JP7143629B2 - 骨形成促進材 - Google Patents
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Description
[1]多糖類を溶解した状態で含有する、骨分化促進用液体培地組成物。
[2]多糖類が、脱アシル化ジェランガム、寒天、ダイユータンガム、キサンタンガム又はそれらの塩である、[1]記載の液体培地組成物。
[3]多糖類が、脱アシル化ジェランガム又はその塩である、[2]記載の液体培地組成物。
[4]骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞を、[1]~[3]の何れか記載の液体培地組成物中で培養し、骨芽細胞への分化を誘導することを含む、骨芽細胞の製造方法。
[5]該間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、[4]記載の製造方法。
[6]該間葉系細胞を、該液体培地組成物中で接着培養する、[4]又は[5]記載の製造方法。
[7]該液体培地組成物が、骨芽細胞分化誘導因子を含有する、[4]~[6]の何れか記載の製造方法。
[8]骨芽細胞分化誘導因子が、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質、Rhoキナーゼ阻害剤、増殖因子、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、[7]記載の製造方法。
[9]骨芽細胞分化誘導因子が、β-グリセロホスフェート、及びアスコルビン酸類又はその塩を含む、[8]記載の製造方法。
[10]骨芽細胞を、[1]~[3]の何れか記載の液体培地組成物中で培養し、石灰化を誘導することを含む、骨芽細胞の石灰化誘導方法。
[11]該骨芽細胞を、該液体培地組成物中で接着培養する、[10]記載の製造方法。
[12]該液体培地組成物が、骨芽細胞石灰化誘導因子を含有する、[10]又は[11]記載の方法。
[13]骨芽細胞石灰化誘導因子が、骨芽細胞分化誘導因子が、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質、Rhoキナーゼ阻害剤、増殖因子、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、[12]記載の製造方法。
[14]骨芽細胞石灰化誘導因子が、β-グリセロホスフェート、及びアスコルビン酸類を含む、[13]記載の方法。
本発明は、多糖類を溶解した状態で含有する、骨分化促進用液体培地組成物(以下、本発明の培地組成物と称する。)を提供する。本発明の培地組成物中で、骨分化(例、骨芽細胞への分化、骨芽細胞の石灰化)を誘導すると、該多糖類を用いないコントロールの場合と比較して、より強力な骨分化が達成される。本発明の液体培地組成物は、WO2014/017513 A1及びUS2014/0106348 A1の記載に従い、多糖類を液体培地に溶解することにより調製することが可能である。
寒天の場合、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、寒天濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、寒天濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
キサンタンガム又はその塩の場合、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、キサンタンガム又はその塩の濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、キサンタンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
ダイユータンガム又はその塩の場合、通常0.01%(w/v)以上、好ましくは0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
濃度[%(w/v)]=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
脱アシル化ジェランガム又はその塩の場合、通常0.001%(w/v)以上、好ましくは0.005%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、通常0.1%(w/v)以下、好ましくは0.03%(w/v)以下である。一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、0.005~0.03%(w/v)である。
寒天の場合、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、寒天濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、寒天濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
キサンタンガム又はその塩の場合、通常0.03%(w/v)以上以上である。液体の状態を維持する観点から、キサンタンガム又はその塩の濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、キサンタンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
ダイユータンガム又はその塩の場合、通常0.01%(w/v)以上、好ましくは0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
該培地組成物の粘度は、37℃において、10 mPa・s以下であり、好ましくは9 mPa・s以下、6 mPa・s以下、又は4 mPa・s以下である。
本発明は、骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞を、上記本発明の培地組成物中で培養し、骨芽細胞への分化を誘導することを含む、骨芽細胞の製造方法(以下、本発明の製造方法1と称する)を提供するものである。
例えば、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質(WO2004/106502)、Rhoキナーゼ阻害剤(WO2001/017562)、増殖因子(WO2010/055616)、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類(JP2009-256350A)からなる群から選択される少なくとも1種の因子、好ましくは前記群から選択される2種以上の因子を組み合わせて使用する。グルココルチコイド受容体作動剤としては、特に限定されないが、例えばデキサメタゾン、コルチゾール、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド等を挙げることができ、好ましくはデキサメタゾン又はコルチゾールである。アスコルビン酸類としては、特に限定されないが、例えばL-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩)を挙げることができる。骨形成タンパク質としては、特に限定されないが、例えばBMP-2、BMP-4等を挙げることができる。Rhoキナーゼ阻害剤としては、特に限定されないが、例えばY-27632等を挙げることができる。増殖因子としては、特に限定されないが、例えば、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β等を挙げることができる。フラボン類としては、特に限定されないが、例えば、ケンフェロールを挙げることができる。
・β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及び増殖因子(例、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)(WO2010/055616)
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))及び骨形成タンパク質(例、BMP-4)(WO2004/106502)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びRhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)(WO2001/017562)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びケンフェロール(JP2009-256350A)
等を挙げることができるが、これらに限定されない。
グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン、コルチゾール)は、種類により異なるが、例えば、0.01~100μMの濃度で添加する。
β-グリセロホスフェートは、例えば、1~50 mMの濃度で添加する。
アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))は、種類により異なるが、例えば、5~500μMの濃度で添加する。
骨形成タンパク質(例、BMP-2、BMP-4)は、種類により異なるが、例えば、10~1000 ng/mlの濃度で添加する。
Rhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)は、種類により異なるが、例えば、3~30 μMの濃度で添加する。
フラボン類(例、ケンフェロール)は、種類により異なるが、例えば、3.5~35 μMの濃度で添加する。
工程を含む。一態様において、培養物中に骨芽細胞が出現するまで、骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞の骨芽細胞分化誘導因子を含有する本発明の培地組成物中での培養が行われる。
本発明は、骨芽細胞を、上記本発明の培地組成物中で培養し、石灰化を誘導することを含む、骨芽細胞の石灰化誘導方法(以下、本発明の誘導方法1と称する)を提供するものである。
例えば、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質(WO2004/106502)、Rhoキナーゼ阻害剤(WO2001/017562)、増殖因子(WO2010/055616)、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類(JP2009-256350A)からなる群から選択される少なくとも1種の因子、好ましくは前記群から選択される2種以上の因子を組み合わせて使用する。グルココルチコイド受容体作動剤としては、特に限定されないが、例えばデキサメタゾン、コルチゾール、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド等を挙げることができ、好ましくはデキサメタゾン又はコルチゾールである。アスコルビン酸類としては、特に限定されないが、例えばL-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩)を挙げることができる。骨形成タンパク質としては、特に限定されないが、例えばBMP-2、BMP-4等を挙げることができる。Rhoキナーゼ阻害剤としては、特に限定されないが、例えばY-27632等を挙げることができる。増殖因子としては、特に限定されないが、例えば、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β等を挙げることができる。フラボン類としては、特に限定されないが、例えば、ケンフェロールを挙げることができる。
・β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及び増殖因子(例、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)(WO2010/055616)
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))及び骨形成タンパク質(例、BMP-4)(WO2004/106502)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びRhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)(WO2001/017562)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びケンフェロール(JP2009-256350A)
等を挙げることができるが、これらに限定されない。
グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン、コルチゾール)は、種類により異なるが、例えば、0.01~100 μMの濃度で添加する。
β-グリセロホスフェートは、例えば、1~50 mMの濃度で添加する。
アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))は、種類により異なるが、例えば、5~500 μMの濃度で添加する。
骨形成タンパク質(例、BMP-2、BMP-4)は、種類により異なるが、例えば、10~1000 ng/mlの濃度で添加する。
Rhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)は、種類により異なるが、例えば、3~30 μMの濃度で添加する。
フラボン類(例、ケンフェロール)は、種類により異なるが、例えば、3.5~35 μMの濃度で添加する。
本発明は、
(1)骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞及び/又は骨芽細胞、及び
(2)本発明の培地組成物
を含む、培養調製物を提供する。本発明の培養調製物において、骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞及び/又は骨芽細胞は、固相担体(例、適切な固相担体(例、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスでコートした固相担体)上に接着した状態で存在し得る。
脱アシル化ジェランガム又はその塩の場合、その濃度は、通常0.001%(w/v)以上、好ましくは0.005%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、通常0.1%(w/v)以下、好ましくは0.03%(w/v)以下である。一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、0.005~0.03%(w/v)である。
寒天の場合、その濃度は、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、寒天濃度は、通常0.1%(w/v)以下である。一態様において、寒天濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
キサンタンガム又はその塩の場合、その濃度は、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、キサンタンガム又はその塩の濃度は、通常0.01%(w/v)以下である。一態様において、キサンタンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
ダイユータンガム又はその塩の場合、その濃度は、通常0.03%(w/v)以上である。液体の状態を維持する観点から、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、通常0.10%(w/v)以下である。一態様において、ダイユータンガム又はその塩の濃度は、0.03~0.10%(w/v)である。
該培地組成物の粘度は、37℃において、10 mPa・s以下であり、好ましくは9 mPa・s以下、6 mPa・s以下、又は4 mPa・s以下である。
・β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及び増殖因子(例、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)(WO2010/055616)
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))及び骨形成タンパク質(例、BMP-4)(WO2004/106502)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びRhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)(WO2001/017562)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びケンフェロール(JP2009-256350A)
・β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸、又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・BMP-2、β-グリセロホスフェート及びアスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート及び増殖因子(例、EGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)(WO2010/055616)
・グルココルチコイド受容体作動剤(例、コルチゾール、デキサメタゾン)、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類(例、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2-リン酸又はこれらの塩(例、ナトリウム塩))及び骨形成タンパク質(例、BMP-4)(WO2004/106502)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びRhoキナーゼ阻害剤(例、Y-27632)(WO2001/017562)
・骨形成タンパク質(例、BMP-2)及びケンフェロール(JP2009-256350A)
ヒトフィブロネクチン溶液(タカラバイオ社製)をPBSで10μg/mLとなるように希釈し、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3603)に1ウェルあたり100μL添加し、1時間室温に静置した後、上記のフィブロネクチン溶液を除去した。引き続き、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(タカラバイオ社製)を間葉系幹細胞増殖培地2(タカラバイオ社製)に懸濁し、上記のプレートに3000cells/100μL/ウェルになるように分注し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で2日間培養した。特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.75%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌社製)水溶液を調製した。また、1%(w/v)寒天(和光純薬社製)水溶液、1%(w/v)キサンタンガム(KELTROL CG、三昌社製)水溶液及び0.3%(w/v)ダイユータンガム(KELCO-CRETE、三昌社製)水溶液も同様の方法で調製を行った後、0.005%(w/v)、0.015%(w/v)、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガム;0.03%(w/v)、0.1%(w/v)の寒天;0.03%(w/v)、0.1%(w/v)のキサンタンガム;及び0.03%(w/v)、0.1%(w/v)のダイユータンガムを含有する間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地(タカラバイオ社製)をそれぞれ調製した。また、比較対象として同一濃度の脱アシル化ジェランガム、寒天、キサンタンガム及びダイユータンガムをそれぞれ含む間葉系幹細胞増殖培地2も調製した。培養3日目に培地を除去後、上記の脱アシル化ジェランガム、寒天、キサンタンガム又はダイユータンガムを含む間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地もしくは間葉系幹細胞増殖培地2を100μL/ウェル添加し、引き続き細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で3日間培養した。上記と同様の培地交換は培養6日目及び9日目にも行った。培養12日目に培地を除去し、PBSを100μL/ウェルで添加し、除去した。引き続き、エタノール(99.5%(v/v))(和光純薬社製)を100μL/ウェルで添加し、1時間室温で静置した。10倍濃度のOsteoImage(登録商標)Wash buffer(OsteoImage(登録商標)石灰化アッセイ、LONZA社製)を精製水で10倍希釈し、1倍濃度のOsteoImage(登録商標)Wash bufferとした。エタノール(99.5%(v/v))を除去し、上記の1倍濃度のOsteoImage(登録商標)Wash bufferを200μL/ウェルで添加し、除去した。OsteoImage(登録商標)Staining Reagent(OsteoImage(登録商標)石灰化アッセイ、LONZA社製)をStaining Reagent Dilution Buffer(OsteoImage(登録商標)石灰化アッセイ、LONZA社製)を用いて1:100の比率で希釈した。上記のOsteoImage(登録商標)Staining Reagent溶液を200μL/ウェルで添加し、遮光下、室温で30分間静置した。30分後に1倍濃度のOsteoImage(登録商標)Wash bufferを200μL/ウェルで添加し、除去した。本操作は2度行った。最後に1倍濃度のOsteoImage(登録商標)Wash bufferを100μL/ウェル添加し、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて蛍光強度(RFU値、励起波長:490nm、蛍光波長:520nm)を測定し、細胞に沈着したハイドロキシアパタイト量を測定した。測定したRFU値を表1に示す。
ヒトフィブロネクチン溶液(タカラバイオ社製)をPBSで10μg/mLとなるように希釈し、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)に1ウェルあたり100μL添加し、1時間室温に静置した後、上記のフィブロネクチン溶液を除去した。引き続き、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(タカラバイオ社製)を間葉系幹細胞増殖培地2(タカラバイオ社製)に懸濁し、上記のプレートに3000cells/100μL/ウェルになるように分注し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で2日間培養した。特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.75%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌社製)水溶液を調製した。また、1%(w/v)寒天(和光純薬社製)水溶液、1%(w/v)キサンタンガム(KELTROL CG、三昌社製)水溶液及び0.3%(w/v)ダイユータンガム(KELCO-CRETE、三昌社製)水溶液も同様の方法で調製を行った後、0.005%(w/v)、0.015%(w/v)、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガム;0.03%(w/v)、0.1%(w/v)の寒天;0.03%(w/v)、0.1%(w/v)のキサンタンガム;及び0.03%(w/v)、0.1%(w/v)のダイユータンガムを含有する間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地(タカラバイオ社製)をそれぞれ調製した。また、比較対象として同一濃度の脱アシル化ジェランガム、寒天、キサンタンガム及びダイユータンガムをそれぞれ含む間葉系幹細胞増殖培地2も調製した。培養3日目に培地を除去後、上記の脱アシル化ジェランガム、寒天、キサンタンガム又はダイユータンガムを含む間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地もしくは間葉系幹細胞増殖培地2を100μL/ウェル添加し、引き続き細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で培養した。上記と同様の培地交換は培養6日目及び9日目にも行った。培養12日目に培地を除去し、PBSを100μL/ウェルで添加し、除去した。引き続き、エタノール(99.5%(v/v))(和光純薬社製)を100μL/ウェルで添加し、1時間室温で静置した。アリザリンレッドS(和光純薬社製)を精製水に溶解して、1%(w/v)アリザリンレッドS溶液を調製した。引き続き、エタノール(99.5%(v/v))を除去し、上記の1%(w/v)アリザリンレッドS溶液を100μL/ウェルで添加し、5分間室温で静置した。アリザリンレッドS溶液を除去後に精製水を200μL/ウェルで添加後、除去した。上記の操作を3回行った後、各ウェルの画像を顕微鏡下で取得した。取得した画像を図1に示す。図1に示すように、多糖類を何も添加していない間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地群(Control)と比較して、脱アシル化ジェランガム、寒天、キサンタンガム及びダイユータンガムをそれぞれ添加した間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地群ではアリザリンレッドSによる強い染色が認められた。
MEM alpha(シグマ社製)にFBSを10%(v/v)となるように添加し、さらに200mMのL‐グルタミン溶液(和光純薬社製)を2mMとなるように添加した培地を調製した(増殖培地)。上記の培地にマウスMC3T3‐E1細胞(eCACC社製)を懸濁し、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3603)に4000cells/100μL/ウェルになるように分注し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で1日間培養した。L‐アスコルビン酸 2‐ホスフェート(シグマ社製)を5mMとなるようにMEM alphaに溶解した。β‐グリセロホスフェート(シグマ社製)を1MとなるようにMEM alphaに溶解した。分化培地として、増殖培地に上記のL‐アスコルビン酸 2‐ホスフェート及びβ‐グリセロホスフェートを、それぞれ、50μM及び10mMとなるように添加した。特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.75%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌社製)水溶液を調製した後、0.005%(w/v)、0.015%(w/v)、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含有する分化培地を調製した。また、比較対象として同一濃度の脱アシル化ジェランガムを含む増殖培地も調製した。培養2日目に培地を除去後、上記の脱アシル化ジェランガムを含む分化培地及び増殖培地を、それぞれ、100μL/ウェル添加し、引き続き、細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で培養した。上記と同様の培地交換を培養5日目、8日目、11日目、14日目、17日目及び20日目にも実施した。以降の操作は試験例1に従って行い、細胞に沈着したハイドロキシアパタイト量を測定した。測定したRFU値を表2に示す。
MEM alpha(シグマ社製)にFBSを10%(v/v)となるように添加し、さらに200mMのL‐グルタミン溶液(和光純薬社製)を2mMとなるように添加した培地を調製した(増殖培地)。上記の培地にマウスMC3T3‐E1細胞(eCACC社製)を懸濁し、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)に4000cells/100μL/ウェルになるように分注し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で1日間培養した。L‐アスコルビン酸 2‐ホスフェート(シグマ社製)を5mMとなるようにMEM alphaに溶解した。β‐グリセロホスフェート(シグマ社製)を1MとなるようにMEM alphaに溶解した。分化培地として、増殖培地に上記のL‐アスコルビン酸 2‐ホスフェート及びβ‐グリセロホスフェートを、それぞれ、50μM及び10mMとなるように添加した。特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.75%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌社製)水溶液を調製した後、0.005%(w/v)、0.015%(w/v)、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含有する分化培地を調製した。また、比較対象として同一濃度の脱アシル化ジェランガムを含む増殖培地も調製した。培養2日目に培地を除去後、上記の脱アシル化ジェランガムを含む分化培地及び増殖培地を、それぞれ、100μL/ウェル添加し、引き続き、細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で培養した。上記と同様の培地交換を培養5日目、8日目、11日目、14日目、17日目及び20日目にも実施した。以降の操作は試験例2に従って行い、顕微鏡にて画像を取得した。取得した画像を図2に示す。図2に示すように、多糖類を何も添加していない分化培地群(Control)と比較して、脱アシル化ジェランガムを添加した分化培地群ではアリザリンレッドSによる強い染色が認められた。
試験例1及び2で使用した、以下の多糖類を含有する間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地(タカラバイオ社製)の粘度を測定した。
脱アシル化ジェランガム(DAG) 0.03%(w/v)
寒天 0.1%(w/v)
キサンタンガム 0.1%(w/v)
ダイユータンガム 0.1%(w/v)
Claims (13)
- 多糖類を溶解した状態で含有する、骨分化促進用液体培地組成物であって、多糖類が、脱アシル化ジェランガム、寒天、ダイユータンガム、キサンタンガム又はそれらの塩である、液体培地組成物。
- 多糖類が、脱アシル化ジェランガム又はその塩である、請求項1記載の液体培地組成物。
- 骨芽細胞への分化能を有する間葉系細胞を、請求項1又は2記載の液体培地組成物中で培養し、骨芽細胞への分化を誘導することを含む、骨芽細胞の製造方法。
- 該間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、請求項3記載の製造方法。
- 該間葉系細胞を、該液体培地組成物中で接着培養する、請求項3又は4記載の製造方法。
- 該液体培地組成物が、骨芽細胞分化誘導因子を含有する、請求項3~5の何れか1項記載の製造方法。
- 骨芽細胞分化誘導因子が、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質、Rhoキナーゼ阻害剤、増殖因子、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、請求項6記載の製造方法。
- 骨芽細胞分化誘導因子が、β-グリセロホスフェート、及びアスコルビン酸類又はその塩を含む、請求項7記載の製造方法。
- 骨芽細胞を、請求項1又は2記載の液体培地組成物中で培養し、石灰化を誘導することを含む、骨芽細胞の石灰化誘導方法。
- 該骨芽細胞を、該液体培地組成物中で接着培養する、請求項9記載の方法。
- 該液体培地組成物が、骨芽細胞石灰化誘導因子を含有する、請求項9又は10記載の方法。
- 骨芽細胞石灰化誘導因子が、グルココルチコイド受容体作動剤、β-グリセロホスフェート、アスコルビン酸類、骨形成タンパク質、Rhoキナーゼ阻害剤、増殖因子、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、及びフラバノール類からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、請求項11記載の方法。
- 骨芽細胞石灰化誘導因子が、β-グリセロホスフェート、及びアスコルビン酸類を含む、請求項12記載の方法。
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