JP7179002B2 - 改良されたプラスチック分解プロテアーゼ - Google Patents
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Description
プロテアーゼは、ポリエステルを含む各種のポリマーの加水分解を触媒することができる。この文脈において、プロテアーゼは、食器洗浄及び洗濯用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を処理するための分解酵素として、環境汚染物質の無毒化における生物触媒として又は繊維工業におけるポリエステル布地の処理のためのものを含む、多くの工業用途において有望な効果を示している。同様に、ポリ乳酸(PLA)を加水分解するための分解酵素としてのプロテアーゼの使用は特に興味深い。実際に、PLAは、多数の技術分野、例えば、可撓性及び剛性の包装、バッグ、マルチフィルムに並びに衣類及びカーペットの製造に使用されるバイオ系ポリマーである。したがって、埋立地におけるPLAの蓄積により、生態系の問題が大きくなっている。
本発明は、親又は野生型プロテアーゼの変異体であり、前記野生型プロテアーゼと比較して向上したポリエステル分解活性を示すことができる、新規なプロテアーゼを提供する。とりわけ、本発明は、UniProtKBにおいてP80146と称されるアミノ酸配列のアミノ酸133~410位に対応し、Munro et al, 1995 Jul, Microbiology, 141 (Pt 7):1731-8(Thermus sp.Rt41A株由来のアルカリセリンプロテイナーゼ)に記載され、Munro et al, 1995に70℃で24時間を超える安定性を示すと記載された成熟プロテアーゼのアミノ酸配列に対応する、配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有する親プロテアーゼの変異体を提供する。野生型プロテアーゼ及び変異体は両方とも、スブチリシン様プロテアーゼとみなされる。本発明のプロテアーゼは、プラスチック材料及び製品、例えば、ポリ乳酸(PLA)を含有するプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。したがって、本発明は、配列番号:1で示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%の同一性を有し、配列番号:1と比較して、おそらく、特定のアミノ酸における1つ以上の置換を有するプロテアーゼを使用して、ポリ乳酸(PLA)を含有するプラスチック材料及び製品を分解するための方法を更に提供する。
(a)プロテアーゼをコードする核酸を発現させるのに適した条件下で、本発明のホスト細胞を培養することと、場合により、
(b)前記プロテアーゼを細胞培養物から回収することとを含む、本発明のプロテアーゼを製造する方法を提供することである。
(a)プラスチック製品を、本発明のプロテアーゼ又はホスト細胞と接触させることにより、プラスチック製品を分解することと、場合により、
(b)モノマー及び/又はオリゴマー、好ましくは、乳酸(PLA)のモノマー及び/又はオリゴマーを回収することとを含む、方法に関する。
定義
本開示は、下記定義を参照することにより最もよく理解されるのであろう。
現在入手可能な酵素と比較して改善されたポリエステル分解活性を有する新規なプロテアーゼの開発に取り組むことにより、本発明者らは、配列番号:1のアミノ酸配列を有し、70℃で24時間を超える安定性を示す(Munro et al, 1995)セリンプロテアーゼが、興味深いことに、ポリエステル分解活性も示すことを発見した。本発明者らは、この酵素に更に取り組み、この親タンパク質と比較して改善されたポリエステル分解活性を示すこの酵素の特定の変異体を開発した。とりわけ、本発明者らは、工業的プロセスにおいて使用するための優れた特性を有する新規酵素を設計した。分解性プラスチック製品の工業的生産を行うことができ及び/又はプラスチック製品の環境分解を達成することができる条件下でプロテアーゼの活性を改善することを目的として、本発明者らは、この親プロテアーゼと比較してより高い活性を示す配列番号:1のプロテアーゼに由来する新規なプロテアーゼを開発した。本発明のプロテアーゼは、PLAを含有するプラスチック製品を分解するのに特に適している。本発明のプロテアーゼは、有利には、配列番号:1のプロテアーゼと比較して、ポリエステル、とりわけ、PLAに対して向上した比分解活性を示す。興味深いことに、本発明者らは、ポリエステル基質のタンパク質との接触を促進することにより、このポリエステルへの酵素の吸着及び/又はタンパク質の分解活性を向上させるように有利に改変することができるタンパク質の構造において、ポリエステル基質と接触することが意図される、特定のアミノ酸残基を特定した。
本発明の目的は、プロテアーゼ活性を有する新規な酵素を提供することである。
有利には、変異体の熱安定性は、親プロテアーゼの熱安定性と比較して著しく損なわれていることはない。より有利には、変異体の熱安定性は、配列番号:1の親プロテアーゼの熱安定性と比較して改善されている。本発明の文脈において、「改善された熱安定性」という用語は、配列番号:1のプロテアーゼと比較して、高温、とりわけ、40℃~90℃の温度において、その化学的及び/又は物理的構造の変化に抵抗する酵素の能力の向上を示す。特に、本発明のプロテアーゼは、配列番号:1のプロテアーゼと比較して、40℃~90℃の温度における延長した半減期を有することができる。特に、プロテアーゼは、配列番号:1のプロテアーゼと比較して、より高い又は同等の融解温度(Tm)を示すことができる。特に、本発明の変異体は、押出プロセスの間、とりわけ、50℃~250℃、好ましくは、130℃~180℃に含まれる温度で行われる押出プロセスの間、改善された熱安定性を示す。
本発明の更なる目的は、上記定義されたプロテアーゼをコードする核酸を提供することである。
本発明の別の目的は、プロテアーゼをコードする核酸を発現させることと、場合により、プロテアーゼを回収することとを含む、本発明のプロテアーゼ変異体の製造方法を提供することである。
(a)本発明のプロテアーゼをコードする核酸を含むホスト細胞を、核酸を発現させるのに適した条件下で培養することと、場合により、
(b)前記プロテアーゼを細胞培養物から回収することとを含む。
本発明の更なる目的は、本発明のプロテアーゼ又はホスト細胞を含む組成物を提供することである。本発明の文脈において、「組成物」という用語は、本発明のプロテアーゼを含む任意の種類の組成物を包含する。特定の実施態様では、プロテアーゼは、単離された形態又は少なくとも部分的に精製された形態にある。
また、本発明者らは、驚くべきことに、親タンパク質もポリエステル分解活性、特に、ポリ乳酸分解活性有することも発見した。
実施例1:プロテアーゼの構築、発現及び精製
- 構築
Thermus sp.(Rt41A株)由来の親プロテアーゼをコードする遺伝子をプラスミドpET26b+(EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)にクローニングした。配列番号:1の親プロテアーゼ及びその天然プロペプチド(配列番号:42)をコードする遺伝子(配列番号:2)をこの遺伝子の上流にPelBシグナルペプチド(配列番号:43:MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)をコードし、この遺伝子の下流に6×ヒスチジンタグ(配列番号:44:LEHHHHHH)をコードする配列とインフレームでプラスミドpET26b+に挿入した。E. coli One Shot(登録商標)BL21 DE3(Life technologies, Carlsbad, California, USA)を構築したプラスミドによりトランスフォーメーションした。得られた株は、タンパク質のN末端にPelBシグナル配列及びC末端に6×ヒスチジンタグを有する野生型プロテアーゼを発現する。QuikChange II部位特異的突然変異誘発キットを供給元の推奨に従って使用して、変異体を構築した(Santa Clara, California, USA)。表1に、部位特異的突然変異誘発に使用したフォワード及びリバースプライマーを与える。
野生型プロテアーゼ及びその変異体を発現する株のリコンビナント発現をZYM5052自己誘導性培地 50mL中において、23℃で24時間の間に実現した(Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234)。培養物をAvanti J-26 XP遠心分離機(Beckman Coulter, Brea, USA)での遠心分離(8000rpm、10℃で20分)により停止させた。細胞を-80℃で少なくとも2.5時間の間凍結させ、ついで、Tris HClバッファー(Tris 0.1M、pH7.5) 10mLに懸濁させた。Lysonase(商標)Bioprocessing Reagent(EMD Millipore)を使用して、供給元の推奨に従って、細胞を溶解した。ついで、細胞懸濁液を11000rpm及び10℃で30分の間遠心分離した。可溶性画分を回収し、Talon(登録商標)Metal Affinity樹脂(Clontech, CA, USA)を使用して、コバルト親和性クロマトグラフィーに供した。タンパク質を20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH8.0中の100mM イミダゾールにより溶出した。イミダゾールを45℃においてpH調節されたTris HClバッファー(Tris 0.1M、5mM CaCl2、pH7.5)に対する透析工程後に、精製抽出物から除去した。精製タンパク質を、Bio-Rad Bradfordタンパク質アッセイを使用し、製造メーカーの説明書(Lifescience Bio-Rad、France)に従って定量し、+4℃で保存した。精製の質をTCA沈殿後のSDS-PAGE上で評価した。予想されるタンパク質サイズは、約29kDaである。
野生型プロテアーゼ及び変異体の比分解活性をPLA加水分解の間に決定した。500μmのPLA粉末(PLLA 001-Natureplast)を50mg秤量し、透析チューブに導入した。ついで、酵素サンプルである、固定濃度の酵素(正確な比活性を測定するために、66.7mg/L、30mg/L、10mg/L又は5mg/L)を含有するプロテアーゼ調製物 1.5mLを透析チューブに加え、その後、それを閉じ、この後者を5mM CaCl2を含有する0.1M Tris-HClバッファーpH7.5(45℃に調節) 25mLを含有するガラスボトルに導入した。野生型プロテアーゼ(配列番号:1)を対照として使用した。
本発明のプロテアーゼの比分解活性を測定し、配列番号:1の野生型プロテアーゼの比分解活性と比較した。
(1)pNA加水分解に基づく比分解活性
(2)固体状態でのポリエステル(PLA)の分解に基づく比分解活性
(3)PLA含有エマルジョンの濁度の低下に基づく比分解活性
(4)反応器中のPLA加水分解に基づく比分解活性
溶液中のタンパク質 20μLをTris HClバッファー、0.1M pH7.5(30℃で調節)中の5mM N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(pNA) 180μLに合わせた。酵素反応を反応中のpNA放出を定量するために、30℃において攪拌下で少なくとも15分間行い、405nmでの吸光度をマイクロプレート分光光度計(Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)により取得した。比活性(1分あたり酵素1gあたりに405nmでの吸光度(A405nm)で表した初速度)を加水分解曲線の直線部分で測定し、野生型プロテアーゼ又は変異体のプロテアーゼ活性をアッセイするのに使用した。酵素を含有しない0.1M Tris HClバッファー(pH7.5) 20μLの溶液をネガティブ対照反応として使用した。
酵素調製物 20μLを、PLAを含有するアガロースプレートに作製したウェルに堆積させた。アガロースプレートの調製は、ジクロロメタン(DCM) 10mL中の450mg PLAを可溶化し、ボルテックスでホモジナイズすることにより実現した。0.1M Tris HClバッファー(pH7~9) 90mLを加え、続けて、超音波処理工程(Fisher Scientific(商標)モデル705 Sonic Dismembrator、最大出力の30%)を行った後、DCMを50℃で蒸発させた。得られた溶液をろ過して、未溶解残留物を除去した。最後に、0.5% PLAエマルジョン 12mLを1M Tris HClバッファー(pH7.5)(45℃で調整) 3mL及び2% アガロース 15mLと混合し、各omnitrayを調製した(4℃で保存)。
PLA分解酵素活性を100mM Tris-HClバッファー(pH7.5)中に最終濃度0.1%(w/v)で乳化させたPLAにより、波長630nmでの濁度の低下に基づいて、45℃及びpH7.5(45℃で調節)で30分間アッセイした(Sonic Dismembratorを使用、最大出力の30%)。PLA分解活性の1単位を、記載されたアッセイ条件下での1分あたりの光学密度の1単位減少として定義した。
Minibio 500バイオリアクター(Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands)をPLA 5g及び2.5~10mg プロテアーゼを含有する100mM Tris-HClバッファーpH7.5(45℃で調節) 100mLで開始した。撹拌を、マリンインペラーを使用して250rpmに設定した。バイオリアクターを外部水浴に浸漬することにより45℃で温度調節した。pHを3M KOHの添加により、7.5に調節した。種々のパラメーター(pH、温度、撹拌、塩基の添加)をBioXpertソフトウェアV2.95によりモニタリングした。反応媒体 500μLを定期的にサンプリングした。
異なる方法論を使用して、熱安定性を推定した。
(1)温度、時間及びバッファーの所定の条件下でタンパク質をインキュベーションした後の残存ポリエステルの脱重合活性
(2)溶液中のタンパク質の円二色性
本発明の野生型プロテアーゼ及び変異体の熱安定性をヒートショック後に回収された残存比分解活性(実施例2で記載されたPLA加水分解)の測定により決定した。ヒートショックを下記のように行った。0.1M Tris-HClバッファーpH7.5(45℃で調節)、20mM CaCl2中に固定酵素濃度(0.2又は0.1g/L)を含有する酵素サンプルを所定の時間の間(5、30、45、60又は240分)、固定温度(70℃、75℃、85℃又は98℃)に調節された水浴に浸した。ヒートショック後に、サンプルを直ちに氷上に置いた。酵素の希釈工程(0.03g/L又は0.01g/Lまで)後、ヒートショックサンプル及び非ヒートショックサンプルの後に回収された比分解活性(PLA加水分解)を実施例2に詳述されたように測定した(バッファー:Tris-HCl 0.1M pH7.5;CaCl2濃度:5mM)。残存分解活性の結果を非ヒートショックサンプルに対応する参照条件の比活性の割合として表わす。
ヒートショック条件及びヒートショック後の残存分解活性の結果を表3に示す。これらの実験では、比分解活性を酵素濃度0.03g/Lで評価した。
ヒートショック条件及びヒートショック後の残存分解活性の結果を以下の表4に示す。これらの実験では、比活性を酵素濃度0.01g/Lで評価した。
円二色性(CD)をJ-815 CD分光計(JASCO)において行い、本発明の配列番号:1のプロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体の融解温度(Tm)を決定し、比較した。Tmは、50% タンパク質が変性する温度に相当する。
- 押出プロセスによるプラスチックコンパウンドの調製
本発明のプロテアーゼ変異体を含むプラスチックコンパウンド配合物を調製し、市販の酵素(Savinase(登録商標))を含むプラスチックコンパウンド配合物と比較した。両配合物を表6に列記する。%は、配合物の総重量に基づいて重量で与えられる。
- 液体窒素に浸漬し、Ultra Centrifugal Mill ZM 200システムを使用して微粉化したPLAペレットから得られた、粉末状(<1mm)のPLA(ポリ乳酸ポリマー、NatureWorksからのPLA 4043D)、
- 3.5kDa膜での限外ろ過、透析ろ過、アラビアゴム(Nexira)の添加及び凍結乾燥による乾燥により、市販の液体形態から得られた、固体状のSavinase(登録商標)16L、
- 発酵プロセス、続けて、コバルトカラムでの精製、透析ろ過、アラビアゴムの添加及び凍結乾燥による乾燥から得られた、固体状の変異体V16
上記得られたプラスチックコンパウンドの生分解性を評価した。
Claims (16)
- (i)配列番号:1で示される全長アミノ酸配列と少なくとも90%、95%又は99%の同一性を有し、(ii)S104L、N102F、N107I、G132I、G134K及びY167Rから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有するプロテアーゼ変異体であり、
ここで、該位置は、配列番号:1で示されるアミノ酸配列を参照することによりナンバリングされ、
(iii)PLA-分解活性を示し、及び(iv)配列番号:1のプロテアーゼと比較して向上したPLA-分解活性を示す、プロテアーゼ変異体。 - 前記プロテアーゼが、Y167R、N102F、S104L及びN107Iから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1記載のプロテアーゼ変異体。
- 前記プロテアーゼが、S104L+N107I、S104L+Y167R、D160E+Y167R、N102S+D160E+Y167R、S106T+D160E+Y167R、N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I、N102F+S104L+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R及びN102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167Rからなる群より選択される少なくとも1つの置換組み合わせを含み、
ここで、該位置が、配列番号:1で示されるアミノ酸配列を参照することによりナンバリングされる、請求項1又は2のいずれか一項記載のプロテアーゼ変異体。 - 前記プロテアーゼが、N102F、S104L、N107I、G132I、G134K及びY167Rから選択されるる1つのアミノ酸置換を含む、請求項1又は2のいずれか一項記載のプロテアーゼ変異体。
- 前記プロテアーゼがそのN末端に、配列番号:42で示される全長アミノ酸配列と少なくとも100%の同一性を有するアミノ酸配列を更なる配列として含む、請求項1~4のいずれか一項記載のプロテアーゼ変異体。
- 更なる配列が、R24、Y75、D106、Q107、E108、V109、R110、A111及びF112から選択される位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、
ここで、該位置が、配列番号:42で示されるアミノ酸配列を参照することによりナンバリングされる、請求項5記載のプロテアーゼ変異体。 - 請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ変異体をコードする、核酸。
- 請求項7記載の核酸を含む、発現カセット又はベクター。
- 請求項7記載の核酸又は請求項8記載の発現カセットもしくはベクターを含む、ホスト細胞。
- 請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ変異体もしくは請求項9記載のホスト細胞又は前記プロテアーゼ変異体を含むその抽出物を含む、組成物。
- プロテアーゼを製造する方法であって、
(a)前記プロテアーゼをコードする核酸を発現させるのに適した条件下で、請求項9記載のホスト細胞を培養することと、場合により、
(b)前記プロテアーゼを細胞培養物から回収することとを含む、方法。 - 少なくともポリ乳酸(PLA)を含有するプラスチック製品を分解する方法であって、
(a)プラスチック製品を、請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ又は請求項9記載のホスト細胞又は請求項10記載の組成物又は配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼと接触させることと、場合により、
(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収することとを含む、方法。 - 請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ又は請求項9記載のホスト細胞又は前記プロテアーゼを含むその抽出物又は請求項10記載の組成物又は配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼと、少なくともポリ乳酸(PLA)を含有する、プラスチックコンパウンド。
- 請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ又は請求項9記載のホスト細胞又は前記プロテアーゼを含むその抽出物又は請求項10記載の組成物又は配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼと、少なくとも1種のポリエステルを含有する、マスターバッチ組成物。
- 少なくとも1種のポリエステルと、請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ又は請求項9記載のホスト細胞又は前記プロテアーゼを含むその抽出物又は請求項10記載の組成物又は配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼとを、ポリエステルが部分的又は全体が溶融状態にある温度で、好ましくは、押出しにより混合する、請求項12もしくは13記載のプラスチックコンパウンド又は請求項14記載のマスターバッチ組成物を製造するための方法。
- ポリ乳酸含有材料を分解するための、請求項1~6のいずれか一項記載のプロテアーゼ又は請求項9記載のホスト細胞又は請求項10記載の組成物又は配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼの使用。
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