JP7123552B2 - Anti-influenza virus agent and composition containing same - Google Patents

Description

本発明は、抗インフルエンザウイルス剤及びそれを含む組成物に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to anti-influenza virus agents and compositions containing the same.

インフルエンザはインフルエンザウイルスを病原体とする急性の呼吸器感染症であり、毎年違う型のインフルエンザが世界中で流行している。一般的に、インフルエンザウイルスの感染に対しては、ワクチン接種による予防や、ノイラミニダーゼ阻害剤等の薬剤による治療が行われているが、インフルエンザウイルスのタイプによってはそれらの効果が著しく異なるという問題がある。また、薬剤によっては副作用や耐性ウイルスの出現といった問題も残されている。 Influenza is an acute respiratory infection caused by an influenza virus, and different types of influenza are prevalent throughout the world every year. In general, influenza virus infection is prevented by vaccination and treated with drugs such as neuraminidase inhibitors, but there is a problem that these effects differ significantly depending on the influenza virus type. . In addition, depending on the drug, problems such as side effects and emergence of resistant viruses remain.

上記のような問題に鑑み、インフルエンザウイルスの予防・治療に効果のある物質の探索においては、飲食品に配合されるような、人体に害の少ない安全・安心な抗インフルエンザウイルス剤が望まれている。 In view of the above problems, in the search for substances effective in preventing and treating influenza viruses, safe and secure anti-influenza virus agents that are less harmful to the human body, such as those that are added to food and drink, are desired. there is

クランベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ Ａｉｔ．）は、北アメリカなどの寒冷地に生育するツツジ科スノキ属ツルコケモモ節の植物であり、小果実を実らせる。アメリカでは品種改良が行われて大規模に栽培されている。クランベリー果実はそのままでも食せるが、これまでドライフルーツとして、またジュースなどの飲料用、料理用ソース、ジャム、ゼリー菓子などの原料として広く利用されている。またクランベリージュースの摂取が、***症に有効であることが知られている。 Cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) is a plant belonging to the family Ericaceae Vaccinium cranberry, which grows in cold regions such as North America, and bears small fruits. In the United States, it has been bred and cultivated on a large scale. Although cranberry fruit can be eaten as it is, it has been widely used as a dried fruit, as a raw material for beverages such as juices, cooking sauces, jams, jellies, and the like. It is also known that ingestion of cranberry juice is effective against urinary tract infections.

プロポリスは、蜜蜂が巣箱内に貯蔵する樹脂状物で、これには樹脂、ミツロウ、精油、花粉、フラボノイドなどが含まれており、古くから民間療法薬として感受性疾患の予防、治療や健康の維持、増進などに利用されている。 Propolis is a resinous material that bees store in their hives. It contains resin, beeswax, essential oils, pollen, flavonoids, etc., and has been used as a folk remedy since ancient times to prevent and treat susceptible diseases and maintain health. , is used for enhancement.

Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．２０１２；７８（１０）：９６２－７Planta Med. 2012;78(10):962-7 Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２００５；６６（１）：９－１２Antiviral Res. 2005;66(1):9-12 Ｎｕｔｒ Ｊ．２０１３ ；１２：１６１NutrJ. 2013; 12:161 Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１２ ；１７（５）：６０５－１７J Biomol Screen. 2012;17(5):605-17 Ａｎｔｉｖｉｒ Ｃｈｅｍ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００８；１９（１）：７－１３Antivir Chem Chemother. 2008;19(1):7-13

特開２０１１－１６８５７２号公報JP 2011-168572 A

本発明は、新規な抗インフルエンザウイルス剤及びそれを含む組成物を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel anti-influenza virus agent and a composition containing the same.

抗インフルエンザウイルス作用を有する種々の天然物由来のエキスが存在しており、例えば、クランベリーのエキスは、アガリクス茸の子実体及び／又は菌糸体を親水性溶媒で抽出処理した抽出物との組み合わせでインフルエンザウイルス感染及び／又は該感染後の生体内での増殖を顕著に抑制することが知られている（特許文献１）。また、クランベリーエキス単独又はクランベリーに含まれる抗酸化成分であるプロアントシアニジンがインフルエンザウイルスなどの種々のウイルスの増殖を阻害することも知られている（非特許文献１－４）。 There are various extracts derived from natural products that have anti-influenza virus activity. It is known to remarkably suppress influenza virus infection and/or proliferation in vivo after the infection (Patent Document 1). It is also known that cranberry extract alone or proanthocyanidins, which are antioxidant components contained in cranberries, inhibit the growth of various viruses such as influenza virus (Non-Patent Documents 1 to 4).

プロポリスについても、そのエタノール抽出物がインフルエンザの感染に対して効果を奏するという知見が存在している（非特許文献５）。 As for propolis, there is also knowledge that its ethanol extract is effective against influenza infection (Non-Patent Document 5).

その他にも種々の天然物抽出物について抗インフルエンザウイルス作用の報告がなされているが、その効果は十分ではないと考えられる。事実、このことを裏付けるかのように、いずれの抽出物も我が国において一般的にインフルエンザ対策に使用されるまでには至っていない。 Various other natural product extracts have been reported to have anti-influenza virus effects, but the effects are considered to be insufficient. In fact, as if to support this fact, none of the extracts have come to be generally used for influenza measures in Japan.

飲食品に配合可能な数多の成分のうち、抗インフルエンザウイルス作用を有することが知られている成分の効果について本発明者らが確認したところ、単独での抗インフルエンザウイルス作用はさほど強くないものの、組み合わせることにより効果が増大する場合があることが明らかとなった。本発明者らは、これらの特定の組み合わせについて更に鋭意検討を行った結果、（Ａ）プロアントシアニジン含有植物エキス、（Ｂ）プロポリスエキス、及び、任意に（Ｃ）乳酸菌を含有する組成物が（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）単独の効果の総和を遥かに上回る抗インフルエンザ効果を有することを見出し、本発明に至った。 Among the many ingredients that can be added to food and drink, the present inventors confirmed the effects of ingredients known to have anti-influenza virus effects, and found that although the anti-influenza virus action alone was not very strong. , it became clear that the effect may increase by combining. The present inventors have made further intensive studies on these specific combinations, and found that a composition containing (A) proanthocyanidin-containing plant extract, (B) propolis extract, and optionally (C) lactic acid bacteria ( The inventors have found that they have an anti-influenza effect that far exceeds the sum of the effects of A), (B) and (C) alone, leading to the present invention.

本発明の概要は、以下の通りである。
（１）有効成分として、プロアントシアニジン含有植物エキスと、プロポリスエキスとを含む抗インフルエンザウイルス剤。
（２）プロアントシアニジン含有植物がベリー類に属する植物である、（１）に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（３）ベリー類に属する植物がクランベリーである、（１）又は（２）に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（４）エキスの抽出がエタノールによる、（１）～（３）のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（５）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）産生促進作用を有するか、若しくは二本鎖ＲＮＡを含有する、乳酸菌又はその他の菌類を更に含む、（１）～（４）のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（６）乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌である、（５）に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（７）ラクトバチルス・パラカゼイがラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９（ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６３３）株である、（６）に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
（８）（１）～（７）のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤を含む、組成物。
（９）飲食品、サプリメント又は医薬に配合される、（８）に記載の組成物。
（１０）インフルエンザウイルス感染の予防又は治療のための、（８）に記載の組成物。
（１１）プロアントシアニジンを０．１～０．９８重量部、プロポリスエキスを０．０１～０．９８重量部、乳酸菌を乾燥重量換算で０．０１～０．９８重量部含む、（８）～（１０）のいずれかに記載の組成物。 The outline of the present invention is as follows.
(1) An anti-influenza virus agent containing a proanthocyanidin-containing plant extract and a propolis extract as active ingredients.
(2) The anti-influenza virus agent according to (1), wherein the proanthocyanidin-containing plant belongs to the berry family.
(3) The anti-influenza virus agent according to (1) or (2), wherein the plant belonging to the berry family is cranberry.
(4) The anti-influenza virus agent according to any one of (1) to (3), wherein the extract is extracted with ethanol.
(5) The method according to any one of (1) to (4), further comprising lactic acid bacteria or other fungi that have an interleukin-12 (IL-12) production-promoting effect or contain double-stranded RNA. Anti-influenza virus agent.
(6) The anti-influenza virus agent according to (5), wherein the lactic acid bacterium belongs to Lactobacillus paracasei.
(7) The anti-influenza virus agent according to (6), wherein the Lactobacillus paracasei is Lactobacillus paracasei MCC1849 (NITE BP-01633) strain.
(8) A composition comprising the anti-influenza virus agent according to any one of (1) to (7).
(9) The composition according to (8), which is incorporated in food, drink, supplements, or pharmaceuticals.
(10) The composition according to (8) for preventing or treating influenza virus infection.
(11) 0.1 to 0.98 parts by weight of proanthocyanidins, 0.01 to 0.98 parts by weight of propolis extract, and 0.01 to 0.98 parts by weight of lactic acid bacteria in terms of dry weight, (8) ~ The composition according to any one of (10).

本発明の抗インフルエンザウイルス剤及び飲食用組成物は、（Ａ）プロアントシアニジン含有植物エキス、（Ｂ）プロポリスエキス、及び、任意に（Ｃ）乳酸菌を含有し、優れた抗インフルエンザ効果を有する。特に、エキス（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせは、抗インフルエンザウイルス作用について顕著な相乗効果を有することが確認されている。また、いずれの成分も飲食品に配合される成分であることから、安全に経口摂取できると考えられる。 The anti-influenza virus agent and the food and drink composition of the present invention contain (A) a proanthocyanidin-containing plant extract, (B) a propolis extract, and optionally (C) lactic acid bacteria, and have excellent anti-influenza effects. In particular, it has been confirmed that the combination of extracts (A) and (B) has a significant synergistic effect on anti-influenza virus action. In addition, it is considered that all of these ingredients can be safely orally ingested because they are ingredients that are blended in foods and drinks.

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、下記の実施の形態に限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below. In addition, the present invention is not limited to the following embodiments.

（抗インフルエンザウイルス剤）
本実施形態の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分として、プロアントシアニジン含有植物エキスと、プロポリスエキスとを含む。抗インフルエンザウイルス作用は、広くインフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスの活性を抑制することを意味する。理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の抗インフルエンザウイルス剤は体内でインフルエンザウイルスの増殖を抑え、インフルエンザウイルスに起因するあらゆる症状を緩和し、重篤化を防ぐことが期待される。本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、各症状の緩和のみならず、インフルエンザの治療や、二次感染の防止などの予防にも使用され得る。 (Anti-influenza virus agent)
The anti-influenza virus agent of this embodiment contains a proanthocyanidin-containing plant extract and a propolis extract as active ingredients. The anti-influenza virus activity generally means suppression of the activity of influenza viruses, particularly influenza A virus. Although not intended to be bound by theory, the anti-influenza virus agent of the present invention is expected to suppress the proliferation of influenza virus in the body, alleviate all symptoms caused by influenza virus, and prevent aggravation. be done. The anti-influenza virus agent of the present invention can be used not only for alleviating each symptom, but also for treatment of influenza and prophylaxis such as prevention of secondary infection.

（Ａ）プロアントシアニジン含有植物エキス
プロアントシアニジンは各種植物体中に存在する縮合型タンニン、あるいは非加水分解性タンニン、すなわちフラバン－３－オールまたはフラバン－３，４－ジオールを構成単位として縮合、重合により結合した化合物群である。プロアントシアニジンは、結合様式の違いから数種類に分類されており、例えば、２つ以上のフラバン－３－オール構造が４β位→８位および２β位→Ｏ→７位または４β位→６位および２β位→Ｏ→７位を介して結合する部位が少なくとも１箇所に存在する場合はＡ型、２つ以上のフラバン－３－オール構造が４β位→８位または４β位→６位を介して結合している場合はＢ型に分類されることが知られている。エキスに含まれるプロアントシアニジンはＡ型又はＢ型のいずれか、あるいはその両方でもよいが、Ａ型が好ましい。 (A) Proanthocyanidin-Containing Plant Extract Proanthocyanidins are condensed tannins present in various plant bodies, or non-hydrolyzable tannins, that is, flavan-3-ol or flavan-3,4-diol are condensed and polymerized as structural units. It is a group of compounds bound by Proanthocyanidins are classified into several types due to differences in binding modes. Type A when there is at least one site that binds via position → O → 7, two or more flavan-3-ol structures bind via 4β → 8 or 4β → 6 is known to be classified as type B. Proanthocyanidins contained in the extract may be either A-type or B-type, or both, but A-type is preferred.

プロアントシアニジン含有植物とは、プロアントシアニジンを含む植物を意味する。限定することを意図するものではないが、プロアントシアニジン含有植物として、ベリー類、プラム、アボカド、ピーナッツ、シナモンなどが挙げられる。ベリー類の中では、プロアントシアニジンを多く含むことが知られているクランベリーが好ましい。 A proanthocyanidin-containing plant means a plant containing proanthocyanidins. Although not intended to be limiting, proanthocyanidin-containing plants include berries, plums, avocados, peanuts, cinnamon, and the like. Among berries, cranberries, which are known to contain a large amount of proanthocyanidins, are preferred.

本明細書で使用する場合、プロアントシアニジン含有植物エキスとは、例えば、ベリー果実などのプロアントシアニジンを含有する部位から搾汁して得られた汁もしくはその汁を濃縮したもの、前記汁もしくは濃縮汁にデキストリンなどの賦形剤を添加混合し噴霧乾燥あるいは凍結乾燥するなどの手段で得られた汁中の固形分を含有するもの、またはプロアントシアニジンを含有する果実や果皮・種子より適当な溶剤を用いて抽出された抽出物などをいう。有効成分を所定の量含んでいる限り、エキスの剤型は重要ではなく、軟エキス剤又は乾燥エキス剤、あるいはそれ以外の類似の形態、例えば乾燥状態であってもよい。本発明で使用する他のエキスについても同様である。 As used herein, the proanthocyanidin-containing plant extract is, for example, juice obtained by squeezing from a part containing proanthocyanidins such as berry fruit or a concentrate of the juice, the juice or concentrated juice Add excipients such as dextrin to and mix and spray-dry or freeze-dry the solid content in the juice obtained by such means, or a suitable solvent from fruits, pericarp and seeds containing proanthocyanidins It refers to extracts extracted using The form of the extract is not critical as long as it contains the desired amount of active ingredient, it may be a soft extract or a dry extract, or other similar forms such as dry. The same applies to other extracts used in the present invention.

抽出処理に用いる溶剤は特に限定されず、通常の極性溶媒、両極性溶媒等が使用できる。溶剤としては、例えば、水、有機溶媒またはそれを含む溶剤、水と有機溶媒との混合液等が使用できる。有機溶媒としては例えば、低級アルコール（具体的にはエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール）、エーテル類（具体的にはジエチルエーテル）、ハロゲン化炭化水素（具体的にはクロロホルム）、ニトリル類（具体的にはアセトニトリル）、エステル類（具体的には酢酸エチル）、ケトン類（具体的にはアセトン）などの他に、ヘキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等であるが、作業性の面から、エタノール、メタノール、または、酢酸エチルが好ましい。有機溶媒は２種以上を混合して使用しても良い。 The solvent used for the extraction treatment is not particularly limited, and ordinary polar solvents, bipolar solvents and the like can be used. As the solvent, for example, water, an organic solvent or a solvent containing it, a mixture of water and an organic solvent, or the like can be used. Examples of organic solvents include lower alcohols (specifically ethanol, methanol, propanol, butanol), ethers (specifically diethyl ether), halogenated hydrocarbons (specifically chloroform), nitriles (specifically acetonitrile), esters (specifically ethyl acetate), ketones (specifically acetone), hexane, dimethylsulfoxide, dimethylformamide and the like. Methanol or ethyl acetate are preferred. Two or more kinds of organic solvents may be mixed and used.

プロアントシアニジンを植物原料から抽出する場合、水やエタノール等の有機溶媒を用いて抽出し乾燥濃縮させる方法（例えば、特開平９－２２１４８４号公報、再表２００５／０７９８２５号公報、再表２００６／０６８２１２号公報参照）等が知られている。これらの方法により、プロアントシアニジンＢ型を果実果皮等から効率よく抽出することができる。プロアントシアニジンＡ型については、その抽出効率を上げるために、抽出後に得られる溶液を合成吸着剤や逆相の吸着剤により吸着処理を行う方法（例えば、特許２９７５９９７号明細書、再表２００５／０３０２００号公報、再表２００５／０７２７６２号公報、特開２００８－１５６２６５号公報、特開２００８－１５６２６５号公報参照）等が知られている。更に、プロアントシアニジンＡの抽出に伴う諸問題を改良した方法が特許第５４５９６９９号に開示されている。 When extracting proanthocyanidins from plant raw materials, a method of extracting with an organic solvent such as water or ethanol and drying and concentrating (for example, JP-A-9-221484, retable 2005/079825, retable 2006/068212 No. 2004-200040) and the like are known. By these methods, proanthocyanidin type B can be efficiently extracted from fruit pericarp and the like. For proanthocyanidin type A, in order to increase the extraction efficiency, a method of subjecting the solution obtained after extraction to adsorption treatment with a synthetic adsorbent or a reversed-phase adsorbent (for example, Japanese Patent No. 2975997, Table 2005/030200 No. 2005/072762, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-156265, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-156265) and the like are known. Further, a method for improving the problems associated with the extraction of proanthocyanidin A is disclosed in Japanese Patent No. 5459699.

なお、クランベリー抽出物中の有効成分を濃縮・精製するために更なる溶媒抽出、合成吸着剤やイオン交換樹脂処理等を行ってもよい。 In addition, in order to concentrate and purify the active ingredients in the cranberry extract, further solvent extraction, synthetic adsorbent, ion exchange resin treatment, etc. may be performed.

プロアントシアニジン含有植物エキスの配合量は、所望とする効果やエキスに含まれるプロアントシアニジン又はその他の有効成分等の量によっても変動し、例えば、エキス中のプロアントシアニジン含量が４０質量％の場合、抗インフルエンザウイルス剤１００重量部に対して０．０５～０．９８重量部程度であってもよい。単独での抗インフルエンザウイルス作用を考慮した場合、例えば、エキス末中のプロアントシアニジン含量が４０質量％であるとすると、エキスの配合量は抗インフルエンザウイルス剤中の終濃度が約５～約４０μｇ／ｍｌ、好ましくは約７．８～約３１．３μｇ／ｍｌの範囲となるように調節され得る。 The amount of the proanthocyanidin-containing plant extract varies depending on the desired effect and the amount of proanthocyanidins or other active ingredients contained in the extract. It may be about 0.05 to 0.98 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the influenza virus agent. Considering the anti-influenza virus action alone, for example, assuming that the proanthocyanidin content in the extract powder is 40% by mass, the blending amount of the extract is such that the final concentration in the anti-influenza virus agent is about 5 to about 40 μg/ ml, preferably adjusted to range from about 7.8 to about 31.3 μg/ml.

（Ｂ）プロポリスエキス
プロポリスは、粘稠性を有する樹脂、粘性物質及びバルサム（ｂａｌｓａｍ）物質の集合物であって、これを巣に輸送し並びに自身の唾液分泌及びワックスの添加によってこれを或る程度改良するハチによって、植物の或る特定の部分、特に芽（ｂｕｄｓ）及び樹皮（ｂａｒｋｓ）上に収集される、粘稠性を有する樹脂、粘性物質及びバルサム物質の集合物を指す。 (B) Propolis Extract Propolis is a conglomerate of viscous resins, viscous substances and balsam substances that transports it to the hive and holds it in place by its own salivation and the addition of waxes. Refers to an aggregate of resinous, viscous and balsam substances with a viscous consistency that are collected on certain parts of the plant, especially the buds and barks, by amending bees.

プロポリスは、担体として賦形剤、例えば、マルトデキストリン、水アルコール溶液と混合してもよい。エキスの形態は液体に限定されず、粉末であってもよい。例えば、エタノール抽出で得られたプロポリスエキスにデキストリンを練合させ、プロポリス末としたものを使用することができる。 Propolis may be mixed with excipients such as maltodextrin, hydroalcoholic solutions as carriers. The form of the extract is not limited to liquid, and may be powder. For example, a propolis powder obtained by kneading a propolis extract obtained by ethanol extraction with dextrin can be used.

プロポリスエキスとは、日本プロポリス協議会のプロポリス食品自主規格基準に従い、プロポリス（原塊）の水、含水エタノール又はエタノール、超臨界抽出法、等による抽出物をいう。本明細書では、日本健康栄養食品協会の「プロポリスエキス加工食品」（プロポリスエキス含有量１０％以上）におけるプロポリスエキスを使用する。本明細書に記載のプロポリスエキスの量は、特に断らない限り、プロポリス食品自主規格基準（２０１０年４月）に記載の算出方法に従い表される。以下に具体的に説明する。 Propolis extract refers to an extract of propolis (original mass) by water, hydrous ethanol or ethanol, supercritical extraction, etc., according to the Propolis Food Voluntary Standards of the Japan Propolis Council. In the present specification, the propolis extract in the "propolis extract processed food" (propolis extract content of 10% or more) of the Japan Health and Nutrition Food Association is used. Unless otherwise specified, the amount of propolis extract described in this specification is expressed according to the calculation method described in Voluntary Standards for Propolis Foods (April 2010). A specific description will be given below.

試験溶液の高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）から保持時間３０分までの（水抽出プロポリスエキスを用いた場合は保持時間４５分まで）の全ピークの面積合計量を求める。次に、ｐ－クマル酸標準溶液のピーク面積をもとめ、標準面積とする。全ピークの合計面積をｐ－クマル酸に相当する量によるものとみなし、その相当量を算出する。このｐ－クマル酸相当量から換算係数を用いプロポリス可溶性成分量を算出する。最後にこのプロポリス可溶性成分量が表示値以上であることを判定する。 From the high performance liquid chromatogram (HPLC) of the test solution, the total area of all peaks with a retention time of up to 30 minutes (up to a retention time of 45 minutes when water-extracted propolis extract is used) is determined. Next, the peak area of the p-coumaric acid standard solution is obtained and used as the standard area. The total area of all peaks is assumed to be due to the equivalent amount of p-coumaric acid, and the equivalent amount is calculated. The amount of propolis soluble components is calculated from the equivalent amount of p-coumaric acid using a conversion factor. Finally, it is determined that the amount of propolis soluble components is greater than or equal to the indicated value.

プロポリスエキス末の配合量は、所望とする効果やエキスに含まれるプロポリス由来の固形分量又はその他の有効成分等の量によっても変動し、例えば、ｐ－クマル酸相当量として２５％含む原料を使用する場合、抗インフルエンザウイルス剤に対して０．０１～０．９８重量部程度であってもよい。単独での抗インフルエンザウイルス作用を考慮した場合、例えば、ｐ－クマル酸相当量として２５％含む原料を使用すると、終濃度が約２００～約５００μｇ／ｍｌ、好ましくは約２５０～約３００μｇ／ｍｌの範囲となるように調節され得る。 The amount of propolis extract powder blended varies depending on the desired effect, the amount of propolis-derived solids contained in the extract, the amount of other active ingredients, etc. For example, a raw material containing 25% p-coumaric acid equivalent is used. When used, it may be about 0.01 to 0.98 parts by weight with respect to the anti-influenza virus agent. Considering the anti-influenza virus action alone, for example, if a raw material containing 25% p-coumaric acid equivalent is used, the final concentration is about 200 to about 500 μg/ml, preferably about 250 to about 300 μg/ml. range can be adjusted.

（Ｃ）乳酸菌
乳酸菌は、様々な感染症に対して予防作用や防御作用を示すことが報告されている。乳酸菌によるこれらの作用は、宿主の細胞性免疫を賦活化することや、腸管や呼吸器などの粘膜からのＩｇＡの分泌を亢進させることなどによることが報告されている。ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌は、宿主の免疫担当細胞からのＩＬ－１２（インターロイキン－１２）やＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）などのサイトカイン産生を誘導することにより、宿主の細胞性免疫を賦活化し、インフルエンザウイルスなどの感染を防御することが報告されている。 (C) Lactic acid bacteria Lactic acid bacteria have been reported to exhibit preventive and protective actions against various infectious diseases. These actions by lactic acid bacteria are reported to be due to activation of host cell-mediated immunity and enhancement of IgA secretion from mucous membranes such as the intestinal tract and respiratory tract. Lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus casei induce the production of cytokines such as IL-12 (interleukin-12) and IFN-γ (interferon-γ) from host immunocompetent cells, thereby inhibiting the growth of the host. It has been reported that it activates cell-mediated immunity and protects against infections such as influenza viruses.

本発明において乳酸菌が果たす抗インフルエンザウイルス作用は上記エキスとは異なっていてもよい。そのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗インフルエンザウイルス活性が低い場合であっても、サイトカイン産生を顕著に増大させる乳酸菌であれば本発明において好適に使用することができる。例えば、二本鎖ＲＮＡはサイトカイン産生を促進することが知られており（特許第５０９９６４９号）、二本鎖ＲＮＡを大量に含有する乳酸菌は上記エキスと組み合わせるのに好ましいと考えられる。 In the present invention, the anti-influenza virus action of lactic acid bacteria may be different from that of the above extract. Therefore, even if the in vitro anti-influenza virus activity is low, lactic acid bacteria that significantly increase cytokine production can be suitably used in the present invention. For example, double-stranded RNA is known to promote cytokine production (Patent No. 5099649), and lactic acid bacteria containing a large amount of double-stranded RNA are considered preferable for combining with the above extract.

本発明の一態様の乳酸菌における二本鎖ＲＮＡの含有量は、同一の菌株を至適温度かつ非通気条件下で同一の培養時間で培養したときの該菌株の二本鎖ＲＮＡの含有量と比べて、２．０倍以上の量であり、好ましくは３．０倍以上の量であり、より好ましくは５．０倍以上の量であり、さらに好ましくは１０倍以上の量であり、なおさらに好ましくは３０倍以上の量であってもよい。また、本発明の一態様の乳酸菌は、二本鎖ＲＮＡの含有量が乾燥菌体５ｍｇあたり１，０００ｎｇ／ｍＬ以上である乳酸菌であることが好ましい。 The content of double-stranded RNA in the lactic acid bacterium of one aspect of the present invention is the content of double-stranded RNA of the same strain when the same strain is cultured under optimal temperature and non-aerated conditions for the same culture time. The amount is 2.0 times or more, preferably 3.0 times or more, more preferably 5.0 times or more, still more preferably 10 times or more, and more preferably 10 times or more. Preferably, the amount may be 30 times or more. In addition, the lactic acid bacterium of one embodiment of the present invention preferably has a double-stranded RNA content of 1,000 ng/mL or more per 5 mg of dry bacterial cells.

ＩＬ－１２産生促進作用を有するか、若しくは二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌は、乳酸菌を所定の条件下の培養に供することにより得ることができる。この際に使用する乳酸菌は通常知られているとおりの乳酸を生成する微生物のことを意味する。乳酸菌としては、例えば、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属乳酸菌、テトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌などに属する乳酸菌が挙げられ、具体的にはペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されない。 A lactic acid bacterium having an IL-12 production-promoting effect or containing double-stranded RNA can be obtained by culturing lactic acid bacteria under predetermined conditions. The lactic acid bacteria used in this case mean microorganisms that produce lactic acid as commonly known. Examples of lactic acid bacteria include Pediococcus lactic acid bacteria, Lactococcus lactic acid bacteria, Lactobacillus lactic acid bacteria, Streptococcus lactic acid bacteria, Leuconostoc lactic acid bacteria, and Tetragenococcus. (Tetragenococcus) lactic acid bacteria belonging to the genus lactic acid bacteria, specifically Pediococcus acidilactici, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, lacto Bacillus pentosus, Lactobacillus sakei, Tetragenococcus halophilus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus brucei Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ）などがExamples include, but are not limited to:

乳酸菌のより具体的な非限定的な例としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株、ラクトコッカス・ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５株、ラクトバチルス・プランタラム ＡＴＣＣ１４９１７株、ラクトバチルス・ペントーサス ＡＴＣＣ８０４１株、ラクトバチルス・サケイ Ｋ４１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラス ＫＫ２２１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラス ＮＢＲＣ１２１７２株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ－３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ００９９株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ０１２２株、ラクトバチルス・プランタラム ＮＲＩＣ１９３０株、ラクトバチルス・プランタラム ＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス ＮＲＩＣ１６８８株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティス ＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ブレビス ＮＲＩＣ１７１３株、ラクトバチルス・ペントーサス ＮＲＩＣ０３９１株、ラクトバチルス・ペントーサス ＮＲＩＣ０３９６株、ラクトバチルス・ペントーサス ＮＲＩＣ１８３６株、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ ＮＲＩＣ０６４４株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ ＮＲＩＣ１９３６、ストレプトコッカス・サーモフィラス ＮＲＩＣ０２５６株、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス ＮＲＩＣ１９８２株、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス ＡＴＣＣ１２２９１株、ロイコノストック・ラクティス ＮＲＩＣ１５８２株などが挙げられる。 More specific non-limiting examples of lactic acid bacteria include Pediococcus acidilactici K15 strain, Lactococcus lactis ATCC19435 strain, Lactobacillus plantarum ATCC14917 strain, Lactobacillus pentosus ATCC8041 strain, Lactobacillus Sakei K41 strain, Tetragenococcus halophilus KK221 strain, Tetragenococcus halophilus NBRC12172 strain, Pediococcus pentosaceus OS strain (NITE P-354), Pediococcus pentosaceus NRIC1915 strain, Pediococcus pentosaceus NRIC0099 strain, Pediococcus pentosaceus NRIC0122 strain, Lactobacillus plantarum NRIC1930 strain, Lactobacillus plantarum NRIC1067 strain, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus NRIC1688 strain, Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis NRIC1683 strain, Lactobacillus brevis NRIC1713 strain, Lactobacillus pentosus NRIC0391 strain, Lactobacillus pentosus NRIC0396 strain, Lactobacillus pentosus NRIC1836 strain, Lactobacillus casei subsp. - Paracasei NRIC1936, Streptococcus thermophilus NRIC0256 strain, Leuconostoc mesenteroides subsp.

本発明の一態様の乳酸菌を得るために使用する乳酸菌としては、上記したものの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。また、上記したもののうち、二本鎖ＲＮＡの含有量の観点から、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株、ラクトコッカス・ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５株、ラクトバチルス・プランタラム ＡＴＣＣ１４９１７株、ラクトバチルス・ペントーサス ＡＴＣＣ８０４１株及びラクトバチルス・サケイ Ｋ４１株が好ましく、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株がより好ましい。 As the lactic acid bacterium used to obtain the lactic acid bacterium of one embodiment of the present invention, one of the above-described lactic acid bacteria can be used alone, or two or more of them can be used in combination. Among the above, from the viewpoint of double-stranded RNA content, Pediococcus acidilactici K15 strain, Lactococcus lactis ATCC19435 strain, Lactobacillus plantarum ATCC14917 strain, Lactobacillus pentosus ATCC8041 strain and Lactobacillus sakai strain K41 are preferred, and Pediococcus acidilactici strain K15 is more preferred.

別の好ましい態様において、乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の新規菌株である、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＭＣＣ１８４９（ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６３３）株であってもよい（特許第特許５６４６１２４号）。 In another preferred embodiment, the lactic acid bacterium may be Lactobacillus paracasei MCC1849 (NITE BP-01633) strain, which is a novel strain of lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus paracasei (Patent No. 5646124). .

本発明で使用するラクトバチルス・パラカゼイは、上記寄託菌株に制限されず、同寄託菌株と実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、ラクトバチルス・パラカゼイに属する菌株であって、寄託菌株と同程度の高いＩＬ－１２産生促進作用を有し、かつ、好ましくは細胞壁分解酵素、及び、ＲＮａｓｅによる処理によってもＩＬ－１２産生促進作用の低下が寄託菌株と同程度に少ない菌株を言う。また、実質的に同等の菌株は、さらに、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、上記寄託菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくは上記寄託菌株と同一の菌学的性質を有する。さらに、本発明の乳酸菌は、本発明の効果が損なわれない限り、寄託菌株、又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。 The Lactobacillus paracasei used in the present invention is not limited to the above deposited strain, and may be a strain substantially equivalent to the deposited strain. A substantially equivalent strain is a strain belonging to Lactobacillus paracasei, which has an IL-12 production-promoting effect as high as that of the deposited strain, and is preferably treated with a cell wall-degrading enzyme and RNase. It means a strain that exhibits as little decrease in the IL-12 production-promoting effect as the deposited strain. In addition, the substantially equivalent strain has a 16S rRNA gene nucleotide sequence that is 98% or more, preferably 99% or more, more preferably 100% homologous to the 16S rRNA gene nucleotide sequence of the deposited strain. and preferably have the same mycological properties as the deposited strain. Furthermore, the lactic acid bacterium of the present invention is a strain bred by mutation treatment, genetic recombination, selection of natural mutant strains, etc. from the deposited strain or a strain substantially equivalent thereto, as long as the effects of the present invention are not impaired. There may be.

乳酸菌の配合量は、所望とする効果や乳酸菌の種類又はその他の有効成分等の量によっても変動し、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９を使用する場合、抗インフルエンザウイルス剤に対して０．００１～０．９８重量部程度であってもよい（乾燥重量換算）。単独での抗インフルエンザウイルス作用を考慮した場合、例えばラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９の終濃度が乾燥重量換算で約２００～約１，５００μｇ／ｍｌ、好ましくは約２５０～約１，０００μｇ／ｍｌの範囲となるように配合量が調節され得る。 The amount of lactic acid bacteria to be blended varies depending on the desired effect, the type of lactic acid bacteria, and the amount of other active ingredients. It may be about 0.98 parts by weight (converted to dry weight). When considering the anti-influenza virus action alone, for example, the final concentration of Lactobacillus paracasei MCC1849 is in the range of about 200 to about 1,500 μg/ml, preferably about 250 to about 1,000 μg/ml in terms of dry weight. The blending amount can be adjusted so that

（組成物）
本実施形態の組成物は、上記抗インフルエンザウイルス剤を含む。本発明の組成物は飲食品、サプリメント又は医薬品に配合され得る。 (Composition)
The composition of this embodiment contains the above anti-influenza virus agent. The composition of the present invention can be incorporated into food and drink, supplements, or pharmaceuticals.

本発明の組成物における、（Ａ）クランベリーエキス、（Ｂ）プロポリスエキス、（Ｃ）乳酸菌の合計量の配合比（質量比）は、各成分について述べた量に特に限定されず、目的や使用対象等の条件に応じて適宜設定できる。 The blending ratio (mass ratio) of the total amount of (A) cranberry extract, (B) propolis extract, and (C) lactic acid bacteria in the composition of the present invention is not particularly limited to the amount described for each component, and the purpose and use It can be appropriately set according to conditions such as the object.

本発明の成物には、（Ａ）クランベリーエキス、（Ｂ）プロポリスエキス、（Ｃ）乳酸菌以外に、その他の成分を含有しても良い。その他の成分としては、例えば、タンパク質、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維等の食物繊維、ミネラル類、植物又は植物加工品、藻類、乳酸菌以外の微生物等を配合することができる。 The composition of the present invention may contain other components in addition to (A) cranberry extract, (B) propolis extract, and (C) lactic acid bacteria. As other ingredients, for example, protein, dietary fiber such as water-soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber, minerals, plants or processed plant products, algae, microorganisms other than lactic acid bacteria, and the like can be blended.

さらに必要に応じて、通常飲食品分野で用いられるデキストリン、でんぷん等の糖類、オリゴ糖類、甘味料、酸味料、着色料、増粘剤、光沢剤、賦形剤、ビタミン類、栄養補助剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、乳化剤、食品添加物、調味料等を挙げることができる。これらその他の成分の含有量は、本発明の組成物の形態等に応じて適宜選択することができる。その他、最終製品の目的に応じて適宜追加の成分を組成物に配合してもよい。 Furthermore, if necessary, sugars such as dextrin and starch, oligosaccharides, sweeteners, acidulants, coloring agents, thickeners, brightening agents, excipients, vitamins, nutritional supplements, Binders, lubricants, stabilizers, diluents, extenders, emulsifiers, food additives, seasonings and the like can be mentioned. The content of these other components can be appropriately selected according to the form of the composition of the present invention. In addition, additional components may be appropriately added to the composition depending on the purpose of the final product.

本発明の組成物の形態は、特に限定されず、任意の形態とすることができる。具体的な形態としては、例えば、粉や顆粒、細粒等の粉末状、タブレット（チュアブル）状、球状、カプセル状、カプレット状、液状等の形状が挙げられる。なお、カプセル状の組成物は、ソフトカプセル及びハードカプセルが含まれる。 The form of the composition of the present invention is not particularly limited, and can be any form. Specific forms include, for example, powders such as powder, granules, and fine granules, tablets (chewable), spheres, capsules, caplets, and liquids. The capsule composition includes soft capsules and hard capsules.

本発明の組成物は、粉や顆粒、細粒等の粉末状が好ましく、特に、水などと混合し、溶解したり懸濁させたりして使用する粉末飲料とすることにより、組成物としての安定性にも優れるとともに、カプセルや錠剤等と異なり１度に多くの組成物を摂取することができるので好ましい。 The composition of the present invention is preferably in the form of powder such as powder, granules, and fine granules. In addition to being excellent in stability, unlike capsules, tablets, etc., a large amount of the composition can be ingested at once, which is preferable.

本発明の組成物は、従来公知の方法により製造することができる。本発明の組成物を製造する際、使用する原料の形態は、特に限定されず、組成物の形態に合わせて適宜選択し、使用することができる。例えば、粉や顆粒、細粒等の粉末状の組成物を得る場合、（Ａ）クランベリーエキス、（Ｂ）プロポリスエキス及び（Ｃ）乳酸菌は、これらをそのまま使用しても良いし、賦形剤、増量剤等との混合物を使用しても良い。また、カプセル状の組成物を得る場合は、水や食用油等の溶媒にあらかじめ溶解又は分散させたものを使用しても良い。 The composition of the present invention can be produced by a conventionally known method. When producing the composition of the present invention, the form of the raw material to be used is not particularly limited, and can be appropriately selected and used according to the form of the composition. For example, when obtaining a powdery composition such as powder, granules, fine granules, (A) cranberry extract, (B) propolis extract and (C) lactic acid bacteria may be used as they are, or as excipients , extenders and the like may be used. Moreover, when obtaining a capsule-like composition, it may be dissolved or dispersed in a solvent such as water or edible oil in advance.

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples. However, the present invention is not limited to these examples.

・（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗インフルエンザウイルス活性評価試験）
（Ａ）クランベリーエキス、（Ｂ）プロポリスエキス及び（Ｃ）乳酸菌（ラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９）（以下、３種をまとめて「被験物質」ということがある。）について、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に対する抗ウイルス活性を評価した。 ・(In vitro anti-influenza virus activity evaluation test)
(A) cranberry extract, (B) propolis extract, and (C) lactic acid bacteria (Lactobacillus paracasei MCC1849) (hereinafter, the three types may be collectively referred to as “test substances”). was evaluated for its antiviral activity against

評価は、培養細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ感染系にて行い、抗ウイルス活性と同時に被験物質の細胞毒性についても評価した。試験は、まず、（１）（Ａ）クランベリーエキス、（Ｂ）プロポリスエキス及び（Ｃ）乳酸菌の単独使用時の抗ウイルス活性並びに細胞毒性について評価し、その結果にもとづき試験内容を定めた後に、（２）（Ａ）クランベリー抽出物、（Ｂ）プロポリス及び（Ｃ）乳酸菌の３種併用時の抗ウイルス活性について評価した。 The evaluation was carried out in an in vitro infection system using cultured cells, and the cytotoxicity of the test substance was evaluated simultaneously with the antiviral activity. In the test, first, (1) (A) cranberry extract, (B) propolis extract, and (C) lactic acid bacteria when used alone were evaluated for antiviral activity and cytotoxicity, and based on the results, after determining the test content, (2) The antiviral activity of (A) cranberry extract, (B) propolis and (C) lactic acid bacteria in combination was evaluated.

・（試験材料）
（Ａ）～（Ｃ）の原料はいずれも粉末状のものを用いた。クランベリーエキス末はネキシラ株式会社製の総プロアントシアニジン規格４０％のもの、プロポリスエキス末は森川健康堂株式会社製のブラジル産プロポリスエキス２０％パウダー（賦形剤：β―ＣＤ）（注：β－ＣＤはβ－シクロデキストリンを意味する）、乳酸菌末は森永乳業株式会社製のシールド乳酸菌Ｍ－１（ラクトバチルス・パラカゼイ・ＭＣＣ１８４９株）をそれぞれ使用した。 ・(test material)
Powdered materials were used for all of the raw materials (A) to (C). The cranberry extract powder is 40% total proanthocyanidin standard manufactured by Nexila Co., Ltd. The propolis extract powder is 20% Brazilian propolis extract powder manufactured by Morikawa Kenkodo Co., Ltd. (excipient: β-CD) (Note: β- CD means β-cyclodextrin), and lactic acid bacteria powder used was Shield lactic acid bacterium M-1 (Lactobacillus paracasei MCC1849 strain) manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., respectively.

使用した対照物質は、下記のとおりである。
物質名 ：Ｚａｎａｍｉｖｉｒ ｈｙｄｒａｔｅ（商品名：リレンザ（登録商標））
由来 ：グラクソ・スミスクライン社製
溶媒 ：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
保管方法 ：溶解後－２０℃に保管
備考 ：ノイラミニダーゼ阻害薬 The control substances used are as follows.
Substance name: Zanamivir hydrate (trade name: Relenza (registered trademark))
Origin: manufactured by GlaxoSmithKline Solvent: DMSO (dimethyl sulfoxide)
Storage method: Store at -20°C after dissolution Remarks: Neuraminidase inhibitor

使用したウイルスは、下記のとおりである。
ウイルス名 ：Ａ型インフルエンザウイルス
株名 ：ＷＳＮ（Ａ／ＷＳＮ／３３， Ｈ１Ｎ１）株
由来 ：ＡＶＳＳ保有株（管理番号：Ｈ１６１１）、ＭＤＣＫ細胞で増幅し培養上清中に回収したウイルス液 The viruses used are as follows.
Virus name: Influenza A virus strain name: WSN (A/WSN/33, H1N1) strain origin: AVSS stock (control number: H1611), virus solution amplified in MDCK cells and collected in culture supernatant

インフルエンザウイルスの感染宿主として使用した細胞は、下記のとおりである。
細胞株名 ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞由来（イヌ腎臓由来細胞株 ） Cells used as hosts for influenza virus infection are as follows.
Cell line name MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) cell-derived (canine kidney-derived cell line)

（試薬・器具類）
・ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ， Ｃａｔ．＃ ０５１－０７６１５）
・牛胎児血清 ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃ １７２０１２－５００ＭＬ）
・１００×ＭＥＭ ｖｉｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃ １１１２０－０５２）
・ペニシリンＧカリウム（ｎａｃａｌａｉ，Ｃａｔ．＃ ２６２３９－４２）
・ストレプトマイシン硫酸塩（ｎａｃａｌａｉ，Ｃａｔ．＃ ３２２０４－９２）
・ジメチルスルホキシド（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ．＃ ０３１－２４０５１）
・トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．＃ １５０９００４６）
・９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＴＰＰ，Ｃａｔ．＃ ９２０９６）
・φ１０ｃｍ ｄｉｓｈ（ＴＰＰ，Ｃａｔ．＃ ９３１００）
・マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ，ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）
・プレートシェーカー（Ｍ＆Ｓ，Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｇｅｎｉｅ）
・８連マイクロピペット（ＧＩＬＳＯＮ）
・マイクロピペット（２０，２００，１０００ Ｌ，ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） (Reagents/instruments)
・MEM medium (Wako, Cat.# 051-07615)
- Fetal bovine serum FBS (Sigma, Cat. # 172012-500ML)
- 100x MEM vitamin (Gibco, Cat. # 11120-052)
- Penicillin G potassium (nacalai, Cat. # 26239-42)
- Streptomycin sulfate (nacalai, Cat. # 32204-92)
- Dimethyl sulfoxide (Wako, Cat.# 031-24051)
- Trypsin (Thermo Fisher, Cat. # 15090046)
・96-well plate (TPP, Cat.#92096)
・φ10cm dish (TPP, Cat.#93100)
・Microplate reader (TECAN, infinite M200)
・Plate shaker (M&S, Microplate genie)
・8-channel micropipette (GILSON)
・Micropipette (20, 200, 1000 L, eppendorf)

・（試験方法）
試験は、「試験（１）」と「試験（２）」の２段階で実施した。
試験（１）では、被験物質３種について、各々を単独で使用した際の抗インフルエンザウイルス活性並びに細胞毒性を評価した。 ·(Test method)
The test was conducted in two stages, "test (1)" and "test (2)".
In test (1), the anti-influenza virus activity and cytotoxicity of each of the three test substances were evaluated when used alone.

次に、試験（２）では試験（１）の結果にもとづき、各被験物質の試験濃度やプレートレイアウトを決定した後、３種併用時の抗ウイルス活性について評価した。 Next, in Test (2), based on the results of Test (1), the test concentration and plate layout of each test substance were determined, and then the antiviral activity when the three substances were used in combination was evaluated.

以下に試験（１）の概要を示す。試験（２）は試験（１）と各被験物質添加時の液量が異なるが基本的な方法は同一である。 The outline of test (1) is shown below. Test (2) differs from Test (1) in the amount of liquid when adding each test substance, but the basic method is the same.

・（被験物質の調製方法）
クランベリーエキス末及びプロポリスエキス末については、これらを秤量し、エタノールを添加して濃度を１００ｍｇ／ｍｌに調整し、更に感染維持培地（ビタミン含有無血清ＭＥＭ）を添加し、各被験物質の濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにサンプルを調製した。これにより溶媒として使用したエタノールの最終濃度は２％（ｖ／ｖ）となった。乳酸菌末については、上記感染維持培地で濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるよう調製した。調製後のサンプルは使用時まで４℃で保存した。希釈用に別途用意する９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上で、２ｍｇ／ｍｌを最高濃度とした２倍段階希釈系列を計１０濃度（非添加群を除く）調製した。希釈には感染維持培地を使用した。また、同様にして陽性対照物質の２倍段階希釈系列を調製した。 ・(Preparation method of test substance)
Cranberry extract powder and propolis extract powder were weighed, ethanol was added to adjust the concentration to 100 mg/ml, and infection maintenance medium (vitamin-containing serum-free MEM) was added to determine the concentration of each test substance. Samples were prepared at 2 mg/ml. This resulted in a final concentration of 2% (v/v) of ethanol used as solvent. The powder of lactic acid bacteria was prepared in the above-mentioned infection maintenance medium so that the concentration was 2 mg/ml. The prepared samples were stored at 4°C until use. On a 96-well plate separately prepared for dilution, a two-fold serial dilution series with a maximum concentration of 2 mg/ml was prepared for a total of 10 concentrations (excluding the non-addition group). Infection maintenance medium was used for dilution. Similarly, a 2-fold serial dilution series of the positive control substance was prepared.

・（抗インフルエンザウイルス活性）
ＭＤＣＫ細胞を１０％血清含有ＭＥＭ（ＭＥＭ－１０％ＦＢＳ）で３．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種した（例えば、３．０×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
ただし、プレート左端１列目（計８ ｗｅｌｌｓ）には細胞を播種せず、解析時の補正用ブランク群とした。３７℃、５％ＣＯ₂下で２４時間培養後、培養液を除去し、１００μｌ／ｗｅｌｌの無血清ＭＥＭで各ｗｅｌｌの細胞単層を１回洗浄した。 ・(Anti-influenza virus activity)
MDCK cells were prepared with 10% serum-containing MEM (MEM-10% FBS) to 3.0×10 ⁵ cells/ml and seeded at 100 μl/well onto a 96-well plate (for example, 3.0×10 ⁴ cells /well).
However, cells were not seeded in the first column (8 wells in total) at the left end of the plate, and this was used as a blank group for correction during analysis. After culturing for 24 hours at 37° C. under 5% CO ₂ , the culture medium was removed, and the cell monolayer in each well was washed once with 100 μl/well of serum-free MEM.

洗浄後、調製する被験物質等の２倍段階希釈系列を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、続けて、抗ウイルス活性評価群には感染維持培地で１，０００ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌに調製したインフルエンザウイルス溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した（ＭＯＩ≒０．００２ ｐｆｕ／ｃｅｌｌ相当）。 After washing, a 2-fold serial dilution series of the test substance to be prepared was added at 100 μl/well. Subsequently, 100 μl of an influenza virus solution prepared to 1,000 TCID ₅₀ /ml in an infection maintenance medium was added to the antiviral activity evaluation group. /well (equivalent to MOI≈0.002 pfu/cell).

被験物質等は０～２ｍｇ／ｍｌの各濃度から２倍に希釈され、０～１ｍｇ／ｍｌに示した最終試験濃度に調製した。ウイルス添加後の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅは室温下で３０秒間撹拌した後、３７℃、５％ＣＯ₂下で３日間（７２ｈｒｓ）培養した。なお、試験はＮ＝２（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で実施した。 Test substances were diluted twice from each concentration of 0 to 2 mg/ml to prepare final test concentrations of 0 to 1 mg/ml. After addition of virus, the 96-well plate was stirred at room temperature for 30 seconds and then cultured at 37° C. under 5% CO ₂ for 3 days (72 hours). The test was performed with N=2 (duplicates).

・（結果の定量・解析方法）
培養後の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから培養液を除去し、７０％エタノール水溶液で細胞を固定後（室温下で５分間）、エタノールを除去し、０．５％クリスタルバイオレット水溶液で残存細胞を染色した。染色後、水道水でプレートを軽くリンスし風乾させた。 ・(Method of quantification and analysis of results)
After culturing, the culture medium was removed from the 96-well plate, the cells were fixed with a 70% ethanol aqueous solution (at room temperature for 5 minutes), the ethanol was removed, and the remaining cells were stained with a 0.5% crystal violet aqueous solution. After staining, the plates were rinsed lightly with tap water and air dried.

風乾後、各ｗｅｌｌの吸光度（λ＝５６０ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定し、得られた測定結果をもとに統計解析ソフト「ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）」を使用して、５０％感染阻害濃度（ＩＣ₅₀）を算定した。
結果を以下に示す。
表１:単独で使用した際の抗インフルエンザウイルス活性

After air-drying, the absorbance (λ = 560 nm) of each well was measured with a microplate reader. The % infection inhibitory concentration ( _IC50 ) was calculated.
The results are shown below.
Table 1: Anti-influenza virus activity when used alone

その結果、クランベリーエキスは、単独の場合、添加濃度が７．８～３１．３μｇ／ｍｌにおいて濃度依存的な抗ウイルス活性の上昇が認められた。プロポリスエキスは単独で添加濃度が２５０μｇ／ｍｌ付近の場合に顕著な抗ウイルス活性が認められた。乳酸菌末も単独で２５０～１，０００μｇ／ｍｌの濃度において抗ウイルス活性の上昇が認められた。 As a result, when the cranberry extract was used alone, a concentration-dependent increase in antiviral activity was observed at concentrations of 7.8 to 31.3 μg/ml. The propolis extract alone was found to have significant antiviral activity when added at a concentration of around 250 μg/ml. The antiviral activity of the powder of lactic acid bacteria alone was also increased at concentrations of 250 to 1,000 μg/ml.

更に、（Ａ）～（Ｃ）の成分を全て組み合わせ、クランベリーエキスの抗ウイルス活性の変化を見た場合、各成分単独の効果を大幅に上回る顕著な抗インフルエンザウイルス作用を確認することができた。以下に一部の結果を示す。
表２：被験物質３種併用時のクランベリーエキスＩＣ₅₀値一覧

Furthermore, when all of the components (A) to (C) were combined and changes in the antiviral activity of the cranberry extract were observed, a remarkable anti-influenza virus effect that greatly exceeded the effect of each component alone was confirmed. . Some results are shown below.
Table 2: List of cranberry extract IC ₅₀ values when three test substances are used in combination

（飲食用組成物の製造）
以下の表３に示す配合を有するソフトカプセルを調製した。

(Manufacture of food and drink composition)
Soft capsules were prepared having the formulations shown in Table 3 below.

本発明によれば、クランベリーエキス、プロポリスエキス、及び、任意に乳酸菌を含有することにより、優れた抗インフルエンザ用組成物を提供することができる。 According to the present invention, an excellent anti-influenza composition can be provided by containing cranberry extract, propolis extract, and optionally lactic acid bacteria.

Claims (6)

有効成分として、クランベリーエキスを０．１～０．９８重量部、エタノール抽出されたプロポリスエキスを０．０１～０．９８重量部、乳酸菌を乾燥重量換算で０．０１～０．９８重量部含み、
前記乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌である、抗インフルエンザウイルス剤。 As active ingredients, it contains 0.1 to 0.98 parts by weight of cranberry extract, 0.01 to 0.98 parts by weight of ethanol-extracted propolis extract, and 0.01 to 0.98 parts by weight of lactic acid bacteria in terms of dry weight. fruit,
An anti-influenza virus agent, wherein the lactic acid bacterium is a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus paracasei . 前記ラクトバチルス・パラカゼイがラクトバチルス・パラカゼイＭＣＣ１８４９（ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６３３）株である、請求項１に記載の抗インフルエンザウイルス剤。 2. The anti-influenza virus agent according to claim 1 , wherein said Lactobacillus paracasei is Lactobacillus paracasei MCC1849 (NITE BP-01633) strain. 請求項１又は２に記載の抗インフルエンザウイルス剤を含む、組成物。 A composition comprising the anti-influenza virus agent according to claim 1 or 2 . 飲食品、サプリメント又は医薬に配合される、請求項３に記載の組成物。 4. The composition according to claim 3 , which is incorporated in food, drink, supplements, or pharmaceuticals. インフルエンザウイルス感染の予防又は治療のための、請求項４に記載の組成物。 5. The composition according to claim 4 , for prevention or treatment of influenza virus infection. 前記クランベリーエキスの配合量が０．１～０．９８重量部、前記プロポリスエキスの配合量が０．０１～０．９８重量部、前記乳酸菌の配合量が乾燥重量換算で０．０１～０．９８重量部含である、請求項３～５のいずれか１項に記載の組成物。 The content of the cranberry extract is 0.1 to 0.98 parts by weight, the content of the propolis extract is 0.01 to 0.98 parts by weight, and the content of the lactic acid bacteria is 0.01 to 0.01 in terms of dry weight. A composition according to any one of Claims 3 to 5 , containing 98 parts by weight.