JP7174429B2 - Cyclic peptide with binding activity to collagen - Google Patents
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Description
本発明は、変性コラーゲンに対して強い結合活性を有する環状ペプチド、該
環状ペプチドの変性コラーゲンの検査薬及び研究用試薬としての使用、並びに、該環状ペプチドを含有する変性コラーゲンを生じる疾患の診断用及び治療用の組成物等に関する。The present invention provides a cyclic peptide having a strong binding activity to denatured collagen, the use of the cyclic peptide as a test drug and a research reagent for denatured collagen, and the diagnosis of diseases that cause denatured collagen containing the cyclic peptide. and therapeutic compositions.
コラーゲンは、-(Xaa-Yaa-Gly)-の基本単位を繰り返してなる一次構造のアミノ酸配列を有するペプチド(Xaa及びYaaは任意のアミノ酸残基を表す)の3本鎖が、三重らせん構造を形成するタンパク質の総称であり、動物組織の細胞間に存在する細胞外マトリックスの主要構成成分である(非特許文献1)。動物結合組織中に豊富に含まれ、組織の骨格構造を構成している。ヒトのコラーゲンタンパク質は28種あることが報告されている。 Collagen has a triple helical structure of three chains of peptides (Xaa and Yaa represent arbitrary amino acid residues) having an amino acid sequence of a primary structure consisting of repeating basic units of -(Xaa-Yaa-Gly)-. It is a general term for proteins that form, and is a major component of the extracellular matrix that exists between cells in animal tissues (Non-Patent Document 1). It is abundantly contained in animal connective tissue and constitutes the skeletal structure of the tissue. It has been reported that there are 28 types of human collagen proteins.
一方、コラーゲンは、マトリックスメタロプロテアーゼ活性が上昇したがん等の疾患で、コラーゲンが分解・変性し、その三重らせん構造が緩んだ変性コラーゲンを生じることが知られている(非特許文献2)。そこで、変性コラーゲンに結合可能な人工的なコラーゲン様ペプチドを合成し、これらの変性コラーゲンの検査薬や、変性コラーゲンを有する疾患の診断薬への応用が試みられている(特許文献1~2、非特許文献3)。
On the other hand, collagen is known to be degraded and denatured in diseases such as cancer in which matrix metalloprotease activity is increased, resulting in denatured collagen with a loose triple helical structure (Non-Patent Document 2). Therefore, attempts have been made to synthesize artificial collagen-like peptides that can bind to denatured collagen and to apply them to test agents for these denatured collagens and diagnostic agents for diseases having denatured collagen (
しかし、変性コラーゲンを高い感度で検出可能な検査薬及び研究用試薬や、変性コラーゲンが存在する組織への分布を利用した変性コラーゲンが関連する疾患に対する治療薬等はまだ知られていない。 However, test agents and research reagents capable of detecting denatured collagen with high sensitivity, therapeutic agents for denatured collagen-related diseases utilizing distribution to tissues in which denatured collagen is present, and the like are not yet known.
本発明は、変性コラーゲンに対して結合活性を有する薬剤結合環状ペプチド、該薬剤結合環状ペプチドの変性コラーゲンの検査薬及び研究用試薬としての使用、並びに、該薬剤結合環状ペプチドを含有する変性コラーゲンを生じる疾患の診断用組成物及び予防若しくは治療用組成物を提供することを課題とする。 The present invention provides a drug-bound cyclic peptide having binding activity to denatured collagen, use of the drug-bound cyclic peptide as a test agent for denatured collagen and a reagent for research, and denatured collagen containing the drug-bound cyclic peptide. The object is to provide diagnostic and prophylactic or therapeutic compositions for the diseases that occur.
本発明者らは、二本鎖ペプチドが平行に束ねられた環状構造を有するコラーゲン様ペプチドが、変性コラーゲンに対して強い結合活性を有することを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors have found that a collagen-like peptide having a cyclic structure in which double-stranded peptides are bundled in parallel has a strong binding activity to denatured collagen, and have completed the present invention.
具体的には、本発明は、(Xaa-Yaa-Gly)からなるトリペプチド基を繰り返し単位として、5~9回の繰り返し構造を有し、連結基を含んでもよく、同一又は相違してもよいペプチド鎖の二本鎖を含み、
各ペプチド鎖のN末端近傍及びC末端近傍が架橋された環状ペプチド基を含み、
前記ペプチド鎖の少なくとも1方のペプチド鎖の少なくとも1つのアミノ酸残基の側鎖に薬剤基(agent)が結合(conjugate)している、
薬剤結合環状ペプチド(agent conjugated cyclic peptide)、又はその塩若しくは溶媒和物を提供する;
ただし、Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リジン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよく、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく又は相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく又は相違してもよい。Specifically, the present invention uses a tripeptide group consisting of (Xaa-Yaa-Gly) as a repeating unit, has a repeating structure of 5 to 9 times, may contain a linking group, and may be the same or different. containing two strands of a good peptide chain,
Each peptide chain contains a cyclic peptide group in which the vicinity of the N-terminus and the vicinity of the C-terminus are crosslinked,
an agent is conjugated to a side chain of at least one amino acid residue of at least one of said peptide chains;
providing an agent conjugated cyclic peptide, or a salt or solvate thereof;
However, Xaa and Yaa are each independently proline (Pro or P) residue, hydroxyproline (Hyp or O) residue, arginine (Arg or R) residue, lysine (Lys or K) residue, valine (Val or V) residue, leucine (Leu or L) residue, isoleucine (Ile or I) residue, serine (Ser or S) residue, threonine (Thr or T) residue, alanine (Ala or A) residue residues, glycine (Gly or G) residues, phenylalanine (Phe or F) residues, methionine (Met or M) residues, glutamic acid (Glu or E) residues, aspartic acid (Asp or D) residues, asparagine (Asn or N) residues, glutamine (Gln or Q) residues, histidine (His or H) residues, tryptophan (Trp or W) residues or tyrosine (Tyr or Y) residues, and proline residues may be modified with an amino group or a fluorine atom, and N-isobutyl group glycine residues may be used at the Xaa and Yaa positions,
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different, and Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記薬剤結合環状ペプチドが、下記式(I)で表される薬剤結合環状ペプチドである場合がある;
L1、L1'、L2及びL2'は、それぞれ独立して同一又は相違してもよいスペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基、又は、-L1-L2-若しくは-L1'-L2'-が1つのアミノ酸残基を形成して、スペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基を表し、
L3は、スペーサー基を含んでもよい、前記環状ペプチド基と前記薬剤基との連結基であり、
Aは、スペーサー基を含んでもよい薬剤基を表し、
n及びmは、同一又は相違してもよく、5~9であり、
前記XaaはXaa1又はXaa2として、YaaはYaa1又はYaa2として表され、Xaa1、Xaa2、Yaa1及びYaa2は、同一又は相違してもよく、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リジン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa1位、Xaa2位、Yaa1位及びYaa2位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよく、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、
(i) 式(I)におけるN末端側の下記式(II)で表される置換基は、スペーサー基を含んでもよく、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択され、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋、
・側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択でき、
L 1 , L 1 ', L 2 and L 2 ' are each independently the same or different and may be a cross-linking group that may contain a spacer group (-Sp-), or -L 1 -L 2 - or -L 1 '-L 2 '- forms one amino acid residue and represents a cross-linking group that may include a spacer group (-Sp-),
L3 is a linking group between the cyclic peptide group and the drug group , which may contain a spacer group;
A represents a drug group that may contain a spacer group,
n and m, which may be the same or different, are 5 to 9;
Said Xaa is represented as Xaa 1 or Xaa 2 , Yaa is represented as Yaa 1 or Yaa 2 , Xaa 1 , Xaa 2 , Yaa 1 and Yaa 2 may be the same or different, each independently proline (Pro or P) residue, hydroxyproline (Hyp or O) residue, arginine (Arg or R) residue, lysine (Lys or K) residue, valine (Val or V) residue, leucine (Leu or L) residue group, isoleucine (Ile or I) residue, serine (Ser or S) residue, threonine (Thr or T) residue, alanine (Ala or A) residue, glycine (Gly or G) residue, phenylalanine (Phe or F) residue, methionine (Met or M) residue, glutamic acid (Glu or E) residue, aspartic acid (Asp or D) residue, asparagine (Asn or N) residue, glutamine (Gln or Q) residue a histidine (His or H) residue, a tryptophan (Trp or W) residue or a tyrosine (Tyr or Y) residue, the proline residue optionally modified with an amino group or a fluorine atom, Xaa N-isobutyl group glycine residues may be used at the 1 -position, Xaa 2 -position, Yaa 1 -position and Yaa 2 -position,
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different; Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit,
(i) the substituent represented by the following formula (II) on the N-terminal side in formula (I) may include a spacer group,
- cross-linking by disulfide bonds,
- Cross-linking by amino acid residues having -COOH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
is selected from
- cross-linking by disulfide bonds,
- cross-linking by amino acid residues with -NH2 in the side chain,
- Cross-linking by amino acid residues having -OH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
can be selected from
本発明の薬剤結合環状ペプチドの前記式(I)の前記架橋形成基において、
ジスルフィド結合による架橋が、-Cys-Cys-による架橋、
側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋が、アスパラギン酸(Asp、D)残基若しくはグルタミン酸(Glu、E)残基による架橋、
側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋が、リジン(lys、K)による架橋、又は、
側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋が、(セリン残基(Ser又はS)、トレオニン残基(Thr又はT)若しくはチロシン残基(Tyr又はY))による架橋、
から選択される場合がある。In the cross-linking group of formula (I) of the drug-binding cyclic peptide of the present invention,
Cross-linking by disulfide bonds is cross-linking by -Cys-Cys-,
cross-linking by amino acid residues having -COOH in side chains is cross-linking by aspartic acid (Asp, D) residues or glutamic acid (Glu, E) residues;
cross-linking by amino acid residues having -NH2 in the side chain, cross-linking by lysine (lys, K), or
cross-linking by amino acid residues having -OH in side chains, cross-linking by (serine residues (Ser or S), threonine residues (Thr or T) or tyrosine residues (Tyr or Y)),
may be selected from
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記スペーサー基は、-(Gly)p-(pは1~3の整数)、-(βAla)q-(qは1~3の整数)、-PEG4-、又は、6-アミノヘキサン酸基から選択される場合がある。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the spacer groups are -(Gly) p - (p is an integer of 1 to 3), -(βAla) q - (q is an integer of 1 to 3), -PEG4-, Alternatively, it may be selected from 6-aminohexanoic acid groups.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、L3は、側鎖に前記薬剤基を連結可能なアミノ酸残基Zaaを含み、Zaaは、アスパラギン酸残基(Asp又はD)、グルタミン酸残基(Glu又はE)、リジン残基(Lys又はK)、(セリン残基(Ser又はS)、トレオニン残基(Thr又はT)、チロシン残基(Tyr又はY))、システイン残基(Cys又はC)、プロパルギルグリシン残基から選択される場合がある。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, L3 contains an amino acid residue Zaa capable of linking the drug group to its side chain, and Zaa is an aspartic acid residue (Asp or D), a glutamic acid residue (Glu or E ), lysine residue (Lys or K), (serine residue (Ser or S), threonine residue (Thr or T), tyrosine residue (Tyr or Y)), cysteine residue (Cys or C), propargyl It may be selected from glycine residues.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、薬剤基が、標識基又は医薬分子基から選択される場合がある。 In the drug-binding cyclic peptides of the present invention, drug groups may be selected from labeling groups or drug molecule groups.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記薬剤基が標識基であり、前記標識基における標識体は、ビオチン、酵素、並びに、カルボキシフルオレセイン(CF又はFAM: carboxy fluorescein)、5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)、Alexa fluor(登録商標)、Cyanine Dye 、IRDye、HiLyte fluor(登録商標)を含む蛍光色素、金属錯体化合物及び放射性標識化合物からなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。 In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the drug group is a labeling group, and the label in the labeling group is biotin, an enzyme, and carboxyfluorescein (CF or FAM: carboxy fluorescein), 5(6)-carboxytetramethylrhodamine ( TAMRA), Alexa fluor (registered trademark), Cyanine Dye, IRDye, fluorescent dyes including HiLyte fluor (registered trademark), metal complex compounds and radiolabeled compounds.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記薬剤基が医薬分子基であり、前記医薬分子基における医薬分子は、抗腫瘍薬、骨粗鬆症薬、放射性金属錯体化合物、放射性標識化合物、抗生物質、抗真菌薬、細胞接着分子由来ペプチド、Stromal-derived factor 1 (SDF-1)、成長因子及び抗炎症薬からなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。 In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the drug group is a drug molecule group, and the drug molecules in the drug molecule group are antitumor drugs, osteoporosis drugs, radiometal complex compounds, radiolabeled compounds, antibiotics, and antifungal drugs. , cell adhesion molecule-derived peptides, stromal-derived factor 1 (SDF-1), growth factors and anti-inflammatory drugs.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記式(I)の薬剤結合環状ペプチドが、下記式(IV)~(XIV)で表される場合がある;
-Cys-Cys-は、2つのCys残基の側鎖の-SH基がジスルフィド結合したシスチン残基を表し、
Acは、アセチル基を表し、
Ahxは、6-アミノヘキサン酸基を表し、
Aは、前記スペーサー基を含んでもよい、ビオチン基、カルボキシフルオレセイン(CF又はFAM: carboxy fluorescein)基、IRDye750基、ドキソルビシン基、PTH基、5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)基及びStromal-derived factor 1 (SDF-1)からなる群から選択される少なくとも1種であり、Lys残基の側鎖の-NH2基とアミド結合又はシスチン残基のジスルフィド結合で結合し、
n'及びm'が、同一又は相違してもよく、5~9の整数であり、及び、
s及びtが、同一又は相違してもよく、3又は4の整数である。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the drug-binding cyclic peptide of formula (I) may be represented by the following formulas (IV) to (XIV);
-Cys-Cys- represents a cystine residue in which the side chain -SH groups of two Cys residues are disulfide-bonded,
Ac represents an acetyl group,
Ahx represents a 6-aminohexanoic acid group,
A is a biotin group, a carboxyfluorescein (CF or FAM: carboxyfluorescein) group, an IRDye750 group, a doxorubicin group, a PTH group, a 5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) group, and a stromal-derived factor, which may contain the spacer group is at least one selected from the group consisting of 1 (SDF-1) and binds to the -NH2 group of the side chain of the Lys residue via an amide bond or a disulfide bond of the cystine residue;
n' and m', which may be the same or different, are integers from 5 to 9, and
s and t may be the same or different and are 3 or 4 integers.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記金属錯体化合物がキレート剤と放射性金属との金属錯体であり、該放射性金属が、51Cr、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、47Sc、88Y、86Y、90Y、97Ru、99mTc、103Ru、105Rh、109Pd、111In、117mSn、141Ce、140La、149Pm、153Sm、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi及び225Ac、並びにその酸化物又は窒化物からなる群から選択される1以上の放射性金属である薬剤結合環状ペプチドである場合がある。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the metal complex compound is a metal complex of a chelating agent and a radioactive metal, and the radioactive metal is 51 Cr, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 67 Ga, 68 Ga, 47 Sc, 88Y , 86Y , 90Y , 97Ru , 99mTc , 103Ru , 105Rh , 109Pd , 111In , 117mSn , 141Ce , 140La , 149Pm , 153Sm , 161Tb , 165Dy , 166 Dy, 166 Ho, 167 Tm, 168 Yb, 175 Yb, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 198 Au, 199 Au, 203 Pb, 211 Bi, 212 Bi, 213 Bi, 214 Bi and 225 Ac, and their The drug-binding cyclic peptide may be one or more radiometals selected from the group consisting of oxides or nitrides.
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記金属錯体化合物がキレート剤とX線不透過性金属との金属錯体であり、該X線不透過性金属がビスマス(Bi)、タングステン(W)、タンタル(Ta)、ハフニウム(Hf)、ランタン(La)、その他のランタノイド(lanthanide)、バリウム(Ba)、モリブデン(Mo)、ニオブ(Nb)、ジルコニウム(Zr)及びストロンチウム(Sr)からなる群から選択される1以上の金属である場合がある。 In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the metal complex compound is a metal complex of a chelating agent and a radiopaque metal, and the radiopaque metal is bismuth (Bi), tungsten (W), tantalum ( Ta), hafnium (Hf), lanthanum (La), other lanthanides, barium (Ba), molybdenum (Mo), niobium (Nb), zirconium (Zr) and strontium (Sr) may be one or more metals that
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記金属錯体がキレート剤と常磁性金属との金属錯体であり、該常磁性金属が、クロム(Cr)、マンガン(Mn)、鉄(Fe2+)、鉄(Fe3+)、プラセオジム(Pr)、ネオジム(Nd)、サマリウム(Sm)、イッテルビウム(Yb)、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ジスプロシウム(Dy)、ホルミウム(Ho)及びエルビウム(Er)からなる群から選択される1以上の金属である場合がある。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the metal complex is a metal complex of a chelating agent and a paramagnetic metal, and the paramagnetic metal is chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe 2+ ), iron (Fe 3+ ), Praseodymium (Pr), Neodymium (Nd), Samarium (Sm), Ytterbium (Yb), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Holmium (Ho) and Erbium (Er) may be one or more metals selected from the group consisting of
また、本発明は、前記薬剤結合環状ペプチド、又はその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有し、前記薬剤基は標識基であり、変性領域を含むコラーゲンを含む試料に対する研究用試薬としての、変性領域を含むコラーゲンを有する疾患の検出若しくは診断のための変性コラーゲン検出用としての、又は、変性領域を含むコラーゲンを有する疾患を有する患者の予防若しくは治療用としての組成物を提供する。 In addition, the present invention contains the drug-binding cyclic peptide, or a salt or solvate thereof as an active ingredient, the drug group is a labeling group, and as a research reagent for a sample containing collagen containing a denatured region, A composition is provided for detecting denatured collagen for the detection or diagnosis of diseases with collagen containing denatured regions, or for prophylaxis or treatment of patients with diseases with collagen containing denatured regions.
また、本発明は、前記薬剤結合環状ペプチド、又はその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有し、前記薬剤基は医薬分子基であり、生体内で変性コラーゲンを含む組織に選択的に結合し、標的細胞又は標的組織に分布し、前記標的細胞又は組織における疾患又は障害を予防若しくは治療する、変性領域を含むコラーゲンを有する患者の疾患の治療のための組成物を提供する。 Further, the present invention contains the drug-binding cyclic peptide, or a salt or solvate thereof as an active ingredient, the drug group is a drug molecular group, and selectively binds to tissue containing denatured collagen in vivo. , a composition for the treatment of a disease in a patient having collagen comprising degenerate regions distributed to target cells or tissues to prevent or treat a disease or disorder in said target cells or tissues.
さらに、本発明は、前記薬剤結合環状ペプチド、又はその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有し、前記薬剤基は医薬分子基であり、生体内で変性コラーゲンを含む組織に選択的に結合し、標的細胞又は標的組織に分布し、前記標的細胞又は組織における疾患又は障害を予防若しくは治療する、変性領域を含むコラーゲンを有する患者の疾患の予防若しくは治療方法を提供する。 Furthermore, the present invention contains the drug-binding cyclic peptide, or a salt or solvate thereof as an active ingredient, the drug group is a drug molecular group, and selectively binds to tissue containing denatured collagen in vivo. , a method of preventing or treating disease in a patient having collagen containing degenerate regions distributed to target cells or tissues to prevent or treat diseases or disorders in said target cells or tissues.
本発明の組成物又は予防若しくは治療方法において、前記疾患が、コラーゲン変性、コラーゲンリモデリング及び/又はマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性の亢進を伴う疾患であり、がん、筋骨格系疾患(マルファン症候群、骨粗鬆症、骨折、軟骨性疾患)、創傷、角膜損傷から選択される疾患の検出、診断、予防又は治療に使用される場合がある。 In the composition or preventive or therapeutic method of the present invention, the disease is a disease accompanied by collagen degeneration, collagen remodeling and/or matrix metalloproteinase (MMP) activity enhancement, cancer, musculoskeletal disease (Marfan syndrome, osteoporosis, bone fractures, cartilaginous diseases), wounds, corneal damage, detection, diagnosis, prevention or treatment of diseases.
本発明の組成物又は予防若しくは治療方法において、前記がんがMMP高発現転移性がんが好ましい。 In the composition or preventive or therapeutic method of the present invention, the cancer is preferably MMP-highly expressing metastatic cancer.
本発明により、変性コラーゲンに対して結合活性を有する薬剤結合環状ペプチド、該薬剤結合環状ペプチドの変性コラーゲンの検査薬及び研究用試薬としての使用、並びに、該薬剤結合環状ペプチドを含有する変性コラーゲンを生じる疾患の診断用組成物及び予防若しくは治療用組成物を提供できる。 According to the present invention, a drug-bound cyclic peptide having binding activity to denatured collagen, use of the drug-bound cyclic peptide as a test drug for denatured collagen and a reagent for research, and denatured collagen containing the drug-bound cyclic peptide Diagnostic compositions and prophylactic or therapeutic compositions for the resulting disease can be provided.
1.薬剤結合環状ペプチド
本発明の実施形態の1つは、変性コラーゲンに対して結合活性を有する環状ペプチドに薬剤基が連結された薬剤結合環状ペプチドである。1. Drug-Binding Cyclic Peptide One of the embodiments of the present invention is a drug-binding cyclic peptide in which a drug group is linked to a cyclic peptide having binding activity to denatured collagen.
より具体的には、前記薬剤結合環状ペプチドは、(Xaa-Yaa-Gly)からなるトリペプチド基を繰り返し単位として、5~9回の繰り返し構造を有し、連結基を含んでもよく、同一又は相違してもよいペプチド鎖の二本鎖を含み、
各ペプチド鎖のN末端近傍及びC末端近傍が架橋された環状ペプチド基を含み、
前記ペプチド鎖の少なくとも1方のペプチド鎖の少なくとも1つのアミノ酸残基の側鎖に薬剤基(agent)が結合(conjugate)している、薬剤結合環状ペプチド(agent-conjugated cyclic peptide)、又はその塩若しくは溶媒和物である;
ただし、Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リジン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよく、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよい。More specifically, the drug-binding cyclic peptide has a tripeptide group consisting of (Xaa-Yaa-Gly) as a repeating unit, has a repeating structure of 5 to 9 times, and may contain a linking group. comprising two strands of peptide chains, which may be different;
Each peptide chain contains a cyclic peptide group in which the vicinity of the N-terminus and the vicinity of the C-terminus are crosslinked,
an agent-conjugated cyclic peptide, or a salt thereof, wherein an agent is conjugated to the side chain of at least one amino acid residue of at least one of said peptide chains; or is a solvate;
However, Xaa and Yaa are each independently proline (Pro or P) residue, hydroxyproline (Hyp or O) residue, arginine (Arg or R) residue, lysine (Lys or K) residue, valine (Val or V) residue, leucine (Leu or L) residue, isoleucine (Ile or I) residue, serine (Ser or S) residue, threonine (Thr or T) residue, alanine (Ala or A) residue residues, glycine (Gly or G) residues, phenylalanine (Phe or F) residues, methionine (Met or M) residues, glutamic acid (Glu or E) residues, aspartic acid (Asp or D) residues, asparagine (Asn or N) residues, glutamine (Gln or Q) residues, histidine (His or H) residues, tryptophan (Trp or W) residues or tyrosine (Tyr or Y) residues, and proline residues may be modified with an amino group or a fluorine atom, and N-isobutyl group glycine residues may be used at the Xaa and Yaa positions,
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different; Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit.
コラーゲンは、3本のペプチド鎖によって構成される三重らせん構造を有する生体内成分である。本発明の薬剤結合環状ペプチドは、二本鎖のコラーゲン様ペプチド鎖を含み、両ペプチド鎖の両方のN末端近傍と、両方のC末端近傍がそれぞれ架橋することにより環状ペプチドを形成する。そして、該環状ペプチドが、変性コラーゲンの三重らせん構造がほどけたペプチド鎖に結合する活性を有する(図1参照)。 Collagen is a biocomponent having a triple helical structure composed of three peptide chains. The drug-binding cyclic peptide of the present invention comprises a double-stranded collagen-like peptide chain, and forms a cyclic peptide by cross-linking near the N-terminus of both peptide chains and near the C-terminus of both peptide chains. Then, the cyclic peptide has the activity of binding to the peptide chain unwound from the triple helix structure of denatured collagen (see FIG. 1).
なお、本明細書において、ペプチドの構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の3文字又は1文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸はL体である。本明細書のアミノ酸は、分子生物学で一般的なタンパク質の翻訳に用いられることが知られた20種類の標準L-アミノ酸の他、当該技術分野においてよく知られる修飾アミノ酸残基、例えば、4-ヒドロキシ-L-プロリン、4-フルオロ-L-プロリン及びN-イソブチル基グリシンを含む。本明細書において、ヒドロキシルプロリンは、3-ヒドロキシ-L-プロリン又は4-ヒドロキシ-L-プロリンであり、3文字表記で「Hyp」と、一文字表記で「O」と表される。 In the present specification, the structure of a peptide is described in terms of three-letter or one-letter amino acid notation well known to those skilled in the art. As used herein, amino acids are in the L configuration. The amino acids herein refer to the 20 standard L-amino acids known to be used for general protein translation in molecular biology, as well as modified amino acid residues well known in the art, such as 4 -hydroxy-L-proline, 4-fluoro-L-proline and N-isobutyl group glycine. As used herein, hydroxylproline is 3-hydroxy-L-proline or 4-hydroxy-L-proline, represented by the three-letter code "Hyp" and the one-letter code "O".
本明細書において、「コラーゲン様ペプチド(collagen mimetic peptide: CMP)」とは、非天然の、即ち、人工的なペプチド又はポリペプチドであって、天然のコラーゲンを模して、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造を有するもの、又は、該繰り返し構造を有する複数本のペプチド鎖を、さらに、架橋させたペプチド又はポリペプチドを言う。ただし、前記Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リジン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよく、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよい。As used herein, a "collagen mimetic peptide (CMP)" is a non-natural or artificial peptide or polypeptide that mimics natural collagen and has the -(Xaa-Yaa It refers to a peptide or polypeptide having a repeating structure with -Gly)- as a basic unit, or a plurality of peptide chains having the repeating structure further crosslinked. provided that the Xaa and Yaa are each independently a proline (Pro or P) residue, a hydroxyproline (Hyp or O) residue, an arginine (Arg or R) residue, a lysine (Lys or K) residue, Valine (Val or V) residue, Leucine (Leu or L) residue, Isoleucine (Ile or I) residue, Serine (Ser or S) residue, Threonine (Thr or T) residue, Alanine (Ala or A ) residue, glycine (Gly or G) residue, phenylalanine (Phe or F) residue, methionine (Met or M) residue, glutamic acid (Glu or E) residue, aspartic acid (Asp or D) residue, selected from asparagine (Asn or N) residues, glutamine (Gln or Q) residues, histidine (His or H) residues, tryptophan (Trp or W) residues or tyrosine (Tyr or Y) residues; The group may be modified with an amino group or a fluorine atom, N-isobutyl group glycine residues may be used at the Xaa and Yaa positions,
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different; Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit.
本明細書において、「各ペプチド鎖のN末端近傍及びC末端近傍が架橋された環状ペプチド」とは、(1)各環状ペプチド鎖のN末端及びC末端に架橋形成基が結合したペプチド鎖によって架橋を形成して環状構造を有する環状ペプチド、(2) 各環状ペプチド鎖のN末端側及びC末端側の各末端から逆の末端の方向に、1~3のアミノ酸残基を介した架橋形成によって環状構造を有する環状ペプチド、及び/又は、(1)と(2)との組み合わせによって架橋形成される環状構造を有する環状ペプチドである。なお、架橋形成基は、スペーサー基(Sp-)を有していてもよい。 As used herein, "a cyclic peptide in which the vicinity of the N-terminus and the vicinity of the C-terminus of each peptide chain are cross-linked" means (1) a peptide chain in which a cross-linking group is attached to the N-terminus and the C-terminus of each cyclic peptide chain; Cyclic peptides having a cyclic structure by forming crosslinks, (2) crosslink formation via 1 to 3 amino acid residues in the opposite direction from each end of the N-terminal side and C-terminal side of each cyclic peptide chain and/or a cyclic peptide having a cyclic structure crosslinked by a combination of (1) and (2). In addition, the cross-linking group may have a spacer group (Sp-).
より具体的には、前記薬剤結合環状ペプチドは、下記式(I)で表される薬剤結合環状ペプチドであって;
L1、L1'、L2及びL2'は、それぞれ独立して同一又は相違してもよい、スペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基、又は、-L1-L2-若しくは-L1'-L2'-が1つのアミノ酸残基を形成して、スペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基を表し、
L3は、スペーサー基を含んでもよい、前記環状ペプチド基と前記薬剤基との連結基であり、
Aは、スペーサー基を含んでもよい薬剤基を表し、
n及びmは、同一又は相違してもよく、5~9であり、
前記XaaはXaa1又はXaa2として、YaaはYaa1又はYaa2として表され、Xaa1、Xaa2、Yaa1及びYaa2は、同一又は相違してもよく、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リジン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa1位、Xaa2位、Yaa1位及びYaa2位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよく、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、
(i) 式(I)におけるN末端側の下記式(II)で表される置換基は、スペーサー基を含んでもよく、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択され、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋、
・側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択でき、
L 1 , L 1 ', L 2 and L 2 ' each independently may be the same or different, a cross-linking group which may contain a spacer group (-Sp-), or -L 1 -L 2 - or -L 1 '-L 2 '- form one amino acid residue and represent a cross-linking group that may include a spacer group (-Sp-),
L3 is a linking group between the cyclic peptide group and the drug group , which may contain a spacer group;
A represents a drug group that may contain a spacer group,
n and m, which may be the same or different, are 5 to 9;
Said Xaa is represented as Xaa 1 or Xaa 2 , Yaa is represented as Yaa 1 or Yaa 2 , Xaa 1 , Xaa 2 , Yaa 1 and Yaa 2 may be the same or different, each independently proline (Pro or P) residue, hydroxyproline (Hyp or O) residue, arginine (Arg or R) residue, lysine (Lys or K) residue, valine (Val or V) residue, leucine (Leu or L) residue group, isoleucine (Ile or I) residue, serine (Ser or S) residue, threonine (Thr or T) residue, alanine (Ala or A) residue, glycine (Gly or G) residue, phenylalanine (Phe or F) residue, methionine (Met or M) residue, glutamic acid (Glu or E) residue, aspartic acid (Asp or D) residue, asparagine (Asn or N) residue, glutamine (Gln or Q) residue a histidine (His or H) residue, a tryptophan (Trp or W) residue or a tyrosine (Tyr or Y) residue, the proline residue optionally modified with an amino group or a fluorine atom, Xaa N-isobutyl group glycine residues may be used at the 1 -position, Xaa 2 -position, Yaa 1 -position and Yaa 2 -position,
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different; Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit,
(i) the substituent represented by the following formula (II) on the N-terminal side in formula (I) may include a spacer group,
- cross-linking by disulfide bonds,
- Cross-linking by amino acid residues having -COOH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
is selected from
- cross-linking by disulfide bonds,
- cross-linking by amino acid residues with -NH2 in the side chain,
- Cross-linking by amino acid residues having -OH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
can be selected from
本発明の薬剤結合環状ペプチドの前記式(I)の前記架橋形成基において、
ジスルフィド結合による架橋が、-Cys-Cys-による架橋、
側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋が、アスパラギン酸(Asp、D)残基若しくはグルタミン酸(Glu、E)残基による架橋、
側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋が、リジン(lys、K)による架橋、又は、
側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋が、(セリン残基(Ser又はS)、トレオニン残基(Thr又はT)若しくはチロシン残基(Tyr又はY))による架橋、
から選択できる。In the cross-linking group of formula (I) of the drug-binding cyclic peptide of the present invention,
Cross-linking by disulfide bonds is cross-linking by -Cys-Cys-,
cross-linking by amino acid residues having -COOH in side chains is cross-linking by aspartic acid (Asp, D) residues or glutamic acid (Glu, E) residues;
cross-linking by amino acid residues having -NH2 in the side chain, cross-linking by lysine (lys, K), or
cross-linking by amino acid residues having -OH in side chains, cross-linking by (serine residues (Ser or S), threonine residues (Thr or T) or tyrosine residues (Tyr or Y)),
You can choose from
前記ジケトピペラジンを用いた架橋形成の場合、例えば、Cavelier F.らの方法(Cavelier F. et al., "Original and General Stragegy of Dimerization of Bioactive Molecules"in Peptides: The Wave of the Future, Ed. by Michal Lebt and Richard A. Houghten, American Peptide Society, 2001)と同様の方法で、下記式(XIV)による架橋反応を利用できる。
また、オレフィンメタセシスによる架橋形成の場合、例えば、Vijaya R. ら(Vijaya R. et al., Organic Letters, 2007, 9, 699)やKhan S. N.ら(Khan S. N. et al., Organic Letters 2012, 14, 2952)の方法と同様の方法で、下記式(XV)による架橋反応を利用できる。
本発明の薬剤結合環状ペプチドを製造するためのペプチド鎖の合成において、例えば、所望の連結基、スペーサー基、架橋形成基、及び/又は、側鎖に薬剤基を連結可能なアミノ酸残基Zaaを含むアミノ酸残基を組み込んだペプチド鎖を合成し、高速液体クロマトグラフィーや分子濾過法等の当業者に周知慣用の精製法を用いて、精製したペプチド鎖を取得できる(国際公開パンフレットWO2013111759等)。 In synthesizing a peptide chain for producing a drug-binding cyclic peptide of the present invention, for example, a desired linking group, spacer group, cross-linking group, and/or amino acid residue Zaa capable of linking a drug group to a side chain is A purified peptide chain can be obtained by synthesizing a peptide chain incorporating an amino acid residue containing the amino acid residue and using purification methods well known to those skilled in the art such as high-performance liquid chromatography and molecular filtration (International pamphlet WO2013111759, etc.).
また、前記式(I)において、前記架橋形成基は、前記架橋形成基が、スペーサー基(-Sp-)を含まなくともよく又は含んでもよく、リジン残基(Lys、K)、オルニチン残基、システイン残基(Cys, C)、アスパラギン酸残基(Asp、D)、グルタミン酸残基(Glu、E)、プロパルギルグリシン残基、ジスルフィド基、スルフィド基及びアミド基からなる群から選択されてもよい。 Further, in the formula (I), the cross-linking group may or may not contain a spacer group (-Sp-), a lysine residue (Lys, K), ornithine residue , cysteine residues (Cys, C), aspartic acid residues (Asp, D), glutamic acid residues (Glu, E), propargylglycine residues, disulfide groups, sulfide groups and amide groups. good.
さらに、本発明の薬剤結合環状ペプチドは、前記架橋形成基にスペーサー基を含む場合は、該スペーサー基は、-(Gly)p-(pは1~3の整数)、-(βAla)q-(qは1~3の整数)、-PEG(polyethylene glycol)4-、6-アミノヘキサン酸基から選択されるペプチド鎖であってもよい。Furthermore, when the drug-binding cyclic peptide of the present invention contains a spacer group in the cross-linking group, the spacer group is -(Gly) p - (p is an integer of 1 to 3), -(βAla) q - (q is an integer from 1 to 3), -PEG (polyethylene glycol) 4-, 6-aminohexanoic acid group may be a peptide chain.
前記架橋形成基が、例えば、Lys残基の場合、前記式(III)で表される置換基は、以下の式(XVI)で表される架橋構造を有する。
前記架橋形成基が、例えば、オルニチン残基の場合、前記式(III)で表される置換基は、以下の式(XVII)で表される架橋構造を有する。
前記架橋形成基がシステイン残基であり、ジスルフィド結合により架橋形成する場合、前記式(III)で表される置換基は、以下の式(XVIII-I)で表される架橋構造を有する。
前記架橋形成基がシステイン残基であり、ジスルフィド結合により架橋形成する場合、前記式(II)で表される置換基は、以下の式(XVIII-II)で表される架橋構造を有する。
前記架橋形成基がアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であり、アミド結合により架橋形成する場合、前記式(II)で表される置換基は、以下の式(IX)で表される架橋構造を有し、Hojo H.ら(Hojo H. et al, Tetrahedron 1997, 53, 14263)と同様の方法で、架橋形成を行うことができる。架橋形成基がグルタミン酸の場合の構造を式XIXに示した。
前記架橋形成基がプロパルギルグリシン残基であり、クリックケミストリーにより架橋形成する場合、Li H.ら(Li H. et al., Molecules. ; 2013, 18: 9797)と同様の方法で架橋することができ、前記式(III)で表される置換基は、以下の式(XX)で表される架橋構造を有する。
また、前記式(I)において、L3は、側鎖に前記薬剤基を連結可能なアミノ酸残基Zaaを含み、Zaaは、アスパラギン酸残基(Asp又はD)、グルタミン酸残基(Glu又はE)、リジン残基(Lys又はK)、(セリン残基(Ser又はS)、トレオニン残基(Thr又はT)、チロシン残基(Tyr又はY))、システイン残基(Cys又はC)又はプロパルギルグリシン残基から選択されてもよい。In the above formula (I), L3 contains an amino acid residue Zaa capable of linking the drug group to the side chain, and Zaa is an aspartic acid residue (Asp or D), a glutamic acid residue (Glu or E ), lysine residue (Lys or K), (serine residue (Ser or S), threonine residue (Thr or T), tyrosine residue (Tyr or Y)), cysteine residue (Cys or C) or propargyl It may be selected from glycine residues.
本発明の薬剤結合環状ペプチドは、架橋形成基を有するペプチド鎖を、架橋反応によって架橋形成することによって製造することができる。また、前記ペプチド鎖の製造は、市販のアミノ酸を使用し、公知のペプチドの化学合成法によって製造できるが、これに限定されない。 The drug-binding cyclic peptide of the present invention can be produced by cross-linking peptide chains having a cross-linking group by a cross-linking reaction. In addition, the peptide chain can be produced by a known chemical peptide synthesis method using commercially available amino acids, but is not limited to this.
本発明の薬剤結合環状ペプチドの製造方法の例を以下に記載する。 Examples of methods for producing drug-binding cyclic peptides of the present invention are described below.
前記スペーサーを含んでもよい架橋形成基を有するペプチド鎖と、側鎖に薬剤連結基を連結するためのアミノ酸残基とを含むペプチド鎖とを、架橋反応により架橋形成することにより、環状ペプチドを形成する。N末端側をジスルフィド結合で、C末端側をペプチド結合で架橋する場合の合成スキームを図2Aに、N末端側とC末端側の両方をジスルフィド結合で架橋した環状ペプチド(環状(POG-R’7):配列番号39)の合成スキームを図2Bに示した。 A cyclic peptide is formed by cross-linking a peptide chain having a cross-linking group that may contain a spacer and a peptide chain containing an amino acid residue for linking a drug linking group to a side chain by a cross-linking reaction. do. Fig. 2A shows a synthetic scheme for cross-linking the N-terminal side with a disulfide bond and the C-terminal side with a peptide bond. A cyclic peptide (cyclic (POG-R' 7): The synthetic scheme of SEQ ID NO: 39) is shown in Figure 2B.
次に、上記環状ペプチドに薬剤基を連結することにより、薬剤結合環状ペプチドを製造することができる。薬剤基の連結方法は、例えば、当業者に周知慣用の縮合反応や架橋反応を用いることにより実施できる(国際公開パンフレットWO2016208673等)。 A drug-binding cyclic peptide can then be produced by linking a drug group to the cyclic peptide. A method for linking drug groups can be carried out by using, for example, condensation reaction or cross-linking reaction well known to those skilled in the art (International Publication WO2016208673, etc.).
本発明の薬剤結合環状ペプチドにおける薬剤基の例としては、標識基、医薬分子基が挙げられる。 Examples of the drug group in the drug-binding cyclic peptide of the present invention include labeling groups and drug molecule groups.
例えば、薬剤基が標識基の場合に、前記標識基における標識体は、ビオチン、酵素、並びに、カルボキシフルオレセイン(CF又はFAM: carboxy fluorescein)、5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)、Alexa fluor(登録商標)、Cyanine Dye 、IRDye、HiLyte fluor(登録商標)を含む蛍光化合物又はりん光化合物、金属錯体化合物及び放射性標識化合物からなる群から選択される少なくとも1種であってもよい。 For example, when the drug group is a labeling group, the label in the labeling group is biotin, an enzyme, carboxyfluorescein (CF or FAM: carboxy fluorescein), 5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Alexa fluor (registered (trademark), Cyanine Dye, IRDye, HiLyte fluor (registered trademark), fluorescent or phosphorescent compounds, metal complex compounds and radiolabeled compounds.
より具体的には、前記蛍光標識体の例としては、Alexa fluor(登録商標)の例として、Alexa fluor 350、405、488、532、546、555、568、594、647、680又は750が、Cyanine Dyeの例としてCy2、3、3.5、5、5.5及び7が、IRDyeの例として、 IRDye 650、680RD, 680LT、700DX、700phosphoramidite、750、800CW及び800phosphoramiditeが、HiLyte fluorの例として、HiLyte fluor 405、488、555、594、647、680及び750が、また、FITC、FAM、rhodamine、carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)が、さらに、DyLightの例として、DyLight 350、405、550、633及び755が、さらに、Dy-405、415、430、431、478、490、495及び505が、Oyster-488、555、647、680及び800が、並びに、NorthernLight-493、557及び637等が挙げられる。
More specifically, examples of the fluorescent label include Alexa fluor (registered trademark) such as
また、薬剤基が医薬分子基である場合に、医薬分子を連結基を介して医薬分子基として環状ペプチドに連結させることによって、本発明の薬剤結合環状ペプチドを製造できる。 When the drug group is a drug molecule group, the drug-binding cyclic peptide of the present invention can be produced by linking the drug molecule as the drug molecule group to the cyclic peptide via a linking group.
前記医薬分子の例としては、ドキソルビシン、5-FU、シスプラチン、ビンブラスチン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ブレオマイシン、イリノテカン、パクリタキセル、シクロホスファミド、アクチノマイシンD又はタキサン等から選択される抗腫瘍薬、PTH等の骨粗鬆症薬、放射性金属錯体化合物、放射性標識化合物、ペニシリン、テトラサイクリン等の抗生物質、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、ナイスタチン、エコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール又はクロトリマゾール等から選択される抗真菌薬、カドヘリン、フィブロネクチン、インテグリン、ラミニン又はセレクチン等から選択される細胞接着分子由来の細胞接着活性ペプチド、Stromal-derived factor 1 (SDF-1)、成長因子及び抗炎症薬からなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。 Examples of the pharmaceutical molecule include antidote selected from doxorubicin, 5-FU, cisplatin, vinblastine, daunomycin, epirubicin, idarubicin, mitomycin-C, bleomycin, irinotecan, paclitaxel, cyclophosphamide, actinomycin D or taxanes. Tumor drugs, osteoporosis drugs such as PTH, radioactive metal complex compounds, radiolabeled compounds, antibiotics such as penicillin and tetracycline, parabens, chlorobutanol, phenolsorbic acid, nystatin, econazole, miconazole, fluconazole, ketoconazole, itraconazole, or clotrimazole antifungal drug selected from Etc., cell adhesion active peptide derived from cell adhesion molecule selected from cadherin, fibronectin, integrin, laminin or selectin, stromal-derived factor 1 (SDF-1), growth factor and anti-inflammatory drug At least one selected from the group consisting of
また、前記金属錯体化合物がキレート剤と金属との金属錯体の場合には、該キレート剤は、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)、cyclohexyl-DTPA(シクロヘキシル-ジエチレントリアミン五酢酸)、DOTA(1,4,7,10-テトラ-アザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸)若しくはNOTA(1,4,7-トリアザシクロノナン -N,N',N''-三酢酸)からなる群から選択されるいずれか一つのC-ファンクショナライズド(C-functionalized)コンプレキサン型配位子(特開2015-86213号公報)、L-システイニル基(特開2014-181309号公報)等が挙げられ、これらのキレート剤の製造方法に従い、キレート基を付与したペプチド鎖を合成し、これらのペプチド鎖を架橋反応により架橋形成することにより、本発明の薬剤結合環状ペプチドを製造できる。 When the metal complex compound is a metal complex of a chelating agent and a metal, the chelating agent includes EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), cyclohexyl-DTPA (cyclohexyl-diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) or NOTA (1,4,7-triazacyclononane-N,N',N''- triacetic acid), any one C-functionalized complexan ligand (JP 2015-86213), L-cysteinyl group (JP 2014- 181309), etc., and the drug-binding cyclic peptide of the present invention is produced by synthesizing a peptide chain to which a chelating group is attached according to the production method of these chelating agents, and by cross-linking these peptide chains by a cross-linking reaction. can be manufactured.
さらに、前記金属錯体化合物がキレート剤と放射性金属との金属錯体の場合には、該放射性金属が、51Cr、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、47Sc、88Y、86Y、90Y、97Ru、99mTc、103Ru、105Rh、109Pd、111In、117mSn、141Ce、140La、149Pm、153Sm、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi及び225Ac、並びにその酸化物又は窒化物からなる群から選択される1以上の放射性金属を使用できる。Furthermore, when the metal complex compound is a metal complex of a chelating agent and a radioactive metal , the radioactive metal is 86Y , 90Y , 97Ru , 99mTc , 103Ru , 105Rh , 109Pd , 111In , 117mSn , 141Ce , 140La , 149Pm , 153Sm , 161Tb , 165Dy , 166Dy , 166Ho , 167 Tm, 168 Yb, 175 Yb, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 198 Au, 199 Au, 203 Pb, 211 Bi, 212 Bi, 213 Bi, 214 Bi and 225 Ac, and oxides or nitrides thereof One or more radioactive metals selected from the group consisting of can be used.
さらに、前記金属錯体化合物がキレート剤とX線不透過性金属との金属錯体の場合に、該X線不透過性金属が、ビスマス(Bi)、タングステン(W)、タンタル(Ta)、ハフニウム(Hf)、ランタン(La)、その他のランタノイド(lanthanide)、バリウム(Ba)、モリブデン(Mo)、ニオブ(Nb)、ジルコニウム(Zr)及びストロンチウム(Sr)からなる群から選択される1以上の金属を使用してもよい。 Furthermore, when the metal complex compound is a metal complex of a chelating agent and an X-ray opaque metal, the X-ray opaque metal is bismuth (Bi), tungsten (W), tantalum (Ta), hafnium ( Hf), lanthanum (La), other lanthanides, barium (Ba), molybdenum (Mo), niobium (Nb), zirconium (Zr) and strontium (Sr). may be used.
また、前記金属錯体がキレート剤と常磁性金属との金属錯体の場合に、該金属が、クロム(Cr)、マンガン(Mn)、鉄(Fe2+)、鉄(Fe3+)、プラセオジム(Pr)、ネオジム(Nd)、サマリウム(Sm)、イッテルビウム(Yb)、ガドリニウム(Gd)、テルビウム(Tb)、ジスプロシウム(Dy)、ホルミウム(Ho)及びエルビウム(Er)からなる群から選択される1以上の金属であってもよい。Further, when the metal complex is a metal complex of a chelating agent and a paramagnetic metal, the metal is chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe 2+ ), iron (Fe 3+ ), praseodymium ( Pr), neodymium (Nd), samarium (Sm), ytterbium (Yb), gadolinium (Gd), terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Ho) and erbium (Er) The above metals may be used.
以上の実施形態のより好ましい具体的な例として、下記式(IV)~(XIV)で表される薬剤結合環状ペプチドが挙げられる;
-Cys-Cys-は、2つのCys残基の側鎖の-SH基がジスルフィド結合したシスチン残基を表し、
Acは、アセチル基を表し、
Ahxは、6-アミノヘキサン酸基を表し、
Aは、前記スペーサー基を含んでもよい、ビオチン基、カルボキシフルオレセイン(CF又はFAM: carboxy fluorescein)基、IRDye750基、ドキソルビシン基、PTH基、5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)基及びStromal-derived factor 1 (SDF-1)からなる群から選択される少なくとも1種であり、Lys残基の側鎖の-NH2基とアミド結合又はシスチン残基のジスルフィド結合で結合し、
n'及びm'が、同一又は相違してもよく、5~9の整数であり、及び、
s及びtが、同一又は相違してもよく、3又は4の整数である。More preferred specific examples of the above embodiments include drug-binding cyclic peptides represented by the following formulas (IV) to (XIV);
-Cys-Cys- represents a cystine residue in which the side chain -SH groups of two Cys residues are disulfide-bonded,
Ac represents an acetyl group,
Ahx represents a 6-aminohexanoic acid group,
A is a biotin group, a carboxyfluorescein (CF or FAM: carboxyfluorescein) group, an IRDye750 group, a doxorubicin group, a PTH group, a 5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) group, and a stromal-derived factor, which may contain the spacer group is at least one selected from the group consisting of 1 (SDF-1) and binds to the -NH2 group of the side chain of the Lys residue via an amide bond or a disulfide bond of the cystine residue;
n' and m', which may be the same or different, are integers from 5 to 9, and
s and t may be the same or different and are 3 or 4 integers.
このような薬剤結合環状ペプチドを、例えば、高速液体クロマトグラフィー等の当業者に周知慣用の分離手段を用いて分離精製して取得し、本発明の薬剤結合環状ペプチドの製造に使用できる(国際公開パンフレットWO2013111759等)。 Such drug-binding cyclic peptides can be obtained by separating and purifying using separation means well known to those skilled in the art, such as high-performance liquid chromatography, and used in the production of drug-binding cyclic peptides of the present invention (International publication pamphlet WO2013111759, etc.).
係る薬剤結合環状ペプチドは、以下で説明する変性コラーゲンの検出剤や、変性コラーゲンを含む疾患の診断用組成物(診断薬)や予防(予防薬)若しくは治療用組成物(治療薬)の有効成分として、また、研究用試薬として使用できる。また、バイオマテリアルとしてのコラーゲンへの生理活性物質のアンカリングにも利用できる。 Such a drug-binding cyclic peptide is an active ingredient of a detection agent for denatured collagen described below, a diagnostic composition (diagnostic agent), or a preventive (preventive agent) or therapeutic composition (therapeutic agent) for a disease containing denatured collagen. as well as as a research reagent. It can also be used for anchoring physiologically active substances to collagen as a biomaterial.
2.変性コラーゲン検出用若しくは研究用の組成物又は変性コラーゲンを有する患者の診断薬(診断用組成物)
本発明のもう1つの実施形態は、前記薬剤結合環状ペプチド、又はその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有し、前記薬剤基は標識基である変性領域を含むコラーゲンを有する疾患の検出若しくは研究のための、又は診断のための変性コラーゲン検出用の組成物である。2. Composition for detecting or researching denatured collagen or diagnostic agent for patients with denatured collagen (diagnostic composition)
Another embodiment of the present invention contains the drug-binding cyclic peptide, or a salt or solvate thereof as an active ingredient, and the drug group is a labeling group. or for detecting denatured collagen for diagnosis.
例えば、メタロプロテアーゼの活性が亢進した細胞や組織を有する疾患において、メタロプロテアーゼによってコラーゲンが一部切断され、コラーゲンの三重らせん構造がほどけた変性コラーゲンが生じる(非特許文献2、図1参照)。前記薬剤結合環状ペプチドは、この三重らせん構造がほどけた変性コラーゲンに結合することができ、例えば、薬剤結合環状ペプチドの薬剤基が蛍光性を有する薬剤である場合、この蛍光を検出することにより、変性コラーゲンの有無、局在位置、及び/又は局在する量等を検出し、測定することができる。そこで、本発明の薬剤結合環状ペプチドは、変性コラーゲンに対して、検出用として、又は研究用として使用できる。
For example, in diseases involving cells or tissues with increased metalloprotease activity, collagen is partially cleaved by the metalloprotease, resulting in denatured collagen in which the triple helical structure of collagen is unwound (see
さらに、係る変性コラーゲンの発生に関与する疾患を有する患者に対する診断薬(診断用組成物)としても使用できる。 Furthermore, it can also be used as a diagnostic agent (diagnostic composition) for patients with diseases associated with the generation of such denatured collagen.
前記疾患の例としては、コラーゲン変性、コラーゲンリモデリング及び/又はマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性の亢進を伴う疾患であり、がん、筋骨格系疾患(マルフィン症候群、骨粗鬆症、骨折、軟骨性疾患)、創傷又は角膜損傷から選択される疾患が挙げられ、これらの疾患の検出、診断、予防又は治療に使用できる。 Examples of the diseases include collagen degeneration, collagen remodeling and/or diseases accompanied by increased matrix metalloproteinase (MMP) activity, cancer, musculoskeletal diseases (Marfin's syndrome, osteoporosis, bone fractures, cartilaginous diseases). , wounds or corneal damage, and can be used for the detection, diagnosis, prevention or treatment of these diseases.
特に、本発明の変性コラーゲン検出用の組成物は、MMP高発現転移性がんの検出又は診断に好適に使用することができる。 In particular, the composition for detecting denatured collagen of the present invention can be suitably used for detecting or diagnosing MMP-highly expressing metastatic cancer.
3.変性コラーゲンを含む疾患の予防又は治療用組成物
本発明のもう1つの実施形態は、変性コラーゲンを含む疾患の予防又は治療用組成物である。3. Composition for Prevention or Treatment of Disease Containing Denatured Collagen Another embodiment of the present invention is a composition for prevention or treatment of disease containing denatured collagen.
上記のように、本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記薬剤基が医薬分子基の場合に、薬剤結合環状ペプチドを有効成分として含有する予防又は治療用組成物を生体に投与することにより、前記薬剤結合環状ペプチドは、生体内で変性コラーゲンを含む組織に選択的に結合し、標的細胞又は標的組織に分布し、前記標的細胞又は組織における疾患又は障害を治療する変性領域を含むコラーゲンを有する患者の疾患の治療に使用できる。また、変性コラーゲンを含む組織を有する前記疾患の発症前の生体に、前記薬剤結合環状ペプチドを含有する組成物を投与することにより、該疾患の予防用の組成物として使用することができる。 As described above, in the drug-binding cyclic peptide of the present invention, when the drug group is a drug molecule group, by administering a prophylactic or therapeutic composition containing the drug-binding cyclic peptide as an active ingredient to a living body, the The drug-linked cyclic peptide selectively binds to tissues containing denatured collagen in vivo, distributes to target cells or tissues, and treats diseases or disorders in said target cells or tissues. Patients with collagen containing denatured regions can be used to treat diseases of In addition, by administering a composition containing the drug-binding cyclic peptide to a living body having a tissue containing denatured collagen before the onset of the disease, it can be used as a composition for preventing the disease.
前記疾患の例としては、コラーゲン変性、コラーゲンリモデリング及び/又はマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性の亢進を伴う疾患であり、がん、筋骨格系疾患(マルフィン症候群、骨粗鬆症、骨折、軟骨性疾患)、創傷又は角膜損傷から選択される疾患の予防又は治療に使用できる。 Examples of the diseases include collagen degeneration, collagen remodeling and/or diseases accompanied by increased matrix metalloproteinase (MMP) activity, cancer, musculoskeletal diseases (Marfin's syndrome, osteoporosis, bone fractures, cartilaginous diseases). , wounds or corneal damage.
係る疾患の予防若しくは治療薬、又は予防若しくは治療用組成物として使用する場合、その有効成分は、前記式(I)の化合物であり、前記式(I)の化合物における薬剤基が医薬分子基であり、前記医薬分子基における医薬分子は、好ましくは、ドキソルビシン、5-FU、シスプラチン、ビンブラスチン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ブレオマイシン、イリノテカン、パクリタキセル、シクロホスファミド、アクチノマイシンD又はタキサン等から選択される抗腫瘍薬、PTH等の骨粗鬆症薬、放射性金属錯体化合物、放射性標識化合物、ペニシリン、テトラサイクリン等の抗生物質、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、ナイスタチン、エコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール又はクロトリマゾール等から選択される抗真菌薬、カドヘリン、フィブロネクチン、インテグリン、ラミニン又はセレクチン等から選択される細胞接着分子由来ペプチド、Stromal-derived factor 1 (SDF-1)、成長因子及び抗炎症薬からなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。 When used as a prophylactic or therapeutic agent for such diseases or a prophylactic or therapeutic composition, the active ingredient is the compound of formula (I), and the drug group in the compound of formula (I) is a drug molecular group. and the pharmaceutical molecule in said pharmaceutical molecule group is preferably doxorubicin, 5-FU, cisplatin, vinblastine, daunomycin, epirubicin, idarubicin, mitomycin-C, bleomycin, irinotecan, paclitaxel, cyclophosphamide, actinomycin D or taxane Antitumor drug selected from, etc., osteoporosis drug such as PTH, radioactive metal complex compound, radiolabeled compound, antibiotics such as penicillin and tetracycline, paraben, chlorobutanol, phenolsorbic acid, nystatin, econazole, miconazole, fluconazole, ketoconazole , antifungal drug selected from itraconazole or clotrimazole, etc., cell adhesion molecule-derived peptide selected from cadherin, fibronectin, integrin, laminin or selectin, etc., Stromal-derived factor 1 (SDF-1), growth factor and anti At least one selected from the group consisting of inflammatory drugs.
また、本発明の薬剤結合環状ペプチドにおいて、前記医薬分子基としては放射性金属錯体基であり、該放射性金属として、既に臨床で使用されているイットリウム-90(90Y)、又はルテチウム-177(177Lu)等の治療用の放射性金属を使用することもできる。例えば、標的疾患が、メタロプロテアーゼ活性が亢進したがんの場合、メタロプロテアーゼによって切断され、三重らせん構造がほどけた変性コラーゲンを有する患者に、この90Yの錯体置換基が医薬分子基として結合した薬剤結合環状ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を投与することにより、メタロプロテアーゼ活性が亢進した細胞又は組織に、該薬剤結合環状ペプチドが分布する。この薬剤結合環状ペプチドの90Yから放出される放射線により、がん細胞に障害を与え、がん細胞を死に至らしめることができる。かかる方法によって、例えば、90Yを使用する本発明の薬剤結合環状ペプチドを有効成分とする医薬組成物は、がんの治療に使用することができる。また、変性コラーゲンを含む組織を有するがんを発症する前の生体に、前記薬剤結合環状ペプチドを含有する組成物を投与することにより、がんの予防用の組成物として使用することができる。In the drug-binding cyclic peptide of the present invention, the drug molecule group is a radiometal complex group, and the radiometal is yttrium-90 ( 90 Y) or lutetium-177 ( 177 Lu) and other therapeutic radioactive metals can also be used. For example, when the target disease is cancer with increased metalloprotease activity, this 90 Y complex substituent is attached as a drug molecule group to a patient who has denatured collagen that has been cleaved by the metalloprotease and the triple helix structure has been unwound. By administering a pharmaceutical composition containing a drug-binding cyclic peptide as an active ingredient, the drug-binding cyclic peptide is distributed in cells or tissues in which metalloprotease activity is enhanced. Radiation emitted from 90 Y of this drug-binding cyclic peptide can damage cancer cells and cause cancer cells to die. By such a method, for example, a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, the drug-binding cyclic peptide of the present invention using 90 Y can be used for treating cancer. In addition, by administering a composition containing the drug-binding cyclic peptide to a living body having a tissue containing denatured collagen before cancer develops, it can be used as a composition for preventing cancer.
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。 All documents mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety. The examples described herein are illustrative of embodiments of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention.
略語 一覧
1 アミノ酸残基
Ahx : 6-aminohexanoic acid
Ala (A) : alanine
Arg (R) : arginine
Asn (N) : asparagine
Asp (D) : aspartic acid
Cys (C) : cysteine
Gly (G) : glycine
Gln (Q) : glutamine
Glu (E) : glutamic acid
His (H) : histidine
Hyp (O) : 4-hydroxyproline
Ile (I) : isoleucine
Leu (L) : leucine
Lys (K) : lysine
Met (M) : methionine
Phe (F) : phenylalanine
Pro (P) : proline
Ser (S) : serine
Thr (T) : threonine
Trp (W) : tryptophan
Tyr (Y) : tyrosine
Val (V) : valine
2 保護基
Ac : acetyl
Acm : acetamidomethyl
Boc : tert-butoxycarbonyl
Fmoc : 9-fluorenylmethoxycarbonyl
Mtt : p-methyltrityl
Npys : 3-nitro-2-pyridinesulfenyl
OtBu : tert-butoxy
Pbf : 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Spy : pyridine-2-sulfenyl
tBu : tert-butyl
Trt : triphenylmethyl
3 縮合剤及び関連試薬
DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide
HOBt : N-hydroxybenzotriazole
4 分析装置
HPLC : high-performance liquid chromatography
ESI MS : electron spray ionization mass spectrometry
5 その他
AcOH : acetic acid
ABTS : 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)
CMP : collagen-mimetic peptide
DCM : dichloromethane
DMF : N,N-dimethylformamide
EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
EtOH : ethanol
FAM: Carboxyfluorescein (CF)
HFIP : 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol
HRP : horseradish peroxidase
NHS : N-hydroxysuccinimide
MeCN : acetonitrile
MeOH : methanol
PEG : polyethylene glycol
PBS : phosphate buffered saline
TES : triethylsilane
TFA : trifluoroacetic acid
TFE : trifluoroethanol
TIPS : triisopropylsilane
Abbreviations list
1 amino acid residue
Ahx : 6-aminohexanoic acid
Ala (A): alanine
Arg (R): arginine
Asn (N) : asparagine
Asp (D) : aspartic acid
Cys (C): cysteine
Gly (G): glycine
Gln (Q) : glutamine
Glu (E) : glutamic acid
His (H) : histidine
Hyp(O): 4-hydroxyproline
Ile (I): isoleucine
Leu (L) : leucine
Lys (K): lysine
Met (M): methionine
Phe (F): phenylalanine
Pro (P) : proline
Ser (S): serine
Thr (T): threonine
Trp (W): tryptophan
Tyr (Y): tyrosine
Val (V) : Valine
2 Protecting group
Ac: acetyl
Acm : acetamidomethyl
Boc: tert-butoxycarbonyl
Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl
Mtt : p-methyltrityl
Npys : 3-nitro-2-pyridinesulfenyl
OtBu : tert-butoxy
Pbf : 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Spy : pyridine-2-sulfenyl
tBu: tert-butyl
Trt : triphenylmethyl
3 Condensing agents and related reagents
DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide
HOBt : N-hydroxybenzotriazole
4 Analyzer
HPLC: high-performance liquid chromatography
ESI MS : electron spray ionization mass spectrometry
5 Others
AcOH : acetic acid
ABTS : 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt)
CMP : collagen-mimetic peptide
DCM: copy
DMF : N,N-dimethylformamide
EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
EtOH: ethanol
FAM: Carboxyfluorescein (CF)
HFIP: 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol
HRP : horseradish peroxidase
NHS : N-hydroxysuccinimide
MeCN : acetonitrile
MeOH: methanol
PEG: polyethylene glycol
PBS: phosphate buffered saline
TES : triethylsilane
TFA : trifluoroacetic acid
TFE : trifluoroethanol
TIPS: Triisopropylsilane
[実施例1]
同一のアミノ酸配列を有する二本鎖のペプチドから形成される環状ペプチド
(1) ペプチドの固相合成
ペプチド鎖はRink-Amide-AM-resin LL (100-200 mesh) (Novabiochem、Merck KGaA.、ドイツ) を固相担体とし、Fmoc固相法で合成した。Fmocアミノ酸はNovabiochemから購入したFmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、及び、発明者らによって合成されたFmoc-Ahx-OH、Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OHを用いた。レジンはPD-10カラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社、東京)に計りとり、DMF(ペプチド合成用、和光純薬工業株式会社、大阪)中で2時間室温撹拌し、膨潤させた。ペプチド鎖の伸長はDMF中で反応点となるアミノ基に対し、5等量のFmocアミノ酸、5等量のHOBt(株式会社同仁化学研究所、熊本)、5等量のDIC(ペプチド合成用、和光純薬工業)を2時間室温撹拌しながら反応させた。反応後DMFによる洗浄を4回行った。その後、縮合反応が完結しているかの確認のため、数10個のレジンをとり、0.001 M シアン化カリウム/ピリジン、4 mg/mlフェノール/エタノール、ニンヒドリン/エタノールをそれぞれ一滴ずつ添加し、95℃で1分間加熱した。レジンが着色した場合は再度Fmocアミノ酸を上記の方法で縮合した。Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OHに関しては反応点となるアミノ基に対し3等量加え、3等量のHOBt、3等量のDICとともに2時間室温撹拌しながら縮合させた。反応後DMFによる洗浄を4回行った。その後縮合反応が完結しているかの確認のため、数10個のレジンをとり、2%アセトアルデヒト/DMF 1滴に続き、2%p-クロラニール/DMFを1滴添加し、10秒室温で放置した。レジンが着色した場合は再度Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OHを上記の方法で縮合した。[Example 1]
Cyclic peptides formed from two chains of peptides with identical amino acid sequences
(1) Solid Phase Synthesis of Peptide Peptide chains were synthesized by the Fmoc solid phase method using Rink-Amide-AM-resin LL (100-200 mesh) (Novabiochem, Merck KGaA., Germany) as a solid phase carrier. Fmoc amino acids were purchased from Novabiochem, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH and synthesized by the inventors. Fmoc-Ahx-OH and Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH were used. The resin was weighed into a PD-10 column (GE Healthcare Japan Co., Ltd., Tokyo) and swollen by stirring in DMF (for peptide synthesis, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) at room temperature for 2 hours. Elongation of the peptide chain was performed with 5 equivalents of Fmoc amino acids, 5 equivalents of HOBt (Dojindo Laboratories, Kumamoto), 5 equivalents of DIC (for peptide synthesis, Wako Pure Chemical Industries) was reacted with stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction, washing with DMF was performed four times. After that, in order to confirm the completion of the condensation reaction, several tens of resins were taken, and 0.001 M potassium cyanide/pyridine, 4 mg/ml phenol/ethanol, and ninhydrin/ethanol were added drop by drop to each of them. heated for a minute. When the resin was colored, the Fmoc amino acid was condensed again by the method described above. As for Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH, 3 equivalents were added to the amino group serving as the reaction point, and the mixture was condensed with 3 equivalents of HOBt and 3 equivalents of DIC for 2 hours while stirring at room temperature. After the reaction, washing with DMF was performed four times. After that, to confirm the completion of the condensation reaction, take several tens of resin, add 1 drop of 2% acetaldehyde/DMF and then 1 drop of 2% p-chloranil/DMF, and leave at room temperature for 10 seconds. did. When the resin was colored, Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH was again condensed by the above method.
アミノ酸が縮合されていることが確認できたレジンについては、20%ピペリジン(和光純薬工業株式会社)/DMFに浸漬し、15分間室温撹拌した。DMFによる洗浄を6回行ったあと、上記の方法でFmocアミノ酸を縮合した。側鎖アミノ基がFmoc基で保護されたLys残基を上記の方法で縮合させることで、側鎖アミンに対してアミノ酸を縮合させ、ペプチド鎖を二股に伸長した。ペプチドのN末端は20等量のピリジンと20等量の無水酢酸を用い、DMF中で1時間室温撹拌し、アセチル化した。ペプチド鎖が合成し終わったレジンはメタノールによる洗浄を3回行い、続いてエーテルによる洗浄を3回行った後、1晩以上減圧乾燥した。 The resin confirmed to have condensed amino acids was immersed in 20% piperidine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)/DMF and stirred at room temperature for 15 minutes. After washing with DMF six times, the Fmoc amino acids were condensed as described above. Lys residues whose side chain amino groups were protected with Fmoc groups were condensed by the above-described method to condense amino acids to the side chain amines and extend the peptide chain into two branches. The N-terminus of the peptide was acetylated with 20 equivalents of pyridine and 20 equivalents of acetic anhydride in DMF with stirring at room temperature for 1 hour. After the peptide chain had been synthesized, the resin was washed with methanol three times, then with ether three times, and then dried under reduced pressure for one night or longer.
(2) ペプチドの脱保護
乾燥したレジンに対し、4℃のTFA、m-クレゾール、チオアニソール、エタンジチオールを(82.5:5:5:2.5)の割合となるように加え、2時間室温撹拌することでAcm基を除く全ての保護基を除去した。脱保護に用いた溶液及びカラムを洗浄したTFAを50 ml チューブにとり、40 mlの冷エーテルを加えてペプチドを沈澱させた。溶液は4℃、3500 rpmで5分間遠心した後、上清を廃棄した。沈澱に対して20 mlの冷エーテルを加え、撹拌後、冷エーテルを20 ml追加し、遠心後上清を廃棄した。この操作を3回行った後、沈殿を2時間程度室温で風乾した。この沈殿を40% MeCN/H2Oに溶解し、Sep Pak(登録商標)Plus C18カラム(Waters、米国)に通すことにより疎水性の不純物を除去し凍結後、凍結乾燥した。(2) Deprotection of peptide Add TFA, m-cresol, thioanisole, and ethanedithiol at 4°C to the dried resin at a ratio of (82.5:5:5:2.5) and stir at room temperature for 2 hours. This removed all protecting groups except the Acm group. The solution used for deprotection and the column-washed TFA were placed in a 50 ml tube, and 40 ml of cold ether was added to precipitate the peptide. After the solution was centrifuged at 4°C and 3500 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded. 20 ml of cold ether was added to the precipitate, and after stirring, 20 ml of cold ether was added, and after centrifugation, the supernatant was discarded. After performing this operation three times, the precipitate was air-dried at room temperature for about 2 hours. The precipitate was dissolved in 40% MeCN/H 2 O, passed through a Sep Pak® Plus C18 column (Waters, USA) to remove hydrophobic impurities, frozen, and lyophilized.
(3) ペプチドの環化
Cys残基の側鎖チオールを保護しているAcm基は、過等量のヨウ素と反応させ脱保護すると同時に分子内ジスルフィド架橋を形成させ、環状CMPとした。反応は、Pro-Hyp-Gly繰り返し数が4回、5回及び6回のものは80%酢酸水を溶媒として60℃で行い、繰り返し数が7回以上のものは20%酢酸水を溶媒とし、6 Mグアニジン塩酸塩下で行った。反応は2時間行い、溶液中のヨウ素は過剰量のアスコルビン酸を添加することでクエンチした。溶液はSephadex G-15(GE ヘルスケア バイオサイエンス)ビーズを詰めたカラム(内径2.7 cm、35 ml)を用いてゲルろ過し、溶出液を1 mlずつフラクションに分けた。各フラクションの280 nm における吸光度の値からCMPが溶出しているフラクションを特定した。その際溶出液として、0.05% TFA/H2Oを用いた。CMPが溶出しているフラクションは合わせて凍結乾燥した。(3) Peptide cyclization
The Acm group protecting the side chain thiol of the Cys residue was deprotected by reacting with an overequivalent amount of iodine, and at the same time an intramolecular disulfide bridge was formed, resulting in cyclic CMP. The reaction was carried out at 60°C with 80% aqueous acetic acid as the solvent for 4, 5, and 6 Pro-Hyp-Gly repeats, and 20% aqueous acetic acid as the solvent for 7 or more repeats. , under 6 M guanidine hydrochloride. The reaction was run for 2 hours and the iodine in solution was quenched by adding excess ascorbic acid. The solution was subjected to gel filtration using a column (inner diameter: 2.7 cm, 35 ml) packed with Sephadex G-15 (GE Healthcare Bioscience) beads, and the eluate was divided into 1 ml fractions. A fraction in which CMP was eluted was identified from the absorbance value at 280 nm of each fraction. At that time, 0.05% TFA/H 2 O was used as an eluent. CMP eluting fractions were combined and lyophilized.
(4) CMPの精製
一本鎖CMP及び二本鎖CMP、環状CMPは逆相HPLCを用い、0.05%TFA/H2Oと0.05%TFA/MeCNの直線濃度勾配によって分取精製した。分取は株式会社日立製作所(東京)又は日本分光株式会社(東京)のHPLCを用い、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II 20 × 250 mm (ナカライテスク株式会社、京都)又はCOSMOSIL5C18-AR-II 6.0 × 250 mm (ナカライテスク株式会社)を用いた。(4) Purification of CMP Single-stranded CMP, double-stranded CMP, and cyclic CMP were separated and purified by reversed-phase HPLC with a linear concentration gradient of 0.05% TFA/H 2 O and 0.05% TFA/MeCN. For preparative separation, HPLC by Hitachi, Ltd. (Tokyo) or JASCO Corporation (Tokyo) was used, and the column was COSMOSIL 5C18-AR-
(5) CMPの質量分析
精製したCMPはMALDI-TOF MS(Bruker Autoflex III MALDI-TOF MS、Bruker Daltonics, Leipzig、ドイツ))、又はESI MS(Bruker micrOTOF ESI MS、ruker Daltonics, Leipzig、ドイツ)で質量分析した。各ペプチド鎖又は環状ペプチドの測定結果を表1に示した(配列番号5~19)。(5) Mass Spectrometry of CMP Purified CMP was analyzed by MALDI-TOF MS (Bruker Autoflex III MALDI-TOF MS, Bruker Daltonics, Leipzig, Germany) or ESI MS (Bruker microTOF ESI MS, Ruker Daltonics, Leipzig, Germany). Mass spectrometry was performed. Measurement results for each peptide chain or cyclic peptide are shown in Table 1 (SEQ ID NOs: 5-19).
(6) CMPの定量
CMPを溶かしたサンプル溶液50 μlを384 Well UV-star Microplate (Greiner Bio-One)に添加し、280、900、977 nmにおける吸光度を測定した。その値を次の式を用いて光路長補正した。
補正吸光度 = (A280 sample - A280 blank) × (A977 sample - A900 sample) / ( A977 water - A900 water)
なお、
A280 sample:サンプル溶液の280 nmにおける吸光度
A280 blank:溶媒の280 nmにおける吸光度
A977 sample:サンプル溶液の977 nmにおける吸光度
A900 sample:サンプル溶液の900 nmにおける吸光度
A977 water:水1 cmあたりの977 nmにおける吸光度
A900 water:水1 cmあたりの900 nmにおける吸光度である。(6) CMP quantification
50 µl of the sample solution in which CMP was dissolved was added to a 384-well UV-star Microplate (Greiner Bio-One), and absorbance at 280, 900 and 977 nm was measured. The value was corrected for the optical path length using the following formula.
Corrected absorbance = (A 280 sample - A 280 blank) × (A 977 sample - A 900 sample) / ( A 977 water - A 900 water)
note that,
A 280 sample: Absorbance of sample solution at 280 nm
A 280 blank: absorbance of solvent at 280 nm
A 977 sample: absorbance at 977 nm of the sample solution
A 900 sample: absorbance of sample solution at 900 nm
A 977 water: absorbance at 977 nm per cm of water
A 900 water: Absorbance at 900 nm per 1 cm of water.
次に求められた補正吸光度から、公知の方法(Pace C. N.ら、Prorein Science 1995, 4:2411-2423)により次の式を用いてCMP濃度を算出した。
CMP濃度(M) = 補正吸光度 / (Tyr残基数×1490 + cystine残基数×125)Next, from the corrected absorbance obtained, the CMP concentration was calculated using the following formula by a known method (Pace CN et al., Prorein Science 1995, 4:2411-2423).
CMP concentration (M) = corrected absorbance / (number of Tyr residues × 1490 + number of cystine residues × 125)
(7) CMPの二次構造解析
精製した11種類のCMP(環状CMP4~9、二本鎖CMP4~9及び一本鎖CMP6~10)の 1 mg/ml溶液を、PBSを溶媒として、200~300 μl調製した。その後溶液を95℃で5分間加熱し、室温で10分間徐冷した後4℃で一晩静置することで三重らせんを形成させた。このCMP溶液の4℃における260 nmから190 nmのCDスペクトルを連続的に測定した。測定には日本分光円二色性分光光度計J-820を用いた。スペクトルは残基平均モル楕円率に、(全残基数/Pro、Hyp、Gly残基数)をかけることで、ヘリックス部分の残基平均モル楕円率として求め、その2次構造を解析した。(7) Secondary structure analysis of
コラーゲン三重らせんを構成する3本のペプチド鎖はpolyproline-II様の二次構造をとることが知られている(Duane D. J., Cindy S., Johnson W. C. Jr., Circular dichroism of collagen, gelatin,and poly(proline) II in the vacuum ultraviolet (1976) Biopolymers. 15. 513-521)。すべてのCMPは4℃において、polyproline-II様の二次構造をとっているとの結果を得た(図示せず)。 The three peptide chains that compose the collagen triple helix are known to have a polyproline-II-like secondary structure (Duane D. J., Cindy S., Johnson W. C. Jr., Circular dichroism of collagen, gelatin, and poly (proline) II in the vacuum ultraviolet (1976) Biopolymers. 15, 513-521). All CMPs were found to have polyproline-II-like secondary structures at 4°C (not shown).
(8) CMPの温度変化測定
続いてCMP溶液の温度を4℃から85℃まで18℃ / hで変化させたときの225 nmにおけるCDシグナルを連続的に測定した。温度制御にはPeltier式の温度コントローラを用いた。また得られた曲線を微分し、傾きの絶対値が最も大きい点温度をTmとした。(8) Temperature change measurement of CMP Subsequently, the CD signal at 225 nm was continuously measured while the temperature of the CMP solution was changed from 4°C to 85°C at 18°C/h. A Peltier temperature controller was used for temperature control. The obtained curve was differentiated, and the point temperature with the largest absolute value of the slope was taken as Tm.
CMPのθ225におけるCDシグナルの温度変化測定結果では、二本鎖CMP4と環状CMP4は1次関数的に225 nmにおけるCDシグナルが減少した(図示せず)。したがって、この2種類のCMPは4℃において、三重らせんを形成していないと考えられる。他のCMPは、協同的なCDシグナルの減少が確認された(図示せず)。よってこの環状CMP5~9、二本鎖CMP5~9及び一本鎖CMP6、8、10のCMPは4℃において、三重らせんを形成していると考えられる。これらのCMPの三重らせん変性温度(Tm)を表2に示した。
The results of temperature change measurement of the CD signal at θ225 of CMP showed that the CD signal at 225 nm decreased linearly for double-stranded CMP4 and cyclic CMP4 (not shown). Therefore, it is considered that these two CMPs do not form a triple helix at 4°C. Other CMPs were confirmed to have cooperative CD signal reduction (not shown). Therefore, the cyclic CMPs 5-9, double-stranded CMPs 5-9, and single-stranded
CMPを二本に束ねることでTmが15℃程度上昇した。また、環化することによりさらにTmは数℃上昇した。すなわち、CMPを束ねることで、三重らせんの安定性が向上したと考えられる。 By bundling two CMPs, Tm increased by about 15°C. In addition, cyclization further increased the Tm by several degrees Celsius. In other words, bundling CMPs is thought to improve the stability of the triple helix.
(9) CMPのビオチン標識
CMPを20 mM NaHCO3溶媒中で1 mg/mlに調製し、3等量のNHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Sientific)と2時間室温で反応させ、ビオチン標識した。ビオチン標識したCMPはSephadex G-15ビーズを詰めたカラム(内径2.7 cm、35 ml)を用いてゲルろ過し、溶出液を1 mlずつフラクションに分けた。各フラクションの280 nmにおける吸光度の値からCMPが溶出しているフラクションを特定した。その際溶出液として、0.05%TFA/H2Oを用いた。CMPが溶出しているフラクションは合わせて凍結乾燥した。(9) Biotin labeling of CMP
CMP was prepared at 1 mg/ml in 20 mM NaHCO 3 solvent, reacted with 3 equivalents of NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific) for 2 hours at room temperature, and labeled with biotin. The biotin-labeled CMP was subjected to gel filtration using a column (inner diameter 2.7 cm, 35 ml) packed with Sephadex G-15 beads, and the eluate was divided into 1 ml fractions. A fraction in which CMP was eluted was identified from the absorbance value at 280 nm of each fraction. At that time, 0.05% TFA/H 2 O was used as an eluent. CMP eluting fractions were combined and lyophilized.
(10) CMPのFAM標識
一本鎖CMP10と環状CMP7について20 mM NaHCO3溶媒中で1 mg/mlに調製し、3等量の5-FAM SE (5-Carboxyfluorescein, Succinimidyl Ester、Invitrogen、米国)と2時間室温で遮光しながら反応させ、FAM標識した。FAM標識したCMPは逆相HPLCを用い、0.05%TFA/H2Oと0.05%TFA/MeCNの直線濃度勾配によって分取精製した。その際、COSMOSIL 5C18-AR-II size 6.0 ×250 mmを用いた。(10) FAM labeling of CMP Single-stranded CMP10 and cyclic CMP7 were prepared to 1 mg/ml in 20 mM NaHCO 3 solvent, and 3 equivalents of 5-FAM SE (5-Carboxyfluorescein, Succinimidyl Ester, Invitrogen, USA). and FAM-labeled for 2 hours at room temperature while shielding from light. FAM-labeled CMP was separated and purified by reversed-phase HPLC with a linear concentration gradient of 0.05% TFA/H 2 O and 0.05% TFA/MeCN. At that time, COSMOSIL 5C18-AR-II size 6.0 × 250 mm was used.
FAM標識したCMPをH2Oに溶解し、95℃で5分間加熱後1分間氷上で冷却し、0.1 M NaOH水に溶解し、480 nmにおける吸光度を測定し、FAMのモル吸光係数(76,900 cm-1M-1)からFAM-CMP conjugate溶液の濃度を求めた(R. Sjobackら、Spectrochimica Acta Part A, 1995, 51, L7-L21)。FAM-labeled CMP was dissolved in H 2 O, heated at 95°C for 5 minutes, cooled on ice for 1 minute, dissolved in 0.1 M NaOH water, and the absorbance at 480 nm was measured. −1 M −1 ) to determine the concentration of the FAM-CMP conjugate solution (R. Sjoback et al., Spectrochimica Acta Part A, 1995, 51, L7-L21).
(11) 標識CMPの質量分析
ビオチン又はFAM標識したCMPの質量分析を行った。質量分析は、MALDI-TOF MS又はESI MSで行った。各ペプチドの質量分析を測定した結果を表3に示した(配列番号20~36)。(11) Mass Spectrometry of Labeled CMP Biotin- or FAM-labeled CMP was subjected to mass spectrometry. Mass spectrometry was performed by MALDI-TOF MS or ESI MS. Table 3 shows the results of mass spectrometric measurement of each peptide (SEQ ID NOS: 20-36).
(12) ELISAによるCMPのコラーゲン結合活性の評価
Atelo collagen IPC(株式会社高研、東京)を10 mM AcOH/H2Oに希釈し、10 μg/mlに調製した。Nunc Microwell 96マイクロウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)上にこの溶液を50 μl添加し、クリーンベンチ内で3日間放置することでコラーゲンをコートした。その際、溶液を95℃で3分間処理した熱変性コラーゲンと、非変性コラーゲンの2種類を用いた。コートしたコラーゲンに0.5%スキムミルク/ELISA緩衝液(20 mM HEPES-Na (pH 7.5)、100mM NaCl, 0.005% Tween-20)を50 μl添加し、室温で1時間ブロッキングした。その後コラーゲンに対し、0.5%スキムミルク/PBS溶媒で5 μg/mlに調製したビオチン標識CMPを、三重らせんを形成させた状態(annealed)、及び95℃で5分間加熱し熱変性させ4℃で1分間急冷させた状態(heated)でそれぞれ50 μl添加し、37℃で1時間結合させた。次にstreptavidin-HRPコンジュゲート(Thermo Fisher Scientific、米国)を0.5%スキムミルク/ELISA緩衝液で3000倍に希釈した溶液を50 μl添加し、ビオチンと酵素標識したアビジンを4℃で30分間反応させて結合させた。
最後にABTSをABTS緩衝液(pH5.0) (100 mMリン酸、200 mMクエン酸)に溶解し、0.5 mg/mlに調製した溶液を50 μl添加し、ABTSとHRPを37℃で10分間反応させ、基質の発色の強さを405 nmにおける吸光度から測定した。なお、全ての過程の間に、ELISA緩衝液50 μlによる洗浄を3回行った。(12) Evaluation of collagen-binding activity of CMP by ELISA
Atelo collagen IPC (Koken Co., Ltd., Tokyo) was diluted to 10 mM AcOH/H 2 O to prepare 10 μg/ml. 50 μl of this solution was added to a Nunc Microwell 96 microwell plate (Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand for 3 days in a clean bench to coat the collagen. At that time, two types of collagen were used: thermally denatured collagen obtained by treating the solution at 95° C. for 3 minutes, and non-denatured collagen. 50 μl of 0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.005% Tween-20) was added to the coated collagen and blocked at room temperature for 1 hour. After that, biotin-labeled CMP prepared at 5 µg/ml in 0.5% skimmed milk/PBS solvent was applied to the collagen to form a triple helix (annealed), and heat denatured by heating at 95°C for 5 minutes. 50 μl of each was added, heated for 1 minute and allowed to bind for 1 hour at 37°C. Next, 50 μl of streptavidin-HRP conjugate (Thermo Fisher Scientific, USA) diluted 3000 times with 0.5% skimmed milk/ELISA buffer was added, and biotin and enzyme-labeled avidin were allowed to react at 4°C for 30 minutes. combined.
Finally, dissolve ABTS in ABTS buffer (pH 5.0) (100 mM phosphoric acid, 200 mM citric acid), add 50 μl of the solution adjusted to 0.5 mg/ml, and mix ABTS and HRP at 37°C for 10 minutes. After reacting, the strength of color development of the substrate was measured from the absorbance at 405 nm. In addition, washing with 50 μl of ELISA buffer was performed three times during all processes.
その結果、アニーリングしたCMPは、コラーゲンへの結合をほとんど検出することができなかった。CDのデータとともに考えると、CMP自身が三重らせんを形成している場合、コラーゲン又は熱変性コラーゲンに結合することができないと考えられる。 As a result, almost no binding of annealed CMP to collagen could be detected. Taken together with the CD data, it appears that CMP cannot bind to collagen or heat-denatured collagen if it itself forms a triple helix.
環状CMP及び二本鎖CMPはPOGの繰り返し数が増えるに従い、405 nmにおける吸光度が上昇した。つまり、POGの繰り返し数が増えるに従い、コラーゲンへの結合活性が上昇するとの結果を得た。また、非変性コラーゲンよりも変性コラーゲンに、より多く結合した。これはCMPがコラーゲン上のほどけた部位に結合したことを示している。環状CMP7及び二本鎖CMP7は、従来より知られる一本鎖CMP10よりも強い結合活性を示し、環状の方が二本鎖のものより強く結合しているとの結果を得た(図3参照)。 Cyclic CMP and double-stranded CMP increased in absorbance at 405 nm as the number of POG repeats increased. In other words, as the number of POG repeats increased, the binding activity to collagen increased. It also bound more to denatured collagen than to undenatured collagen. This indicates that CMP bound to unfolded sites on collagen. Circular CMP7 and double-stranded CMP7 exhibited stronger binding activity than conventionally known single-stranded CMP10, and we obtained results that the cyclic one binds more strongly than the double-stranded one (see Fig. 3). ).
(13) ELISAによるCMPの、コラーゲンに対する解離定数算出実験
一本鎖CMP10と環状CMP7について、0.5%スキムミルク/PBS溶媒で30、 10、3、1、0.3、0.1、0.03 μg/mlに調製した。上記の方法で96マイクロウェルプレート上に熱変性コラーゲン及びコラーゲンをコートし、ブロッキングを行った。各CMP溶液を95℃で5分間加熱し熱変性させ、4℃で1分間急冷した後50 μl添加し、4℃で1時間反応し、結合させた。その後上記の方法で基質を発色させ、405 nmにおける吸光度を測定した。測定結果からCMPのコラーゲン及び変性コラーゲンに対する解離定数(KD)を算出した。その結果を表4に示した。(13) Calculation Experiment of Dissociation Constant of CMP for Collagen by ELISA Single-stranded CMP10 and cyclic CMP7 were prepared to 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg/ml with 0.5% skim milk/PBS solvent. A 96-microwell plate was coated with heat-denatured collagen and collagen by the method described above and blocked. Each CMP solution was heated at 95° C. for 5 minutes for heat denaturation, rapidly cooled at 4° C. for 1 minute, added with 50 μl, reacted at 4° C. for 1 hour, and bound. After that, the substrate was developed with the method described above, and the absorbance at 405 nm was measured. From the measurement results, the dissociation constant (KD) of CMP to collagen and denatured collagen was calculated. The results are shown in Table 4.
環状CMP7のKD値は、非変性コラーゲンに対しては1.1×10-7 M、変性コラーゲンに対しては6.6×10-8 Mであり、変性コラーゲンに対する環状CMP7の最大結合量は、非変性コラーゲンの1.67倍であった。これは変性によりコラーゲン上の環状CMP7が結合できる部位が増加したことを示す。今回コートした熱変性コラーゲンは加熱後徐冷させているが、熱変性コラーゲンをアニーリングさせたとき、225 nmにおけるCDシグナルが6割程度回復したという報告がある(Leikina E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 99. 1314-1318) 。よってこの結果は既報のデータに準じ、アニーリングにより三重らせん構造を形成していると考えられる。The KD value of cyclic CMP7 is 1.1 × 10 -7 M for non-denatured collagen and 6.6 × 10 -8 M for denatured collagen, and the maximum binding amount of cyclic CMP7 for denatured collagen is It was 1.67 times that of collagen. This indicates that the denaturation increased the number of sites on the collagen to which cyclic CMP7 can bind. The coated thermally denatured collagen was slowly cooled after heating, and there is a report that the CD signal at 225 nm recovered about 60% when the thermally denatured collagen was annealed (Leikina E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 99. 1314-1318). Therefore, this result conforms to the previously reported data, and it is considered that the triple helical structure is formed by annealing.
この濃度範囲からでは一本鎖CMP10の非変性、変性コラーゲンに対する解離定数を直接求めることができない。そこで、非変性及び変性コラーゲンに結合することのできる一本鎖CMP10と環状CMP7の最大量は同じであると仮定し、解離定数を概算した。その結果、非変性コラーゲンに対しては1.1×10-7 M、変性コラーゲンに対しては6.6×10-8 Mと求まった。ここから変性コラーゲンに対し環状CMP7は、一本鎖CMP10より144倍程度強く結合していた(図4参照)。From this concentration range, the dissociation constants of single-stranded CMP10 to non-denatured and denatured collagen cannot be determined directly. We therefore estimated the dissociation constants by assuming that the maximum amounts of single-stranded CMP10 and cyclic CMP7 that can bind to native and denatured collagen are the same. As a result, it was found to be 1.1×10 −7 M for non-denatured collagen and 6.6×10 −8 M for denatured collagen. From this, cyclic CMP7 bound to denatured collagen about 144 times stronger than single-stranded CMP10 (see FIG. 4).
(14) ウェスタンブロッティングによる抗コラーゲン抗体とのコラーゲン検出能の比較
3 mg/mlのatelo collagen IPCをSDSサンプルバッファー A (50 mM Tris-HCl (pH 6.7)、2%SDS、10%グリセロール、0.002% BPB)に希釈し、30、10、3、1、0.3、0.1 μg/mlとした。これらの溶液を95℃で5分間処理した。これらの溶液各10 μlを8%ゲルを用いたSDS-PAGE後、ニトロセルロース膜上に転写した。このニトロセルロース膜を5%スキムミルク/TBS (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl)に浸漬し、室温で1時間ブロッキングした。TBSで5分間洗浄を3回行った後、5%スキムミルク/PBSで20 μg/mlに調製したCMP溶液、又は抗体緩衝液(3% BSA、20mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.01% Tween-20)で希釈したウサギ抗I型コラーゲン抗体 (Rockland Immunochemicals Inc.)溶液に室温で1時間浸漬した。CMPとしてはビオチン標識一本鎖CMP10とビオチン標識環状CMP7を用い、95℃で5分間加熱しすぐに使用した。抗体は1000倍希釈のものと、200倍希釈のものを用いた。TBSで5分間の洗浄を3回行った後、CMP溶液に浸漬したものについてはstreptavidin-AP conjugate (Promega)を2%スキムミルク/TBSで2000倍に希釈したものに、抗体溶液に浸漬したものについてはヒツジ抗ウサギIgG-AP conjugate (Santa Cruz Biotechnology, INC)を2%スキムミルク/TBSで2000倍に希釈したものに室温で30分間浸漬した。TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.1% Tween-20)でそれぞれ5、10、25分間の洗浄を行った後、AP-conjugate substitute kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.、米国)を用いて20分間発色させてコラーゲンを検出した。(14) Comparison of collagen detectability with anti-collagen antibody by Western blotting
3 mg/ml atelo collagen IPC was diluted in SDS sample buffer A (50 mM Tris-HCl (pH 6.7), 2% SDS, 10% glycerol, 0.002% BPB), 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 µg/ml. These solutions were treated at 95°C for 5 minutes. 10 μl of each of these solutions was transferred onto a nitrocellulose membrane after SDS-PAGE using an 8% gel. This nitrocellulose membrane was immersed in 5% skimmed milk/TBS (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl) and blocked at room temperature for 1 hour. After washing three times with TBS for 5 minutes, CMP solution adjusted to 20 μg/ml with 5% skim milk/PBS, or antibody buffer (3% BSA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, It was immersed in a rabbit anti-type I collagen antibody (Rockland Immunochemicals Inc.) solution diluted with 0.01% Tween-20) at room temperature for 1 hour. Biotin-labeled single-stranded CMP10 and biotin-labeled cyclic CMP7 were used as CMPs, which were heated at 95°C for 5 minutes and used immediately. Antibodies were diluted 1000-fold and 200-fold diluted. After washing with TBS for 5 minutes three times, immersed in CMP solution: streptavidin-AP conjugate (Promega) diluted 2000 times with 2% skim milk/TBS; immersed in antibody solution was immersed in a 2000-fold dilution of sheep anti-rabbit IgG-AP conjugate (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) with 2% skimmed milk/TBS for 30 minutes at room temperature. After washing with TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) for 5, 10, and 25 minutes respectively, AP-conjugate substitute kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) was developed for 20 minutes to detect collagen.
環状CMP7を用いることにより、10 ngのコラーゲンを検出することができた。これは抗コラーゲン抗体を濃い濃度で使用したときと同等程度のコラーゲン検出能であった。一本鎖CMP10では300 ngに薄いバンドが確認され、推奨濃度の抗体も一本鎖CMP10と同程度であった(図5参照)。 By using cyclic CMP7, 10 ng of collagen could be detected. This was comparable to collagen detectability when anti-collagen antibody was used at high concentration. A faint band was observed at 300 ng for single-chain CMP10, and the recommended concentration of antibody was similar to that for single-chain CMP10 (see Figure 5).
(15) 大腸菌のライセート作製
E.coli (ATCC 25922)の凍結菌体を2 mlのLB培地に添加し、37℃で一晩振盪培養した。振盪培養した菌体を遠心して上清を除去した。ペレットに対し、200 μlのSDS sample buffer B (50 mM Tris-HCl (pH 6.7)、2%SDS、10%グリセロール)を添加し、95℃で5分間加熱することでライセートを作製した。ライセートのタンパク質濃度はBCATM protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国)を用いて求め、SDS sample buffer Bで希釈して10 mg/mlに調製した。(15) Escherichia coli lysate preparation
Frozen cells of E. coli (ATCC 25922) were added to 2 ml of LB medium and shake cultured overnight at 37°C. The shake-cultured cells were centrifuged to remove the supernatant. 200 μl of SDS sample buffer B (50 mM Tris-HCl (pH 6.7), 2% SDS, 10% glycerol) was added to the pellet and heated at 95° C. for 5 minutes to prepare a lysate. The protein concentration of the lysate was determined using a BCA ™ protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) and diluted with SDS sample buffer B to a concentration of 10 mg/ml.
(16) ウェスタンブロッティングによる環状CMP7のコラーゲン特異性の評価
3 mg/mlのatelo collagen IPCをSDS sample buffer Aに希釈し100 μg/mlとした。この溶液を95℃で5分間処理した。コラーゲン溶液5 μl、コラーゲン溶液5 μlと大腸菌のライセート2 μlの混合溶液、及び大腸菌のライセート2 μlを8%ゲルを用いたSDS-PAGE後、ニトロセルロース膜上に転写した。このニトロセルロース膜を5%スキムミルク/TBS (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl)に浸漬し、室温で1時間ブロッキングした。TBSで5分間の洗浄を3回行った後、PBSで20 μg/mlに調製した環状CMP7溶液に室温で1時間浸漬した。環状CMP7溶液は95℃で3分間加熱しすぐに使用した。TBSで5分間の洗浄を3回行った後streptavidin-AP conjugate (Promega Corporation、米国)を2%スキムミルク/TBSで2000倍に希釈したものに室温で30分間浸漬した。TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.1%Tween-20)でそれぞれ5、10、25分間の洗浄を行った後、AP-conjugate substitute kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いて20分間発色させコラーゲンを検出した。(16) Evaluation of collagen specificity of cyclic CMP7 by Western blotting
3 mg/ml atelo collagen IPC was diluted with SDS sample buffer A to 100 μg/ml. This solution was treated at 95°C for 5 minutes. 5 μl of collagen solution, a mixed solution of 5 μl of collagen solution and 2 μl of E. coli lysate, and 2 μl of E. coli lysate were subjected to SDS-PAGE using 8% gel and transferred onto a nitrocellulose membrane. This nitrocellulose membrane was immersed in 5% skimmed milk/TBS (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl) and blocked at room temperature for 1 hour. After washing with TBS for 5 minutes three times, it was immersed in a cyclic CMP7 solution adjusted to 20 μg/ml with PBS for 1 hour at room temperature. The cyclic CMP7 solution was heated at 95°C for 3 minutes and used immediately. After washing with TBS for 5 minutes three times, the membrane was immersed in a 2000-fold dilution of streptavidin-AP conjugate (Promega Corporation, USA) with 2% skim milk/TBS at room temperature for 30 minutes. After washing with TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) for 5, 10, and 25 minutes respectively, AP-conjugate substitute kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.) was developed for 20 minutes to detect collagen.
また、同サンプルを上記の方法でニトロセルロース膜に転写したのち、CBB溶液(0.001%CBB、50%メタノール、10%酢酸)に30分間浸漬し、CBB脱色液(50%メタノール、10%AcOH)に浸すことですべてのタンパク質を染色した。 In addition, after transferring the same sample to a nitrocellulose membrane by the above method, it was immersed in CBB solution (0.001% CBB, 50% methanol, 10% acetic acid) for 30 minutes, and CBB destaining solution (50% methanol, 10% AcOH). All proteins were stained by immersion in
環状CMP7で検出した場合には、大腸菌ライセートのみを泳動したものにバンドは確認されず、I型コラーゲン及び大腸菌ライセートとI型コラーゲンを混ぜて泳動したものにはバンドが確認された。ここから、環状CMP7はI型コラーゲンを特異的に検出できていることがわかる。また、CBBで検出した際にはI型コラーゲンのバンドは薄く、大腸菌ライセートでは多量のバンドが検出させている。ここから、環状CMP7は、多量のタンパク質の中から、I型コラーゲンのみを検出しているとの結果を得た(図6参照)。 In the case of detection with cyclic CMP7, no band was observed in E. coli lysate alone, but bands were observed in type I collagen and E. coli lysate mixed with type I collagen. From this, it can be seen that cyclic CMP7 can specifically detect type I collagen. In addition, when detected with CBB, the type I collagen band is faint, and with E. coli lysate, a large amount of band is detected. From this, we obtained the result that cyclic CMP7 detected only type I collagen among a large amount of proteins (see FIG. 6).
(17) コラーゲンの型特異性の検証
3 mg/mlのI、II、III、IV、V型コラーゲン(I型:Atelo Cell IPC (株式会社高研)、II型:Type II collagen (株式会社高研)、III型:Type III collagen (株式会社高研)、IV型:Cell Matrix Type IV (新田ゼラチン株式会社、大阪)、V型:Type V collagen (株式会社高研) )をSDS sample buffer Aに希釈し30 μg/mlとした。この溶液を95℃で5分間処理した。これらの溶液10 μlにタンパク質分子量マーカー(Bio-Rad Laboratories, Inc.、プレシジョンPlusプロテイン未着色スタンダード) 5 μlを混ぜて8%ゲルを用いたSDS-PAGE後上記の方法で、ビオチン標識環状CMP7を用いてウェスタンブロッティングした。(17) Verification of collagen type specificity
3 mg/ml of type I, II, III, IV, and V collagen (Type I: Atelo Cell IPC (Koken Co., Ltd.), Type II: Type II collagen (Koken Co., Ltd.), Type III: Type III collagen ( Koken Co., Ltd.), Type IV: Cell Matrix Type IV (Nitta Gelatin Co., Ltd., Osaka), Type V: Type V collagen (Koken Co., Ltd.) was diluted with SDS sample buffer A to 30 μg/ml. . This solution was treated at 95°C for 5 minutes. 10 μl of these solutions were mixed with 5 μl of a protein molecular weight marker (Precision Plus Protein Unstained Standard, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Western blotting was performed using
環状CMP7により、I型からV型までの全てのコラーゲンを検出することがで
きた。これより、環状CMP7はコラーゲン上の特定の配列ではなく、コラーゲンに共通するX-Y-Glyの繰り返し配列に対してハイブリダイズしていることが示された。すなわち、環状CMP7はコラーゲンを網羅的に検出できることが示された(図7参照)。Cyclic CMP7 was able to detect all collagens from type I to type V. This indicated that cyclic CMP7 hybridized not to a specific sequence on collagen, but to the XY-Gly repeat sequence common to collagen. That is, it was shown that cyclic CMP7 can comprehensively detect collagen (see FIG. 7).
(18) 細胞外に分泌されたコラーゲン蛍光染色
野生型マウス胚性線維芽細胞を、内径35 mmのグラスベースディッシュ(IWAKI、AGCテクノグラス株式会社、静岡)に1 ml(10×104 cells)を播種し、10%FBS (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific Inc.)、100 units/mlのペニシリン、及び100 μg/mlのストレプトマイシン (Sigma-Aldrich Co. LLC.、米国)を添加したD-MEM (和光純薬工業株式会社)培地中で培養した。細胞がコンフルエントになったときに100 units/mlのペニシリン、及び100 μg/mlのストレプトマイシンを添加したHFDM-1(+)(株式会社細胞化学研究所)培地に交換し、3日間培養した。PBS(-)による洗浄を3回行った後、PBSを95℃で5分間処理したものと、室温のPBSそれぞれを細胞に添加することで、細胞外を熱変性させたサンプルと、未変性のサンプルを用意した。その後4%パラホルムアルデヒド/PBS(-)を用いて15分間室温で処理し、固定した。固定した細胞はPBS(-)による洗浄を3回行った後、3%BSA/PBS(-)溶液に浸漬し、室温でブロッキングした。(18) Fluorescent staining of
(19) 抗体による染色
3%BSA/PBS(-)溶液に浸漬し、室温で1時間ブロッキングした細胞に対し、PBS(-)による洗浄を3回行った後、1/100 ウサギ抗I型コラーゲン抗体/1%BSA-PBS(-)を添加した。一時間室温で静置後、PBS(-)による洗浄を3回行い、1/100に希釈したヒツジ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、FITC conjugate (Thermo Fisher Scientific Inc.)/1%BSA-PBS(-)を添加し、1時間室温で静置した。PBS(-)による洗浄を5分間3セット行ったのち、FV1200共焦点レーザー顕微鏡(オリンパス工業株式会社、東京)で観察した。(19) Antibody staining
Cells were immersed in 3% BSA/PBS(-) solution and blocked for 1 hour at room temperature. After washing with PBS(-) three times, 1/100 rabbit anti-type I collagen antibody/1% BSA- PBS(-) was added. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, wash with PBS(-) three times, then add sheep anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody diluted to 1/100, FITC conjugate (Thermo Fisher Scientific Inc.)/1%. BSA-PBS(-) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After 3 sets of washing with PBS(-) for 5 minutes, observation was performed with an FV1200 confocal laser microscope (Olympus Industry Co., Ltd., Tokyo).
(20) CMPによる染色
3%BSA/PBS(-)溶液に浸漬し、室温で2時間ブロッキングした細胞に対し、FAM標識したCMPをPBS(-)中で30、3、0.3 μg/mlに調製したものを添加した。CMPは環状CMP7と一本鎖CMP10を用い、95℃で5分間加熱した後1分間氷上で冷却し添加した。1時間室温で静置した後、PBS(-)による洗浄を5分間3セット行ったのち、FV1200共焦点レーザー顕微鏡で観察した。(20) Staining with CMP
FAM-labeled CMP adjusted to 30, 3, and 0.3 μg/ml in PBS(-) was added to cells that had been immersed in a 3% BSA/PBS(-) solution and blocked for 2 hours at room temperature. Cyclic CMP7 and single-stranded CMP10 were used as CMP, which was added after being heated at 95°C for 5 minutes and then cooled on ice for 1 minute. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, the cells were washed with PBS(-) for 3 sets of 5 minutes, and then observed with an FV1200 confocal laser microscope.
その結果、環状CMP7を用いることで、コラーゲン繊維を検出することができた。抗体を用いた場合は変性コラーゲンと未変性コラーゲンを見分けることはできなかった。一方で環状CMP7及び一本鎖CMP10は変性コラーゲンに強く結合しているとの結果を得た。環状CMP7の変性コラーゲン検出能は一本鎖CMP10の検出能と100倍程度の差があることが確認され、これはELISAの結果と一致した(図8参照)。 As a result, collagen fibers could be detected by using cyclic CMP7. It was not possible to distinguish between denatured and undenatured collagen using antibodies. On the other hand, cyclic CMP7 and single-stranded CMP10 bind strongly to denatured collagen. It was confirmed that the detectability of cyclic CMP7 for denatured collagen differed from that of single-stranded CMP10 by about 100 times, which was consistent with the results of ELISA (see FIG. 8).
一方でELISAの結果では、環状CMP7は未変性のコラーゲンにも、変性コラーゲンの70%程度結合している結果が得られたが、細胞外に分泌されたコラーゲンの染色では変性コラーゲンと未変性コラーゲンとの検出に10倍以上の差を認めた。これは、コラーゲンは繊維形成をすることで、ほどけた部分が減ることを示している。 On the other hand, ELISA results showed that cyclic CMP7 binds to undenatured collagen by about 70% of denatured collagen. A 10-fold or more difference was observed in the detection of This indicates that collagen fiber formation reduces unraveled portions.
(21) 培養細胞内のコラーゲン染色
上記の方法で野生型マウス胚性線維芽細胞を培養した。PBS(-)による洗浄を3回行った後、4%パラホルムアルデヒド/PBS(-)を用いて15分間処理し、固定した。固定した細胞はPBS(-)による洗浄を3回行った後、0.5%TritonX-100/PBS(-)溶液に5分間室温で浸漬し、透過処理を行った。透過処理を行った細胞はPBS(-)による洗浄を3回行った後、3%BSA/PBS(-)溶液に浸漬し、室温1時間でブロッキングした。PBS(-)による洗浄を3回行った後、1/500に希釈した抗KDELマウスモノクローナル抗体(10C3)/1%BSA-PBS(-)を添加し、室温で一時間静置した。PBS(-)による5分間の洗浄を3セット行ったのち、30 μg/ml FAM-CMP・1/200に希釈したヒツジ抗マウス(H+L)抗体、Alexa Fluore594 conjugate/1%BSA-PBS(-)の混合溶液を添加し、1時間室温で静置した。混合溶液は33 μg/ml FAM-CMP溶液を95℃で5分間加熱し、1分間氷冷したのち、11%BSA溶液及び抗体と混合した後、添加した。CMPとしては環状CMP7と一本鎖CMP10を使用した。PBS(-)による5分間の洗浄を3セット行った後、FV1200共焦点レーザー顕微鏡で観察した。(21) Collagen Staining in Cultured Cells Wild-type mouse embryonic fibroblasts were cultured by the method described above. After washing with PBS(-) three times, the cells were treated with 4% paraformaldehyde/PBS(-) for 15 minutes and fixed. The fixed cells were washed three times with PBS(-) and then immersed in a 0.5% TritonX-100/PBS(-) solution for 5 minutes at room temperature for permeabilization. The permeabilized cells were washed three times with PBS(-), immersed in a 3% BSA/PBS(-) solution, and blocked at room temperature for 1 hour. After washing with PBS(-) three times, anti-KDEL mouse monoclonal antibody (10C3)/1% BSA-PBS(-) diluted to 1/500 was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After 3 sets of 5-minute washing with PBS(-), 30 μg/ml FAM-CMP・1/200 diluted sheep anti-mouse (H+L) antibody, Alexa Fluore594 conjugate/1%BSA-PBS ( -) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. For the mixed solution, a 33 μg/ml FAM-CMP solution was heated at 95° C. for 5 minutes, ice-cooled for 1 minute, mixed with an 11% BSA solution and an antibody, and then added. Cyclic CMP7 and single-stranded CMP10 were used as CMPs. After 3 sets of washing with PBS(-) for 5 minutes, observation was performed with an FV1200 confocal laser microscope.
結果を図9に示した。抗体は小胞体を染色し、環状CMP7により、小胞体が染色された。コラーゲンは小胞体内で生合成されるので、環状CMP7は小胞体内のコラーゲンを染色することができたとの結果を得た。一方、一本鎖CMP10では、同条件で細胞内のコラーゲンを染色できなかった(図9参照)。 The results are shown in FIG. The antibody stained the endoplasmic reticulum, and cyclic CMP7 stained the endoplasmic reticulum. Since collagen is biosynthesized in the endoplasmic reticulum, cyclic CMP7 was able to stain collagen in the endoplasmic reticulum. On the other hand, single-stranded CMP10 could not stain intracellular collagen under the same conditions (see FIG. 9).
(22) CMPのIRDye750標識
環状CMP7を20 mM NaHCO3溶液中で1 mg/mlに調製し、それに対して3等量のIR750Dye NHS esterを遮光条件で、室温で2時間反応させた。CMPはSephadex G-25 (GE Healthcare Life Sciences)を用いてゲルろ過し、溶出液を500 mlずつフラクションに分けた。各フラクションの220 nmにおける吸光度の値からCMPが溶出しているフラクションを特定した。その際溶出液として、0.05%TFA/H2Oを用いた。CMPが溶出しているフラクションは合わせて凍結乾燥した。(22) IRDye750 Labeling of CMP Cyclic CMP7 was prepared to 1 mg/ml in a 20 mM NaHCO 3 solution, and 3 equivalents of IR750Dye NHS ester were reacted with it for 2 hours at room temperature under dark conditions. CMP was subjected to gel filtration using Sephadex G-25 (GE Healthcare Life Sciences), and the eluate was divided into 500 ml fractions. A fraction in which CMP was eluted was identified from the absorbance value at 220 nm of each fraction. At that time, 0.05% TFA/H 2 O was used as an eluent. CMP eluting fractions were combined and lyophilized.
このIR標識したCMPをMALDI-TOF MS又はESI MSで質量分析すると以下の結果であった。
IR-環状CMP7
[M+3H]3+計算値 = 1974.532
実測値 MS = 1974.596
このCMPをH2Oに溶解し、95℃で5分間加熱後760 nmにおける吸光度を測定し、IRDyeのモル吸光係数(252,000 cm-1M-1)からIR-CMPconjugateの濃度を求めた。Mass spectrometry of this IR-labeled CMP by MALDI-TOF MS or ESI MS gave the following results.
IR-cyclic CMP7
[M+3H] 3+ Calculated Value = 1974.532
Measured value MS = 1974.596
This CMP was dissolved in H 2 O, heated at 95° C. for 5 minutes, and then the absorbance at 760 nm was measured to determine the concentration of IR-CMPconjugate from the molar extinction coefficient (252,000 cm −1 M −1 ) of IRDye.
(23) In vivoがん細胞イメージング
PBS中で150 μg/mlに調製したCMP溶液を95℃で5分間加熱後、37℃に設定したポットプレート上に置いたシリンジに充填した。この溶液をPC-3細胞、及びLNCaP細胞をそれぞれ左脇腹、右脇腹に担癌したマウス(雄性C.B-17/Ice scid/scid)に対し、37℃程度で尾静脈から投与した。なお、PC-3細胞は骨転移型の前立腺がんであり、LNCaP細胞はリンパ転移型の前立腺がんである。(23) In vivo cancer cell imaging
A 150 µg/ml CMP solution in PBS was heated at 95°C for 5 minutes and then filled into a syringe placed on a pot plate set at 37°C. This solution was administered to mice (male CB-17/Ice scid/scid) bearing PC-3 cells and LNCaP cells on the left flank and right flank, respectively, through the tail vein at about 37°C. PC-3 cells are for bone-metastatic prostate cancer, and LNCaP cells are for lymph-metastatic prostate cancer.
結果を図10に示した。図10において、背中から見て左側はPC-3細胞、背中からみて右側はLNCap細胞が注入された。IR標識した環状CMP7は投与後30分でPC-3細胞への集積が確認された。また、膀胱と腎臓にも強い集積が確認されたため、このCMPは尿排出されることが推測される。投与後24時間ではバックグラウンドは低くなり、膀胱、腎臓、PC-3細胞への集積がより顕著に確認された。一方で環状CMP7の、LNCaP細胞への集積は確認されなかった(図10参照)。
The results are shown in FIG. In FIG. 10, PC-3 cells were injected on the left side of the back and LNCap cells were injected on the right side of the back. IR-labeled cyclic CMP7 was confirmed to accumulate in PC-3
IR標識した環状CMP7は投与後30分でPC-3細胞への集積が確認された。また、膀胱と腎臓にも強い集積が確認されたため、このCMPは尿排出されることが推測される。投与後24時間ではバックグラウンドは低くなり、膀胱、腎臓、PC-3細胞への集積がより顕著に確認された。一方で環状CMP7の、LNCaP細胞への集積は確認されなかった。
IR-labeled cyclic CMP7 was confirmed to accumulate in PC-3
また、PC-3細胞はLNCaP細胞と比較して悪性度が高いとされている。環状CMP7はこの2種類のがん細胞の違いを見分けることができたので、悪性がんのイメージングに応用することができると考えられる。 In addition, PC-3 cells are considered to be more malignant than LNCaP cells. Circular CMP7 was able to distinguish between these two types of cancer cells, and could be applied to the imaging of malignant cancers.
[実施例2]
2つの鎖の配列が異なる環状ペプチドの合成と変性コラーゲンに対する結合活性の評価
下記表5に示した、配列が異なる2本のペプチド鎖から形成される環状ペプチドを合成し(配列番号37~42)、変性コラーゲンに対する結合活性を評価した。
Synthesis of Cyclic Peptides with Different Chain Sequences and Assessment of Binding Activity to Denatured Collagen
Cyclic peptides formed from two peptide chains with different sequences shown in Table 5 below were synthesized (SEQ ID NOs: 37 to 42), and their binding activity to denatured collagen was evaluated.
(1) ペプチドの固相合成
ペプチド鎖chain A及びchain Bを、実施例1と同様の方法で、Fmoc法で固相合成した。(1) Peptide Solid-Phase Synthesis Peptide chains chain A and chain B were solid-phase synthesized in the same manner as in Example 1 by the Fmoc method.
(2) ペプチドの脱保護
[Chain Aの脱保護]
脱保護を実施例1と同様の方法で行い、chain Aとして下記表6に示したペプチドを合成した(配列番号43~45)。
[Deprotection of Chain A]
Deprotection was performed in the same manner as in Example 1, and peptides shown in Table 6 below were synthesized as chain A (SEQ ID NOS: 43-45).
[Chain Bの脱保護]
乾燥したレジンに対し、4℃のTFA、m-クレゾール、チオアニソール、TIPSを(82.5:5:5:2.5)の割合となるように加え、4時間室温撹拌することでAcm基を除く全ての保護基を除去した。また脱保護溶液に150 mMとなるように2,2'-ジチオジピリジンを添加することで、Cys(Trt)のトリチル基を脱保護すると同時にSpy化し、Cys(Spy)とした。その後の操作は、実施例と同様の操作を行い、凍結した後、凍結乾燥した。
合成したchain Bの構造を表7に示した(配列番号46~48)。
TFA, m-cresol, thioanisole, and TIPS at 4°C were added to the dried resin at a ratio of (82.5:5:5:2.5), and stirred for 4 hours at room temperature to remove all of the Acm groups. Protecting groups were removed. In addition, by adding 2,2'-dithiodipyridine to the deprotection solution to a concentration of 150 mM, the trityl group of Cys(Trt) was simultaneously deprotected and converted to Spy to obtain Cys(Spy). Subsequent operations were performed in the same manner as in Examples, and freeze-dried after freezing.
The structures of synthesized chain B are shown in Table 7 (SEQ ID NOS: 46-48).
(3) ペプチドの二量体形成
Chain AおよびChain Bをそれぞれ20 mg/mlとなるようにbuffer (50 mM NH4OAc、2mM EDTA、6M guanidine-HCl、pH 5.5) に溶解した。それぞれの溶液を混合し、室温で1時間反応させて二本鎖ペプチドを得た。溶液はSephadex G-15 (GEヘルスケア バイオサイエンス) ビーズを詰めたカラム (内径2.7 cm、35 ml) を用いてゲルろ過し、溶出液を1 mlずつフラクションに分けた。各フラクションの280 nmにおける吸光度の値からCMPが溶出しているフラクションを特定した。その際溶出液として、0.05% TFA/H2Oを用いた。CMPが溶出しているフラクションは合わせて凍結乾燥し、下記表8に示した二本鎖CMPを取得した(配列番号49~54)。
Chain A and Chain B were each dissolved in buffer (50 mM NH 4 OAc, 2 mM EDTA, 6 M guanidine-HCl, pH 5.5) to 20 mg/ml. Each solution was mixed and reacted at room temperature for 1 hour to obtain a double-chain peptide. The solution was subjected to gel filtration using a column (inner diameter: 2.7 cm, 35 ml) packed with Sephadex G-15 (GE Healthcare Bioscience) beads, and the eluate was divided into 1 ml fractions. A fraction in which CMP was eluted was identified from the absorbance value at 280 nm of each fraction. At that time, 0.05% TFA/H 2 O was used as an eluent. Fractions in which CMP was eluted were combined and lyophilized to obtain double-stranded CMP shown in Table 8 below (SEQ ID NOS: 49-54).
(4) ペプチドの環化、精製及びビオチン標識
表8に示したペプチドの二本鎖に対して、実施例1と同様の方法で、架橋反応を行うことにより環化し、環状ペプチドを合成し、精製後、ビオチン標識を行い、ビオチン標識環状ペプチドを取得した。(4) Peptide Cyclization, Purification, and Biotin Labeling The double chains of the peptides shown in Table 8 were cyclized by performing a cross-linking reaction in the same manner as in Example 1 to synthesize a cyclic peptide, After purification, biotin labeling was performed to obtain a biotin-labeled cyclic peptide.
(5) 環状ペプチドの質量分析
環状ペプチド及びビオチン標識環状ペプチドの質量分析をESI MS法で行った。結果を表9に示した。
(6) ELISAによる環状ペプチドのコラーゲン結合活性の評価
Atelo collagen IPC (高研) を10 mM AcOH/H2Oに希釈し、10 μg/mlに調製した。Nunc Microwell 96マイクロウェルプレート (Thermo Fisher Scientific) 上にこの溶液を50 μl添加し、クリーンベンチ内で2日間放置することでコラーゲンをコートした。コートしたコラーゲンに0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5)、100mM NaCl、0.005% Tween-20)を50 μl添加し、室温で1時間ブロッキングした。その後コラーゲンに対し、95℃に加熱したPBSを添加して熱変性させ、PBS溶媒で5 μg/mlに調製したビオチン標識環状ペプチドを、4℃ (annealed)、又は95℃で5分間加熱し熱変性後急冷した状態(heated)でそれぞれ50 μlを添加し、4℃、18℃又は37℃で1時間反応させることにより結合させた。
その後のELISAによる環状ペプチドの結合活性の評価は、実施例1と同様の方法で行った。(6) Evaluation of collagen-binding activity of cyclic peptides by ELISA
Atelo collagen IPC (Koken) was diluted to 10 mM AcOH/H 2 O to prepare 10 μg/ml. 50 μl of this solution was added to a Nunc Microwell 96 microwell plate (Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand for 2 days in a clean bench to coat the collagen. 50 μl of 0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.005% Tween-20) was added to the coated collagen and blocked at room temperature for 1 hour. After that, PBS heated to 95°C was added to the collagen for heat denaturation, and the biotin-labeled cyclic peptide adjusted to 5 μg/ml in PBS solvent was heated at 4°C (annealed) or at 95°C for 5 minutes. After denaturation, 50 µl of each was added in a heated state and allowed to react at 4°C, 18°C or 37°C for 1 hour to bind.
Evaluation of the binding activity of the cyclic peptide by subsequent ELISA was performed in the same manner as in Example 1.
(7) 実験結果
POG7-R'3、POG7-R'7を除く加熱後急冷した(heated)CMPは4℃において変性コラーゲン結合活性を示した。また、アニーリング(annealed)した、すなわち高次構造(三重らせん構造)を形成したE3-E'3も変性コラーゲン結合活性を示した(図11A参照)。(7) Experimental results
Heated CMPs, except for POG7-R'3 and POG7-R'7, exhibited denatured collagen-binding activity at 4°C. E3-E'3 that was annealed, that is, formed a higher-order structure (triple helical structure) also exhibited denatured collagen-binding activity (see FIG. 11A).
また、4℃において高次構造をとった条件でも顕著な変性コラーゲン結合活性を示していたE3-E'3は、18℃では変性コラーゲン結合活性を示さなかった(図11B参照)。一方でPOG7-E'3とR3-E'3に関しては、高次構造をとった条件における変性コラーゲン結合活性が上昇した。さらに結合温度を37℃へと上げると、全体的に変性コラーゲン結合活性が低下し、結合が検出されたのは環状CMP7、POG7-E'3及びR3-R'3のみであった(図11C参照)。 In addition, E3-E'3, which showed significant denatured collagen-binding activity even under the condition of forming a higher-order structure at 4°C, did not exhibit denatured collagen-binding activity at 18°C (see Fig. 11B). On the other hand, POG7-E'3 and R3-E'3 increased the denatured collagen-binding activity under the condition of higher-order structure. When the binding temperature was further increased to 37°C, the denatured collagen-binding activity decreased overall, and binding was detected only for cyclic CMP7, POG7-E'3 and R3-R'3 (Fig. 11C). reference).
温度変化させたときの変性コラーゲン結合活性の変化の原因として、コラーゲンと環状ペプチドhybridの熱安定性、及び、環状ペプチドの自己三重らせんの熱安定性等の寄与が考えられる。 The change in the binding activity of denatured collagen when the temperature is changed may be attributed to the thermal stability of the collagen and the cyclic peptide hybrid and the thermal stability of the self-triple helix of the cyclic peptide.
[実施例3]
様々なスペーサーを含む環状ペプチドの合成と変性コラーゲンに対する結合活性の評価
下記表10に示した様々なスペーサー基としてAhx基又はGly残基を含む環状ペプチドを合成し(配列番号55~59)、それぞれの変性コラーゲンに対する結合活性を評価した。
Synthesis of cyclic peptides containing various spacers and evaluation of binding activity to denatured collagen
Cyclic peptides containing Ahx groups or Gly residues as various spacer groups shown in Table 10 below were synthesized (SEQ ID NOs: 55 to 59), and their binding activity to denatured collagen was evaluated.
(1) ペプチドの固相合成及び脱保護
ペプチド鎖は、実施例1と同様の方法で、Fmoc法で固相合成後、脱保護することにより、表11に示した二本鎖コラーゲン様ペプチド(CMP)を取得した(配列番号60~64)。
(2) ペプチドの環化、精製及びビオチン標識
上記表11に示された二本鎖コラーゲン様ペプチド(dsCMP)を用いて、実施例1と同様の方法で、環化し、精製後、ビオチン標識を行い、ビオチン標識環状ペプチドを取得した。(2) Peptide cyclization, purification and biotin labeling Using the double-stranded collagen-like peptide (dsCMP) shown in Table 11 above, cyclization and purification were performed in the same manner as in Example 1, followed by biotin labeling. to obtain a biotin-labeled cyclic peptide.
(3) CMPの質量分析
精製したCMPはMALDI-TOF MS又はESI MS法で質量分析した。結果を表12に示した。
(4) ELISAによるCMPのコラーゲン結合活性の評価
Atelo collagen IPC (高研) を10 mM AcOH/H2Oに希釈し、10 μg/mlに調製した。Nunc Microwell 96マイクロウェルプレート (Thermo Fisher Scientific) 上にこの溶液を50 μl添加し、クリーンベンチ内で3日間放置することでコラーゲンをコートした。その際、95℃で5分間加熱した熱変性コラーゲンと、非変性コラーゲンを用いた。コートしたコラーゲンに0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5)、100mM NaCl、0.005% Tween-20) を50 μl添加し、室温で1時間ブロッキングした。その後、コラーゲンに対して、PBS溶媒で3.0×10-7 Mに調製したビオチン標識CMPを、三重らせんを形成させた状態(annealed)、又は、95℃で3分間加熱し熱変性させ4℃で1分間急冷させた状態(heated)でそれぞれ50 μlを添加し、37℃で1時間結合させた。
その後のELISAによる環状ペプチドの結合活性の評価は、実施例1と同様の方法で行った。(4) Evaluation of collagen-binding activity of CMP by ELISA
Atelo collagen IPC (Koken) was diluted to 10 mM AcOH/H 2 O to prepare 10 μg/ml. 50 μl of this solution was added to a Nunc Microwell 96 microwell plate (Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand for 3 days in a clean bench to coat the collagen. At that time, thermally denatured collagen heated at 95° C. for 5 minutes and non-denatured collagen were used. 50 μl of 0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.005% Tween-20) was added to the coated collagen and blocked at room temperature for 1 hour. Subsequently, biotin-labeled CMP prepared to 3.0×10 −7 M in PBS solvent was applied to the collagen to form a triple helix (annealed), or heat denatured by heating at 95° C. for 3 minutes at 4° C. 50 μl of each was added, heated for 1 minute and allowed to bind for 1 hour at 37°C.
Evaluation of the binding activity of the cyclic peptide by subsequent ELISA was performed in the same manner as in Example 1.
(5) 実験結果
アニーリング(annealed)条件でCMPを用いた場合、コラーゲンへの結合をほとんど検出することができなかった(図12A参照)。(5) Experimental Results When CMP was used under annealed conditions, almost no binding to collagen could be detected (see FIG. 12A).
加熱後急冷(heated)したCMPを用いた場合、環状CMPは一本鎖CMPよりも高いコラーゲン結合活性を示した。また、これらのCMPは熱変性コラーゲンにより強く結合した。また、スペーサー基を含まないほうが変性コラーゲンに対して結合活性が高い傾向を示したが、スペーサー基の有無は必ずしも大きな影響を与えなかった(図12B参照)。 Cyclic CMPs showed higher collagen binding activity than single-stranded CMPs when CMPs were heated and then quenched. Also, these CMPs bound more strongly to heat-denatured collagen. In addition, the binding activity to denatured collagen tended to be higher when the spacer group was not included, but the presence or absence of the spacer group did not necessarily have a large effect (see FIG. 12B).
[実施例4]
2つのペプチド鎖の鎖長が異なる環状ペプチドの合成と変性コラーゲンに対する結合活性の評価
下記表12に示される2つのペプチド鎖の各鎖長が異なる弓型形状の環状ペプチドを合成し(配列番号65~70)、変性コラーゲンに対する結合活性を評価した。
Synthesis of cyclic peptides with two different chain lengths and evaluation of their binding activity to denatured collagen
Bow-shaped cyclic peptides having two different chain lengths of the peptide chains shown in Table 12 below were synthesized (SEQ ID NOS: 65 to 70), and their binding activity to denatured collagen was evaluated.
(1) ペプチドの固相合成
ペプチド鎖の固相合成は、実施例1と同様にFmoc法により固相合成した。(1) Peptide Solid-Phase Synthesis Solid-phase synthesis of peptide chains was performed by the Fmoc method in the same manner as in Example 1.
(2) ペプチドの脱保護
ペプチドの脱保護は、実施例1と同様の方法で実施した。
合成した二本鎖ペプチドの配列を表13に示した(配列番号71~76)。
The sequences of the synthesized double-stranded peptides are shown in Table 13 (SEQ ID NOs:71-76).
(3) ペプチドの環化、精製及びビオチン標識化
上記表13に示した二本鎖ペプチドの環化、精製及びビオチン標識は、実施例1と同様に行い、ビオチン標識環状ペプチドを取得した。(3) Peptide Cyclization, Purification, and Biotin Labeling The double-stranded peptides shown in Table 13 were cyclized, purified, and labeled with biotin in the same manner as in Example 1 to obtain biotin-labeled cyclic peptides.
(4) 環状ペプチドの質量分析
上記環状ペプチド及びビオチン標識環状ペプチドの質量分析を行った。質量分析は、ESI MS法で行った。表14に環状ペプチドの質量分析の理論値と測定値とを示した。
(5) ELISAによる環状ペプチドの変性コラーゲン結合活性の評価
Atelo collagen IPC (高研) を10 mM AcOH/H2Oに希釈し、10 μg/mlに調製した。Nunc Microwell 96マイクロウェルプレート (Thermo Fisher Scientific) 上にこの溶液を50 μl添加し、クリーンベンチ内で2日間放置することでコラーゲンをコートした。コートしたコラーゲンに0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5)、100mM NaCl、0.005% Tween-20) を50 μl添加し、室温で1時間ブロッキングした。その後コラーゲンに対し、95℃に加熱したPBSを添加して熱変性させ、PBS溶媒で5 μg/mlに調製したビオチン標識環状ペプチドを、4℃ (annealed)又は95℃で5分間加熱し熱変性させた状態(heated)でそれぞれ50 μl添加し、4℃又は37℃で1時間結合させた。
その後のELISAによる環状ペプチドの結合活性の評価は、実施例1と同様の方法で行った。(5) Evaluation of denatured collagen-binding activity of cyclic peptides by ELISA
Atelo collagen IPC (Koken) was diluted to 10 mM AcOH/H 2 O to prepare 10 μg/ml. 50 μl of this solution was added to a Nunc Microwell 96 microwell plate (Thermo Fisher Scientific) and allowed to stand for 2 days in a clean bench to coat the collagen. 50 μl of 0.5% skim milk/ELISA buffer (20 mM HEPES-Na (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.005% Tween-20) was added to the coated collagen and blocked at room temperature for 1 hour. After that, PBS heated to 95°C was added to the collagen for heat denaturation, and the biotin-labeled cyclic peptide adjusted to 5 μg/ml in PBS solvent was heated at 4°C (annealed) or at 95°C for 5 minutes for heat denaturation. 50 μl of each was added while heated and allowed to bind for 1 hour at 4°C or 37°C.
Evaluation of the binding activity of the cyclic peptide by subsequent ELISA was performed in the same manner as in Example 1.
(6) 実験結果
全ての環状ペプチドは4℃において使用直前に加熱した場合は変性コラーゲンに対して結合活性を示した。一方で直前にペプチド溶液を加熱しなかった場合は、変性コラーゲン結合活性が低かった(図13A参照)。(6) Experimental results All cyclic peptides showed binding activity to denatured collagen when heated at 4°C immediately before use. On the other hand, when the peptide solution was not heated immediately before, the denatured collagen-binding activity was low (see FIG. 13A).
Arch 5-7及びarch 5-8を除く環状ペプチドは37℃において変性コラーゲン結合活性を示した。また、arch 6-7及びarch 6-8についてはペプチド溶液の使用直前の加熱の有無に関わらず、コラーゲン結合活性を示した。その中、arch 6-7の方が、より高い変性コラーゲン結合活性を示した(図13B参照)。 Cyclic peptides except Arch 5-7 and Arch 5-8 exhibited denatured collagen binding activity at 37°C. In addition, arch 6-7 and arch 6-8 showed collagen-binding activity regardless of whether the peptide solution was heated immediately before use. Among them, arch 6-7 showed higher denatured collagen-binding activity (see Fig. 13B).
[実施例5]
副甲状腺ホルモンペプチド(PTH(1-34))を結合させた環状ペプチドの合成と変性コラーゲンに対する結合活性の評価
副甲状腺ホルモンペプチド(PTH(1-34))を結合させた環状ペプチドを合成し、その変性コラーゲンに対する結合活性を評価した。[Example 5]
Synthesis of cyclic peptide bound with parathyroid hormone peptide (PTH(1-34)) and evaluation of binding activity to denatured collagen
Cyclic peptides bound with parathyroid hormone peptide (PTH(1-34)) were synthesized and their binding activity to denatured collagen was evaluated.
(1) 合成方法
副甲状腺ホルモンペプチド(PTH(1-34))を結合させた環状ペプチドの合成の概要を図14Aに示した。
環状ペプチドを形成するためのペプチド鎖の合成は、実施例1と同様の方法でFmoc法で固相合成した。(1) Synthesis method An outline of synthesis of a cyclic peptide to which a parathyroid hormone peptide (PTH(1-34)) is bound is shown in Fig. 14A.
A peptide chain for forming a cyclic peptide was synthesized by solid-phase synthesis by the Fmoc method in the same manner as in Example 1.
二本鎖ペプチドを合成する際、側鎖アミノ基がFmoc基で保護されたLys残基を上記の方法で縮合させることで、側鎖アミンに対してアミノ酸を縮合させ、ペプチド鎖を二股に伸長した。N末端はアミンに対して20等量のピリジンと無水酢酸を加えて室温で1時間反応させることでアセチル化した。 When synthesizing a double-chain peptide, by condensing the Lys residue whose side chain amino group is protected by the Fmoc group by the above method, the amino acid is condensed to the side chain amine, and the peptide chain is extended in two branches. did. The N-terminus was acetylated by adding 20 equivalents of pyridine and acetic anhydride to the amine and reacting at room temperature for 1 hour.
PTH(1-34)は、検出のため、N末端にビオチンを縮合した。反応はDMF中で行い、アミンに対して5等量のビオチンを、5等量のHOBt、5等量のDICとともに2時間室温撹拌しながら縮合させた。また、スペーサーとしてβアラニン(βAla)を導入した。 PTH(1-34) was condensed with biotin at the N-terminus for detection. The reaction was carried out in DMF, and 5 equivalents of biotin relative to the amine was condensed with 5 equivalents of HOBt and 5 equivalents of DIC for 2 hours while stirring at room temperature. Also, β-alanine (βAla) was introduced as a spacer.
(2) ペプチドの脱保護
ペプチドの脱保護は、実施例1と同様の方法で行った。
以下に固相合成で構築したペプチド(配列番号77)と、ビオチン標識したPTH(1-34)のアミノ酸配列(下線部: PTH 1-34:配列番号78)を示した。
The peptide (SEQ ID NO: 77) constructed by solid-phase synthesis and the amino acid sequence of biotin-labeled PTH(1-34) (underlined: PTH 1-34: SEQ ID NO: 78) are shown below.
(3) 空気酸化による二本鎖ペプチドの環化
二本鎖ペプチドの粗精製物に50 mM Tris-HCl (pH 8.8)を加え、ペプチド濃度を0.2 mg/mLに調製し、60°Cで一晩静置した。反応終了はエルマン試薬で確認した。ペプチド溶液48 μLに対してエルマン試薬を2 μL加え、384 Well UV-starR Microplate (Greiner Bio-One社製、オーストリア) に全量を添加し、Multi-spectophotometer VientoR XS (DSファーマバイオメディカル社製、大阪)を使い412 nmでの吸光度を測定した。測定値が反応直後の吸光度と比較して、95%以上減少したことを確認した時点で反応が完結したと判断した。(3) Cyclization of double-chain peptide by air oxidation Add 50 mM Tris-HCl (pH 8.8) to the crude double-chain peptide to adjust the peptide concentration to 0.2 mg/mL, and heat at 60°C. Let stand overnight. Completion of the reaction was confirmed with Ellman's reagent. Add 2 μL of Ellman's reagent to 48 μL of peptide solution, add the entire amount to 384 Well UV-star R Microplate (manufactured by Greiner Bio-One, Austria), and measure with Multi-spectophotometer Viento R XS (manufactured by DS Pharma Biomedical). , Osaka) was used to measure the absorbance at 412 nm. The reaction was judged to be completed when it was confirmed that the measured value decreased by 95% or more compared to the absorbance immediately after the reaction.
(4) 環状ペプチドの精製
環状ペプチド(配列番号79)及びビオチン標識したPTH(1-34)は逆相HPLCを用い、0.05%TFA/H2Oと0.05%TFA/MeCNの直線濃度勾配によって分取精製した。分取はHPLCを用い、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II 6.0 × 250 mm (ナカライテスク社製) を用いた。(4) Purification of Cyclic Peptide Cyclic peptide (SEQ ID NO: 79) and biotin-labeled PTH (1-34) were separated by reversed-phase HPLC with a linear concentration gradient of 0.05% TFA/H 2 O and 0.05% TFA/MeCN. Extracted and purified. HPLC was used for fractionation, and COSMOSIL 5C18-AR-II 6.0 × 250 mm (manufactured by Nacalai Tesque) was used as a column.
(5) 環状ペプチドのC末端に存在するCys残基の側鎖チオールを保護するAcm基のNpys化
TFA:AcOH (1:2, v/v) に溶解した精製済みの環状ペプチドに、2当量のNpys-Clを加え、10 mg/mLに調製した後、室温・窒素雰囲気下・遮光条件下で30分間反応させた。反応の終了をRP-HPLC分析で確認した後、氷冷したH2Oで反応溶液を10倍に希釈した。希釈した反応溶液中の主生成物をRP-HPLCで精製した。(5) Npys conversion of the Acm group that protects the side chain thiol of the Cys residue present at the C-terminus of the cyclic peptide
Add 2 equivalents of Npys-Cl to the purified cyclic peptide dissolved in TFA:AcOH (1:2, v/v) to adjust the concentration to 10 mg/mL. React for 30 minutes. After the completion of the reaction was confirmed by RP-HPLC analysis, the reaction solution was diluted 10-fold with ice-cooled H2O . The main product in the diluted reaction solution was purified by RP-HPLC.
(6) Npys化した環状ペプチドとビオチン標識したPTH(1-34)の結合
Npys化した環状ペプチドをbuffer A (6 M guanidine HCl、50 mM AcONa、2 mM EDTA・2Na、pH 5.4)で10 mg/mLに調製し、ビオチン標識したPTH(1-34)を0.5等量加え、窒素雰囲気下・遮光・室温・pH 5.4の条件下で1.5時間反応させた。反応終了をRP-HPLCで確認し、主生成物 1 (図14A参照)をRP-HPLCで精製した(配列番号80)。(6) Binding of Npys-ylated cyclic peptides to biotin-labeled PTH(1-34)
Npys-modified cyclic peptide was adjusted to 10 mg/mL with buffer A (6 M guanidine HCl, 50 mM AcONa, 2 mM EDTA/2Na, pH 5.4), and 0.5 equivalent of biotin-labeled PTH(1-34) was added. , under the conditions of nitrogen atmosphere, light shielding, room temperature, and pH 5.4, for 1.5 hours. Completion of the reaction was confirmed by RP-HPLC, and the main product 1 (see Figure 14A) was purified by RP-HPLC (SEQ ID NO: 80).
(7) PTH(1-34)-環状ペプチドconjugateの質量分析
上記ビオチン標識化したペプチドをESI MSで質量分析した。その結果、測定値(Found MS): 1904.729、理論値(Calcd MS):([M+5H]5+/5): 1904.517であった。(7) Mass Spectrometry of PTH(1-34)-Cyclic Peptide Conjugate The biotin-labeled peptide was subjected to mass spectrometry by ESI MS. As a result, measured value (Found MS): 1904.729, theoretical value (Calcd MS): ([M+5H] 5+ /5): 1904.517.
(8) ELISAによるコラーゲン結合活性の評価
PTH(1-34)-環状ペプチド結合体(conjugate)の変性コラーゲンへの結合活性をビオチン標識した環状CMP7(Bio-cCMP7)及びビオチン標識したPTH (1-34) (Bio-PTH (1-34)-cCMP)と比較した。96ウェルプレートにAtelocollagen I-PCを添加し、ドライ法でコートをした。Atelocollagen I-PCは何も処理せずそのまま添加したもの (非変性コラーゲン) と湯浴で加熱処理したもの (熱変性コラーゲン) をコートした。また、プラスチックとブロッキング剤への吸着を見るため、溶媒のみを添加したブランクも用意した。次に、それぞれのウェルをスキムミルクでブロッキング後、PBSで1 μMに調整したペプチドを添加し、37°Cで静置した。ペプチドは添加直前に95℃で5分間加熱した後4℃で1分間冷却したCMPを使用した。次に、結合したペプチドを検出するため、1/2000倍に希釈したstreptavidin-HRP conjugateを加え、4℃で30分間静置した。最後に0.5 mg/mL ABTS /100 mM phosphate-200 mM citrate buffer (pH 5.0)、0.05% (v/v) H2O2を加えて、37°Cで20 min静置してABTSを発色させた。発色させたABTSの波長405 nmの吸光度をMulti-spectophotometer VientoR XSを使い測定した。(8) Evaluation of collagen binding activity by ELISA
Biotin-labeled cyclic CMP7 (Bio-cCMP7) and biotin-labeled PTH (1-34) (Bio-PTH (1-34) )-cCMP). Atelocollagen I-PC was added to a 96-well plate and coated by the dry method. Atelocollagen I-PC was applied without any treatment (non-denatured collagen) and after heat treatment in a hot water bath (thermally denatured collagen). In addition, a blank to which only the solvent was added was also prepared in order to check the adsorption to plastics and blocking agents. Next, after blocking each well with skim milk, a peptide adjusted to 1 μM with PBS was added and allowed to stand at 37°C. Peptides were used in CMP that had been heated at 95°C for 5 minutes immediately before addition and then cooled at 4°C for 1 minute. Next, in order to detect bound peptides, streptavidin-HRP conjugate diluted to 1/2000 was added and allowed to stand at 4°C for 30 minutes. Finally, add 0.5 mg/mL ABTS/100 mM phosphate-200 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.05% (v/v) H 2 O 2 and let stand at 37°C for 20 min to develop ABTS. rice field. The absorbance of the colored ABTS at a wavelength of 405 nm was measured using a Multi-spectophotometer Viento R XS.
(9) 実験結果
PTH(1-34)-環状ペプチド結合体は、PTH(1-34)が結合していない環状ペプチド(Bio-cCMP7)と同等のコラーゲン結合活性を示した(図14B参照)。本結果は、PTH(1-34)を環状ペプチドに結合させても、立体障害を惹起することなく、変性コラーゲンに結合できることを示すものである。(9) Experimental results
The PTH(1-34)-cyclic peptide conjugate showed collagen-binding activity equivalent to that of the cyclic peptide (Bio-cCMP7) to which PTH(1-34) was not bound (see FIG. 14B). This result indicates that even if PTH(1-34) is bound to a cyclic peptide, it can bind to denatured collagen without causing steric hindrance.
Claims (10)
各ペプチド鎖のN末端近傍及びC末端近傍が架橋された環状ペプチド基を含み、
前記ペプチド鎖の少なくとも1方のペプチド鎖の少なくとも1つのアミノ酸残基の側鎖に薬剤基(agent)が結合(conjugate)していることを特徴とする、
薬剤結合環状ペプチド(agent conjugated cyclic peptide)、又はその塩若しくは溶媒和物;
ただし、(Xaa-Yaa-Gly)は、(Pro-Hyp-Gly)、(Glu-Hyp-Gly)又は(Pro-Arg-Gly)から選択され、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく又は相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく又は相違してもよい。 A tripeptide group consisting of (Xaa-Yaa-Gly) as a repeating unit, having a repeating structure of 5 to 9 times, optionally containing a linking group, and containing double chains of peptide chains which may be the same or different ,
Each peptide chain contains a cyclic peptide group in which the vicinity of the N-terminus and the vicinity of the C-terminus are crosslinked,
An agent is conjugated to the side chain of at least one amino acid residue of at least one of the peptide chains,
an agent conjugated cyclic peptide, or a salt or solvate thereof;
provided that (Xaa-Yaa-Gly) is selected from (Pro-Hyp-Gly), (Glu-Hyp-Gly) or (Pro-Arg-Gly);
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different, and Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit.
L1、L1'、L2及びL2'は、それぞれ独立して同一又は相違してもよいスペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基、又は、-L1-L2-若しくは-L1'-L2'-が1つのアミノ酸残基を形成して、スペーサー基(-Sp-)を含んでもよい架橋形成基を表し、
L3は、スペーサー基を含んでもよい、前記環状ペプチド基と前記薬剤基との連結基であり、
Aは、スペーサー基を含んでもよい薬剤基を表し、
n及びmは、同一又は相違してもよく、5~9であり、
前記XaaはXaa1又はXaa2として、YaaはYaa1又はYaa2として表され、Xaa1、Xaa2、Yaa1及びYaa2は、同一又は相違してもよく、(Xaa-Yaa-Gly)は、(Pro-Hyp-Gly)、(Glu-Hyp-Gly)又は(Pro-Arg-Gly)から選択され、
(Xaa-Yaa-Gly)の繰り返し単位は、各繰り返し単位毎に独立しており、同一又は相違してもよく、Xaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、Yaaが各繰り返し単位毎に同一であってもよく、相違してもよく、
(i) 式(I)におけるN末端側の下記式(II)で表される置換基は、スペーサー基を含んでもよく、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択され、
・ジスルフィド結合による架橋、
・側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋、
・側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋、
・ジケトピペラジンを用いた架橋、
・オレフィンメタセシスによる架橋、又は、
・クリックケミストリーによる架橋、
から選択される。
L 1 , L 1 ', L 2 and L 2 ' are each independently the same or different and may be a cross-linking group that may contain a spacer group (-Sp-), or -L 1 -L 2 - or -L 1 '-L 2 '- forms one amino acid residue and represents a cross-linking group that may include a spacer group (-Sp-),
L3 is a linking group between the cyclic peptide group and the drug group , which may contain a spacer group;
A represents a drug group that may contain a spacer group,
n and m, which may be the same or different, are 5 to 9;
Said Xaa is represented as Xaa 1 or Xaa 2 , Yaa as Yaa 1 or Yaa 2 , Xaa 1 , Xaa 2 , Yaa 1 and Yaa 2 may be the same or different, and (Xaa-Yaa-Gly) is , (Pro-Hyp-Gly), (Glu-Hyp-Gly) or (Pro-Arg-Gly);
repeating units of (Xaa-Yaa-Gly) are independent for each repeating unit and may be the same or different, and Xaa may be the same or different for each repeating unit; Yaa may be the same or different for each repeating unit,
(i) the substituent represented by the following formula (II) on the N-terminal side in formula (I) may include a spacer group,
- cross-linking by disulfide bonds,
- Cross-linking by amino acid residues having -COOH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
is selected from
- cross-linking by disulfide bonds,
- cross-linking by amino acid residues with -NH2 in the side chain,
- Cross-linking by amino acid residues having -OH in the side chain,
- cross-linking with diketopiperazines,
- Cross-linking by olefin metathesis, or
・Cross-linking by click chemistry,
is selected from
ジスルフィド結合による架橋が、-Cys-Cys-による架橋、
側鎖に-COOHを有するアミノ酸残基による架橋が、アスパラギン酸(Asp、D)残基若しくはグルタミン酸(Glu、E)残基による架橋、
側鎖に-NH2を有するアミノ酸残基による架橋が、リジン(lys、K)による架橋、又は、
側鎖に-OHを有するアミノ酸残基による架橋が、(セリン残基(Ser又はS)、トレオニン残基(Thr又はT)若しくはチロシン残基(Tyr又はY))による架橋、
から選択されることを特徴とする、請求項2に記載の薬剤結合環状ペプチド。 In the cross-linking group,
Cross-linking by disulfide bonds is cross-linking by -Cys-Cys-,
cross-linking by amino acid residues having -COOH in side chains is cross-linking by aspartic acid (Asp, D) residues or glutamic acid (Glu, E) residues;
cross-linking by amino acid residues having -NH2 in the side chain, cross-linking by lysine (lys, K), or
cross-linking by amino acid residues having -OH in side chains, cross-linking by (serine residues (Ser or S), threonine residues (Thr or T) or tyrosine residues (Tyr or Y)),
3. A drug-binding cyclic peptide according to claim 2, characterized in that it is selected from
-Cys-Cys-は、2つのCys残基の側鎖の-SH基がジスルフィド結合したシスチン残基を表し、
Acは、アセチル基を表し、
Ahxは、6-アミノヘキサン酸基を表し、
Aは、前記スペーサー基を含んでもよい、ビオチン基、カルボキシフルオレセイン(CF又はFAM: carboxy fluorescein)基、IRDye750基、ドキソルビシン基、PTH基、5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)基及びStromal-derived factor 1 (SDF-1)からなる群から選択される少なくとも1種であり、Lys残基の側鎖の-NH2基とアミド結合又はシスチン残基のジスルフィド結合で結合し、
n'及びm'が、同一又は相違してもよく、5~9の整数であり、及び、
s及びtが、3である。 Any one of claims 2 to 8, wherein the drug-binding cyclic peptide of formula (I) is represented by the following formulas (IV), (VI) to (IX), (XII) and (XIV) . or the drug-binding cyclic peptide according to claim 1;
-Cys-Cys- represents a cystine residue in which the side chain -SH groups of two Cys residues are disulfide-bonded,
Ac represents an acetyl group,
Ahx represents a 6-aminohexanoic acid group,
A is a biotin group, a carboxyfluorescein (CF or FAM: carboxyfluorescein) group, an IRDye750 group, a doxorubicin group, a PTH group, a 5(6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) group, and a stromal-derived factor, which may contain the spacer group is at least one selected from the group consisting of 1 (SDF-1) and binds to the -NH2 group of the side chain of the Lys residue via an amide bond or a disulfide bond of the cystine residue;
n' and m', which may be the same or different, are integers from 5 to 9, and
s and t are 3 ;
10. A modified region comprising the drug-binding cyclic peptide according to any one of claims 1 to 9, or a salt or solvate thereof as an active ingredient, wherein the drug group is a labeling group. as a research reagent for samples containing collagen, for detecting denatured collagen for the detection or diagnosis of diseases having collagen containing denatured regions, or for detecting denatured collagen, or wherein the drug group is a pharmaceutical molecular group, A composition for prophylaxis or treatment of a patient having a disease with collagen containing degenerate areas.
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