JP7146211B2 - 人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents
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Description
第1実施形態に係る人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子RNAを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む。
ゲル培地ではない液体培地である、10%FBS(Gibco)を含む2mLのDMEM(Gibco)に懸濁した1×105個の繊維芽細胞(HDF2443又はHDF2802、Cell Applications, Inc.)を、ウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を接着培養した。24時間後、蛍光タンパク質EGFPを発現させることのできるセンダイウイルス(CytoTune、登録商標、EmGFP Sendai Fluorescence Reporter、Invitorogen)を、感染多重度(MOI)が3.0となるよう液体培地に添加した。24時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図1(HDF2443)及び図2(HDF2802)に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
10%FBSを含むDMEM(Gibco)にジェランガム(日産化学)が0.02質量%になるよう添加した2mLのゲル培地に懸濁した1×105個の繊維芽細胞(HDF2443又はHDF2802)をチューブに播種し、チューブを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を浮遊培養した。24時間後、蛍光タンパク質EGFPを発現させることのできるセンダイウイルス(CytoTune、登録商標、EmGFP Sendai Fluorescence Reporter、Invitorogen)を、MOIが3.0となるようゲル培地に添加した。24時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図1(HDF2443)及び図2(HDF2802)に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
bFGF(Gibco)を4ng/mL含有しているhES培地(Primate ES Cell Medium、リプロセル)にジェランガム(日産化学)が0.02質量%になるよう添加した2mLのゲル培地に懸濁した1×105個の繊維芽細胞(HDF1419、Cell Applications, Inc.)をチューブに播種し、チューブを37℃のCO2インキュベーター中に静置し、繊維芽細胞を浮遊培養した。24時間後、初期化因子OSKM(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC)を発現させることのできるセンダイウイルス(Invitrogen)をゲル培地に添加した。センダイウイルスは、hKOS(KLF4、OCT3/4、SOX2)のMOIが5.0、c-MYCのMOIが5.0、及びhKLFのMOIが5.0となるようゲル培地に添加した。
センダイウイルスを、hKOS(KLF4、OCT3/4、SOX2)のMOIが2.5、c-MYCのMOIが2.5、及びhKLFのMOIが2.5となるようゲル培地に添加した以外は、第1実施形態の実施例3と同様にして、繊維芽細胞(HDF1419、Cell Applications, Inc.)を初期化した。
bFGFを含有しないゲル培地を用いた以外は、第1実施形態の実施例3と同様にして、繊維芽細胞(HDF1419、Cell Applications, Inc.)を初期化した。
繊維芽細胞(HDF2802、Cell Applications, Inc.)を用いた以外は、第1実施形態の実施例5と同様にして、繊維芽細胞(HDF2802、Cell Applications, Inc.)を初期化した。
ゲル培地ではない液体培地である、750μLのStemspanACF(Stemcell Technologies)に懸濁した5×104個の血液細胞(単核球細胞、スタンフォード大学血液センター)をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。なお、StemspanACFには、成長因子として、20ng/mLのFLT3、10ng/mLのTPO、50ng/mLのIL6、10ng/mLのGCSF、50ng/mLのSCF、及び20ng/mLのIL3を添加した。StemspanACFを使用する以下の実施例においても、同様である。
StemspanACF(Stemcell Technologies)に脱アシル化ジェランガム(日産化学)が0.02質量%になるよう添加した750μLのゲル培地に懸濁した5×104個の血液細胞(単核球細胞、スタンフォード大学血液センター)をチューブに播種し、チューブを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。
StemspanACF(Stemcell Technologies)にジェランガム(日産化学)が0.02質量%になるよう添加した100μLのゲル培地に懸濁した5×104個の血液細胞(単核球細胞、スタンフォード大学血液センター)をチューブに播種し、チューブを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、血液細胞を浮遊培養した。
750μLのStemspanACF(Stemcell Technologies)に懸濁した1×106個の血液細胞(単核球細胞、スタンフォード大学血液センター)をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、血液細胞を接着培養した。3日後、750μLのStemspanACFを各ウェルに添加し、37℃のCO2インキュベーター中に静置して、引き続き血液細胞を培養した。
センダイウイルスを、hKOS(KLF4、OCT3/4、SOX2)のMOIが5.0、c-MYCのMOIが5.0、及びhKLFのMOIが2.5となるようゲル培地に添加した以外は、第1実施形態の実施例10と同様にして、血液細胞(単核球細胞、スタンフォード大学血液センター)を初期化した。
8mLの全血に対して2mLのHetaSep(登録商標、ステムセルテクノロジーズ)又はHES40(NIPRO)を添加し、37℃のCO2インキュベーターで30分から1時間インキュベートし、赤血球を沈降させた。その後、血漿成分をチューブに移し、単核球細胞数を計測した。結果を図12に示す。Ficoll(GE Healthcare)を用いた場合と同等以上に、単核球細胞を分離できた。
ゲル培地ではない液体培地である、750μLのStemspanACF(Stemcell Technologies)に、第1実施形態の実施例12で分離した5×104個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。
ゲル培地ではない液体培地である、750μLのStemspanACF(Stemcell Technologies)に、第1実施形態の実施例12で分離した1×106個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。3日後、750μLのStemspanACFを各ウェルに添加し、37℃のCO2インキュベーター中に静置した。
第2実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞にRNAトランスフェクション試薬を用いて初期化因子RNAを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む。
ウェルプレートの各ウェルに、1.5mLのPBSに対し、iMatrix-511(nippi)を0.5μg/cm2となるように希釈した基底膜マトリックスの希釈液を入れた。その後、ウェルプレートを37℃のインキュベーターに1時間以上入れた。次に、ウェルプレートの各ウェルから基底膜マトリックスの希釈液を取り除き、ウェルプレートの各ウェルに10%FBS培地に懸濁した繊維芽細胞を約1×105個播種し、繊維芽細胞を接着培養した。
ヒト血液細胞は健康な成人男性から入手した。また、修飾化mRNA(TriLink社)、非接着ディッシュ、15mLチューブ、50mLチューブ、フィコール、サイトフローメータ(BD)、CD34に対する抗体(Miltenyi Biotec)、CD3に対する抗体(Miltenyi Biotec)、MACS(登録商標)バッファ(Miltenyi Biotec)、T細胞培地、低血清培地(Opti-MEM(登録商標)、Gibco)、siRNA導入試薬(Lipofectamine(登録商標)RNAiMAX、ThermoFisherScience)、及びTRA-1-60に対する抗体(BD)を用意した。
リポフェクションを開始してから7日目に、細胞の一部を12ウェルプレートから取り出し、取り出した細胞を初期化され始めた細胞で特異的に発現する表面抗原であるTRA-1-60対する抗体であって、Allophycocyanin(APC)蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ(FACS(登録商標)、BD)で、TRA-1-60陽性細胞の割合を確認することによって、細胞においてリプログラミングが開始され、iPS細胞遺伝子が発現し、iPS細胞ができてくる事を確認した。
Claims (12)
- ヒト体細胞を用意することと、
ゲル培地で浮遊培養されている前記ヒト体細胞に初期化因子RNAを含むセンダイウイルスを導入することと、
前記ヒト体細胞を初期化することと、
を含む、
人工多能性幹細胞の作製方法。 - 前記ヒト体細胞がヒト繊維芽細胞である、請求項1に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 前記ヒト体細胞がヒト血液細胞である、請求項1に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 前記ヒト体細胞としてヒト単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項3に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- フィルターを用いて、前記ヒト体細胞としてヒト単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項3に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 免疫磁気ビーズを用いて、前記ヒト体細胞としてヒト単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項3に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 前記初期化因子RNAが、M3O又はOCT3/4のmRNA、SOX2のmRNA、KLF4のmRNA、及びc-MYCのmRNAを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 培地が攪拌されない、請求項1から7のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 培地が、成長因子を含まない、請求項1から7のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 培地が、成長因子を40質量%以下の濃度で含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 培地が、bFGFを含まない、請求項1から7のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
- 前記培地が終濃度0.001質量%から0.5質量%のジェランガムを含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
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