JP7183174B2 - 分岐αグルカン - Google Patents
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Description
材料及び方法
炭水化物に対し活性のある酵素の自動アノテーション用のdbCANデータベースを使用して、NCCゲノムデータベースに存在するGH70ファミリー酵素のアノテーションを実施した[Y.Yin et al.,dbCAN:a web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation Nucleic Acids Res.40(2012)W445-51]。1E-5未満のE値及び350を超えるビットスコアを有するヒットを検討した。結果として、788のタンパク質配列が回収された。MUSCLEアルゴリズムを使用するJalview 2デスクトップアプリケーションとの多重配列アラインメントの構築のため、L.ロイテリ121GtfB(アクセッション番号:AAU08014.2)、ロイコノストック・シトレウムNRRL B-1299分岐スクラーゼ(アクセッション番号:CDX66820.1)、及びL.ロイテリ180Gtf180 GS(アクセッション番号:AAU08001.1)タンパク質配列と共に使用した[A.M.Waterhouse et al.,Jalview Version 2--a multiple sequence alignment editor and analysis workbench,Bioinformatics 25(2009)1189-1191]。配列は、典型的にはGS中に存在する保存されたTrpを置換する芳香族Tyr(Y1055 L.ロイテリ121GtfBの残基番号)を持つ場合にのみデンプンに作用すると推定されるGH70酵素であるとみなされ、その結果、106のGtfB様遺伝子産物のセットが得られた。分岐スクラーゼは、アラインメント中のこの位置におけるGly残基の存在によって区別された。更なる分析のために、NCCゲノムデータベース内で同定されたGtfBタンパク質のセットを、CAZy(http://www.cazy.org/)にインデックスされており、デフォルトパラメータを使用してMUSCLEによって整列された、特性評価されたGH70タンパク質によって拡大した。MEGA6を使用して、JTTマトリックスモデルに基づく最尤法によって系統発生の関係を決定した[K.Tamura,G.Stecher,D.Peterson,A.Filipski,S.Kumar,MEGA6:Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0,Mol.Biol.Evol.30(2013)2725-2729]。分析には、167個のアミノ酸配列が含まれた。アラインメントのギャップ及び欠損データを含む位置の部分的な削除を行った。推定された系統発生の関係の統計的信頼性は、1,000回のブートストラップ反復試験を実施することにより評価した。
多重アミノ酸配列アラインメントを、Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)により作成し、Jalview 2デスクトップアプリケーションを使用して視覚化する。L.ロイテリGtfBタンパク質の細胞内局在を、CELLO v.2.5:細胞内局在予測システム(http://cello.life.nctu.edu.tw/)を使用して予測し、その理論MW(分子量)をExPASy Compute pI/MW(http://web.expasy.org/compute_pi/)によって予測した。
L.ロイテリ121GtfB 4,6-α-GTase(PDB登録:5JBD)の最近決定された三次元構造[Bai et al.,Structure 25(2016)231-242]を、デフォルト設定で完全長配列の1対1スレッディングのテンプレートとして用い、Phyreによって[Kelley et al.,Nat.Protoc.10(2015)845-858]L.ロイテリCNCM I-2452GtfBの三次元モデルを構築した。結合部位の比較のために、マルトペンタオース又はイソマルト-マルトペンタサッカライド(PDB登録:5JBE、5JBF)と複合させたL.ロイテリ121GtfB4,6-α-GTaseの結晶構造もまた使用した。
Phusion DNAポリメラーゼ(Finnzyme,Helsinki,Finland)により、L.ロイテリCNCM I-2452ゲノムDNAからGtfBタンパク質のN末端切断変異体(GtfB-ΔN)をコードしているgtfB遺伝子フラグメントを増幅させ、改変pET15bベクターにライゲーション非依存性クローニング(LIC)によりクローニングした[D.Bonsor et al.,Org.Biomol.Chem.4(2006)1252-1260]。使用したプライマーは、LIC適合性延長部(下線部)を含有し、フォワードCAGGGACCCGGTGGGCATTTACTTGGAAATC及びリバースCGAGGAGAAGCCCGGTTAATCGTCTTCAATATTAGCとした。KpnI消化ベクター及び生成されたPCR産物をゲルから精製し、続いてdATP及びdTTPそれぞれの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理した。2つの反応生成物を1:4のモル比で共に混合し、該混合物を用いてケミカルコンピテントな大腸菌DH5α細胞(Phabagen)を形質転換し、pET15b/gtfB-ΔNを得た。このベクターは、3Cプロテアーゼにより切断可能なN末端His6-タグと融合したGtfB-ΔN(アミノ酸417~1281)をコードする。構築された発現ベクターpET15b/gtfB-ΔNをヌクレオチドシーケンシング(GATC,Cologne,Germany)により検証し、大腸菌BL21 Star(DE3)に形質転換した。
アンピシリン(100μg/mL)を添加した新鮮なLuria Broth培地に、pET15b/gtfB-ΔNプラスミドを有する大腸菌BL21 Star(DE3)の一晩培養物の1%(v/v-1)を接種し、37℃及び160rpmで培養した。イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシドを0.1mMまで添加し、0.7のOD600でタンパク質発現を誘導し、16℃で20時間培養を続けた。遠心分離により細胞を回収した(10,000×g、20分)。GtfB-ΔN酵素を、既報のように[Gangoiti et al.,Biochim Biophys Acta 1860(2016)1224-1236]、Ni2+-ニトリロ三酢酸(NTA)アフィニティークロマトグラフィー(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)により精製した。純度をSDS-PAGE分析によって評価し、NanoDrop 2000分光光度計(Isogen Life Science,De Meern,The Netherlands)を使用して、280nmでの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。
L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔN酵素の初期の総活性を、先に記載のとおり[19,29]、0.125%(w/v)V型アミロース(AVEBE,Foxhol,The Netherlands)を使用したアミロース-ヨウ素染色法により測定した。酵素アッセイは、25mMの酢酸ナトリウム(pH5.5)及び1mMのCaCl2中2μg/mLの酵素で慣習的に実施した。トランスグリコシル化及び/又は加水分解活性によるα-グルカン-ヨウ素複合体の吸光度の減少を、40℃で8分間、660nmでモニターした。活性は、1分当たり1mgの基質を変換する酵素の量を1単位として定義した。pHプロファイル及び最適pHは、pHを3.0~10.0に変化させて40℃で測定した。ナトリウムシトレート緩衝液(25mM)はpH3.0~7.0で、ナトリウムホスフェート緩衝液(25mM)はpH7.0~8.0で、Tris-HCl(25mM)はpH8.0~9.0で、及びナトリウムバイカーボネート(25mM)はpH9.0~10.0で使用した。
40μg/mLの精製酵素を25mMのスクロース(Acros)、ニゲロース(Sigma-Aldrich)、パノース(Sigma-Aldrich)、イソマルトース(Sigma-Aldrich)、イソマルトトリオース(Sigma-Aldrich)、イソマルトペンタオース(Carbosynth)、2~7の重合度(DP)を有するマルトオリゴ糖(MOS)(Sigma-Aldrich)、又は0.6%(w/v)V型アミロース(AVEBE,Foxhol,The Netherlands)、ジャガイモデンプン(Sigma-Aldrich)若しくはアミロペクチン(Sigma-Aldrich)のいずれかとインキュベートして、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB酵素の基質特異性を調べた。ジャガイモデンプンをオートクレーブでα化した(15分,120℃)。V型アミロース(1%、w/v)を水酸化ナトリウム(1M)で原液として調製した。使用前に、原液を7MのHClで中和し、0.85%(w/v)の濃度に希釈した。1mMのCaCl2を含む25mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)で37℃で24時間インキュベートを行った。試料を100℃まで8分間加熱することにより反応を停止させた。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー(TLC)及び/又は高性能アニオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)によって分析した。
炭水化物試料を、TLCシリカゲル60F254シート(Merck,Darmstadt,Germany)上の1cm線にスポットした。TLCプレートを、ブタノール:酢酸:水(2:1:1、v/v)中で6時間展開し、生成物をオルシノール/硫酸染色で可視化した。グルコース及びマルトオリゴ糖(DP2~DP7)の混合物を標準として使用した。
生成物混合物の分子量分布は、先に記載のとおり[20,29]、多角度レーザー光散乱検出器(SLD 7000 PSS,Mainz)、粘度計(ETA-2010 PSS,Mainz)、及び示差屈折率検出器(G1362A 1260 RID Agilent Technologies)を備えたサイズ排除クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies 1260 Infinity)を使用して決定した。簡潔に述べると、試料をDMSO-LiBr(0.05M)中4mg/mLの濃度で溶解し、PFGガードカラムに結合した100、300及び4000Åの多孔性を有する3つのPFG-SECカラムを使用して分離を実施した。DMSO-LiBr(0.05M)を溶離液とし、流速は0.5mL/分とした。342~805,000DaまでのMwの標準プルランキット(PSS、マインツ、ドイツ)を用い、システムの較正及びバリデーションを行った。特定のRI増分値(dn/dc)もPSSによって測定したところ、0.072mL/gであった(PSSによる個別連絡(private communication))。多角度レーザー光散乱シグナルを使用して、V型アミロース、並びにA.クロオコッカム及びP.ベイジンゲンシスGtfD酵素により生成される高分子量(HMM)多糖類の分子量を求めた。これらの多糖類のdn/dc値は、プルランと同じであると考えられた。L.ロイテリCNCM I-2452GtfB、L.ロイテリ121GtfB、及びP.ベイジンゲンシスGtfD低分子量(LMM)ポリマーの分子量を、ユニバーサルキャリブレーション法によって求めた。測定は二度行った。
V型アミロース(0.6%w/v)及びGtfB-ΔN(0.2mg)のインキュベートを、「Substrate specificity of the L.reuteri CNCM I-2452GtfB」に記載の条件下で実施した。37℃で24時間インキュベート後、10分間100℃まで移すことによって反応を停止させた。多糖類は、Biogel P2カラム(2.5×50cm;Bio-Rad,Veenendaal,The Netherlands)でのサイズ排除クロマトグラフィーで、10mMのNH4HCO3を溶離液とし、48mL/hの流速で使用して、生成物混合物に一緒に存在する微量の小さなオリゴ糖(DP<5)から単離した。
分解能向上1D/2D1H及び13C NMRスペクトルは、プローブ温度298Kで、Varian Inova-500分光計(NMR center,University of Groningen,The Netherlands)でD2O中で記録された。試料をD2O中で2回交換し(99.9 at% D,Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Andover,MA)途中で凍結乾燥させて、次いで0.6mLのD2O中で溶解した。HODシグナルを抑制するためにWET1Dパルスを用いて、4000Hzのスペクトル幅及び16kの複素数ポイントで、一次元500MHz1H NMRスペクトルを記録した。二次元1H-1Hスペクトル(COSY、TOCSY MLEV17 30、50、及び150ms、及びROESY 300ms)を4000Hzのスペクトル幅で記録し、200の増分を収集した。TOCSYスペクトルの場合、2000の複素数データポイントが収集され、COSY及びROESYスペクトルについては4000の複素数データポイントが使用された。2D13C-1H NMRスペクトルを、t2で4000Hz、及びt1で10000Hzのスペクトル幅を有する2000の複素数ポイントの128増分で記録した。データは、MestReNova 5.3(Mestrelabs Research SL,Santiago de Compostella,Spain)を使用して処理した。手動位相補正及びWhittackerのより滑らかなベースライン補正を全てのスペクトルに適用した。化学シフト(δ)は、内部アセトンを基準としてppmで表される(1Hの場合δ2.225、13Cの場合δ31.08)。
先に記載のとおり、多糖試料(約5mg)をDMSO中CH3I及び固体NaOHを用いて完全メチル化した[S.S.van Leeuwen et al.,Carbohydr.Res.343(2008)1237-1250]。2Mのトリフルオロ酢酸(2時間、120℃)で加水分解後、生成した部分メチル化単糖類をNaBD4で還元し(2時間、室温、水溶液)、該溶液を酢酸で中和した。続いて、メタノールと一緒に蒸発にさせてホウ酸を除去した。得られた部分メチル化アルジトールを、120℃でピリジン:無水酢酸(1:1 v/v)を用いて完全アセチル化し、部分メチル化アルジトールアセテートの混合物を得、これを記載のGLC-EI-MSにより分析した。
α-グルカン試料(5mg)を500μLの酢酸ナトリウム緩衝液(50mM pH5.0)に溶解し、過剰量のα-アミラーゼ(アスペルギルス・オリゼ;Megazyme)、デキストラナーゼ(ケトミウム・エラティカム;Sigma-Aldrich)、及びプルラナーゼM1(クレブシエラ・プランティコラ;Megazyme)と37℃で別々にインキュベートした。48時間後、加水分解度を、TLC及び/又はHPAECによって評価した。デンプン、デキストラン、及びプルランを、それぞれα-アミラーゼ、デキストラナーゼ、及びプルラナーゼ処理の陽性対照として使用し、これらの条件下で完全に加水分解された生成物を得た。
精製した小麦粉の試料を異なる量のL.ロイテリCNCM I-2452GtfB酵素で処理し、in vitro法を使用して消化率を評価した。
NCCゲノムデータベース内の新規デンプン活性GH70酵素の同定
NCCゲノムデータベースを新規なGtfB様酵素についてスクリーニングした。GtfB酵素のうち同定されたのはL.ロイテリCNCM I-2451、L.ロイテリCNCM I-2452、S.サーモフィルスCNCM I-5167、S.サーモフィルスCNCM I-5168、L.デルブルエッキ亜種デルブルエッキCNCM I-5166、及びL.ファーメンタムCNCM I-5068(同時係属出願欧州特許出願公開第16172606.2号に記載されている4,3-α-GTase)であった。これらのGtfBタンパク質の保存モチーフI~IVを詳細に分析した(図1)。NCCで同定されたGtfB酵素のモチーフI~IVは、以前に特性評価された4,6-α-GTaseに対応するものと明らかな類似性を示し、容易に同定された。GtfB配列中のこれらの保存領域I~IVの順序は、II-III-IV-Iであり、それらの循環式に順序の変えられたドメイン構成を反映する。これらのGH70モチーフ間で保存された、触媒残基(D1015、E1053、D1125;L.ロイテリ121 GtfBの残基番号)及びサブサイト-1の形成に関与する残基(R1013、H1124、D1479)を含む、6つの残基は、全て同定されたGtfBタンパク質配列に見出された。
L.ロイテリCNCM I-2452ゲノムは、145kDaの理論分子量を有するGH70酵素をコードする単一遺伝子を含有する。他のGH70ファミリータンパク質について報告されているように、L.ロイテリCNCM I-2452 GH70酵素は、細胞外タンパク質として機能すると予測される。アミノ酸配列の、生化学的に特性評価されたGH70酵素とのアラインメントは、L.ファーメンタムGtfB 4,3-α-GTaseと最も高い配列同一性を示す(83%同一性)。L.ロイテリ121、ラクトバチルス・ロイテリML1、及びラクトバチルス・ロイテリDSM 20016の特性評価されたGtfB 4,6-α-GTase酵素はまた、L.ロイテリCNCM I-2452 GH70酵素と著しいアミノ酸同一性を共有し(76%、75%、及び66%の同一性)、このことは、このタンパク質がGH70酵素のGtfBサブファミリーに属することを更に示す。
これまでの研究では、L.ロイテリ121GtfBのN末端可変領域の切断は、酵素触媒特性に影響を与えなかったものの、タンパク質発現を促進したことを示した[Y.Bai et al.,Environ.Microbiol.81(2015)7223-7232]。したがって、GtfB酵素をコードするL.ロイテリCNCM I-2452遺伝子をクローン化し、N末端可変領域を持たない大腸菌(DE3)BL21 Starで発現させた(アミノ酸417~1281)。使用条件下で、可溶性画分において高レベルのタンパク質発現を観察し、Hisタグ親和性精製後、培養液1リットル当たり合計約50mgの純粋タンパク質を得た。SDS-PAGE分析により、約100kDaの見かけの分子量(これは、アミノ酸配列から推定される予想分子量(98kDa)に合致する)を有する単一のタンパク質バンドが示される。
L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNを、異なる炭水化物基質と37℃で24時間インキュベートし、その活性をL.ロイテリ121 4,6-α-GTaseGtfBの活性と比較した。TLCによって示されるように(図3)、GtfB酵素は両方とも、より短鎖及びより長鎖のオリゴ糖生成物の形成から明らかであるように、DP4~DP7を有するMOSに対する加水分解及びトランスグリコシラーゼ(不均化)活性を示した。両方の酵素はまた、MOSからポリマー材料も蓄積した。L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNの場合、マルトペンタオース(DP5)及びより長いMOS基質を使用したときにポリマーの蓄積が検出されたが、L.ロイテリ121GtfBは、マルトテトラオース(DP4)からでもポリマーを形成した。L.ロイテリ121GtfBの場合、異なるMOS基質からグルコースが明らかに蓄積されることに留意されたい。代わりに、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNは、マルトース及びいくつかの低分子量オリゴ糖を蓄積するが、そのヒドロラーゼ/トランスグリコシダーゼ活性の副生成物としてのグルコースは生成しない。この観察は、これらの2つのGtfB酵素が、それらの作用様式において異なることを示唆している。V型アミロース、ジャガイモデンプン、及びアミロペクチンをL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔN酵素とインキュベートすると、TLCでは明瞭に検出することはできなかったものの、L.ロイテリ121GtfBと同様に、この酵素がこれらのポリマー基質に対しても活性であることを示すいくつかの低分子量生成物が出現した。L.ロイテリCNCM I-2452GtfB酵素は、DP2、DP3、及びDP5を有するスクロース、パノース、ニゲロース、プルラン、デキストラン、及びイソマルトオリゴ糖に対して不活性であった(データ非掲載)。
L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔN LMM多糖類の構造特性を更に調査するために、アミロース由来の反応混合物をBio-Gel P-2サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。この多糖類の1D NMR分析は、結合比(α1→4):(α1→6)=75:25を示した。連続した(α1→6)結合に対応する典型的な化学シフト値は、このL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマーの2D NMRスペクトルにおいて同定されなかった(図5)。メチル化分析により、モル百分率15、59、10、及び16%での末端、4-置換、6-置換、及び4,6-二置換のグルコピラノース残基の存在が明らかとなった。これは、1H NMRによって求められる結合比と一致している。総合すると、これらのデータは、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNが、GtfD型の酵素と同様にロイテラン様α-グルカンを合成することを裏付け、GtfB様GH70サブファミリー内のこの生成物特異性についての第1の証拠となる。異なるアミロース由来のロイテラン型のポリマーの構造特性については表1に要約する。サイズ及び(α1→4):(α1→6)結合比に関しては、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNによって合成されたα-グルカンは、ほとんどがLMM P.ベイジンゲンシスGtfDポリマーに似ているが、6-置換グルコピラノシル単位の量の増加によって示されるように(すなわち、5%ではなく10%)、交互の(α1→4)/(α1→6)グリコシド結合がより多量に含まれる。
L.ロイテリNCC 2623GtfB-ΔNロイテラン様生成物の形成について理解を深めるために、時間内にマルトヘプタオースから形成されたオリゴ糖をHPAECにより分析した(図6)。L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNは、反応の初期段階で、マルトヘプタオース(マルトヘキサオース及びマルトペンタオースがわずかに混入した)から主な加水分解生成物としてマルトース、マルトトリオース及びマルトペンタオースを放出した。これらの第1の明らかな加水分解生成物と共に、マルトオクタオース標準(溶出時間=45.7分)よりも速い溶出時間にて、トランスグリコシル化活性により生じる生成物と共に多くのピークが溶出した。24時間の反応後、マルトヘプタオース基質は完全に枯渇した一方、低DPのいくつかのMOS及び未知の構造のオリゴ糖は反応混合物中に残った。注目すべきことに、24時間の反応中に検出されたグルコースは微量であった。主な加水分解生成物としてのマルトース及びマルトトリオースの形成は、8より高いDPを有するオリゴ糖に対応するピークの出現と合わせて、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB酵素が、異なるDPのMOSを別のグルカン鎖に優先的に転移させて(グルコースの代わりに)、ロイテラン様ポリマーを形成することを示唆する。この重合機序は、反応サイクル毎に単一のグルコシル単位のみを転移させるGSについて観察されたものとは異なる。むしろ、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNの作用様式は、同様にロイテラン型ポリマーを生成するGtfD 4,6-α-GTaseに類似している[PCT/EP2016/071474]。同様に、L.ファーメンタムGtfB 4,3-α-GTaseは、異なるDPのMOSを転移させることにより、アミロースを交互の(α1→3)/(α1→4)結合及び(α1→3,4)分岐点を含有するポリマーに変換する[同時係属出願欧州特許出願公開第16172606.2号]。GSでは活性部位がサブサイト-1を超えて遮断されるのに対し、デンプンに活性をもつGH70酵素は、2つ以上のドナー基質結合部位を有し、デンプンから生じるMOS単位の連続的な転移による伸長プロセスの開始を可能にするものと考えられる。
マルトース及びイソマルトースをアクセプター基質と、これらの存在下又は非存在下で酵素を24時間インキュベートし、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔN酵素及びL.ロイテリ121GtfBのアクセプター基質特異性を比較した。図7Aに示すように、マルトースは、ドナー基質としてのV型アミロースの存在下でL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNのアクセプター基質としての機能を果たすことができ、その結果、パノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオース、並びに相当量の他の未確認のオリゴ糖を形成する。L.ロイテリ121GtfBは、異なる生成物分布を示したが、この酵素は、マルトースをアクセプター基質として使用することも可能であり、連続した(α1→6)結合及び増加した重合度を有する一連の伸長生成物と共に、パノース、マルトトリオース、及びマルトテトラオースを生じる(図7B)。これらの結果は、GtfB酵素の両方が、マルトースを伸長させて新たな(α1→4)又は(α1→6)結合のいずれかを形成することができることを示唆する。イソマルトースとのアクセプター反応は、これらのGtfB酵素の異なる作用様式をより明確に反映した。L.ロイテリ121GtfB酵素は、相当量のイソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、及びイソマルトペンタオース(連続した(α1→6)結合によるイソマルトースの伸長から得られる)の検出によって示されるように、アクセプター基質としてはマルトースよりもイソマルトースの方が明らかに好ましい。対照的に、V型アミロースを、イソマルトースの存在下又は非存在下でL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNとインキュベートしたときには、オリゴ糖形成において有意な変化は観察されなかった。したがって、L.ロイテリ121GtfBは、α1→6結合した非還元末端を有するオリゴ糖を優先的に伸長するが、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNは、A.クロオコッカムGtfDと同様に、アクセプター基質としてイソマルトースを認識することができない[PCT/EP2016/071474]。これらの観察と一致して、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔN及びL.ロイテリ121GtfB生成物は、それぞれ、それらの構造における連続した(α1→6)結合の非存在又は存在によって異なる。
L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNにより生成されたα-グルカンのロイテラン様構造を、このα-グルカンを過剰量の異なる加水分解酵素、α-アミラーゼ、デキストラナーゼ、及びプルラナーゼで処理することによって更に確認した。比較のため、L.ロイテリ121GtfB 4,6-α-GTaseにより合成されたIMMP、並びにA.クロオコッカム及びP.ベイジンゲンシスGtfD 4,6-α-GTaseにより生産されたロイテラン様ポリマーを、同じ酵素処理に並行して供した。図8に示すように、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマーは、α-アミラーゼのエンド-(1→4)ヒドロラーゼ活性に対して非常に耐性があった。アミロース対照は完全に分解されたのに対し、このポリマーをα-アミラーゼとインキュベートしたときには極微量のHMMオリゴ糖及びマルトースが形成された。同様の加水分解パターンは、A.クロオコッカム及びP.ベイジンゲンシスGtfD 4,6-α-GTaseによって合成されたロイテラン様ポリマーでも得られたが、IMMP消化の場合にはこれらの少量のマルトース又は他のオリゴ糖は検出されなかった。同様に、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマーを、(1→6)グリコシド結合の加水分解を触媒するデキストラナーゼ及びプルラナーゼM1による酵素加水分解にかけた。デキストラナーゼが(α1→6)結合したD-グルコピラノシル繰り返し単位の直鎖状配列を特異的に攻撃するのに対し、プルラナーゼはプルランの主鎖、及びデンプン分子の分岐点にあるα1→6結合に特異的である。デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素処理については、それぞれ、デキストラン及びプルランを陽性対照として使用した。予想されるように、L.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマー並びにA.クロオコッカム及びP.ベイジンゲンシスGtfDポリマーは、デキストラナーゼの作用によって分解されず、代わりにこれらのポリマーはプルラナーゼにより加水分解された。対照的に、IMMP生成物はプルラナーゼ処理に対して耐性であったが、デキストラナーゼのエンド-(α1→6)-ヒドロラーゼ活性により消化された。これらの結果は、L.ロイテリ121GtfBポリマーに連続した(α1→6)結合のみが存在すること、及びL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマー中にはそれらが存在しないことと一致している。GtfA GS及びGtfD 4,6-α-GTaseによって合成されたロイテラン型のポリマーと同様に、そしてIMMPとは異なり、このL.ロイテリCNCM I-2452GtfB-ΔNポリマーは、交互の(α1→6)/(α1→4)結合及び(α1→4,6)分岐点を含有するものと考えられる。
小麦粉試料を、上記のように異なる濃度のL.ロイテリCNCM I-2452GtfB酵素で処理した。最初に、試料によるグルコース放出率をin vitro消化により分析した。この測定は、ヒトの消化を模倣するように設定し、参照と比較して試料によるグルコース放出率を得た。
Claims (12)
- 少なくとも8%の分岐率を有するα-グルカンの製造方法であって、(α1→4)グルコシド結合を切断し、かつ連続した(α1→6)グルコシド結合は形成せずに新たな(α1→6)グルコシド結合を作成することのできるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素に、(α1→4)結合したD-グルコース単位を非還元末端に少なくとも2つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を接触させて、(α1→6)グルコシド結合が散在している(α1→4)結合したD-グルコース単位の直鎖状セグメントを有しかつ(α1→4,6)分岐点を有するグルコースポリマーを形成することを含み、前記α-グルカノトランスフェラーゼが、配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記α-グルカノトランスフェラーゼが、GtfBタイプの酵素である、α-グルカンの製造方法。
- 前記α-グルカノトランスフェラーゼが、Gtf180ラクトバチルス・ロイテリ180の残基番号による1029位にヒスチジン残基、及び/又は1137位にセリン残基、及び/又は1140位にアラニン残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記α-グルカノトランスフェラーゼが、L.ロイテリCNCM I-2451、L.ロイテリCNCM I-2452、S.サーモフィルスCNCM I-5167、S.サーモフィルスCNCM I-5168、及びL.デルブルエッキ亜種デルブルエッキCNCM I-5166からなる群から選択される細菌由来のGtfB酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記基質が、少なくとも4の重合度を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質が、デンプン、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、(α1→4)グルカン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多糖類又はオリゴ糖基質が、30℃~75℃の温度及び4.0~9.0のpHでα-グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- (α1→6)グルコシド結合が散在している(α1→4)結合したD-グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ(α1→4,6)分岐点を有するα-グルカンであって、前記α-グルカンが、少なくとも8%の分岐率を有し、1重量%未満の連続した(α1→6)結合を含み、1×103Da~5×104Daの平均分子量を有し、そして少なくとも85重量%のα-グルカンが、2~7の重合度を有する(α1→4)結合したD-グルコース単位を含む、α-グルカン。
- 請求項7に記載のα-グルカンを含む食品組成物。
- 前記食品組成物が、飲料、ジャガイモ製品、朝食用シリアル、ペットフード製品、焼成された生地製品、又は菓子製品である、請求項8に記載の食品組成物。
- デンプン含有食品材料の可消化炭水化物を低減するためのα-グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用であって、前記α-グルカノトランスフェラーゼ酵素が、配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記α-グルカノトランスフェラーゼ酵素が、L.ロイテリCNCM I-2451、L.ロイテリCNCM I-2452、S.サーモフィルスCNCM I-5167、S.サーモフィルスCNCM I-5168、及びL.デルブルエッキ亜種デルブルエッキCNCM I-5166からなる群から選択される細菌由来のGtfB型酵素である、使用。
- 配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L.ロイテリCNCM I-2451、L.ロイテリCNCM I-2452、S.サーモフィルスCNCM I-5167、S.サーモフィルスCNCM I-5168、及びL.デルブルエッキ亜種デルブルエッキCNCM I-5166からなる群から選択される細菌由来のGtfB型酵素である、α-グルカノトランスフェラーゼ酵素。
- 配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を持ち、(α1→4)グルコシド結合を切断しかつ連続した(α1→6)グルコシド結合は形成せずに新たな(α1→6)グルコシド結合を作成することのできるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素の機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記α-グルカノトランスフェラーゼ酵素が、L.ロイテリCNCM I-2451、L.ロイテリCNCM I-2452、S.サーモフィルスCNCM I-5167、S.サーモフィルスCNCM I-5168、及びL.デルブルエッキ亜種デルブルエッキCNCM I-5166からなる群から選択される細菌由来のGtfB型酵素である、発現ベクター。
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