JP7169580B2 - 線維症治療用医薬組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、線維症治療用医薬組成物に関する。
特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＩＰＦ）は、予後不良の難病であり、診断後の生存期間中央値は２．８－４．２年と非常に短い。これまでにＩＰＦ治療薬としてステロイドや免疫抑制剤が用いられてきたが、いずれも大規模な臨床試験において、有効ではないことが報告されている。また近年、抗線維化薬として、ピルフェニドンとニンテダニブという２つの新薬が上市された。これらの薬剤は臨床試験でＩＰＦ患者の努力肺活量（ｆｏｒｃｅｄ ｖｉｔａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ；ＦＶＣ）の低下を抑制したが（非特許文献１～３）、長期間使用した時の有効性に関しては明らかとなっていない。また、両薬剤共に高頻度で重篤な副作用、特に胃腸障害を起こすことが問題となっている（非特許文献２、３）。したがって、より安全で、有効な新規ＩＰＦ治療薬の開発は大変重要である。
ＩＰＦの発症・増悪メカニズムは明らかにされていないが、種々の刺激により肺胞上皮細胞が傷害され、それをきっかけに肺線維芽細胞が異常に増殖・活性化することが主な原因であると考えられている（非特許文献４～６）。具体的には、ＩＰＦ患者の肺組織では、線維芽細胞が活性化した結果、筋線維芽細胞が増加・蓄積していることが報告されている（非特許文献７）。また、動物のＩＰＦモデルにおいてもヒトと同様に筋線維芽細胞が増加・蓄積していることが報告されている（非特許文献８）。その結果、コラーゲンなどの細胞外マトリクスが異常に産生・蓄積し、異常な修復やリモデリングが進行し、肺が線維化していくと考えられている。
筋線維芽細胞の由来はいくつか報告されているが、線維芽細胞から分化するものと上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）から分化するものに大別される。具体的には、線維芽細胞にｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）－β１などの刺激が作用することにより、筋線維芽細胞へと分化することが報告されている（非特許文献９）。一方、ＴＧＦ－β１が肺胞上皮細胞に作用すると、上皮間葉転換が誘導され、肺胞上皮細胞が筋線維芽細胞に形質転換することも明らかになっている（非特許文献１０、１１）。したがって、肺胞上皮細胞に傷害性を示すことなく、筋線維芽細胞への誘導を抑制する化合物や線維芽細胞のコラーゲン産生を抑制する化合物はＩＰＦの良い治療薬になると考えられる。実際に、近年上市されたピルフェニドンやニンテダニブは線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化、肺胞上皮細胞のＥＭＴ、及び活性化した線維芽細胞のコラーゲン産生を抑制することが報告されている（非特許文献１２～１４）。
Am. J. Respir. Crit. Care Med. 192, e3-e19(2015) Lancet 377, 1760-1769(2011) N. Engl. J. Med. 370, 2071-2082(2014) Am. J. Pathol. 170, 1807-1816(2007) Chest 122, 286S-289S(2002) Chest 132, 1311-1321(2007) Int. J. Mol. Med. 34, 1219-1224(2014) Physiol. Rep. 2, (2014) Proc. Am. Thorac. Soc. 5, 338-342(2008) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol 293, L525-534(2007) Respir Res. 6, 56(2005) Eur. J. Pharm. Sci. 58, 13-19(2014) BMC Pulm Med. 12, 24(2012) J. Pharmacol. Exp. Ther. 349, 209-220(2014)
本発明の課題は、肺胞上皮細胞に傷害性を示すことなく、肺線維芽細胞の選択的細胞死を誘導し、肺の線維化を抑制する新たな線維症治療薬を提供することにある。
そこで本発明者らは、ヒトでの安全性が充分に確認されている既承認薬から、前記作用を有する薬物を見出すべく種々検討した結果、下記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物が、肺胞上皮細胞に傷害性を示すことなく、肺線維芽細胞に対して選択的に作用し、優れたｉｎ ｖｉｖｏで肺線維化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の発明〔１〕～〔１１〕を提供するものである。
〔１〕式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する、線維症治療用医薬組成物。
Figure 0007169580000001
（式（Ｉ）中、Ｒ1はハロゲン原子が置換していてもよいＣ1-4アルキル基を示し、ｌは３～６の整数を示す。
式(II)中、ｎは８～１２の整数を示す。）
〔２〕式（Ｉ）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する〔１〕記載の医薬組成物。
〔３〕式（Ｉ）において、ｌが４又は５であり、Ｒ1がメチル基、エチル基又はトリフルオロメチル基である〔２〕記載の医薬組成物。
〔４〕式（Ｉ）において、ｌが５であり、Ｒ1がメチル基又はエチル基である〔２〕又は〔３〕記載の医薬組成物。
〔５〕式（II）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する〔１〕記載の医薬組成物。
〔６〕式（II）において、ｎが１０である〔５〕記載の医薬組成物。
〔７〕前記線維症が、肺線維症である〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔８〕前記肺線維症が、特発性肺線維症である〔７〕記載の医薬組成物。
〔９〕経気道投与用に製剤化されている〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１０〕経口投与用に製剤化されている〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１１〕経静脈投与用に製剤化されている〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の医薬組成物。
式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物は、いずれも既に医薬品として用いられている、ヒトに対する安定性が確認されている化合物である。そして、これらの化合物は、従来知られている薬理作用とは全く相違する作用、すなわち、肺胞上皮細胞に傷害性を示さない量で、肺線維芽細胞に対して選択的な細胞死誘導作用を示すとともに、肺線維化抑制作用を示し、線維症治療薬、特に特発性肺線維症治療薬として有用である。
イデベノンのＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 イデベノンのＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞におけるＬＤＨ活性に対する作用を示す。 イデベノンのＬＬ２９細胞の細胞死に対する作用を示す。 イデベノンのＡ５４９細胞の細胞死に対する作用を示す。 ピルフェニドン及びニンテダニブのＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（アッシュクロフトスコア）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（アッシュクロフトスコア）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（アッシュクロフトスコア）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（アッシュクロフトスコア）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するイデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の作用を示す。 イデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の筋線維芽細胞（α－ＳＭＡ細胞染色）に対する効果を示す。 イデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０の筋線維芽細胞（α－ＳＭＡ陽性細胞数）に対する効果を示す。 イデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０のコラーゲンに対する作用を示す。 イデベノン（Ｉｄｅ）及びＣｏＱ１０のα－ＳＭＡ、ＣＯＬ１Ａ１に対する作用を示す。 トルペリゾンのＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 ピルフェニドン及びニンテダニブのＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の治療効果を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するトルペリゾン（Ｔｏｌ）の治療効果を示す。 同種同効薬（エペリゾン、チザニジン）のＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 同種同効薬（ランペリゾン、イナペリゾン）のＬＬ２９細胞及びＡ５４９細胞の生存細胞数（％）に対する作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するエペリゾン（Ｅｐｅ）及びチザニジン（Ｔｉｚａ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（コラーゲン染色）に対するエペリゾン（Ｅｐｅ）及びチザニジン（Ｔｉｚａ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（ヒドロキシプロリン量）に対するエペリゾン（Ｅｐｅ）及びチザニジン（Ｔｉｚａ）の作用を示す。 ＢＬＭ依存の肺線維化（全肺及び肺胞のエラスタンス、ＦＶＣ）に対するエペリゾン（Ｅｐｅ）及びチザニジン（Ｔｉｚａ）の作用を示す。 トルペリゾン（Ｔｏｌ）及びエペリゾン（Ｅｐｅ）のα－ＳＭＡ、ＣＯＬ１Ａ１に対する作用を示す。
本発明の線維症治療用医薬組成物に含まれる有効成分は、式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物、その医薬的に許容し得る塩、又はそれらの溶媒和物である。
Figure 0007169580000002
（式（Ｉ）中、Ｒ1はハロゲン原子が置換していてもよいＣ1-4アルキル基を示し、ｌは３～６の整数を示す。
式(II)中、ｎは８～１２の整数を示す。）
式（Ｉ）で表される化合物は、鎮痙剤の一種であり、中枢神経系及び血管平滑筋の双方に作用し、骨格筋の疼痛緩和、虚血改善、緊張軽減によって筋緊張症を改善し、筋肉の凝りと痙直を解きほぐす作用を有することが知られている。しかし、線維症に対する作用は全く知られていない。特に、式（Ｉ）で表される化合物は、線維芽細胞、より好ましくは肺線維芽細胞に対して特異的に細胞死を誘導する効果を有する。また、式（Ｉ）で表される化合物は、線維芽細胞、より好ましくは肺線維芽細胞の活性化を特異的に抑制する効果を有する。また、式（Ｉ）で表される化合物は、組織の線維化、特に肺組織の線維化を抑制する効果を有する。また、式（Ｉ）で表される化合物は、呼吸機能の低下を抑制する効果を有する。また、式（Ｉ）で表される化合物は、組織の傷害、特に肺組織の傷害を抑制する効果を有する。
式（Ｉ）中、Ｒ1のハロゲン原子が置換していてもよいＣ1-4アルキル基としては、１～３個の塩素原子、フッ素原子、臭素原子又はヨウ素原子が置換していてもよいＣ1-4アルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基等が挙げられ、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基がより好ましく、メチル基、エチル基がさらに好ましい。
式（Ｉ）中、ｌは３～６の整数を示す。このうち、３～５の整数がより好ましく、４又は５がさらに好ましく、５がさらに好ましい。式（Ｉ）で表される化合物としては、ｌが４又は５で、Ｒ1がメチル基、エチル基又はトリフルオロメチル基である化合物がより好ましく、ｌが５であり、Ｒ1がメチル基又はエチル基である化合物がさらに好ましい。ここで、ｌが５であり、Ｒ1がメチル基である化合物はトルペリゾンである。ｌが５であり、Ｒ1がエチル基である化合物はエペリゾンである。ｌが４であり、Ｒ1がエチル基である化合物はイナペリゾンである。ｌが４であり、Ｒ1がトリフルオロメチル基である化合物は、ランペリゾンである。
式（II）で表される化合物は、アルツハイマー型認知症や認識障害の治療薬として知られている。
これらの式（II）で表される化合物の線維症に対する作用は全く知られていない。特に、式（II）で表される化合物は、線維芽細胞、より好ましくは肺線維芽細胞に対して特異的に細胞死を誘導する効果を有する。また、式（II）で表される化合物は、線維芽細胞、より好ましくは肺線維芽細胞の活性化を特異的に抑制する効果を有する。また、式（II）で表される化合物は、組織の線維化、特に肺組織の線維化を抑制する効果を有する。また、式（II）で表される化合物は、呼吸機能の低下を抑制する効果を有する。また、式（II）で化合物は、組織の傷害、特に肺組織の傷害を抑制する効果を有する。
式（II）中、ｎは８～１２の整数であるが、９又は１０がより好ましく、１０がさらに好ましい。ここで、ｎ＝１０の化合物はイデベノンである。
式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物の塩としては、医薬上許容される塩であれば特に限定されないが、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩が挙げられる。このうち、式（Ｉ）で表される化合物の塩酸塩がより好ましい。
式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物又はその医薬上許容される塩の溶媒和物としては、水和物、アルコール和物等が挙げられるが、水和物がより好ましい。
式（Ｉ）又は式（II）で表される化合物は、前記の如く、既に知られている化合物であり、公知の製造法に従って製造できる。
式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物、その医薬上許容し得る塩又はそれらの溶媒和物は、後記実施例に示すように、肺胞上皮細胞に傷害性を示さない量で、肺線維芽細胞に対して選択的な細胞死誘導作用を示し、また優れた肺線維化抑制作用を示す。よって、これらの化合物は、各種の線維症治療薬として有用である。ここで、線維症としては、肺線維症、特発性肺線維症、強皮症、腎臓線維症、肝臓線維症、心臓線維症、及びその他の臓器又は組織における線維症が挙げられるが、肺線維症、特発性肺線維症に用いるのが好ましく、特に特発性肺線維症に用いるのが好ましい。
従って、式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物、その医薬上許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する医薬組成物は、線維症治療用医薬組成物、より好ましくは肺線維症治療用医薬組成物、さらに好ましくは特発性肺線維症治療用医薬組成物として有用である。
本発明の医薬組成物の形態としては、経口投与用製剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、経気道投与用製剤、腹腔内投与用製剤、経静脈投与製剤、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できるが、経口投与用製剤、経気道投与用製剤又は経静脈投与用製剤が好ましい。なお、動物における腹腔内投与は、ヒトにおける経静脈投与と同等の投与経路であることが当業者に認識されているため、動物における腹腔内投与の結果は、ヒトにおける経静脈投与の結果とみなすことができる。
これらの投与形態は、前記有効成分に加えて、薬学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
本発明医薬組成物の投与量は、投与経路、性別、体重、年令、症状等によって異なるが、前記有効成分量として通常成人１日投与量を、０．５ｍｇ～３０００ｍｇとするのが好ましく、さらに１ｍｇ～３００ｍｇとするのが好ましい。１日投与量は、単回投与によるものであってよく、複数回投与によるものであってもよい。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ａ．実験方法
（１）ブレオマイシン（ＢＬＭ）、イデベノン及びトルペリゾンの投与
正常飼育下の雄性ＩＣＲマウスに対して、初日にＢＬＭを経気道投与しＢＬＭ肺障害モデルマウスを作製した。
前投与：イデベノンを初日から７日目まで１日１回経気道投与した。初日はＢＬＭ投与１時間前にイデベノンを経気道投与した。
後投与：イデベノンを１０日目から１８日目まで１日１回経気道投与した。両薬剤共に、０．９％ ＮａＣｌに懸濁して用いた。
後投与：トルペリゾンを１０日目から１９日目まで１日１回投与した。両薬剤共に、０．９％ ＮａＣｌに懸濁して用いた。
なお、動物における腹腔内投与は、ヒトにおける経静脈投与と同等の投与経路であることが当業者に認識されているので、動物における腹腔内投与の結果は、ヒトにおける経静脈投与の結果とみなすことができる。
（２）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ
細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２．５μｇをｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、ＴＡＫＡＲＡ社のプロトコールに従って逆転写反応を行った。合成したｃＤＮＡはＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いてＣＦＸ９６TM Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍで解析した。それぞれの反応において全ＲＮＡ量を揃えるために、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内部標準として用いた。
（３）細胞培養
Ａ５４９細胞（ヒト肺胞上皮細胞）、ＬＬ２９細胞（ＩＰＦ患者由来の肺線維芽細胞）はそれぞれ１０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、１５％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）ｍｅｄｉｕｍを用い３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。
生細胞数の測定はＭＴＴ法もしくは、ＣｏｕｎｔｅｓｓTM Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたトリパンブルー染色で測定した。細胞死の評価は培地中のＬＤＨ活性をアッセイキットのプロトコールに従って測定した。
（４）組織染色法と組織免疫染色法
摘出した肺組織を２４時間１０％ｆｏｒｍａｌｉｎで固定後、パラフィンに包埋し、厚さ４μｍのパラフィン切片を作製した。
Ｈ＆Ｅ染色は、まずＭａｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅで染色した後、１％ｅｏｓｉｎ溶液で染色した。染色後、ｍａｌｉｎｏｌで封入し、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ－ＸＲ ｄｉｇｉｔａｌ ｓｌｉｄｅ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて組織学的解析を行った。
Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色は、第１媒染液（５ｗ／ｖ％ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ，５ｗ／ｖ％ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｃ）、Ｗｅｉｇｅｒｔ’ｓ ｉｒｏｎ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、第２媒染液（１．２５ｗ／ｖ％ ｐｈｏａｐｈｏｔａｎｇｓｔｅｎｉｃａｃｉｄ，１．２５ｗ／ｖ％ ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｌｙｂｄｉｃ ａｃｉｄ）、０．７５ｗ／ｖ％ ｏｒｅｎｇｅ Ｇ、ポンソー・キシリジン混合液（０．１２ｗ／ｖ％ ｘｙｌｉｄｉｎｅ ｐｏｓｅａｕ，０．０４ｗ／ｖ％ ａｃｉｄ ｆｃｈｓｉｎ，０．０２ｗ／ｖ％ ａｚｏｐｈｌｏｘｉｎ）、ａｎｉｌｉｎｅ ｂｌｕｅを用いて行った。染色後、ｍａｌｉｎｏｌで封入し、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ－ＸＲ ｄｉｇｉｔａｌ ｓｌｉｄｅ ｓｃａｎｎｅｒを用いて組織学的解析を行った。肺線維化はアッシュクロフトスコアを用いてスコア化した。尚、アッシュクロフトスコアはJ. Clin. Pathol. 41, 467-470(1988)を参考にした。
α－ＳＭＡの免疫染色法は、２．５％ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍで１０ｍｉｎのブロッキング後、一次抗体処理（ａｇａｉｎｓｔ α－ＳＭＡ、１：１００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を行った。１２ｈ後、切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＧとＤＡＰＩで２ｈインキュベーションした。その後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤを用いて封入した。切片は、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１）を用いて撮影を行った。
α－ＳＭＡ陽性領域はＩｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて定量した。また、８－ＯＨｄＧ陽性細胞数はＤｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ ＳｔｕｄｉｏTM ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて定量した。
（５）肺機能、及び努力肺活量の測定
肺機能はコンピューター制御型小動物用ベンチレーター（ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ；ＳＣＩＲＥＱ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用し、過去の文献に従い測定した。抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）麻酔下のマウスの気管に金属管（外径及び内径がそれぞれ１．２７ｍｍ、０．８４ｍｍのもの）を８ｍｍ挿入し、８．７ｍｌ／ｋｇの一回換気量と２－３ｃｍＨ2Ｏの呼気終末陽圧換気を用いて１５０ｂｒｅａｔｈｓ／ｍｉｎの速度で機械的に呼吸させた。
全体のエラスタンス（ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｌａｓｔａｎｃｅ）、及び組織エラスタンス（ｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ）は、それぞれｓｎａｐ ｓｈｏｔ、及びｆｏｒｃｅｄ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅにより測定した。また、努力肺活量は上述のコンピューター制御型小動物用ベンチレーター、並びに陰圧リザーバー（ＳＣＩＲＥＱ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用し、Chest 142, 1011-1019(2012)に従い測定した。すべてのデータはＦｌｅｘｉＶｅｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３；ＳＣＩＲＥＱ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いて解析した。
（６）Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅの定量
摘出したマウス左肺上葉を０．５ｍＬの５％ＴＣＡ中でホモジナイズ後、遠心分離して得られた沈殿物に濃塩酸を０．５ｍＬ加え、１１０℃で１６時間加熱した。これにより、沈殿物を加水分解し、ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅを抽出した。抽出したｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅは１．４ｗ／ｖ％ ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔを加え２０分間静置後、Ｅｈｒｉｃｈ’ｓ試薬（１Ｍ ＤＭＢＡ，７０ｖ／ｖ％ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ａｎｄ ３０ｖ／ｖ％ ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）と共に６５℃で１０分間加温し赤～紫に呈色させた。その後、吸光度（５５０ｎｍ）を測定した。
（７）統計学的解析
全ての値を平均値±標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ；ＳＥＭ）で示している。有意差検定はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、多群間ではＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを、２群間ではＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いた。また、検定にはＳＰＳＳ２２ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した。Ｐの値が０．０５未満になった時、有意な差があると判定した。
ｂ－１．結果
（１）細胞死及び細胞増殖に対するイデベノンの効果
ＩＰＦの線維化メカニズムにおいて肺線維芽細胞の活性化が重要であると考えられている。これまでに、ＩＰＦ患者の肺において線維芽細胞が異常に増殖・活性化していること、及び活性化した肺線維芽細胞からコラーゲンが異常に産生されていることが報告されている。そこで我々は、肺胞上皮細胞に傷害性を示すことなく、肺線維芽細胞に対して選択的に作用する既承認薬のスクリーニングを行った。スクリーニングでは、化合物による肺線維芽細胞の細胞生存率の低下を肺線維芽細胞の活性抑制の簡易的な指標として用いた。具体的な方法はＩＰＦ患者由来の肺線維芽細胞（ＬＬ２９細胞）及びヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞）、それぞれに既承認薬を処理し、２４時間後の細胞生存率をＭＴＴ法を用いて評価した。その結果、Ａ５４９細胞よりもＬＬ２９細胞のＩＣ50（細胞生存率を５０％低下させるのに必要な濃度）の値が低かった化合物の中から、特に両細胞間のＩＣ50の値の差が顕著に見られた化合物、イデベノンを選出した。
スクリーニングの再現性実験を兼ねて、スクリーニング時より、より細かい用量をふってイデベノンの細胞死誘導作用の検討を行った。その結果、イデベノンはＡ５４９細胞（肺胞上皮細胞）で細胞生存率の低下が見られた濃度よりも低濃度でＬＬ２９細胞（肺線維芽細胞）の細胞生存率を低下させた（図１Ａ）。次に、細胞から放出されたＬＤＨを定量することで細胞死を評価したところ、ＬＬ２９細胞ではイデベノン（１５０μＭ）で培地中にＬＤＨが放出されたが、Ａ５４９細胞ではＬＤＨ放出がほとんど見られなかった（図１Ｂ）。これらのことから、イデベノンがＡ５４９細胞よりもＬＬ２９細胞に対して選択的に細胞死を誘導することが示された。
図１Ａ、図１Ｂからイデベノンは７５～１２５μＭでＬＬ２９細胞の細胞増殖を抑制している可能性が考えられた。そこで、我々はトリパンブルー染色を用いて生細胞数と死細胞数を測定した。その結果、イデベノンは７５μＭからＬＬ２９細胞の増殖を抑制し、１７５μＭからＬＬ２９細胞の細胞死を誘導した（図１Ｃ）。一方、上皮細胞においては、イデベノンは１７５μＭから細胞増殖を抑制し、検討した濃度において細胞死誘導は見られなかった（図１Ｄ）。
また、既存のＩＰＦ治療薬であるピルフェニドン、ニンテダニブを用いて検討したところ、これらの２薬剤も線維芽細胞選択的な細胞死を誘導しなかった（図２）。
（２）ブレオマイシン（ＢＬＭ）依存の肺線維化に対するイデベノンの効果
イデベノンのＩＰＦ治療薬としての開発を考えると、ＩＰＦの動物モデルにおいても効果を示すことが重要である。ＩＰＦの動物モデルとしてはブレオマイシン（ＢＬＭ）肺傷害モデルがよく用いられており、ＢＬＭ肺傷害モデルがＩＰＦの病態の典型的な特徴を再現していること、またこれまでに、ＢＬＭを経気道投与することにより肺胞上皮細胞が傷害されること、肺線維芽細胞が増殖し蓄積していること、及び呼吸機能が低下することが報告されている。そこで、ＢＬＭ肺傷害モデルを用いて、肺線維化に対するイデベノンの予防効果及び治療効果について検討を行った。
ＢＬＭをマウスに経気道投与して、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色によりコラーゲンの染色を行ったところ、ＢＬＭ依存に肺の傷害（肥厚、肺胞壁や間質の浮腫）やコラーゲンの蓄積が確認されたが、イデベノンの経気道投与によりこれらの傷害やコラーゲンの蓄積が顕著に抑制された（図３Ａ）。さらに、組織像をもとに線維化を定量したアッシュクロフトスコア、及び肺のコラーゲンに多く含まれるアミノ酸であるヒドロキシプロリン量を指標に、ＢＬＭ依存の肺線維化に対するイデベノンの効果を評価した。ＢＬＭ依存にアッシュクロフトスコア及びヒドロキシプロリン量が増加したが、イデベノンを投与することによりこれらの増加が顕著に抑制された（図３Ｂ，図３Ｃ）。
イデベノンの臨床応用を考えると、組織学的な指標だけでなく、呼吸機能などの指標においても効果を示すことが重要である。これまでに、ＩＰＦ患者では線維化によって肺が硬くなるため肺エラスタンスが上昇し、努力肺活量（ＦＶＣ）が低下することが報告されている。そこで我々は、マウス用ベンチレーターを用いて、これらの指標を測定した。ＢＬＭを投与することで、ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（気管支、細気管支、肺胞のすべてを含む全肺のエラスタンス）とｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（肺胞のエラスタンス）の上昇が見られたが、イデベノンを経気道投与することでこれらの上昇が抑制された（図３Ｄ）。また、ＦＶＣはＢＬＭ依存に低下したが、イデベノンを経気道投与することでこの低下が抑制される傾向が見られた（図３Ｄ）。以上の結果から、イデベノンを経気道投与することでＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を抑制することが示された。また、イデベノン（１８．８ｍｇ／ｋｇ）を単独で経気道投与しても肺線維化や呼吸機能に影響を与えなかった（図３Ａ－Ｄ）。
（３）ＢＬＭ依存の肺線維化に対するイデベノンの治療効果
次に我々は、予めＢＬＭを投与して線維化を誘発させたマウスにイデベノンを投与することで、治療効果の検討を行った。これまでに、ＢＬＭを投与して１０日程度経過すると、肺線維化が形成されることが報告されている。そこで我々は、イデベノンの経気道投与はＢＬＭを投与した１０日後から開始し、肺線維化及び呼吸機能はＢＬＭを投与してから２０日後に評価した。ＢＬＭを投与してから２０日後の肺傷害や線維化はイデベノンを経気道投与することで顕著に抑制された（図４Ａ－Ｃ）。さらに、ＢＬＭ依存の呼吸機能の低下もイデベノンを経気道投与することで顕著に抑制された（図４Ｄ）。以上の結果から、予めＢＬＭを投与して線維化を誘発させたマウスに対してもイデベノンがＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を改善することが示された。
（４）イデベノンとＣｏＱ１０の比較
イデベノンの効果を決定するメカニズムを理解するために、我々はブレオマイシン肺線維症に対するイデベノンとＣｏＱ１０の効果を比較した。図５Ａ－Ｃに示すように、ブレオマイシンによる肺傷害、線維化は、イデベノンまたはＣｏＱ１０の経気道投与によって抑制された。
次に、我々はイデベノンとＣｏＱ１０のＢＬＭ肺線維症の治療効果を比較した。図６Ａ－Ｃに示すように、イデベノンは、ブレオマイシンによる肺傷害・線維化を抑制したが、ＣｏＱ１０は抑制しなかった。
前述の通り、筋線維芽細胞はＩＰＦ患者の肺線維症およびブレオマイシン誘発性肺線維症に重要な役割を果たしている。そこで、筋線維芽細胞に着目して、イデベノンとＣＯＱ１０の効果を検討した。図７Ａ、Ｂに示すように、ブレオマイシンの投与により肺のα－ＳＭＡ陽性細胞（筋線維芽細胞）の数が増加したが、イデベノンはこの増加を顕著に抑制した。一方、ＣｏＱ１０でのこの抑制効果は見られなかった。そこで、イデベノンとＣｏＱ１０を用いて、ＴＧＦ－β１依存の肺線維芽細胞の活性化（筋線維芽細胞への分化）に対する影響を比較した。ＬＬ２９細胞にイデベノンまたはＣｏＱ１０を処理した後、ＴＧＦ－β１を処理し、培地中のコラーゲン量を測定した。図８Ａに示すように、ＴＧＦ－β１の処置はコラーゲン量を上昇させたが、イデベノンによりその上昇が抑制された。一方、ＣｏＱ１０は抑制しなかった。次に、α－ＳＭＡ、及びコラーゲンのｍＲＮＡ量を指標にイデベノンの効果を調べた。図８Ｂに示すように、ＬＬ２９細胞をＴＧＦ－β１で処理すると、α－ＳＭＡおよびＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡの発現が誘導されたが、イデベノン処理すると、この誘導が抑制された。一方、ＣｏＱ１０は抑制しなかった。これらの結果は、イデベノンが線維芽細胞に作用し、肺線維芽細胞の活性化を抑制したことを示している。
ｂ－２．結果
（１）細胞死に対するトルペリゾンの効果
前記（ｂ－１）と同様に、ＩＰＦ患者由来の肺線維芽細胞（ＬＬ２９細胞）及びヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞）、それぞれに既承認薬を処理し、２４時間後の細胞生存率をＭＴＴ法を用いて評価した。その結果、Ａ５４９細胞よりもＬＬ２９細胞のＩＣ50（細胞生存率を５０％低下させるのに必要な濃度）の値が低かった化合物の中から、特に両細胞間のＩＣ50の値の差が顕著に見られた化合物、トルペリゾンを選出した。
スクリーニングの再現性実験を兼ねて、スクリーニング時より、より細かい用量をふってトルペリゾンの細胞死誘導作用の検討を行った。その結果、トルペリゾンはＡ５４９細胞（肺胞上皮細胞）で細胞生存率の低下が見られた濃度よりも低濃度でＬＬ２９細胞（肺線維芽細胞）の細胞生存率を低下させた（図９Ａ）。次に、既存のＩＰＦ治療薬であるピルフェニドン、ニンテダニブを用いて線維芽細胞選択的な細胞死を検討したところ、これらの２薬剤も線維芽細胞選択的な細胞死をほとんど誘導しなかった（図９Ｂ）。
（２）ＢＬＭ依存の肺線維化に対するトルペリゾン経気道投与の効果
ＢＬＭ肺傷害モデルを用いて、肺線維化に対するトルペリゾンの治療効果について検討を行った。
ＢＬＭをマウスに経気道投与して、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色によりコラーゲンの染色を行ったところ、ＢＬＭ依存に肺の傷害（肥厚、肺胞壁や間質の浮腫）やコラーゲンの蓄積が確認されたが、トルペリゾンの経気道投与によりこれらの傷害やコラーゲンの蓄積がわずかながら抑制された（図１０Ａ，Ｂ）。さらに、肺のコラーゲンに多く含まれるアミノ酸であるヒドロキシプロリン量を指標に、ＢＬＭ依存の肺線維化に対するトルペリゾンの効果を評価した。ＢＬＭ依存にヒドロキシプロリン量が増加したが、トルペリゾンを経気道投与しても、この増加はほとんど抑制されなかった（図１０Ｃ）。次に、マウス用ベンチレーターを用いて、呼吸機能を測定した。ＢＬＭを投与することで、ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（気管支、細気管支、肺胞のすべてを含む全肺のエラスタンス）とｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（肺胞のエラスタンス）の上昇が見られたが、トルペリゾンを投与することでこれらの上昇が抑制される傾向が見られた（図１０Ｄ）。また、ＦＶＣはＢＬＭ依存に低下したが、トルペリゾンを投与することでこの低下が抑制された（図１０Ｄ）。以上の結果から、トルペリゾンを経気道投与することでＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を抑制することが示された。
（３）ＢＬＭ依存の肺線維化に対するトルペリゾン経口投与の効果
ＢＬＭをマウスに経気道投与して、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色によりコラーゲンの染色を行ったところ、ＢＬＭ依存に肺の傷害（肥厚、肺胞壁や間質の浮腫）やコラーゲンの蓄積が確認されたが、トルペリゾンの経口投与によりこれらの傷害やコラーゲンの蓄積が抑制された（図１１Ａ，Ｂ）。ＢＬＭ依存にヒドロキシプロリン量が増加したが、トルペリゾンを経口投与すると、この増加が顕著に抑制された（図１１Ｃ）。次に、マウス用ベンチレーターを用いて、呼吸機能を測定した。ＢＬＭを投与することで、ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（気管支、細気管支、肺胞のすべてを含む全肺のエラスタンス）とｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（肺胞のエラスタンス）の上昇が見られたが、トルペリゾンを投与することでこれらの上昇が抑制された（図１１Ｄ）。また、ＦＶＣはＢＬＭ依存に低下したが、トルペリゾンを投与することでこの低下が抑制された（図１１Ｄ）。以上の結果から、トルペリゾンを経口投与することでＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を抑制することが示された。
（４）ＢＬＭ依存の肺線維化に対するトルペリゾン腹腔内投与の効果
ＢＬＭをマウスに経気道投与して、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色によりコラーゲンの染色を行ったところ、ＢＬＭ依存に肺の傷害（肥厚、肺胞壁や間質の浮腫）やコラーゲンの蓄積が確認されたが、トルペリゾンの腹腔内投与によりこれらの傷害やコラーゲンの蓄積が抑制された（図１２Ａ，Ｂ）。ＢＬＭ依存にヒドロキシプロリン量が増加したが、トルペリゾンを腹腔内投与すると、この増加が顕著に抑制された（図１２Ｃ）。次に、マウス用ベンチレーターを用いて、呼吸機能を測定した。ＢＬＭを投与することで、ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（気管支、細気管支、肺胞のすべてを含む全肺のエラスタンス）とｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（肺胞のエラスタンス）の上昇が見られたが、トルペリゾンを投与することでこれらの上昇が抑制された（図１２Ｄ）。また、ＦＶＣはＢＬＭ依存に低下したが、トルペリゾンを投与することでこの低下が抑制された（図１２Ｄ）。以上の結果から、トルペリゾンを腹腔内投与することでＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を抑制することが示された。
（５）トルペリゾン同種同効薬の効果（線維芽細胞への選択性）
トルペリゾンが線維芽細胞選択的に作用する機構を解明するため、図１３では同種同効薬を用いて、線維芽細胞選択的な細胞死が見られるか解析した。その結果、エペリゾンはＡ５４９細胞で細胞生存率の低下が見られた濃度よりも低濃度でＬＬ２９細胞の細胞生存率を低下させたが、チザニジンではそのような効果は見られなかった（図１３Ａ）。エペリゾンは、トルペリゾンと化学構造が非常に類似している化合物である。そこで、トルペリゾンと類似の化学構造を有する化合物を用いて、線維芽細胞選択性を解析した。その結果、トルペリゾンの化学構造類似体である、イナペリゾン、ランペリゾンではトルペリゾンと同様の線維芽細胞選択的な細胞死が見られた（図１３Ｂ）。
（６）ＢＬＭ依存の肺線維化に対するエペリゾン、チザニジン腹腔内投与の効果
ＢＬＭをマウスに経気道投与して、Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色によりコラーゲンの染色を行ったところ、ＢＬＭ依存の肺傷害やコラーゲン蓄積がエペリゾンの腹腔内投与により抑制されたが、チザニジンでは抑制されなかった（図１４Ａ，Ｂ）。ＢＬＭ依存のヒドロキシプロリン量が、エペリゾンの腹腔内投与により抑制傾向が観察されたが、チザニジンでは抑制されなかった（図１４Ｃ）。次に、マウス用ベンチレーターを用いて、呼吸機能を測定した。ＢＬＭを投与することで、ｔｏｔａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（気管支、細気管支、肺胞のすべてを含む全肺のエラスタンス）とｔｉｓｓｕｅ ｅｌａｓｔａｎｃｅ（肺胞のエラスタンス）の上昇、ＦＶＣの低下が見られた。一方、エペリゾンはこれらの反応を抑制したが、チザニジンは抑制しなかった（図１４Ｄ）。以上の結果から、エペリゾンではトルペリゾンと同様にＢＬＭ依存の肺線維化、呼吸機能の低下を抑制することが示された。
（７）トルペリゾンとエペリゾンによる線維芽細胞の活性化抑制
図１５ではＴＧＦ－β１を処理した時の線維芽細胞の活性化（α－ＳＭＡ、及びコラーゲンのｍＲＮＡ量の増加）に対するトルペリゾン、エペリゾンの効果を検討した。ＬＬ２９細胞をＴＧＦ－β１で処理すると、α－ＳＭＡおよびＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡの発現が増加したが、トルペリゾン、エペリゾン処理すると、この誘導が抑制された。これらの結果は、トルペリゾン、エペリゾンが線維芽細胞に作用し、肺線維芽細胞の活性化を抑制したことを示している。

Claims (9)

  1. 式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する、特発性肺線維症治療用医薬組成物。
    Figure 0007169580000003
     （式（Ｉ）中、Ｒ1はハロゲン原子が置換していてもよいＣ1-4アルキル基を示し、ｌは３～６の整数を示す。
    式（ＩＩ）中、ｎは８～１２の整数を示す。）
  2. 式（Ｉ）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する請求項１記載の医薬組成物。
  3. 式（Ｉ）において、ｌが４又は５であり、Ｒ1がメチル基、エチル基又はトリフルオロメチル基である請求項２記載の医薬組成物。
  4. 式（Ｉ）において、ｌが５であり、Ｒ1がメチル基又はエチル基である請求項２又は３記載の医薬組成物。
  5. 式（II）で表される化合物、その医薬として許容し得る塩又はそれらの溶媒和物を含有する請求項１記載の医薬組成物。
  6. 式（II）において、ｎが１０である請求項５記載の医薬組成物。
  7. 経気道投与用に製剤化されている請求項１～６のいずれか１項記載の医薬組成物。
  8. 経口投与用に製剤化されている請求項１～６のいずれか１項記載の医薬組成物。
  9. 経静脈投与用に製剤化されている請求項１～６のいずれか１項記載の医薬組成物。
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