JP7166344B2 - タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法およびアルコール性脂肪肝を治療する用途 - Google Patents
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Description
(1)浸出:タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のpH値を4~8に調節して反応液を得る。
(2)酵素分解:その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、30~50℃で1~4時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
(3)抽出、濃縮:ろ液をマクロ孔質樹脂Aで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る。
(4)単離、精製:濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Bで単離精製し、波長510nmで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る。
前記マクロ孔質樹脂Aは、AB-8、DM-130、HZ841、ZH-00、ZH-01、ZH-02、ZH-03、CAD-40、CAD-45、BS-30から選択される少なくとも1つである。
前記マクロ孔質樹脂Bは、D-101、D-140、D-141、XAD-3、XAD-4、HP-20、HP-21、LD-605、LSA-10から選択される少なくとも1つである。
(1)本発明は、タカサゴサンシチソウ抽出物についてさらに掘り下げて研究する。これにより80~85%のルチンを含有するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を浸出、単離し;さらにゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝モデルを実験モデルとして有効性試験の研究を行う。実験結果は、本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が、アルコール性肝損傷に対して効果的に保護効果を発揮することができ、肝保護の薬効作用を有し、アルコール性肝損傷を潜在的に治療する薬物とすることができることを明らかにしている。
(2)本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、浸出工程の後、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択することにより、30~50℃で酵素分解を行う。タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の構造が高温下で破壊されるのを防止するだけでなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物を最大限に浸出させることができる。さらにマクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製工程により、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率は1.8%~2.0%に達することができる。既存方法におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率より30%以上高くなり、得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンのHPLC純度は80~85%に達することができる。
(1)浸出:タカサゴサンシチソウ100gに重量で30倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のpH値を5に調節して反応液を得る。
(2)酵素分解:その後、反応液中に25gの複合酵素(該複合酵素は重量比で1:3:2のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる)を添加して酵素分解を行い、40℃で3時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
(3)抽出、濃縮:AB-8マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、30℃、100rpmで12時間撹拌して、ろ過する。AB-8マクロ孔質樹脂の重量に基づき、吸着後のAB-8マクロ孔質樹脂に重量で20倍量の体積濃度75%のエタノール溶液を添加する。その後30℃、120rpmで12時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が0.5mg/mLになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
(4)単離、精製:濃縮液を10000rpmで10分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂D-101を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、60min静止吸着させる。体積濃度75%のエタノール水溶液を用いて、5m/hの速度で溶出し、波長510nmで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図(クロマトグラムは図1に示す)を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
一定質量の乾燥させたルチン標準物質に1:100で乾燥させた臭化カリウムを添加し、すり混ぜた後、固体の錠剤を作製する。フーリエ赤外線分光光度計を用いて、スキャン範囲4000~400cm-1、分解能4、スキャン回数4の条件で赤外吸収スペクトルを作成する。同じ方法で精製後のタカサゴサンシチソウ抽出物の赤外吸収スペクトルを作成し、比較同定する。結果は図2に示す通りである。
液体クロマトグラフ条件:ガードカラムEclipse XDB-C18 AnalyticalGuard Column(4.6×12.5mm、5μm):ZOR BZX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)、流速0.5mL/min、カラム温度35℃、検出波長368nm、254nm、210nm、サンプル体積10μL、移動相0.03%ギ酸水溶液(A)、アセトニトリル(B)、グラジエント溶離プログラム:0~10min、20%B;10~12min、20%~24%B;12~20min、24%B;20~25min、24%~30%B;25~48min、30%B。
ルチン0.001gを正確に秤取し、1mLメタノール中に溶解し、1mg/mLの単一の標準物質溶液を調製する。使い捨てフィルタでろ過し、小さな試験管に入れて使用に備える。
標準物質溶液、被験物質溶液(実施例1で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物であり、濃度1μg/μLのメタノール溶液に調製した)を精密に量り、液体クロマトグラフの検出条件に基づいて、それぞれ検出分析する。
(1)浸出:タカサゴサンシチソウ100gに重量で20倍量の水を添加して浸出させ、希水酸化ナトリウム溶液で浸出液のpH値を8に調節して反応液を得る。
(2)酵素分解:その後、反応液中に20gの複合酵素(該複合酵素は重量比で0.5:5:1のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる)を添加して酵素分解を行い、30℃で4時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
(3)抽出、濃縮:DM-130マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、30℃、80rpmで24時間撹拌して、ろ過する。DM-130マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のDM-130マクロ孔質樹脂に重量で10倍量の体積濃度95%のエタノール溶液を添加する。その後30℃、80rpmで24時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が0.5mg/mLになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
(4)単離、精製:濃縮液を6000rpmで8分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂HP-21を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、60min静止吸着させる。体積濃度80%のエタノール水溶液を用いて、3m/hの速度で溶出し、波長510nmで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
(1)浸出:タカサゴサンシチソウ100gに重量で60倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のpH値を4に調節して反応液を得る。
(2)酵素分解:その後、反応液中に32gの複合酵素(該複合酵素は重量比で1.5:2:3のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる)を添加して酵素分解を行い、50℃で1時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
(3)抽出、濃縮:ZH-01マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、30℃、150rpmで6時間撹拌して、ろ過する。ZH-01マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のZH-01マクロ孔質樹脂に重量で30倍量の体積濃度70%のエタノール溶液を添加する。その後30℃、150rpmで6時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が0.5mg/mLになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
(4)単離、精製:濃縮液を8000rpmで5分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂XAD-3を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、60min静止吸着させる。体積濃度70%のエタノール水溶液を用いて、15m/hの速度で溶出し、波長510nmで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
一、実験材料
デジタル位相差倒立顕微鏡(IX51 日本Olympus);Nikon SMZ18デジタル顕微鏡;全自動生化学分析装置(BS-220深ゼン邁端生物医療電子股フン有限公司);組織包埋装置(BMJ-III常州中威電子儀器廠);ミクロトーム(RM2235 ドイツLeica);スライドウォーマー(PHY-III常州事郊区中威電子機器廠);マイクロプレートリーダ(SUNRISE スイスTecan);組織ホモジナイザー(PRO200 米国PRO Scientific);高速冷却遠心分離機(Centrifuge 5810R ドイツEppendorf);逆浸透純水システム(RO-200上海和泰儀器有限公司);MDAアッセイキット(碧雲天生物技術研究所);SODアッセイキット(碧雲天生物技術研究所);無水エタノール(西隴化工股フン有限公司);Oil red O オイルレッド染色液(阿拉丁);PBS緩衝溶液(Thermo Fisher Scientific);プロピレングリコール(西隴化工股フン有限公司);グリセリン(西隴化工股フン有限公司);N-ベンジルチオ尿素(Sigma);トリカインメタンスルホフォナート(Sigma);ポリオキシメチレン(北京拓英坊科技有限公司);キシレン(西隴化工股フン有限公司);ヘマトキシリン・エオジン(HE)。以上の試薬はいずれも分析用試薬である。実験試薬キットは碧雲天生物技術研究所から提供された。
1、試験薬物の調製
実施1の方法に基づいて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を調製し、被験薬物とする。
野生型のゼブラフィッシュ成魚はザン州市花鳥市場から購入した。28℃の恒温環境において、自動タイマーで実験室を明期14h、暗期10hに制御し、1週間連続して毎日定時に一定量で給餌し、実験に備えた。実験で用いるゼブラフィッシュ稚魚は、すべて実験室で飼育した野生型のTUゼブラフィッシュである。ゼブラフィッシュはWesterfield方法に基づき、養殖する。つまり明期14h、暗期10hを交互に行い、雌雄は別々に飼育し、毎日定時に新鮮なブラインシュリンプを与える。実験前日の晩に、TUゼブラフィッシュを雌雄1:1で別々に交配タンク中に入れ、仕切り板を挿入する。次の日の朝、仕切り板を抜くと、ゼブラフィッシュは交配、産卵する。卵を28℃の恒温培養器中に集めて96hpf培養し、期間中は定時に水を換え、死卵を除去し、実験に備える。
各実験群のゼブラフィッシュについて、最後の水交換の後、実験動物を12h絶食させる。ゼブラフィッシュを屠殺する前に体重を量り、眼球から採血する。各50匹を1群とし、ブランク対照群、モデル群および実験群の各3つである。採血後すぐに屠殺し、重さを量り、実験に必要な肝臓組織をただちに分離し、肝臓組織の重さを量る。その後ホルマリン固定するか、または液体窒素で保存する。ゼブラフィッシュを屠殺し、サンプリングする順序は図5に示す通りである。
血液を4000r/min、4℃で10min遠心分離して上清を採取し、全自動生化学分析装置を用いて血清のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)を測定する。上記指標はキットの指示に基づいて全自動生化学分析装置で測定し、さらにキットの使用説明に基づいて肝臓中の抗酸化レベルSOD、抗ストレスレベルMDAを測定する。
固定した組織サンプルを脱水(脱水順序:75%エタノール30min→90%エタノール10min→95%エタノール10min→95%エタノール10min→100%エタノール10min→100%エタノール10min→100%エタノール10min→キシレンI5min→キシレンII5min→キシレンIII5min)後、パラフィン包埋し、4μmで薄切し、70℃で30minスライドを加温する。通常の染色液ヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色し、中性樹脂で封入し、顕微鏡で観察する。
必要とする実験を32h行った後、対照群、モデル群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中、低濃度群である計5群に、ゼブラフィッシュ稚魚を各50匹で無作為に選び、全自動生化学分析装置でゼブラフィッシュ稚魚全体のホモジネートのAST、ALT含量を測定する。キットの説明に基づいて、ゼブラフィッシュ稚魚全体のホモジネートのSOD活性およびMDA含量を測定し、各群で3回繰り返す。データを記録して分析する。
実験データは平均±標準偏差(x±s)の形式で表し、統計学ソフトSPSS10.0および一元配置分散分析法を採用してデータを分析処理する。P<0.05は有意水準の差を表し、P<0.01は高有意水準の差を表す。
1、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝損傷を修復する際の最大の非致死濃度の確定
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物のゼブラフィッシュ成魚に対する慢性毒性実験の結果および急性毒性実験の結果は、表3および表4に示す通りである。表3および表4から、ゼブラフィッシュ成魚に対する1週間の投与期間内に、各群の外観の形態、遊動能力、精神状態を観察すると、いずれも正常で、死亡の記録はないことがわかる。ゼブラフィッシュ稚魚は32hの投与時間内に、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の濃度が0.08mg/mLに達する実験群で死亡が起こり、0.12mg/mL群は4hで死亡し始め、32hの死亡率は7%で、大規模な死亡は起こらなかった。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の濃度0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mLを、ゼブラフィッシュ稚魚の実験群における高、中、低用量群の濃度とする。
ゼブラフィッシュ成魚の体重、肝臓重量および肝臓指数に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表5に示す通りである。表5から、正常対照群と比較して、モデル群のゼブラフィッシュ成魚はアルコール処理後に体重が低下し、肝臓重量は上昇し、肝臓指数は顕著に上昇し、有意差を有する(P<0.05)ことがわかり、アルコールが一定程度でゼブラフィッシュに毒性作用を有し、ゼブラフィッシュの肝臓を損傷させることを立証している。モデル群と比較して、様々な濃度のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物群は、処理後、ゼブラフィッシュの肝臓重量が低下し、体重および肝臓指数はいずれも上昇し、中、高用量群の肝臓指数はモデル群と比較して有意差を有する(P<0.05)。これは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュの肝臓指数を改善させる効果が比較的良好であることを表している。
ゼブラフィッシュ血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)含量は、表6に示す通りである。
アルコール性脂肪肝を有するゼブラフィッシュ稚魚のホモジネートのALT、AST、SOD、MDAに対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表8に示す通りである。表8から、対照群と比較して、モデル群はゼブラフィッシュ稚魚のALT、AST、SOD活性がいずれも明らかに低下し、高有意差に達し(P<0.01)、MDAは明らかに上昇し、高有意差に達した(P<0.01)ことがわかる。ALTおよびASTの変化傾向に関する様々な原因は以下の通りである。前の研究で測定したのは血清中のALTおよびAST活性であり、本実験で測定したのは組織ホモジネート液中のALTおよびAST活性である。モデル群は肝臓を損傷すると、細胞透過性が高くなり、血清中のALTおよびAST活性は高くなる。しかし、動物全体について述べると、肝臓を損傷すると、肝細胞のALTおよびAST合成能力は低下するため、ALTおよびASTの総活性は低下する。異なる視点から、アルコールがALTおよびASTに対して影響を及ぼすことを説明している。
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が肝保護効果を有しているかどうかをより深いレベルで探求するため、本実験は新規のゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝モデルを採用する。該モデルはサンプル量が多く、実験技術の操作は簡単で、実験周期が短く、浪費が少ないなどの利点を有する。
Claims (4)
- 以下の工程
(1)浸出:タカサゴサンシチソウに浸出溶媒である水を前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比が1:(20~60)となるように添加して浸出させ、浸出液のpH値を4~8に調節して反応液を得る;
(2)酵素分解:その後、反応液中に、3つの重量比が、(0.5~1.5):(2~5):(1~3)もしくは1:3:2であるパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を、前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比が1:5~1:3となるように添加して酵素分解を行い、30~50℃で1~4時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する;
(3)抽出、濃縮:ろ液をマクロ孔質樹脂Aで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る;
(4)単離、精製:濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Bで単離精製し、波長510nmで吸光度を測定し、溶出溶媒を体積濃度70~80%のエタノール水溶液、溶出速度を5~25cm/minとして、溶出液を収集して、前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が0.5mg/mLとなるように濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る;
を含む、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法であって、
当該フラボノイド抽出物は、重量百分率で80~85%のルチンを含有する、アルコール性脂肪肝を治療する薬品もしくは健康製品の調製におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。 - 前記マクロ孔質樹脂Aが、AB-8、DM-130から選択される少なくとも1つである、請求項1に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
- 前記マクロ孔質樹脂Bが、D-101、HP-21から選択される少なくとも1つである、請求項1または2に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
- 活性成分として、通常の工程に基づき、通常の添加剤が添加されて得られる、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造されうることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
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