JP7155258B2 - 磁気粒子を用いて生物学的試料をプロセシングするための方法 - Google Patents
磁気粒子を用いて生物学的試料をプロセシングするための方法 Download PDFInfo
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Description
しかし、質量分析および核酸配列決定を含む特定の分析または診断技術によって必要とされるように、少ない体積でプロセスを実行し、そして少ない溶出体積を得ることは困難であると立証されてきている。前記技術はしばしば、問題の分析物を高濃度で必要とするが、これは、特に、生物学的ターゲット物質が、多くの場合、臨床試料などの試料においては豊富に入手可能ではないか、または試料自体の入手可能性が限定されている可能性もあるため、大きな溶出体積では達成が困難であろう。
概要
本明細書に記載する第一の側面において、磁気粒子の懸濁物を含む液体試料を保持するマルチウェルプレートの提供で始まる、液体試料から生物学的ターゲット物質を単離するための方法を記載する。生物学的物質が粒子に結合する条件下で試料をインキュベーションし、そして続いて磁気分離プレートの磁石を、マルチウェルプレートの対応する凹部内に導入し、こうして磁場勾配を発動して、それぞれのウェルの内部側壁で磁気粒子のペレットを形成する。次いで、多数のピペットチップをウェルの底に下げて導入し、壁に保持されたペレットを乱すことなく、液体試料を抜き取る。随意の洗浄工程後、マルチウェルプレートの凹部から磁石を回収し、そして溶出緩衝液をウェルに添加する。溶出体積は、各ウェル中の問題の液体試料の最初の体積よりも少ない。適切な条件下で所望の生物学的物質を溶出した後、磁石をプレート凹部内に再導入し、そして磁気勾配によって、ウェルの内部側壁の特定の高さで磁気粒子のペレットを保持しながら、ピペットチップを用いることによって、ウェルの底部から溶出液を抜き取る。結合、洗浄および溶出の工程の少なくとも1つの後、ペレットが、磁場勾配によって、それぞれのウェルの頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動するように、垂直および側方方式で、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させることによって、磁気粒子のペレットを収集する。
a.開放頂部および閉鎖底部を持つ複数のウェルを有するマルチウェルプレートを提供し、ここで、複数のウェルの少なくとも一部は、第一の液体体積において、液体試料および結合表面を持つ磁気粒子の懸濁物を含み、マルチウェルプレートは磁気分離プレートの複数の磁石のあらかじめ決定された幾何学的配置に対応する位置で凹部をさらに含む;
b.磁気分離プレートの磁石が磁気粒子を移動させるために十分な強度でマルチウェルプレートのウェル内に磁場勾配を引き起こさないように、互いに十分な距離である、マルチウェルプレートおよび磁気分離プレートのインキュベーション位置において、磁気粒子の表面に生物学的ターゲット物質が結合する条件を用いて、液体試料および磁気粒子をインキュベーションし;
c.上部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートの凹部内に、磁気分離プレートの磁石を導入し、ここで、各磁石は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェルの外壁に十分に近接しており、それによって、第一の特定の高さで、それぞれのウェルの内壁に磁気粒子のペレットを形成する;
d.下部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレットが、磁場勾配によって、それぞれのウェルの頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動して、第二の特定の高さに到達するように、垂直および側方方式で行われる;
e.ピペッターの複数のピペットチップをマルチウェルプレートのウェル内に、そしてピペットチップで液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェルの底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレットおよびピペットチップの側方位置は、ペレットを乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、磁気粒子のペレットおよびピペットチップに関して十分に間隔が空いている;
f.磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから液体を抜き取り;
g.随意に、生物学的ターゲット物質を磁気粒子上に保持しながら、磁気粒子の表面から望ましくない構成要素を除去するため、洗浄緩衝液をウェルに添加し、次いで、磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから液体を抜き取り;
h.マルチウェルプレートの凹部から、マルチウェルプレートおよび磁気分離プレートのインキュベーション位置に、磁気分離プレートの磁石を回収し、そしてウェルに溶出緩衝液を添加して、第二の液体体積を生じ、ここで、第二の液体体積は第一の液体体積より少ない、そしてその中で磁気粒子を再懸濁し;
i.溶出緩衝液で、磁気粒子から生物学的ターゲット物質を溶出させ;
j.磁気分離プレートの磁石を、上部または下部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートの凹部内に導入し、ここで、各磁石は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェルの外壁に十分に近接しており、それによって、第一または第二の特定の高さで、それぞれのウェルの内壁に磁気粒子のペレットを形成する;
k.ピペッターの複数のピペットチップをマルチウェルプレートのウェル内に、そしてピペットチップで液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェルの底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレットおよびピペットチップの側方位置は、ペレットを乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、ペレットおよびピペットチップに関して十分に間隔が空いている;
l.磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから、単離された生物学的ターゲット物質を含有する溶出液を抜き取る
工程を含む、前記方法である。
特に、磁気粒子の収集に関する効率の増加は、問題の生物学的物質の収量の改善を可能にする。さらに、磁気勾配を通じた収集に際して、よく定義された位置での粒子の集合は、粒子の大部分を湿らせることが可能であり、そして/または比較的低体積のそれぞれの溶出剤中に懸濁することが可能であるため、比較的高い溶出体積の必要性を減少させる。
「生物学的ターゲット物質」または「生物学的物質」は、本開示の意味において、すべての種類の生物学的分子、例えばタンパク質または核酸を含むが、また、天然に存在するか、あるいはその誘導体または合成類似体または変異体である他の分子も含む。さらに、用語「生物学的物質」は、ウイルスならびに真核および原核細胞を含む。いくつかの態様において、生物学的ターゲット物質は、核酸、例えばDNA、RNAまたはPNAである。DNAは、例えばウイルスDNA、ゲノムDNAまたはプラスミドDNAであってもよい。生物学的ターゲット物質は、天然であってもまたは修飾されていてもよい。天然生物学的物質は、それぞれの天然存在生物学的物質、例えば生物から単離されたDNAまたはRNAに比較した際、不可逆的に改変されていない。修飾生物学的物質は、例えばビオチン化分子、例えば核酸またはタンパク質を含む。
「ピペッター」は、流体トランスファーまたは吸引および排出(sip and spit)混合のためなどの流体体積の自動的抜き取りおよび/または分配を可能にするデバイスである。本明細書記載の背景において、これらの流体には、液体生物学的試料、液体生物学的試料をプロセシングするために用いる試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液、プロセシングされた液体、プロセシングされた分析物を含有する液体等が含まれる。液体を以下の位置/容器のいずれかから抜き取りそして分配してもよい:試料チューブ、中間プロセスチューブ、試薬容器、廃棄物容器または位置、チップ洗浄ステーション、排出容器、反応チューブ等。特に、本明細書記載のマルチウェルプレートのウェル内に、流体生物学的試料を分配するか、またはそこから試料を抜き取るために、ピペッターを用いてもよい。ピペッターは、いくつかの態様において、空気圧系または水力系によって駆動される。圧媒液として、ピペッターは、いくつかの態様において、水または一般的に用いられる試薬を用いてもよい。
I.中央収集位置に到達するように、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレットが、磁場勾配によって、それぞれのウェルの頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動して、ウェル底部でプールされて、単一のペレットを形成するように、垂直および側方方式で行われる;
II.下部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させる、ここで、移動は、ペレットが、磁場勾配によって、第二の特定の高さに到達するように、それぞれのウェルの底部から頂部への方向で、内壁に沿って移動するように、垂直および側方方式で行われる。
a.開放頂部および閉鎖底部を持つ複数のウェルを有するマルチウェルプレートを提供し、ここで、複数のウェルの少なくとも一部は、第一の液体体積において、液体試料および結合表面を持つ磁気粒子の懸濁物を含み、マルチウェルプレートは磁気分離プレートの複数の磁石のあらかじめ決定された幾何学的配置に対応する位置で凹部をさらに含む;
b.磁気分離プレートの磁石が磁気粒子を移動させるために十分な強度でマルチウェルプレートのウェル内に磁場勾配を引き起こさないように、互いに十分な距離である、マルチウェルプレートおよび磁気分離プレートのインキュベーション位置において、磁気粒子の表面に生物学的ターゲット物質が結合する条件を用いて、液体試料および磁気粒子をインキュベーションし;
c.上部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートの凹部内に、磁気分離プレートの磁石を導入し、ここで、各磁石は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェルの外壁に十分に近接しており、それによって、第一の特定の高さで、それぞれのウェルの内壁に磁気粒子のペレットを形成する;
d.中央収集位置に到達するように、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレットが、磁場勾配によって、それぞれのウェルの頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動してウェル底部でプールされるように、垂直および側方方式で行われる;
そして
下部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートを互いに対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレットが、磁場勾配によって、第二の特定の高さに到達するように、それぞれのウェルの底部から頂部への方向で、内壁に沿って移動するように、垂直および側方方式で行われる;
e.ピペッターの複数のピペットチップをマルチウェルプレートのウェル内に、そしてピペットチップで液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェルの底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレットおよびピペットチップの側方位置は、ペレットを乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、磁気粒子のペレットおよびピペットチップに関して十分に間隔が空いている;
f.磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから液体を抜き取り;
g.随意に、生物学的ターゲット物質を磁気粒子上に保持しながら、磁気粒子の表面から望ましくない構成要素を除去するため、洗浄緩衝液をウェルに添加し、次いで、磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから液体を抜き取り;
h.マルチウェルプレートの凹部から、マルチウェルプレートおよび磁気分離プレートのインキュベーション位置に、磁気分離プレートの磁石を回収し、そしてウェルに溶出緩衝液を添加して、第二の液体体積を生じ、ここで、第二の液体体積は第一の液体体積より少ない、そしてその中で磁気粒子を再懸濁し;
i.溶出緩衝液で、磁気粒子から生物学的ターゲット物質を溶出させ;
j.磁気分離プレートの磁石を、上部または下部周辺収集位置に到達するように、マルチウェルプレートの凹部内に導入し、ここで、各磁石は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェルの外壁に十分に近接しており、それによって、第一または第二の特定の高さで、それぞれのウェルの内壁に磁気粒子のペレットを形成する;
k.ピペッターの複数のピペットチップをマルチウェルプレートのウェル内に、そしてピペットチップで液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェルの底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレットおよびピペットチップの側方位置は、ペレットを乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、ペレットおよびピペットチップに関して十分に間隔が空いている;
l.磁力によって、磁気粒子のペレットを保持しながら、それぞれのウェルから、単離された生物学的ターゲット物質を含有する溶出液を抜き取る。
-開放頂部および閉鎖底部を持つ複数のウェルを有するマルチウェルプレートであって、複数のウェルの少なくとも一部が、第一の液体体積において、液体試料および結合表面を持つ磁気粒子の懸濁物を含み、マルチウェルプレートが磁気分離プレートの複数の磁石のあらかじめ決定された幾何学的配置に対応する位置で凹部をさらに含む、前記マルチウェルプレート;
-ガイドスクリーンおよび磁気分離プレートを含む磁気分離デバイスであって、ガイドスクリーンがマルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートに対して本質的に垂直であり、そしてマルチウェルプレートおよび/または磁気分離プレートの互いに対して相対的な移動を導くためのガイドレールを有し、磁場勾配によって、磁気粒子のペレットがマルチウェルプレートのウェルの内壁に沿って移動するように、移動が垂直および側方方式で行われる、前記磁気分離デバイス
の要素を含む。
いくつかの態様において、磁気分離デバイスは、マルチウェルプレートを受け入れるため、上面にフレームを含む。より特定の態様において、ガイドスクリーンはフレームに物理的に連結される。
図1の模式図は、本明細書記載の方法の態様の横断側面図を示す。明確にするため、マルチウェルプレート(200、未提示)の1つのウェル(210)を、磁気分離プレート(400、未提示)に含まれる2つの直方体状磁石(411、412)と相互作用する、独立の1つの容器として示す。示す態様中の磁気粒子(230)は、磁気ビーズ、例えば磁気ガラスビーズ、官能化表面を持つ磁気ビーズ等である。図1A~Kに示す画像は、本明細書に開示する方法の工程に相当する。
下部周辺収集位置(1002)にある、図3Aに示すペレット(240)を含むウェル(210)は、例えば、図1A~Kに示すインキュベーションの、または図2A~Dに示す洗浄の結果でありうる。いくつかの態様において、ペレット(240)は、慣用的な風乾、または熱の適用等によって乾燥されている。
図4Aは、磁気分離デバイス(500)のソケット(560、図4Fに示す)上に搭載されたマルチウェルプレート(200)を示す。示す態様において、マルチウェルプレート(200)は、標準SBS 96ウェルプレートである。こうしたプレートは、当該技術分野においてよく確立されており、そして多様な供給業者から商業的に入手可能である。磁気分離プレート(400)の磁石(410)は、マルチウェルプレート(200)によって隠されている。
Claims (11)
- 液体試料から生物学的ターゲット物質を単離するための方法であって:
a.開放頂部および閉鎖底部を持つ複数のウェル(210)を有するマルチウェルプレート(200)を提供し、ここで、複数のウェル(210)の少なくとも一部は、第一の液体体積において、液体試料(220)および結合表面を持つ磁気粒子(230)の懸濁物を含み、マルチウェルプレート(200)は磁気分離プレート(400)の複数の磁石(410)のあらかじめ決定された幾何学的配置に対応する位置で凹部(205)をさらに含む;
b.磁気分離プレート(400)の磁石(410)が磁気粒子(230)を移動させるために十分な強度でマルチウェルプレート(200)のウェル(210)内に磁場勾配を引き起こさないように、互いに十分な距離である、マルチウェルプレート(200)および磁気分離プレート(400)のインキュベーション位置(1000)において、磁気粒子(230)の表面に生物学的ターゲット物質が結合する条件を用いて、液体試料(220)および磁気粒子(230)をインキュベーションし;
c.上部周辺収集位置(1001)に到達するように、マルチウェルプレートの凹部(205)内に、磁気分離プレート(400)の磁石(410)を導入し、ここで、各磁石(410)は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェル(210)の外壁に十分に近接しており、それによって、第一の特定の高さで、それぞれのウェル(210)の内壁に磁気粒子(230)のペレット(240)を形成する;
d.下部周辺収集位置(1002)に到達するように、磁気分離プレート(400)をマルチウェルプレート(200)に対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレット(240)が、磁場勾配によって、第二の特定の高さに到達するように、それぞれのウェル(210)の頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動するように、垂直および側方方式で行われる、ここで、マルチウェルプレート(200)に対する相対的な磁気分離プレート(400)の垂直および側方移動が、ガイドレール(541、542)を有するガイドスクリーン(540)によって導かれ、ガイドスクリーン(540)がマルチウェルプレート(200)および/または磁気分離プレート(400)に対して本質的に垂直である;
e.ピペッターの複数のピペットチップ(260)をマルチウェルプレート(200)のウェル(210)内に、そしてピペットチップ(260)で液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェル(210)の底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレット(240)およびピペットチップ(260)の側方位置は、ペレット(240)を乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、磁気粒子(230)のペレット(240)およびピペットチップ(260)に関して十分に間隔が空いている;
f.磁力によって、磁気粒子(230)のペレット(240)を保持しながら、それぞれのウェル(210)から液体を抜き取り;
g.随意に、生物学的ターゲット物質を磁気粒子上に保持しながら、磁気粒子(230)の表面から望ましくない構成要素を除去するため、洗浄緩衝液(300)をウェル(210)に添加し、次いで、磁力によって、磁気粒子(230)のペレット(240)を保持しながら、それぞれのウェル(210)から液体を抜き取り;
h.マルチウェルプレート(200)の凹部(205)から、マルチウェルプレート(200)および磁気分離プレート(400)のインキュベーション位置に、磁気分離プレート(400)の磁石(410)を回収し、そしてウェル(210)に溶出緩衝液(430)を添加して、第二の液体体積を生じ、ここで、第二の液体体積は第一の液体体積より少ない、そしてその中で磁気粒子(230)を再懸濁し;
i.溶出緩衝液(430)で、磁気粒子(230)から生物学的ターゲット物質を溶出させ;
j. 磁気分離プレート(400)の磁石(410)を、上部(1001)または下部周辺収集位置(1002)に到達するように、マルチウェルプレート(200)の凹部(205)内に導入し、ここで、各磁石(410)は、ウェルの内部空間に磁場勾配を課すように、対応するウェル(210)の外壁に十分に近接しており、それによって、第一または第二の特定の高さで、それぞれのウェル(210)の内壁に磁気粒子(230)のペレット(240)を形成する;
k.ピペッターの複数のピペットチップ(260)をマルチウェルプレート(200)のウェル(210)内に、そしてピペットチップ(260)で液体の可能な最大量を抜き取るために、ウェル(210)の底部に十分に近接して下方に導入し、ここで、ペレット(240)およびピペットチップ(260)の側方位置は、ペレット(240)を乱すために十分な互いの間の物理的相互作用を回避するため、ペレット(240)およびピペットチップ(260)に関して十分に間隔が空いている;
l.磁力によって、磁気粒子(230)のペレット(240)を保持しながら、それぞれのウェル(210)から、単離された生物学的ターゲット物質を含有する溶出液を抜き取る
工程を含む、前記方法。 - 工程c.で複数のペレット(241、242)が形成され、そして工程d.が複数のペレット(241、242)をプールするための以下の
I.中央収集位置(1003)に到達するように、磁気分離プレート(400)を、マルチウェルプレート(200)に対して相対的に移動させて、ここで、移動は、ペレット(241、242)が、磁場勾配によって、それぞれのウェル(210)の頂部から底部への方向で、内壁に沿って移動して、ウェル底部でプールされて、単一のペレット(240)を形成するように、垂直および側方方式で行われる;
II.下部周辺収集位置(1002)に到達するように、磁気分離プレート(400)を、マルチウェルプレート(200)に対して相対的に移動させる、ここで、移動は、ペレット(241、242)が、磁場勾配によって、第二の特定の高さに到達するように、それぞれのウェル(210)の底部から頂部への方向で、内壁に沿って移動するように、垂直および側方方式で行われる;
下位工程からなる、請求項1の方法。 - 工程d.を、工程g.および/または工程j.に続いて反復する、請求項2の方法。
- 磁気粒子(230)が50nm~50μmの平均直径を有する、請求項1~3のいずれか1項の方法。
- 磁気粒子(230)が超常磁性である、請求項1~4のいずれか1項の方法。
- 工程h.の溶出体積が5μl~50μlである、請求項1~5のいずれか1項の方法。
- マルチウェルプレート(200)に対する相対的な磁気分離プレート(400)の側方移動が、水平軸に沿って一次元である、請求項1~6のいずれか1項の方法。
- 液体試料(220)から生物学的ターゲット物質を単離するためのプレ分析系であって:
-開放頂部および閉鎖底部を持つ複数のウェル(210)を有するマルチウェルプレート(200)、ここで、複数のウェル(210)の少なくとも一部が、第一の液体体積において、液体試料(220)および結合表面を持つ磁気粒子(230)の懸濁物を含み、マルチウェルプレート(200)が磁気分離プレート(400)の複数の磁石(410)のあらかじめ決定された幾何学的配置に対応する位置で凹部(205)をさらに含む;
-ガイドスクリーン(540)および磁気分離プレート(400)を含む磁気分離デバイス(500)、ここで、ガイドスクリーン(540)がマルチウェルプレート(200)および/または磁気分離プレート(400)に対して本質的に垂直であり、そしてマルチウェルプレート(200)に対して相対的な磁気分離プレート(400)の移動を導くためのガイドレール(541、542)を有する、ここで、磁場勾配によって、磁気粒子(230)のペレット(240)がマルチウェルプレート(200)のウェル(210)の内壁に沿って移動するように、移動が垂直および側方方式で行われる
の要素を含む、前記プレ分析系。 - マルチウェルプレート(200)が標準SBS形式にしたがった寸法を有する、請求項8のプレ分析系。
- 磁気分離デバイス(500)が、その上面に、マルチウェルプレート(200)を受け入れるためのフレーム(560)をさらに含む、請求項8または9のプレ分析系。
- ガイドスクリーン(540)が、磁気分離デバイス(500)のフレーム(560)に物理的に連結されている、請求項10のプレ分析系。
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