JP7195517B2 - Proteins with epimerization activity - Google Patents

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Description

本発明は、エピメリ化活性を有するタンパク質に関する。 The present invention relates to proteins with epimerization activity.

マンノースは、グルコースの異性体であり、コンニャクなどから抽出されるグルコマンナン、ヘミセルロース、あるいは細胞表面などに存在する糖鎖の構成糖として良く知られている。また、マンノースそのものとしてはクランベリーに含まれることが知られている。 Mannose is an isomer of glucose, and is well known as a constituent sugar of sugar chains present on glucomannan extracted from konjac, hemicellulose, cell surfaces, and the like. Also, mannose itself is known to be contained in cranberries.

マンノースの生体利用性は低く、経口摂取したマンノースの殆どは速やかに尿中に排出される。***症の原因菌は、当該菌が有するマンノース結合タンパク質 (レクチン) と、尿路表面細胞表面に存在する糖鎖の結合を介して尿路表面細胞へ付着し感染する、というメカニズムが提唱されている。先述の通り、経口摂取したマンノースは尿中に速やかに排出されるため、排出されたマンノースは当該菌のマンノースレクチンと細胞表面糖鎖への結合を阻害するため、***症を予防する効果が期待されている。 The bioavailability of mannose is low, and most orally ingested mannose is rapidly excreted in the urine. The mechanism proposed is that the causative bacteria of urinary tract infections adhere to and infect urinary tract surface cells through the binding of mannose-binding proteins (lectins) possessed by the bacteria and sugar chains present on the surface of urinary tract surface cells. It is As mentioned above, orally ingested mannose is rapidly excreted in the urine, and the excreted mannose inhibits the binding of the bacterium to mannose lectin and cell surface sugar chains, thus preventing urinary tract infections. is expected.

特許文献１にはマンノース含有糖組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関わる技術が開示されている。特許文献２にはマンノースを有効成分とする飲食品の食感改良剤についての記述がある。 Patent Literature 1 discloses a technique related to an agent for suppressing infection of harmful bacteria or a feed for preventing infection of harmful bacteria containing a mannose-containing sugar composition as an active ingredient. Patent Document 2 describes an agent for improving the texture of food and drink containing mannose as an active ingredient.

マンノースの調製法としては、化学反応法及び酵素法が知られている。 A chemical reaction method and an enzymatic method are known as methods for preparing mannose.

第一の化学反応法は、フラクトースを還元することでソルビトールとマンニトールを生成し、マンニトールを分取し、さらにマンニトールを酸化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は多段階のステップおよび高温高圧での触媒反応を必要とするため、効率面で問題がある。 The first chemical reaction method is a method of producing sorbitol and mannitol by reducing fructose, separating mannitol, and preparing mannose by oxidizing mannitol. However, this method has efficiency problems because it requires multiple steps and catalytic reactions at high temperature and pressure.

第二の化学反応法は、グルコマンナンやマンナンを加水分解することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、基質が高価でありかつ基質の調整に労力を要するという問題がある。 The second chemical reaction method is a method of preparing mannose by hydrolyzing glucomannan or mannan. However, this method has the problem that the substrate is expensive and preparation of the substrate requires labor.

第三の化学反応法は、コプラミールなどのヘミセルロースを加水分解する手法である。しかし、この方法は、構成糖が多様であるためマンノースの収率が悪く、酸加水分解の場合はさらに収率が悪化し精製負荷が大きくなるという問題がある。 The third chemical reaction method is to hydrolyze hemicellulose such as copra meal. However, this method has a problem that the yield of mannose is poor due to the variety of constituent sugars, and that the yield is further deteriorated in the case of acid hydrolysis, increasing the purification load.

第四の化学反応法は、グルコースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、糖の分解が生じるため収率が悪く、精製負荷が大きいという問題がある。 A fourth chemical reaction method is a method of preparing mannose by isomerizing glucose under alkaline conditions. However, this method has the problem that the yield is poor due to decomposition of the sugar and the purification load is large.

第五の化学反応法は、同じくフルクトースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、第四の化学反応法と同様に収率および精製負荷の点で問題があり、またフルクトースがグルコースに比べ比較的高価である点およびフルクトースが反応系に残存してしまいマンノースとの分離が困難である点でも問題がある。 A fifth chemical reaction method is a method of preparing mannose by isomerizing fructose under alkaline conditions. However, this method has the same problems as the fourth chemical reaction method in terms of yield and purification load, fructose is relatively expensive compared to glucose, and fructose remains in the reaction system, resulting in mannose. Another problem is that it is difficult to separate the

第一の酵素法としては、フルクトースにマンノースイソメラーゼを作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、原料となるフルクトースの価格面および反応系に残存するフルクトースの分離の点で問題がある。 The first enzymatic method is a method of preparing mannose by allowing mannose isomerase to act on fructose. However, there are problems in terms of the price of fructose as a raw material and the separation of fructose remaining in the reaction system.

第二の酵素法としては、グルコースあるいはフルクトースに対してアルドース－ケトースイソメラーゼ（Ａｌｄｏｓｅ－ｋｅｔｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＫＩ」と記載する）を作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、反応系に残存するフルクトースの分離の点でやはり問題がある。 The second enzymatic method is a method of preparing mannose by allowing Aldose-ketose isomerase (hereinafter referred to as "AKI") to act on glucose or fructose. However, this method is still problematic in terms of separation of fructose remaining in the reaction system.

また、セロビオースなどの還元末端糖残基がβ－１，４結合で結合している２つ以上の糖残基からなる糖について、前記還元末端糖残基の２位の水酸基を２－エピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を触媒する酵素として、セロビオース２－エピメラーゼ（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＣＥ」と記載する）が知られている（特許文献３、特許文献４）。当該酵素により、グルコースがβ－１，４結合されたセロビオースを４－Ｏ－β－グルコシルマンノースへ変換、またはその逆反応を触媒することができる。また、特許文献４には、当該セロビオース２－エピメラーゼをグルコースに作用させると、マンノースが得られたことが記載されている（第三の酵素法）。 In addition, regarding sugars such as cellobiose, which consist of two or more sugar residues in which the reducing end sugar residues are linked via β-1,4 bonds, the hydroxyl group at the 2-position of the reducing end sugar residue is 2-epimerized. Cellobiose 2-epimerase (hereinafter referred to as “CE”) is known as an enzyme that catalyzes the (isomerization) reaction or its reverse reaction (Patent Documents 3 and 4). The enzyme can convert cellobiose with β-1,4-linked glucose to 4-O-β-glucosylmannose, or catalyze the reverse reaction. Moreover, Patent Document 4 describes that mannose was obtained by allowing the cellobiose 2-epimerase to act on glucose (third enzymatic method).

特開２００１－２１３７８１号Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-213781 特開２００１－２７５５８３号Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-275583 特開２０１２－１３０３３２号JP 2012-130332 国際公開２０１０／０９００９５号WO2010/090095

しかし、特許文献４に記載のＣＥを用いる第三の酵素法では、ＣＥがエピメリ化反応に加えアルドース－ケトース異性化反応も触媒する。そのため、マンノースと共にフルクトースも生成してしまい、副生するフルクトースの分離の点で問題がある。
また、これまで、ケトースを実質的に生成せずにアルドース間で異性化する酵素はＡＧＥやＣＥしか報告されておらず、非修飾単糖類にて同様の反応を行う酵素はこれまで全く知られていない。 However, in the third enzymatic method using CE described in Patent Document 4, CE catalyzes not only the epimerization reaction but also the aldose-ketose isomerization reaction. Therefore, fructose is produced together with mannose, and there is a problem in separation of by-produced fructose.
In addition, until now, only AGE and CE have been reported as enzymes that isomerize between aldoses without substantially producing ketoses, and no enzymes that perform similar reactions with unmodified monosaccharides have been known. not

本発明は、より安価・簡便にマンノースを製造する手段を提供することを目的とする。より詳細には、比較的安価な原料を用いてマンノースを効率よく製造できる方法及びその方法に用いることができる酵素又は酵素剤を提供することが本発明の課題であり、目的である。タロースを効率よく製造できる方法及びその方法に用いることができる酵素又は酵素剤を提供することも本発明の課題であり、目的である。 An object of the present invention is to provide means for producing mannose more inexpensively and easily. More specifically, it is an object and object of the present invention to provide a method for efficiently producing mannose using relatively inexpensive raw materials, and an enzyme or enzymatic agent that can be used in the method. It is also an object and object of the present invention to provide a method for efficiently producing talose and an enzyme or enzymatic agent that can be used in the method.

本発明者らは、これまでにＣＥをはじめ、種々の糖の異性化酵素を探索してきた。 The present inventors have so far searched for various sugar isomerases including CE.

ルネラ・スリシフォルミス（Runella slithyformis）はゲノム上にＮ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（Ｎ－ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＧＥと記載する」）をコードすると推定される遺伝子を３種類有していることが知られている（Gene Bank）。それぞれを発現解析した結果、３種のうち２種はＣＥ活性を有していたが、残る１種についてはＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかった。このＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかったタンパク質について、各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、このＣＥ活性を有しないタンパク質は、驚くべきことに、グルコースおよびマンノースに対して作用し、それぞれマンノースおよびグルコースを生成した。すなわち、当該タンパク質はグルコースとマンノースを相互に変換するマンノース２－エピメラーゼ（Ｍａｎｎｏｓｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＭＥ」と記載する）であることが明らかとなった。 Runella slithyformis has three types of genes presumed to encode N-acylglucosamine 2-epimerase (hereinafter referred to as "AGE") on its genome. Known (Gene Bank). As a result of expression analysis of each, two of the three had CE activity, but the remaining one did not have AGE or CE activity. Reactivity to various carbohydrates was examined for the proteins that did not have AGE activity and CE activity. As a result, this protein without CE activity surprisingly acted on glucose and mannose to produce mannose and glucose, respectively. That is, it was clarified that the protein is mannose 2-epimerase (hereinafter referred to as "ME") that converts glucose and mannose mutually.

さらに、ディアドバクター ファーメンタンス（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からＡＧＥと推定されるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、ＡＧＥと推定されるタンパク質の中に、ＭＥ活性を有するタンパク質があることが明らかとなった。 Furthermore, a gene encoding a protein presumed to be an AGE was cloned from Dyadobacter fermentans, and the reactivity of the recombinant enzyme to various carbohydrates was examined. As a result, it was clarified that among the proteins presumed to be AGEs, there is a protein having ME activity.

これらのタンパク質は、既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列と比較すると特異的な挿入配列を有しており、当該挿入配列の存在がＭＥとしての機能上極めて重要であること、さらに当該挿入配列に類似する複数のＭＥを新たに見出し、本発明を完成するに至った。 These proteins have a specific insertion sequence when compared with the known primary amino acid sequences such as CE, and the presence of the insertion sequence is extremely important for the function of ME, and furthermore, the insertion sequence is similar to the insertion sequence. The present inventors have newly found a plurality of MEs that do so, and have completed the present invention.

本発明は以下の通りである。
［１］
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
［２］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質。
［３］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質。
［５］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］又は［４］に記載のタンパク質。
［６］
［１］～［５］のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤。
［７］
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有する［１］～［５］のいずれか１項に記載のタンパク質。
［８］
（ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
［９］
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［８］に記載のタンパク質。
［１０］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［８］に記載のタンパク質。
［１１］
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤。
［１２］
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質から、（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質を選択すること及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
［１３］
（ｄ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を挿入すること、または（ｅ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部の配列を、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列に改変すること、及び
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）で挿入又は改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
［１４］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１５］
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、［１２］～［１４］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１６］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１７］
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、［１２］、［１３］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］
グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、［１２］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１９］
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、［１２］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［２０］
グルコースに、［１］～［５］のいずれか１項に記載のタンパク質、［６］若しくは［１１］に記載のエピメリ化剤又は［１２］～［１８］のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質を作用させて、マンノースを生成させることを含む、マンノースの製造方法。
［２１］
配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするガラクトースとタロースのエピメリ化剤。
［２２］
ガラクトースに、［７］～［１０］のいずれか１項に記載のタンパク質、［１２］～［１７］のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質、または［２１］に記載のエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む、タロースの製造方法。 The present invention is as follows.
[1]
(a) has an inserted sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 2 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence with an identity of 50% or more with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in and having epimerization activity of glucose and mannose, or (b) SEQ ID NO: 12 having an insertion sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the indicated amino acid sequence;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 12 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in , and has epimerization activity for glucose and mannose (however, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, excluding proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14).
[2]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
General formula (1):
X 1 APQIKFDX 2 X 3 WGWDRFX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 (where X 1 is V or I, X 2 is I or V, X 3 is V or I, X 4 is N, T or S, X 5 is P or E, X 6 is D or G, X 7 is G or D, X 8 is L, V, Q or A , X 9 is K or Q and X 10 is S, A, E or K);
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 The protein of [1], which is an amino acid sequence having 90% or more identity with.
[3]
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 An amino acid sequence with 90% or more identity with
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 427 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 The protein of [1] or [2], which has an amino acid sequence identity of 90% or more with the protein of [1] or [2].
[4]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 The protein of [1], which is an amino acid sequence having 90% or more identity with.
[5]
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 An amino acid sequence with 90% or more identity with
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 The protein of [1] or [4], which has an amino acid sequence identity of 90% or more with the protein of [1] or [4].
[6]
An epimerization agent for glucose and mannose, comprising the protein according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
[7]
The protein according to any one of [1] to [5], further having galactose and talose epimerization activity.
[8]
(c) has an insertion sequence of an amino acid sequence that has 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 10 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence with an identity of 50% or more with the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in and having galactose and talose epimerization activity, or (b) SEQ ID NO: 12 having an insertion sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the indicated amino acid sequence;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 12 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in , and has galactose and talose epimerization activity (however, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, excluding proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14).
[9]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 An amino acid sequence with 90% or more identity with
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10,
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 The protein of [8], which has an amino acid sequence identity of 90% or more with.
[10]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 An amino acid sequence with 90% or more identity with
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or identical to the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is an amino acid sequence with a sex of 90% or more,
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence with 90% or more identity, or an amino acid sequence with 90% or more identity with the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, according to [8] protein.
[11]
A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or 70% or more identical to the amino acid sequence of the protein An epimerizing agent for glucose and mannose, comprising as an active ingredient a protein having an amino acid sequence and epimerizing activity for glucose and mannose.
[12]
Proteins not known to have glucose and mannose epimerization activities and galactose and talose epimerization activities are selected from proteins that are (a) identical to the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Select a protein having an amino acid sequence whose identity is 70% or more, or (b) a protein having an amino acid sequence whose identity is 70% or more with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12. and (c) selecting from the proteins selected in (a) or (b) a protein having glucose and mannose epimerization activity, galactose and talose epimerization activity, or both,
A method for producing a protein having glucose and mannose epimerization activity and/or galactose and talose epimerization activity.
[13]
(d) an amino acid sequence of a known or unknown protein that has 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or shown in SEQ ID NO: 12 inserting an amino acid sequence with an identity of 70% or more with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence provided, or (e) inserting at least a partial sequence of the amino acid sequence of a protein whose amino acid sequence is known or unknown , an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and (f) from the protein inserted or modified in (d) or (e), epimerization activity of glucose and mannose, epimerization activity of galactose and talose, or selecting proteins that have both
A method for producing a protein having epimerization activity.
[14]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
General formula (1):
X 1 APQIKFDX 2 X 3 WGWDRFX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 (where X 1 is V or I, X 2 is I or V, X 3 is V or I, X 4 is N, T or S, X 5 is P or E, X 6 is D or G, X 7 is G or D, X 8 is L, V, Q or A , X 9 is K or Q and X 10 is S, A, E or K);
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 The production method of [12] or [13], wherein the amino acid sequence has 90% or more identity with.
[15]
an amino acid sequence in which the protein (a), (d) or (e) has 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 further has an amino acid sequence that is 90% or more identical to, and an amino acid sequence that is 50% or more or 90% or more identical to the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 427 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 The production method according to any one of [12] to [14], further having an amino acid sequence with 90% or more identity with.
[16]
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 The production method of [12] or [13], wherein the amino acid sequence has 90% or more identity with.
[17]
The protein of (b), (d) or (e) is an amino acid sequence having 50% or more or 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or Further has an amino acid sequence that has 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence that has 50% or more or 90% or more identity with the original amino acid sequence, or an amino acid sequence that has 90% or more identity with the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 The production method according to [12], [13] or [16], further comprising:
[18]
The production method according to any one of [12] to [17], which is production of a protein having epimerization activity of glucose and mannose.
[19]
The production method according to any one of [12] to [17], which is production of a protein having galactose and talose epimerization activity.
[20]
Glucose, the protein of any one of [1] to [5], the epimeric agent of [6] or [11], or the method of any one of [12] to [18] A method for producing mannose, comprising allowing the protein produced in to act to produce mannose.
[21]
Galactose containing, as an active ingredient, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or a protein having epimerization activity for galactose and talose that has an identity of 70% or more with the amino acid sequence of the protein and the epimerizing agent of talose.
[22]
To galactose, the protein of any one of [7] to [10], the protein produced by the method of any one of [12] to [17], or the epimerization of [21] A method for producing talose, comprising allowing an agent to act to produce talose.

本発明によれば、安価なグルコースを原料とし、本発明者らが新たな基質特異性を有することを見出した複数のＭＥにより、グルコースをマンノースへそれぞれエピメリ化することでより、簡便かつ効率的にマンノースを製造することができる。 According to the present invention, inexpensive glucose is used as a raw material, and by epimerizing glucose to mannose using multiple MEs that the present inventors have found to have new substrate specificity, it is easier and more efficient mannose can be produced in

Runsl_4512遺伝子産物(RsME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。The results of reactivity tests of Runsl_4512 gene product (RsME) to various substrates are shown. RsMEのグルコース、マンノースおよびフルクトースに対する反応性試験結果を示す。Fig. 3 shows the reactivity test results of RsME to glucose, mannose and fructose. RsMEの最適pHを求める試験結果を示す。Test results for determining the optimum pH of RsME are shown. RsMEのpH安定性試験結果を示す。The pH stability test results of RsME are shown. RsMEの熱安定性試験結果を示す。The results of a thermal stability test of RsME are shown. RsMEのグルコースからのマンノース生成試験（温度依存性）結果を示す。The results of a mannose production test (temperature dependence) from glucose for RsME are shown. Dfer_5652遺伝子産物(DfME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。The results of reactivity tests of the Dfer_5652 gene product (DfME) to various substrates are shown. DfMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results of DfME to various substrates are shown. DfMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results of DfME to various substrates are shown. DfMEの最適pHを求める試験結果を示す。Shown are test results for determining the optimum pH of DfME. DfMEのpH安定性試験結果を示す。2 shows the pH stability test results of DfME. DfMEの熱安定性試験結果を示す。1 shows the thermal stability test results of DfME. Emtol_1243遺伝子産物(EoME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。Shown are the reactivity test results of Emtol_1243 gene product (EoME) to various substrates. EoMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results for various substrates of EoME are shown. Slin_6381遺伝子産物(SlME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。The results of reactivity test of Slin_6381 gene product (SlME) to various substrates are shown. SlMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results of SlME to various substrates are shown. Spirs_3060遺伝子産物(SsME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。Fig. 3 shows the reactivity test results of Spirs_3060 gene product (SsME) to various substrates. SsMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results of SsME to various substrates are shown. Trebr_2067遺伝子産物(TbME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。The results of reactivity test of Trebr_2067 gene product (TbME) to various substrates are shown. TbMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。Reactivity test results of TbME to various substrates are shown. Treaz_2550遺伝子産物(TaME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。The reactivity test results of the Treaz_2550 gene product (TaME) to various substrates are shown. TaMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。The results of reactivity tests of TaME to various substrates are shown. 挿入配列付近のタンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２のアミノ酸配列、機能未知及び既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列との比較表。Amino acid sequences of proteins Runsl — 4512 and Dfer — 5652 near the insertion sequence, comparison table with primary amino acid sequences such as CEs of unknown and known function. タンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２を含む、機能未知のタンパク質であって挿入配列付近の一次アミノ酸配列比較表。A primary amino acid sequence comparison table of proteins of unknown function, including the protein Runsl_4512, near the insertion sequence. タンパク質Ｄｆｅｒ＿５６５２を含む、機能未知のタンパク質であって挿入配列付近の一次アミノ酸配列との比較表。A comparison table of primary amino acid sequences near the insertion sequences of proteins of unknown function, including the protein Dfer_5652. Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列（配列番号１）及びこの塩基配列がコードするＲｕｎｓｌ＿４５１２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。1 shows the base sequence of the Runsl — 4512 gene (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of the Runsl — 4512 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 2). Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列（配列番号３）及びこの塩基配列がコードするＤｆｅｒ＿５６５２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。The base sequence of the Dfer — 5652 gene (SEQ ID NO: 3) and the amino acid sequence of the Dfer — 5652 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 4) are shown. Ｅｍｔｏｌ＿１２４３遺伝子の塩基配列（配列番号５）及びこの塩基配列がコードするＥｍｔｏｌ＿１２４３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。The base sequence of the Emtol — 1243 gene (SEQ ID NO: 5) and the amino acid sequence of the Emtol — 1243 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 6) are shown. Ｓｌｉｎ＿６３８１遺伝子の塩基配列（配列番号７）及びこの塩基配列がコードするＳｌｉｎ＿６３８１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。The base sequence of the Slin — 6381 gene (SEQ ID NO: 7) and the amino acid sequence of the Slin — 6381 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 8) are shown. Ｓｐｉｒｓ＿３０６０遺伝子の塩基配列（配列番号９）及びこの塩基配列がコードするＳｐｉｒｓ＿３０６０タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。The base sequence of the Spirs — 3060 gene (SEQ ID NO: 9) and the amino acid sequence of the Spirs — 3060 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 10) are shown. Ｔｒｅｂｒ＿２０６７遺伝子の塩基配列（配列番号１１）及びこの塩基配列がコードするＴｒｅｂｒ＿２０６７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。The base sequence of the Trebr — 2067 gene (SEQ ID NO: 11) and the amino acid sequence of the Trebr — 2067 protein encoded by this base sequence (SEQ ID NO: 12) are shown. Ｔｒｅａｚ＿２５５０遺伝子の塩基配列（配列番号１３）及びこの塩基配列がコードするＴｒｅａｚ＿２５５０タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。The nucleotide sequence of the Treaz — 2550 gene (SEQ ID NO: 13) and the amino acid sequence of the Treaz — 2550 protein encoded by this nucleotide sequence (SEQ ID NO: 14) are shown.

本明細書における糖質の記載について、特に明記しない場合はＤ体を表す。 Carbohydrate descriptions herein refer to the D-form unless otherwise specified.

＜グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質＞
本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有するグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質に関する。但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く。
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質。 <Protein having epimerization activity of glucose and mannose>
The present invention relates to a protein having the following amino acid sequence (a) or (b) and epimerization activity for glucose and mannose. However, proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 are excluded.
(a) has an inserted sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 2 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of amino acid residues 264 to 423 of the amino acid sequence shown in , and has epimerization activity for glucose and mannose.
(b) has an insertion sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 12 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of amino acid residues 263 to 419 of the amino acid sequence shown in , and has glucose and mannose epimerization activity.

前述したように、ルネラ・スリシフォルミス（Ｒｕｎｅｌｌａ ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１９５９４）はゲノム上にＮ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）をコードすると推定される遺伝子を３種類有していることが知られている（Gene Bank）。本発明者等はそれぞれを発現解析した結果、３種のうち２種はＣＥ活性を有していたが、残る１種についてはＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかった。このＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかったタンパク質について、各種糖質に対する反応性を検討した（実施例１）。その結果、このＣＥ活性を有しないタンパク質は、驚くべきことに、グルコースおよびマンノースに対して作用し、それぞれマンノースおよびグルコースを生成した。すなわち、当該タンパク質はグルコースとマンノースを相互に変換するマンノース２－エピメラーゼ（ＭＥ）であることが明らかとなった。このＣＥ活性を有しないタンパク質が、配列番号２に示された１～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）である。Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基配列であり、またこの塩基配列からＲｕｎｓｌ＿４５１２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１３９３０１２４）。但し、配列番号２に示された１～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）は、本発明以前においては機能未知であった。 As described above, Runella slithyformis (DSM19594) is known to have three types of genes presumed to encode N-acylglucosamine 2-epimerase (AGE) on its genome ( Gene Bank). The present inventors analyzed the expression of each of them and found that two of the three had CE activity, but the remaining one did not have AGE or CE activity. The protein that did not have AGE activity and CE activity was examined for reactivity to various carbohydrates (Example 1). As a result, this protein without CE activity surprisingly acted on glucose and mannose to produce mannose and glucose, respectively. That is, it was clarified that the protein is mannose 2-epimerase (ME) that converts glucose and mannose mutually. This protein without CE activity is a protein (Runsl_4512) having an amino acid sequence of 1 to 423 amino acid residues shown in SEQ ID NO:2. The nucleotide sequence of the Runsl — 4512 gene is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and from this nucleotide sequence, Runsl — 4512 is published in the Gene Bank as a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (Gene Bank ID: WP_013930124). However, the function of the protein (Runsl_4512) having the amino acid sequence of 1 to 423 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 2 was unknown prior to the present invention.

本発明においては、さらに、ディアドバクター ファーメンタンス （Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（ＤＳＭ１８０５３）からＡＧＥと推定されるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の各種糖質に対する反応性を検討した（実施例２）。その結果、ＡＧＥと推定されるタンパク質の中に、ＭＥ活性を有するタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）があることが明らかとなった。Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基配列であり、またこの塩基配列からタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）は、配列番号４で表される１～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１５８１５０８２）。但し、タンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）本発明以前においては機能未知であった。 In the present invention, a gene encoding a protein presumed to be an AGE was cloned from Dyadobacter fermentans (DSM18053), and the reactivity of the recombinant enzyme to various carbohydrates was examined (Example 2). As a result, it was revealed that among the proteins presumed to be AGEs, there is a protein (Dfer — 5652) with ME activity. The base sequence of the Dfer — 5652 gene is the base sequence of SEQ ID NO: 3, and from this base sequence, the protein (Dfer — 5652) consists of the amino acid sequence of 1 to 423 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 4 in the Gene Bank. It is publicly available (Gene Bank ID: WP_015815082). However, the function of the protein (Dfer — 5652) was unknown prior to the present invention.

これら２つのタンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２は、既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列と比較すると特異的な挿入配列（以下、単に挿入配列ということがある）を有しており（図２３ａ～ｃ）、この挿入配列の存在がＭＥとしての機能上極めて重要であろうと推定した。この挿入配列が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列である。次いで、Ｎ－ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ （ＡＧＥ）等とデータベース上で推定され、更にこの挿入配列と一定以上の同一性を有する配列を有する機能未知のタンパク質を探索し、追加で５種のタンパク質の機能を検討した。それらが、エムティシシア オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上にそれぞれ存在する、ＡＧＥ等とデータベース上で推定されている遺伝子にコードされたタンパク質であり、これらタンパク質の各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、挿入配列を有するＡＧＥ等と推定されるタンパク質はいずれも、ＭＥ活性を有するタンパク質（Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０）であることが明らかとなった（実施例３～７）。Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号５、７、９、１１、１３の塩基配列であり、またこの塩基配列からタンパク質（Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０）は、それぞれ配列番号６、８、１０、１２及び１４で表されるアミノ酸配列からなることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ＩＤ：それぞれ、ＷＰ＿０１５０２８０９２、ＡＤＢ４２３３９、ＷＰ＿０１３２５５６２０、ＷＰ＿０１３７５９１８５およびＷＰ＿０１５７１２９７７）。但し、これらのタンパク質は、本発明以前においては機能未知であった。 These two proteins, Runsl — 4512 and Dfer — 5652, have specific insertion sequences (hereinafter sometimes simply referred to as insertion sequences) when compared with known primary amino acid sequences such as CE (FIGS. 23a-c). It was presumed that the presence of the sequence would be extremely important for its function as an ME. This inserted sequence is the amino acid sequence of amino acid residues 241-263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. Then, N-acylglucosamine 2-epimerase (AGE) etc. is estimated on the database, and a protein with unknown function having a sequence having a certain or more identity with this inserted sequence is searched, and the function of 5 additional proteins It was investigated.それらが、エムティシシア オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上にそれぞれIt is a protein encoded by a gene that is presumed to be AGE etc. on the database, and the reactivity of these proteins to various carbohydrates was examined. As a result, it was revealed that the proteins presumed to be AGEs and the like having the inserted sequences are all proteins having ME activity (Emtol_1243, Slin_6381, Spirs_3060, Trebr_2067 and Treaz_2550) (Examples 3 to 7). The base sequences of the Emtol_1243, Slin_6381, Spirs_3060, Trebr_2067 and Treaz_2550 genes are the base sequences of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11 and 13, respectively, and proteins (Emtol_1243, Slin_6381, Spirs_3060, Trebr_2067 and Treaz_550) were obtained from the base sequences. are published in the Gene Bank consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12 and 14, respectively (Gene Bank IDs: WP_015028092, ADB42339, WP_013255620, WP_013759185 and WP_015712977, respectively). However, the functions of these proteins were unknown prior to the present invention.

（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列であることができる。
一般式（１）のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８及び１０で表されるアミノ酸配列における挿入配列に基づき、かつＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10は、これらの挿入配列におけるバリエーションから決定されたものである。 The amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) preferably has 80% or more, 90% or more identity. , 95% or greater, 98% or greater, or 99% or greater. Furthermore, an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) is represented by general formula (1):
X 1 APQIKFDX 2 X 3 WGWDRFX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 (where X 1 is V or I, X 2 is I or V, X 3 is V or I, X 4 is N, T or S, X 5 is P or E, X 6 is D or G, X 7 is G or D, X 8 is L, V, Q or A , X 9 is K or Q and X 10 is S, A, E or K).
The amino acid sequence of general formula (1) is based on the insertion sequences in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 and 10, and X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X7 , X8 , X9 , and X10 were determined from variations in these insertion sequences.

（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。これら２４１～２６３アミノ酸残基（配列番号２、４、６、８）又は２４１～２６４アミノ酸残基（配列番号１０）は、各タンパク質における挿入配列である。 An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) is, for example, 241 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 an amino acid sequence having 90% or more identity with an amino acid sequence of ~263 amino acid residues,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to. These 241-263 amino acid residues (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8) or 241-264 amino acid residues (SEQ ID NO:10) are insertion sequences in each protein.

（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) is, for example,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the protein (a) is, for example,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 427 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列であることができる。一般式（２）のアミノ酸配列は、配列番号１２及び１４で表されるアミノ酸配列における挿入配列に基づき、かつＸ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15は、これらの挿入配列におけるバリエーションから決定されたものである。 The amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) preferably has 80% or more, 90% or more identity. , 95% or greater, 98% or greater, or 99% or greater. Furthermore, an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) is represented by general formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R can be an array. The amino acid sequence of general formula (2) is based on the insertion sequences in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 12 and 14, and X 11 , X 12 , X 13 , X 14 and X 15 are variations in these insertion sequences. It is determined from

（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることもできる。 The amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein of (b) is 241 to 262 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of amino acid residues, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 can also

（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) is, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be

（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (b) is, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be

尚、本願明細書においてアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列とは、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。 In the present specification, an amino acid sequence having an identity of 90% or more with an amino acid sequence is preferably an amino acid sequence having an identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more. be.

本発明において、タンパク質がグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質であることは、実施例にも記載された以下の活性測定方法により確認することができる。
活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、およびタンパク質（酵素）を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止する。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量する。ヘキソキナーゼ法は、0.5 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、1.0 U/mL へキソキナーゼ (パン酵母由来、ナカライテスク) および1.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ (ナカライテスク) を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定する。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義する。 In the present invention, whether the protein has epimerization activity for glucose and mannose can be confirmed by the following activity measurement method described in Examples.
Activity measurement
100 μL of the reaction solution containing 10 mM mannose, 40 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0), and protein (enzyme) is held at 37°C for 20 minutes and then heated at 80°C for 5 minutes to stop the enzyme reaction. . The amount of glucose contained in 50 μL of the supernatant obtained by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes is quantified by the hexokinase method using Thio-NAD + . For the hexokinase method, 0.5 mM Thio-NAD + , 7 mM ATP, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.0 mM MgCl 2 , 1.0 U/mL hexokinase (derived from baker's yeast, Nacalai Tesque) and 1.0 U/mL G6P An equal volume of a coloring reagent containing dehydrogenase (Nacalai Tesque) was added to the reaction solution and kept at 37°C for 20 minutes. Measured by Enzyme activity 1 U is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of glucose per minute.

本発明のグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質には、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有するタンパク質がある。ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有するタンパク質であることは、実施例にも記載された以下の活性測定方法により確認することができる。
活性測定
10 mM ガラクトース、40 mM HEPES-Na緩衝液（pH 8.0）、およびタンパク質（酵素）を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止する。この反応停止液をHPLC分析に供し、酵素反応によって生成したタロースを検出する。なお、HPLCは『HILICpak VG-50 4E』カラム（Shodex社製）を用い、カラム温度40℃、流速0.6 ml/min、溶媒は80% アセトニトリルとして行う。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのタロースを生成する酵素量と定義する。 The proteins having glucose and mannose epimerization activity of the present invention include proteins that further have galactose and talose epimerization activity. Whether the protein further has galactose and talose epimerization activity can be confirmed by the following activity measurement method described in Examples.
Activity measurement
100 μL of the reaction solution containing 10 mM galactose, 40 mM HEPES-Na buffer (pH 8.0), and protein (enzyme) is held at 37°C for 20 minutes and then heated at 80°C for 5 minutes to stop the enzyme reaction. . This reaction-stopped solution is subjected to HPLC analysis to detect talose produced by the enzymatic reaction. HPLC is performed using a "HILICpak VG-50 4E" column (manufactured by Shodex) at a column temperature of 40°C, a flow rate of 0.6 ml/min, and a solvent of 80% acetonitrile. Enzyme activity 1 U is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of talose per minute.

＜エピメリ化剤＞
本発明は、上記本発明のタンパク質を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤を包含する。エピメリ化剤は、グルコースとマンノースをエピメリ化することができればよく、上記本発明のタンパク質以外に、他の酵素、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる素材を含んでいてもよい。また、その形状も特に制限は無く、粉末状、液状でもよく、担体に固定化された固定化酵素であっても良い。本発明のエピメリ化剤は、例えば、基質であるグルコースの水溶液に添加することで使用することができる。 <Epimerization agent>
The present invention includes an epimeric agent for glucose and mannose containing the protein of the present invention as an active ingredient. The epimerization agent is sufficient as long as it can epimerize glucose and mannose, and in addition to the protein of the present invention, it may contain materials used in ordinary enzyme preparations, such as other enzymes, stabilizers, and excipients. good. Also, the form thereof is not particularly limited, and may be in the form of powder, liquid, or an immobilized enzyme immobilized on a carrier. The epimerization agent of the present invention can be used, for example, by adding it to an aqueous solution of glucose as a substrate.

本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤を包含する。 The present invention provides a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or a protein having amino acid sequence identity with the protein. It includes an epimerization agent for glucose and mannose containing, as an active ingredient, a protein having an amino acid sequence of 70% or more and having epimerization activity for glucose and mannose.

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれＲｕｎｓｌ＿４５１２、Ｄｆｅｒ＿５６５２、Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０のタンパク質であり、これらは、前述したように、ＭＥ活性を有する。 The proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14 are Runsl_4512, Dfer_5652, Emtol_1243, Slin_6381, Spirs_3060, Trebr_2067, respectively. and Treaz — 2550 proteins, which, as previously mentioned, have ME activity.

本発明のエピメリ化剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列と同一性が７０％以上、７５％以上、好ましくは、同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分として含有する。グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質であることは前述の活性測定方法にて確認できる。 The epimerizing agent of the present invention has 70% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, 75 % or more, preferably an amino acid sequence with an identity of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more, and has glucose and mannose epimerization activity It contains protein as an active ingredient. It can be confirmed by the activity measurement method described above that the protein has epimerization activity for glucose and mannose.

＜ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質＞
本発明は、下記（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有するガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質も包含する。但し、本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質から、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除かれる。
（ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質。 <Protein having galactose and talose epimerization activity>
The present invention also includes a protein having the following amino acid sequence (c) or (d) and epimerization activity for galactose and talose. However, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 from the protein having galactose and talose epimerization activity of the present invention except for proteins with
(c) has an insertion sequence of an amino acid sequence that has 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 10 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of amino acid residues 265 to 428 of the amino acid sequence shown in , and has galactose and talose epimerization activity.
(d) has an insertion sequence of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 12 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to the amino acid sequence of amino acid residues 263 to 419 of the amino acid sequence shown in , and has galactose and talose epimerization activity.

（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列（１～４２８アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０タンパク質であり、このタンパク質は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性に加えて、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性も有する。 The protein having the amino acid sequence (1 to 428 amino acid residues) shown in SEQ ID NO: 10 in the protein of (c) is the Spirs — 3060 protein, and in addition to the epimerization activity of glucose and mannose, this protein has galactose and It also has talose epimerization activity.

（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに、（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein (c) preferably has 80% or more, 90% or more identity. , 95% or greater, 98% or greater, or 99% or greater. Furthermore, the amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein of (c) is the amino acid sequence 241 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to an amino acid sequence of ˜264 amino acid residues.

（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein (c) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein of (c) is, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence having 90% or more identity with an amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues.

（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein (c) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the protein of (c) is 265 to 265 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that has 90% or more identity with an amino acid sequence of 428 amino acid residues.

（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (d) preferably has 80% or more, 90% or more identity. , 95% or greater, 98% or greater, or 99% or greater. Furthermore, the amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein of (d) has the general formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列（１～４１９アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７タンパク質であり、配列番号１４に示されたアミノ酸配列（１～４３０アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｔｒｅａｚ＿２５５０タンパク質であり、これらのタンパク質も、グルコースとマンノースのエピメリ化活性に加えて、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有する。 The protein having the amino acid sequence (1 to 419 amino acid residues) shown in SEQ ID NO: 12 in the protein of (d) is Trebr — 2067 protein, and the amino acid sequence (1 to 430 amino acid residues) shown in SEQ ID NO: 14. are the Treaz — 2550 proteins, which also have galactose and talose epimerization activities in addition to glucose and mannose epimerization activities.

（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (d) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein of (d) is, for example,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or identical to the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical.

（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 The amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein (d) preferably has 60% or more, 70% or more identity. , 80% or more, 90% or more, or 95% or more. Furthermore, the amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the protein of (d) is, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 90% or more identical to the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of, or 90% or more identical to the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be an array.

本発明のタンパク質は、その由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のタンパク質は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよい。 The origin of the protein of the present invention is not particularly limited. For example, the protein of the present invention may be a recombinant protein produced by various genetic engineering techniques, or a synthetic protein produced by chemical synthesis.

遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上述の本発明のタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を作成し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作製するに当たり、アミノ酸の欠失、置換及び／または付加を施すためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明のタンパク質をコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。 When the recombinant protein of the present invention is produced by genetic engineering technology, the protein of the present invention can be expressed by preparing a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the protein of the present invention and incorporating it into various expression vectors. can be made In order to perform amino acid deletion, substitution and/or addition in preparing the nucleic acid encoding the protein of the present invention, for example, error-prone PCR, DNA shuffling, various site-directed mutagenesis methods, etc. Any base deletions, substitutions and/or insertions can be made. The protein of the present invention can be produced by introducing the thus prepared nucleic acid encoding the protein of the present invention into an appropriate expression system.

本発明のタンパク質を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌、菌類（例えば、酵母類）等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。 The expression system that can be used to produce the protein of the present invention is not particularly limited, but for example, an expression vector that enables expression of a recombinant protein in various species (hosts) can be used. . Usable expression vectors include various expression vectors that enable protein expression in hosts such as microorganisms such as bacteria and fungi (e.g., yeast), plants, insect cells, and mammalian cells. It may be a viral vector (including a phage vector) or a plasmid vector. Alternatively, the protein of the present invention may be produced using a cell-free protein expression system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate, or the like.

特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明のタンパク質を発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、製造方法により調製することができる。 When the protein of the present invention is expressed in an expression system using a specific species as a host, the nucleic acid encoding the protein of the present invention is mounted on a vector, and the host cell is transformed with this vector. It can be prepared by a production method comprising culturing transformed host cells to accumulate the protein encoded by the gene in the culture, and collecting the accumulated protein.

本発明においては、本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。 In the present invention, a nucleic acid encoding the protein of the present invention, a vector containing the nucleic acid, and a transformant transformed with the vector are aspects of the present invention.

本発明のタンパク質をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、以下の実施例に記載の通り、本発明のタンパク質をコードする核酸を材料として本発明のタンパク質をコードする核酸を取得してもよいし、或いは本発明のタンパク質をコードする核酸を調製して、それに適当な置換等を行って、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造してもよい。また、本発明のタンパク質をコードする核酸は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。 The method for obtaining the nucleic acid encoding the protein of the present invention is not particularly limited. For example, as described in the following examples, the nucleic acid encoding the protein of the present invention may be used as a material to obtain the nucleic acid encoding the protein of the present invention, or the nucleic acid encoding the protein of the present invention may be prepared. Then, appropriate substitutions or the like may be performed thereon to produce a nucleic acid encoding the protein of the present invention. Nucleic acids encoding the proteins of the present invention can be produced by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, or mutagenesis.

本発明のタンパク質は、アミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列が分かれば既存の方法で適宜調製することができる。このような製造方法に加えて本発明は以下の製造方法（１）及び（２）も包含する。 The protein of the present invention can be appropriately prepared by existing methods if the amino acid sequence or the nucleotide sequence encoding it is known. In addition to such production methods, the present invention also includes the following production methods (1) and (2).

＜エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法＞
本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）は、グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質から、（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質を選択すること及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む。 <Method for Producing Protein Having Epimerization Activity>
The method (1) for producing a protein having epimerization activity on glucose and mannose and/or epimerization activity on galactose and talose of the present invention (1) has epimerization activity on glucose and mannose and epimerization activity on galactose and talose. (a) a protein having an amino acid sequence identity of 70% or more with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (b) SEQ ID NO: 12, from an unknown protein Selecting a protein having an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in and (c) from the protein selected in (a) or (b), This includes selecting proteins that have glucose and mannose epimerization activity, galactose and talose epimerization activity, or both.

上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質の選択は、アミノ酸配列が既知のタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて行うことができる。本製造方法に用いるアミノ酸配列既知のタンパク質としては、後述の表５並びに図２３ｂ及び図２３ｃに示す、挿入配列を有するタンパク質を例示することができる。（ｃ）における選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質の選択は、選択したタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを調製し、これを発現し、酵素活性を測定することで実施することができる。ＤＮＡ調製、発現は、前述の既存の方法で実施できる。酵素活性測定は、前述のとおりである。 The protein (a) or (b) above can be selected based on amino acid sequence information of proteins whose amino acid sequences are known. Examples of proteins with known amino acid sequences used in this production method include proteins having insertion sequences shown in Table 5 below and Figures 23b and 23c. From the proteins selected in (c), selection of proteins having glucose and mannose epimerization activity, galactose and talose epimerization activity, or both, prepares DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the selected protein It can be carried out by expressing this and measuring the enzymatic activity. DNA preparation and expression can be performed by the existing methods described above. Enzyme activity measurement is as described above.

本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（２）は、（ｄ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を挿入すること、または（ｅ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部の配列を、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列に改変すること、及び
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）で挿入又は改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む。 The method (2) for producing a protein having glucose and mannose epimerization activity and/or galactose and talose epimerization activity of the present invention includes (d) the amino acid sequence of a protein with a known or unknown amino acid sequence, SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence that has 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the indicated amino acid sequence or an amino acid sequence that has 70% identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or (e) inserting at least a partial sequence of the amino acid sequence of a protein with a known or unknown amino acid sequence, amino acid residues 241 to 263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 modifying an amino acid sequence with an identity of 70% or more with the sequence or an amino acid sequence with an identity of 70% or more with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and (f) Selecting from the proteins inserted or modified in (d) or (e) a protein having glucose and mannose epimerization activity, galactose and talose epimerization activity, or both.

上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて行うことができる。アミノ酸配列既知のタンパク質の例としては、図２３ａに示すタンパク質を挙げることができる。挿入及び改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質の選択は、選択したタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを調製し、これを発現し、酵素活性を測定することで実施することができる。上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、好ましくは、特許文献３及び４に記載のＣＥとアミノ酸配列の同一性が７０％以上のアミノ酸配列に対し実施するができる。グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質が選択される確率が高くなるという観点から、好ましくは、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であるタンパク質のアミノ酸配列に対して配列挿入及び／又は改変を行うのよりこのましい。また、上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、図２３ａに示すアミノ酸配列既知のタンパク質に対して行うこともでき、アミノ酸配列既知のタンパク質は、機能既知であっても、機能未知であっても、本発明で特定する挿入配列を有さないアミノ酸配列であればよい。本発明で特定する挿入配列を挿入し、必要により、挿入配列部分またはその前後の配列の改変を行うこともできる。機能既知のタンパク質への、本発明で特定する挿入配列の挿入により、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質に改変される可能性がある。ＤＮＡ調製、発現は、前述の既存の方法で実施できる。酵素活性測定は、前述のとおりである。 The sequence insertion and modification into the protein (d) or (e) above can be performed based on the amino acid sequence information of a protein whose amino acid sequence is known or unknown. Examples of proteins whose amino acid sequences are known include the protein shown in FIG. 23a. A protein having epimerization activity for glucose and mannose, epimerization activity for galactose and talose, or both of them is selected from the inserted and modified proteins by preparing a DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the selected protein, This can be done by expressing it and measuring the enzymatic activity. The above (d) or (e) sequence insertion and modification into the protein can preferably be carried out on an amino acid sequence having 70% or more identity with the CE described in Patent Documents 3 and 4. Preferably, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% from the viewpoint of increasing the probability of selecting a protein having glucose and mannose epimerization activity, galactose and talose epimerization activity, or both. More preferably, sequence insertions and/or alterations are made to the amino acid sequence of the protein that is greater than or equal to 99%. In addition, the sequence insertion and modification to the protein (d) or (e) above can also be performed on a protein with a known amino acid sequence shown in FIG. , even if the function is unknown, it may be an amino acid sequence that does not have the insertion sequence specified in the present invention. The insertion sequence specified in the present invention can be inserted, and if necessary, the insertion sequence portion or the sequences before and after it can be modified. By inserting the insertion sequence specified in the present invention into a protein whose function is known, the protein may be modified to have epimerization activity for glucose and mannose, epimerization activity for galactose and talose, or both. DNA preparation and expression can be performed by the existing methods described above. Enzyme activity measurement is as described above.

グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができ、例えば、一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 In methods (1) and (2) for producing a protein having epimerization activity for glucose and mannose and/or epimerization activity for galactose and talose,
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in (a), (d) or (e) preferably has 80% identity. % or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more, for example, general formula (1):
X 1 APQIKFDX 2 X 3 WGWDRFX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 (where X 1 is V or I, X 2 is I or V, X 3 is V or I, X 4 is N, T or S, X 5 is P or E, X 6 is D or G, X 7 is G or D, X 8 is L, V, Q or A , X9 is K or Q, and X10 is S, A, E or K), and has identity with the amino acid sequence of amino acid residues 241 to 263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. 90% or more amino acid sequence,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）を経て、（ｃ）又は（ｆ）で調製されるタンパク質が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有するタンパク質であることができる。 In methods (1) and (2) for producing a protein having epimerization activity,
Through (a), (d) or (e), the protein prepared in (c) or (f) is identical to the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 50% or more or 90% or more of the amino acid sequence,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 further has an amino acid sequence that is 90% or more identical to, and an amino acid sequence that is 50% or more or 90% or more identical to the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 427 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 It can also be a protein that further has an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができ、例えば、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。 In methods (1) and (2) for producing a protein having epimerization activity,
An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 in (b), (d) or (e) preferably has 80% identity. % or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more, for example,
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 It can be an amino acid sequence that is 90% or more identical to.

エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）を経て、（ｃ）又は（ｆ）で調製されるタンパク質が、（ｂ）のタンパク質が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有するタンパク質であることができる。 In methods (1) and (2) for producing a protein having epimerization activity,
Through (b), (d) or (e), the protein prepared in (c) or (f) is the protein of (b), 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 An amino acid sequence that has 50% or more or 90% or more identity with the original amino acid sequence, or an amino acid sequence that has 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 Furthermore, an amino acid sequence having 50% or more or 90% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 It can be a protein further having an amino acid sequence that is 90% or more identical to the amino acid sequence of 268-430 amino acid residues.

本発明の製造方法（１）及び（２）は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である。本発明の製造方法は、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造であることもできる。ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造においては、酵素活性の測定をガラクトースとタロースのエピメリ化活性について行えばよい。 The production methods (1) and (2) of the present invention are for producing a protein having epimerization activity for glucose and mannose. The production method of the present invention can also be production of a protein having galactose and talose epimerization activity. In the production of a protein having galactose and talose epimerization activity, the enzymatic activity may be measured for galactose and talose epimerization activity.

＜マンノースの製造方法＞
本発明は、マンノースの製造方法を包含し、本発明のマンノースの製造方法は、グルコースに、本発明のグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、本発明のエピメリ化剤又は本発明の方法で製造したタンパク質を作用させて、マンノースを生成させることを含む。本発明のタンパク質等を用いるグルコースからマンノースの生成は、例えば、グルコースを含む固形分濃度１～５０％程度の糖質水溶液を調製し、必要応じて酸又はアルカリを用いてｐＨを６～１０程度に調整し、当該溶液に本発明のタンパク質を加え３０～６０℃に１～７２時間保持することでマンノース（マンノース含有糖質組成物）を製造することができる。上記酵素反応の後、必要に応じて常法を用いてマンノース含有糖質組成物に脱色・脱塩・精製処理などを施すことができる。さらに、得られたマンノース含有糖質組成物に樹脂分画処理等を施すことでマンノースと基質であるグルコース等を分離し、マンノース純度を高めることもできる。また、本発明のタンパク質を担体に固定して固定化酵素とし、当該固定化酵素に上記基質溶液を接触させることでマンノース（マンノース含有糖質組成物）を製造することもできる。 <Method for producing mannose>
The present invention includes a method for producing mannose, wherein the method for producing mannose comprises glucose, a protein having an epimerization activity of glucose and mannose of the present invention, the epimerization agent of the present invention, or the method of the present invention. It includes allowing the produced protein to act to produce mannose. For the production of mannose from glucose using the protein of the present invention, for example, an aqueous sugar solution containing glucose having a solid content concentration of about 1 to 50% is prepared, and if necessary, acid or alkali is used to adjust the pH to about 6 to 10. , the protein of the present invention is added to the solution, and the solution is maintained at 30 to 60°C for 1 to 72 hours to produce mannose (mannose-containing carbohydrate composition). After the above enzymatic reaction, the mannose-containing saccharide composition can be subjected to decolorization, desalting, purification treatment, etc., if necessary, using conventional methods. Further, the resulting mannose-containing saccharide composition can be subjected to resin fractionation or the like to separate mannose from substrates such as glucose, thereby increasing the purity of mannose. Alternatively, mannose (mannose-containing carbohydrate composition) can be produced by immobilizing the protein of the present invention on a carrier to form an immobilized enzyme, and bringing the immobilized enzyme into contact with the substrate solution.

グルコースからマンノースを生成する際の基質としては、グルコース純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよく、例えば、水飴、粉飴、ハイドロール（結晶グルコース製造の際に生ずる分蜜液）などを用いることができる。さらに、例えばデキストリン、澱粉等のグルコースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明のタンパク質と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるグルコースを生成しつつグルコースからマンノースを製造することもできる。 As a substrate for producing mannose from glucose, pure glucose may be used, but from the viewpoint of cost, etc., a sugar composition containing other sugars may be used. Hydrol (a fractional liquid produced during the production of crystalline glucose) or the like can be used. Furthermore, for example, saccharides containing glucose as a constituent sugar such as dextrin and starch may be used as raw materials, and a hydrolase may be added together with the protein of the present invention to produce glucose as a substrate from the raw materials while producing mannose from glucose. can.

＜ガラクトースとタロースのエピメリ化剤＞
本発明は、ガラクトースとタロースのエピメリ化剤を包含する。本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化剤は、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、７５％以上、好ましくは、同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とする。 <Epimerization of galactose and talose>
The present invention includes galactose and talose epimerizing agents. The epimerizing agent for galactose and talose of the present invention has 70% or more, 75% or more identity with the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, or with the amino acid sequence of the protein, Preferably, the active ingredient is a protein having galactose and talose epimerization activity with an identity of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more.

＜タロースの製造方法＞
本発明は、タロースの製造方法を包含し、本発明のタロースの製造方法は、ガラクトースに、本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、または本発明の方法で製造したガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、または本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む。本発明のタンパク質等を用いるガラクトースからタロースの生成は、例えば、ガラクトースを含む固形分濃度１～５０％程度の糖質水溶液を調製し、必要に応じて酸又はアルカリを用いてｐＨを６～１０程度に調整し、当該溶液に本発明のタンパク質を加え３０～６０℃に１～７２時間保持することでタロース（タロース含有糖質組成物）を製造することができる。上記酵素反応の後、必要に応じて常法を用いてタロース含有糖質組成物に脱色・脱塩・精製処理などを施すことができる。さらに、得られたタロース含有糖質組成物に樹脂分画処理等を施すことでタロースと基質であるガラクトース等を分離し、タロース純度を高めることもできる。また、本発明のタンパク質を担体に固定して固定化酵素とし、当該固定化酵素に上記基質溶液を接触させることでタロース（タロース含有糖質組成物）を製造することもできる。 <Method for producing talose>
The present invention includes a method for producing talose, and the method for producing talose of the present invention comprises galactose, the protein having the epimerization activity of galactose and talose of the present invention, or the galactose and talose produced by the method of the present invention. This includes producing talose by acting a protein having an epimerization activity or an epimerization agent for galactose and talose of the present invention. Production of talose from galactose using the protein or the like of the present invention is carried out by, for example, preparing an aqueous saccharide solution containing galactose and having a solid content concentration of about 1 to 50%, and adjusting the pH to 6 to 10 using an acid or alkali as necessary. The protein of the present invention is added to the solution and kept at 30-60° C. for 1-72 hours to produce talose (a saccharide composition containing talose). After the above enzymatic reaction, the talose-containing saccharide composition can be subjected to decolorization, desalting, purification, and the like using conventional methods, if necessary. Further, the obtained talose-containing saccharide composition can be subjected to resin fractionation or the like to separate talose from the substrate galactose or the like, thereby increasing the purity of talose. Alternatively, talose (a saccharide composition containing talose) can be produced by immobilizing the protein of the present invention on a carrier to form an immobilized enzyme, and bringing the immobilized enzyme into contact with the substrate solution.

ガラクトースからタロースを生成する際の基質としては、ガラクトース純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよい。さらに、例えば乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明のタンパク質と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるガラクトースを生成しつつガラクトースからタロースを製造することもできる。 As a substrate for producing talose from galactose, pure galactose may be used, but a sugar composition containing other carbohydrates may be used from the viewpoint of cost and the like. Furthermore, for example, saccharides containing galactose as a constituent sugar such as lactose are used as raw materials, and a hydrolase is added together with the protein of the present invention to produce talose from galactose while producing galactose as a substrate from the raw materials.

以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not intended to be limited to the examples.

［実施例１］
本実施例では、ルネラ スリシフォルミス （Ｒｕｎｅｌｌａ ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ）からＮ－ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＡＧＥ）と推定される機能未知のタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の特性評価を行った。 [Example 1]
In this example, a gene encoding a protein of unknown function (Runsl_4512) presumed to be N-acylglucosamine 2-epimerase (AGE) from Runella slithyformis was cloned, and the characteristics of the recombinant enzyme were evaluated.

（１）Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子のクローニング
Ｒ．ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ１９５９４）から、Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子をクローニングした。Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基配列であること、また前記塩基配列からＲｕｎｓｌ＿４５１２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている。 (1) Cloning of the Runsl — 4512 gene The Runsl — 4512 gene was cloned from Slithyformis (DSM19594). The Gene Bank has disclosed that the base sequence of the Runsl_4512 gene is the base sequence of SEQ ID NO: 1, and that Runsl_4512 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 based on the base sequence.

（２）Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子産物の調製
配列番号１に示すＲｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子から終止コドンを除いたものをｐＥＴ２３ａのＮｄｅ１－Ｘｈｏ１サイトに導入して、ヒスチジンタグを付与したＲｕｎｓｌ＿４５１２発現ベクターを構築した。前記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ600）が０．５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌイソプロピルβ－チオガラクトピラノシド１ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を７，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。得られた無細胞抽出液をニッケルイオンをキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ） に供して組換Ｒｕｎｓｌ＿４５１２を精製した。すなわち，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）で担体を洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２５０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）により溶出した。得られた試料を１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）に透析して以後の解析に用いた。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析し、単一のバンドであることを確認した。 (2) Preparation of Runsl — 4512 gene product A histidine-tagged Runsl — 4512 expression vector was constructed by removing the stop codon from the Runsl — 4512 gene shown in SEQ ID NO: 1 and introducing it into the Nde1-Xho1 site of pET23a. The expression vector was introduced into Escherichia coli BL21(DE3) to prepare a transformant. The transformant was inoculated into 30 mL of LBA medium containing 100 µg/mL ampicillin and cultured overnight at 37°C. This was placed in 1 L of LBA medium and cultured at 37° C. until the absorbance (A 600 ) at a wavelength of 600 nm reached 0.5. After ice-cooling the culture solution, 1 mL of 0.1 mol/L isopropyl β-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.1 mmol/L, and cultured at 16° C. for 24 hours. The culture solution was centrifuged at 7,000×g, 4° C. for 10 minutes to collect the cells. The cells were suspended in a 30 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl and disrupted by ultrasonication. The lysate obtained was centrifuged at 10,000×g, 4° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. The resulting cell-free extract was subjected to Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chelated with nickel ions to purify recombinant Runsl_4512. That is, after washing the carrier with 30 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl, elution was performed with 250 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl. did. The resulting sample was dialyzed against 10 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7) and used for subsequent analysis. Samples were analyzed by SDS-PAGE and confirmed to be a single band.

（３）反応生成物のＴＬＣ分析
５０ｍＭ各種基質、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７）および０．１７２ｍｇ／ｍＬ Ｒｕｎｓｌ＿４５１２からなる反応液５μＬを３７℃に４時間保持し、このうち１μＬを１－ブタノール／２－プロパノール／水＝２／２／１を展開溶媒としてＴＬＣに供した。糖をアニスアルデヒド／硫酸／酢酸＝１／２／９７をＴＬＣプレートに噴霧後，加熱することにより検出した。D-グルコース、D-マンノース、D-グルコサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、D-アロース、D-ガラクトース、D-キシロース、L-フコース、L-アラビノース、L-ラムノース、D-グルコース6-リン酸、D-マンノース6-リン酸、D-フルクトース、D-リキソース、D-タガトース、D-キシルロース、L-ソルボース、D-タロース、D-アルトロース、β-1,4-マンノビオースおよびD-グルコン酸を基質とした。その結果を図１に示す。D-グルコースおよびD-マンノースからのみ反応生成物が検出された。 (3) TLC Analysis of Reaction Products 5 μL of a reaction solution consisting of 50 mM various substrates, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and 0.172 mg/mL Runsl_4512 was held at 37° C. for 4 hours, and 1 μL of this was 1- TLC was performed using butanol/2-propanol/water=2/2/1 as a developing solvent. Sugars were detected by spraying anisaldehyde/sulfuric acid/acetic acid=1/2/97 onto a TLC plate followed by heating. D-glucose, D-mannose, D-glucosamine, N-acetylglucosamine, D-allose, D-galactose, D-xylose, L-fucose, L-arabinose, L-rhamnose, D-glucose 6-phosphate, D -Mannose 6-phosphate, D-fructose, D-lyxose, D-tagatose, D-xylulose, L-sorbose, D-talose, D-altrose, β-1,4-mannobiose and D-gluconic acid as substrates and The results are shown in FIG. Reaction products were detected only from D-glucose and D-mannose.

D-グルコース，D-マンノースおよびD-フルクトースに対する反応については，反応前後の試料をTLCにより分析した。上記と同様の組成の反応液20μLを同様に反応させ，TLCに供した。その結果を図２に示す。D-グルコースからのD-マンノースの生成，D-マンノースからのD-グルコースの生成が確認された。一方で、D-フルクトースからは反応生成物が検出されなかった。すなわち，Runsl_4512はD-グルコースとD-マンノースの相互変換を触媒するマンノース2-エピメラーゼであると判断された。 For the reaction to D-glucose, D-mannose and D-fructose, samples before and after the reaction were analyzed by TLC. 20 μL of the reaction solution having the same composition as above was similarly reacted and subjected to TLC. The results are shown in FIG. Production of D-mannose from D-glucose and production of D-glucose from D-mannose were confirmed. On the other hand, no reaction product was detected from D-fructose. Thus, Runsl_4512 was determined to be a mannose 2-epimerase that catalyzes the interconversion of D-glucose and D-mannose.

活性測定
10 mMマンノース，40 mM トリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて5分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をF-キットを用いたヘキソキナーゼ法により定量した。当該反応条件下で得られたRunsl_4512の比活性は，0.864 U/mgであった。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。 Activity measurement
0.1 mL of a reaction solution containing 10 mM mannose, 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) and enzyme was kept at 37°C for 10 minutes and then heated at 80°C for 5 minutes to stop the enzyme reaction. The amount of glucose contained in 50 μL of supernatant obtained by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes was quantified by the hexokinase method using F-kit. The specific activity of Runsl_4512 obtained under the reaction conditions was 0.864 U/mg. Enzyme activity 1 U was defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of glucose per minute.

最適pH
10 mMマンノース，80 mM ブリトン-ロビンソン緩衝液 (pH 6-10)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。上記と同様にグルコース生成量を求めた。その結果を図３に示す。最適pHは7.8であった。 optimum pH
0.1 mL of a reaction solution containing 10 mM mannose, 80 mM Britton-Robinson buffer (pH 6-10) and enzyme was kept at 37°C for 10 minutes and then heated at 80°C for 5 minutes to stop the enzyme reaction. The amount of glucose produced was determined in the same manner as above. The results are shown in FIG. The optimum pH was 7.8.

pH安定性
酵素と0.1 Mブリトン-ロビンソン緩衝液(pH 3-12)からなる溶液0.1 mLを4℃に24時間保持した。この酵素活性を上記と同様に測定した。その結果を図４に示す。pH 6.3-9.8の範囲で安定であった。 pH Stability A 0.1 mL solution of enzyme and 0.1 M Briton-Robinson buffer (pH 3-12) was kept at 4° C. for 24 hours. This enzymatic activity was measured as described above. The results are shown in FIG. It was stable in the range of pH 6.3-9.8.

温度安定性
酵素溶液0.1 mLを30～60℃に15分間保持し，この活性を上記と同様に測定した。その結果を図５に示す。40℃以下で安定であった。 Temperature stability 0.1 mL of the enzyme solution was kept at 30-60°C for 15 minutes, and its activity was measured in the same manner as above. The results are shown in FIG. It was stable below 40°C.

マンノースに対する速度パラメータ
10-100 mMマンノース，40 mM トリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。得られた反応速度をミカエリスメンテンの速度式に回帰し，Km 55.8 mM，kcat 4.55 s-1を得た。 Velocity parameters for mannose
0.1 mL of a reaction solution containing 10-100 mM mannose, 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) and enzyme was kept at 37°C for 10 minutes and then heated at 80°C for 5 minutes to stop the enzyme reaction. The obtained reaction rate was regressed to the Michaelis Menten rate equation, and K m 55.8 mM and k cat 4.55 s −1 were obtained.

マンノースに対する反応の経時変化
0.1 Mマンノース，40 mMトリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)，および酵素からなる反応液1 mLを37℃に保持し，適宜反応液50μLを採取して80℃に3分間保持して反応を停止した。このグルコース濃度を上記の方法で定量した。反応72時間でのグルコース濃度は72 mMであった。 Time course of response to mannose
A 1 mL reaction mixture consisting of 0.1 M mannose, 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8), and enzyme was kept at 37°C, and 50 μL of the reaction mixture was taken appropriately and kept at 80°C for 3 minutes to stop the reaction. did. This glucose concentration was quantified by the method described above. The glucose concentration at 72 hours of reaction was 72 mM.

グルコースからのマンノースの生成
4.2-16.6 μM Runsl_4512，40 mM Tris-HCl (pH 7.8)および30%グルコースからなる反応液0.5 mLを35～55℃に保持し，24時間後に試料0.1 mLを採取して85℃にて10分間加熱して反応を停止した。これを6倍に希釈して10μLをHPLCに供した。HPLCではカラムにSugar D (ナカライ)を用い，カラム温度30℃，移動相80%アセトニトリル，流速1 mL/minとした。糖をRI検出器により検出した。その結果を図６に示した。酵素濃度8.3μM以上，50℃以下の反応条件では反応後のマンノース濃度はほぼ一定であり，7%となった。グルコースからのマンノースへの変換率は23%であった。 Production of mannose from glucose
A 0.5 mL reaction mixture consisting of 4.2-16.6 μM Runsl_4512, 40 mM Tris-HCl (pH 7.8) and 30% glucose was kept at 35-55°C, and after 24 hours, a 0.1 mL sample was taken and incubated at 85°C for 10 minutes. The reaction was stopped by heating. This was diluted 6-fold and 10 μL was subjected to HPLC. In HPLC, Sugar D (Nacalai) was used as the column, the column temperature was 30°C, the mobile phase was 80% acetonitrile, and the flow rate was 1 mL/min. Sugar was detected by RI detector. The results are shown in FIG. The mannose concentration after the reaction was almost constant and was 7% under the conditions of the enzyme concentration above 8.3 μM and the reaction temperature below 50°C. The conversion rate from glucose to mannose was 23%.

［実施例２］
本実施例では、ディアドバクター ファーメンタンス （Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からＮ－ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＡＧＥ）と推定されるタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の特性評価を行った。 [Example 2]
In this example, a gene encoding a putative N-acylglucosamine 2-epimerase (AGE) protein (Dfer — 5652) from Dyadobacter fermentans was cloned and the recombinant enzyme was characterized.

（１）Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子のクローニング
Ｄ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ１８０５３）から、Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子をクローニングした。Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基配列であること、また前記塩基配列からＤｆｅｒ＿５６５２は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている。 (1) Cloning of Dfer — 5652 gene The Dfer — 5652 gene was cloned from S. fermentans (DSM18053). The Gene Bank has disclosed that the base sequence of the Dfer_5652 gene is the base sequence of SEQ ID NO: 3, and that Dfer_5652 is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 based on the base sequence.

（２）Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子産物の調製
配列番号３に示すＤｆｅｒ＿５６５２遺伝子から終止コドンを除いたものをｐＥＴ２３ａのＮｄｅ１－Ｘｈｏ１サイトに導入して、ヒスチジンタグを付与したＤｆｅｒ＿５６５２発現ベクターを構築した。前記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ600）が０．５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌイソプロピルβ－チオガラクトピラノシド１ｍＬを添加して、３７℃で４時間培養した。培養液を７，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む３０ ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。得られた無細胞抽出液をニッケルイオンをキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供して組換Ｄｆｅｒ＿５６５２を精製した。すなわち，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）で担体を洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む５００ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）により溶出した。得られた試料を１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７）に透析して以後の解析に用いた。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析し、単一のバンドであることを確認した。 (2) Preparation of Dfer — 5652 Gene Product A histidine-tagged Dfer — 5652 expression vector was constructed by removing the termination codon from the Dfer — 5652 gene shown in SEQ ID NO: 3 and introducing it into the Nde1-Xho1 site of pET23a. The expression vector was introduced into Escherichia coli BL21(DE3) to prepare a transformant. The transformant was inoculated into 30 mL of LBA medium containing 100 µg/mL ampicillin and cultured overnight at 37°C. This was placed in 1 L of LBA medium and cultured at 37° C. until the absorbance (A 600 ) at a wavelength of 600 nm reached 0.5. After ice-cooling the culture solution, 1 mL of 0.1 mol/L isopropyl β-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.1 mmol/L, and cultured at 37° C. for 4 hours. The culture solution was centrifuged at 7,000×g, 4° C. for 10 minutes to collect the cells. The cells were suspended in a 30 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl and disrupted by ultrasonication. The lysate obtained was centrifuged at 10,000×g, 4° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. The resulting cell-free extract was subjected to Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chelated with nickel ions to purify the recombinant Dfer_5652. That is, after washing the carrier with 30 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl, elution was performed with 500 mmol/L imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 mol/L NaCl. did. The resulting sample was dialyzed against 10 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7) and used for subsequent analysis. Samples were analyzed by SDS-PAGE and confirmed to be a single band.

反応生成物のTLC分析
50 mM 各種基質、5 mM Tris-HCl (pH 8.0)および、0.0410 mg/ml Dfer_5652からなる反応液5μLを37℃に一晩保持し、このうち1μLをTLCに供した。展開溶媒は以下に示す。展開後のTLCプレートにアニスアルデヒド/硫酸/酢酸=1/2/97を噴射し、加熱することによって糖を検出した。基質としてD-グルコース、D-マンノース、L-ラムノース、D-タロース、D-アルトロース、D-ガラクトース、L-フコース、L-フルクトース、D-タガトース、L-ソルボース、D-リキソース、L-アラビノース、D-キシロース、D-キシルロース、N-アセチル-D-グルコサミン、β-1,4-マンノビオース、D-グルコサミンおよびD-グルコン酸を用いたところ、D-グルコース、D-マンノースからのみ反応生成物が検出された。 TLC analysis of reaction products
5 μL of a reaction solution consisting of 50 mM various substrates, 5 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 0.0410 mg/ml Dfer_5652 was kept at 37° C. overnight, and 1 μL of this was subjected to TLC. The developing solvent is shown below. Sugar was detected by injecting anisaldehyde/sulfuric acid/acetic acid=1/2/97 onto the developed TLC plate and heating. D-glucose, D-mannose, L-rhamnose, D-talose, D-altrose, D-galactose, L-fucose, L-fructose, D-tagatose, L-sorbose, D-lyxose, L-arabinose as substrates , D-xylose, D-xylulose, N-acetyl-D-glucosamine, β-1,4-mannobiose, D-glucosamine and D-gluconic acid, the reaction product was only from D-glucose and D-mannose. was detected.

展開溶媒は基質ごとに異なるものを使った。
2-プロパノール/1-ブタノール/水＝2/2/1
D-グルコース、D-マンノース、D-ラムノース、D-タロース、D-アルトロース、D-ガラクトース、L-フコース、D-フルクトース、D-タガトース、L-ソルボース、D-リキソース、L-アラビノース、D-キシロース、D-キシルロース、N-アセチル-D-グルコサミン、β-1,4-マンノビオース
1-ブタノール/酢酸/水＝8/3/2 D-グルコサミン
2-プロパノール/1-ブタノール/水＝12/3/4 D-グルコン酸 A different developing solvent was used for each substrate.
2-propanol/1-butanol/water = 2/2/1
D-glucose, D-mannose, D-rhamnose, D-talose, D-altrose, D-galactose, L-fucose, D-fructose, D-tagatose, L-sorbose, D-lyxose, L-arabinose, D -xylose, D-xylulose, N-acetyl-D-glucosamine, β-1,4-mannobiose
1-butanol/acetic acid/water = 8/3/2 D-glucosamine
2-propanol/1-butanol/water = 12/3/4 D-gluconic acid

その結果を図７、図８および図９に示した。基質試験の結果より、Ｄ－グルコースからＤ－マンノース、Ｄ－マンノースからＤ－グルコースが生成することが確認されたので、Dfer_5652はＤ－グルコースとＤ－マンノースの相互変換を触媒するマンノース 2-エピメラーゼであると判断された。 The results are shown in FIGS. 7, 8 and 9. FIG. Substrate test results confirmed that D-mannose was produced from D-glucose and D-glucose was produced from D-mannose. Dfer_5652 is a mannose 2-epimerase that catalyzes the interconversion of D-glucose and D-mannose. was determined to be

活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、および酵素を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50 μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量した。即ち、0.5 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、1.0 U/mL へキソキナーゼ(パン酵母由来、ナカライテスク)および1.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ(ナカライテスク)を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定することで反応液中のグルコースを定量した。当該反応条件下で得られたDfer_5652の比活性は0.688 U/mgであった。ここでは、酵素活性1 Uを、1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。 Activity measurement
100 μL of a reaction solution containing 10 mM mannose, 40 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0), and enzyme was held at 37° C. for 20 minutes and heated at 80° C. for 5 minutes to terminate the enzyme reaction. The amount of glucose contained in 50 µL of supernatant obtained by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes was quantified by the hexokinase method using Thio-NAD + . That is, 0.5 mM Thio-NAD + , 7 mM ATP, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.0 mM MgCl 2 , 1.0 U/mL hexokinase (derived from baker's yeast, Nacalai Tesque) and 1.0 U/mL G6P dehydrogenase ( Nacalai Tesque) is added to the reaction solution in equal volume and kept at 37°C for 20 minutes, and the absorbance at the maximum absorption wavelength of 405 nm of Thio-NADH produced by the oxidation reaction of G6P is measured with a spectrophotometer. By doing so, the amount of glucose in the reaction solution was quantified. The specific activity of Dfer_5652 obtained under the reaction conditions was 0.688 U/mg. Here, 1 U of enzymatic activity was defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of glucose per minute.

最適pH
10 mMマンノース、40 mMブリトンロビンソン緩衝液（pH 5.5-10.5）および酵素を含む反応液100μLを37℃に20 分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。上記と同様にグルコース生成量を求めた。その結果を図１０に示した。最適pHは8.1であった。 optimum pH
100 μL of a reaction solution containing 10 mM mannose, 40 mM Briton Robinson buffer (pH 5.5-10.5) and enzyme was held at 37° C. for 20 minutes and heated at 80° C. for 5 minutes to terminate the enzyme reaction. The amount of glucose produced was determined in the same manner as above. The results are shown in FIG. The optimum pH was 8.1.

pH安定性
酵素と50 mMブリトン-ロビンソン緩衝液（pH 5.5-12.5）からなる溶液100μLを4℃に24時間保持した。この溶液を酵素液として上記と同様に活性を測定した。その結果を図１１に示した。pH 6.3-9.6の範囲で安定であった。 pH Stability 100 μL of a solution consisting of enzyme and 50 mM Britton-Robinson buffer (pH 5.5-12.5) was kept at 4° C. for 24 hours. Using this solution as an enzyme solution, the activity was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG. It was stable in the range of pH 6.3-9.6.

温度安定性
酵素溶液60μLを20～55℃に20分間保持し、上記活性測定と同様の手順で活性を測定した。その結果を図１２に示した。45℃以下で80%以上の活性が保持されていた。 Temperature Stability 60 μL of the enzyme solution was kept at 20 to 55° C. for 20 minutes, and the activity was measured in the same manner as the activity measurement described above. The results are shown in FIG. 80% or more activity was retained at 45°C or lower.

マンノースに対する速度パラメータ
4-150 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液(pH 8.0)および酵素を含む反応液100 μLを37℃に保持し、反応7分、14分の時点で80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。ミカエリスメンテンの速度式に回帰し、Km 66.4 mM、kcat 3.88 s-1を得た。 Velocity parameters for mannose
Keep 100 μL of reaction mixture containing 4-150 mM mannose, 40 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0) and enzyme at 37°C and heat at 80°C for 5 minutes at 7 minutes and 14 minutes of reaction. to stop the enzymatic reaction. A saturation curve was obtained when the resulting reaction rates were plotted. Regression to the Michaelis Menten kinetic equation yielded a K m of 66.4 mM and a k cat of 3.88 s −1 .

実施例１および実施例２において、MEであることが確認されたＲｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２について機能既知のAGE、CE、AKIとそのアミノ酸配列を比較したところ、上記２つのMEは、機能既知タンパクのアミノ酸配列と比べ特定部位に挿入配列を有していることが判明した（図２３ａ～ｃ）。この挿入配列がMEの機能に重要と考え、同様にＡＧＥ等とデータベース上で推定され挿入配列を有する機能未知のタンパク質５種について、その機能を確認した。 In Examples 1 and 2, the amino acid sequences of Runsl_4512 and Dfer_5652, which were confirmed to be MEs, were compared with AGEs, CEs, and AKIs with known functions. 23a-c). Assuming that this insertion sequence is important for the function of ME, we confirmed the function of 5 proteins of unknown function, which are also presumed on the database as AGE, etc., and have insertion sequences.

［実施例３～７］
本実施例では、エムティシシア オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上にそれぞれ存在する、ＡＧＥ等とデータベース上で推定されている遺伝子（それぞれ、Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０をコードする）を、大腸菌のコドン使用頻度に最適化して合成し、組換酵素として生産し、遺伝子産物の特性評価を行った。 [Examples 3 to 7]
本実施例では、エムティシシア オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上The genes estimated on the database as AGE etc. (respectively encoding Emtol_1243, Slin_6381, Spirs_3060, Trebr_2067 and Treaz_2550), which are present in each, are synthesized by optimizing them for the codon usage of E. coli, and as a recombinant enzyme produced and characterized the gene product.

目的遺伝子の合成
目的遺伝子は人工遺伝子合成を用い、ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した。目的遺伝子の設計は同社のHP上で行い、E. coli K12株のcodon usageに最適化した。合成された遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子を含むpEX-A2J1 (pUC系、Amp耐性) に挿入された状態で納入された。 Synthesis of Target Gene The target gene was purchased from Eurofins Genomics using artificial gene synthesis. The target gene was designed on the company's website and optimized for the codon usage of the E. coli K12 strain. The synthesized gene was delivered inserted into pEX-A2J1 (pUC system, Amp resistance) containing the ampicillin resistance gene.

発現プラスミドの調製
E. coliでの発現検討を行うため、購入した目的遺伝子をpET23aのNdeIサイトおよびヒスチジンタグの間にサブクローニングした。pET23a、あるいは目的遺伝子が挿入されたpEX-A2J1を鋳型としてPCRを行い、線状化pET23aおよび終始コドンを除いた目的遺伝子を増幅した。PCRにはPrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio) を用いた。得られたPCR反応液をアガロースゲル電気泳動し、泳動後のゲルより所望のサイズ付近に存在するバンドを切り出し、PCR増幅産物を切り出し後のゲルより抽出した。In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) を用いて目的遺伝子をpET23aに挿入した。In-Fusion反応後のプラスミド増幅にはE. coli DH5αを用いた。得られたプラスミドをシーケンス解析し、目的遺伝子が正常に挿入されていることを確認した。 Preparation of expression plasmids
To examine expression in E. coli, the purchased target gene was subcloned between the NdeI site and histidine tag of pET23a. PCR was performed using pET23a or pEX-A2J1 into which the target gene was inserted as templates to amplify the target gene excluding linearized pET23a and termination codons. PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio) was used for PCR. The resulting PCR reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, a band near the desired size was excised from the gel after electrophoresis, and the PCR amplification product was extracted from the excised gel. The target gene was inserted into pET23a using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). E. coli DH5α was used for plasmid amplification after the In-Fusion reaction. Sequence analysis of the obtained plasmid confirmed that the target gene was inserted normally.

E. coliでの発現
E. coli BL21(DE3)に発現プラスミドを導入した。100 mg/Lアンピシリンを含むLB培地30 mLにより形質転換体を37℃にて一晩培養し、同培地1 Lに植え継いだ。37℃で培養してA600が0.5-0.8になった段階で0.1 M IPTG 1 mLを添加し、18℃にて24時間培養した。これを遠心分離して菌体を回収し、-30℃にて保存した。 Expression in E. coli
The expression plasmid was introduced into E. coli BL21(DE3). The transformants were cultured overnight at 37°C in 30 mL of LB medium containing 100 mg/L ampicillin, and transferred to 1 L of the same medium. When A600 reached 0.5-0.8 after culturing at 37°C, 1 mL of 0.1 M IPTG was added and cultured at 18°C for 24 hours. The cells were collected by centrifugation and stored at -30°C.

組換え酵素の抽出
冷凍保存したペレットを0.5 M NaClを含む30 mMイミダゾール-HCl緩衝液(pH 7)に懸濁した。ソニケーションにより菌体を破砕した。遠心分離により得られた上清を0.45μmフィルターにてろ過したものを無細胞抽出液とし、沈殿は無細胞抽出液と同量の上記緩衝液に懸濁した。無細胞抽出液を、ニッケルイオンをキレートしたChelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)に供して組換え酵素を精製した。すなわち、上記緩衝液で担体を洗浄後、0.5 M NaClを含む500 mMイミダゾール-HCl緩衝液 (pH 7) により溶出した。溶出画分を回収し、Amicon Ultraを用いて液量が15 mLとなるまで濃縮した。得られた試料を20 mM HEPES-NaOH緩衝液 (pH 7)に透析した。0.45μmフィルターにてろ過し、ろ液を試料として以後の解析に用いた。試料のタンパク質濃度はアミノ酸配列から推定された比吸光度を測定したA280に乗じることで求めた。 Recombinant Enzyme Extraction The cryopreserved pellet was suspended in 30 mM imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 M NaCl. Cells were disrupted by sonication. The supernatant obtained by centrifugation was filtered through a 0.45 μm filter to obtain a cell-free extract, and the precipitate was suspended in the same amount of the above buffer as the cell-free extract. The cell-free extract was subjected to Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chelated with nickel ions to purify the recombinant enzyme. That is, after washing the carrier with the above buffer, it was eluted with a 500 mM imidazole-HCl buffer (pH 7) containing 0.5 M NaCl. Eluted fractions were collected and concentrated using Amicon Ultra until the liquid volume was 15 mL. The resulting sample was dialyzed against 20 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7). It was filtered through a 0.45 μm filter, and the filtrate was used as a sample for subsequent analysis. The protein concentration of the sample was obtained by multiplying the measured A280 by the specific absorbance estimated from the amino acid sequence.

SDS-PAGE
DWで10倍希釈した各試料7.5μLに対し、同量のサンプルバッファーを添加し、99.9℃で5分間加熱したもの全量をSDS-PAGEに供したところ、いずれも単一のバンドであることを確認した。 SDS-PAGE
The same amount of sample buffer was added to 7.5 μL of each sample diluted 10-fold with DW, heated at 99.9°C for 5 minutes, and the entire amount was subjected to SDS-PAGE. confirmed.

活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、および酵素を含む反応液100μLを37℃に30分間あるいは60分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量した。即ち、1 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、2.0 U/mL へキソキナーゼ (パン酵母由来、ナカライテスク) および2.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ (ナカライテスク) を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20 分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定することで反応液中のグルコースを定量した。1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1 Uと定義した。結果を表１に示した。 Activity measurement
100 μL of a reaction solution containing 10 mM mannose, 40 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0), and enzyme was kept at 37° C. for 30 minutes or 60 minutes, and then heated at 80° C. for 5 minutes to terminate the enzyme reaction. . The amount of glucose contained in 50 μL of supernatant obtained by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes was quantified by the hexokinase method using Thio-NAD + . That is, 1 mM Thio-NAD + , 7 mM ATP, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1.0 mM MgCl 2 , 2.0 U/mL hexokinase (derived from baker's yeast, Nacalai Tesque) and 2.0 U/mL G6P dehydrogenase ( Nacalai Tesque) was added to the reaction solution in an equal amount and kept at 37°C for 20 minutes. The absorbance at the maximum absorption wavelength of 405 nm of Thio-NADH produced by the oxidation reaction of G6P was measured with a spectrophotometer. By doing so, the amount of glucose in the reaction solution was quantified. 1 U was defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of glucose per minute. Table 1 shows the results.

Figure 0007195517000001
Figure 0007195517000001

Emtol_1243, Spirs_3060, Slin_6381, Trebr_2067, Treaz_2550の基質特異性の検討（TLC）
50 mm各種基質，5 mm HEPES-NaOH (pH 8.0) 0.5 mg/mL BSAおよび酵素を含む反応液5μLを37℃にて24時間保持し、1μLをTLC板にスポットした。各展開溶媒で展開した後のTLC板にアニスアルデヒド/硫酸/酢酸=1/2/97を噴霧し、加熱して糖を検出した。反応液中の酵素濃度を以下に示す．8.0μm Emtol_1243, 9.5μm Spirs_3060, 9.5μm Slin_6381, 10μm Trebr_2067, 9.5μm Treaz_2550．基質として、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｌ－ソルボース、Ｄ－タガトース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロース、Ｄ－リキソース、Ｌ－ラムノース、Ｌ－フコース，セロビオース、β-(1,4)グルコシルマンノース、β-(1,4)マンノシルグルコース、β-(1,4)マンノビオース、ラクトース、エピラクトース、ラクチュロース、スクロース、マルトース、Ｎ－アセチルＤ－グルコサミンを用いた。展開溶媒として、単糖およびN-アセチルd-グルコサミンには2-プロパノール/1-ブタノール/水＝2/2/1溶液を、二糖には2-プロパノール/1-ブタノール/水＝12/3/4溶液をそれぞれ用いた。
その結果を図１３～図２２に以下に示す。なお、いずれの図においてもＢ：Ｂｌａｎｋ（失活処理酵素添加区）、Ｒ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ（酵素添加区）を意味する。 Examination of substrate specificity of Emtol_1243, Spirs_3060, Slin_6381, Trebr_2067, Treaz_2550 (TLC)
5 μL of the reaction solution containing 50 mm of various substrates, 5 mm HEPES-NaOH (pH 8.0) 0.5 mg/mL BSA and enzyme was kept at 37° C. for 24 hours, and 1 μL was spotted on a TLC plate. Anisaldehyde/sulfuric acid/acetic acid=1/2/97 was sprayed on the TLC plate after developing with each developing solvent, and the sugar was detected by heating. The enzyme concentration in the reaction solution is shown below. 8.0 μm Emtol_1243, 9.5 μm Spirs_3060, 9.5 μm Slin_6381, 10 μm Trebr_2067, 9.5 μm Treaz_2550. As substrates, D-glucose, D-mannose, D-fructose, D-galactose, D-talose, D-allose, D-altrose, L-sorbose, D-tagatose, L-arabinose, D-xylose, D- Lyxose, L-rhamnose, L-fucose, cellobiose, β-(1,4)glucosylmannose, β-(1,4)mannosylglucose, β-(1,4)mannobiose, lactose, epilactose, lactulose, sucrose, Maltose, N-acetyl D-glucosamine were used. As a developing solvent, 2-propanol/1-butanol/water = 2/2/1 for monosaccharides and N-acetyl d-glucosamine, and 2-propanol/1-butanol/water = 12/3 for disaccharides. /4 solutions were used respectively.
The results are shown below in FIGS. 13 to 22. FIG. In both figures, B: Blank (inactivated enzyme addition area) and R: Reaction (enzyme addition area).

各酵素の基質特異性について、表２に纏めた。いずれの酵素もグルコースからマンノース、マンノースからグルコースが生成することが確認されたので、グルコースとマンノースの相互変換を触媒するマンノース 2-エピメラーゼであると判断された。また、Spirs_3060、Trebr_2067 およびTreaz_2550の３つの酵素は、ガラクトースとタロースを相互に変換する触媒作用を有することも判明した。さらに、Treaz_2550は、ＣＥ活性等も有していた。 Table 2 summarizes the substrate specificity of each enzyme. Both enzymes were confirmed to produce mannose from glucose and glucose from mannose. Three enzymes, Spirs_3060, Trebr_2067 and Treaz_2550, were also found to catalyze the interconversion of galactose and talose. Furthermore, Treaz_2550 also had CE activity and the like.

Figure 0007195517000002
反応性生物が確認されたものを＋、確認されなかったものを－、試験していないものを空欄にて表記した。
Figure 0007195517000002
+ indicates that the reactive organism was confirmed, - indicates that the reaction was not confirmed, and blank indicates that the reaction was not tested.

既知のＡＧＥやＣＥ等のアミノ酸配列とＭＥ活性を有することが確認された上記７酵素のアミノ酸配列および他の機能未知のAGE等と推定されるタンパクのアミノ酸配列を比較し、挿入配列部分の比較結果を図２３ａ～ｃに示した。なお、図２３ａに示された機能既知酵素に関する補足情報は下記通りである。
＊１：Porcine kidney 由来のAGE（FEBS Letters 587(2013) 840-846）
＊２：Anabaena sp.由来のAGE（FEBS Letters 587(2013) 840-846）
＊３：Rhodothermus marinus 由来のCE（特開2012-130332 号）
＊４：Ruminococcus albus 由来のCE（Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79, 433-441）
＊５：Caldicellulosiruptor saccharolyticus 由来のCE（国際公開2010/090095 号）
＊６：Escherichia coli 由来のAKI（J. Mol. Biol. (2008) 377，1443-1459）
＊７：Salmonella enteritica 由来のAKI（J. Mol. Biol. (2008) 377，1443-1459）
上記７酵素のアミノ酸配列の挿入配列を表３に示した。また、配列番号２に示されたＲｕｎｓｌ＿４５１２のアミノ酸配列とその他６酵素のアミノ酸配列の同一性及び配列番号１２に示されたＴｒｅｂｒ＿２０６７のアミノ酸配列とその他６酵素のアミノ酸配列の同一性を表４に示した。 Compare the amino acid sequences of known AGEs, CEs, etc. with the amino acid sequences of the above-mentioned 7 enzymes confirmed to have ME activity and the amino acid sequences of proteins presumed to be other AGEs with unknown functions, and compare the insertion sequences. The results are shown in Figures 23a-c. Supplementary information about the enzymes with known functions shown in FIG. 23a is as follows.
*1: AGEs derived from porcine kidney (FEBS Letters 587 (2013) 840-846)
*2: AGE derived from Anabaena sp. (FEBS Letters 587(2013) 840-846)
*3: CE derived from Rhodothermus marinus (JP 2012-130332)
*4: CE derived from Ruminococcus albus (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79, 433-441)
*5: CE derived from Caldicellulosiruptor saccharolyticus (International Publication No. 2010/090095)
*6: AKI derived from Escherichia coli (J. Mol. Biol. (2008) 377, 1443-1459)
*7: AKI derived from Salmonella enteritica (J. Mol. Biol. (2008) 377, 1443-1459)
Table 3 shows the insertion sequences of the amino acid sequences of the above 7 enzymes. In addition, Table 4 shows the identity of the amino acid sequence of Runsl — 4512 shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequences of the other 6 enzymes and the identity of the amino acid sequences of Trebr — 2067 shown in SEQ ID NO: 12 and the amino acid sequences of the other 6 enzymes. rice field.

Figure 0007195517000003
Figure 0007195517000003

Figure 0007195517000004
Figure 0007195517000004

Ｒｕｎｓｌ＿４５１２のアミノ酸配列と同一性が４０％を下回る酵素であっても、挿入配列を有しているものは同様にＭＥ活性を有することが明らかとなった。図２３ａ及び表５に示された機能既知及び未知のタンパクについても、同挿入配列を有するものはＭＥ活性を有する可能性があり、さらには、図２３ｂ及び２３ｃ並びに表６表７に示された機能未知のタンパクについても、同挿入配列を有するものはME活性を有するものと強く推認され、本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法における、グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質として利用し、上記エピメリ化活性を有するタンパク質を製造することができる。 It was found that even enzymes having an amino acid sequence identity of less than 40% with the amino acid sequence of Runsl — 4512 and having an insertion sequence similarly have ME activity. Regarding proteins with known and unknown functions shown in FIG. 23a and Table 5, those having the same insertion sequence may have ME activity, Proteins of unknown function are strongly presumed to have ME activity if they have the same inserted sequence, and the method for producing a protein having glucose and mannose epimerization activity and/or galactose and talose epimerization activity of the present invention. can be used as a protein that is not known to have glucose and mannose epimerization activity and galactose and talose epimerization activity, to produce a protein having the above epimerization activity.

Figure 0007195517000005
Figure 0007195517000005

Figure 0007195517000006
Figure 0007195517000006

Figure 0007195517000007
Figure 0007195517000007

挿入配列の意義
本発明の酵素は一次アミノ酸配列の相同性から、α/α-6バレル構造を有するセロビオース2-エピメラーゼと立体構造が類似すると推察される。本発明の酵素に共通する特有の配列はＣＥで言うところの、α7ヘリックスとα8ヘリックス間のループの一部を構成し、ＣＥと比較して当該ループが延長された形となっている。当該ループは活性部位の一部を構成すると考えられており、当該ループに本酵素特有の配列が存在することで、ＣＥと比較して基質認識機構が変化し、グルコースおよびマンノースへの反応に好ましい活性部位の形状となっているものと推察される。 Significance of Inserted Sequence Based on the homology of the primary amino acid sequence, the enzyme of the present invention is presumed to have a similar three-dimensional structure to cellobiose 2-epimerase having an α/α-6 barrel structure. The unique sequence common to the enzymes of the present invention constitutes a part of the loop between the α7 helix and the α8 helix in CE, and the loop is elongated compared to CE. The loop is thought to constitute a part of the active site, and the presence of a sequence unique to this enzyme in the loop changes the substrate recognition mechanism compared to CE, making it favorable for reactions to glucose and mannose. It is presumed that it has the shape of the active site.

本発明は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質及びガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質など、エピメリ化活性を有するタンパク質に関連する分野に有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in fields related to proteins with epimerization activity, such as proteins with epimerization activity of glucose and mannose and proteins with epimerization activity of galactose and talose.

配列番号１：Ｒｕｎｓｌ＿４５１２塩基配列
配列番号２：Ｒｕｎｓｌ＿４５１２アミノ酸配列
配列番号３：Ｄｆｅｒ＿５６５２塩基配列
配列番号４：Ｄｆｅｒ＿５６５２アミノ酸配列
配列番号５：Ｅｍｔｏｌ＿１２４３塩基配列
配列番号６：Ｅｍｔｏｌ＿１２４３アミノ酸配列
配列番号７：Ｓｌｉｎ＿６３８１塩基配列
配列番号８：Ｓｌｉｎ＿６３８１アミノ酸配列
配列番号９：Ｓｐｉｒｓ＿３０６０塩基配列
配列番号１０：Ｓｐｉｒｓ＿３０６０アミノ酸配列
配列番号１１：Ｔｒｅｂｒ＿２０６７塩基配列
配列番号１２：Ｔｒｅｂｒ＿２０６７アミノ酸配列
配列番号１３：Ｔｒｅａｚ＿２５５０塩基配列
配列番号１４：Ｔｒｅａｚ＿２５５０アミノ酸配列
配列番号１５～４６：表６及び７に記載のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７～５７：表５に記載のタンパク質のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 1: Runsl — 4512 base sequence SEQ ID NO: 2: Runsl — 4512 amino acid sequence SEQ ID NO: 3: Dfer — 5652 base sequence SEQ ID NO: 4: Dfer — 5652 amino acid sequence SEQ ID NO: 5: Emtol — 1243 base sequence SEQ ID NO: 6: Emtol — 1243 amino acid sequence SEQ ID NO: 7: Slin — 6381 base sequence SEQ ID NO: 8: Slin — 6381 amino acid sequence SEQ ID NO: 9: Spirs — 3060 base sequence SEQ ID NO: 10: Spirs — 3060 amino acid sequence SEQ ID NO: 11: Trebr — 2067 base sequence SEQ ID NO: 12: Trebr — 2067 amino acid sequence SEQ ID NO: 13: Treaz — 2550 base sequence SEQ ID NO: 14: Treaz — 2550 amino acid sequence SEQ ID NO: 15-46: amino acid sequences of the proteins listed in Tables 6 and 7 SEQ ID NOS: 47-57: amino acid sequences of the proteins listed in Table 5

Claims (9)

（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列(以下、挿入アミノ酸配列と称す)を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｎ末端側アミノ酸配列と称す)、
及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｃ末端側アミノ酸配列と称す)を有し、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、
かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、
但し、前記挿入アミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ１はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１～２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、又は
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列である、
又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列(以下、挿入アミノ酸配列と称す)を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｎ末端側アミノ酸配列と称す)、
及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｃ末端側アミノ酸配列と称す)を有し、
配列番号1２又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、
かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質
但し、前記挿入アミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、又は
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列である、（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤。 (a) has an inserted sequence (hereinafter referred to as an inserted amino acid sequence) of an amino acid sequence that has 70% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the N-terminal side of the inserted sequence (hereinafter referred to as the N-terminal amino acid sequence) ;
and an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the C-terminal side of the inserted sequence (hereinafter referred to as the C-terminal amino acid sequence) . have
having an amino acid sequence that is 90% or more identical to the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 10;
and a protein having glucose and mannose epimerization activity,
provided that the inserted amino acid sequence is
General formula (1):
X 1 APQIKFDX 2 X 3 WGWDRFX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 (where X 1 is V or I, X 2 is I or V, X 3 is V or I, X 4 is N, T or S, X 5 is P or E, X 6 is D or G, X 7 is G or D, X 8 is L, V, Q or A, X9 is K or Q and X10 is S, A, E or K)
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 263 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 An amino acid sequence with 90% or more identity with
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 , and the C-terminal amino acid sequence is the sequence an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 2 ;
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 , and the C-terminal amino acid sequence is the sequence an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 4 ;
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 , and the C-terminal amino acid sequence is the sequence an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 6 ;
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 , and the C-terminal amino acid sequence is the sequence An amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 427 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 8 , or
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence An amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 10.
or (b) has an inserted sequence (hereinafter referred to as an inserted amino acid sequence) of an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the N-terminal side of the inserted sequence (hereinafter referred to as the N-terminal amino acid sequence) ;
and an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 on the C-terminal side of the inserted sequence (hereinafter referred to as the C-terminal amino acid sequence) . have
having an amino acid sequence that is 90% or more identical to the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14;
and a protein having epimerization activity of glucose and mannose, provided that the inserted amino acid sequence is
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 An amino acid sequence with 90% or more identity with
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 , and the C-terminal amino acid sequence is SEQ ID NO: An amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in 12 , or
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence An amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in No. 14 (provided that SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, An epimerizing agent for glucose and mannose, comprising as an active ingredient a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14). ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有する請求項１に記載のエピメリ化剤。 2. The epimerization agent according to claim 1, further having galactose and talose epimerization activity. （ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１～２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５～４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｄ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列(以下、挿入アミノ酸配列と称す)を有し、前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｎ末端側アミノ酸配列と称す)、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列(以下、Ｃ末端側アミノ酸配列と称す)を有し、
配列番号1２又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、
但し、前記挿入アミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１～２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６～２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３～４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、又は
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列である、
（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）を有効成分とするガラクトースとタロースのエピメリ化剤。 (c) has an insertion sequence of an amino acid sequence that is 90% or more identical to the amino acid sequence of 241 to 264 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 on the N-terminal side of the inserted sequence, and SEQ ID NO: 10 on the C-terminal side of the inserted sequence A protein having an amino acid sequence that is 90% or more identical to the amino acid sequence of 265 to 428 amino acid residues of the amino acid sequence shown in and has galactose and talose epimerization activity, or (d) SEQ ID NO: 12 An inserted sequence (hereinafter referred to as an inserted amino acid sequence) having an amino acid sequence identity of 70% or more with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the indicated amino acid sequence, and a sequence on the N-terminal side of the inserted sequence An amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 12 (hereinafter referred to as the N-terminal amino acid sequence) , and a sequence on the C-terminal side of the inserted sequence Having an amino acid sequence (hereinafter referred to as the C-terminal amino acid sequence) having 50% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 12,
A protein having an amino acid sequence that is 90% or more identical to the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, and having galactose and talose epimerization activity,
provided that the inserted amino acid sequence is
General formula (2):
KX 11 PAINIX 12 RTW NAEREX 13 X 14 EX 15 ID
amino acids with the proviso that X 11 is L or I, X 12 is K or Y, X 13 is A or T, X 14 is G or N, and X 15 is K or R arrangement,
An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of 241 to 262 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence of 246 to 267 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 An amino acid sequence with 90% or more identity with the sequence,
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 , and the C-terminal amino acid sequence is SEQ ID NO: An amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 263 to 419 amino acid residues of the amino acid sequence shown in 12 , or
The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and the C-terminal amino acid sequence is SEQ ID NO: An amino acid sequence having 95 % or more identity with the amino acid sequence of 268 to 430 amino acid residues of the amino acid sequence shown in 14,
Galactose and talose containing as active ingredients (excluding proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14) epimerization agent. 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤。 A protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or 90% or more identical to the amino acid sequence of the protein An epimerizing agent for glucose and mannose, comprising as an active ingredient a protein having an amino acid sequence and epimerizing activity for glucose and mannose. （ａ）のタンパク質であって、The protein of (a),
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号４に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４～４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 423 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 4;
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号６に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４～４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であるか、又はThe N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence An amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 264 to 422 amino acid residues of the amino acid sequence shown in number 6, or
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号８に示されたアミノ酸配列の１～２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４～４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列である、請求項１に記載のエピメリ化剤。The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 240 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence 2. The epimerization agent according to claim 1, which is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of amino acid residues 264 to 427 of the amino acid sequence shown in number 8. （ｂ）のタンパク質であって、The protein of (b),
前記Ｎ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１～２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列であり、かつ前記Ｃ末端側アミノ酸配列が、配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８～４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列である、請求項１に記載のエピメリ化剤。The N-terminal amino acid sequence is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of 1 to 245 amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and the C-terminal amino acid sequence is the sequence 2. The epimerization agent according to claim 1, which is an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of amino acid residues 268 to 430 of the amino acid sequence shown in number 14. グルコースに、請求項５または６に記載のエピメリ化剤を作用させて、マンノースを生成させることを含む、マンノースの製造方法。 A method for producing mannose, which comprises reacting glucose with the epimerization agent according to claim 5 or 6 to produce mannose. 配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするガラクトースとタロースのエピメリ化剤。 Galactose containing, as an active ingredient, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or a protein having epimerization activity for galactose and talose and having 90% or more identity with the amino acid sequence of the protein and the epimerizing agent of talose. ガラクトースに、請求項２、３または８に記載のエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む、タロースの製造方法。 A method for producing talose, comprising reacting galactose with the epimerization agent according to claim 2, 3 or 8 to produce talose.
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