JP7144872B2 - Serum-free medium for human lymphocyte cell culture - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Description

特許法第３０条第２項適用 （１）平成３０年１月３０日に日立化成株式会社に対し評価用サンプルを提供Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act (1) Provision of samples for evaluation to Hitachi Chemical Co., Ltd. on January 30, 2018

特許法第３０条第２項適用 （２）平成３０年２月１７日に第１５回日本免疫治療学研究会学術集会の自社ブースにてパンフレットを配布Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law (2) Distributing pamphlets at the company's booth at the 15th Annual Meeting of the Japanese Society for Immunotherapy on February 17, 2018

特許法第３０条第２項適用 （３）平成３０年２月２６日に株式会社リンフォテックのウェブサイトにて公開Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act applies (3) Released on the website of Lynphotech Co., Ltd. on February 26, 2018

特許法第３０条第２項適用 （４）平成３０年３月３０日に株式会社ストラテジックのダイレクトメール（郵送）にてパンフレットを配布Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law applies. (4) Distribute pamphlets by direct mail (mail) of Strategic Co., Ltd. on March 30, 2018.

特許法第３０条第２項適用 （５）平成３０年３月３０日に株式会社ストラテジックのウェブサイトにて公開Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act applies (5) Published on the website of Strategic Co., Ltd. on March 30, 2018

特許法第３０条第２項適用 （６）平成３０年５月１０日に国立大学法人東京大学に対し評価用サンプルを提供Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law (6) Provision of samples for evaluation to the University of Tokyo on May 10, 2018

特許法第３０条第２項適用 （７）平成３０年５月２８日に学校法人東京医科大学に対し評価用サンプルを提供Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law (7) Provision of samples for evaluation to Tokyo Medical University on May 28, 2018

特許法第３０条第２項適用 （８）平成３０年５月３１日に株式会社メディカルレビュー社が発行した「再生医療－日本再生医療学会雑誌Ｖｏｌ．１７、Ｉｓｓｕｅ ０２、表紙裏頁」にて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act (8) In "Regenerative Medicine-Journal of the Japanese Society for Regenerative Medicine Vol.17, Issue 02, back cover page" published by Medical Review Co., Ltd. publication

特許法第３０条第２項適用 （９）平成３０年６月２０日にコスモ・バイオ株式会社が発行した「Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｎｅｗｓ２０１８．７ Ｎｏ．１４３ 第９頁」にて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act (9) Announced in "Cosmo Bio News 2018.7 No. 143, p. 9" issued by Cosmo Bio Co., Ltd. on June 20, 2018

特許法第３０条第２項適用 （１０）平成３０年６月２５日にコスモ・バイオ株式会社のウェブサイトにて公開Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act applies (10) Released on the website of Cosmo Bio Co., Ltd. on June 25, 2018

本発明は、ヒトリンパ球細胞を培養するための無血清培地（すなわち、「ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地」）や、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等に関する。 The present invention relates to a serum-free medium for culturing human lymphocytes (that is, a "serum-free medium for culturing human lymphocytes"), a method for culturing human lymphocytes using such a serum-free medium, and the like.

がんの三大治療法は、外科手術、化学療法、放射線療法であるが、がんの第四の治療法として、免疫治療への注目が近年高まりつつある。免疫療法はヒトが本来有する免疫力を利用するため、他の治療法と比較して副作用がきわめて少ない。また、免疫療法は三大治療法とは作用機序が全く異なるため、三大治療法と併用することもできる。免疫療法のうち、免疫システムを担当する免疫細胞を使用する治療法は免疫細胞療法と呼ばれている。免疫細胞療法としては、患者の血液から採取した単球をin vitroで樹状細胞へ誘導し、次いで、その樹状細胞をがん細胞又はがんペプチドで感作した後、それを患者に投与する樹状細胞ワクチン療法、がんペプチドを患者に投与するがんペプチドワクチン療法、患者の血液から採取した少量のガンマデルタＴ細胞をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与するガンマデルタＴ細胞療法、患者の血液から採取したナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）をin vitroで活性化した後、それを患者に投与するＮＫＴ細胞療法、患者の血液から採取したリンパ球と患者から採取したがん細胞とをin vitroで共培養してがん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、そのＣＴＬを患者に投与するＣＴＬ療法、患者の血液から採取したリンパ球をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与する活性化自己リンパ球療法などが知られている。免疫細胞療法に用いる免疫細胞、中でも、がん治療に高い効果を発揮し得る免疫細胞は、一般的に少量しか得られないことも多いため、免疫細胞を培養で大幅に増殖できるかが、治療効果を得るために重要な要素となる。 The three major treatments for cancer are surgery, chemotherapy, and radiotherapy, and immunotherapy has been attracting increasing attention in recent years as the fourth treatment for cancer. Since immunotherapy utilizes the inherent immunity of humans, it has very few side effects compared to other treatments. In addition, since immunotherapy has a completely different mechanism of action from the three major therapeutic methods, it can be used in combination with the three major therapeutic methods. Among immunotherapies, a therapeutic method using immune cells that are in charge of the immune system is called immune cell therapy. In immuno-cell therapy, monocytes collected from the patient's blood are induced in vitro to become dendritic cells, then the dendritic cells are sensitized with cancer cells or cancer peptides, and then administered to the patient. dendritic cell vaccine therapy, cancer peptide vaccine therapy in which cancer peptides are administered to the patient, and a small amount of gamma delta T cells collected from the patient's blood are proliferated and activated in vitro and then administered to the patient Gamma delta T cell therapy, NKT cell therapy in which natural killer T cells (NKT cells) collected from the patient's blood are activated in vitro and then administered to the patient, lymphocytes collected from the patient's blood and from the patient CTL therapy, in which collected cancer cells are co-cultured in vitro to induce cytotoxic T cells (CTL) against cancer cells, and the CTLs are administered to patients; Activated autologous lymphocyte therapy and the like are known in which the cells are proliferated and activated in vitro and then administered to patients. Immune cells used in immuno-cell therapy, especially immune cells that can be highly effective in cancer treatment, are generally obtained in small quantities, so whether immune cells can be significantly expanded in culture is the key to treatment. important factor in obtaining an effect.

末梢血リンパ球細胞（以下、単に「リンパ球細胞」とも表示する。）は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。リンパ球細胞の表面には分化抗原と称される抗原型が発現しており、リンパ球細胞はこの抗原型により様々なサブセットに分類されている。例えば、リンパ球細胞は、ＣＤ３（ＣＤはcluster of differentiationの略）発現の有無をモノクローナル抗体の反応性により検出することにより、細胞性免疫に関与するＴリンパ球細胞（ＣＤ３陽性、ＣＤ３＋とも表す；以下陽性を＋、陰性を－と記載することもある）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ１６１陽性、ＣＤ１６１＋とも表す）と、液性免疫に関与するＢリンパ球細胞等（ＣＤ３陰性、ＣＤ３－とも表す）とに区別される。そしてこれらのリンパ球細胞はその機能も異なる。さらに、細胞性免疫に関与するＣＤ３陽性Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞ともいう）は、ＣＤ４を発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ＣＤ８を発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞とに分類される。末梢におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型とＴｈ２型に分類される。末梢におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により活性化すると細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）である。 Peripheral blood lymphocytes (hereinafter also simply referred to as "lymphocytes") have recently attracted a great deal of attention as an important means for the immune system to defend the body. Antigens called differentiation antigens are expressed on the surface of lymphocytes, and lymphocytes are classified into various subsets according to these antigens. For example, lymphocytes are T lymphocytes involved in cell-mediated immunity by detecting the presence or absence of expression of CD3 (CD stands for cluster of differentiation) by the reactivity of monoclonal antibodies (CD3 positive, also referred to as CD3 +; In the following, positive is sometimes described as +, negative is sometimes described as -) and NKT cells (also referred to as CD161 positive, CD161 +), and B lymphocytes involved in humoral immunity (CD3 negative, also referred to as CD3-) distinguished. And these lymphocytes also differ in their functions. Furthermore, CD3-positive T lymphocyte cells (also referred to as T cells) involved in cell-mediated immunity are classified into CD4-expressing CD4-positive T cells and CD8-expressing CD8-positive T cells. The majority of CD4-positive T cells in the periphery are called helper T cells, which are involved in assisting antibody production and inducing various immune responses, and are classified into Th1 and Th2 types, which differ in the types of cytokines produced by antigen stimulation. be done. Most of CD8-positive T cells in the periphery are cytotoxic T lymphocytes (CTL) that exhibit cytotoxic activity when activated by antigen stimulation.

前述の活性化自己リンパ球療法に関して、最初に活性化Ｔリンパ球細胞の製造方法を報告したのは関根らである。その方法は、活性化Ｔリンパ球細胞群の増殖を選択的に刺激し、増殖した活性化Ｔリンパ球細胞群を得る方法であり、より具体的には、ヒトの末梢血リンパ球細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell）を、抗ＣＤ３抗体のひとつであるＯＫＴ３抗体の固相化された培養フラスコ中で第一期培養し、そのように培養した細胞をＯＫＴ３抗体非存在下で第二期培養する方法である。この方法で得られた活性化リンパ球細胞群は、さらにインターロイキン２（ＩＬ－２）存在下での培養を経て、がんの養子免疫療法として、当該末梢血を採取した患者に投与することができる（特許文献１参照）。また、特許文献２には、ドナー由来の末梢血リンパ球細胞をＯＫＴ３抗体が固相化された培養容器でＩＬ－２存在下に培養し、得られた活性化リンパ球細胞群からＣＤ４陽性細胞を分離し、分離したＣＤ４陽性細胞が総細胞に対して９０％以上含有する製剤を、感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物として患者に投与することができることが記載されている（特許文献２参照）。これらのリンパ球細胞源としては、腫瘍浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ：Tumor Infiltrating Lymphocyte）、臍帯血、骨髄等が使用可能である（特許文献２参照）。 Regarding the above-mentioned activated autologous lymphocyte therapy, Sekine et al. first reported a method for producing activated T lymphocyte cells. The method is a method of selectively stimulating proliferation of activated T lymphocyte cell population to obtain a proliferated activated T lymphocyte cell population, more specifically, human peripheral blood lymphocyte cells (PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells) are first-stage cultured in a culture flask immobilized with OKT3 antibody, one of anti-CD3 antibodies, and the so-cultured cells are second-stage culture in the absence of OKT3 antibody It is a way to The activated lymphocyte cell group obtained by this method is further cultured in the presence of interleukin 2 (IL-2) and administered to the patient from whom the peripheral blood was collected as adoptive immunotherapy for cancer. (see Patent Document 1). In addition, in Patent Document 2, donor-derived peripheral blood lymphocytes are cultured in the presence of IL-2 in a culture vessel in which OKT3 antibody is immobilized, and from the obtained activated lymphocyte cell group CD4 positive cells can be isolated, and a preparation containing 90% or more of the isolated CD4-positive cells relative to the total cells can be administered to a patient as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of infectious diseases, tumor recurrence, and autoimmune diseases. is described (see Patent Document 2). Tumor infiltrating lymphocytes (TIL), umbilical cord blood, bone marrow and the like can be used as sources of these lymphocytes (see Patent Document 2).

別の機能的観点から、リンパ球細胞をナイーブリンパ球細胞とメモリーリンパ球細胞とに分類することがある。ナイーブリンパ球細胞は、未だ抗原刺激を受けていない、ＣＤ４５ＲＡ抗原を細胞表面に発現しているリンパ球細胞であり、局所リンパ節等で抗原と出会い刺激を受ける中で活性化されるとされている。メモリーリンパ球細胞は、特異的刺激か非特異的刺激かを問わず、既に抗原刺激を受けてＣＤ４５ＲＯ抗原を発現しているリンパ球細胞である。Ｔリンパ球細胞やＢリンパ球細胞もそれぞれの状態に応じてナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞や、ナイーブＢ細胞とメモリーＢ細胞とに分けることができる。メモリーＴ細胞はさらにエフェクターメモリー（effector memory；ＥＭ）Ｔ細胞とセントラルメモリー（central memory；ＣＭ）Ｔ細胞に分けることができる。セントラルメモリーＴ細胞には、リンパ節にホーミングして体内に侵入してくる異物や抗原を迎え撃つ機能があり、エフェクターメモリーＴ細胞には本来あるべき部位に所属して異物や抗原を捕らえる作用がある。したがって、メモリーＴ細胞群を主成分として含有する製剤は、養子免疫療法において高い治療効果が得られることが予想された。そこで、大隅らは、養子免疫療法に使用される活性化リンパ球細胞の作用メカニズムを解明するために、メモリーＴ細胞サブセットに着目して、活性化増殖培養して得られた活性化リンパ球細胞群の機能を解析した。その結果、活性化リンパ球細胞群に含まれるエフェクターメモリーＴ細胞が、腫瘍細胞との共培養開始２４時間後にはがん細胞に対する細胞障害活性を発現していたこと、一方、セントラルメモリーＴ細胞はがん細胞と共培養を開始して腫瘍抗原を認識した４８時間後にがん細胞に対する細胞障害活性を発現したもので、そのときエフェクターメモリーＴ細胞へと分化していたことが明らかとなった（非特許文献１参照）。 From another functional point of view, lymphocytic cells can be classified into naive and memory lymphocytic cells. Naive lymphocytes are lymphocytes expressing the CD45RA antigen on the cell surface, which have not yet been stimulated with antigens, and are said to be activated when they encounter antigens in local lymph nodes or the like and are stimulated. there is Memory lymphocytes are lymphocytes that have already been stimulated with an antigen to express the CD45RO antigen, regardless of whether it is by specific or non-specific stimulation. T lymphocyte cells and B lymphocyte cells can also be divided into naive T cells and memory T cells, and naive B cells and memory B cells, according to their respective states. Memory T cells can be further divided into effector memory (EM) T cells and central memory (CM) T cells. Central memory T cells have the function of homing to lymph nodes and intercepting foreign substances and antigens that invade the body, while effector memory T cells have the function of catching foreign substances and antigens by belonging to their proper sites. . Therefore, it was expected that a preparation containing a memory T cell group as a main component would have a high therapeutic effect in adoptive immunotherapy. Therefore, in order to elucidate the mechanism of action of activated lymphocyte cells used in adoptive immunotherapy, Ohsumi et al. Group function was analyzed. As a result, effector memory T cells contained in the activated lymphocyte cell group expressed cytotoxic activity against cancer cells 24 hours after the start of co-culture with tumor cells, while central memory T cells 48 hours after starting co-culture with cancer cells and recognizing tumor antigens, cytotoxic activity against cancer cells was expressed, at which time it was revealed that they had differentiated into effector memory T cells ( See Non-Patent Document 1).

メモリーＴ細胞を採取したという報告は、関根らによる２０００年の文献に遡り（特許文献３参照）、これは臍帯血由来のリンパ球細胞を抗ＣＤ３抗体とＩＬ－２との存在下に活性化培養し、７日間活性化増殖させた結果、ＣＤ３陽性細胞の割合が９８％、さらにＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の割合が７３％の細胞集団を採取したものである。しかしながら、この時期の細胞は増殖が十分ではなく細胞数が少ないという問題があった。 A report of harvesting memory T cells dates back to the 2000 article by Sekine et al. After culturing and activating and proliferating for 7 days, a cell population with a CD3-positive cell ratio of 98% and a CD45RO-positive cell ratio of 73% was collected. However, there was a problem that the cells at this stage did not proliferate sufficiently and the number of cells was small.

上記の活性化リンパ球細胞は、増殖培養後速やかに患者に投与する必要があり、病状に即した迅速な投与や安定した品質管理が困難であった。そこで、患者の便を考慮して、患者血よりリンパ球細胞を調製するに際し、活性化培養後にリンパ球細胞を凍結保存した報告がある（非特許文献２参照）。ここでは凍結解凍したリンパ球細胞を再度活性化培養して得られる活性化リンパ球細胞中のＣＤ４リンパ球細胞及びＣＤ８リンパ球細胞の占有率が算出されており、ほとんど全てのポピュレーションがほぼ並行的に増殖していると結論付けている。非特許文献３では、臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞を分離した後、一旦凍結保存し、解凍後に活性化培養した際のサブセット変化を培養期間中追跡した結果が開示されている。臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞はいずれも、メモリーＴ細胞のサブセットであるセントラルメモリーＴ細胞が培養開始後速やかに増殖し６日から７日で増殖のピークに達してその後減少すること、エフェクターメモリーＴ細胞が培養後期に増殖することが報告されている。また、関根らは、患者のリンパ球細胞をインビトロで増殖・活性化培養させた後に超低温フリーザー内で凍結・保存し、使用時に凍結状態から解凍した直後に、生理食塩液を加えて懸濁して投与用製剤とする投与用製剤の製造方法（特許文献４参照）を開示している。 The above-mentioned activated lymphocyte cells must be administered to a patient immediately after proliferation and culture, and it has been difficult to perform prompt administration suitable for disease conditions and stable quality control. Therefore, there is a report of cryopreservation of lymphocytes after activation culture when preparing lymphocytes from patient blood in consideration of patient's stool (see Non-Patent Document 2). Here, the occupancy rates of CD4 lymphocyte cells and CD8 lymphocyte cells in activated lymphocyte cells obtained by reactivating and culturing freeze-thawed lymphocyte cells are calculated, and almost all populations are almost parallel. concluded that it is growing exponentially. Non-Patent Document 3 discloses the results of tracking subset changes during the culture period when lymphocytes derived from cord blood and peripheral blood were separated, frozen, and then cultured for activation after thawing. In both umbilical cord blood and peripheral blood-derived lymphocytes, central memory T cells, which are a subset of memory T cells, proliferate rapidly after the start of culture, reach a peak in proliferation after 6 to 7 days, and then decrease. , reported that effector memory T cells proliferate late in culture. In addition, Sekine et al. proliferated and activated the patient's lymphocyte cells in vitro, then frozen and stored them in an ultra-low temperature freezer, and immediately after thawing from the frozen state at the time of use, added physiological saline to suspend them. Disclosed is a method for manufacturing an administration preparation (see Patent Document 4).

また、特許文献５には、
（ａ）採取されたリンパ球細胞を、ＩＬ－２及び固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で活性化培養する工程；
（ｂ）メモリーＴ細胞群の占有率上昇を、工程（ａ）の活性化培養中の培地中に浮遊するリンパ球細胞の細胞密度に基づいて検知し、前記細胞密度が４×１０５細胞／ｍＬ以上となることを指標として工程（ａ）のリンパ球細胞を収穫し、凍結保存する工程；及び、
（ｃ）凍結されたリンパ球細胞を解凍し、活性化培養する工程；
を順次備えた高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法が記載されている。
かかる製造方法を用いると、養子免疫療法に供することができるメモリーＴ細胞を、抗体等を使用することなく、簡便かつ迅速により効率的に増殖することができ、その結果、メモリーＴ細胞を大量に製造することができる。Moreover, in Patent Document 5,
(a) activating and culturing the collected lymphocyte cells in the presence of IL-2 and immobilized anti-CD3 antibody;
(b) an increase in the occupancy rate of the memory T cell group is detected based on the cell density of lymphocytes floating in the medium during the activation culture in step (a), and the cell density is 4 × 10 5 cells/ A step of harvesting and cryopreserving the lymphocyte cells of step (a) using mL or more as an indicator; and
(c) thawing the frozen lymphocyte cells and culturing them for activation;
A method for producing a lymphocyte cell group composed mainly of memory T cells by a high-proliferation culture method sequentially comprising
Using such a production method, memory T cells that can be subjected to adoptive immunotherapy can be proliferated simply, rapidly and more efficiently without using antibodies or the like, and as a result, memory T cells can be produced in large quantities. can be manufactured.

また、メモリーＴ細胞に特に限定せず、細胞傷害性リンパ球を効率的に増殖する方法として、例えば特許文献６には、培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法が開示されている。また、特許文献７には、インビトロで培地中の最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大するための方法であって、
インビトロで培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程；
少なくとも１つのＴ細胞刺激成分を発現する、***していない哺乳動物細胞株を培地に添加する工程であって、ここで、該細胞株はＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）でない、工程；及び、
培養物をインキュベートする工程を包含する、方法が開示されている。
また、特許文献８には、リンパ球細胞の成長及び増殖に適した細胞培地を作製する方法であって、
ａ）第１のドナーに由来する第１の血液製剤を少なくとも提供する工程、
ｂ）前記第１の血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記場合以外の場合には、前記第１の血液製剤を選択しない工程
を含む、
２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞液を作製する方法が開示されている。In addition, as a method for efficiently proliferating cytotoxic lymphocytes, not particularly limited to memory T cells, for example, Patent Document 6 discloses that the total concentration of serum and plasma in the medium is 0% by volume or more and 5% by volume. performing at least one selected from induction, maintenance and expansion of cytotoxic lymphocytes in the presence of fibronectin, fragments thereof, or mixtures thereof using a medium that is less than A method for producing cytotoxic lymphocytes is disclosed. Also, in US Pat. No. 6,300,000, a method for rapidly expanding an initial T lymphocyte population in culture in vitro comprising:
adding an initial T lymphocyte population to the culture medium in vitro;
adding to the medium a non-dividing mammalian cell line expressing at least one T cell stimulatory component, wherein the cell line is an EBV-transformed lymphoblastoid cell line (LCL); is not a step; and
A method is disclosed comprising incubating the culture.
In addition, Patent Document 8 discloses a method for producing a cell culture medium suitable for the growth and proliferation of lymphocytes, comprising:
a) providing at least a first blood product derived from a first donor;
b) measuring the concentration of at least one quality factor in said first blood product;
c) comparing the measured quality factor concentration to a predetermined concentration range for said quality factor;
d) if the measured concentration for said quality factor is within said predetermined range, selecting said first blood product for cell culture medium, wherein said first selected blood product is further selected; into the first processed blood product, otherwise comprising the step of not selecting said first blood product.
A method of making a cell fluid containing a mixture of blood products from two or more donors is disclosed.

また、一般的な動物細胞用の培地として、特許文献９には、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする、動物細胞培養用の無血清培地が開示されており、間葉系幹細胞用の培地として、特許文献１０には、化学的に定められている無血清細胞培地であって、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
ｉ）インスリン；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、化学的に定められている無血清細胞培地が開示されている。特許文献１０には、かかる無血清細胞培地における基礎培地として、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、トランスフェリン、電子伝達活性化因子（亜セレン酸など）、抗酸化剤（酢酸α－トコフェロール、アスコルビン酸－２－リン酸など）、ヒト血清アルブミンなどを含んでよいことが記載されており、基礎培地補充物質として、インスリンなどを含んでよいことが記載されている。しかし、特許文献９及び１０は、一般的な動物細胞や間葉系幹細胞用の培地の組成を開示しているに過ぎない。Further, as a general culture medium for animal cells, Patent Document 9 describes an animal culture medium containing insulin, transferrin, sodium selenite, ethanolamine, Pluronic F68, iron sulfate, putrescine and sodium pyruvate. A serum-free medium for cell culture is disclosed, and as a medium for mesenchymal stem cells, Patent Document 10 is a chemically defined serum-free cell medium comprising:
a) a serum-free basal medium;
b) a basal medium supplement,
i) insulin;
ii) one or more phospholipid growth factors; and iii) one or more WNT signaling pathway activators;
Disclosed are chemically defined serum-free cell culture media containing basal media supplements, including: Patent Document 10 discloses sodium pyruvate, HEPES, transferrin, electron transfer activators (such as selenious acid), antioxidants (α-tocopherol acetate, ascorbic acid-2- phosphoric acid, etc.), human serum albumin, etc., and insulin, etc., as basal medium supplements. However, Patent Documents 9 and 10 merely disclose the composition of media for general animal cells and mesenchymal stem cells.

前述の特許文献５のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法において、リンパ球細胞の培養には、リンパ球用の無血清合成培地であるＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地（インビトロジェン社製）にヒト血清及びｒＩＬ－２（組換えヒトインターロイキン－２）を添加した培地が用いられている。血清は、ロットにより成分の変動があり、また病原体混入のリスクもあるため、無血清培地が求められている。しかし、一般に、無血清培地を用いた場合は血清培地を用いた場合と比較して、細胞増殖率がかなり低くなることも多く、細胞増殖率の高い無血清培地を得ることは容易なことではない。 In the above-mentioned method for producing a lymphocyte cell group containing memory T cells as a main component of Patent Document 5, the culture of lymphocytes includes AIM-V (registered trademark) medium (a serum-free synthetic medium for lymphocytes) ( (manufactured by Invitrogen) to which human serum and rIL-2 (recombinant human interleukin-2) are added. Serum is required to be a serum-free medium because the components of serum vary from lot to lot and there is a risk of contamination with pathogens. However, in general, when serum-free medium is used, the cell growth rate is often considerably lower than when serum medium is used, and it is not easy to obtain a serum-free medium with a high cell growth rate. do not have.

特開平３－８００７６号公報JP-A-3-80076 特許第４３８９０３９号公報Japanese Patent No. 4389039 特開２００２－１７１９６６号公報JP-A-2002-171966 特許第４３９５６４４号公報Japanese Patent No. 4395644 特許第６１４２１４２号公報Japanese Patent No. 6142142 国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレットWO 2005/019450 Pamphlet 特表２００２－５１６５６２号公報Japanese Patent Publication No. 2002-516562 特表２０１７－５２２９０２号公報Japanese translation of PCT publication No. 2017-522902 特開２０１７－１６３８７６号公報JP 2017-163876 A 特表２０１３－５２９９１７号公報Japanese translation of PCT publication No. 2013-529917

第３２回癌免疫外科研究会 プログラム・抄録集 １０３ページ 平成２３年４月The 32nd Cancer Immuno-Surgery Research Meeting Program/Abstract Page 103 April 2011 Sekine T., Human Cell, 5(3) 243-245 (1992)Sekine T., Human Cell, 5(3) 243-245 (1992) Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 257-262 (2009)Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 257-262 (2009)

本発明の課題は、ヒトリンパ球細胞の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a serum-free medium that provides a high cell growth rate when used for culturing human lymphocyte cells, and to provide a method for culturing human lymphocyte cells using such a serum-free medium. It is in.

発明を解決するための手段Means for solving the invention

本発明者らは、ヒトリンパ球細胞の増殖効率を上昇させることを目的として培地成分の様々な組合せについて鋭意検討を重ねた結果、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのモノエタノールアミンを含有する無血清培地をヒトリンパ球細胞の培養に用いると、培地のロット間差がほとんどなく、安全性が高く、かつ、高い増殖効率が得られることを見いだし、本発明を完成するに至った。 The present inventors have extensively studied various combinations of medium components for the purpose of increasing the growth efficiency of human lymphocyte cells. L of human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg/L glutathione, 9-54 mg/L ascorbic acid phosphate or its When a serum-free medium containing salt and 3 to 37 mg/L of monoethanolamine is used for culturing human lymphocyte cells, there is almost no difference between medium lots, high safety, and high growth efficiency can be obtained. I found that it can be done, and came to complete the present invention.

すなわち、本発明は、
（１）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（２）さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（１）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（３）１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１～７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５～１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、上記（２）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（４）抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、上記（１）～（３）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（５）動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法；や、
（７）ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット；や、
（８）キットがさらに、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有し、
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、さらに、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（７）に記載のキット；や、
（９）キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、上記（７）又は（８）に記載のキット；
に関する。That is, the present invention
(1) Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3 Serum-free medium for human lymphocyte cell culture containing ~15 mg/L glutathione, 9-54 mg/L ascorbic acid phosphate or its salt, and 3-37 mg/L ethanolamine;
(2) Furthermore, 0.02 to 0.6 g/L pyruvate, 1.3 to 34 μg/L selenite compound, 0.1 to 2.5 g/L L-alanyl-L-glutamine, 0.02 to 0.5 g/L antibiotics, 1 to 15 g/L buffers, and 2 to 50 μg/L acetic acid or salts thereof containing one or more selected from the group consisting of The serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to (1); and
(3) The buffer for human lymphocyte cell culture according to (2) above, wherein the 1 to 15 g/L buffer is 1 to 7 g/L HEPES and 0.5 to 10 g/L sodium bicarbonate. serum medium; and
(4) the serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to any one of (1) to (3) above, wherein the antibiotic is kanamycin and streptomycin;
(5) The basal medium for animal cell culture is DMEM/F-12, DMEM, EMEM, IMDM, GMEM, RPMI-1640, α-MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham 's Medium F-12K, ATCC-CRCM30, BME (Basal Medium Eagle), Fischer's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, RITC80-7 medium, MCDB105 medium, MCDB107 medium, MCDB153 medium , MCDB201 medium, NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB 752/1 medium, Williams' medium E, and ReproFF2 cell culture medium. , the serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to any one of the above (1) to (4);
(6) A method for culturing human lymphocytes, comprising the step of culturing human lymphocytes using the serum-free medium for culturing human lymphocytes according to any one of (1) to (5) above;
(7) A kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture,
The kit contains serum-free animal cell culture basal medium, human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine,
The serum-free medium for human lymphocyte cell culture is
Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg/L the kit containing L glutathione, 9 to 54 mg/L ascorbic acid phosphate or its salt, and 3 to 37 mg/L ethanolamine; and
(8) The kit further contains one or more selected from the group consisting of pyruvate, selenite compounds, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or salts thereof. contains,
The serum-free medium for human lymphocyte cell culture further contains 0.02-0.6 g/L pyruvate, 1.3-34 μg/L selenite compound, 0.1-2.5 g/L L - 1 or 2 selected from the group consisting of alanyl-L-glutamine, 0.02-0.5 g/L antibiotics, 1-15 g/L buffers and 2-50 μg/L acetic acid or salts thereof The kit according to (7) above, which contains at least one species; and
(9) The kit according to (7) or (8) above, wherein the kit further contains a serum-free animal cell culture basal medium;
Regarding.

本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。また、本発明の無血清培地は無血清であるので、培地のロット間差がほとんどなく、また、安全性の高いヒトリンパ球細胞を得ることができる。 According to the present invention, there is provided a serum-free medium that provides a high cell proliferation rate when used for culturing human lymphocytes (preferably human T lymphocytes), and human lymphocytes using such a serum-free medium. A method for culturing cells (preferably human T lymphocyte cells) and the like can be provided. In addition, since the serum-free medium of the present invention is serum-free, there is almost no difference between medium lots, and highly safe human lymphocyte cells can be obtained.

ヒトアルブミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表２参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 4 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of human albumin (see Table 2 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). ヒトトランスフェリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表３参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 4 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of human transferrin (see Table 3 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). ヒトインスリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表４参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 4 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of human insulin (see Table 4 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). グルタチオン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表５参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 10 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of glutathione (see Table 5 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表６参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 4 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of Mg ascorbate phosphate (see Table 6 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). エタノールアミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表７参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 10 is a diagram showing changes in the number of viable cells when lymphocytes are cultured using various media with different concentrations of ethanolamine (see Table 7 in Examples of the present application). The horizontal axis represents the elapsed time (h) from the start of culture, and the vertical axis represents the number of viable cells (pieces). 従来の血清培地又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 2 shows viable cell counts when lymphocytic cells are cultured for 14 days using a conventional serum medium or the preferred serum-free medium of the present invention. The vertical axis represents the number of viable cells (pieces). 既存の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。FIG. 2 is a diagram showing the number of viable cells when lymphocyte cells are cultured for 14 days using existing serum-free media (medium X, medium Y) or a suitable serum-free medium of the present invention. The vertical axis represents the number of viable cells (pieces).

本発明は、
［１］血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（以下、「本発明の無血清培地」とも表示する。）；や、
［２］本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含むヒトリンパ球細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」とも表示する。）；や、
［３］ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット（以下、「本発明のキット」とも表示する。）；
等を含む。
本発明において「培地」とは、「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。The present invention
[1] Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3 Serum-free medium for human lymphocyte cell culture containing ~15 mg/L glutathione, 9-54 mg/L ascorbic acid phosphate or its salt, and 3-37 mg/L ethanolamine (hereinafter referred to as "the present invention Also referred to as "serum-free medium".);
[2] A method for culturing human lymphocyte cells, comprising a step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium of the present invention (hereinafter also referred to as "the culture method of the present invention"); and
[3] A kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture,
The kit contains human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine,
The serum-free medium for human lymphocyte cell culture is
Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg/L L glutathione, 9 to 54 mg/L ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and the kit containing 3 to 37 mg/L ethanolamine (hereinafter also referred to as "the kit of the present invention");
etc.
In the present invention, the term "medium" refers to a state in which water is added to the "medium components".

１．［本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地］
本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（本発明の無血清培地）としては、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミン（これらを総称して「必須成分」とも表示する。）を含有している培地が挙げられる。また、本発明の無血清培地には、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを添加してなる培地が含まれる。1. [Serum-free medium for human lymphocyte cell culture of the present invention]
As the serum-free medium for human lymphocyte cell culture of the present invention (serum-free medium of the present invention),
Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg/L A medium containing L of glutathione, 9 to 54 mg/L of ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and 3 to 37 mg/L of ethanolamine (these are collectively referred to as "essential ingredients"). is mentioned. In addition, the serum-free medium of the present invention contains
0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg in serum-free animal cell culture basal medium /L of glutathione, 9-54 mg/L of ascorbic acid phosphate or its salt, and 3-37 mg/L of ethanolamine.

（ヒトリンパ球細胞）
本発明において「ヒトリンパ球細胞」とは、ヒトのリンパ球細胞を意味し、ヒトから採取されたリンパ球細胞や、ヒトから採取されたリンパ球細胞から増殖したリンパ球細胞や、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導したヒトのリンパ球細胞等が挙げられる。ヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、ヒトリンパ球細胞は、末梢血由来リンパ球細胞、臍帯血由来リンパ球細胞、骨髄由来リンパ球細胞等が挙げられるが、採取の機会や採取の容易さから末梢血由来リンパ球細胞が好ましく挙げられる。また、本発明において「ヒトリンパ球細胞」は、凍結保存されたヒトリンパ球細胞を解凍したヒトリンパ球細胞であってもよい。これらのことから、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。(human lymphocyte cells)
In the present invention, "human lymphocytic cells" means human lymphocytic cells, such as lymphocytic cells collected from humans, lymphocytic cells proliferated from lymphocytic cells collected from humans, and iPS cells. Examples include human lymphocyte cells differentiated from stem cells. Human lymphocytes are preferably human T lymphocytes, more preferably CD3-positive T lymphocytes. Human lymphocytes include peripheral blood-derived lymphocytes, umbilical cord blood-derived lymphocytes, bone marrow-derived lymphocytes, and the like. Peripheral blood-derived lymphocytes are preferred because of their availability and ease of collection. be done. In addition, in the present invention, "human lymphocyte cells" may be human lymphocyte cells obtained by thawing cryopreserved human lymphocyte cells. Based on these facts, the human lymphocyte cells in the present invention are peripheral blood-derived human T lymphocyte cells (preferably peripheral blood-derived human T lymphocyte cells, which are cryopreserved and then thawed. Among them, peripheral blood-derived CD3-positive human T lymphocyte cells (preferably peripheral blood-derived CD3-positive human T lymphocyte cells, and cryopreserved Human T lymphocyte cells that have been thawed after being thawed) are particularly preferred.

（ヒトアルブミン）
本発明において用いられるヒトアルブミンとしては、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、ヒト型の遺伝子組換え体のアルブミン（リコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＳＡ））などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているｒＨＳＡとしては、sigma aldrich社A9731（型番）、Science Research Laboratory社OsrHSA-10（型番）、Healthgen Biotechnology社HY01E-10g（型番）、eEnzyme（登録商標）社HSA-1r（型番）、BioVerde社IBK-A1-10（型番）等の組換えイネ由来の製品；や、sigma aldrich社A7223（型番）、A6608（型番）、A7736（型番）、novozymes社のAlbucult（登録商標）（製品名）、Recombumin alpha（登録商標）（製品名）、AlbIX（登録商標）（製品名）等の組換え酵母由来の製品；が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来アルブミンとしては、CSLベーリング社の「アルブミナ－２０％静注」（製品名）や「アルブミナ－２５％静注」（製品名）、sigma aldrich社A1887（型番）、A1653（型番）、A9511（型番）、A3782（型番）、A8763（型番）、A4327（型番）、Biological Industries社Bio-Pure HSA 10% Solution（製品名）等の製品が挙げられる。(human albumin)
Examples of the human albumin used in the present invention include naturally occurring albumin such as human-derived albumin, and human-type genetically-recombinant albumin (recombinant human albumin (rHSA)), which are commercially available. or prepared by yourself. Commercially available rHSAs include A9731 (model number) from sigma aldrich, OsrHSA-10 (model number) from Science Research Laboratory, HY01E-10g (model number) from Healthgen Biotechnology, HSA-1r (model number) from eEnzyme (registered trademark), Recombinant rice-derived products such as BioVerde IBK-A1-10 (model number); ), Recombumin alpha (registered trademark) (product name), AlbIX (registered trademark) (product name), and other recombinant yeast-derived products; In addition, as commercially available human plasma-derived albumin, CSL Behring "Albumina-20% intravenous injection" (product name) and "Albumina-25% intravenous injection" (product name), Sigma Aldrich A1887 (model number) , A1653 (model number), A9511 (model number), A3782 (model number), A8763 (model number), A4327 (model number), and Bio-Pure HSA 10% Solution (product name) from Biological Industries.

本発明の無血清培地中のヒトアルブミン含量又は本発明の無血清培地へのヒトアルブミンの添加量としては、０．２～５ｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～４ｇ／Ｌ、より好ましくは１～４ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５～２．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．７～２．３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．８～２．２ｇ／Ｌ、特に好ましくは２ｇ／Ｌが挙げられる。 The content of human albumin in the serum-free medium of the present invention or the amount of human albumin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.2 to 5 g/L. From the viewpoint of balance of production cost, preferably 0.3 to 4 g / L, more preferably 1 to 4 g / L, still more preferably 1 to 3 g / L, more preferably 1.5 to 2.5 g / L, further It is preferably 1.7 to 2.3 g/L, more preferably 1.8 to 2.2 g/L, and particularly preferably 2 g/L.

（ヒトトランスフェリン）
本発明において用いられるヒトトランスフェリンとしては、ヒト由来トランスフェリン等の天然由来のトランスフェリンや、ヒト型の遺伝子組換え体のトランスフェリン（リコンビナントヒトトランスフェリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトトランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン，ヒト，組換え体」205-18084（型番）、sigma aldrich社T3705（型番）、PROSPEC社PRO-747（型番）等の組換えイネ由来の製品が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来トランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン（ホロ），ヒト血液由来」208-18971（型番）、sigma aldrich社90190（型番）等が挙げられる。(human transferrin)
Examples of the human transferrin used in the present invention include naturally occurring transferrin such as human-derived transferrin, and human-type genetically modified transferrin (recombinant human transferrin). It may be one prepared by oneself. Examples of commercially available recombinant human transferrin include Fuji Film Wako Pure Chemicals "Transferrin, Human, Recombinant" 205-18084 (model number), Sigma Aldrich T3705 (model number), PROSPEC PRO-747 (model number), and the like. Products derived from recombinant rice are included. In addition, commercially available transferrin derived from human plasma includes "Transferrin (holo), derived from human blood" 208-18971 (model number) manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 90190 (model number) manufactured by Sigma Aldrich, and the like.

本発明の無血清培地中のヒトトランスフェリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトトランスフェリンの添加量としては、０．２～１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３～３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７～１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。 The content of human transferrin in the serum-free medium of the present invention or the amount of human transferrin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.2 to 15 mg/L. From the viewpoint of balance of production cost, preferably 0.3 to 6 mg/L, more preferably 0.3 to 4 mg/L, still more preferably 0.3 to 3 mg/L, more preferably 0.5 to 2 mg/L , more preferably 0.7 to 1.5 mg/L, more preferably 0.7 to 1.3 mg/L, still more preferably 0.8 to 1.2 mg/L, and particularly preferably 1 mg.

（ヒトインスリン）
本発明において用いられるヒトインスリンとしては、ヒト型の遺伝子組換え体のインスリン（リコンビナントヒトインスリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトインスリンとしては、富士フィルム和光純薬社094-06484（型番）、sigma aldrich社I9278（型番）等の組換え酵母由来の製品；や、Cell Prime（登録商標）社のr Insulin等の組換え大腸菌由来の製品；が挙げられる。(human insulin)
Examples of human insulin used in the present invention include human-type genetic recombinant insulin (recombinant human insulin), which may be commercially available or prepared by oneself. Commercially available recombinant human insulin includes recombinant yeast-derived products such as Fujifilm Wako Pure Chemical Co. 094-06484 (model number) and Sigma Aldrich I9278 (model number); recombinant E. coli-derived products such as insulin;

本発明の無血清培地中のヒトインスリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトインスリンの添加量としては、０．３～５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３～３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７～１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。 The human insulin content in the serum-free medium of the present invention or the amount of human insulin added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.3 to 5 mg/L. From the viewpoint of balance of production cost, preferably 0.3 to 8 mg/L, more preferably 0.3 to 5 mg/L, still more preferably 0.3 to 3 mg/L, more preferably 0.5 to 2 mg/L , more preferably 0.7 to 1.5 mg/L, more preferably 0.7 to 1.3 mg/L, still more preferably 0.8 to 1.2 mg/L, and particularly preferably 1 mg.

（グルタチオン）
本発明において用いられるグルタチオンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているグルタチオンとしては、富士フィルム和光純薬社073-02013（型番）、sigma aldrich社G4251（型番）等が挙げられる。(glutathione)
The glutathione used in the present invention may be commercially available or self-prepared. Examples of commercially available glutathione include 073-02013 (model number) manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and G4251 (model number) manufactured by Sigma Aldrich.

本発明の無血清培地中のグルタチオン含量又は本発明の無血清培地へのグルタチオンの添加量としては、０．３～１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３～８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～６ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５～４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７～４．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２～４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５～３．５ｍｇ、特に好ましくは３ｍｇが挙げられる。 The content of glutathione in the serum-free medium of the present invention or the amount of glutathione added to the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as it is 0.3 to 15 mg / L, but the growth efficiency and production cost of human lymphocyte cells From the viewpoint of balance, preferably 0.3 to 8 mg / L, more preferably 0.3 to 6 mg / L, still more preferably 0.5 to 4.5 mg / L, more preferably 0.7 to 4.5 mg /L, more preferably 1 to 4.5 mg/L, more preferably 2 to 4 mg/L, still more preferably 2.5 to 3.5 mg, and particularly preferably 3 mg.

（アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩）
アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩におけるその塩としては、アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩として、アスコルビン酸リン酸エステル及びその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。アスコルビン酸リン酸エステルやその塩としては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているアスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩としては、富士フィルム和光純薬社013-19641（型番）（Ｌ－アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）、sigma aldrich社A8960（型番）（L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩 水和物）等が挙げられ、ナトリウム塩としては、sigma aldrich社49752（型番）（2-ホスホ-L-アスコルビン酸 三ナトリウム塩）等が挙げられる。(Ascorbic acid phosphate or its salt)
Examples of the ascorbic acid phosphate or salts thereof include magnesium salt, sodium salt, calcium salt, potassium salt and the like of ascorbic acid phosphate. As the ascorbic acid phosphate or its salt, one or more selected from the group consisting of ascorbic acid phosphate and its salt may be used. The ascorbic acid phosphate and its salt may be commercially available or may be prepared by oneself. Commercially available magnesium salts of ascorbic acid phosphate include Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 013-19641 (model number) (L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate), Sigma Aldrich A8960 (model number). (L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate) and the like, and sodium salts include sigma aldrich 49752 (model number) (2-phospho-L-ascorbic acid trisodium salt) and the like. .

本発明の無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地へのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の添加量としては、無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステルとその塩の合計濃度又は合計添加量が９～５４ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは１３～４５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８～４０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１９～３６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２２～３２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２４～３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２５～２９ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２７ｍｇが挙げられる。 As the content of ascorbic acid phosphate or its salt in the serum-free medium of the present invention or the amount of ascorbic acid phosphate or its salt added to the serum-free medium of the present invention, ascorbic acid phosphate in the serum-free medium The total concentration or total addition amount of the ester and its salt is not particularly limited as long as it is 9 to 54 mg/L, but is preferably 13 to 45 mg/L, more preferably 13 to 45 mg/L, from the viewpoint of the balance between the growth efficiency of human lymphocyte cells and the production cost. is 18 to 40 mg/L, more preferably 19 to 36 mg/L, more preferably 22 to 32 mg/L, still more preferably 24 to 30 mg/L, more preferably 25 to 29 mg/L, particularly preferably 27 mg. .

（エタノールアミン）
本発明において用いられるエタノールアミンとしては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンが挙げられ、中でも、モノエタノールアミンが好ましく挙げられる。エタノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。本発明において用いられるエタノールアミンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているモノエタノールアミンとしては、富士フィルム和光純薬社016-12453（型番）、sigma aldrich社E9508（型番）が挙げられ、市販されているジエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0376（型番）が挙げられ、市販されているトリエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0377（型番）が挙げられる。(ethanolamine)
Ethanolamine used in the present invention includes monoethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine, and among them, monoethanolamine is preferred. As ethanolamine, one or more selected from the group consisting of monoethanolamine, diethanolamine and triethanolamine may be used. Ethanolamine used in the present invention may be commercially available or prepared by oneself. Commercially available monoethanolamines include 016-12453 (model number) manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and E9508 (model number) manufactured by Sigma Aldrich Co., Ltd. Examples of commercially available diethanolamines include S0376 (model number ), and commercially available triethanolamines include S0377 (model number) manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.

本発明の無血清培地中のエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのエタノールアミンの添加量としては、前記３種のエタノールアミンの合計濃度又は合計添加量が３～３７ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは３～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４～１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６～１６ｍｇ／Ｌ、９～１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１～１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明の好適な態様として、本発明の無血清培地中のモノエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのモノエタノールアミンの添加量が、例えば３～３７ｍｇ／Ｌ、好ましくは３～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４～１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５～１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６～１６ｍｇ／Ｌ、９～１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１～１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌである場合が挙げられる。 As for the content of ethanolamine in the serum-free medium of the present invention or the amount of ethanolamine added to the serum-free medium of the present invention, the total concentration or the total amount of ethanolamine added is 3 to 37 mg/L. Although it is not particularly limited as long as the /L, more preferably 6 to 16 mg/L, 9 to 16 mg/L, more preferably 11 to 14 mg/L, and particularly preferably 12.3 mg/L. Further, as a preferred aspect of the present invention, the content of monoethanolamine in the serum-free medium of the present invention or the amount of monoethanolamine added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 3 to 37 mg/L, preferably 3. ~18.5 mg/L, more preferably 4-18.5 mg/L, more preferably 5-18.5 mg/L, more preferably 6-16 mg/L, 9-16 mg/L, more preferably 11-14 mg /L, particularly preferably 12.3 mg/L.

（血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地）
本明細書において「血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地」としては、血清を含有しない、動物細胞培養用基礎培地（以下、単に「基礎培地」とも表示する。）である限り特に制限されない。かかる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12）、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle’s minimal essential medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、ＧＭＥＭ（Glasgow’s Minimum Essential Medium）、ＲＰＭＩ－１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、α－ＭＥＭ（Alpha modification of Eagle’s minimal essential medium）、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社）からなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地等が挙げられる。また、幹細胞培養用に改変された培地や、上記基礎培地と他の培地との混合物等を用いてもよい(basal medium for animal cell culture without serum)
As used herein, the “serum-free animal cell culture basal medium” is not particularly limited as long as it is a serum-free animal cell culture basal medium (hereinafter simply referred to as “basal medium”). Examples of such basal medium include DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's minimal essential medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's Minimum Essential Medium), RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium), α-MEM (Alpha modification of Eagle's minimal essential medium), Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham 's Medium F-12K, ATCC-CRCM30, BME (Basal Medium Eagle), Fischer's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, RITC80-7 medium, MCDB105 medium, MCDB107 medium, MCDB153 medium , MCDB201 medium, NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB 752/1 medium, Williams' medium E, and one or more media selected from the group consisting of ReproFF2 cell culture medium (ReproCELL) A mixed medium etc. are mentioned. In addition, a medium modified for stem cell culture, a mixture of the above basal medium and other medium, etc. may be used.

（任意成分）
本発明の無血清培地は、上記の必須成分の他に、任意成分を含有してもよく、又は、任意成分を添加してなっていてもよい。好適な任意成分としては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸若しくは酢酸塩から選択される１種又は２種以上（以下、「特定の任意成分」とも表示する。）が挙げられる。また、本発明の無血清培地で用いる動物細胞培養用基礎培地の組成に、前述の１種又は２種以上の特定の任意成分が含まれている場合は、その基礎培地を含む本発明の無血清培地におけるその１種又は２種以上の特定の任意成分の含量を、後に例示するそれぞれの特定の任意成分の含量に調整することが好ましい。(Optional component)
The serum-free medium of the present invention may contain optional components in addition to the essential components described above, or may be formed by adding optional components. Preferred optional ingredients include one or more selected from pyruvate, selenite compound, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or acetate (hereinafter, " (also referred to as "specific optional ingredient"). In addition, when the composition of the basal medium for animal cell culture used in the serum-free medium of the present invention contains one or more of the above-mentioned specific optional components, the non-free medium of the present invention containing the basal medium is used. It is preferable to adjust the content of one or more specific optional ingredients in the serum medium to the content of each specific optional ingredient exemplified later.

上記のピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中のピルビン酸塩の含量又は本発明の無血清培地へのピルビン酸塩の添加量としては、例えば０．０２～０．６ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０７～０．２ｇ／Ｌが挙げられる。 Examples of the pyruvate include sodium pyruvate, potassium pyruvate, magnesium pyruvate, calcium pyruvate and the like. The content of pyruvate in the serum-free medium of the present invention or the amount of pyruvate added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 0.02-0.6 g/L, preferably 0.05-0. 25 g/L, more preferably 0.07 to 0.2 g/L.

上記の亜セレン酸化合物としては、亜セレン酸及び／又は亜セレン酸塩が挙げられ、かかる亜セレン酸塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン酸マグネシウム、亜セレン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の亜セレン酸化合物の含量又は本発明の無血清培地への亜セレン酸化合物の添加量としては、例えば１．３～３４μｇ／Ｌ、好ましくは３～１５μｇ／Ｌ、より好ましくは４～１０μｇ／Ｌが挙げられる。 The above selenite compounds include selenite and/or selenite, and such selenite includes sodium selenite, potassium selenite, magnesium selenite, calcium selenite. etc. The content of the selenite compound in the serum-free medium of the present invention or the amount of the selenite compound added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 1.3 to 34 μg/L, preferably 3 to 15 μg/L, More preferably 4 to 10 μg/L.

本発明の無血清培地中のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの含量又は本発明の無血清培地へのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの添加量としては、例えば０．１～２．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～１ｇ／Ｌが挙げられる。 The content of L-alanyl-L-glutamine in the serum-free medium of the present invention or the amount of L-alanyl-L-glutamine added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 0.1 to 2.5 g/L, Preferably 0.2 to 1.5 g/L, more preferably 0.3 to 1 g/L.

上記の抗生物質の種類としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン等のアミノグリコシド系抗生物質；ペニシリン（例えばペニシリンＧ）、アンピシリン、バカンピシリン等のβ－ラクタム系抗生物質；アムホテリシンＢ等のポリエン系抗生物質；などが挙げられ、カナマイシンとストレプトマイシンの組合せや、ペイシリンとストレプトマイシンの組合せが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の抗生物質の合計含量又は本発明の無血清培地への抗生物質の合計添加量としては、抗生物質の種類等にもよるが、例えば０．０２～０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３～０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌが挙げられる。本発明の無血清培地の好適な態様として、カナマイシンとストレプトマイシンの合計含量又は合計添加量が例えば０．０２～０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３～０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５～０．２５ｇ／Ｌであることが挙げられ、中でも、カナマイシンの含量又は添加量が例えば０．０２～０．３ｇ／Ｌ、好ましくは０．０４～０．１６ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０６～０．１２ｇ／Ｌであり、かつ、ストレプトマイシンの含量が例えば０．０１～０．９ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０２～０．０３５ｇ／Ｌであることが挙げられる。 Examples of the above antibiotics include aminoglycoside antibiotics such as kanamycin, streptomycin, gentamicin, tobramycin, and amikacin; β-lactam antibiotics such as penicillin (eg, penicillin G), ampicillin, and bacampicillin; polyene antibiotics such as amphotericin B; antibiotics; and the like, preferably a combination of kanamycin and streptomycin and a combination of paicillin and streptomycin. The total content of antibiotics in the serum-free medium of the present invention or the total amount of antibiotics added to the serum-free medium of the present invention is, for example, 0.02 to 0.5 g/ L, preferably 0.03-0.4 g/L, more preferably 0.05-0.25 g/L. As a preferred embodiment of the serum-free medium of the present invention, the total content or total addition amount of kanamycin and streptomycin is, for example, 0.02 to 0.5 g/L, preferably 0.03 to 0.4 g/L, more preferably 0. 0.05 to 0.25 g/L, and among them, the content or addition amount of kanamycin is, for example, 0.02 to 0.3 g/L, preferably 0.04 to 0.16 g/L, more preferably 0.06-0.12 g/L, and the streptomycin content is, for example, 0.01-0.9 g/L, preferably 0.015-0.7 g/L, more preferably 0.02-0. 035 g/L.

上記の緩衝剤としては、その緩衝剤を水に添加することによって緩衝液を作製することができ、かつ、その緩衝液がヒトリンパ球細胞の培養を妨げない限り、緩衝剤の種類や濃度等は特に制限されないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等が挙げられ、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳを併用することが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の緩衝剤の含量又は本発明の無血清培地への緩衝剤の添加量としては、緩衝剤の種類等にも左右されるため一概に規定することはできないが、緩衝剤の合計含量又は合計添加量として、例えば１～１５ｇ／Ｌ、好ましくは２～１２ｇ／Ｌ、より好ましくは４～１０ｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明において炭酸水素ナトリウムとＨＥＰＥＳを併用する場合のそれぞれの含量又は添加量としては、例えば０．５～１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．８～７ｇ／Ｌ、より好ましくは１～４ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、例えば１～７ｇ／Ｌ、好ましくは２～６ｇ／Ｌ、より好ましくは３～５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳが挙げられる。 As for the above-mentioned buffer, the buffer can be prepared by adding the buffer to water, and the buffer does not interfere with the culture of human lymphocyte cells. Examples include, but are not limited to, sodium hydrogen carbonate and HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), and sodium hydrogen carbonate and HEPES are preferably used in combination. The content of the buffering agent in the serum-free medium of the present invention or the amount of buffering agent added to the serum-free medium of the present invention depends on the type of buffering agent, etc., and cannot be generally defined. The total content or total added amount of the agents is, for example, 1 to 15 g/L, preferably 2 to 12 g/L, more preferably 4 to 10 g/L. Further, in the present invention, when sodium hydrogen carbonate and HEPES are used in combination, the content or addition amount of each is, for example, 0.5 to 10 g/L, preferably 0.8 to 7 g/L, more preferably 1 to 4 g/L. L of sodium bicarbonate and, for example, 1-7 g/L, preferably 2-6 g/L, more preferably 3-5 g/L of HEPES.

上記の酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の酢酸又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地への酢酸又はその塩の添加量としては、無血清培地中の酢酸とその塩の合計濃度が例えば２～５０μｇ／Ｌ、好ましくは３～４０μｇ／Ｌ、より好ましくは５～２０μｇ／Ｌが挙げられる。 Examples of the above acetate include sodium acetate, magnesium acetate, calcium acetate and the like. The content of acetic acid or salts thereof in the serum-free medium of the present invention or the amount of acetic acid or salts thereof added to the serum-free medium of the present invention is such that the total concentration of acetic acid and salts thereof in the serum-free medium is, for example, 2 to 50 μg. /L, preferably 3 to 40 μg/L, more preferably 5 to 20 μg/L.

本発明の無血清培地は、水と必須成分を混合すること、好ましくは、水と必須成分と任意成分を混合することにより調製することができる。添加する水の量は、当業者であれば、無血清培地の組成にしたがって適宜決定することができる。 The serum-free medium of the present invention can be prepared by mixing water with essential ingredients, preferably by mixing water with essential ingredients and optional ingredients. The amount of water to be added can be appropriately determined by those skilled in the art according to the composition of the serum-free medium.

本発明の無血清培地は、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。かかる容器としては、市販の培地に用いられる通常の容器等を用いることができる。 From the viewpoint of distribution and storage, the serum-free medium of the present invention is preferably in a container. As such a container, a normal container or the like used for commercially available culture media can be used.

２．［本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法］
本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法（本発明の培養方法）としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含んでいる限り特に制限されない。2. [Method for culturing human lymphocyte cells of the present invention]
The method for culturing human lymphocyte cells of the present invention (the culture method of the present invention) is not particularly limited as long as it includes the step of culturing human lymphocyte cells using the serum-free medium of the present invention.

（ヒトリンパ球細胞）
前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、末梢血由来でＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。かかる末梢血としては、他者由来末梢血や自己由来末梢血があげられるが、培養して得られるヒトリンパ球細胞を養子免疫療法に用いる場合には自己由来末梢血が有利に用いられる。腫瘍及びその再発、ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患に対する予防及び治療の観点から、臓器又は骨髄移植等を受けた患者の場合は、移植臓器又は骨髄等の提供者由来の末梢血であることが好ましい。(human lymphocyte cells)
As described above, human lymphocytes in the present invention are preferably human T lymphocytes, more preferably CD3-positive T lymphocytes. In addition, peripheral blood-derived human T lymphocyte cells are preferred, and peripheral blood-derived CD3-positive T lymphocyte cells are more preferred. Examples of such peripheral blood include peripheral blood derived from another person and autologous peripheral blood. Autologous peripheral blood is advantageously used when cultured human lymphocytes are used for adoptive immunotherapy. From the perspective of prevention and treatment of tumors and their recurrence, as well as viral infections and autoimmune diseases, in the case of patients who have received organ or bone marrow transplantation, peripheral blood derived from the donor of the transplanted organ or bone marrow is recommended. preferable.

ヒトリンパ球細胞としては、単離されたヒトリンパ球細胞を用いることが好ましく、かかる単離されたヒトリンパ球細胞は、血管からの採血やフェレーシス等により採取された末梢血、好ましくは静脈から採取された末梢血を一般的手法で処理することにより得ることができる。末梢血からのリンパ球細胞の分離は、ショ糖や市販のリンパ球細胞分離剤等を用いた不連続密度勾配遠心法などの周知のリンパ球細胞分離法によって取得できる。リンパ球細胞単離用の末梢血は、血液の凝固が起こらないように、ヘパリンやクエン酸を加えたものを使用することができる。かかる末梢血の量は特に制限されず、ドナーの負担、採血の手間、リンパ球細胞の分離操作等に基づいて適宜設定することができ、１回に採血する量を０．０１ｍＬから１００ｍＬ程度、より好ましくは５ｍＬから５０ｍＬ程度、さらに好ましくは１０ｍＬから２０ｍＬとすることができる。 As human lymphocytes, it is preferable to use isolated human lymphocytes, and such isolated human lymphocytes are peripheral blood collected by blood collection from blood vessels, pheresis, etc., preferably collected from veins. It can be obtained by processing peripheral blood in a conventional manner. Lymphocyte cells can be separated from peripheral blood by a well-known lymphocyte cell separation method such as discontinuous density gradient centrifugation using sucrose, a commercially available lymphocyte cell separating agent, or the like. Peripheral blood for lymphocyte cell isolation can be used with heparin or citrate added to prevent blood coagulation. The amount of such peripheral blood is not particularly limited, and can be appropriately set based on the donor's burden, blood collection effort, lymphocyte cell separation operation, etc. The amount of blood collected per time is about 0.01 mL to 100 mL, It is more preferably about 5 mL to 50 mL, still more preferably 10 mL to 20 mL.

前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞の凍結保存処理の方法やその解凍処理の方法等は、後述するとおりである。 As described above, the human lymphocyte cells in the present invention include peripheral blood-derived human T lymphocyte cells (preferably peripheral blood-derived human T lymphocyte cells, which are cryopreserved and then thawed. Among them, peripheral blood-derived CD3-positive human T lymphocyte cells (preferably peripheral blood-derived CD3-positive human T lymphocyte cells, and cryopreserved Human T lymphocyte cells that have been thawed after being thawed) are particularly preferred. The method of cryopreservation treatment of human lymphocyte cells, the method of thawing treatment thereof, and the like are as described later.

（本発明の無血清培地を用いてヒト末梢血リンパ球細胞を培養する工程）
本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する限り特に制限されず、例えば、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で活性化することを含む培養（以下、「活性化培養」とも表示する。）であってもよいし、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で刺激せずに増殖する培養（以下、「増殖培養」とも表示する。）等であってもよい。上記のヒトリンパ球細胞刺激物質としては、マイトジェン、サイトカイン、抗原、抗体等の、ヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質が挙げられ、中でもヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質（ヒトＴリンパ球細胞刺激物質）が好ましく挙げられる。ヒトＴリンパ球細胞刺激物質としては、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体等が挙げられる。(Step of culturing human peripheral blood lymphocytes using the serum-free medium of the present invention)
The step of culturing human lymphocytes using the serum-free medium of the present invention is not particularly limited as long as human lymphocytes are cultured using the serum-free medium of the present invention. It may be a culture that includes activation with a substance (hereinafter also referred to as "activation culture"), or a culture that proliferates human lymphocyte cells without stimulation with a human lymphocyte cell stimulating substance (hereinafter, " Also displayed as "proliferation culture".), etc. may be used. The above-mentioned human lymphocyte cell stimulating substance includes substances that stimulate human T lymphocyte cells such as mitogens, cytokines, antigens, and antibodies. substances) are preferred. Human T lymphocyte cell stimulators include IL-2, anti-CD3 antibody and the like.

（活性化培養）
上記の活性化培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球刺激物質で活性化することを含む培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中、抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ－２（インターロイキン２）及び抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞を活性化するために、抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２を用いてリンパ球細胞を方法は、従来から知られている（例えば特開平３－８００７６号公報）ため、本発明の培養方法においてもその方法を参照することができる。例えば、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器中に、ＩＬ－２を添加した本発明の無血清培地を入れ、かかる無血清培地にヒトリンパ球細胞を浮遊させて培養する方法を好適に例示することができる。さらに、必要により、抗ＣＤ３抗体等の各種マイトジェンを使用してヒトリンパ球細胞の活性化を行うことができる。かかる抗ＣＤ３抗体としては、ヒトリンパ球細胞表面のＣＤ３表面抗原を認識して増殖・活性化を促進できる抗体であれば、どのようなものでも使用できる。リンパ球細胞の活性化刺激に使用する抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を使用して動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、容易性に優れた市販品のＯＫＴ－３抗体（製造元：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社や、タカラバイオ社等）を有利に使用することができる。(activation culture)
The above-mentioned activation culture is not particularly limited as long as it involves activating human lymphocyte cells (preferably human T lymphocyte cells) with a human lymphocyte stimulating substance. , methods of culturing human lymphocytes in the presence of anti-CD3 antibodies, among others, culturing human lymphocytes in the presence of IL-2 (interleukin 2) and anti-CD3 antibodies in the serum-free medium of the present invention A preferred method is to Methods for activating human lymphocytes using anti-CD3 antibody or IL-2 are conventionally known (for example, Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 3-80076). The method can also be referred to in For example, a suitable example is a method in which the serum-free medium of the present invention supplemented with IL-2 is placed in a culture vessel in which an anti-CD3 antibody has been immobilized, and human lymphocyte cells are suspended and cultured in the serum-free medium. be able to. Furthermore, if necessary, various mitogens such as anti-CD3 antibodies can be used to activate human lymphocytes. As such an anti-CD3 antibody, any antibody can be used as long as it can recognize the CD3 surface antigen on the surface of human lymphocytes and promote their proliferation and activation. The anti-CD3 antibody used to stimulate the activation of lymphocytes can be produced in animals or cells using purified CD3 molecules, but the commercially available OKT-3 antibody ( Manufacturers: eBioscience, Takara Bio, etc.) can be used advantageously.

上記の活性化培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば１～１０日間、好ましくは２～８日間、より好ましくは３～７日間、さらに好ましくは４～６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化及びＩＬ－２活性の低下を防ぐ等のために、１～７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１～５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。 The culture period of the above activation culture is not particularly limited, but can be, for example, 1 to 10 days, preferably 2 to 8 days, more preferably 3 to 7 days, and even more preferably 4 to 6 days. The frequency of changing the medium during this culture period is not particularly limited, but in order to prevent deterioration of the medium and a decrease in IL-2 activity, etc., it is preferable to replace the medium once every 1 to 7 days, and a new medium is added. It is preferable to add a new medium in an amount about 0.1 to 5 times the liquid volume of the medium before the addition.

上記の活性化培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を活性化することができる限り特に制限されないが、例えば３６～３８℃（好ましくは３６．５～３７．５℃）、湿度９０～９８％（好ましくは９３～９７％、より好ましくは９４～９６％）、ＣＯ２濃度２～１３％（好ましくは３～１０％、より好ましくは５～１０％）等が挙げられる。The culture conditions for the activation culture are not particularly limited as long as the human lymphocyte cells can be activated. (preferably 93 to 97%, more preferably 94 to 96%), CO 2 concentration of 2 to 13% (preferably 3 to 10%, more preferably 5 to 10%), and the like.

上記の活性化培養において、ヒトリンパ球細胞には、フラスコ底面に付着して増殖する細胞もあるし、活性化を受けた後、培地中に浮遊しながら増殖していく細胞もある。フラスコ底面に付着して増殖する細胞は、浮遊細胞と同様に生細胞である。活性化培養開始時から培地の液量を増加させずに活性化培養を行う方法を採用することもできるが、活性化培養の途中でさらに培地を添加し、その後、数日間（例えば１～２日間）、活性化培養を継続してヒトリンパ球細胞をさらに増殖する方法を採用することもできる。かかる培地の添加量としては、活性化培養開始時の培地の液量に対して０．５～２倍の液量が好ましく、中でも、活性化培養開始時の培地の液量と同量の液量がより好ましく挙げられる。活性化培養の途中でさらに培地を添加して活性化培養を継続する場合、培地中に浮遊するヒトリンパ球細胞のみを植え継ぐこともできるが、浮遊ヒトリンパ球細胞と、培養容器に接着したヒトリンパ球細胞の両方を植え継ぐこともできる。 In the above-described activation culture, some human lymphocytes proliferate while adhering to the bottom of the flask, while others proliferate while floating in the medium after being activated. Cells adhering to the bottom of the flask and proliferating are viable cells as well as floating cells. A method of performing activation culture without increasing the volume of the medium from the start of activation culture can also be adopted. days), a method of continuing the activation culture to further proliferate the human lymphocyte cells can also be adopted. The amount of the medium to be added is preferably 0.5 to 2 times the amount of the medium at the start of the activation culture, especially the same amount of the medium at the start of the activation culture. Amount is more preferred. When further medium is added during the activation culture and the activation culture is continued, only the human lymphocytes floating in the medium can be subcultured. It is also possible to pass both cells.

上記の活性化培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくする方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、活性化培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５～１．０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１．５×１０５～６．０×１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは４．０×１０５～６．０×１０５細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに２０～２００ｍＬ（好ましくは３０～１００ｍＬ、より好ましくは３０～７０ｍＬ、さらに好ましくは５０ｍＬ）の培地を使用する例や、２５ｃｍ２フラスコに２～２０ｍＬ（好ましくは３～１０ｍＬ、より好ましくは３～７ｍＬ、さらに好ましくは５ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。In the above-mentioned activation culture, there is no particular limit to the number of human lymphocytes used at the start of culture, but if the number of cells at the start of culture is too small in cell culture, the period until the cell growth curve rises will be prolonged. On the other hand, if the amount is too large, the growth of human lymphocytes will reach a plateau too early, making it difficult to adopt the method of increasing the culture scale by adding medium. There is a demerit that cells cannot be obtained. Considering these facts, the number of human lymphocytes used at the start of activation culture is, for example, 1.0×10 5 to 1.0×10 6 cells/mL, preferably 1.5×10 5 to 6 cells/mL. 0×10 5 cells/mL, more preferably 4.0×10 5 to 6.0×10 5 cells/mL. In addition, the volume of the culture vessel and the amount of culture solution can be appropriately selected in consideration of operability. 50 mL) of medium and an example of using 2 to 20 mL (preferably 3 to 10 mL, more preferably 3 to 7 mL, and even more preferably 5 mL) of medium in a 25 cm 2 flask can be given.

上記のように、本発明における活性化培養では、抗ＣＤ３抗体は、ヒトリンパ球細胞の増殖効率や操作の容易性の観点から、固相化して使用することが好ましい。抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としてはガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質からなる各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。入手が容易であるため、市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養用フラスコ等の器具を使用することもでき、その大きさは適宜選択することができる。前記抗体の固相化方法は、固相化した抗ＣＤ３抗体によりリンパ球細胞が刺激できる固相化方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、非特異的吸着による方法や化学結合による方法が挙げられる。より具体的な固相化方法としては、固相化する器具に抗ＣＤ３抗体の希釈液を分注し、例えば４～３７℃で２～２４時間静置する方法を挙げることができる。前記抗ＣＤ３抗体の希釈液は、抗ＣＤ３抗体を、滅菌したダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１～３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈して希釈液として用いることが好ましい。固相化した器具は、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時に前記希釈液を除去して、常温のダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄することが好ましい。また上記のように、本発明における活性化培養では、培養用培地液中にインターロイキン２（ＩＬ－２）を使用することがリンパ球細胞の増殖効率の観点から望ましい。ＩＬ－２は、培養用培地液の濃度が１～２０００Ｕ／ｍＬとなるように希釈して使用することが好ましい。かかるＩＬ－２としては市販品を用いることができる。ＩＬ－２は、水、生理食塩液、ダルベッコリン酸緩衝液、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ－Ｖ等の一般に広く用いられる動物細胞培養用基礎培地等に溶解して使用することができる。また一旦溶解したものは、活性の低下を防ぐために冷蔵保存することが好ましい。 As described above, in the activation culture of the present invention, the anti-CD3 antibody is preferably solid-phased and used from the viewpoint of proliferation efficiency of human lymphocyte cells and ease of manipulation. Various types of flasks, petri dishes, plates, and bags made of materials such as glass, polyurethane, polyolefin, and polystyrene can be used as the support for immobilizing the anti-CD3 antibody. Since it is easily available, a commercially available plastic sterilized flask for cell culture and the like can also be used, and the size thereof can be appropriately selected. The method for immobilizing the antibody may be any method as long as it can stimulate lymphocyte cells with the immobilized anti-CD3 antibody. A method by A more specific immobilization method includes dispensing a diluted solution of anti-CD3 antibody into a device to be immobilized and allowing it to stand, for example, at 4 to 37° C. for 2 to 24 hours. The anti-CD3 antibody diluent is preferably prepared by diluting the anti-CD3 antibody to a concentration of 1 to 30 μg/mL in a physiological buffer such as sterilized Dulbecco's phosphate buffer. The solid-phased instrument can be stored in a cold room or refrigerator (4°C) until use. At the time of use, the diluent is removed and a physiological buffer such as Dulbecco's phosphate buffer at room temperature is added. Washing is preferred. Moreover, as described above, in the activation culture of the present invention, it is desirable to use interleukin-2 (IL-2) in the culture medium from the viewpoint of proliferation efficiency of lymphocytes. IL-2 is preferably used after being diluted so that the concentration of the culture medium is 1 to 2000 U/mL. A commercial product can be used as such IL-2. IL-2 can be used by dissolving in water, physiological saline, Dulbecco's phosphate buffer, RPMI-1640, DMEM, IMDA, AIM-V, and other commonly used basal media for animal cell culture. . Moreover, once dissolved, it is preferable to store it in a refrigerator in order to prevent a decrease in activity.

本発明の培養方法が上記の活性化培養する工程を有する場合、かかる活性化培養する工程の後に、ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程、ヒトリンパ球細胞を増殖培養する工程、又は、その両方の工程をさらに有していてもよい。 When the culture method of the present invention has the above step of culturing for activation, after the step of culturing for activation, a step of cryopreserving human lymphocytes, a step of proliferating and culturing human lymphocytes, or both It may further have a step.

（凍結保存処理）
上記の「ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程」における凍結保存処理する方法としては、細胞凍結の一般的な方法を用いることができる。例えば、ヒトリンパ球細胞をバンバンカー（登録商標）（リンフォテック社製）、ＣＰ－１（極東製薬工業社製）、ＫＭバンカー（コージンバイオ社製）等の細胞凍結保存液製品に懸濁して凍結保存容器に格納し、その容器をＢＩＣＥＬＬ（登録商標）（日本フリーザー社製）に入れ、－８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で一時保管して２日後に、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として液体窒素中で保存することができる。また、凍結及び解凍した後の活性化培養における増殖の立ち上がりの早さを調整する観点から、１つの凍結保存容器に格納するリンパ球細胞数を調整することが望ましく、１つの凍結保存容器あたり１×１０７～５．０×１０７個を保存することが好ましい。複数の凍結保存容器に保存した細胞を合わせて凍結解凍後の培養に用いてもよいが、操作の容易性及び品質管理の観点から１つの凍結保存容器のリンパ球細胞を１つ又は２つ以上の培養容器に移して培養することが好ましい。(Cryopreservation treatment)
As a method of cryopreservation in the above-mentioned "step of cryopreservation of human lymphocyte cells", a general method of cell freezing can be used. For example, human lymphocyte cells are suspended in cell cryopreservation products such as Bambanker (registered trademark) (manufactured by Lymphotech), CP-1 (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Industry Co., Ltd.), KM Bunker (manufactured by Kohjin Bio). Store in a cryopreservation container, place the container in BICELL (registered trademark) (manufactured by Japan Freezer Co., Ltd.), temporarily store in an ultra-low temperature freezer (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.) at -80 ° C. After 2 days, transfer to a liquid nitrogen tank ( MVE) and stored as cryopreserved cells in liquid nitrogen. In addition, from the viewpoint of adjusting the speed of proliferation in the activated culture after freezing and thawing, it is desirable to adjust the number of lymphocytes stored in one cryopreservation container, and 1 per cryopreservation container. It is preferable to store ×10 7 to 5.0×10 7 cells. Cells stored in multiple cryopreservation containers may be combined and used for culture after freezing and thawing. It is preferable to transfer the cells to a culture vessel of 100.degree.

凍結保存処理したヒトリンパ球細胞の凍結保存期間としては、特に制限されず、例えば３０分間～２年間や１時間～１年間などが挙げられる。 The cryopreservation period of the cryopreserved human lymphocyte cells is not particularly limited, and examples thereof include 30 minutes to 2 years and 1 hour to 1 year.

凍結保存処理したヒトリンパ球細胞を解凍する方法としては、凍結細胞の一般的な解凍方法を用いることができる。例えば、３７℃のドライサーモユニット（タイテック社製）等を用いて、凍結したヒトリンパ球細胞を４分間加熱処理することにより解凍することができる。その後、かかる解凍したヒトリンパ球細胞を適量の培地に移しいれた後に室温にて遠心操作を行い、上清を除去することにより細胞凍結保存液を除去することが好ましい。 As a method for thawing cryopreserved human lymphocyte cells, a general method for thawing frozen cells can be used. For example, frozen human lymphocyte cells can be thawed by heating for 4 minutes using a 37° C. dry thermo unit (manufactured by Tytec) or the like. Thereafter, it is preferable to remove the cell cryopreservation medium by transferring the thawed human lymphocyte cells to an appropriate amount of medium, performing centrifugation at room temperature, and removing the supernatant.

解凍後のヒトリンパ球細胞はそのまま養子免疫療法に用いてもよいが、より高い治療効果を得る観点から、活性化培養を行うことが好ましく、活性化培養及び増殖培養を行うことがより好ましい。活性化培養については前述したとおりであり、増殖培養については後述するとおりである。 The thawed human lymphocyte cells may be directly used for adoptive immunotherapy, but from the viewpoint of obtaining a higher therapeutic effect, activation culture is preferably performed, and activation culture and proliferation culture are more preferably performed. The activation culture is as described above, and the proliferation culture is as described below.

（増殖培養）
上記の増殖培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球細胞刺激物質（好ましくはヒトＴリンパ球細胞刺激物質）で刺激せずに増殖する培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体の不存在下でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が好ましく挙げられる。(proliferation culture)
The above proliferation culture is not particularly limited as long as it is a culture in which human lymphocyte cells (preferably human T lymphocyte cells) are proliferated without being stimulated with a human lymphocyte cell stimulating substance (preferably a human T lymphocyte cell stimulating substance). First, for example, a method of culturing human lymphocyte cells (preferably human T lymphocyte cells) in the serum-free medium of the present invention. A preferred example is a method of culturing human lymphocyte cells (preferably human T lymphocyte cells) in the absence thereof.

上記の増殖培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば、１～２０日間、好ましくは１～１５日間、より好ましくは１～１０日間、さらに好ましくは２～８日間、より好ましくは３～７日間、さらに好ましくは４～６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化を防ぐ等のために、１～７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１～５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。 The culture period of the above-mentioned proliferation culture is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 days, preferably 1 to 15 days, more preferably 1 to 10 days, still more preferably 2 to 8 days, more preferably 3 to 7 days. days, more preferably 4 to 6 days. The frequency of changing the medium during this culture period is not particularly limited, but in order to prevent deterioration of the medium, etc., it is preferably performed once every 1 to 7 days, and the liquid volume of the medium before adding a new medium It is preferable to add fresh medium in an amount of about 0.1 to 5 times the amount.

上記の増殖培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を増殖することができる限り特に制限されないが、例えば３６～３８℃（好ましくは３６．５～３７．５℃）、湿度９０～９８％（好ましくは９３～９７％、より好ましくは９４～９６％）、ＣＯ２濃度２～１３％（好ましくは３～１０％、より好ましくは５～１０％）等が挙げられる。The culture conditions for the above proliferation culture are not particularly limited as long as human lymphocyte cells can be proliferated. is 93 to 97%, more preferably 94 to 96%), CO 2 concentration is 2 to 13% (preferably 3 to 10%, more preferably 5 to 10%), and the like.

上記の増殖培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくするなどの方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、増殖培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５～１．０×１０１０細胞／ｍＬ、好ましくは１．０×１０６～５．０×１０９細胞／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０７～１．０×１０９細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに５０～２００ｍＬ（好ましくは８０～１８０ｍＬ、より好ましくは１００～１８０ｍＬ）の培地を使用する例や、１０００ｍＬ容の培養バッグに５０～１０００ｍＬ（好ましくは１００～１０００ｍＬ、より好ましくは２００～１０００ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。In the above growth culture, there is no particular limit to the number of human lymphocytes used at the start of culture, but if the number of cells at the start of culture is too small in cell culture, the disadvantage is that the period until the cell growth curve rises will be prolonged. On the other hand, if the amount is too high, the proliferation of human lymphocytes will reach a plateau too early, making it difficult to adopt methods such as increasing the culture scale by adding medium. There is a demerit that it is not possible to obtain cells of Taking these things into account, the number of human lymphocytes used at the start of proliferation culture is, for example, 1.0×10 5 to 1.0×10 10 cells/mL, preferably 1.0×10 6 to 5.0×10 10 cells/mL. 0×10 9 cells/mL, more preferably 1.0×10 7 to 1.0×10 9 cells/mL. In addition, the volume of the culture vessel and the amount of culture solution can be appropriately selected in consideration of operability. An example of use and an example of using 50 to 1000 mL (preferably 100 to 1000 mL, more preferably 200 to 1000 mL) of medium in a 1000 mL culture bag can be given.

３．［ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキット］
本発明のキットは、本発明の無血清培地を調製するためのキットである。すなわち、本発明のキットは、
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２～５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２～１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３～１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、１０～６０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３～３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キットである。本発明のキットにおける「本発明の無血清培地」は、前述したとおりである。3. [Kit for preparing serum-free medium for human lymphocyte cell culture]
The kit of the present invention is a kit for preparing the serum-free medium of the present invention. That is, the kit of the present invention is
A kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture, comprising:
The kit contains human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or a salt thereof, and ethanolamine,
The serum-free medium for human lymphocyte cell culture is
Serum-free basal medium for animal cell culture, 0.2-5 g/L human albumin, 0.2-15 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 0.3-15 mg/L L of glutathione, 10 to 60 mg/L of ascorbic acid phosphate or its salt, and 3 to 37 mg/L of ethanolamine. The "serum-free medium of the present invention" in the kit of the present invention is as described above.

本発明のキットは、本発明の無血清培地のうち、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地以外の成分を少なくとも含有している。本発明のキットとしては、かかるキットと、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を用いることによって、本発明の無血清培地を調製することができる限り、特に制限はない。血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地は、本発明のキットの使用者が別途用意したものを使用することができる。本発明の無血清培地を調製する方法としては、血清を含有しない、液体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分を添加等する方法や、血清を含有しない、固体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分及び水を添加等する方法などが挙げられる。 The kit of the present invention contains at least the components of the serum-free medium of the present invention other than the serum-free basal medium for animal cell culture. The kit of the present invention is not particularly limited as long as the serum-free medium of the present invention can be prepared by using the kit and a serum-free basal medium for animal cell culture. The serum-free basal medium for animal cell culture may be prepared separately by the user of the kit of the present invention. As a method for preparing the serum-free medium of the present invention, there is a method of adding the components of such a kit to a serum-free, liquid basal medium for animal cell culture, or a serum-free, solid animal cell culture medium. Examples include a method of adding the components of the kit and water to the basal medium.

本発明のキットとしては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上、又は、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地をさらに含有することが好ましく挙げられ、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上と、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地とをさらに含有することがより好ましく挙げられる。 The kit of the present invention includes one or more selected from the group consisting of pyruvate, selenite compounds, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or salts thereof; Alternatively, it preferably further contains a serum-free animal cell culture basal medium, pyruvate, selenite compound, L-alanyl-L-glutamine, antibiotics, buffers, and acetic acid or its More preferably, it further contains one or more selected from the group consisting of salts and a serum-free basal medium for animal cell culture.

本発明のキットの各成分は、液体であってもよいし、粉状、粒状等の固体であってもよい。また、液体か固体かは、各成分毎に異なっていてもよい。本発明のキットは、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。本発明のキットにおいて、各成分毎にそれぞれ１つの容器に入っていてもよいし、１つの容器に２種又は２種以上の成分が入っていてもよいし、かかるキットのすべての成分が１つの容器に入っていてもよい。かかる容器としては、本発明のキットに類する製品に用いられる通常の容器等を用いることができる。 Each component of the kit of the present invention may be liquid or solid such as powder or granule. Moreover, liquid or solid may be different for each component. From the viewpoint of distribution and storage, the kit of the present invention is preferably in a container. In the kit of the present invention, each component may be contained in one container, or two or more components may be contained in one container, or all components of such kit may be contained in one container. may be in one container. Usual containers and the like used for products similar to the kit of the present invention can be used as such containers.

以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following descriptions.

１．リンパ球細胞の調製及び培養の方法
（１）末梢血リンパ球細胞の調製
同意を得た健常者３名の末梢血各５０ｍＬを静脈からヘパリンを加えて採血した。各採血検体を２５０ｍＬの遠沈管（コーニング；４３０７７６）に移し、検体毎に洗浄用液（０．１％ヒトアルブミン添加生理食塩水：生理食塩液５００ｍＬ 製造元；大塚製薬株式会社、アルブミナ－２０％静注 製造元；ＣＳＬベーリング株式会社）１００ｍＬを加え静かに混和して３倍に希釈した。本操作を含む以下の操作は無菌的に行った。１検体あたり、１５ｍＬのフィコール（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を分注した５０ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン；352070）４本に、３倍希釈した血液を重層し、その遠沈管を１８００ｒｐｍで２０分間、室温でブレーキをかけずに遠心した（遠心機：株式会社コクサン製；H-700）。中間層の単核球層を、予め洗浄用液を分注した５０ｍＬ遠沈管に回収した。遠沈管の蓋を閉めて、２～３回、転倒混和して１８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心後に上清を除去し、ペレットを分散させた後に洗浄用液を添加し、総量５０ｍＬの細胞懸濁液とした。前記懸濁液を１８００ｒｐｍ、１０分間、常温にて遠心し、得られたペレットに５０ｍＬの培地Ａを加えて懸濁して細胞懸濁液とした。なお、培地Ａとして、後述の２．（２）に記載の各アルブミン検討試験用培地又はコントロール培地を用いて培養を行った。1. Method of Preparation and Cultivation of Lymphocyte Cells (1) Preparation of Peripheral Blood Lymphocyte Cells 50 mL each of peripheral blood from 3 healthy volunteers who gave consent was added to heparin and collected from a vein. Transfer each blood sample to a 250 mL centrifuge tube (Corning; 430776), wash solution for each sample (0.1% human albumin added physiological saline: physiological saline 500 mL Manufacturer; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., albumina-20% static Note Manufacturer: CSL Behring Co., Ltd.) 100 mL was added and mixed gently to dilute 3 times. The following operations including this operation were performed aseptically. Three-fold diluted blood was overlaid on four 50 mL centrifuge tubes (BD Falcon; 352070) in which 15 mL of Ficoll (manufactured by GE Healthcare Biosciences) was dispensed per sample, and the centrifuge tubes were centrifuged at 1800 rpm for 20 minutes. , and centrifuged at room temperature without braking (centrifuge: H-700 manufactured by Kokusan Co., Ltd.). The intermediate mononuclear cell layer was collected in a 50 mL centrifugation tube into which washing liquid had been dispensed in advance. The cap of the centrifuge tube was closed, mixed by inversion two or three times, and centrifuged at 1800 rpm for 15 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the pellet was dispersed, and a washing solution was added to make a cell suspension of 50 mL in total. The suspension was centrifuged at 1800 rpm for 10 minutes at room temperature, and 50 mL of medium A was added to the obtained pellet to suspend it to obtain a cell suspension. In addition, as the medium A, 2. below is used. Cultivation was performed using each albumin study test medium or control medium described in (2).

かかる細胞懸濁液の細胞数、生細胞数、及び、細胞の生存率は以下の方法により算出した。
（細胞数の測定法）
４０μＬのチュルク氏液（武藤化学薬品社製）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを加えて混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤（エルマー社製；9731）上に流し込み、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製；211320）下に細胞数（総細胞数）を算出した。The cell count, viable cell count, and cell viability of the cell suspension were calculated by the following methods.
(Method for measuring cell count)
Dispense 40 μL of Turk's solution (manufactured by Mutoh Chemical Co., Ltd.) into a 5 mL round tube (BD Falcon; 352008), add 10 μL of the above cell suspension and mix, and transfer 10 μL of the mixed solution to a Neubauer hemocytometer ( Elmer; 9731), and the number of cells (total cell number) was calculated under a microscope (Olympus Optical Co.; 211320).

（生細胞数、及び、細胞の生存率の測定法）
２０μＬのトリパンブルー染色液（SIGMA社製；93595）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤に流し込み、顕微鏡下に染色されていない生細胞数を計測した。かかる生細胞数と、前述の細胞数（総細胞数）から、生存率を算出した。(Method for measuring viable cell count and cell viability)
20 μL of trypan blue staining solution (manufactured by SIGMA; 93595) is dispensed into a 5 mL round tube (BD Falcon; 352008), 10 μL of the cell suspension is mixed with this, and 10 μL of the mixed solution is poured into a Neubauer hemocytometer. , the number of unstained viable cells was counted under a microscope. The survival rate was calculated from the number of viable cells and the aforementioned cell number (total cell number).

（２）ＯＫＴ３固相化フラスコの調製
ＯＫＴ３（製造元：タカラバイオ株式会社：Ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｍＡＢ ＧＭＰ ｇｒａｄｅ）溶液を生理食塩液で５μｇ／ｍＬに調製し、調製液１０ｍＬを底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）に分注し、その底面全面がＯＫＴ３溶液で覆われるようにした。フラスコを３時間以上静置した後、フラスコ内のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）を注ぎ込み、フラスコの蓋を閉めて激しく振蕩した後に、フラスコ内の液体を捨てた。再度、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）をフラスコ内に流し入れ、固相化面を下にして室温で１５分間静置した。その後、フラスコの蓋を閉めて、フラスコを１分間激しく振蕩した後、フラスコ内の液体を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取り、ＯＫＴ３固相化フラスコを得た。ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した当日に該フラスコを使用しない場合は、少量の生理食塩液をフラスコ内に残して使用時まで４℃で保存した。(2) Preparation of OKT3 immobilized flask OKT3 (manufacturer: Takara Bio Inc.: Anti-CD3 mAB GMP grade) solution is prepared with physiological saline to 5 μg / mL, and 10 mL of the prepared solution is used for culture with a bottom area of 225 cm 2 It was dispensed into a flask (manufactured by Sumitomo Bakelite Co.; MS-2180R) so that the entire bottom surface was covered with the OKT3 solution. After allowing the flask to stand for 3 hours or more, the OKT3 solution in the flask is sucked out with an aspirator, about 100 mL of physiological saline (manufacturer: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) is poured, the lid of the flask is closed, and the flask is shaken vigorously. Drain the liquid inside. About 100 mL of physiological saline (manufacturer: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was again poured into the flask, and the flask was allowed to stand with the immobilized surface down at room temperature for 15 minutes. After that, the lid of the flask was closed, the flask was vigorously shaken for 1 minute, and then the liquid in the flask was discarded. The liquid remaining in the flask and on the lid was carefully sucked out with an aspirator to obtain an OKT3 immobilized flask. When the OKT3-immobilized flask was not used on the day it was prepared, a small amount of physiological saline was left in the flask and stored at 4°C until use.

（３）リンパ球細胞の活性化培養
上記１．（１）で調製した細胞懸濁液を８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心して得られたリンパ球細胞に、リンパ球細胞の細胞密度が６×１０５個／ｍＬとなるように培地Ａを添加して細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液５０ｍＬを、上記１．（２）で作製した２２５ｃｍ２ＯＫＴ３固相化フラスコに分注し播種し、培地Ａを用いてテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始３日目に浮遊細胞数が４×１０５個／ｍＬを超えていたことから、５０ｍＬの培地Ａを添加して翌日まで培養を継続した。培養開始４日目に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収して培地Ａによる細胞懸濁液を得た。前記細胞懸濁液中の細胞数を上記１．（１）と同様の手順で計測した。(3) Activated Culture of Lymphocyte Cells Above 1. The cell suspension prepared in (1) was centrifuged at 800 rpm for 15 minutes at room temperature. A cell suspension was prepared by adding medium A to the lymphocyte cells obtained by centrifugation so that the cell density of the lymphocyte cells was 6×10 5 cells/mL. 50 mL of this cell suspension was added to the above 1. Dispense into the 225 cm 2 OKT3 immobilized flask prepared in ( 2 ) and inoculate. .0±5.0% and CO2 concentration of 5.0±0.2%. Since the number of floating cells exceeded 4×10 5 cells/mL on day 3 after the start of culture, 50 mL of medium A was added and culture was continued until the next day. On the 4th day after starting the culture, the activation culture was stopped, and the lymphocytes adhering to the bottom of the flask were detached by tapping to form floating cells. The number of cells in the cell suspension is determined according to the above 1. It was measured by the same procedure as (1).

（４）リンパ球細胞の凍結保存
上記１．（３）で計測した細胞密度をもとに、３検体について、凍結保存チューブ（コーニング社製）１本あたりのリンパ球細胞数を３×１０７個となるように、培地Ａを加えて調製し、１５ｍＬ遠沈管に分注して１２００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。遠心後、各遠沈管中の上清を除去し、得られたペレットを分散させ、凍結保存チューブ１本あたり１．８ｍＬの液量となるように細胞凍結保存液（ＣＰ－１：極東製薬工業株式会社製）を添加して細胞を懸濁して凍結保存チューブに分注し、その凍結保存チューブをバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、－８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で２日間一時保管した後、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として保存した。(4) Lymphocyte cell cryopreservation 1 above. Based on the cell density measured in (3), medium A was added to the three specimens so that the number of lymphocytes per cryopreservation tube (manufactured by Corning) was 3×10 7 . and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, remove the supernatant in each centrifuge tube, disperse the obtained pellet, cell cryopreservation solution (CP-1: Kyokuto Pharmaceutical Industry) so that the liquid volume is 1.8 mL per cryopreservation tube Co., Ltd.) is added to suspend the cells and dispensed into cryopreservation tubes, and the cryopreservation tubes are placed in Bicelles (manufactured by Nippon Freezer Co., Ltd.) and placed in an ultra-low temperature freezer (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.) at -80 ° C. After being temporarily stored for 2 days, they were transferred to a liquid nitrogen tank (MVE) and preserved as cryopreserved cells.

（５）凍結リンパ球細胞の解凍
上記１．（４）で凍結保存した凍結保存チューブを液体窒素タンクより取り出し、３７℃に設定したドライサーモユニット（タイテック社製）中で凍結保存チューブを４分間加温して、凍結リンパ球細胞を解凍した。解凍したリンパ球細胞を、１０ｍＬの培地Ａで懸濁しながら１５ｍＬ遠沈管に移し入れ、１２００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを分散させ１０ｍＬの培地Ａを添加して細胞懸濁液とし、上記１．（１）記載の方法と同じ方法で細胞数を計測した。解凍したリンパ球細胞は、チューブ毎に細胞数が異なるため、そのまま同量の培地で懸濁播種すると、播種細胞数の差が増殖に影響する可能性がある。この可能性を排除するために、解凍した細胞を播種して培養する工程では、播種前及び工程毎にリンパ球細胞数を計測し、播種時の細胞密度はもとより、添加する培地量を調製して細胞密度をほぼ一定とした（６×１０５個／ｍＬ）。
解凍した細胞懸濁液のうち、４０ｍＬの細胞懸濁液を２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ウェル当たり２ｍＬずつ播種し、播種日を第１日として３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内で２日間培養した。(5) Thawing frozen lymphocyte cells 1 above. The cryopreservation tube cryopreserved in (4) was removed from the liquid nitrogen tank, and the cryopreservation tube was heated for 4 minutes in a dry thermo unit (manufactured by Taitec Co., Ltd.) set at 37 ° C. to thaw the frozen lymphocyte cells. . The thawed lymphocyte cells were suspended in 10 mL of medium A, transferred to a 15 mL centrifuge tube, and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the pellet was dispersed, and 10 mL of medium A was added to obtain a cell suspension. (1) The number of cells was counted by the same method as described. Since the number of thawed lymphocytes differs from tube to tube, if the cells are seeded in suspension in the same volume of medium, the difference in the number of seeded cells may affect proliferation. In order to eliminate this possibility, in the process of seeding and culturing the thawed cells, the number of lymphocytes is measured before seeding and at each step, and the cell density at the time of seeding as well as the amount of medium to be added are adjusted. to keep the cell density almost constant (6×10 5 cells/mL).
Of the thawed cell suspension, 40 mL of cell suspension was seeded in a 24-well multiwell plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 2 mL per well. It was cultured for 2 days in a carbon dioxide gas incubator with a CO 2 concentration of 5.0%.

（６）解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養
ＯＫＴ３の固相化処理をしていない、底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）を用意した。上記１．（５）で解凍処理後に２日間培養したリンパ球細胞懸濁液（４０ｍＬ）を、３日目に２４穴マルチウェルプレートからそれぞれ前述のフラスコに移した。別途、５０ｍＬの培地Ａを用意し、その培地Ａで２４穴マルチウェルプレートのウェル内を洗浄して、ウェル内に残った細胞を回収し、各フラスコ内に移した。各フラスコ内の液量は、９０ｍＬとなった。(6) Expansion culture of lymphocyte cells after thawing treatment A culture flask (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.; MS-2180R) with a bottom area of 225 cm 2 without OKT3 immobilization treatment was prepared. 1 above. The lymphocyte cell suspension (40 mL) cultured for 2 days after the thawing treatment in (5) was transferred from the 24-well multiwell plate to the aforementioned flask on the 3rd day. Separately, 50 mL of medium A was prepared, the inside of the wells of the 24-well multiwell plate was washed with the medium A, and the cells remaining in the wells were collected and transferred into each flask. The liquid volume in each flask was 90 mL.

各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％にてリンパ球細胞の拡大培養を行った。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地の一部をサンプリングし、総細胞数及び生細胞数を計測した。Each flask was placed in a Teher-type CO2 incubator (manufactured by Hirasawa), and lymphocyte cell expansion was performed at a temperature of 37.0 ± 0.5°C, a humidity of 95%, and a CO2 concentration of 5.0%. rice field. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, part of the medium in the flask was sampled and the total cell number and viable cell number were counted.

２．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトアルブミンの影響］
培地中のヒトアルブミン（以下、単に「アルブミン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。2. [Influence of human albumin in medium on cell proliferation rate of human lymphocyte]
The following experiment was performed to investigate how the presence or absence and concentration of human albumin (hereinafter also simply referred to as "albumin") in the medium affects the cell growth rate of human lymphocyte cells.

（１）基本培地の調製
基本培地として、以下の表１に記載の組成の培地を調製した。(1) Preparation of basal medium As a basal medium, a medium having the composition shown in Table 1 below was prepared.

Figure 0007144872000001
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（２）アルブミン検討試験用培地の調製
上記基本培地にヒトアルブミン（CSLベーリング社製：「アルブミナ－２５％静注１２．５ｇ/５０ｍＬ」）を、０．３ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ又は１０．０ｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトアルブミンを添加しない基本培地を、コントロール培地（アルブミン０ｇ／Ｌ）とした。(2) Preparation of culture medium for albumin examination test Human albumin (manufactured by CSL Behring: "Albumina-25% intravenous injection 12.5 g/50 mL") was added to the above basal medium at 0.3 g/L, 1.0 g/L, Media supplemented with 3.0 g/L or 10.0 g/L were prepared, respectively. A basal medium to which human albumin was not added was used as a control medium (albumin 0 g/L).

（３）アルブミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
アルブミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表２に示す。また、表２の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図１に示す。(3) Cultivation of lymphocytes using an albumin study medium (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained at n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 2 below. In addition, among the results in Table 2, transitions in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000002
Figure 0007144872000002

表２及び図１の結果から、培地にアルブミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アルブミン濃度は、０．３ｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｇ／Ｌ以上がより好ましく、２ｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。ただ、アルブミン濃度２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌでは増殖効率にあまり差はなく、１０ｇ／Ｌではそれよりも増殖効率が低下したため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約２ｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アルブミン濃度を２ｇ／Ｌとした。 The results in Table 2 and FIG. 1 indicated that the addition of albumin to the medium significantly increased the growth efficiency of human lymphocyte cells. It was also shown that the albumin concentration is preferably 0.3 g/L or higher, more preferably 1 g/L or higher, and still more preferably 2 g/L or higher. However, albumin concentrations of 2 g/L, 3 g/L, and 4 g/L showed little difference in proliferation efficiency, and albumin concentrations of 10 g/L resulted in a lower proliferation efficiency than that. /L has been shown to be particularly preferred. Therefore, the albumin concentration was set to 2 g/L in the medium for the subsequent culture tests.

３．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトトランスフェリンの影響］
培地中のヒトトランスフェリン（以下、単に「トランスフェリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。3. [Effect of human transferrin in culture medium on cell proliferation rate of human lymphocyte cells]
The following experiment was conducted to investigate how the presence and concentration of human transferrin (hereinafter also simply referred to as "transferrin") in the medium affects the cell proliferation rate of human lymphocyte cells.

（１）トランスフェリン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン」）にヒトトランスフェリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：205-18084（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトトランスフェリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン」）を、コントロール培地（トランスフェリン０ｍｇ／Ｌ）とした。(1) Preparation of culture medium for transferrin examination test 2. Albumin was added to the basal medium of (1) to adjust the albumin concentration of the medium to 2 g/L (“basic medium + albumin”). Human transferrin (recombinant) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 205-18084 (model number)) was added to such a medium (“basic medium + albumin”) at 0.3 mg/L and 1.0 mg/L. Media supplemented with 0 mg/L or 10.0 mg/L were prepared, respectively. A medium (“basic medium + albumin”) to which human transferrin was not added was used as a control medium (transferrin 0 mg/L).

（２）トランスフェリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
トランスフェリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表３に示す。また、表３の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図２に示す。(2) Cultivation of Lymphocyte Cells Using Transferrin Examination Test Medium (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained at n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 3 below. In addition, among the results in Table 3, changes in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000003
Figure 0007144872000003

表３及び図２の結果から、培地にトランスフェリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、トランスフェリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｍｇ／Ｌ以上がより好ましいことが示された。また、トランスフェリンが１ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌでは増殖効率に大きな差はなかったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。 The results in Table 3 and FIG. 2 indicate that the addition of transferrin to the medium markedly increases the growth efficiency of human lymphocyte cells. Moreover, it was shown that the transferrin concentration is preferably 0.3 mg/L or more, more preferably 1 mg/L or more. In addition, transferrin of 1 mg/L, 3.0 mg/L, and 10.0 mg/L showed no significant difference in growth efficiency. shown. Therefore, the transferrin concentration was set at 1 mg/L in the medium for the subsequent culture tests.

４．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトインスリンの影響］
培地中のヒトインスリン（以下、単に「インスリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。4. [Influence of Human Insulin in Medium on Cell Proliferation Rate of Human Lymphocyte Cells]
The following experiment was performed to investigate how the presence or absence and concentration of human insulin (hereinafter also simply referred to as "insulin") in the medium affects the cell proliferation rate of human lymphocytes.

（１）インスリン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン及びトランスフェリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、及び、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）にヒトインスリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：094-06484（型番）））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトインスリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）を、コントロール培地（インスリン０ｍｇ／Ｌ）とした。(1) Preparation of medium for insulin examination test 2. Albumin and transferrin were added to the basal medium of (1) to adjust the albumin concentration of the medium to 2 g/L and the transferrin concentration to 1 mg/L (“basic medium + albumin + transferrin”). Human insulin (recombinant) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 094-06484 (model number))) is added to such a medium (“basic medium + albumin + transferrin”) at 0.3 mg/L and 1.0 mg/L. , 3.0 mg/L or 10.0 mg/L, respectively. A medium (“basic medium + albumin + transferrin”) to which human insulin was not added was used as a control medium (insulin 0 mg/L).

（２）インスリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
インスリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表４に示す。また、表４の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図３に示す。(2) Cultivation of Lymphocyte Cells Using Insulin Examination Test Medium (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained at n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 4 below. In addition, among the results in Table 4, changes in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000004
Figure 0007144872000004

表４及び図３の結果から、培地にインスリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、インスリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、約１ｍｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。３．０ｍｇ／Ｌでは１ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が低く、１０．０ｍｇ／Ｌでは、０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、インスリンは約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。 The results in Table 4 and FIG. 3 indicate that the addition of insulin to the medium markedly increases the growth efficiency of human lymphocyte cells. Also, it was shown that the insulin concentration is preferably 0.3 mg/L or more, and particularly preferably about 1 mg/L. At 3.0 mg/L, the proliferation efficiency was lower than at 1 mg/L, and at 10.0 mg/L, the proliferation efficiency was similar to that at 0 mg/L. It was shown that about 1.0 mg/L of insulin is preferable from the viewpoint of the balance between growth efficiency and production cost. Therefore, the insulin concentration was set to 1 mg/L in the culture medium for subsequent culture tests.

５．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のグルタチオンの影響］
培地中のグルタチオンの有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。5. [Influence of glutathione in medium on cell proliferation rate of human lymphocyte cells]
The following experiment was performed to investigate how the presence or absence and concentration of glutathione in the medium affect the cell proliferation rate of human lymphocyte cells.

（１）グルタチオン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン及びインスリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）にグルタチオン（富士フィルム和光純薬社製：073-02013（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、グルタチオンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）を、コントロール培地（グルタチオン０ｍｇ／Ｌ）とした。(1) Preparation of medium for glutathione study test 2. Albumin, transferrin and insulin were added to the basal medium of (1) to adjust the albumin concentration of the medium to 2 g/L, the transferrin concentration to 1 mg/L, and the insulin concentration to 1 mg/L (“basic medium + albumin + transferrin + insulin"). Glutathione (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 073-02013 (model number)) was added to such a medium (“basic medium + albumin + transferrin + insulin”) at 0.3 mg/L, 1.0 mg/L, and 3.0 mg/L. A medium supplemented with L or 10.0 mg/L was prepared, respectively. A medium without glutathione added (“basic medium + albumin + transferrin + insulin”) was used as a control medium (glutathione 0 mg/L).

（２）グルタチオン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
グルタチオン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表５に示す。また、表５の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図４に示す。(2) Cultivation of Lymphocyte Cells Using Glutathione Examination Test Medium (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained at n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 5 below. In addition, among the results in Table 5, changes in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000005
Figure 0007144872000005

表５及び図４の結果から、培地にグルタチオンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、グルタチオン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、３．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。１０．０ｍｇ／Ｌでは、３．０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、グルタチオンは約３．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌとした。 The results in Table 5 and FIG. 4 indicate that the addition of glutathione to the medium markedly increases the growth efficiency of human lymphocyte cells. It was also shown that the glutathione concentration is preferably 0.3 mg/L or higher, more preferably 1.0 mg/L or higher, and even more preferably 3.0 mg/L or higher. At 10.0 mg/L, the growth efficiency was similar to that of 3.0 mg/L. It was shown that about 3.0 mg/L of glutathione is preferable from the viewpoint of the balance between growth efficiency and production cost. Therefore, the glutathione concentration was set to 3 mg/L in the medium for subsequent culture tests.

６．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のアスコルビン酸リン酸マグネシウムの影響］
培地中のアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。6. [Influence of magnesium ascorbate phosphate in medium on cell proliferation rate of human lymphocyte cells]
The following experiment was conducted to investigate how the presence or absence and concentration of magnesium ascorbic acid phosphate (Mg ascorbic acid phosphate) in the medium affect the cell proliferation rate of human lymphocytes.

（１）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン及びグルタチオンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）にアスコルビン酸リン酸Ｍｇ（富士フィルム和光純薬社製：013-19641（型番））L-アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩n水和物：含量９０重量％）を、１０．０ｍｇ／Ｌ、３０．０ｍｇ／Ｌ又は５０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。(1) Preparation of Mg Ascorbate Phosphate Examination Test Medium 2 above. Albumin, transferrin, insulin and glutathione were added to the basal medium of (1), and the albumin concentration of the medium was adjusted to 2 g/L, the transferrin concentration to 1 mg/L, the insulin concentration to 1 mg/L, and the glutathione concentration to 3 mg/L. L ("basal medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione"). Mg ascorbate phosphate (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 013-19641 (model number)) L-ascorbyl phosphate magnesium salt n hydrated A medium containing 10.0 mg/L, 30.0 mg/L, or 50.0 mg/L was prepared, respectively. A medium (“basic medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione”) to which Mg ascorbyl phosphate was not added was used as a control medium (0 mg/L Mg ascorbyl phosphate).

（２）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表６に示す。また、表６の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図５に示す。(2) Cultivation of Lymphocyte Cells Using Mg Ascorbyl Phosphate Study Medium Using either the Mg ascorbate phosphate study medium or the control medium as medium A, the above 1. (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained at n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 6 below. In addition, among the results in Table 6, changes in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000006
Figure 0007144872000006

表６及び図５の結果から、培地にアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度は、９．０ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２７．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、４５．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。４５．０ｍｇ／Ｌでは、２７．０ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が高かったが、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、アスコルビン酸リン酸Ｍｇは約２７．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度を２７．０ｍｇ／Ｌとした。 The results in Table 6 and FIG. 5 indicated that the addition of Mg ascorbate phosphate to the medium markedly increased the growth efficiency of human lymphocyte cells. It was also shown that the Mg ascorbate phosphate concentration is preferably 9.0 mg/L or higher, more preferably 27.0 mg/L or higher, and even more preferably 45.0 mg/L or higher. At 45.0 mg/L, the growth efficiency was higher than at 27.0 mg/L, but it was shown that about 27.0 mg/L of Mg ascorbate phosphate is preferable from the viewpoint of the balance between growth efficiency and production cost. rice field. Therefore, the concentration of Mg ascorbate phosphate was set to 27.0 mg/L in the medium for the subsequent culture test.

７．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のモノエタノールアミンの影響］
培地中のモノエタノールアミン（２－アミノエタノール）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。7. [Influence of monoethanolamine in medium on cell proliferation rate of human lymphocyte cells]
The following experiment was conducted to investigate how the presence or absence and concentration of monoethanolamine (2-aminoethanol) in the medium affects the cell proliferation rate of human lymphocyte cells.

（１）モノエタノールアミン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン、グルタチオン及びアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを２７ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）にモノエタノールアミン（富士フィルム和光純薬社製：016-12453（型番））を添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオンアスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。(1) Preparation of culture medium for monoethanolamine investigation test 2. Albumin, transferrin, insulin, glutathione, and Mg ascorbate phosphate were added to the basal medium of (1) to adjust the albumin concentration to 2 g/L, the transferrin concentration to 1 mg/L, and the insulin concentration to 1 mg/L. , the glutathione concentration was adjusted to 3 mg/L and the Mg ascorbate phosphate to 27 mg/L ("basal medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione + Mg ascorbate phosphate"). A medium was prepared by adding monoethanolamine (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: 016-12453 (model number)) to such a medium (“basic medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione + Mg ascorbic acid phosphate”). . A medium to which Mg ascorbate phosphate was not added (“basic medium + albumin + transferrin + insulin + glutathione Mg ascorbate phosphate”) was used as a control medium (Mg ascorbate phosphate 0 mg/L).

（２）モノエタノールアミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
モノエタノールアミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表７に示す。また、表７の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図６に示す。(2) Cultivation of Lymphocyte Cells Using Monoethanolamine Examination Test Medium (3) "Activation culture of lymphocyte cells", (4) "Cryopreservation of lymphocyte cells", (5) "Thawing frozen lymphocyte cells", and (6) "After thawing treatment "Expansion culture of the lymphocyte cells" was performed. In step (6), expansion culture was started with 1.3×10 6 lymphocytes per flask. After 72 hours, 96 hours, 120 hours and 144 hours from the start of the expansion culture, the medium in the flask was sampled to measure the total cell number and viable cell number. The survival rate was also calculated from the results. The average viable cell count results obtained with n=3 for each type of medium and the average viability are shown in Table 7 below. In addition, among the results in Table 7, changes in the number of viable cells when using each medium are shown in FIG.

Figure 0007144872000007
Figure 0007144872000007

表７及び図６の結果から、培地にモノエタノールアミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、モノエタノールアミン濃度は、５０μＭ（３．０７５ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、１００μＭ（６．１５ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましく、２００μＭ（１２．３ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましいことが示された。３００μＭ（１８．４５ｍｇ／Ｌ）や４００μＭ（２４．６ｍｇ／Ｌ）では、２００μＭよりも増殖効率よりも増殖効率が低かったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、モノエタノールアミンは約２００μＭが好ましいことが示された。 The results in Table 7 and FIG. 6 indicated that the addition of monoethanolamine to the medium markedly increased the growth efficiency of human lymphocyte cells. It was also shown that the monoethanolamine concentration is preferably 50 μM (3.075 mg/L) or higher, more preferably 100 μM (6.15 mg/L) or higher, and even more preferably 200 μM (12.3 mg/L). At 300 μM (18.45 mg/L) and 400 μM (24.6 mg/L), the growth efficiency was lower than at 200 μM. shown to be favorable.

８．［本発明の特に好適な培地の組成］
実施例の上記２．～７．の結果から、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地の特に好適な組成として以下の表８に記載の組成が挙げられる。以下、かかる表８記載の組成の培地を、「本発明の好適な無血清培地」と表示する。8. [Particularly suitable medium composition of the present invention]
The above 2. of the embodiment. ~7. From the results of , from the viewpoint of the balance between growth efficiency of human lymphocyte cells and production cost, particularly suitable compositions of the serum-free medium for human lymphocyte cell culture of the present invention include the compositions shown in Table 8 below. Hereinafter, the medium having the composition shown in Table 8 will be referred to as "preferred serum-free medium of the present invention".

Figure 0007144872000008
Figure 0007144872000008

９．［本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験］
本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験を以下の方法で行った。9. [Comparative test of suitable serum-free medium of the present invention and conventional serum medium]
A comparative test between the preferred serum-free medium of the present invention and a conventional serum medium was conducted in the following manner.

（１）従来の血清培地を用いた培養方法
従来の血清培地を用いた培養方法に用いる３種類の培地（Ｓ１（表９）、Ｓ２（表１０）、Ｓ３（表１１））を調製した。なお、表１０のＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地は、インビトロジェン社製のリンパ球用無血清合成培地であり、ＣＰ－４培地は、リンフォテック社製のリンパ球用無血清合成培地である。(1) Culture Method Using Conventional Serum Medium Three types of media (S1 (Table 9), S2 (Table 10), and S3 (Table 11)) were prepared for use in the conventional culture method using serum medium. The AIM-V (registered trademark) medium in Table 10 is a serum-free synthetic medium for lymphocytes manufactured by Invitrogen, and the CP-4 medium is a serum-free synthetic medium for lymphocytes manufactured by Lymphotech. .

Figure 0007144872000009
Figure 0007144872000009

Figure 0007144872000010
Figure 0007144872000010

Figure 0007144872000011
Figure 0007144872000011

上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの血清培地Ｓ１に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに血清培地Ｓ１を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。1 above. An OKT3-immobilized flask was prepared by the method described in (2). A cell suspension was prepared by suspending 3×10 7 peripheral blood lymphocytes in 50 mL of serum medium S1. Each cell suspension was dispensed into the aforementioned OKT3-immobilized flask. 50 mL of serum medium S1 was added to the OKT3-immobilized flask. The flask was placed in a Teher-type CO2 incubator (manufactured by Hirasawa) to a temperature of 37.0 ± 0.5 °C, a humidity of 95.0 ± 5.0%, and a CO2 concentration of 5.0 ± 0.2%. was cultured. Five days after the initiation of culture, the cell suspension in the flask was transferred to a gas-permeable culture bag. This culture bag is returned to the above-mentioned Teha-type CO 2 incubator, and culture is performed at a temperature of 37.0 ± 0.5 ° C , a humidity of 95.0 ± 5.0%, and a CO concentration of 5.0 ± 0.2%. It continued for another 14 days. Such culture tests were performed in 9 replicates. The viable cell count and total cell count of the cell suspension after culture were calculated. Also, the total cell number and viable cell number were calculated. The results of viable cell counts are shown in FIG.

（２）本発明の好適な無血清培地を用いた培養方法
上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの本発明の好適な無血清培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに本発明の好適な無血清培地を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。本発明の好適な無血清培地をフラスコに入れてフラスコを洗浄した後、その培地も培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。(2) Cultivation method using the serum-free medium suitable for the present invention 1. An OKT3-immobilized flask was prepared by the method described in (2). A cell suspension was prepared by suspending 3×10 7 peripheral blood lymphocytes in 50 mL of a suitable serum-free medium of the invention. Each cell suspension was dispensed into the aforementioned OKT3-immobilized flask. 50 mL of the suitable serum-free medium of the present invention was added to the OKT3 immobilized flask. The flask was placed in a Teher-type CO2 incubator (manufactured by Hirasawa) to a temperature of 37.0 ± 0.5 °C, a humidity of 95.0 ± 5.0%, and a CO2 concentration of 5.0 ± 0.2%. was cultured. Five days after the initiation of culture, the cell suspension in the flask was transferred to a gas-permeable culture bag. After adding the preferred serum-free medium of the present invention to the flask and washing the flask, the medium was also transferred to the culture bag. This culture bag is returned to the above-mentioned Teha-type CO 2 incubator, and culture is performed at a temperature of 37.0 ± 0.5 ° C , a humidity of 95.0 ± 5.0%, and a CO concentration of 5.0 ± 0.2%. It continued for another 14 days. Such culture tests were performed in 9 replicates. The viable cell count and total cell count of the cell suspension after culture were calculated. Also, the total cell number and viable cell number were calculated. The results of viable cell counts are shown in FIG.

（３）比較試験の結果
図７から、本発明の好適な無血清培地は、従来の血清培地よりも、増殖効率が割合として約３０％程度も高いことが示された。このことから、本発明の好適な無血清培地を末梢血リンパ球細胞の培養に用いると、顕著な増殖効率が得られることが示された。(3) Results of comparative test Fig. 7 shows that the suitable serum-free medium of the present invention has a growth efficiency that is about 30% higher than that of the conventional serum medium. From this, it was shown that when the suitable serum-free medium of the present invention is used for culturing peripheral blood lymphocytes, remarkable growth efficiency can be obtained.

１０．［本発明の好適な無血清培地と、既存の無血清培地との比較試験］
本発明の好適な無血清培地と、既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地との比較試験を以下の方法で行った。10. [Comparative test between suitable serum-free medium of the present invention and existing serum-free medium]
A comparative test between the preferred serum-free medium of the present invention and an existing serum-free medium for lymphocyte cell culture was conducted by the following method.

（１）増殖効率及び生存率の比較
市販されている既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地を２種類用意し、既存の無血清培地Ｘ、Ｙとそれぞれ命名した。以下の比較試験では、培地として、本発明の好適な無血清培地、培地Ｘ又は培地Ｙを用いた。(1) Comparison of Proliferation Efficiency and Survival Rate Two types of existing commercially available serum-free media for lymphocyte cell culture were prepared and designated as existing serum-free media X and Y, respectively. In the comparative tests below, a suitable serum-free medium, medium X or medium Y of the present invention was used as the medium.

上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに各培地を５０ｍＬずつ追加した。追加した培地は、細胞懸濁液に用いた培地と同じ種類の培地とした。各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、各フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグにそれぞれ移した。各培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。各種の培地について、それぞれ３連で培養試験を行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数から生存率を算出した。これらの結果を以下の表１２に示し、生細胞数を図８に示す。1 above. An OKT3-immobilized flask was prepared by the method described in (2). A cell suspension was prepared by suspending 3×10 7 peripheral blood lymphocytes in 50 mL of medium. Each cell suspension was dispensed into the aforementioned OKT3-immobilized flask. 50 mL of each medium was added to the OKT3-immobilized flask. The medium added was of the same type as the medium used for the cell suspension. Each flask was placed in a Teher-type CO2 incubator (manufactured by Hirasawa) at a temperature of 37.0±0.5 °C, a humidity of 95.0±5.0%, and a CO2 concentration of 5.0±0.2%. was cultured at Five days after the initiation of culture, the cell suspension in each flask was transferred to a gas-permeable culture bag. Each culture bag was returned to the aforementioned Teher-type CO 2 incubator, and culture was performed at a temperature of 37.0 ± 0.5 ° C , a humidity of 95.0 ± 5.0%, and a CO concentration of 5.0 ± 0.2%. It continued for another 14 days. A culture test was performed in triplicate for each type of medium. The viable cell count and total cell count of the cell suspension after culture were calculated. Also, the survival rate was calculated from the total cell count and viable cell count. These results are shown in Table 12 below and viable cell counts are shown in FIG.

Figure 0007144872000012
Figure 0007144872000012

表１２及び図８の結果から、本発明の好適な無血清培地は、市販されている既存の、２種類のリンパ球細胞培養用の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）よりも、リンパ球細胞の増殖効率及びリンパ球細胞の生存率が高いことが示された。 From the results of Table 12 and FIG. 8, the preferred serum-free medium of the present invention is more lymphocyte than two types of existing commercially available serum-free medium for lymphocyte cell culture (medium X, medium Y). High cell proliferation efficiency and lymphocyte cell viability were demonstrated.

（２）リンパ球細胞の表面抗原の比較
上記１０．（１）の各培養で得られたリンパ球細胞の各集団について、ＣＤ３、ＴＣＲ－ＧＤ（ＴＣＲγδ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面抗原マーカーの解析をフローサイトメーターで行った。その解析結果を以下の表１３に示す。(2) Comparison of Surface Antigens of Lymphocyte Cells 10 above. Each population of lymphocytes obtained in each culture of (1) was analyzed for surface antigen markers of CD3, TCR-GD (TCRγδ), CD4, CD8, CD16 and CD56 using a flow cytometer. The analysis results are shown in Table 13 below.

Figure 0007144872000013
Figure 0007144872000013

表１３の結果から、本発明の好適な無血清培地を用いた場合、培地Ｘや培地Ｙを用いた場合と比べて、ＣＤ３陽性細胞の割合が高かった。ＣＤ３はＴリンパ球細胞のマーカーとして知られている。これらのことから、本発明の好適な無血清培地を用いると、Ｔリンパ球細胞の増殖効率がより高いだけでなく、Ｔリンパ球細胞の占有割合がより高いことが示された。すなわち、本発明の好適な無血清培地は、Ｔリンパ球細胞をより高い選択性で増殖することができることが示された。 From the results in Table 13, when the serum-free medium suitable for the present invention was used, the ratio of CD3-positive cells was higher than when medium X and medium Y were used. CD3 is known as a marker for T lymphocytes. From these results, it was shown that when the preferred serum-free medium of the present invention is used, not only the efficiency of proliferation of T lymphocytes is higher, but also the occupancy rate of T lymphocytes is higher. That is, it was shown that the preferred serum-free medium of the present invention is able to grow T lymphocytes with higher selectivity.

本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。 According to the present invention, there is provided a serum-free medium that provides a high cell proliferation rate when used for culturing human lymphocytes (preferably human T lymphocytes), and human lymphocytes using such a serum-free medium. A method for culturing cells (preferably human T lymphocyte cells) and the like can be provided.

Claims (7)

血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、１～４ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．３～６ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、２～４ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、３～１８．５ｍｇ／Ｌのエタノールアミン、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤、及び、２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩を含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。 Serum-free basal medium for animal cell culture, 1-4 g/L human albumin, 0.3-6 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 2-4 mg/L glutathione, 9-54 mg/L ascorbic acid phosphate or its salt , 3-18.5 mg/L ethanolamine , 0.02-0.6 g/L pyruvate, 1.3-34 μg/L L selenite, 0.1-2.5 g/L L-alanyl-L-glutamine, 0.02-0.5 g/L antibiotic, 1-15 g/L buffer, and 2 A serum-free medium for human lymphocyte cell culture containing ˜50 μg/L of acetic acid or a salt thereof . １～１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１～７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５～１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、請求項１に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。 The serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to claim 1 , wherein the 1-15 g/L buffer is 1-7 g/L HEPES and 0.5-10 g/L sodium bicarbonate. 抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、請求項１又は２に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。 The serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to claim 1 or 2 , wherein the antibiotics are kanamycin and streptomycin. 動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ－１２Ｋ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０－７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、請求項１～３のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。 Animal cell culture basal medium is DMEM/F-12, DMEM, EMEM, IMDM, GMEM, RPMI-1640, α-MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F-12K, ATCC-CRCM30, BME (Basal Medium Eagle), Fischer's medium, McCoy's 5A medium, Leibovitz's L-15 medium, RITC80-7 medium, MCDB105 medium, MCDB107m MC medium, MCDB153 medium DB210m, , NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB 752/1 medium, Williams' medium E, and ReproFF2 cell culture medium. 4. A serum-free medium for human lymphocyte cell culture according to any one of 1 to 3 . 請求項１～４のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法。 A method for culturing human lymphocytes, comprising the step of culturing human lymphocytes using the serum-free medium for culturing human lymphocytes according to any one of claims 1 to 4 . ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、エタノールアミン、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩を含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、１～４ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．３～６ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３～５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、２～４ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９～５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、３～１８．５ｍｇ／Ｌのエタノールアミン、０．０２～０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３～３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１～２．５ｇ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．０２～０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１～１５ｇ／Ｌの緩衝剤、及び、２～５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩を含有する、前記キット。 A kit for preparing a serum-free medium for human lymphocyte cell culture, comprising:
The kit contains human albumin, human transferrin, human insulin, glutathione, ascorbic acid phosphate or its salt , ethanolamine , pyruvate, a selenite compound, L-alanyl-L-glutamine, an antibiotic, a buffering agent. , and containing acetic acid or a salt thereof ,
The serum-free medium for human lymphocyte cell culture is
Serum-free basal medium for animal cell culture, 1-4 g/L human albumin, 0.3-6 mg/L human transferrin, 0.3-5 mg/L human insulin, 2-4 mg/L glutathione, 9-54 mg/L ascorbic acid phosphate or its salt , 3-18.5 mg/L ethanolamine , 0.02-0.6 g/L pyruvate, 1.3-34 μg/L L selenite, 0.1-2.5 g/L L-alanyl-L-glutamine, 0.02-0.5 g/L antibiotic, 1-15 g/L buffer, and 2 Said kit containing ˜50 μg/L of acetic acid or a salt thereof . キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、請求項６に記載のキット。 7. The kit of claim 6 , wherein the kit further contains a serum-free animal cell culture basal medium.
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