JP7146739B2

JP7146739B2 - 癌を処置するためのアデノウイルスとチェックポイント阻害剤の組合せ

Info

Publication number: JP7146739B2
Application number: JP2019513967A
Authority: JP
Inventors: トゥーリランキ; サリペソネン; マグヌスイェーデルベルク; エリナハーヴィスト; ウカシュクリュク; アンッティヴオラント
Original assignee: タルゴヴァックスオサケユキチュア
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: US10940203B2; AU2017324482A1; US11690913B2; WO2018046803A1; HRP20210133T1; JP2019532047A; EP3293201B1; US20190201525A1; PT3293201T; JP2022183170A; PL3293201T3; HUE053236T2; CN109715664A; DK3293201T3; LT3293201T; US20210121564A1; ES2845690T3; EP3293201A1; EP3783032A1; SI3293201T1

Description

本発明は、医学分野に関する。具体的には、本発明は、ヒト癌の処置のために、１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせてＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを使用する新規な戦略に関する。又、ヒト癌の処置においてこのウイルスと１又は複数のチェックポイント阻害剤の組合せを使用する方法も開示される。ウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤に加えて他の薬剤も治療プロトコールに含むことができる。

免疫系の重要な部分は、身体の正常な細胞とそれが「外来」と見なす細胞を見分けるその能力である。これは正常細胞をそのまま残しつつ、免疫系に外来細胞を攻撃させる。これを行うため、免疫系は「チェックポイント」、すなわち、免疫応答を開始するために活性化（又は不活化）される必要がある特定の免疫細胞上の分子を用いる。

癌細胞は、免疫系による攻撃を回避するためにこれらのチェックポイントを使用する方法を見出す場合がある。免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞に対する免疫系の攻撃を解除する、多くの場合抗体からなる薬物である。免疫チェックポイント阻害剤は近年、特に、転移性黒色腫又はホジキンリンパ腫を有する一部の患者で、幾つかの印象的な成功を収め、他種の癌を有する患者を対象とする含む臨床試験で有望視されている。

黒色腫及び非小細胞肺癌などのいくつかの癌の治療において、チェックポイントタンパク質のターゲッティングの重要性が急速に高まっている。研究者らは又、いくつかの他の癌種に対しても有望な初期結果を見出している。他のほとんどの癌治療薬と異なり、これらのチェックポイント阻害剤は、多くの異なる種類の癌に対して役立つと見られる。

ウイルス療法は、いくつかのウイルスの、それらが増殖する細胞を死滅させる生来の能力、及び隣接する細胞に拡散することにより初期投与用量の治療効果を増幅する能力を利用する、比較的新規な治療アプローチである。ウイルス療法では、効果的且つ安全な腫瘍根絶を得るために、癌細胞の形質導入及びウイルス複製は、ウイルスゲノムの遺伝子工学によって注意深く制御される。安全な腫瘍根絶は、それにより複製をもっぱら腫瘍細胞に制限し、最後には健常な組織に対する副作用なく腫瘍の選択的根絶を得る、アデノウイルスゲノムに対する種々の遺伝子改変の導入を必要とする。

標的細胞中に存在する特定の遺伝的特徴への依存をもたらす機能不全タンパク質又はそれらの発現の欠如を作り出すために、アデノウイルスの重要な調節遺伝子に対する特定の欠失を利用することができる。Ｅ１Ａの部分的欠失は、正常細胞での複製には制限をもたらすが、癌細胞などの標的細胞における複製を可能とする。ＣＲ２（定常領域２）の２４塩基対の欠失を特徴とする条件付き複製ウイルスが作出され、神経膠腫及び乳癌異種移植片の処置において強力且つ選択的であることが示されている（Ｆｕｅｙｏら２０００；Ｈｅｉｓｅら２０００）。それらの癌特異性は、機能不全Ｅ１ＡがＥ２Ｆ１転写因子を放出できないことに起因し、これは遊離型Ｅ２Ｆ１要求をもたらす。Ｅ２Ｆ１は癌細胞には豊富であり、癌細胞ではｐＲｂ経路がほとんどの場合で破壊されている（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ２０００）。

臨床結果及び前臨床結果は、非武装腫瘍溶解性ウイルスによる処置に持続的な抗腫瘍治療的免疫応答をもたらすに十分な免疫刺激性が無いことを示した。この点について、腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激性をより高めるように武装されたものである。ウイルスは、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの高免疫原性タンパク質を発現するように操作することができる。免疫原性タンパク質が腫瘍微小環境内で発現されると、これらのタンパク質は特異的且つ持続的な抗腫瘍免疫の強力な刺激因子となる。免疫治療遺伝子の腫瘍細胞への導入及び更にはそれらのタンパク質への翻訳は、免疫応答の活性化及び腫瘍細胞のより効率的な破壊をもたらす。この点で最も関連のある免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

ＯＮＣＯＳ－１０２（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦ；国際公開第２０１０／０７２９００号に開示）は、癌細胞への遺伝子送達の増強のためのキメラカプシド及び癌細胞限定複製のためのＥ１Ａ領域のＲｂ結合部位における２４ｂｐの欠失を含む血清型５アデノウイルスである。ＯＮＣＯＳ－１０２は、免疫刺激効果の増強のために顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）で武装されている。ＯＮＣＯＳ－１０２の安全性及び免疫活性は、第１相臨床試験（ＮＣＴ０１５９８１２９）で既に実証されている。本発明者らのこの第１相試験では、難治性悪性胸膜中皮腫患者の最終選択治療において、ＯＮＣＯＳ－１０２による胸膜中皮腫の局所処置が、全身性の抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を誘導した。

Ｋｏｓｋｉら（２０１０）は、ＯＮＣＯＳ－１０２による標準治療に不応の進行固形腫瘍を有する合計２１名の患者の処置を開示している。それらの研究によれば、ＯＮＣＯＳ－１０２は、癌患者の処置に安全であると思われる。又、有効性についても有望な徴候が見られた。

ウイルス療法をチェックポイント阻害剤と共に用いる併用療法の幾つかの例が開示されている。国際公開第２０１４／０４７３５０号は、ウイルスゲノムに挿入された抗ＰＤ－１抗体をコードする遺伝子を有する組換え腫瘍溶解性ウイルスを想定している。国際公開第２０１４／０３６４１２号は、単純ヘルペスウイルスを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用して黒色腫を処置する方法に関する。腫瘍で選択的に複製するように設計された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－１に基づく腫瘍溶解性免疫療法であるタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ、商標イムリジック（Ｉｍｌｙｇｉｃ））の第１ｂ／３相試験は、黒色腫においてＧＭ－ＣＳＦを産生し、抗腫瘍免疫応答を刺激し、又、切除不能病期のＩＩＩＢ－ＩＶ黒色腫におけるペンブロリズマブは現在進行中である。

米国特許出願第２０１５００８６５４１号には、免疫刺激細胞傷害性遺伝子療法と免疫チェックポイント調節剤の組合せを放射線療法、化学療法、手術、及び免疫療法を含む他の療法と併用することにより、限局性又は転移性腫瘍の大きさを縮小する又は拡大を遅延させるための方法が開示されている。

黒色腫の処置において、それぞれの処置が２つの異なるチェックポイント阻害剤を標的とする組合せアプローチは、それぞれの処置単独を用いるよりも良好に働くことが示されている。しかしながら、この組合せは、重大な副作用のリスクの増大を伴う。更に、組合せ療法には、種々の癌に対する免疫応答を誘導するように向けられた処置の有効性及び安全性を改善する必要が存在する。よって、更なる癌処置、特に、進行黒色腫に対する癌処置が求められている。

従来、病巣中のウイルスの存在がその効力に必要とされると考えられてきた。今般、本発明者らは驚くことに、ウイルスが局所投与される場合でもそのウイルスによって生じる全身効果を見出した。又、ＯＮＣＯＳ－１０２による強いプライミング期間の後に、元はＰＤ－１阻害剤に対し不応性であった腫瘍がＰＤ－１阻害剤に感受性となったのは驚くべきことであった。

本発明の目的は、患者において癌を処置するため及び又従来の癌療法に関連する問題を克服するための、腫瘍溶解性アデノウイルスと１又は複数のチェックポイント阻害剤の新規な組合せ、腫瘍溶解性アデノウイルスと１又は複数のチェックポイント阻害剤を用いる新規な併用療法を提供することである。

本発明の一態様は、ヒト癌の処置、好ましくは、ヒト悪性黒色腫の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスであり、ここで、前記ウイルスのそれを必要とするヒト患者への投与は、１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与と組み合わせて行われる。

本発明の別の態様は、患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む、患者においてヒト癌、好ましくは、ヒト悪性黒色腫を処置するための方法である。

本発明の更に別の態様は、ヒト黒色腫の処置におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であり、ここで、前記ウイルスは、１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与される。

以下の図は、本発明の特定の態様及び特徴を更に示すために含まれる。本発明は、これらの図面の１以上を、実施例を含む特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照すればより良く理解することができる。

有効性試験における、免疫不全ヒト化マウス中のヒト黒色腫Ａ－３７５細胞に基づく腫瘍の、ＯＮＣＯＳ－１０２単独、チェックポイント阻害剤単独又はチェックポイント阻害剤とＯＮＣＯＳ－１０２との組合せによる処置。Ａ）Ａ－３７５細胞に基づく腫瘍は、免疫不全マウスにおいてウイルス用量依存的感受性を示す。Ｂ）ヒト免疫系は、ヒト化マウスにおいてＡ－３７５腫瘍の成長を阻害するが、非処置の免疫不全マウスでは腫瘍成長は阻害されない。Ｃ）Ａ３７５腫瘍細胞を移植したヒト化ＮＯＧマウスにおける、腫瘍溶解性ウイルスとペンブロリズマブ（キートルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ））の組合せの全身効果を示す。ペンブロリズマブ単独で処置した腫瘍に比べて、ＯＮＣＯＳ－１０２（５×１０⁷ＶＰ）で処置した右側のＳＫ－ＭＥＬ２腫瘍の成長とＯＮＣＯＳ－１０２で処置しなかった左側のＳＫ－ＭＥＬ２腫瘍の成長は両方とも同様に阻害された。ペンブロリズマブ（キートルーダ）単独がＩＰ注射として投与されたマウスの腫瘍は成長速度の低下を示さなかったが、これはＯＮＣＯＳ－１０２の存在が全身効果に必要であったことを示す。Ｄ）ペンブロリズマブ（キートルーダ）とＯＮＣＯＳ－１０２の組合せは、ヒト化マウスにおいて、ＯＮＣＯＳ－１０２、ペンブロリズマブ(pembrolizumb)又はニボルマブ（オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ））単独によりマウスを処置する場合に比べて、Ａ－３７５腫瘍に対して抗腫瘍効果の増強を示す。腫瘍成長分析。Ｎ＝６～８（動物当たり(pen animal)１２～１６腫瘍）。結果を平均＋／－ＳＤとして示す、^*＜０．０５。免疫細胞の浸潤。ヒトＣＤ４５白血球の数を計数し、左側腹部（左のパネル）及び右側腹部（右のパネル）の腫瘍１グラム当たりの細胞数として表した。結果を平均＋／－ＳＤとして表す。Ｎ＝２～６。^*＜０．０５ＯＶ＋キートルーダ２００に対する。免疫細胞の浸潤。ＣＤ３＋白血球中のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の％を左側腹部（左のパネル）及び右側腹部（右のパネル）で定量した。結果を平均＋／－ＳＤとして表す。ｎ＝２～６。^*＜０．０５ ^**＜０．０１ビヒクルに対する。§＜０．０５、§§＜０．０１キートルーダ４００に対する。＃＜０．０５キートルーダ２００に対する。腫瘍上の黒色腫細胞表面のＰＤＬ１の発現。結果を黒色腫細胞中のＰＤＬ１陽性細胞の％として表す。結果は平均＋／－ＳＤを示す。

そうではないことが定義されない限り、本出願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者によって一般に理解されているものを同じ意味を有する。

用語「抗ウイルス応答」は、本明細書で使用する場合、ウイルス感染に対する細胞の応答を指し、例えば、インターフェロンの生産、サイトカイン放出、ケモカインの生産、リンホカインの生産又はそれらの任意の組合せを含む。

表現「正常宿主細胞」及び「正常組織」は、本明細書で使用する場合、完全な抗ウイルス応答を有する非癌、非感染細胞又は組織を指す。

用語「腫瘍溶解性薬剤」は、本明細書で使用する場合、腫瘍細胞の成長を阻害し、且つ／又は腫瘍細胞を死滅させることができる薬剤を指す。

用語「対象」は、本明細書で使用する場合、いずれのヒト及び動物を含む生物、ヒト及び動物組織、及びヒト及び動物細胞も指す。

用語「患者」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるような併用療法による処置から利益を得る可能性のある、黒色腫などの疾患に罹患している対象（好ましくは、ヒト）を指す。

アデノウイルスは、正二十面体カプシドを有する直径７０～９０ｎｍのエンベロープを持たないウイルスである。それらのゲノムは、両末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有し、５’末端に末端タンパク質が結合している、２５～４５キロベースの間の様々な大きさの直鎖二本鎖ＤＮＡである。

正二十面体カプシドは、３つの主要なタンパク質により形成され、そのうちヘキソン三量体が最も多い。カプシドの１２の頂点のそれぞれはまた、ファイバーに共有結合されているペントンベースである五量体タンパク質も含む。ファイバーは、ペントンベースから突き出た三量体タンパク質であり、ノブ付きの棒状の構造である。他のウイルスタンパク質ＩＩＩａ、ＩＶａ２、ＶＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸも又ウイルスカプシドに会合している。タンパク質ＶＩＩ、小ペプチドミュー及び末端タンパク質（ＴＰ）はＤＮＡと会合している。タンパク質Ｖは、カプシドにタンパク質ＶＩを介した構造的連結を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「カプシド」は、ヘキソン、ファイバー及びペントンベースタンパク質を含む、ウイルスのタンパク質の殻を指す。

全てのヒトアデノウイルスは、それらのファイバー構造に類似性を有する。それぞれはＮ末端テール、反復配列を有するシャフト、及び球状構造を有するＣ末端ノブドメインを有する。ノブドメインは、主として標的細胞受容体との結合を担い、その球状構造はラテラル結合及びアピカル結合のために大きな表面を与える。異なるサブグループのアデノウイルスのファイバータンパク質は、長さ及び曲げ能力が最も明確に異なる。

ファイバーはウイルスの標的細胞への付着に関与する。第一に、ファイバータンパク質のノブドメインが標的細胞の受容体に結合し、第二に、ウイルスがインテグリン分子と相互作用し、第三に、ウイルスが標的細胞に内部移行される。次に、ウイルスゲノムがエンドソームから核に運ばれ、ウイルスゲノムの複製が始まり得る。

本明細書で使用する場合、カプシドの「Ａｄ５／３キメラ現象」は、ファイバーのノブ部分がＡｄ血清型３に由来し、ファイバーの残りの部分がＡｄ血清型５に由来するキメラ現象を指す。

アデノウイルスは、ウイルスゲノムを複製するために細胞の機構に依存する。アデノウイルスは休止中の細胞に感染し、それらを、ウイルスＤＮＡ複製を可能とする細胞周期Ｓ期様の状態に誘導することができる。アデノウイルスゲノムは、前初期遺伝子（Ｅ１Ａ）、初期遺伝子（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）、中期遺伝子（ＩＸ、Ｉｖａ）、及び後期遺伝子（Ｌ１－Ｌ５）に分けられる。

Ｅ３遺伝子産物は、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるウイルス複製には必須ではないが、種々の宿主免疫応答の制御のために供される。Ｅ３－ｇｐ１９Ｋは、小胞体（ＥＲ）から原形質膜へのクラス１主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の輸送を阻害し、それによりＭＨＣによるＴリンパ球へのペプチドの提示を妨げる。

アデノウイルスＥ１Ａタンパク質は、当初は、休止中の正常細胞においてＤＮＡ複製を誘導することができるｐＲｂ結合タンパク質として記載されていた。Ｅ１Ａタンパク質の重要な機能の１つは、ｐＲｂ－Ｅ２Ｆ相互作用を乱し、それによりＥ２Ｆ転写因子を放出してＥ２Ｆ反応性プロモーター及びそれらのプロモーターが制御するアデノウイルスＥ２Ａなどの遺伝子の転写を活性化することである。Ｅ１Ａタンパク質の保存された領域２（ＣＲ２）はｐＲｂのポケット結合ドメインと強い相互作用を形成し、ＣＲ１は、ｐＲｂのＥ２Ｆ結合の事実上の破壊を媒介する。ＣＲ２の２４塩基対の欠失を特徴とする条件付き複製ウイルスが作出され、神経膠腫及び乳癌異種移植片の処置において強力且つ選択的であることが示されている。それらの癌特異性は、機能不全Ｅ１ＡがＥ２Ｆ１転写因子を放出できないことに起因し、これは遊離型Ｅ２Ｆ１要求をもたらす。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、初期には国際公開第２０１０／０７２９００号に開示されている。ＯＮＣＯＳ－１０２は、Ａｄ５ゲノムとは異なる以下の改変を示す血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）である：
１．Ｅ１Ａ－遺伝子定常領域２（ＣＲ２）における２４塩基対（ｂｐ）の欠失。機能不全Ｅ１Ａタンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）からＥ２Ｆ１転写因子と結合しＥ２Ｆ１転写因子を放出することはできず、アデノウイルス遺伝子転写のために遊離型Ｅ２Ｆ１の要求をもたらす。遊離型Ｅ２Ｆ１は癌細胞に豊富であり、癌細胞ではｐＲｂ経路がほとんどの場合で破壊されている。それにより、Ｅ１Ａに２４ｂｐの欠失を有するウイルスは、癌細胞において効率的に複製することができる。Ｅ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡへの転写は、内因性Ｅ１Ａプロモーターにより制御されている。
２．９６５ｂｐの欠失が、６．７Ｋ及びｇｐ１９Ｋタンパク質をコードする初期３（Ｅ３）領域に導入されている。これらのタンパク質は、宿主の免疫制御機構を逃れるアデノウイルスの能力と関連し、それらの機能はアデノウイルス複製のために供される。
３．ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子がＥ３領域に、６．７Ｋ及びｇｐ１９Ｋに置き換えて挿入されている。ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のｍＲＮＡへの転写は、内因性のＥ３プロモーターにより制御されている。言い換えれば、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスでは、ウイルス遺伝子ｇｐ１９Ｋ及び６．７Ｋをコードする９６５塩基対がＥ３領域から欠失され、それらに取って代わって導入遺伝子ＧＭ－ＣＳＦが導入されている。
４．血清型５ファイバーノブは血清型３ファイバーによって置き換えられ、それにより血清型５受容体ＣＡＲの代わりに血清型３受容体を介してウイルスの細胞への侵入を可能としている。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスでは、天然型Ｅ１Ａプロモーターが存在し、すなわち、それは他のプロモーターで置換されていない。

要するに、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスでは、ＧＭ－ＣＳＦは内因性ウイルスＥ３制御エレメント下にあり、これにより、感染約８時間後に複製関連の導入遺伝子の発現が得られる。ウイルスは腫瘍選択的に複製し、よって、腫瘍に限定されるＧＭ－ＣＳＦの産生が生じる。腫瘍特異性は、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位を排除する２４ｂｐの欠失によって達成され、従前の報告で示されているように、ウイルスは、全てではないとしてもほとんどのヒト癌を含む、ｐ１６－Ｒｂ経路の欠陥を有する細胞で選択的に複製する。ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの腫瘍溶解性効力は、野生型対照ウイルスよりも有効であることが示された。

ＧＭ－ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍溶解によって癌細胞に直接作用しつつ抗癌免疫を誘導する。ＧＭ－ＣＳＦは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、主として樹状細胞の動員及び成熟、並びに自然免疫系の細胞の動員に関連する全身性抗腫瘍免疫の強力なインデューサーである。しかしながら、全身で上昇したサイトカインレベルは、毒性副作用のリスクを表す。高血清濃度のＧＭ－ＣＳＦにより媒介される副作用の直接的リスクの他、間接的リスクは骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の動員に起因する。ＭＤＳＣの免疫抑制作用は一般に癌患者に潜在的に有害であるが、それは癌免疫療法に関しては特に逆効果であり得る。よって、ＧＭ－ＣＳＦ発現を腫瘍部位に限定することが重要である。

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、良好な腫瘍溶解能及びｉｎｖｉｔｒｏにおいて機能的に活性なヒトＧＭ－ＣＳＦの産生を示した（Ｋｏｓｋｉら２０１０）。免疫応答性ハムスターでは、ウイルスが侵攻性同系膵臓腫瘍の成長の阻止に有効であることが示された。腫瘍におけるウイルスの複製の証拠が、ウイルスコピー数を測定することによって示された。複製の選択性は、直接注入された肝臓組織ではウイルスコピー数の増加が無かったことから証明された。局部的複製に関連した腫瘍内でのＧＭ－ＣＳＦの産生は証明されたが、ＧＭ－ＣＳＦの血清又は肝臓への漏出は極めて少なかった。又、低用量シクロホスファミドとＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを組み合わせると抗腫瘍効果を増強することができるが、シクロホスファミド処置単独は腫瘍成長の有意な低下をもたらさなかったことも示された。

全体的に見れば、進行癌患者のＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスによる処置は、安全であると思われ、又、潜在的有効性の有望な徴候も見られた。ウイルスは単回投与の後でも長期間血清中に存在するが、複数回の注射は腫瘍形質導入を向上させ、抗腫瘍免疫を増強する可能性がある。

本明細書で使用する場合、用語「免疫チェックポイント阻害剤」又は「チェックポイント阻害剤」は、１以上のチェックポイントタンパク質を全面的若しくは部分的に低減する、阻害する、前記タンパク質に干渉する又は変調する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化又は機能を調節する。免疫チェックポイント過程の中枢は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)（ＣＴＬＡ－４）及びプログラムされた細胞死１(programmed death 1)（ＰＤ－１）免疫チェックポイント経路である。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１経路は、免疫応答の異なる段階で作動すると思われる。ＣＴＬＡ－４は、それが一般にリンパ節においてナイーブＴ細胞の活性化の初期段階で潜在的に自己反応性のＴ細胞を停止させることから、免疫チェックポイント阻害剤の「リーダー」と考えられる。ＰＤ－１経路は、主として末梢組織において免疫応答の後の段階で、事前に活性化されたＴ細胞を調節する。

進行中の患者は、腫瘍細胞又は腫瘍浸潤免疫細胞のいずれかによるＰＤ－Ｌ１アップレギュレーションを欠くことが示されている（Ｒｏｍａｎｏら２０１５）。よって、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路を標的とする免疫療法は、この免疫抑制軸が作動している腫瘍で特に有効である可能性があり、このバランスを免疫保護環境に向かって逆転させることが既存の抗腫瘍免疫応答を再燃させ、強化するであろう。モノクローナル抗体は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１／ＰＤ－１ＬなどのＴ細胞免疫応答に負の調節を行う細胞相互作用を遮断して既存の免疫を増幅し、それにより抗腫瘍免疫応答を誘発することができる（Ｓａｇｉｖ－Ｂａｒｆｉら２０１５）。

よって、ＰＤ－１は感染に対する炎症性応答時に末梢組織においてＴ細胞の活性を制限し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて自己免疫ＰＤ－１遮断を制限することは、特定の抗原標的による又は混合リンパ球反応における同種異系細胞による刺激に応答してＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を促進する。ＰＤ－１遮断は、ＰＤ－１又はそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１と結合する抗体を含む多様な機構によって達成することができる。

免疫チェックポイント経路の阻害は、数種の新薬：イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）））、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１；キートルーダ（登録商標））、及びニボルマブ（抗ＰＤ－１；オプジーボ（登録商標））の承認に至っている。又、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＰＤＬ３２８０）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）（ＭＥＤＩ４７３６）などのＰＤ－Ｌ１阻害剤が利用可能である。これらのアンタゴニスト抗体は、癌患者における客観的臨床奏効と関連している。ＣＴＬＡ－４を標的とする抗体は、転移性黒色腫のために既に上市されている（例えば、イピリムマブ、すなわちヤーボイ、ブリストルマイヤーズスクイブ、すなわちＢＭＳ）。抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Ｒｏｃｈｅ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ、ＢＭＳ）による抗体療法も進行中である。

他の免疫チェックポイント阻害剤としては、可溶性Ｉｇ融合タンパク質であるリンパ球活性化遺伝子－３(lymphocyte activation gene-3)（ＬＡＧ－３）阻害剤、例えば、ＩＭＰ３２１が含まれる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、Ｂ７阻害剤、例えば、Ｂ７－Ｈ３及びＢ７－Ｈ４阻害剤が含まれる。特に、抗Ｂ７－Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１。又、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3)）阻害剤が含まれる。

特定の実施形態では、ＰＤ－１遮断薬としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がある。特定の他の実施形態では、ＰＤ－１遮断薬としては、抗ＰＤ－１抗体及び類似の結合タンパク質、例えば、リガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２と結合してそれらのリガンドによるＰＤ－１の活性化を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ９３６５５８、ＯＮＯ４５３８）；ＰＤ－１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体であるラムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＳＣＨ９００４７５）；ＰＤ－１と結合するヒト化抗体であるＣＴ－０１１；ＡＭＰ－２２４は、Ｂ７－ＤＣの融合タンパク質である；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５－０１）が含まれる。特定の実施形態で使用可能なＰＤ－Ｌ１阻害剤の更なる例は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びデュルバルマブである。

好ましくは、本発明では抗ＰＤ－１抗体ペンブロリズマブ（キートルーダ）、及びニボルマブ（オプジーボ）が使用される。又、デュルバルマブなどのＰＤ－Ｌ１阻害剤も抗ＰＤ－１－抗体と併用可能である。よって、本発明の好ましいチェックポイント阻害剤はＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１に対するものである。

ペンブロリズマブ（キートルーダ）及びニボルマブ（オプジーボ）は、皮膚の黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、及びホジキンリンパ腫を含む数種類の癌の処置に役立つことが示されている。それらは又、多くの他の種類の癌に対する使用についても研究されている。デュルバルマブ及びトレメリムマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体）の第１Ｂ相臨床試験では、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において幾らかの活性が認められた。進行転移性尿路上皮膀胱（治験１１０８）における第１相データは、ＦＤＡブレークスルー指定に至った。更に、肺癌患者におけるデュルバルマブとゲフィチニブを組み合わせた第Ｉ相治験の初期結果は「有望性が示された」。ＰＤ－Ｌ１を標的とする薬物の更なる例は、アテゾリズマブ（テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ））である。この薬物は膀胱癌の処置に使用することができ、他の種類の癌に対する使用についても研究されている。

ＯＮＣＯＳ－１０２を１以上のチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用する本発明の方法によって処置可能な癌種は、例えば、黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌及び扁平非小細胞肺癌）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、中皮腫、及び肝臓癌である。好ましくは、本発明を用いて処置される癌は進行黒色腫である。

黒色腫は、神経冠に由来する細胞であるメラノサイトの腫瘍である。黒色腫は主として成人に生じ、これらの症例の半数以上は皮膚の見かけ上正常な領域に生じる。ほとんどの黒色腫は皮膚に生じるが、それらは又粘膜表面からも若しくは神経冠細胞が移動する他の部位においても生じ得る。「悪性黒色腫」又は「黒色腫」は、本明細書で使用する場合、メラノサイトとして知られる色素含有細胞から発生する癌の一種を指す。黒色腫は一般に皮膚に生じるが、口腔、腸、又は眼にも稀に生じることがある。黒色腫が身体の他の場所に拡散すると、それは転移性、又は進行と呼ばれる。よって、「進行黒色腫」は本明細書で使用する場合、転移性黒色腫である。進行黒色腫は、本明細書に記載されるような併用療法の主要な標的である。

黒色腫患者の予後は、臨床因子及び組織学的因子によって、並びに病変の解剖学的場所によって影響を受ける。黒色腫の厚さ及び／又は浸潤のレベル、腫瘍浸潤リンパ球、***指数、及び原発部位の潰瘍化又は出血は予後に影響を及ぼす。臨床的病期分類は、腫瘍が所属リンパ節又は遠隔部位に拡散しているかどうかに基づく。黒色腫は、局所進展（リンパ管を経る）及び／又は血液経路によって遠隔部位に拡散し得る。いずれの器官も転移に関与する可能性があるが、肺及び肝臓が一般的な部位である。

ステージＩＶ黒色腫（すなわち、進行黒色腫）は、遠隔リンパ節又は身体の他の領域に既に拡散しているので治癒が難しい場合が多い。成人における切除不能の又は進行した黒色腫のための従来の非外科的療法には、化学療法（ダカルバジン、テモゾロミド、若しくは他の薬剤単独又は組合せ）、又はインターロイキン－２が含まれる。客観的奏効をもたらした治療計画もあるが、それらは通常短期的であった。ＢＲＡＦ阻害（ベムラフェニブ）及び免疫刺激薬（イピリムマブ）などのより新しい療法が、限定されたパーセンテージの被処置患者に関して、対照処置に比べて全生存期間に有意な改善を示したが、毒性が問題となる。

進行黒色腫の処置は近年、より新しい形態の免疫療法として変化を遂げ、標的化された薬物は化学療法よりも有効であることが示された。黒色腫に対する現行の免疫療法アプローチは、７つの主要なカテゴリーに入る：チェックポイント阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌ワクチン、アジュバント免疫療法、養子細胞療法、モノクローナル抗体、及びサイトカイン。癌免疫療法における中心概念は、通常Ｔ細胞により認識される腫瘍細胞は、末梢性免疫寛容を活用することによって宿主免疫系を逃れる方法を発達させたということである。ペンブロリズマブ（キートルーダ）、ニボルマブ（オプジーボ）、及びイピリムマブ（ヤーボイ）などのチェックポイント阻害剤は、進行黒色腫を有する一部の患者の余命の延長につながることが示された。

「化学療法」は、本明細書で使用する場合、化学療法という用語はほとんどの場合癌の処置に関連するが、疾患の処置における化学化合物又は薬物の使用を指す。癌化学療法化合物は、１００近い各個の薬物を包含する。

先に開示したように、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを用いた癌療法並びにチェックポイント阻害剤を用いた療法は、単独で使用した場合に幾らかの有効性を示した。本発明者らは、アデノウイルス遺伝子療法とチェックポイント阻害剤の組合せが進行黒色腫の処置においていずれか一方単独よりも有効であり得るかどうか検討したかった。特に、本発明者らは、チェックポイント阻害剤による前治療に応答するのを止めた進行黒色腫がＯＮＣＯＳ－１０２で処置した場合に応答を始めるかどうかに関心を持った。

「併用療法」は、本明細書で使用する場合、必要とする患者に投与されるＯＮＣＯＳ－１０２及び１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与を指す。好ましくは、ＯＮＣＯＳ－１０２は、ペンブロリズマブなどの抗ＰＤ－１抗体と併用される。又、ＯＮＣＯＳ－１０２と２つの抗ＰＤ－１抗体の組合せ、抗ＰＤ－１抗体と１つの抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は２つの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組合せを、それを必要とする患者に投与することができる。

従前の試験では、一部の患者がＰＤ－１阻害剤処置に耐性を獲得したという事態が起こった。恐らく、問題は腫瘍に対して基礎にある免疫が存在しないことであり、この場合、チェックポイント阻害剤は、免疫抑制を低下させるが免疫を生じないので有効でない。

本発明者らは、ＯＮＣＯＳ－１０２が、処置前に腫瘍特異的Ｔ細胞応答が検出できなかった患者において腫瘍特異的Ｔ細胞応答（末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞）を誘導したことを初期に示した（Ｒａｎｋｉら２０１４、Ｒａｎｋｉら２０１６及びＶａｓｓｉｌｅｖら２０１５）。更に、処置後のＰＤ－Ｌ１のアップレギュレーションの形で示される癌細胞における動的適応変化が見られ、従って、ＯＮＣＯＳ－１０２はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤などのチェックポイント阻害剤に応答するように腫瘍をプライミングするのを助ける可能性があることを示唆する。

併用療法では、ウイルス及び又１又は複数のチェックポイント阻害剤は、数日の間に数用量で投与されてよい。治療プロトコールは、まず、ウイルスでプライミングした後にチェックポイント阻害剤を投与し、その後、所望によりウイルス及びチェックポイント阻害剤の両方の投与を継続することを含む。又、逆の順序の投与も使用可能であり、すなわち、まず、１又は複数のチェックポイント阻害剤でプライミングした後にウイルスを投与し、その後、所望により、ウイルス及びチェックポイント阻害剤の両方の投与を継続する。

用語「プライミング」は、本明細書で使用する場合、例えば、まず細胞をチェックポイント阻害剤の効果に増感させるために腫瘍溶解性ウイルスを投与することを指す。又、チェックポイント阻害剤は、ウイルスを投与する前に細胞を増感させるために使用することができる。「プライミング」は又、アポトーシスを誘導する前処置の使用も指し得る。腫瘍溶解性ウイルスを用いて行われる腫瘍プライミングは免疫原性癌細胞死をもたらし、これは細胞表面でのカルレティキュリンの提示並びに天然アジュバント、具体的には、瀕死の細胞内からの高移動度グループタンパク質Ｂ１(high-mobility group protein B1)（ＨＭＧＢ１）及びＡＴＰの放出を伴い、やがてＤＣ刺激及び続いての適応免疫応答の活性化に至る。このウイルスにより誘導される腫瘍環境の変化は、意義のある抗腫瘍免疫応答のプライミングに不可欠である。抗原提示細胞は瀕死の腫瘍細胞から腫瘍抗原を捕捉し、それらをＭＨＣクラスＩ及びＩＩ提示のために処理し、所属リンパ節に移動し、抗原特異的Ｂ細胞及びＴ細胞を刺激する。

「ウイルス増感剤」は、本明細書で使用する場合、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を改善することができる薬剤を指す。このような併用療法に好適な又はウイルス増感剤として使用可能な薬剤としては、限定されるものではないが、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが含まれる。好ましくは、使用されるウイルス増感剤は、シクロホスファミドである。

本明細書で使用する場合、「同時」は、本明細書に記載されるような併用療法の前、後又は同時に投与された薬物又は療法を指す。同時療法の期間は、数分から数週間まで可変である。一般に、本明細書に記載されるような併用療法と同時に行われる療法は数日又は数週間続く。

本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、意図される結果を遂行できる化合物、治療薬、ウイルス又は薬物の量を指す。例えば、有効量のチェックポイント阻害剤及び／又はアデノウイルスは、臨床結果を含む有益な又は所望の臨床結果を果たすために十分な量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。本明細書に記載されるように、有効量は、悪性黒色腫を改善する、安定化する、逆転させる、その進行を緩徐化する及び／若しくは遅延させる、又は悪性黒色腫を治癒するために十分な量である。本発明では、チェックポイント阻害剤及びＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの効果は、例えば、前記処置に対する腫瘍反応を監視することによって監視することができる。腫瘍反応の監視は、当技術分野で公知のいずれの好適な方法で行ってもよい。この監視は、例えば、Ｒａｎｋｉら（２０１４）に挙げられているものなど、細胞の免疫学的状態を評価する方法を用いて行うことができる。例えば、監視は、腫瘍内で腫瘍浸潤リンパ球の存在を評価することによって行うことができ、ＴＨ１型応答はマイクロアレイを用いて監視することができ、又、ＩＦＮγ酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）も監視に使用することができる。

よって、有効量は、腫瘍において所望の効果又は反応を生じさせ得る又は生じさせるのに必要とされる量である。当技術分野で理解されるように、有効量は、とりわけ、患者病歴並びに使用されるチェックポイント阻害剤の種類及び／又は用量などの他の要因によって異なる場合がある。

本明細書で使用する場合、用語「処置期間」は、併用療法が行われる期間を指す。処置期間は、ＯＮＣＯＳ－１０２及びチェックポイント阻害剤の数回の投与からなってよく、ここで、それらの投与はサイクルで行うことができる。処置期間は数週間又は数ヶ月続き得る。処置期間は最大１年続き得る。

本明細書で使用する場合、用語「投与期間」は、アデノウイルス、チェックポイント阻害剤、又は他の薬剤が患者に投与される期間を指す。この投与期間中に、単一用量又は複数用量の対象薬剤を投与することができる。投与期間は、数分、数時間、数日、数週間又は数ヶ月であり得る。投与期間は、サイクルからなってよい。例えば、１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与において３週間（２１日）のサイクルを使用することができる。

ペンブロリズマブ（キートルーダ）は通常、３週間に一用量として投与されるが、低用量を毎週投与するなどの他のサイクルを使用することもできる。ニボルマブ（オプジーボ）は通常、２週間に一用量として投与されるが、低用量を毎週投与するなどの他のサイクルを使用することもできる。

治療組成物(Therapeutic ccompositions)は一般に、特定の投与経路に対して調剤される。本明細書に記載されるような併用療法では、ペンブロリズマブなどのチェックポイント阻害剤はその有効濃度で使用される。一例として、ペンブロリズマブは、２１日サイクルが使用される場合には、各２１日サイクルの１日目に１０分間かけて静注（ｉ．ｖ．）で投与することができる。

本発明のもう１つの目的は、ヒト黒色腫、特に、進行ヒト黒色腫の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスであり、このウイルスは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与され、ここで、チェックポイント阻害剤はペンブロリズマブである。

本発明の幾つかの実施形態では、ＯＮＣＯＳ－１０２及び１又は複数のチェックポイント阻害剤に加えて、シクロヘキサミド、シアノコボラミン(Cyanocobolamine)、フォラティックアシッド(Folatic acid)及びデキサメタゾンの種々の組合せも使用することができる。より具体的には、シクロヘキサミド、シアノコボラミン、フォラティックアシッド及びデキサメタゾンからなる薬剤リストから１つ、２つ、３つ又は４つ及びそれらの任意の組合せが、ＯＮＣＯＳ－１０２及びチェックポイント阻害剤を含む併用療法と同時に使用可能である。一例として、記載の併用療法の薬剤の投与前、投与中、及び投与後に過敏反応を軽減又は排除する１以上の補助薬、例えば、併用療法の薬剤の投与前、投与中、及び投与後にデキサメタゾン、葉酸、及びビタミンＢ１２のうち１以上で対象を処置することができる。特定の実施形態では、対象は、併用療法の薬剤投与の前日、当日、及び後日に２～２５ｍｇのデキサメタゾンの経口投与；併用療法の薬剤の投与の７日前から始まる期間中、少なくとも１回の処置期間中、及び併用療法の最後の薬剤投与の後２１日間に４００～１０００μｇの葉酸の経口投与；並びに処置期間中、併用療法の最初の薬剤投与の１週間前の１０００μｇのビタミンＢ１２の筋肉内投与で処置される。

必要とする患者にＯＮＣＯＳ－１０２を投与するためにいずれの従来法を使用してもよい。投与経路は、組成物の調剤法又は形態、疾患、腫瘍の場所、患者、併存疾患及び他の要因によって異なる。本発明の好ましい実施形態では、投与は、腫瘍内、筋肉内、動脈内、胸膜内、小胞体内、腔内若しくは腹腔内注射、又は経口投与によって行われる。好ましくは、投与は、腫瘍内注射又は腹腔内注射として行われる。

注射は、腫瘍の場所及び大きさに応じて各患者で個別化することができる。例えば、ウイルスは、０．５ｍｌ～１０ｍｌの容量で注射（ｉ．ｔ．）することができる。注射は、数か所、好ましくは、最大５か所の異なる腫瘍部位に行うことができる。腹腔内投与の容量は、２００ｍｌ～８００ｍｌで可変である。好ましくは、投与される容量は５００ｍｌである。

ベクターの有効用量は少なくとも、処置を必要とする対象、腫瘍種、腫瘍の場所及び腫瘍のステージによって異なる。用量は、例えば、約１０⁸ウイルス粒子（ＶＰ）～約１０¹⁴ＶＰ、好ましくは約５×１０⁹ＶＰ～約１０¹³ＶＰ、より好ましくは約８×１０⁹ＶＰ～約１０¹²ＶＰで可変である。本発明の１つの特定の実施形態では、用量は、約５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である。よって、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの投与量は、５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲であり得る。好ましくは、ＯＮＣＯＳ－１０２は、３×１０¹¹ＶＰで投与される。他方、プラーク形成単位で表すと、ＯＮＣＯＳ－１０２は、前記患者の進行黒色腫などの腫瘍中への直接注射によって、又は腹腔内に、約１０⁸～１０¹²プラーク形成単位の用量で投与することができる。

本発明の１つの目的は、ウイルスがペンブロリズマブなどのチェックポイント阻害剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与され、ウイルスの量は５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰである場合の、進行黒色腫などのヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明のもう１つの目的は、ウイルスがチェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与され、ウイルスは３×１０¹¹ＶＰ／５ｍｌの量で投与される場合の、進行黒色腫などのヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更なる態様は、ウイルスがチェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与され、チェックポイント阻害剤及びウイルスは有効量で投与される場合の、進行黒色腫などのヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更に別の目的は、ウイルスがチェックポイント阻害剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与され、ウイルスは腹腔内に又は腫瘍中への直接注射によって投与され、１又は複数のチェックポイント阻害剤は静脈内又は腹腔内に投与される場合の、進行黒色腫などのヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の一態様によれば、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスは、進行黒色腫などのヒト癌の処置において使用するためのものであり、ここで、ウイルスは、チェックポイント阻害剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与され、ウイルスは、１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与前及び前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも投与される。

１つの好ましい実施形態によれば、併用療法の薬剤は、まず、１日～１０か月の期間中、一用量又は１～１０回ウイルスを投与してプライミングし、次に例えば、ウイルス投与を開始した１～４週間後にチェックポイント阻害剤を投与することによって投与することができる。投与は、例えば、下記の一連の順序であってよい：ウイルスでのプライミングは、必要とする対象に８日の間に３回（１、４、８日目）ウイルスを投与することにより行われ、次に、ペンブロリズマブ（キートルーダ）が２１日目に投与され、以降は３週間毎に投与される。よって、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ペンブロリズマブの投与は、ウイルス投与開始の３週間後に始めることができる。１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与は、投与が例えば、約３週間サイクルで合計６回行われるように継続することができる。投与回数は、１～６回で可変である。

本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、ビリオンにより媒介される腫瘍細胞の溶解を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。本発明の好ましい実施形態では、その方法又は使用は、対象において制御性Ｔ細胞のダウンレギュレーションを可能とする物質の投与を更に含む。「制御性Ｔ細胞をダウンレギュレーションできる物質」」は、Ｔ－サプレッサー又は制御性Ｔ細胞として同定される細胞の量を低減する薬剤を指す。これらの細胞は、以下の免疫表現型マーカー：ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ１２７－及びＧＩＴＲ＋の１つ又は多数からなることが確認されている。Ｔ－サプレッサー又は制御性Ｔ細胞を低減するこのような薬剤は、抗ＣＤ２５抗体又は化学療法薬からなる群から選択され得る。

導入遺伝子ＧＭ－ＣＳＦの免疫調節機能は、武装した腫瘍溶解性アデノウイルスの中枢的作用機序であり、加えて、アデノウイルスそれ自体は、免疫系の強力な活性化因子であり、これはウイルスの全体的な抗腫瘍有効性に大きく寄与する。

本発明のもう１つの態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行悪性黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及びチェックポイント阻害剤を、癌細胞を死滅させるために又は癌細胞の成長を妨げるために十分な量及び時間で投与する工程を含む方法である。

本発明の１つの好ましい態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行悪性黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記処置はチェックポイント阻害剤ペンブロリズマブを投与することを含む方法である。

本発明のもう１つの好ましい態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記ウイルスがまず、前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間の開始前に投与され、前記ウイルスは又前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも投与することができる方法である。

本発明の更にもう１つの好ましい態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記患者に、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが１～１０回投与され、１又は複数のチェックポイント阻害剤が１～６回投与される方法である。

本発明の更にもう１つの好ましい態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの投与量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である方法である。

本発明の更にもう１つの好ましい態様は、患者においてヒト癌、例えば、進行黒色腫を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ（キートルーダ）３週間毎２ｍｇ／ｋｇ、ニボルマブ（オプジーボ）２週間毎２ｍｇ／ｍｇ及びデュルバラマブ(durvalamab)４週間毎２０ｍｇ／ｋｇ又は２週間毎１０ｍｇ／ｋｇとして投与される方法である。デュルバルマブは、４週間毎に１回、合計１２回の４週サイクルの間、ＩＶ注入により投与することができる。

本発明の更なる態様は、ヒト癌、例えば、進行悪性黒色腫の処置におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される使用である。

本発明のなお更なる態様は、ウイルスがそれを必要とする患者に１、２又は３つのチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される場合の、ヒト癌、例えば、進行黒色腫の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明のなお更なる態様は、必要とする患者に、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが１～１０回投与され、チェックポイント阻害剤が１～１５回投与される場合の、ヒト癌、例えば、進行黒色腫の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

患者へのシクロホスファミド（ＣＰＯ）の同時投与は、併用療法の期間中に行うことができる。シクロホスファミドは、いくつかの自己免疫疾患にも使用されている一般的な化学療法薬である。シクロホスファミドは、いくつかの機構を介して腫瘍溶解性ウイルスの有効性を改善することが示されている。シクロホスファミドは、自然免疫の抗ウイルス応答を低下させ、抗腫瘍溶解性ウイルス中和抗体の生成を緩慢にし、Ｔ－ｒｅｇを標的とすることができ、且つ、腫瘍の血管系に影響を及ぼして腫瘍溶解性ウイルスの管外遊出を促進し得る。いくつかの前臨床試験で、シクロホスファミドは腫瘍溶解性ウイルスの免疫クリアランスを遅らせ、ウイルス感染の持続性を高め、治療効力を延長させ得ることが示された。本発明では、シクロホスファミドはウイルス複製を増強するための、並びに腫瘍に対する免疫応答の増強のためにＧＭ－ＣＳＦにより誘導されるＮＫ及び細胞傷害性Ｔ細胞の刺激の効果を増強するための、ウイルス増感剤として使用することができる。シクロホスファミドは、静脈ボーラス用量又は低用量経口メトロノミック投与として使用することができる。本発明の実施形態において使用することができる他の好適なウイルス増感剤としては、テモゾロミド及びエルロチニブが含まれる。

制御性Ｔ細胞を低減するために、患者はＯＮＣＯＳ－１０２の初回注射の１～４日前に低用量ＣＰＯを投与される。ＣＰＯは、例えば、３００ｍｇ／ｍ²のｉ．ｖ．ボーラスとして投与される。ボーラスは、１００～６００ｍｇ／ｍ²間で可変である。ＣＰＯの投与経路は又、例えば、経口投与であってもよい。又、メトロノミック化学療法も使用可能である。

葉酸も又、併用療法の開始前及び併用療法中にも患者に投与することができる。葉酸の投与は、併用療法の化学療法薬の初回用量の投与の少なくとも５日前に開始することができる。例えば、この投与は、併用療法の薬剤投与の開始の１～２週間前に開始することができる。葉酸は毎日投与することができ（経口投与；ＰＯ）、この投与は併用療法中にも継続することができる。この投与は、併用療法の薬剤の最終用量の約３週間後まで継続することができる。葉酸の典型的な用量は４ｍｇ（ＰＯ）である。本発明の１つの好ましい態様は、必要とする患者において黒色腫を処置するための方法であって、（ａ）前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及びチェックポイント阻害剤を投与する工程と、前記患者に葉酸を投与する工程を含む方法である。

シアノコボラミン（ビタミンＢ１２）は、併用療法の開始前及び併用療法中にも患者に投与することができる。シアノコボラミンの投与は一般に、併用療法の薬剤投与の開始の１～２週間前に開始される。シアノコボラミンは、例えば、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）として９週間隔で及び併用療法中にも投与することができる。この投与は、併用療法の薬剤の最終用量の約３週間後まで継続することができる。シアノコボラミンの典型的な量は１０００ｍｃｇ（μｇ）である。本発明の１つの好ましい態様は、必要とする患者において黒色腫を処置するための方法であって、（ａ）前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及びチェックポイント阻害剤を投与する工程と、前記患者にシアノコボラミンを投与する工程を含む方法である。

葉酸及びシアノコボラミンは一般に、処置に関連する血液毒性及び消化管毒性を軽減するために使用される。

デキサメタゾンも又、併用療法下にある患者に投与することができる。一般に、デキサメタゾンは、併用療法の他の薬剤の投与前日、当日及び翌日に投与される。デキサメタゾンは、４ｍｇＢＤ（すなわち、１日２回）で５日間、及び３週頻度で最大６サイクル投与することができる。本発明の１つの目的は、必要とする患者において黒色腫を処置するための方法であって、（ａ）前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及びチェックポイント阻害剤を投与する工程と、（ｂ）前記患者にデキサメタゾンを投与する工程を含む方法である。

本明細書に記載されるような併用療法は、患者へのシクロホスファミドの投与を更に含み得る。本発明の１つの目的は、必要とする患者において黒色腫を処置するための方法であって、（ａ）前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び２つの化学療法薬を投与することを含み、工程（ａ）の前に前記患者にシクロホスファミドを投与することを含む方法である。

本発明の１つの更なる態様は、患者において腫瘍成長を低減するための方法であり、前記方法は、前記患者において腫瘍成長が低減された条件下で前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。

この方法は、併用療法を投与する前に腫瘍を有するとして患者を特定することを含み得る。腫瘍診断はいずれの従来法で行ってもよい。患者は、例えば、画像診断技術を用いて腫瘍を有するとして特定することができる。この方法は、患者に対する併用療法の投与後に腫瘍成長の低減を評価することを更に含み得る。腫瘍の低減はいずれの従来法によって検討してもよい。腫瘍成長の低減は、例えば、画像診断技術を用いて評価することができる。

本発明のもう１つの態様は、腫瘍の成長を阻害するための併用療法の使用である。腫瘍成長の阻害の証拠は、例えば、腫瘍質量の減少及び腫瘍体積の減少であり得る。加えて、併用療法は、腫瘍の拡散を阻害するために使用することもできる。

又、処置に関連する病変サイズの増大に相当する腫瘍の偽性進行は、腫瘍サイズに及ぼす現併用療法の効果を明らかにすることを意図するイメージング追跡調査の結果に影響を及ぼすことがあることにも留意されたい。この種の影響は、化学療法と放射線療法を組み合わせた後に患者の約３０％に見出されている。よって、偽性進行は、本明細書に記載されるような併用療法が使用される場合には、患者の特定の一部に存在することがある。それらの患者については、腫瘍サイズの低減は、その療法の有効性の適切な指標ではない。

又、癌細胞の成長を低減する方法であって、処置を必要とする対象に有効量のＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与することを含む方法も開示される。

患者をＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤で処置することからなり、チェックポイント阻害剤がＰＤ－１若しくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、又はそれらの任意の組合せである、ヒト患者において腫瘍又は癌細胞を阻害する又は死滅させる方法も又開示される。

更に、腫瘍又は癌細胞をＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス、１又は複数のチェックポイント阻害剤と接触させることを含み、チェックポイント阻害剤がＰＤ－１若しくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、又はそれらの任意の組合せである、腫瘍又は癌細胞を死滅させる方法も開示される。

更に、単独で投与されるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス又は前記ウイルスを伴わずに投与される１又は複数のチェックポイント阻害剤の効果に比べて増強された治療効果を有する併用療法を提供するために、必要とする対象に有効量のＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び有効量の１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与することを含む、ヒト癌、例えば、進行黒色腫を処置するための方法も開示される。

本発明の実施形態において、ＯＮＣＯＳ－１０２は、ｉｎｓｉｔｕ癌ワクチンとして働く。本明細書で使用する場合、「ｉｎｓｉｔｕ癌ワクチン」は、腫瘍細胞の死滅と腫瘍細胞に対する免疫応答の増強の両方を行う癌ワクチンを指す。ウイルス複製は、免疫系に対する強く危険なシグナル（＝ＴＨ１型応答に必要とされる）であり、従って、ＧＭ－ＣＳＦにより媒介されるＡＰＣの成熟及び活性化、並びにＮＫ細胞の動員に対する強力な補助刺激現象として働く。腫瘍細胞溶解は又、腫瘍断片及びエピトープをＡＰＣに提示する助けをし、更に、補助刺激は炎症によっても生じる。よって、エピトープ非依存的（すなわち、非ＨＬＡ拘束的）応答が各腫瘍に関して惹起され、従って、ｉｎｓｉｔｕで起こる。腫瘍特異的免疫応答は、腫瘍環境において、腫瘍細胞溶解時に瀕死の細胞から特異的腫瘍抗原が放出される際に活性化される。

本発明の好ましい実施形態では、この方法又は使用は、対象への同時的放射線療法の投与を更に含む。

本発明の好ましい実施形態では、この方法又は使用は、対象への自己貪食誘導剤の投与を更に含む。自己貪食は、リソソーム機構を介した細胞の自己成分の分解に関わる異化過程を指す。「自己貪食誘導剤」は、自己貪食を誘導することができる薬剤を指し、限定されるものではないが、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、テムシロリムス、シロリムス及びテモゾロミドからなる群から選択され得る。本発明の特定の実施形態では、この方法は、対象へのテモゾロミドの投与を更に含む。テモゾロミドは、経口又は静脈内テモゾロミドのいずれかであり得る。

よって、本発明の目的は、ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与される場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本明細書に記載されるような併用療法では、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤は、数用量で異なる時点で投与することができる。

本発明のもう１つの目的は、ヒト癌が進行黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、中皮腫、及び肝臓癌からなる群から選択される場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更にもう１つの目的は、ヒト癌が進行黒色腫である場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更なる目的は、チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体若しくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又はそれらの任意の組合せである場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更なる目的は、抗ＰＤ－１抗体がペンブロリズマブ又はニボルマブである場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更にもう１つの目的は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がデュルバルマブである場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

本発明の更なる目的は、ウイルスの量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰである場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスである。

ウイルスが３×１０¹¹ＶＰの量で投与される場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスも又、本発明の態様である。

本発明の一態様によれば、ウイルスが腫瘍への直接注射により投与され、１又は複数のチェックポイント阻害剤が静脈内に投与される場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。

ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与前に投与され、且つ、所望により、ウイルスが前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも、及び／又は前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与後にも投与される場合の、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスも又、本発明の態様である。

本発明の１つの目的は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む方法である。

好ましい実施形態は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記癌が進行黒色腫である方法である。

１つの好ましい実施形態によれば、患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む、患者において癌を処置するための方法において、１又は複数のチェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又はそれらの任意の組合せである。

別の好ましい実施形態によれば、抗ＰＤ－１抗体ペンブロリズマブ又はニボルマブは、患者において癌を処置するための方法において使用され、前記方法は、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む。好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はデュルバルマブである。よって、抗ＰＤ－１抗体は好ましくはペンブロリズマブ又はニボルマブであり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は好ましくはデュルバルマブである。

１つの好ましい実施形態は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与前に投与され、且つ、所望により、ウイルスが前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも、及び／又は前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与後にも投与される方法である。

もう１つの好ましい実施形態は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、前記患者に、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが１～１０回投与され、チェックポイント阻害剤が１～１５回投与される方法である。

更にもう１つの好ましい実施形態は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの投与量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ＶＰの範囲である方法である。

本発明のもう１つの態様は、患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含み、必要とする患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程の前にシクロホスファミドの投与を更に含む方法である。

ヒト癌の処置におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、ウイルスがそれを必要とする患者に１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される使用も又、本発明の態様である。

本発明の目的は、ウイルス療法単独又は１若しくは複数のチェックポイント阻害剤単独の使用に比べて、安全性が改善され、且つ、癌に対する効果が改善されたＯＮＣＯＳ－１０２腫瘍溶解性アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤の新規な治療上有効な使用を開発することである。

対象部位へのベクターの輸送を可能とする他、本発明のアデノウイルスベクターは又、導入遺伝子の発現及び持続性を保証する。更に、ベクター並びに導入遺伝子に対する免疫応答が最小化される。

本発明は、従来の処置に対する治療抵抗に関連する問題を克服する。更に、本発明は、健常組織に毒性又は傷害が少ない選択的治療のためのツール及び方法を提供する。本発明の利点には、他の治療薬と比較した場合に異なる及び軽減された副作用も含まれる。重要なこととして、このアプローチは、放射線療法を含む多くの他の形態の療法と相乗効果があり、従って、併用レジメンで使用するのに好適である。

本発明は、腫瘍細胞がビリオンにより生じる腫瘍溶解によって破壊される癌治療を達成する。加えて、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び樹状細胞（ＤＣ）の活性化を含むヒト免疫応答を活性化する種々の異なる機構が、本発明における治療的使用のために動員される。

よって、本願は、優れた安全記録を維持しつつ、悪性細胞に対する宿主の免疫系の効果的な動員と、悪性細胞における直接的腫瘍溶解効果及びチェックポイントタンパク質阻害効果の同時的提供の両方を行うための戦略を記載し、その方法及び手段を提供する。

本発明の態様は、癌治療において効率的且つ正確な遺伝子導入並びに高い特異性と十分な腫瘍死滅能を達成するための新規な方法及び手段を対象とする。

要するに、提供されるデータは、ヒト癌の処置のためにＯＮＣＯＳ－１０２と１又は複数のチェックポイント阻害剤を組み合わせることに強い根拠を与える。

以下の実施例は単に本発明の種々の実施形態を説明する目的で示されるものであり、それらは本発明を限定することを意味しない。当業者は、本発明が上述の目的を果たし、上述の意図及び利点並びに本明細書に内在するそれらの意図及び利点を得るように十分に適合されていることを容易に認識するであろう。それにおける変化及び特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨に包含される他の使用が当業者には思いつくであろう。

ＯＮＣＯＳ－１０２の構築
ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードするキメラ腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＮＣＯＳ－１０２）の構築及び特性評価は従前に記載されている（国際公開第２０１０／０７２９００号及びＫｏｓｋｉら）。つまり、Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦは、標準的なアデノウイルス調製技術を用いて作製および増幅した。キメラ５／３ファイバーを含むｐＡｄＥａｓｙ－１由来プラスミドｐＡｄＥａｓｙ５／３は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるＡｄ５／３ｌｕｃ１ウイルスゲノムとｐＡｄＥａｓｙ－１のＢｓｔＸＩ消化８．９ｋｂ断片の相同組換えによって作出された。次に、Ｅ１Ａに２４ｂｐの欠失を含むシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅＤ２４）をＰｍｅＩで線状化し、ｐＡｄＥａｓｙ５／３と再び組み合わせ、ｐＡｄ５／３－Ｄ２４を得た。Ｅ３領域にヒトＧＭＣＳＦ遺伝子を挿入するために、ｐＧＥＭ５Ｚｆ⁺（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）の多重クローニング部位にＡｄ５ゲノム由来のＳｐｅＩ～ＮｄｅＩ断片を挿入することによってＥ３－クローニングベクターｐＴＨＳＮを作出した。ｐＴＨＳＮをＳｕｎＩ／ＭｕｎＩで更に消化してＥ３領域に９６５ｂｐの欠失（６．７Ｋおよびｇｐ１９Ｋが欠失）を作出した。ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする４３２ｂｐの相補的ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）を、この遺伝子に隣接する特異的制限部位ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩを特徴付けるプライマーで増幅させた後、ＳｕｎＩ／ＭｕｎＩで消化したｐＴＨＳＮに挿入した。ｐＡｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦを、大腸菌におけるＦｓｐＩで線状化したｐＴＨＳＮ－ＧＭＣＳＦとＳｒｆＩで線状化したｐＡｄ５／３－Ｄ２４の間の相同組換えによって作出した。Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦウイルスゲノムを、ＰａｃＩ消化並びに増幅及び救済のためのＡ５４９細胞へのトランスフェクションによって放出させた。全段階のクローニングをＰＣＲ及び多重制限消化で確認した。シャトルプラスミドｐＴＨＳＮ－ＧＭ－ＣＳＦの配列決定を行った。野生型Ｅ１が存在しないことはＰＣＲで確認した。Ｅ１領域、導入遺伝子、及びファイバーは、最終的なウイルスにおいて配列決定及びＰＣＲで確認した。ウイルス生産は、野生型組換えのリスクを避けるために、Ａ５４９細胞に対して、ＯｎｃｏｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ヘルシンキ、フィンランド）により、ｃＧＭＰの原理に従って行った。ウイルスストックバッファー配合物は１０ｍモル／ｌトリズマ塩基、７５ｍモル／ｌＮａＣｌ、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース、１ｍモル／ｌＭｇＣｌ、１０ｍモル／ｌＬ（＋）ヒスチジン、０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＥｔＯＨ、０．０２％ツィーン、１００μモル／ｌＥＤＴＡであり；０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌ溶液（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、メルズンゲン、ドイツ）を希釈剤として使用した。ＯＮＣＯＳ－１０２は、Ｂｉｏｖｉａｎ（トゥルク、フィンランド）によりＧＬＰにて生産され、使用まで－８０℃で保存された。使用のために、ＯＮＣＯＳ－１０２を適用の直前に解凍し、使用まで氷上で保存した。解凍後、ＯＮＣＯＳ－１０２を層流ボックス内で希釈して必要な濃度とし、注射シリンジを準備し、使用まで氷上で保存した。

細胞株
Ａ－３７５ヒト黒色腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６１９（商標））、２×１０⁶細胞／側腹部を、１０％熱失活ＦＢＳ（南アフリカ起源、ＤｕｔｓｃｈｅｒＰ３０－１５０６）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Steptomycin)（ＤｕｔｓｃｈｅｒＬ００１８）を添加した、４５００ｍｇ／ｍｌグルコース（Ｓｉｇｍａ－Ｓ５６７１）を含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ₂で３７℃にて培養した。同じ培養プロトコールを、ＳＫ－ＭＥＬ２（ＡＴＣＣＨＴＢ－６８）ヒト黒色腫細胞にも適用する。

チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）：
ペンブロリズマブ（キートルーダ）については、ヒト用量は２ｍｇ／ｋｇであり、外挿の後に４０μｇ／マウスを使用した。ニボルマブ（オプジーボ）については、ヒト用量は３ｍｇ／ｋｇであり、外挿の後に６０μｇ／マウスを使用した。ＣＰＩの外挿用量は、マウスの体重を考慮すると２０ｇである。デュルバルマブについては、ヒト用量は１０～２０ｍｇ／ｋｇであり得（現在のところデュルバルマブの推奨投与スケジュールは２０ｍｇ／ｋｇＱ４Ｗ又は１０ｍｇ／ｋｇＱ２Ｗである。これはＭｅｄＩｍｍｕｎｅからの情報に基づいてデュルバルマブの固定用量に移行されたが、このことは１５００ｍｇデュルバルマブＱ４Ｗの用量及びスケジュールがＰＫモデルに基づいて選択されたことを示す）、外挿の後に２００μｇ～４００μｇ／マウスが使用でき、ＣＰＩの外挿用量は、マウスの体重を考慮すると２０ｇである。

動物の選択、無作為化、群の割り付け、飼育条件、食餌及び水並びに馴化
動物を無作為に群に選別した。動物群は調査カードをケージに付け、個別ケージで維持した。これらのカードは、試験番号、処置群、個々の動物ＩＤ、並びにそれらの起源及び到着日を記した。各ケージの個々の動物に識別のために耳標を付けた。ケージ間の動物の混合を避けるために、一度に一ケージのみを取り扱った。

動物をバイオセーフティーレベル２（ＢＳＬ２）施設にて、湿度及び温度監視環境で飼育した。動物は個々に換気されるフィルターリッド付きプラスチックケージ（ＧｒｅｅｎＬｉｎｅ、Ｓｃａｎｂｕｒ）で飼育した。

動物には、不断給餌される標準ペレット食を与えた。水は馴化及び試験期間中、不断給餌とした。

動物は実験の部を開始する前に７日間馴化した。全ての動物が馴化期間中、良好な健康状態で生残した。

腫瘍サイズの進展の分析
腫瘍サイズを、細胞注射７～１１日後に開始して測定及び記録した。処置の初日及び腫瘍サイズ測定の初日は０日目として示した。腫瘍は３日毎に測定した。

最長直径と最短直径を記録し、腫瘍体積は、（幅×長さ×高さ）／２の式を用いて計算した。

体重は、全試験を通して３日毎に測定した。

腫瘍体積：絶対的腫瘍体積が腫瘍体積分析のエンドポントであった。各マウスについて２つの腫瘍が測定されたので、反復測定に関する分散分析を腫瘍体積の分析法として適用した。このモデルは群効果と固定効果としての共変量としてのベースライン値を含んだ。群間のペアワイズ比較をテューキーの方法で補正した。相乗作用の計算はＦＴＶ(fractional tumor volume)法を用いて行った。

ヒト黒色腫異種移植モデル
これらの試験は、ＮＯＤ／Ｓｈｉｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＯＧ）を用い、フランスのアルシャンでＴＣＳによって実施された。４週齢の免疫不全ＮＯＧマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、化学的骨髄破壊処置の２日後、臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（フランス血液機構）を移植した。移植はＣＤ３４＋細胞の静注からなった。細胞注射の１４週間後に、移植レベルを、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による総白血球中のヒトＣＤ４５＋細胞の分析を用いて監視した。このパイロット試験のために、２０％より高いヒト化率（循環ｈＣＤ４５＋／総白血球の比率と定義）を有するマウスのみを選択した。本発明者らは、雌マウスのみを使用した。本試験において記載される全ての動物試験は、現地倫理委員会（０１＿ＴｒａｎｓＣｕｒｅｂｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ－ＡＢ－０１）によって審査及び承認された。マウスは３～５個体の群に入れられた。各マウスは独自に識別された。動物を換気ケージ（タイプＩＩ（１６×１９×３５ｃｍ、床面積＝５００ｃｍ２））にて、以下の制御条件下で飼育した。
・室温（２２±２℃）
・湿度（５５±１０％）
・光周期（１２：１２時間明暗周期午前７時～午後７時）
・水及び食餌（Ｒｅｆ．２０１８、ＨａｒｌａｎＦｒａｎｃｅ）は不断給餌

マウスをイソフルランであるフォーレン（Ｆｏｒａｎｅ）（Ｂａｘｔｅｒ）で麻酔し、Ａ－３７５細胞×１００μｌを両側腹部に注射した（２Ｅ＋０６／側腹部）。各マウスに１又は２個の腫瘍が誘導された。腫瘍は処置前に７～１１日増殖させた。腫瘍形成１、３及び５日後にウイルスを投与し、チェックポイント阻害剤（キートルーダ及びオプジーボ）を腫瘍形成後９、１３及び１７日後にそれぞれ投与した。全身効果を検討する場合には、１腫瘍のみ／マウスを処置した（図１Ｃ参照）。偽処置動物は０．９％生理食塩水で処置した。ＯＮＣＯＳ－１０２を０．９％生理食塩水に希釈し、腫瘍当たり５×１０⁷ＶＰの用量で腫瘍内に注射した。注射は、腫瘍全体に一様な分布を保証するために扇状パターンで行った。チェックポイント阻害剤（キートルーダ及びオプジーボ）を０．９％ＮａＣｌに希釈し、それぞれ４０ｍｇ／マウス（体重２０ｇ）のキートルーダ及び６０ｍｇ／マウスのオプジーボの用量で腹腔内に投与した。注射容量は５０μｌのチェックポイント阻害剤とした。

実施例１ＯＮＣＯＳ－１０２とチェックポイント阻害剤の組合せを使用することによるマウスにおける黒色腫に対する抗新生物活性の改善
本試験では、マウスを処置しないか、又はＯＮＣＯＳ－１０２単独、チェックポイント阻害剤単独若しくはＯＮＣＯＳ－１０２とチェックポイント阻害剤の組合せで処置した。試験群１～９、マウス数及び使用した最小ターンアラウンドタイム(minimum turn-around times) を表１に示す。要するに、試験群１では、免疫不全マウスを５×１０⁶ＶＰのＯＮＣＯＳ－１０２で処置した。群２では、５×１０⁷ＶＰのＯＮＣＯＳ－１０２を代わりに使用し、群３のマウスには全く処置を施さなかった。これらの群から腫瘍体積を測定することによって得られた結果を図１Ａに示す。これらの結果は、腫瘍体積がウイルス用量に依存して減少したことを示す。

群４のヒト化マウスは５×１０⁷ＶＰのＯＮＣＯＳ－１０２で処置し、群５のマウスは非処置のままとした。群６及び７のヒト化マウスはそれぞれキートルーダ（４０ｍｇ／マウス）及びオプジーボ（６０ｍｇ／マウス）で処置した。群８のヒト化マウスはまずＯＮＣＯＳ－１０２（５×１０⁷ＶＰ）で、次いでキートルーダ（４０ｍｇ／マウス）で処置した。群９では、マウスは２個の腫瘍（それぞれ左及び右）を有した。このマウスは、右の腫瘍だけをウイルスで処置したこと以外は群８と同様に処置した。処置した右の腫瘍の結果を、群９のヒト化マウスの処置していない左の腫瘍及びキートルーダ単独で処置したヒト化マウスの腫瘍（群６）と比べて図１Ｃに示し、ウイルスで処置された腫瘍及びウイルスで処置されなかった腫瘍は両方とも同等の影響を受けたことから、ウイルス処置の全身効果が実証される。図１Ｂでは、群３及び５の処置されていない免疫不全マウスとヒト化マウスの間の比較が示される。これらの結果は、ヒト免疫系がマウスにおいて腫瘍成長を阻害することを実証する。図１Ｄでは、群８（ＯＮＣＯＳ－１０２＋キートルーダ）と４（ＯＮＣＯＳ－１０２単独）と群８及び６（キートルーダ単独）のマウス間の差は、チェックポイント阻害剤を投与する前に、腫瘍がまずＯＮＣＯＳ－１０２でプラミングされる併用療法が、ＯＮＣＯＳ－１０２単独又はプライミング無しのキートルーダで処置する場合よりも有効であることを示唆する。

実施例２併用療法の有効性の評価
これらの試験は、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＯＧ）を用い、フランスのアルシャンでＴＣＳによって実施された。４週齢の免疫不全ＮＯＧマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、化学的骨髄破壊処置の２日後、臍帯血由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（フランス血液バンク）を移植した。移植はＣＤ３４＋細胞の静注からなった。細胞注射の１４週間後に、移植レベルを、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による総白血球中のヒトＣＤ４５＋細胞の分析を用いて監視した。ヒト化率は、循環ｈＣＤ４５＋／総ＣＤ４５＋（ｍＣＤ４５＋ｈＣＤ４５）の比として定義された。６０匹のヒト化ＮＯＧマウスにＡ２０５８腫瘍細胞を移植し、８群に無作為化した。

６～８匹のマウスの８群を無作為化し、次のように処置した。
・群１：Ｎ＝８。ビヒクル。ビヒクル（ＰＢＳ）：１５、１６及び１８日目（両腫瘍に対して腫瘍内）並びに１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群２：Ｎ＝８。ＯＮＣＯＳ－１０２。ＯＮＣＯＳ－１０２（２．５×１０６ＶＰ／腫瘍＝＞５×１０６ＶＰ／マウス）：１５、１６及び１８日目（腫瘍内、両腫瘍）。
・群３：Ｎ＝８。キートルーダ２００：キートルーダ２００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群４：Ｎ＝８。キートルーダ４００：キートルーダ４００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群５：Ｎ＝８。ＯＮＣＯＳ－１０２＋キートルーダ２００：腫瘍溶解性ウイルス（２．５×１０６ＶＰ／腫瘍＝＞５×１０６ＶＰ／マウス）及びキートルーダ２００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目（腫瘍内、両腫瘍）並びに１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群６：Ｎ＝８。ＯＮＣＯＳ－１０２＋キートルーダ４００。腫瘍溶解性ウイルス（２．５×１０６ＶＰ／腫瘍＝＞５×１０６ＶＰ／マウス）及びキートルーダ４００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目（腫瘍内、両腫瘍）並びに１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群７：Ｎ＝６。ＯＶ右＋キートルーダ２００：腫瘍溶解性ウイルス（５×１０６ＶＰ／腫瘍）及びキートルーダ２００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目（右の腫瘍に腫瘍内）並びに１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。
・群８：Ｎ＝６。ＯＶ右＋キートルーダ４００：腫瘍溶解性ウイルス（５×１０６ＶＰ／腫瘍）及びキートルーダ４００μｇ／マウス：１５、１６及び１８日目（右の腫瘍に腫瘍内）並びに１５、１６及び１８日目と試験期間中３～４日毎に静脈内。

腫瘍体積は、カリパスを用いて週に３回監視した。測定に十分な大きさの場合、腫瘍体積は式：（長さ×（幅）２／２）を用いて計算した。１０００ｍｍ３を超える腫瘍体積をエンドポントと見なし、この場合に、マウスを犠牲にした。犠牲は４０日目に予定した。

全てのパラメーターをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエア（バージョン７）を用いて分析した。統計分析は次のように行った。テューキーの事後検定を行う一元配置ＡＮＯＶＡを群間比較に適用した。４０日目に、各処置群とビヒクル群を比較するためにｔ検定を適用した。生存分析については、カプラン・マイヤー曲線をプロットし、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用した。

本発明者らは、ＯＮＣＯＳ－１０２がビヒクル処置群に比べて腫瘍体積を低減したことを認めた（図２）。キートルーダ単独は有意な効果を持たなかったが、ＯＮＣＯＳ－１０２とキートルーダ２００μｇ／マウス及びキートルーダ４００μｇ／マウスの組合せは、ビヒクル処置群に比べて腫瘍体積を有意に低減した（それぞれｐ＝０．００３４及びｐ＝０．００２３）。ＯＮＣＯＳ－１０２とキートルーダ２００及び４００μｇ／マウスの組合せは、腫瘍体積をそれぞれ４６％及び５７％低減した。

腫瘍の免疫細胞浸潤は、犠牲時にフローサイトメトリーによって分析した。分析は試験の終了時の４０日目に回収した腫瘍に対して行った。

まず、総ヒトＣＤ４５＋の量を調べた（図３）。左の腫瘍では、群間に差は見られなかった。右の腫瘍（局所処置）では、免疫ＣＤ４５細胞の数は、ビヒクル、ＯＮＣＯＳ－１０２及びキートルーダ２００群に比べてＯＮＣＯＳ－１０２＋キートルーダ２００群で増加し、これはト免疫細胞の動員を増加させるためのＯＮＣＯＳ－１０２とキートルーダ２００の相乗作用を示し得る。

左の側腹部及び右の側腹部において、ＯＶ処置群及びＯＮＣＯＳ－１０２＋キートルーダで処置した群ではＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加が見られた。右の側腹部において、本発明者らは又、ビヒクル群に比べて、右の腫瘍ではＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の有意な増加が見られたが、左の腫瘍では見られなかったことも認めた。キートルーダ２００及びキートルーダ４００は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に効果を持たなかった（図４）。

又、ＰＤＬ１発現も黒色腫細胞の表面で調べた（図５）。ＰＤＬ１は、腫瘍内の黒色腫細胞の表面で発現され、群間で発現の有意差は見られなかった。

加えて、ＯＮＣＯＳ－１０２とキートルーダ２００及び４００μｇ／マウスの組合せは相乗作用的抗腫瘍効果を示すことが示された（表２）。

参照文献

本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕患者に１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、ヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔２〕前記ヒト癌が進行黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、中皮腫、及び肝臓癌からなる群から選択される、前記〔１〕に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔３〕前記ヒト癌が進行黒色腫である、前記〔１〕又は〔２〕に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔４〕前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体若しくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又はそれらの任意の組合せである、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔５〕前記抗ＰＤ－１抗体がペンブロリズマブ又はニボルマブである、前記〔４〕に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔６〕前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体がデュルバルマブである、前記〔４〕に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔７〕前記ウイルスの量が５×１０ ¹⁰ ～５×１０ ¹¹ ＶＰである、前記〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔８〕前記ウイルスが３×１０ ¹¹ ＶＰの量で投与される、前記〔７〕に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔９〕前記ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与前に投与され、且つ、所望により、ウイルスが前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも、及び／又は前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与後にも投与される、前記〔１〕～〔８〕のいずれか一項に記載のヒト癌の処置において使用するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス。
〔１０〕患者において癌を処置するための方法であって、前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルス及び１又は複数のチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む、方法。
〔１１〕前記１又は複数のチェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体若しくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又はそれらの任意の組合せである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記抗ＰＤ－１抗体がペンブロリズマブ又はニボルマブであり、かつ、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体がデュルバルマブである、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記ウイルスが１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与前に投与され、且つ、所望により、前記ウイルスが前記１若しくは複数のチェックポイント阻害剤の投与期間中にも、及び／又は前記１又は複数のチェックポイント阻害剤の投与後にも投与される、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４〕前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが１～１０回投与され、且つ、前記チェックポイント阻害剤が１～１５回投与される、前記〔１０〕～〔１３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕ヒト癌の処置におけるＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、前記ウイルスが前記処置を必要とする患者に１又は複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、使用。

Claims

ＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスを含む、ＰＤ－１阻害剤に対して不応性のヒト癌を処置するための薬剤であって、
前記ウイルスが、ペンブロリズマブ又はニボルマブと組み合わせて患者に投与され、
前記投与が、まず前記ウイルスでプライミングすること、続いて、ペンブロリズマブ又はニボルマブを投与することを含み、
前記ウイルスの投与が、腫瘍内、胸膜内又は腹腔内注射によって行われる
ことを特徴とする、薬剤。
前記ヒト癌が進行黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、中皮腫、及び肝臓癌からなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
前記ヒト癌が進行黒色腫である、請求項１又は２に記載の薬剤。
前記ウイルスの量が５×１０¹⁰～５×１０¹¹ ウイルス粒子（ＶＰ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤。
前記ウイルスが３×１０¹¹ＶＰの量で投与される、請求項４に記載の薬剤。
前記ウイルスが前記ペンブロリズマブ又はニボルマブの投与期間中にも、及び／又は前記ペンブロリズマブ又はニボルマブの投与後にも投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
前記患者にＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスが１～１０回投与され、且つ、前記ペンブロリズマブ又はニボルマブが１～１５回投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤。
ＰＤ－１阻害剤に対して不応性のヒト癌を処置するための薬剤を製造するためのＯＮＣＯＳ－１０２アデノウイルスの使用であって、
前記薬剤は、前記ウイルスがペンブロリズマブ又はニボルマブと組み合わせて前記処置を必要とする患者に投与され、
前記投与が、まず前記ウイルスでプライミングすること、続いて、ペンブロリズマブ又はニボルマブを投与することを含み、
前記ウイルスの投与が、腫瘍内、胸膜内又は腹腔内注射によって行われる
ることを特徴とする、使用。