴＧＢ８、ＳＣＡＲＦ１、ＫＩＦ１Ｂ、ＦＯＳＬ２、ＳＯＣＳ３、ＤＵＳＰ１、ＩＲＦ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＨＢＥＧＦ、ＣＸＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＡＨＲ、ＳＧＭＳ２、ＦＺＤ５、ＧＣＨ１、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＯＳＭＲ、ＲＳＡＤ２、ＡＰＯＬ６、ＩＣＯＳＬＧ、ＪＡＧ１、Ｇ０Ｓ２、ＧＥＭ、ＫＬＦ４、ＮＦＫＢ１、ＳＴＡＴ１、ＨＬＡ－Ｃ、ＩＦＩＨ１、ＬＹ６Ｅ、ＥＦＮＡ１、ＳＬＣ１６Ａ６、ＢＨＬＨＥ４０、ＴＲＩＭ２６、ＣＤ８２、ＣＹＢＢ、ＩＬ１５ＲＡ、ＧＡＢＢＲ１、ＲＥＬＡ、ＰＨＬＤＡ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＮＵＰ９３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＰＲＥ、ＩＦＩ２７、ＳＮＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＲＨＯＧ、ＳＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ１、ＩＬ６、ＩＬ１５、ＲＡＦ１、ＣＣＬ２０、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＢＩＲＣ２、ＲＢＣＫ１、ＬＡＰ３、ＩＤ２、ＴＮＦＳＦ１０、ＳＩＫ１、ＢＳＴ２、ＰＡＮＸ１、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＰＭＬ、ＣＤ４０、ＴＲＩＭ２１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＳＰＮ、ＴＸＮＩＰ、ＢＴＧ１、ＡＲＥＧ、ＫＹＮＵ、ＰＴＧＳ２、ＩＲＳ２、Ｃ３ＡＲ１、ＳＴＡＴ４、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＩＲＣ３、ＭＡＰ２Ｋ３、ＣＸＣＬ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＩＦＮＡＲ１、ＭＥＴ、ＮＲ４Ａ１、ＣＸＣＬ２、ＥＢＩ３、ＣＤ８３、ＤＮＡＪＢ４、ＣＡＳＰ７、ＰＨＬＤＡ１、ＮＬＲＣ５、ＩＬ１Ｂ、ＴＲＩＭ２５、ＩＥＲ５、ＲＮＦ２１３、ＩＬ１０、ＮＦＡＴ５、ＡＤＡＲ、ＰＮＰ、ＭＭＰ１４、ＩＣＡＭ４、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＳＤＣ４、ＡＢＣＡ１、ＤＵＳＰ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＩＥＲ２、ＨＥＲＣ６、ＢＭＰ２、ＩＬ７、ＩＳＧ２０、ＧＭＰＲ、ＰＳＥＮ１、ＸＡＦ１、ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＭＴＨＦＤ２、ＥＲＥＧ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＭＥＭ１４０、ＫＤＭ６Ｂ、ＣＸＣＬ１１、ＣＡＳＰ１、ＣＹＲ６１、ＩＲＦ９、ＧＢＰ２、ＡＤＭ、ＴＲＩＰ１０、ＰＴＧＥＲ２、ＭＥＴＴＬ７Ｂ、ＳＯＤ２、ＯＡＳ２、ＣＳＦ３、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＭＸＤ１、ＩＣＡＭ１、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＢＣＬ３、ＰＦＫＦＢ３、ＯＧＦＲ、ＳＲＩ、ＩＦＮＡＲ２、ＦＵＴ４、ＩＬ６ＳＴ、ＴＮＩＰ２、ＤＵＳＰ４、ＰＲＯＣＲ、ＴＬＲ２、ＯＡＳＬ、ＪＡＫ２、Ｃ１Ｓ、ＮＭＩ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＬＡＭＰ３、ＴＲＩＢ１、ＴＩＰＡＲＰ、ＩＦＩＴ３、ＧＦＰＴ２、ＩＦＩ３０、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＦＡＭ４６Ａ、ＥＬＦ１、ＵＰＰ１、ＮＯＤ１、ＣＣＬ５、ＦＯＳ、ＶＡＭＰ８、ＲＴＰ４、ＴＰＢＧ、ＩＬ２３Ａ、ＢＥＳＴ１、ＣＥＢＰＢ、ＴＮＦＳＦ１５、ＳＣＮ１Ｂ、Ｐ２ＲＹ２、ＳＴＡＴ５Ａ、ＣＨＳＴ２、ＨＩＦ１Ａ、ＺＦＰ３６、ＫＬＦ２、ＬＰＡＲ１、ＥＨＤ１、ＰＬＳＣＲ１、ＰＤＬＩＭ５、ＯＡＳ１、ＣＸＣＬ１０、ＪＵＮＢ、ＰＦＫＰ、ＣＤ２７４、ＣＤ５５、ＴＮＦＳＦ９、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＥＴＳ２、ＯＡＳ３、ＣＡＳＰ８、ＩＳＧ１５、ＷＡＲＳ、ＳＬＣ７Ａ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＰＡＲＰ１４、ＦＡＳ、ＳＡＭＤ９、ＥＩＦ１、ＣＤ７４、ＴＯＲ１Ｂ、ＰＴＰＮ２、ＭＡＲＣＫＳ、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＬＹＳＭＤ２、ＡＴＦ３、ＦＯＳＢ、ＰＳＭＢ１０、ＩＳＯＣ１、ＰＳＭＡ３、ＩＦＮＧＲ２、ＳＭＡＤ３、ＲＩＰＫ２、ＭＡＲＣＨ１、ＤＨＸ５８、ＩＬ４Ｒ、ＴＲＩＭ５、ＬＩＴＡＦ、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＮＬＲＰ３、ＩＴＧＢ３、ＣＩＩＴＡ、ＩＦＩＴＭ１、ＰＩＭ１、ＢＴＧ３、ＣＤ４４、ＰＬＫ２、ＤＲＡＭ１、ＦＰＲ１、ＲＨＯＢ、ＥＧＲ１、ＧＮＡＩ３、Ｃ１Ｒ、ＮＣＯＡ３、ＰＡＲＰ１２、ＡＢＩ１、ＲＣＡＮ１、ＥＭＰ３、ＩＲＦ２、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＬＡＭＢ３、ＭＹＣ、ＡＴＰ２Ｂ１、ＹＲＤＣ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＮＤＰ、ＭＣＬ１、Ｆ３、ＭＴ２Ａ、ＩＦＩ４４Ｌ、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＭＡＦＦ、ＦＪＸ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＩＬ１８、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＴＬＲ１、ＣＥＢＰＤ、ＧＮＡ１５、ＣＳＦ２、ＳＰＨＫ１、ＩＦＩ３５、ＬＹＮ、ＰＮＲＣ１、ＩＲＦ５、ＩＦＩＴＭ２、ＢＡＮＫ１、ＡＸＬ、ＫＬＦ６、ＰＴＧＥＲ４、ＣＡＳＰ３、ＰＭＥＰＡ１、ＴＮＣ、ＺＢＴＢ１０、ＰＣＤＨ７、ＣＣＲＬ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＣＮＬ１、ＰＥＲ１、ＴＬＲ３、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＣＬＣＦ１、ＭＶＰ、ＣＦＢ、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＴＰＮ１、ＵＳＰ１８、ＮＦＫＢ２、ＣＡＳＰ４、ＴＮＦＡＩＰ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＦＩＴ１、ＥＭＲ１、ＣＦＬＡＲ、ＤＤＸ６０、ＩＤＯ１、ＣＦＨ、ＩＦＩＴ２、ＮＣＯＡ７、ＩＮＨＢＡ、ＴＩＭＰ１、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＭＸ１、ＡＴＰ２Ｃ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＰＥＬＩ１、ＴＡＰＢＰ、ＧＢＰ４、ＣＣＮＤ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＧＫ１、ＺＮＦＸ１、ＲＡＰＧＥＦ６、ＣＣＬ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＵＢＡ７、ＨＡＳ２、ＪＵＮ、ＳＬＣ１１Ａ２、ＦＯＳＬ１、ＳＥＬＬ、ＰＬＡＵＲ、ＢＡＴＦ２、ＴＮＦＡＩＰ８、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＴＡＮＫ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＭＸ２、およびＴＡＰ１が挙げられる。
染色体不安定性シグネチャー遺伝子としては、ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、ＦＧＦ５、およびＮＴＮ４が挙げられる。発現の上昇が乳がんの遠隔無転移生存率の増加を予測する２３個の遺伝子のこの一覧は、これらの遺伝子の発現の上昇が検出された場合、染色体不安定性（ＣＩＮ）シグネチャーと称される。
炎症関連遺伝子、染色体不安定性シグネチャー遺伝子、およびＥＭＴ遺伝子の間に有意な相関があり、それらはすべて亜集団Ｍで高度にエンリッチされていた（図４Ｂ、黒い四角、図５Ｂ）。バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータはまた、染色体不安定性－中／高細胞における炎症反応およびＴＮＦ－α／ＮＦ－κＢ経路に関与する遺伝子の有意なエンリッチメントを明らかにした（図４Ｈ）。これらのデータは、染色体不安定性と腫瘍細胞固有の炎症との間に関係が存在する可能性があることを示している。
インビボ移植前であっても、染色体不安定性に反応した細胞内因性炎症の誘導は予想外であり、ウイルス感染を連想させる。次いで、本発明者らは、染色体不安定性がサイトゾルにゲノムＤＮＡを導入することにより細胞炎症を誘発し、したがって、抗ウイルス免疫のために通常備えられた内因性細胞炎症を惹起するかどうかを尋ねた。
原発性腫瘍と比較して転移病変に由来する細胞を比較したときに見られるように、染色体不安定性－中／高は、より高い小核の優位性を示した。染色体誤分離と小核の頻度との間には、全体的に有意な相関があった（図５Ｃ～５Ｅ、図８Ａ～８Ｃ）。
破裂傾向のある小核の存在が、サイトゾルＤＮＡの生成に寄与しているかどうかを判定するために、選択的な細胞膜透過処理後、２つの異なる抗ｄｓＤＮＡ抗体を使用して細胞を染色した。各場合において、ｄｎＭＣＡＫを発現する細胞は、低レベルの染色体不安定性を示す細胞と比較して、サイトゾルｄｓＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の有意に増加したレベルを示した（図５Ｇ）。ミトコンドリア染色とは異なるｄｓＤＮＡシグナルは、二本鎖特異的なヌクレアーゼ、つまり一本鎖特異的ではないヌクレアーゼでの処理後、およびＤｎアーゼ２の過剰発現後に消失し、これらの抗体の特異性を確認した（図５Ｈ）。
細胞内画分後のｄｓＤＮＡレベルの直接定量化により、中～高レベルの染色体不安定性を示す細胞（ＣＩＮ－中／高細胞、図５Ｇ）と比較して、低レベルの染色体不安定性を示す細胞のサイトゾルＤＮＡが４倍低減することが明らかになった。最後に、細胞内画分の３０倍のカバレッジでの全ゲノムシーケンシングは、サイトゾルＤＮＡのゲノム起源を確認した（図示せず）。サイトゾルｄｓＤＮＡが小核の破裂から生じることをさらに確認するために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ラミンＢ２は、小核エンベロープを安定化する手段として過剰発現され（Ｈａｔｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，４７－６０（２０１３））、細胞を観察して、ラミンＢ２を過剰発現する細胞においてサイトゾルｄｓＤＮＡ染色の選択的低減があったかどうかを確認した（図５Ｉ）。まとめると、これらの結果は、染色体不安定性が、小核の破裂を通じてゲノム起源のサイトゾルＤＮＡを誘導することを示す。
実施例６：サイトゾルＤＮＡ反応からの転移
この実施例は、サイトゾルへのＤＮＡの曝露が、がん細胞の転移につながり得ることを示す。
サイトゾルｄｓＤＮＡは、ウイルス感染と戦うために使用されるＩ型インターフェロンシグナル伝達の誘導につながる明確なシグナル伝達経路を惹起する。染色体不安定性細胞におけるサイトゾルｄｓＤＮＡの下流の影響を調べるために、サイトゾルＤＮＡの重要なセンサーである環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）について細胞を染色した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，７８６－７９１（２０１３））。ｃＧＡＳは、染色体不安定性のレベルに関係なく存在するすべての小核のおよそ半分に顕著な局在を示した（図６Ａ～６Ｂ）。
ｃＧＡＳ＋小核は、選択的血漿膜透過処理後に抗ｄｓＤＮＡ抗体を使用して陽性染色されたが、ｃＧＡＳ－小核は染色されなかった（図６Ａ）。さらに、ラミンＢ２の過剰発現による小核エンベロープの安定化（Ｈａｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，４７－６０（２０１３））は、ｃＧＡＳ染色により小核の相対画分を大幅に減少させた（図６Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ｃＧＡＳによるサイトゾルＤＮＡの感知には小核の破裂が必要であることを示している。そして、染色体不安定性は、それ自体が小核の完全性に影響を与えないが、細胞１個あたりの小核の総数を増やし、結果としてｃＧＡＳ活性化の確率を高める（図５Ｃ～５Ｅ、図６Ａ～６Ｂ）。
ｃＧＡＳは、２’３’－環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）の形成を触媒し、これがインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ、ＴＭＥＭ１７３としても知られている）を活性化し、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する。ＣＩＮ－高細胞中でＳＴＩＮＧタンパク質レベルの増加が観察された（図６Ｃ）。しかしながら、ｐ６５またはＩＲＦのリン酸化に有意な変化がないこと、ならびに核移行がないことによって証明されるように、下流のインターフェロン調節因子または標準ＮＦ－κＢ経路の活性化の証拠はなかった（図６Ｃ）。これは、がん細胞がサイトゾルＤＮＡセンシングの下流でインターフェロン産生を抑制するという観察と一致している（Ｓｔｅｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３４，５８７－５９８（２００８）、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０，５６８－５７１（２０１５））。しかしながら、サイトゾルＤＮＡは、ＳＴＩＮＧ依存的およびＴＢＫ１非依存的な方法で非標準ＮＦ－κＢ経路を活性化することができる（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８，５３２８－５３４１（２０１４））。
中～高レベルの染色体不安定性を示す細胞（ＣＩＮ－中／高細胞）中で、非標準ＮＦ－κＢ経路の活性化の証拠が観察された。これらの細胞は、非標準経路の活性化に沿って、ｐ１００プール全体と比較して、非標準ＮＦ－κＢ前駆体タンパク質ｐ１００のレベルが低く、リン酸化ｐ１００およびその切断産物ｐ５２の量が増加していた（図６Ｃ～６Ｄ）。また、非標準のＮＦ－κＢ経路阻害物質であるＴＲＡＦ２のレベルが大幅に低減した（図６Ｃ）。中～高レベルの染色体不安定性を示すＣＩＮ－中／高細胞細胞において、ｐ５２の結合パートナーであるＲｅｌＢの核移行が観察された（図６Ｅ）。
興味深いことに、ＳＴＩＮＧの枯渇により、非標準ＮＦ－κＢの活性化とＲｅｌＢ核移行が廃止され、ＴＮＦ－α／ＮＦ－κＢならびに他の炎症およびＥＭＴ経路における負のエンリッチメントと関連していた（図６Ｄ～６Ｅ）。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータは、多数の非標準ＮＦ－κＢ標的遺伝子を明らかにし、これらは染色体不安定性に反応して上方制御された（したがって、ＰＰＡＲＧ、ＤＤＩＴ３、ＮＵＰＲ１、ＲＡＢ３Ｂ、ＩＧＦＢＰ４、ＬＲＲＣ８Ｃ、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＭＡＦＫ、ＮＲＧ１、Ｆ２Ｒ、ＫＲＴ１９、ＣＴＧＦ、ＺＦＣ３Ｈ１、ＭＡＣＲＯＤ１、ＧＳＴＡ４、ＳＣＮ９Ａ、ＢＤＮＦ、ＬＡＣＴＢを含むＣＩＮ反応性ＮＣ－ＮＦ－κＢ遺伝子と称される）。同様に、単一細胞分析は、染色体不安定性シグネチャー遺伝子とＣＩＮ反応性ＮＣ－ＮＦ－κＢ遺伝子の間に有意な相関があることを示した（図４Ｂおよび図５Ｂ）。
染色体不安定性シグネチャー遺伝子と独立したデータセット内のＣＩＮ反応性ＮＣ－ＮＦ－κＢ遺伝子との関係を検証するために、ＴＣＧＡ乳がんデータベースからＲＮＡ－ｓｅｑデータを分析した。ＣＩＮ－シグネチャー遺伝子のレベルが高い腫瘍において、ＣＩＮ反応性ＮＣ－ＮＦ－κＢ遺伝子の有意な上方調節が観察された（図６Ｆ）。さらに、非標準ＮＦ－κＢ経路の重要な調節因子またはそのＣＩＮ反応性標的遺伝子のより高い発現は、乳がんおよび肺がんにおけるより短いＤＭＦＳおよび無病生存率と関連していた。逆に、標準的なＮＦ－κＢ経路（ＮＦＫＢ１、ＲｅｌＡ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６）またはインターフェロン調節因子（ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＴＢＫ１）の上方調節は、予後の改善に関連していた（図９）。
まとめると、これらのデータは、染色体不安定性が、非標準ＮＦ－κＢ経路の選択的活性化として現れるサイトゾルｄｓＤＮＡ反応を誘導し、これらの特徴が予後不良と関連していることを示している。
ＳＴＩＮＧ活性が腫瘍細胞自律的な様式での転移に重要であるかどうかを試験するために、高レベルの染色体不安定性を示すＳＴＩＮＧ枯渇細胞の心臓内注射を実施した。ＳＴＩＮＧが枯渇した細胞を注射したマウスでは、ＳＴＩＮＧが豊富な対応物を注射したマウスと比較して、転移性播種および寿命延長が著しく低減した（図６Ｇ－１および６Ｇ－２、図９Ａ）。
同様に、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、または非標準ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２およびＲｅｌＢの枯渇により、高レベルの染色体不安定性を示す細胞（ＣＩＮ－高細胞、図６Ｈ）の浸潤能が大幅に減少した。
一方、ｃＧＡＭＰの添加により、ＭＣＡＫ（ＣＩＮ－低）細胞がコラーゲン膜を通って遊走および浸潤する能力が増加した（図６Ｈ）。
したがって、サイトゾルＤＮＡに反応した腫瘍細胞の自律的なＳＴＩＮＧ活性化は、部分的に非標準ＮＦ－κＢ経路を介して、浸潤と転移を促進する。
実施例７：染色体不安定性はまた免疫浸潤物と相関している
本明細書で提供されるデータは、染色体不安定性（ＣＩＮ）を転移およびサイトゾルＤＮＡに対する腫瘍細胞固有の炎症反応を介した腫瘍免疫浸潤の形成に結び付ける新規経路が存在することを示している。本発明者らによって同定された経路を図７Ｂに要約する。手短に言えば、本発明者らは、ＣＩＮが染色体含有小核の形成を促進し、それが多くの場合破裂して、それらのＤＮＡ内容物を細胞質（またはサイトゾル）に曝露することを見出した。正常な細胞では発生しないこの異常な状況は、ウイルス感染を連想させる。ｃＧＡＳを介してサイトゾルＤＮＡを感知した後、がん細胞は、ｃＧＡＭＰ（小分子）の形成を促進し、これが順にＳＴＩＮＧを活性化する。標準経路を上方調節する代わりに、がん細胞は、非標準ＮＦ－ｋＢ経路（ＮＩＫおよびＲｅｌＢ／ｐ５２）を活性化し、これは前転移プログラムの上方調節につながる。その間、ｃＧＡＭＰは腫瘍細胞を出て、ＳＴＩＮＧタンパク質と直接結合することにより、隣接する間質、特に抗原提示細胞を活性化することができる。
現在、免疫系を活性化して腫瘍細胞を攻撃する際の腫瘍内ｃＧＡＭＰ注射の使用を検討する前臨床努力が進行中である。本発明者らは、免疫細胞の活性化における抗腫瘍の役割とは対照的に、腫瘍細胞自体のｃＧＡＭＰが転移を促進することを発見したため、この努力はそれ自体のリスクがないわけではないと考えている。
染色体不安定性は、転移を促進すると同時に大量の免疫浸潤物を動員するウイルス様免疫反応を促進するという発見（図７Ａ）は重要であり、この免疫活性化の存在下で、染色体不安定性細胞が生存し、繁殖し、転移することができることを示している。
染色体不安定性を示す細胞は、サイトゾルＤＮＡシグナル（およびその副産物）を自身のサイトゾル内で可能な限り保つ能力があると考えられる。言い換えれば、それらは、推定ｃＧＡＭＰトランスポーターＡＢＣＧ２およびＡＢＣＣ４を下方調節する。さらに、これらの細胞は、ｃＧＡＭＰを効率的に分解し、細胞膜の外葉（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅａｆｌｅｔ）にのみ存在する加水分解酵素であるＥＮＰＰ１を大幅に多く産生する。したがって、これらの染色体不安定性腫瘍細胞は、細胞内環境でｃＧＡＭＰを保持し、その搬出を低減し、必要に応じて、漏れたときにｃＧＡＭＰを分解する。さらに、これらの腫瘍細胞はまた、大量のＭ－ＣＳＦを産生し、これはプロ腫瘍Ｍ２マクロファージの生成を促進するサイトカインである。
そのような免疫活性化は、染色体浸潤に関連するがんの治療を促進するために動員することができる。
例えば、ｃＧＡＭＰを直接腫瘍に注射する（および腫瘍細胞中の転移を活性化するリスクがある）代わりに、染色体不安定性腫瘍細胞によって産生されるｃＧＡＭＰは、細胞を出るとそれを破壊する能力の基礎となるＥＮＰＰ１を阻害することによって、それらに対抗することができる。別のアプローチは、ＡＢＣトランスポーターに対するアゴニストを使用して、細胞外空間へのｃＧＡＭＰ搬出を増加させ、近隣の免疫細胞を活性化する。
実施例８：液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用したｃＧＡＭＰの検出および定量
この実施例は、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）が、特異性、再現性、および感度によってｃＧＡＭＰを判定するための実行可能な技術であることを示している。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは非常に特異的であるため、他のヌクレオチドからの干渉を最小限に抑える。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのより大きな特異性は、検体特異的前駆物質に由来し、かつイオンの質量電荷（ｍ／ｚ）値および／または検体特異的保持時間をもたらす。
材料および方法：
ｃＧＡＭＰ溶液を標準として使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、ｄｄＨ２Ｏ中の７０％アセトニトリルでｃＧＡＭＰ標準溶液を調製した。
細胞培養のために、細胞を１０ｃｍプレート中で増殖させた。
収集および試料調製：
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＬＣ／ＭＳグレードの水で１回洗浄した（塩を除去するため）。次いで、細胞の代謝状態を保つために、プレートを液体窒素で急速冷凍した。次いで、細胞を回収／掻き取って、２ｍｌの冷８０％ ＬＣ－ＭＳグレードメタノール（－８０Ｃ）に入れた。次いで、メタノール代謝物抽出物は、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．２０１５によって以前に記載されたＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用した固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。流出液を真空遠心分離機で完全に乾燥させ、１００μｇタンパク質／μＬの濃度でｄｄＨ２Ｏ中の７０％アセトニトリルで再構成した。１５μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
血清／培地試料の調製：
培養培地中の分泌ｃＧＡＭＰを検出するために、馴化培地の５００μｌアリコートを収集し、８０：２０でメタノールと混合し、４℃で２０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離することができる。得られた上清を収集し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの前に－８０℃で保存してｃＧＡＭＰレベルを評価判定することができる。全細胞に関連する代謝物を測定するために、培地を吸引し、細胞を、例えば非集密的な密度で採取することができる。様々な異なる液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離方法を使用することができる。各方法は、ネガティブエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、－３．０ｋＶ）により、注入された代謝物標準溶液で最適化されたＭＳパラメータを用いて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで動作するトリプル四極子質量分析計に連結することができる。
ｃＧＡＭＰの分析
固相抽出（ＳＰＥ）後、真空遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｖａｃｕｆｕｇｅ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して試料を乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏ中の７０％アセトニトリルで再構成した。可溶化されていない粒子を除去するために、４℃で１０分間、２１，１３０ｇで試料を遠心分離した。ダイナミック多重反応モニタリング（ｄＭＲＭ）における陽イオンモニタリングを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣおよびＪｅｔＳｔｒｅａｍエレクトロスプレーイオン化源を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４６０トリプル四極子質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で構成されたＬＣ／ＭＳシステムに上清を注入した。検体ｃＧＡＭＰは、４０℃のカラムコンパートメント温度で、水性中性相カラム（Ｃｏｇｅｎｔ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ｈｙｄｒｉｄｅ、４μｍ粒径、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｍｉｃｒｏｓｏｌｖ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＪ）の干渉シグナルから分離した。試料を４℃に維持し、注射量は１５μＬであった。Ｃｈｅｎらが以前に記載したグラジエントクロマトグラフィー（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（６）：ｐ．ｅ３７１４９（２０１２））を最適化して、干渉ピークからのクロマトグラフィー分離を実現した。水性移動相（Ａ）は、０．０２５％酢酸を含む５０％イソプロパノールであり、有機移動相（Ｂ）は、５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する９０％アセトニトリルであった。クロマトグラフィーのピーク完全性およびＥＳＩイオン化に対する金属イオンの干渉を排除するために、ＥＤＴＡを最終濃度６ｕＭで移動相に添加した。適用された最終グラジエントは、０～１．０分９９％Ｂ、１．０～１０．０分～６０％Ｂ、１０．１～２０分０％Ｂ、および２０．１分９９％Ｂで１０分間、カラムを再生した。流量は、０．４ｍＬ／分であった。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒワークステーション取得ソフトウェア（Ｂ．０６．００ビルド６．０．６０２５．４ ＳＰ４）を使用して、重心モードで保存した。取得した生データファイルは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェア（Ｂ．０７．００ビルド７．０．７０２４．０、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および定量分析ソフトウェア（Ｂ．０７．０１ビルド７．１．５２４．０）で処理した。ＭＳ分析の動作ソースパラメータは次のとおりであった：ガス温度２８０℃、ガス流量１１Ｌ／分、ネブライザー圧力３５ｐｓｉ、シースガス温度３５０℃、シースガス流量１１Ｌ／分、毛細管電圧４０００Ｖ、ノズル電圧３００Ｖ、フラグメンター電圧１４５Ｖ、セルアクセラレータ電圧２Ｖ。ＬＣフローがＭＳに向けられたとき、４分のランタイムから開始してｄＭＲＭデータを取得した。
化合物特異的パラメータは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェア（６４００シリーズトリプル四極子バージョンＢ．０６．００ビルド６．０．６０２５．４ ＳＰ４用）を使用して最適化した。
最適化したｄＭＲＭ遷移は、脱グリコシル化した塩基イオンをもたらした。ｃＧＡＭＰの場合、遷移６７５．１→１３６．１＊（ＣＥ６５ｅＶ）は、アデニンの形成を表し、６７５．１→１５２．１＊＊（ＣＥ６５ｅＶ）は、グアニンの形成を表した。さらに、６７５．１→３１２．０（ＣＥ６１ｅＶ）および６７５．１→５２４．１（ＣＥ３５ｅＶ）のｄＭＲＭ遷移を記録した。＊は、数量詞の遷移を示し、＊＊は、修飾子の遷移を示す（図１０Ａを参照）。すべてのｃＧＡＭＰ遷移は、同じ親イオンに由来していたため、４つの遷移すべてを合計して最終ＴＩＣ（総イオン電流）にし、シグナル量とシグナル対ノイズ比を増やした。
結果
図１０Ｂは、標的ＬＣ－ＭＳメタボロミクスを使用した染色体不安定性尿トリプルネガティブ乳がん細胞（４Ｔ１）におけるｃＧＡＭＰの定量化をグラフで示す。示されているように、４Ｔ１細胞におけるｃＧＡＳのノックダウンは、ｃＧＡＭＰの存在量を低減した。これらの結果は、ｃＧＡＭＰが様々な試料で定量化できること、およびｃＧＡＭＰが患者の転移性疾患を検出およびモニタリングするためのマーカーになり得ることを示している。
実施例９：ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫアゴニストを同定／評価判定するためのＡＴＰアーゼアッセイ
ＫＩＦ２ＢおよびＫＩＦ２Ｃ／ＭＣＡＫは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用して微小管ダイナミクスおよび染色体－動原体の付着を調節する、関連分子キネシンモータータンパク質である。ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫの過剰発現または過剰活性化の中心的な役割は、染色体不安定性（ＣＩＮ）を抑制することであり、それらをがん治療の魅力的な標的にする。ここでは、ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫの強力なアクチベーターを同定および評価判定するために、この実施例では２つの方法（インビトロアッセイおよび画像化法）を概説する。
方法１ ＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫ活性のインビトロアッセイ：
ＡＴＰ加水分解の反応速度の測定は、ＫＩＦ２ＢおよびＭＣＡＫを活性化し、ＣＩＮを抑制する化合物をスクリーニングするための戦略である。このアッセイは、２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）が、無機リン酸（Ｐｉ）の存在下で２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンに変換される場合に生じる吸光度シフト（３３０～３６０ｎｍ）に基づいている（例えば、Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｒ．１９９２．Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４８８４－４８８７を参照）。この反応は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）によって触媒される。１分子の無機リン酸は、不可逆反応で１分子の２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンを生じる。したがって、３６０ｎｍでの吸光度は、ＡＴＰアーゼ反応で生成されるＰｉの量に直接比例し、ＭＣＡＫ活性のプロキシとして使用することができる。
あるいは、ＡＤＰ産生はまた、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ ＬａｂｓからのＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰアッセイを使用してＭＣＡＫ活性についての読み出しとしてモニタリングすることもできる。このアッセイは、ＡＤＰを特異的に認識する抗体に結合した蛍光トレーサー（６３３ｎｍ）を置き換えるＡＤＰの能力に基づいている。トレーサーの置き換えは、６３３ｎｍのレーザー励起により測定される蛍光の減少を引き起こす。したがって、ＭＣＡＫの活性は、使用される薬物の濃度、産生されるＡＤＰ／蛍光強度の減少の量をプロットすることにより計算することができる。
方法２ ＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫ活性の細胞ベースのアッセイ：
ＭＣＡＫは、微小管の先端を結合し、微小管の解重合を促進することにより、微小管の長さを負に調節する。したがって、γ－チューブリン標識中心体間の距離は、細胞内のＭＣＡＫ活性についての間接的読み出しとして測定することができる。スピンドルの長さは、ＭＣＡＫ活性に反比例し、ＭＣＡＫ活性を促進する潜在的な化合物を評価するための代理として機能し得る（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ａ＆Ｃｒｏｓｓ，Ｒ．Ａ．１９９６．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｇ５ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ｍｏｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２３６５－２３７３を参照）。この方法は、ハイスループット画像化顕微鏡を使用することにより、化合物をスクリーニングするために適合させることができる。
その後、化合物（例えば、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにより同定されたトップヒット）は、有効性の読み出しとしてＦＩＳＨを使用する、遅滞染色体、小核、または染色体誤分離を使用する細胞ベースのアッセイに使用することができる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、高度な配列相補性で染色体のそれらの部分のみに結合する蛍光プローブを使用する、分子細胞遺伝学的手法である。プローブは、本明細書に記載される染色体または遺伝子のうちのいずれかの配列の部分を含むことができる。
実施例１０：ＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）阻害物質を同定／評価判定するためのＡＴＰアーゼアッセイ
ＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）は、非標準ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を媒介し、転移に関連している。したがって、ＮＩＫの阻害は、ＣＩＮ誘発炎症反応および転移を抑制する場合がある。この実施例では、ＮＩＫ阻害を同定および評価判定するために使用され得る２つの方法を概説する。
方法１：
ＮＩＫのキナーゼ機能の特異的阻害は、様々な化合物の効力を評価判定するアプローチを提供する。したがって、ＡＤＰ産生は、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ ＬａｂｓからのＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰアッセイを使用してＮＩＫ活性についての読み出しとしてモニタリングすることができる。このアッセイは、ＡＤＰを特異的に認識する抗体に結合した蛍光トレーサー（６３３ｎｍ）を置き換えるＡＤＰの能力に基づいている。トレーサーの競合的置き換えは、６３３ｎｍのレーザー励起により測定される蛍光の減少を引き起こす。したがって、ＮＩＫの活性は、使用される薬物の濃度および産生されたＡＤＰ／蛍光強度の減少の量をプロットするにより計算することができる。
方法２：
ＮＩＫの阻害は、非標準ＮＦ－κＢ経路を直接阻害するアプローチを提供する。このアッセイは、高コンテンツの細胞画像化を使用するｐ５２の核移行（ＲＥＬＢ、非標準ＮＦ－ｋＢシグナル伝達）の定量化に依存している。ヒトＲＥＬＢの配列の例を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９として以下に示す。
Figure 0007197556000064
ＲＥＬＢ核移行アッセイでは、細胞を異なる濃度の化合物で処理し、１００ｎｇ／ｍＬの非標準ＮＦ－ｋＢシグナル伝達の強力なアクチベーターである拮抗性抗リンホトキシンβ受容体（ＬＴ－βＲ）抗体（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから）で刺激する。核へのＲＥＬＢ移行は、サイトゾルシグナル強度に対する核の比率によって定量化される。ＲＥＬＢの核移行を選択的に阻害する強力な化合物が発見された。
参考文献
Figure 0007197556000065
Figure 0007197556000066
Figure 0007197556000067
Figure 0007197556000068
Figure 0007197556000069
本明細書で参照または言及されているすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のスキルのレベルであることを示しており、そのような参照された特許または刊行物は各々、あたかもそれが参照によりその全体が個別に組み込まれているか、またはその全体が本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。出願人は、任意のそのような引用された特許または刊行物からのあらゆる資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
記述：
２）ａ．細胞試料の１つ以上の細胞内に少なくとも１０％、もしくは少なくとも１１％、もしくは少なくとも１２％、もしくは少なくとも１３％、もしくは少なくとも１４％、もしくは少なくとも１５％の検出可能な染色体誤分離を有する、
ｂ．細胞試料の１つ以上の細胞内に少なくとも３％、少なくとも４％、もしくは少なくとも５％の検出可能な小核を有する、
ｃ．細胞試料の１つ以上の細胞内に検出可能なサイトゾル二本鎖ＤＮＡを有する、または
ｄ．細胞試料中もしくは体液試料中、少なくとも１０％超、もしくは少なくとも２０％超、もしくは少なくとも３０％超、もしくは少なくとも５０％超、もしくは少なくとも７０％超、もしくは少なくとも８０％超、もしくは少なくとも９０％超のｃＧＡＭＰの濃度もしくは量を有する
前記細胞試料または体液試料を有する患者に転移化学療法剤を投与し、それによって、前記患者の転移性がんを治療することを含む、方法。
３）転移化学療法剤を、誤分離を呈する前記細胞試料の後期細胞中１５～２０％の染色体を有する患者に投与することを含む、記述１の方法。
４）転移化学療法剤を、小核を呈する前記細胞試料中５～８％の細胞を有する患者に投与することを含む、記述１または２の方法。
５）転移化学療法剤を、正常な非がん組織と比較してサイトゾル内の染色強度が１倍～２倍増加した患者に投与することを含む、記述１、２、または３の方法。
６）転移化学療法剤を、体液試料中のｃＧＡＭＰの濃度または量が非がん性体液試料よりも１倍～２倍大きい患者に投与することを含む、記述１、２、３、または４の方法。
７）前記患者の細胞内または体液内の染色体誤分離、小核、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ、またはｃＧＡＭＰを定量化するために、前記患者由来の試料を経時的にモニタリングすることをさらに含む、記述１～４または５の方法。
８）前記転移化学療法剤が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、または５のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するキネシン－１３タンパク質を含む組成物である、記述１～５または６の方法。
９）前記転移化学療法剤が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、または６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むキネシン－１３核酸を含む組成物である、記述１～６または７の方法。
１０）前記転移化学療法剤が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＭＣＡＫタンパク質またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＭＣＡＫ核酸を含む組成物である、記述１～７または８の方法。
１１）前記転移化学療法剤が、少なくとも１つのＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１阻害性核酸を含む組成物である、記述１～８または９の方法。
１２）前記転移化学療法剤が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物である、記述１～９または１０の方法。
１３）前記転移化学療法剤が、ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１タンパク質に親和性を持って結合する少なくとも１つの抗体を含む組成物である、記述１～１０または１１の方法。
１４）前記転移化学療法剤が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、または７のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するキネシン－１３タンパク質またはＭＣＡＫタンパク質をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを有する発現ベクターを含む組成物である、記述１～１１または１２の方法。
１５）前記転移化学療法剤が、構造
Figure 0007197556000070
を有するキネシン－１３のアゴニストを含む組成物であり、Ｘがメチル基である、記述１～１２または１３の方法。
１６）前記体液試料中または前記細胞試料中のｃＧＡＭＰの濃度または量が、質量分析法（ＭＳ）を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含む方法において定量化される、記述１～１３または１４の方法。
１７）前記体液試料中または前記細胞試料中の前記ｃＧＡＭＰが、アルコール抽出物を生成するためにアルコール中に抽出および／または溶解され、前記アルコール抽出物が、クロマトグラフィーに供され得、かつ前記クロマトグラフィーからの流出液が、前記ｃＧＡＭＰの濃度または量を測定する前に、アセトニトリル、水、またはそれらの組み合わせに懸濁することができる、記述１～１４または１５の方法。
１８）少なくとも１種類のキネシン－１３タンパク質、少なくとも１種類のＭＡＣＫタンパク質、キネシン－１３の少なくとも１種類のアゴニスト、ＭＡＣＫの少なくとも１種類のアゴニスト、またはそれらの組み合わせを対象に投与することを含む、方法。
１９）前記少なくとも１種類のキネシン－１３タンパク質またはＭＣＡＫが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、または７のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、記述１７の方法。
２０）キネシン－１３の少なくとも１種類のアゴニストが
Figure 0007197556000071
であり、Ｘがメチル基である、記述１７または１８の方法。
２１）ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを前記対象に投与することをさらに含む、記述１７、１８、または１９の方法。
２２）哺乳動物細胞中のＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することを含む、方法。
２３）キネシン－１３タンパク質またはＭＡＣＫタンパク質をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを対象に投与することを含む、方法。
２４）少なくとも１種類の前記キネシン－１３タンパク質またはＭＡＣＫタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、または７のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、記述２２の方法。
２５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１、１３、または１５のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性または相補性を有する阻害性核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを投与することを含む、記述１７～２３または２３の方法。
２６）ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、ＭＳＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを前記対象に投与することをさらに含む、記述１～２３または２４の方法。
２７）ＡＢＣＣ４のアゴニスト、ＡＢＣＧ２のアゴニスト、もしくはそれらの組み合わせを投与すること、ＡＢＣＣ４もしくはＡＢＣＧ２をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットもしくは発現ベクターを投与すること、またはそれらの組み合わせをさらに含み、記述１～２４または２５の方法。
２８）前記患者における細胞が、投与前に染色体不安定性を呈する、記述１～２５または２６の方法。
２９）前記患者ががんを有する疑いがある、記述１～２６または２７の方法。
３０）前記患者ががんを発症している疑いがある、記述１～２７または２８の方法。
３１）前記患者ががんを有する、記述１～２８または２９の方法。
３２）前記患者が転移性がんを有する、記述１～２９または３０の方法。
３３）前記対象におけるがんの転移を阻害する、記述１～３０または３１の方法。
３４）前記タンパク質または前記発現ベクターを受容しなかった対照対象と比較して、対象におけるがんの転移を阻害する、記述１～３１または３２の方法。
３５）染色体不安定性を阻害する、記述１～３２または３３の方法。
３６）患者由来の試験試料中の以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５のうちの少なくとも１つの発現レベルを定量化して、試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルを生成することを含む、方法。
３７）健常試料中または非がん性試料中の少なくとも１つの対応する遺伝子の対照発現レベルと比較して、前記試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルにおける少なくとも１つの差を決定することをさらに含む、記述３５の方法。
３８）前記健常試料または非がん性試料が染色体不安定性を呈しない、記述３５または３６の方法。
３９）転移性がんを有する患者由来の試料（または試料のセット）中の少なくとも１つの対応する遺伝子の対照発現レベルと比較して、前記試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルにおける少なくとも１つの差を決定することをさらに含む、記述３５、３６、または３７の方法。
４０）前記試験試料中の以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５のうちの２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、１０個以上、または１１個以上、または１２個以上、または１３個以上、または１４個以上、または１５個以上、または１６個以上、または１７個以上、または１８個以上、または１９個以上、または２０個以上、または２１個以上、または２２個以上の発現レベルを定量化することを含む、記述３５～３７または３８の方法。
４１）健常試料中または非がん性試料中の少なくとも１つの対応する遺伝子の対照発現レベルと比較して、前記試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルにおける差が少なくとも、１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７５％、または１００％の発現の増加である、記述３５～３８または３９の方法。
４２）試料（または転移性がんを有する１名以上の患者由来の試料のセット）中の少なくとも１つの対応する遺伝子の平均対照発現レベルと比較して、前記試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルにおける差が少なくとも、１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７５％、または１００％の発現の増加である、記述３５～３９または４０に記載の方法。
４３）対照発現レベルと比較して、前記試験試料中の少なくとも１つの以下の遺伝子：ＰＥＬＩ２、ＢＭＰ２、ＳＨＨ、ＴＮＳ４、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＯＢＯ１、ＡＲＨＧＡＰ２８、ＣＨＮ２、ＣＳＴ１、Ｆ１３Ａ１、ＣＰＶＬ、ＳＥＭＡ６Ｄ、Ｃ９ｏｒｆ１５２、ＮＨＳＬ２、ＧＴＦ２ＩＰ７、ＤＰＹＳＬ３、ＰＣＤＨ７、ＫＨＤＲＢＳ３、ＴＲＡＣ、ＴＭＥＭ１５６、ＣＳＴ４、ＣＤ２４、またはＦＧＦ５の定量化した少なくとも１つの発現レベルにおける差が少なくとも、これらの対応する遺伝子の発現の増加の少なくとも１．２倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍の発現の増加である、記述３５～４０または４１の方法。
４４）染色体不安定性腫瘍細胞に対する治療ツールとしてサイトゾルＤＮＡセンシングの下流の標準経路を回復および／または活性化して細胞固有の細胞毒性経路を誘導するために、ＳＴＩＮＧタンパク質を対象に投与するかまたは対象において発現カセットまたは発現ベクターからＳＴＩＮＧタンパク質を発現させることを含む、方法。
４５）染色体不安定性腫瘍細胞に対する治療ツールとしてサイトゾルＤＮＡセンシングの下流の標準経路を回復および／または活性化して細胞固有の細胞毒性経路を誘導するために、１種類以上のＳＴＩＮＧアゴニストを対象に投与することを含む、方法。
４６）腫瘍細胞を免疫療法に対して感作させる、記述４３または４４の方法。
４７）担体と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、または５のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するキネシン－１３タンパク質とを含む、組成物。
４８）担体と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、または６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むキネシン－１３核酸とを含む、組成物。
４９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＭＣＡＫタンパク質、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＭＣＡＫ核酸をさらに含む、記述４６または４７の組成物。
５０）少なくとも１つのＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１阻害性核酸を含む、記述４６、４７、または４８の組成物。
５１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する少なくとも１つの阻害性核酸を含む、記述４６～４８または４９の組成物。
５２）ＳＴＩＮＧ、ｃＧＡＳ、ＮＦ－κＢ転写因子ｐ５２、ＮＦ－κＢ転写因子ＲｅｌＢ、ＥＮＰＰ１、ＬＴβＲ、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＦＮ１４、ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）、またはＭＳＴ１タンパク質に親和性を持って結合する少なくとも１つの抗体を含む、記述４６～４９または５０の組成物。
５３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または２３のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質に親和性を持って結合する少なくとも１つの抗体を含む、記述４６～５０または５１の組成物。
５４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、または７のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するキネシン－１３タンパク質またはＭＣＡＫタンパク質をコードする核酸セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
５５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性または相補性を有する阻害性核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
５６）（ａ）培養培地中で試験化合物をがん（または転移性がん）細胞と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｂ）前記試験化合物が細胞と会合するのにまたは細胞に浸透するのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートすること、（ｃ）前記培養培地中、前記細胞中、またはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、ならびに（ｄ）基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する試験化合物を選択し、それによって、有効な試験化合物を生成することを含む、方法。
５７）前記基準ｃＧＡＭＰ値が、試験化合物を含まないアッセイ物混合物の培養培地中、細胞中、またはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量または濃度である、記述５５の方法。
５８）（ａ）患者から細胞試料または組織試料を得ること、（ｂ）前記試料由来の既知数または既知重量の細胞または組織から産生されたｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、基準ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｃ）前記試料由来の前記既知数または既知重量の細胞または組織を試験化合物と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｄ）前記試験アッセイ物中（前記細胞培地中または前記細胞中もしくは前記組織中）のｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、（ｅ）任意に、ステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すこと、ならびに前記基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する試験化合物を選択し、それによって、有効な試験化合物を同定することを含む、方法。
５９）前記転移性がん細胞または転移性組織を前記培養培地中で混合して前記試験アッセイ物を生成する、記述５５、５６、または５７の方法。
６０）ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記細胞試料または前記組織試料をアルコール（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）で抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、記述５５～５７または５８の方法。
６１）半純粋な（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｅ）試験試料のｃＧＡＭＰを測定する前に、１つ以上のＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、記述５９の方法。
６２）前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、アセトニトリル、水、またはそれらの組み合わせにｃＧＡＭｐを懸濁することをさらに含む、記述５９または６０の方法。
６３）ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、ｃＧＡＭＰのレベルを測定するための液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、記述５５～６０または６１の方法。
６４）例えば、前記有効な試験化合物の毒性および／または有効性をさらに評価するために、前記有効な試験化合物を動物モデルに投与することをさらに含む、記述５５～６１または６２の方法。
６５）前記有効な試験化合物を、患者にまたは得られた前記細胞試料もしくは組織試料が由来する患者に投与することをさらに含む、記述５５～６２または６３の方法。
６６）（ａ）培養培地中で試験化合物をがん（または転移性がん）細胞と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｂ）前記試験化合物が前記細胞中のｃＧＡＭＰに影響を及ぼすのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートすること、（ｃ）前記培養培地中、前記細胞中、またはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、ならびに（ｄ）基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する試験化合物を選択し、それによって、有効な試験化合物を生成することを含む方法によって生成される、有効な試験化合物。
６７）前記転移性がん細胞または転移性組織を前記培養培地中に混合して前記試験アッセイ物を生成する、記述６５の生成された有効な試験化合物。
６８）前記方法が、前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記細胞をアルコール（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）で抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、記述６５または６６の生成された有効な試験化合物。
６９）前記方法が、前記細胞試料または組織試料をメタノールで抽出してメタノール抽出物を生成すること、および前記メタノール抽出物中のｃＧＡＭＰを測定することをさらに含む、記述６５、６６、または６７の生成された有効な試験化合物。
７０）前記半純粋な試験試料の前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、１つ以上のＨｙｐｅｒＳｅｐアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物または前記メタノール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、記述６７または６８の生成された有効な試験化合物。
７１）ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、ｃＧＡＭＰのレベルを測定するための液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、記述６５～６８または６９の生成された有効な試験化合物。
７２）例えば、前記有効な試験化合物の毒性および／または有効性をさらに評価するために、前記有効な試験化合物を動物モデルに投与することをさらに含む、記述６５～６９または７０の生成された有効な試験化合物。
７３）前記方法が、前記有効な試験化合物を、患者にまたは得られた前記細胞試料もしくは前記組織試料が由来する患者に投与することをさらに含む、記述６５～７０または７１の生成された有効な試験化合物。
７４）（ａ）２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）を含有する試験アッセイ物混合物中で、試験化合物をＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫと混合すること、（ｂ）前記試験アッセイ物混合物をインキュベートして、インキュベートされた試験アッセイ物を生成すること、（ｃ）無機リン酸の量を測定して、無機リン酸試験結果を提供すること、および（ｄ）前記無機リン酸試験結果を対照または基準と比較することを含む、方法。
７５）前記対照が、ＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫおよび２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）を含有するが前記試験化合物を含有しない対照アッセイ物中に存在する無機リン酸（Ｐｉ）の量である、記述７４の方法。
７６）前記基準が、ＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫおよび２－アミノ－６－メルカプト－７－メチルプリンリボヌクレオシド（ＭＥＳＧ）を含有するが前記試験化合物を含有しない２つ以上の対照アッセイ物中に存在する無機リン酸（Ｐｉ）の平均量である、記述７４の方法。
７７）前記対照または基準よりも高い無機リン酸試験結果を有する試験化合物を選択することをさらに含む、記述７４、７５、または７６の方法。
７８）前記対照または基準よりも高い無機リン酸試験結果を有する試験化合物を選択すること、および第２のアッセイにおいて前記試験化合物を評価して、試験化合物をＫＩＦ２ＢまたはＭＣＡＫのアクチベーターとして評価判定することをさらに含む、記述７４～７６または７７の方法。
７９）（ａ）試験化合物を、γ－チューブリン標識中心体を有するがん細胞と混合して、試験アッセイ物を生成すること、（ｂ）前記試験化合物が前記がん細胞に浸透してインキュベートされた試験がん細胞を生成するのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートすること、（ｃ）平均距離結果をもたらす、一連のインキュベートされた試験がん細胞内のγ－チューブリン標識中心体間の距離を測定すること、ならびに（ｄ）前記平均距離結果を対照または基準と比較することを含む、方法。
８０）前記距離が、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定される、記述７９の方法。
８１）前記対照が、前記試験化合物を含有しない対照アッセイ物のがん細胞におけるγ－チューブリン標識中心体間の距離である、記述７９または８０の方法。
８２）前記基準が、前記試験化合物を含有しない対照アッセイ物における一連のγ－チューブリン標識がん細胞内のγ－チューブリン標識中心体間の平均距離である、記述７９または８０の方法。
８３）前記対照または基準よりも小さい平均距離結果を有する試験化合物を選択することをさらに含む、記述７９、８０、または８１の方法。
８４）前記対照または基準よりも小さい平均距離結果を有する試験化合物を選択すること、および第２のアッセイにおいて前記試験化合物を評価して、試験化合物をＭＣＡＫのアクチベーターとして評価判定することをさらに含む、記述７４～７６または７７の方法。
８５）（ａ）ＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼを、試験化合物と、ＡＴＰと、および特異的にＡＤＰを認識する抗体に結合した蛍光トレーサー（６３３ｎｍ）を有する前記抗体と混合すること、（ｂ）試験アッセイ物混合物をインキュベートして、インキュベートされた試験アッセイ物を生成すること、（ｃ）前記インキュベートされた試験アッセイ物中の蛍光の量を測定すること、ならびに（ｄ）前記インキュベートされた試験アッセイ物中の蛍光の量を対照または基準と比較することを含む、方法。
８６）前記対照が、前記試験化合物を含有しない対照アッセイ物中の蛍光の量である、記述８５の方法。
８７）前記基準が、前記試験化合物を含有しない一連の対照アッセイ物中の蛍光の平均量である、記述８５の方法。
８８）１つ以上のインキュベートされた試験アッセイ物中の蛍光の量が、前記対照または基準よりも高い試験化合物を選択することをさらに含む、記述８５、８６、または８７の方法。
８９）１つ以上のインキュベートされた試験アッセイ物中の蛍光の量が、前記対照または基準よりも高い試験化合物を選択すること、および第２のアッセイ物中の前記試験化合物を評価して、前記試験化合物をＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼの阻害物質として評価判定することをさらに含む、記述８５～８７または８８の方法。
９０）（ａ）がん細胞を試験化合物および抗リンホトキシンβ受容体（ＬＴ－βＲ）抗体と混合すること、（ｂ）前記試験化合物が前記がん細胞に浸透するのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートして、インキュベートされた試験がん細胞を生成すること、（ｃ）前記インキュベートされた試験がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量を測定すること、ならびに（ｄ）前記インキュベートされた試験がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量を対照または基準と比較することを含む、方法。
９１）前記インキュベートされた試験がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量を測定することが、細胞質シグナル強度に対する核の比率を得ることをさらに含む、記述９０の方法。
９２）前記対照が、前記試験化合物を含有しない対照アッセイ物中の核へのＲＥＬＢ移行の量である、記述９０または９１の方法。
９３）前記基準が、前記試験化合物を含有しない一連の対照アッセイ物中の核へのＲＥＬＢ移行の平均量である、記述９０または９１の方法。
９４）前記インキュベートされた試験がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量が、前記対照または基準よりも少ない試験化合物を選択することをさらに含む、記述９０～９２または９３の方法。
９５）前記インキュベートされた試験がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量が、前記対照または基準よりも少ない試験化合物を選択すること、および第２のアッセイにおいて前記試験化合物を評価して、前記試験化合物をＮＦ－ｋＢ誘導キナーゼの阻害物質として評価判定することをさらに含む、記述８５～８７または８８の方法。
９６）記述７４～９４または９５の方法によって生成された有効な試験化合物。
９７）前記方法が、例えば、前記有効な試験化合物の毒性および／または有効性をさらに評価するために、前記有効な試験化合物を動物モデルに投与することをさらに含む、記述９６の有効な試験化合物。
９８）前記方法が、前記有効な試験化合物を、患者にまたは得られた前記がん細胞が由来する患者に投与することをさらに含む、記述９６または９７の有効な試験化合物。
本明細書に記載される特定の方法および組成物は、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する制限として意図されない。他の目的、態様、および実施形態は、本明細書を考慮すると当業者によって想到され、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨内に含まれる。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換および修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。
本明細書に例示的に記載される本発明は、本質的に本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または制限がない場合に適切に実施され得る。本明細書に例示的に記載される方法およびプロセスは、異なるステップの順序で適切に実施することができ、方法およびプロセスは、本明細書または特許請求の範囲に示されるステップの順序に必ずしも限定されない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「核酸」または「発現カセット」または「細胞」への言及は、複数のそのような核酸、発現ベクター、または細胞（例えば、核酸もしくは発現カセットの溶液もしくは乾燥調製物、または細胞集団）等を含む。この文書では、「または」という用語は、非排他的なものを指すために使用され、それにより別途指示されない限り、「ＡまたはＢ」は、「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、「ＡおよびＢ」を含む。
いかなる状況においても、特許は、本明細書に具体的に開示された特定の実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されることはない。いかなる状況においても、特許は、そのような記述が、具体的かつ無制限または無条件に、出願人による応答書面に明白に採用されない限り、特許商標庁のいかなる審査官または他の職員もしくは従業員による陳述によっても制限されていると解釈されることはない。
用いられている用語および表現は、明細書の用語として使用されており、限定するものではない。また、そのような用語および表現を使用して、示されかつ記載された特徴またはその部分のいかなる同等物も除外する意図はないが、特許請求された本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書に開示した概念の修正および変形は、当業者に頼ることができ、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲および本発明の記述によって定義される本発明の範囲内にあると考慮されることが理解されるであろう。
本明細書では、本発明を広く一般的に記載した。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属のグループ分けの各々もまた、本発明の一部を形成する。これには、切り取られた材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、任意の主題を属から取り除く条件または否定的な制限を伴う本発明の一般的な説明が含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明がまた、それによりマーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。

Claims (14)

  1. （ａ）培養培地中で試験化合物を転移性がん細胞試料と混合して、試験アッセイ物をもたらすこと、ここで、前記試料が、がん細胞中に少なくとも１０％の検出可能な染色体誤分離を含む、
    （ｂ）前記試験化合物が細胞と会合するのにまたは細胞に浸透するのに十分な時間および条件下で、前記試験アッセイ物をインキュベートすること、
    （ｃ）前記培養培地中、前記細胞中、もしくはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量もしくは濃度を測定して、試験アッセイ物の値を生成すること、および／または前記細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量を測定すること、ならびに
    （ｄ）
    基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値、および／または
    基準ＲＥＬＢ移行量よりも低い、前記細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量
    を有する試験化合物を選択し、それによって、染色体不安定性の治療に有効な試験化合物を選択すること
    を含み、前記基準ｃＧＡＭＰ値が、試験化合物を含有しないアッセイ物混合物中のｃＧＡＭＰの量もしくは濃度であり、前記基準ＲＥＬＢ移行量が、試験化合物を含有しないアッセイ物混合物内の転移性がん細胞の核へのＲＥＬＢ移行の量である、方法。
  2. 前記方法が、
    （ｃ）前記培養培地中、前記細胞中、もしくはそれらの組み合わせ中のｃＧＡＭＰの量もしくは濃度を測定して、試験アッセイ物の値を生成すること、および
    （ｄ）
    基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する試験化合物を選択し、それによって、染色体不安定性の治療に有効な試験化合物を選択すること
    を含み、前記ｃＧＡＭＰ基準値が、試験化合物を含有しないアッセイ物混合物中のｃＧＡＭＰの量もしくは濃度である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記試料または培養培地をアルコールで抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 半純粋な（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｅ）試験試料の前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、１つ以上のアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、ｃＧＡＭＰのレベルを測定するための液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 方法が、複数の細胞内の中心体間の距離を検出して、平均距離結果を生成することをさらに含み、選択された試験化合物が基準距離よりも小さい平均距離結果を有し、前記基準距離が試験化合物を含有しないアッセイ物混合物内の転移性がん細胞の中心体間の距離である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. （ａ）転移性がんを有する患者から得られた細胞試料または組織試料由来の既知数または既知重量の細胞または組織から産生されたｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、基準ｃＧＡＭＰ値を生成すること、ここで、前記試料はがん細胞内に少なくとも１０％の検出可能な染色体誤分離を含む、
    （ｂ）前記試料由来の前記既知数または既知重量の細胞または組織を試験化合物と混合して、試験アッセイ物を生成すること、
    （ｃ）前記試験アッセイ物中の前記ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定して、試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を生成すること、および
    （ｄ）前記基準ｃＧＡＭＰ値よりも低い試験アッセイ物ｃＧＡＭＰ値を有する任意の試験化合物を選択し、それによって、少なくとも１つの有効な試験化合物を同定すること
    を含む、方法。
  8. 前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、前記細胞試料または組織試料をアルコールで抽出して、アルコール抽出物を生成することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞試料または組織試料をメタノールで抽出してメタノール抽出物を生成すること、および前記メタノール抽出物中の前記ｃＧＡＭＰを測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  10. 半純粋な試験試料の前記ｃＧＡＭＰを測定する前に、１つ以上のアミノプロピル固相カラムを使用する固相抽出（ＳＰＥ）により前記アルコール抽出物または前記メタノール抽出物を精製して、前記半純粋な試験試料を生成することをさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
  11. ｃＧＡＭＰの量または濃度を測定することが、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 液体クロマトグラフィーが、イソプロパノールおよび酢酸を含む水性移動相ならびにアセトニトリルおよび酢酸アンモニウムを含む有機移動相を含む、請求項５または１１に記載の方法。
  13. ｃＧＡＭＰを測定する前に、移動相にＥＤＴＡを添加することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記がんが、乳がんまたは肺がんとして発生したものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
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