JP7168230B2 - 界面横断磁気分離 - Google Patents
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Description
本発明は、2017年6月6日に出願された米国仮特許出願第62/515,876号の優先権利益を主張し、その仮特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書に記載の実施形態を実施または試験する際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似または同等の任意の方法及び材料を使用してもよいが、本明細書でいくつかの好ましい方法、組成物、装置、及び材料について説明する。ただし、本発明の材料及び方法の説明に入る前に、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルは、通例の実験及び最適化に応じて変動することがあるため、本発明がこれらの記載事項に限定されないということを理解されたい。また、説明で使用する用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明するためのものに過ぎず、こうした用語が本明細書に記載の実施形態の範囲を限定するようには意図されていないことも理解されたい。
Δρ=二相の密度差
g=重力加速度
Gh=液体プールが固定される、フレームとアトールとの間の薄いギャップ
σ=表面張力
密封された液体チャンバは、液体が流れ出るとき、負の空気圧を引くことによって静水頭を最小化する。さらに、アトールは、静水圧を比較的大きな領域に広げる、大きな円形界面を提供する(図2)。エアギャップ(Ag)によって分離された離散的な液体プールが各チャンバに作成され、それが液体相互汚染を防止する。これは、多くの他の技術で使用される、コストの高い不混和性のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)適合性油の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、アトールの内径は、アトール上の液体及びPMPの流れを促進するために、丸み付き縁部またはコーナを有する。
例示的な装置の製作及び組立
例示的な装置は、3Dプリントプラスチック(Protolabs、Maple Plain、MN)、レーザ切断プラスチック部品、転写粘着テープ(たとえば、3M 9472LE)、及び、疎水性コーティング(たとえば、Aculon NanoProof 5.0、San Diego、CA)の組合せを使用して製作された。4つのチャンバカートリッジは、プラスチック樹脂から3Dプリントされた。チャンバは一端で密封され、開放端を通してのバッファの追加を可能にする(図4)。
例示的な装置の操作及びテスト
実施例1で説明された例示的なTIMSカートリッジの機能は、最初の3つのチャンバの3つの液体(溶解バッファ、洗浄1(洗浄剤及びアルコールの混合物)、ならびに、洗浄2(アルコール及び水溶液))でテストされた。これらの流体は、ほとんどの表面上において、非常に低い接触角で非常に濡れる。再懸濁されたPMP懸濁物は、チャンバ1に加えられた。小さい円筒形ネオジム磁石(K&J Magnetics、Pipersville、PA)は、疎水処理されたポリカーボネート膜上にチャンバ1のPMPを収集するのに使用された。PMPペレットは、Ghを通して、チャンバ2にゆっくりと移送された。しばらくした後、PMPは、再収集されて、チャンバ3に移送された(図10)。テストは、液体がそれぞれのアトールの外縁に固定されたままでいることを実証した。さらに、PMPの移動中、液体架橋はない。液体キャリーオーバ(汚染)は、チャンバ間で最小化される。
付加的なデザイン要素
実施例1で説明された例示的な装置を使用して行われる実験は、本明細書に範囲内の実施形態に組み込まれてもよい代替的なデザイン、次のプロトタイプに統合されてもよい改善を明らかにした。たとえば、アトール高さの増加(たとえば、より高いフレーム)は液体プールがアトールを過ぎて離れることを防ぐ、アトール上の丸いID縁はPMPの移送を容易にする、内部チャンバ首部からの90°コーナ角の除去は収集中のPMP損失を減少させる、などである。PMPは1つの液体チャンバから次のチャンバに移送されているが、液滴がエアバリアを横切って引かれる場合、Ahは、疎水性移送表面上で、液体プール高さ(LPh)より大きくなければならない(最悪のシナリオとして、180°の接触角を有する液体のために)。これは、それは起きた場合に、液体がカートリッジ表面にさらに接触することを防ぐ。
LPh=疎水性移送表面上の液体プール高さ
σ=液体表面張力
g=重力
ρ=液体密度
アトールのID上の鋭い90°の縁は、PMP収集及びGhに沿った横方向移動の間の、抵抗及び/または剪断の増加をもたらすことがある。抵抗を減少させるために、コーナ半径(たとえば、フィレット、面取りなど)が、ある実施形態において、アトールのIDに加えられ、同時に、箔積層体膜を密封するための十分な幅(Aw)を維持する。たとえば、Ghが約0.005インチ(0.125mm)であるとき、抵抗を減少させるために必要なコーナ半径は重要ではない(図11)。
例示的なカートリッジ
例示的な界面横断磁気分離(TIMS)装置構築の要素が図15A~Fに示される。代替的な構成ならびに図15に示された要素と本明細書の他の実施形態との組合せが意図されている。例示的なTIMS装置の層及びさまざまな特徴は以下で説明される。
チャンバ1及び2で生じる溶解及びハイブリダイゼーションステップの間、数分間の高温(たとえば、120℃)に耐えることができる薄い硬質プラスチック膜(たとえば、ポリカーボネート、厚さ0.010インチ)。膜の種類及び厚さは、チャンバへの高速熱伝達(たとえば、薄いほど熱伝達は速くなる)、及び、その固有の剛性(たとえば、膜とヒータとの間の接触抵抗)の両方に影響を与える。
両面の感圧接着剤(たとえば、3M 9471、AR Care 7876)は、射出成形カートリッジ本体に底カバーを接合するのに使用される。接着剤は、短期間(数分)の間、高温(たとえば、120℃)で使用可能である。接着剤の代わりに、材料が適合する場合、底カバーはカートリッジ本体に溶接されてもよい。
1回限りのプラスチックカートリッジは、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどのいくつかのプラスチックから射出成形することができる。それは、数分間の高温(約120℃)への曝露に耐える。それは、たとえば、流体、エアロックチャンバ、及び流体移送チャネルのための3つのチャンバを特徴とする(図15B)。洗浄試薬のバルクは、チャンバ3に予めパッケージされる(いくつかの実施形態において、試薬は、器具の内部のあるときに穴をあけられる箔ブリスタ内に含まれ、試薬は流れ出て、チャンバに流れ込む)。ユーザは、チャンバ1に患者サンプルを導入する(約300uL)。チャンバ1及び2は、以下のいくつかの理由のために、かなり大きい(たとえば、2~4X必要な容積)。(a)カートリッジが比較的平面状に維持されるとき、高速熱伝達のために流体の表面積を最大化する。(b)乾燥試薬の再可溶化及び均一な熱伝達を支援する、示される軸に沿ってカートリッジを回転させることによって混合する能力に影響を及ぼす(参照エラー!参照元なし)。チャンバ2は、300uLの流体が移送チャネルの出口にぎりぎり到達するように設計されている(参照エラー!参照元なし)。(c)平面の外で本体を回転させることによって、コンパクトな流体容積を実現する。
この薄膜(たとえば、プラスチック膜(たとえば、PSA(たとえば、3M 9471)とポリカーボネートなどの硬質プラスチックとの積層(たとえば、厚さ0.010インチ))は、カートリッジ本体に取り付けられ(たとえば、接着接合され)、2つの固定レッジを作成する(図15C参照)。固定レッジ1はチャンバ2に流体に固定し、一方、固定レッジ2はチャンバ3に洗浄試薬を固定する。ベース層は、流体チャネルの底部の表面特性(たとえば、それはカートリッジ本体プラスチックによって限定されない)、及び、チャネルの底部を親水性または疎水性にする界面活性剤コーティングを加える機能を選択する際に、柔軟性を与える。
スペーサ膜(たとえば、PSA(たとえば、3M 9471、AR Care 7876)、プラスチック(たとえば、PETプラスチック、厚さ0.0075インチ)、及びPSAの積層)は、流体チャネルの高さ(たとえば、約0.0115インチ)を定義し、ベース層に取り付けられる(たとえば、接着接合される)(図15D参照)。ベントは、溶解(加熱)ステップ中のチャンバ1のために設けられる。常磁性粒子(PMP)移送チャネルは、収集、洗浄、及びチャンバ2からチャンバ3へのPMPの移動に利用可能である。
例示的なドラッグ膜(たとえば、COP/COCプラスチック膜と、PSA(たとえば、3M 9471、AR Care 7876)と、硬質プラスチック支持膜(たとえば、厚さ0.010インチのポリカーボネート)との積層)が、図15Eに示されている。いくつかの実施形態において、COP/COCプラスチック膜は、流体チャネルの内側を向き、チャネルの上面として働く。それは、スペーサ膜の第2の粘着面に接合される。2つの小さいベントは、チャンバ2(ベント2。チャンバ1からチャンバ2への流体の移送中に空気が逃げる)、及び、チャンバ3(ベント3a。洗浄試薬が棚の上に流れ出て、側方チャネルに流れ込むときに空気が入れ替えられる)のためのものである。COP/COC膜は、Aculon NanoProof 5.0xなどの超疎水性コーティングで被覆され、PMPの効率的な磁気的移動を支援する。プラスチック支持膜は剛性でなければならないが、一方側の上の磁石と他方側のPMPの収集との間の距離を最小化するだけ比較的薄くもしなければならない。
これは、ドラッグ膜をドラッグプレートに接着接合する両面PSA(たとえば、3M 9471、AR Care7876)である。それは、ベント3a及び磁石アクセスチャネルと重なる単一のベント(3b)を有する(図15F参照)。
このプレートは、カートリッジ本体と一体化されてもよい。それは、たとえば、3/32インチプラスチックシートから組み立てられ、カートリッジ本体が器具とかみ合うのを支援する。ドラッグプレートは器具のレール上で摺動する。それは、PSAドラッグプレートと同じ特徴を有する(図15F参照)。
これは、引込穴をドラッグプレートに接着接合する両面PSA(たとえば、3M 9471、AR Care7876)である。
この機能は、カートリッジ本体と一体化されてもよい。いくつかの実施形態において、それは、3/32インチプラスチックシートから組み立てられ、チャンバ1への開口及びプランジャのための引込部の両方として働き、プランジャは、チャンバ1を閉じ、その後、チャンバ1からチャンバ2に流体を押すのに使用される。
プランジャは、たとえば、チャンバ1の閉鎖及び密封の両方のためのキャップとして働く柔軟なゴム(たとえば、注射器本体のプランジャ)であり、その後、チャンバ1に押し込み、移送チャネルを介してチャンバ1からチャンバ2に患者サンプルを押すことができる。
図15Bに示されるように、カートリッジ本体は、前面に2つのチャンバを有し、それは、(a)たとえば、(たとえば、95℃で)溶解が発生するチャンバ1、及び、(b)たとえば、(たとえば、60℃で)ハイブリダイゼーションが発生するチャンバ2である。2つのチャンバの分離はいくつかの利点を提示する。(a)予熱することができて、固定された設定値で安定させることができる、底カバー(図15A)を介した流体への高速熱伝達に役立つ独立したヒータ。したがって、加熱のみの装置が必要である。エンジニアリングハードウェアを簡略化して、所要時間を早める能動的な冷却は必要とされない。(b)チャンバ1で遭遇する高温に敏感である乾燥試薬は、ハイブリダイゼーションステップで使用するためにチャンバ2に個別に格納されてもよい。
小さい取り囲まれたチャンバ(エアロック)は、2つの固定レッジ1と2との間に位置付けられる(図15C参照)。使用するとき、最初に、洗浄試薬は深い穴から流れ出て、棚の上に流れる。それは固定レッジ2の方へ流れて、(ベース層と超疎水コーティングされたドラッグ膜との間に作成された)表面張力のためにそこで固定されたままになる。患者サンプルがプランジャを介してチャンバ1からチャンバ2に移送されるとき、ベント1がプランジャによって密封されるので、空気はベント2介してのみ逃れることができる。流体レベルがチャンバ2において上がると、それは、毛管作用のために固定レッジ1にすぐに流れ込む。しかしながら、それは、エアロックチャンバのために固定レッジ1を越えて進まず(たとえば、空気はその方向に出ることができない)、安定した液体空気界面を作成する。流体は、チャンバ2を上向きに充填し続け、移送チャネルに到達することなく停止する。チャンバ2の流体とチャンバ3の洗浄試薬との間にエアギャップができる。PMPは、この液体空気界面を横切って移送される。図16を参照のこと。
HIV p24 イムノアッセイ
実験は、血漿サンプルを0または50IU/mlでテストするHIV p24 ELISAによるイムノアッセイに関して[National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC)code 90/636,Potters Bar Hertfordshire,UK]、手動アッセイと比較して、(実施例4で説明されて、図15~18に示された)例示的なTIMSカートリッジの使用を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に行われた。
捕捉抗体(115B-151):ChromaLink(商標)Biotin Antibody Labeling Kit(TriLink Biotechnologies B-9007-105,San Diego,CA)を使用した標識
検出抗体(108-394):ThermoFisher FluoroMax 0.328μM粒子(cat#93470720011150)(Waltham,MA)による標識。最初に、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル生成を使用するBSA、その後、減少したmAbとBSAとの間のGMBS結合により粒子は被覆された。
抗体希釈及びアッセイ&洗浄バッファ
1% BSA
50mM Tris、pH 7.5
0.5% Triton x100
200mM NaCl
0.02% NaN3
溶出バッファ
100mM グリシンHCl、pH 2.74
0.01% Tween 20。
mAb:反応あたり50ngビオチン化捕捉抗体及び7.0X107Eu複合化検出抗体。0または50IU/ml p24(NIBSC 90/636)を含有する25μl血漿サンプルを190μl結合バッファに添加し、25μl抗体カクテルさらに25μlのプレウォッシュされたDynal M270 Streptavidin被覆PMPを添加し、回転混合しながら30分間インキュベートした。
250μlの洗浄バッファで2回洗浄した。磁気スタンド上で収集し、上澄みを廃棄した。
1.サンプルをTIMSカートリッジのチャンバ2に配置。
4.洗浄でPMPを収集して、洗浄チャンバから移動
5.約10μlの洗浄バッファでPMPを再懸濁して、液体を新規のチューブに移動
6.磁気スタンド上でPMPを磁気的に収集
7.上澄みを除去した。
1.125μlの溶出バッファを添加;ピペット混合
2.5分インキュベート
3.磁気スタン上のPMPをペレット化して、溶出タンパク質を含有する上澄みを除去
4.蛍光を読み取る(Biotek Synergy 4 Microplate Reader上での励起@333nm及び発光@613nm)
TIM洗浄は、かなり多くの非結合ビーズを除去し、TIMSの0IU/ml及び50IU/mlの両方のサンプルで、手動アッセイと比較してより低いシグナルになったが、TIMSのシグナルノイズ比は手動のため2倍近くになった。
親和性タンパク質精製
実験は、親和性タンパク質精製における、(実施例4で説明されて、図15~18に示された)例示的なTIMSカートリッジの使用を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に行われた。HISタグタンパク質は、MagneHis(商標)常磁性粒子に結合された。サンプルは分割され、手動で、または、TIMS機器上で処理する(PMPは3回洗浄された)。
30秒間、磁気スタンド上でPMPを収集。
PMPを含有するタンパク質混合物をTIMSカートリッジに添加。
Claims (8)
- 常磁性粒子を、液体/気体界面を横切って移動させる方法であって、
(a)常磁性粒子(PMP)を含有する液体サンプルを準備することと、
(b)前記PMPのペレットを形成するよう、前記液体サンプル内に磁場を形成することと、
(c)前記液体/気体界面に隣接した当該液体内に前記ペレットを位置させるよう、前記磁場を位置決めすることと、
(d)前記PMPが遭遇した前記磁場を減少または除去することと、
(e)前記液体/気体界面の当該気体側に磁場を形成することと、
(f)前記PMPのペレットを、前記液体/気体界面を横切って当該気体内に流すことと
を含み、前記(a)~(f)の工程はこの順序で実施される、
方法。 - 前記PMPを、移送表面の近位側においてペレット化して流すために、移動可能な磁石を当該移送表面の遠位側に隣接して配置する、
請求項1に記載の方法。 - 前記磁場を形成することには、
前記移送表面の遠位側の近傍、あるいは前記移送表面の遠位側に対して、前記磁石を位置させることを含む、
請求項2に記載の方法。 - 前記PMPが遭遇した前記磁場を減少または除去することには、
前記移送表面から前記磁石を離すことを含む、
請求項3に記載の方法。 - 前記PMPは、表面に捕捉剤を提示している、
請求項1に記載の方法。 - 前記捕捉剤は、核酸プローブ、抗体または抗体断片、または親和剤である、
請求項5に記載の方法。 - 前記捕捉剤は、検体に結合する、
請求項5に記載の方法。 - (g)前記気体内にある前記ペレットを移動させて気体/液体界面に隣接させるように前記磁場を位置決めすることと、
(h)前記PMPが遭遇した前記磁場を減少または除去することと、
(i)前記気体/液体界面の当該液体側に磁場を形成することと、
(j)前記気体/液体界面を横切って当該液体内にペレット化したPMPを流すことと
を更に含み、前記(a)~(j)の工程はこの順序で実施される、
請求項1に記載の方法。
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