JP7189866B2 - 新規エステラーゼ及びその使用 - Google Patents
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Description
エステラーゼは、ポリエステルをはじめとする様々なポリマーの加水分解を触媒することができる。この脈絡において、エステラーゼは、例えば、食器洗浄及び洗濯に適用するための洗浄剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の解毒における又は繊維工業におけるポリエステル織物の処理のための生体触媒としてなどの、多くの工業的適用において有望な効果を示している。同じように、ポリエチレンテレフタラート(PET)を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は、特に関心が高い。実際に、PETは、数多くの技術分野において、例えば、服、カーペットの製造などにおいて、あるいは包装又は自動車用プラスチック若しくは他のパーツの製造のための熱硬化性樹脂の形で使用され、埋立地におけるPETの蓄積は、増加しつつあるエコロジー的問題となっている。
本発明は、親エステラーゼ又は野生型エステラーゼと比較して増加した活性を示す新規なエステラーゼ変異体を提供する。これらのエステラーゼは、プラスチック材料及び製品、例えばPETを含有しているプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。より特定すると、本発明は、Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Marに記載のメタゲノム解析から導かれたクチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸36~293、又はスイスプロットのG9BY57に参照されたアミノ酸配列のアミノ酸36~293に対応する、配列番号1に示されているようなアミノ酸配列を有する、エステラーゼ変異体を提供する。
から選択された位置に少なくとも1つの置換を有し(ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる)、(iii)配列番号1のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、エステラーゼ変異体を提供することである。
(a)エステラーゼをコードしている核酸を発現するに適した条件下で、本発明に記載の宿主細胞を培養する工程;及び場合により、
(b)細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
を含む、該エステラーゼを生成する方法を提供することである。
(a)プラスチック製品を、本発明に記載のエステラーゼ又は宿主細胞と接触させることにより、プラスチック製品を分解する工程;並びに場合により
(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収する工程
を含む、少なくとも1つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法に関する。
定義
本開示は、以下の定義への参照によって最善に理解されるだろう。
本発明は、改善された活性を有する新規エステラーゼを提供する。より特定すると、本発明者らは、工業的プロセスに使用するための優れた特性を有する新規酵素を設計した。プラスチック製品の工業的分解を実施できる条件におけるエステラーゼの活性を改善する目的で、本発明者らは、この親エステラーゼと比較してより高い活性を示す配列番号1のエステラーゼから誘導された新規エステラーゼを開発した。本発明のエステラーゼは、PETを含有しているプラスチック製品を分解するのに特に適している。本発明のエステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較して、増加した比活性及び/又はポリマー上への増加した吸着能を示す。興味深いことに、本発明者らは、タンパク質と基質の接触を促進し、これにより、ポリマーの吸着及び/又はこのポリマー上におけるタンパク質の活性を増加させるために有利には改変され得る、タンパク質の結晶構造における、ポリマー基質と接触させる予定の特定のアミノ酸残基を同定した。
から選択された位置に少なくとも1つの置換を有する配列番号1のエステラーゼの変異体であり、ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる。
から選択された少なくとも1つの置換を含む。好ましくは、前記エステラーゼ変異体は、F208W/I/Lから選択された少なくとも1つの置換を含む。好ましい実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、少なくともF208Wの置換を含む。別の好ましい実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、少なくともF208Iの置換を含む。
から選択された位置に配列番号1と比較して少なくとも1つの置換、特に単一の置換を含み、ここでの置換は、
とは異なる。好ましくは、前記エステラーゼは、
からなる群より選択された1つ以上の置換を含む。別の特定の実施態様では、前記エステラーゼは、
からなる群より選択された単一の置換を含む。
本発明のさらなる目的は、配列番号1のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性の両方を示す新規エステラーゼを提供することである。
から選択された置換(群)を少なくとも含み、配列番号1のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す。
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素はさらに、クチナーゼ活性を示す。
本発明のさらなる目的は、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。
本発明の別の目的は、エステラーゼをコードしている核酸を発現させる工程及び場合により該エステラーゼを回収する工程を含む、本発明のエステラーゼ変異体を生成する方法を提供することである。
(a)本発明のエステラーゼをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該核酸を発現するに適した条件下で培養する工程;及び場合により
(b)該エステラーゼを細胞培養液から回収する工程
を含む。
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞を含む組成物を提供することである。本発明の脈絡において、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼをが含む任意の種類の組成物を包含する。特定の実施態様では、エステラーゼは、単離された形態又は少なくとも部分的に精製された形態である。
本発明のさらなる目的は、ポリエステルから作製されるか又は含有しているプラスチック製品などのポリエステル含有材料を好気的及び/又は嫌気的条件で分解するために、並びに/あるいはリサイクルするために、本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼ変異体は、PETを含むプラスチック製品を分解するのに特に有用である。
実施例1-エステラーゼの構築、発現、及び精製
-構築
エステラーゼ変異体は、プラスミド構築物pET26b-LCC-Hisを使用して作製された。このプラスミドは、NdeI制限酵素部位とXhoI制限酵素部位との間に、エシェリヒア・コリにおける発現のために最適化された、配列番号1のエステラーゼをコードしている遺伝子をクローニングすることからなる。エステラーゼ変異体を作製するために、2つの部位特異的突然変異誘発キットが業者の推奨に従って使用された:アジレント社(サンタクララ、カリフォルニア州、米国)製のQuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed。
Stellar(商標)株(クロンテック社、カリフォルニア州、米国)及びE.coli One Shot(登録商標)BL21 DE3(ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)が、50mLのLB-Miller培地又はZYM自己誘導性培地中でのクローニング及び組換え発現を実施するために成功裡に使用された(Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234)。LB-Miller培地中での誘導は、0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG、ユーロメディックス社、ゾウフェルヴァイヤースハイム、フランス)を用いて16℃で実施された。AvantiJ-26XP遠心機(ベックマンコールター社、ブレア、米国)での遠心分離(8000rpm、10℃で20分間)によって培養を停止した。細胞を、20mLのTalon緩衝液(トリス-HCl20mM、NaCl 300mM、pH8)に懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、30%の振幅で(2秒オン、1秒OFFのサイクル)FB超音波発生器(フィシャーブランド社、イルキルシュ、フランス)によって、2分間、超音波処理にかけた。次いで、遠心分離工程を実現した:エッペンドルフ遠心機で11000rpmで10℃で30分間。可溶性画分を回収し、アフィニティクロマトグラフィーにかけた。この精製工程は、Talon(登録商標)金属アフィニティ樹脂(クロンテック社、CA州、米国)を用いて完了させた。タンパク質の溶出は、イミダゾールの補充されたTalon緩衝液の勾配を用いて実施された。精製されたタンパク質を、Talon緩衝液に対して透析し、その後、製造業者の説明書(ライフサイエンスバイオラッド社、フランス)に従ってバイオラッドタンパク質アッセイを使用して定量し、+4℃で保存した。
エステラーゼの比活性を決定し、配列番号1のエステラーゼの比活性と比較した。
(1)pNP-ブチラート加水分解に基づいた比活性;
(2)PET加水分解に基づいた比活性;
(3)固体形下のポリエステルの分解に基づいた比活性;
(4)反応器中のPET加水分解に基づいた比活性。
溶液中のタンパク質 20μLを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)175μL及びpNP-ブチラート(2-メチル-2-ブタノール中40mM)5μLと合わせた。酵素反応を、撹拌下で30℃で15分間行ない、405nmにおける吸光度をマイクロプレート分光光度計(Versamax、モレキュラーデバイス社、サニーベール、CA州、米国)によって取得した。比活性(酵素1mgあたり1分あたりに遊離されたpNPのμmolで表現される初期速度)を加水分解曲線の直線部分において決定し、これを使用して野生型エステラーゼの活性を該変異体の活性と比較した。
無定形PET 100mgを秤量し、100mLのガラス瓶に導入した。エステラーゼ調製物(基準対照として)又は変異体調製物 1mLをそれぞれ、Talon緩衝液(トリス-HCl 20mM、NaCl 0.3M、pH8)中0.02又は0.03mg/mLで調製し、ガラス瓶に導入した。最後に、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8)49mLを加えた。
固体形下のポリエステルの分解
酵素調製物 20μLを、PETを含有している寒天プレートに作られたウェルに沈着させた。寒天プレートの調製は、HFIPに可溶化させたPET 500mgを可溶化することによって実現し、この培地を250mLの水溶液に注いだ。52℃でHFIPを蒸発させた後、溶液を、3%寒天を含有している0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH8)と混合(v/v)した。約30mLの混合物を使用して、各々のOmniTrayを調製し、4℃で保存する。
Minibio 500バイオリアクター(アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ)を、無定形PET 5g、及びエステラーゼ 2.5~5mgを含有している10mMリン酸カリウム緩衝液(pH8)100mLを用いて開始した。撹拌を、マリンインペラーを使用して250rpmに設定した。バイオリアクターは、外付けの水浴への浸漬によって65℃に温度制御された。pHは、3MのKOHの添加によって8に調節された。様々なパラメーター(pH、温度、撹拌、塩基の添加)を、BioXpertソフトウェアV2.95によりモニタリングした。反応培地 500μLを定期的に試料採取した。
本発明のエステラーゼ変異体の熱安定性を評価し、配列番号1のエステラーゼの熱安定性と比較した。
Claims (16)
- (i)配列番号1に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、又は99%の同一率を有し、(ii)F208W/I/L/G/S/N/A/R/T、S65T、T157E/Q/N/G、T176H/N/Q及びN211Qからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有し(ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる)、(iii)配列番号1のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、エステラーゼ変異体。
- 前記エステラーゼが、F208W/I/L/A/R/T、S65T、T157Q/N/G及びT176H/Qからなる群より選択された少なくとも1つの置換を含む、請求項1記載のエステラーゼ変異体。
- 前記エステラーゼが、さらに置換D203C+S248Cの組合せを含む、請求項1又は2記載のエステラーゼ変異体。
- 前記エステラーゼが、F208W+D203C+S248C及びF208I+D203C+S248Cから選択される置換の組合せを含む、請求項3記載のエステラーゼ変異体。
- 前記エステラーゼが、さらに置換V170Iを含む、請求項1~4のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
- 前記エステラーゼが、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T、S65T、T157E/Q/N/G、T176H/N/Q、N211Q、F208W+V170I、Y92P+F208L、Y92P+F208W、T176H+F208W、F208W+T157Q、F208W+T157N、F208W+T157S、F208W+S65T又はF208W+T157Eからなる群より選択された少なくとも1つの置換又は置換の組合せを含み、ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる、請求項1~7のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
- 請求項1~8のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体をコードする核酸。
- 請求項9記載の核酸を含む発現カセット又はベクター。
- 請求項9記載の核酸又は請求項10記載の発現カセット若しくはベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~8のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体、又は請求項11記載の宿主細胞を含む、組成物。
- (a)エステラーゼをコードする核酸を発現するのに適した条件下で、請求項11記載の宿主細胞を培養する工程;及び場合により、
(b)細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
を含む、該エステラーゼを生成する方法。 - (a)プラスチック製品を、請求項1~8のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項11記載の宿主細胞、又は請求項12記載の組成物と接触させる工程;並びに場合により
(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収する工程
を含む、少なくとも1つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法。 - プラスチック製品が、ポリエチレンテレフタラート(PET)、ポリトリメチレンテレフタラート(PTT)、ポリブチレンテレフタラート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート(PEIT)、ポリ乳酸(PLA)、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)、ポリブチレンスクシナート(PBS)、ポリブチレンスクシナートアジパート(PBSA)、ポリブチレンアジパートテレフタラート(PBAT)、ポリエチレンフラノアート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジパート)(PEA)、ポリエチレンナフタラート(PEN)、及びこれらの材料のブレンド/混合物から選択された少なくとも1つのポリエステル、好ましくはポリエチレンテレフタラートを含む、請求項14記載の方法。
- 請求項1~8のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項11記載の宿主細胞を含む、ポリエステル含有材料。
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