JP7122169B2 - メラニン分解促進剤及び美白化粧料 - Google Patents

Description

本発明は、紫外線や加齢などの様々な要因により生じる色素沈着の迅速な改善に有用なメラニン分解促進剤、およびメラニン分解促進剤を含有する美白化粧料に関するものである。

顔や腕などの紫外線に日常的に暴露されやすい部位では局所的な色素沈着、いわゆるシミが加齢とともに形成される。この色素沈着は、長年の紫外線暴露によって表皮に存在するメラノサイトが活性化されることで過剰にメラニンが産生され、その結果皮膚中のメラニン量が多くなったことが原因であると考えられている（非特許文献１）。

そのため、シミの改善が期待できる成分としてメラノサイトにおけるメラニン生合成に関与する酵素活性を阻害する成分（特許文献１）や、メラノサイトを活性化するエンドセリンやプロスタグランジンといったシグナル伝達物質を阻害する成分等が数多く開発されてきた（特許文献２、特許文献３）。

これらの成分が配合された化粧料を日常的に使用することによって、シミの形成が予防できることは明らかであるが、既に形成されたシミ部位の表皮には多量のメラニンが蓄積されているため、シミをすばやく改善するにはメラニン合成抑制効果を有する上記成分に加え、蓄積されたメラニンを取り除くことが重要である。

メラニンを取り除く方法としては表皮の入れ替わり、すなわちターンオーバーを促進する方法等が提案されているが（特許文献４）、細胞内に存在する過剰なメラニンは細胞***能の低下を引き起こすため、細胞内に存在するメラニン量が減少しない限り十分な効果を発揮させるのは難しい。

また、化学的手法によって表皮をピーリングする方法（ケミカルピーリング）も色素斑の改善には有用であり、グリコール酸やサリチル酸などが知られているが、皮膚刺激などの問題があるため医師の管理下で行われることが望ましい（非特許文献２）。

一方、シミ部の表皮に蓄積したメラニンは表皮細胞内の酵素の働きにより分解されることが知られている。そのため、特許文献５ではツボクサエキスを用いたメラニン分解促進剤が提案されているが、そのような効果を有する成分はほとんど見つかっていない。

モダマ葉抽出物については、抗酸化効果（特許文献６）や毛乳頭細胞活性化効果（特許文献７）が知られている。しかしながら、モダマ葉抽出物におけるメラニン分解促進作用については全く知られていなかった。

このような背景から、シミやソバカス等の色素沈着を迅速に改善するため、シミ部位の表皮に存在しているメラニンを分解することができる有効かつ安全性の高いメラニン分解促進剤が強く求められていた。

特開平６－３０５９７８号公報 特開平１１－１０９７６６号公報 特開２００６－１４３６７６号公報 特開２００８－２４７７８３号公報 特開２０１５－５１９３１号公報 特開平１１－５９７５号公報 特開２０００－１２８７４１号公報

保湿・美白・抗シワ・抗酸化評価・実験法マニュアル ２０１２年２月１日、フレグランスジャーナル社 日本皮膚科学会誌１１８（３）３４７－３５５、２００８年

本発明の課題は、新規で有用なメラニン分解促進剤及び、シミやソバカスをはじめとする様々な色素沈着症状の迅速な緩和・改善に有用な美白化粧料を提供することである。

本発明者らが鋭意検討した結果、モダマ葉抽出物を用いることで前記課題を解決した。

本発明により、モダマ葉抽出物を用いた美白への新たなアプローチ方法を提供することができる。加えて、新規のメラニン分解促進剤を提供することができる。さらに本発明で見出したモダマ葉抽出物と、従来から用いられているメラニン合成を抑制するような成分と組み合わせることで、既に形成されたシミを迅速に改善することが可能である。

本発明で用いるモダマ (藻玉、学名：Entada Phaseoloides) はマメ科の常緑性植物で、東南アジアに広く分布している植物で、世界一大きい豆を実らせる植物として知られている。インドネシアのジャワ島では民間薬（ジャムウ）として栽培、利用されている植物でもある。

本発明の表皮細胞におけるメラニン分解促進剤は、外用、内服のいずれの方法でも用いることができるが、皮膚外用剤の形態とすることが好ましい。その剤型は、目的に応じて任意に選択でき、クリーム状、軟膏状、乳液状、ローション状、溶液状、ゲル状、パック状、パウダー状、スティック状等にできる。また、本発明の表皮細胞に対するメラニン分解促進剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品等として用いることができうる。

本願発明で用いるモダマ抽出物の抽出部位は葉であり、その抽出溶媒は特に限定されない。例えば、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール等の低級アルコール或いは、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、等の多価アルコール等があげられるが、特に水、エタノール及び1,3-ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。

本願発明で用いるモダマ葉抽出物の抽出法は、特に限定されない。例えば、乾燥植物１質量部に対して１～１００質量部の水および1,3ブチレングリコールもしくはエタノールの混合液を用い、５～７０℃の、好ましくは１０～６０℃の温度で、１～７日間、特に３～４日間抽出するのが好ましい。抽出後は、ろ過を行い、そのままの状態でも利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を行うことも出来る。更には、凍結乾燥等をして粉末の状態で用いることも出来る。

以下、本願発明の実施例について具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。

［試験１］メラニン分解促進作用確認試験
本発明者は、ヒト表皮由来細胞におけるメラニン分解促進作用を評価することとした。
〔サンプルの調製〕
モダマ葉および比較対照としてインドネシア原産植物として知られるハトムギ、メリンジョ、高い抗酸化効果及びメラニン生成抑制効果が知られているシソ葉を乾燥させ、乾燥原体とした。
乾燥原体１：抽出溶媒１０の割合の質量比で混合し、抽出溶媒が５０％エタノール水溶液の場合は室温、１週間、抽出溶媒が水の場合は６０℃、５時間の条件で抽出物の抽出を行った。抽出後、凍結乾燥にて固形分を得た。

〔メラニン溶液の調製〕
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭ３ＫＯを５％ＣＯ_２下、３７℃のインキュベーター内で、５％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。
１００％コンフルエント近くになり、メラニン産生が進んだ細胞を、トリプシンを用いて７．０×１０^６ｃｅｌｌｓ/ ｔｕｂｅになるようにエッペンドルフチューブに回収、遠心（１０００ｇ、４℃、３分）によって細胞ペレットを作成した。その後ペレットをＰＢＳ（－）にて洗浄した。

細胞ペレットに対し、１ｍＬのｃｏｌｄ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙ）ｅｔｈａｎｏｌ（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０ ）、０．０１％ ＳＤＳ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）を添加した。これを１０分ごとに攪拌しながら、２０分室温にて静置した。この分散溶液を遠心分離（１０００ｇ、４℃、３分）、不要物を沈殿させ、メラノソームを含む上清を回収した。回収した上清を再度、遠心分離し（１０００ｇ、４℃、３分）、上清を回収した。この上清を遠心分離し（２００００ｇ、４℃、３分）、得られた沈殿をメラノソームリッチ画分とした。上清を吸引除去し、メラノソームのペレットをＰＢＳ（－）にて２度洗浄した。（２００００ｇ、４℃、３分）これにＰＢＳ（－）を添加し、５０回以上ピペッティングすることによってメラノソームを分散させた。この懸濁液をメラニン溶液とした。

〔細胞の培養〕
ヒト表皮株化細胞（ＨａＣａＴ）のトリプシン処理を行い、１０％牛胎児血清を含有するＤ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で細胞を分散させ、４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し、１日間、３７℃で培養を行なった。１日間培養を行った後、前述の方法で調製したメラニン溶液を添加した。
ヒト表皮株化細胞にメラニンを取り込ませるため、さらに１日間培養を行った。その後、
培地を取り除きＰＢＳ（－）で洗浄することで細胞に取り込まれなかったメラニンを取り除いた。そこに２％牛胎児血清を含有するＤ－ＭＥＭ培地および試料を添加した。
添加後４日間培養した。その後、培地を抜き取りＰＢＳ（－）で細胞を洗浄し、１０分間マイルドホルム（Ｗａｋｏ）で処理することで細胞を固定した。固定後、精製水で洗浄することで固定液を完全に取り除き、フォンタナアンモニア銀液（武藤化学）を添加した（フォンタナ・マッソン染色、メラニンを染色）。常温、オーバーナイト（１８時間）処理した後、フォンタナアンモニア銀液を取り除き、精製水で洗浄した。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｗａｋｏ）をＰＢＳ（－）で１０００倍希釈した溶液を加え、１５分処理したのち、ＰＢＳ（－）で洗浄した。ＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）をＰＢＳ（－）で１０００倍希釈し、４００μＬずつ加え、４５分、３７℃で反応させ、細胞の核を染色した。洗浄後、顕微鏡（キーエンス、倍率１０倍）にて細胞の画像を取得した。

〔メラニン残存量の定量〕
取得した画像はＩｍａｇｅＪ（オープンソース）にて、二値化することでメラニンの存在部を選択した。メラニン存在部の総面積を求めることで、画像中のメラニン量を算出した。同様にＩｍａｇｅＪを用いて画像中の細胞数を算出した。これらの結果から、細胞あたりのメラニン量を求めた。

精製水を添加した場合の細胞あたりのメラニン量を１００とし、モダマ葉抽出物、比較対象の植物抽出物を添加時のメラニン量を以下の表に示す。１００×（サンプルのメラニン量／細胞数）／（精製水のメラニン量／細胞数）の式から細胞あたりのメラニン量を求めた。

［試験２］ＤＰＰＨ試験
〔ＤＰＰＨ溶液の調製〕
ＤＰＰＨ溶液は、以下に示す各成分を、（Ａ）：（Ｂ）：（Ｃ）＝１：４：３容量の割合で混合し調製した。
（Ａ）ＥＳ（２-（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）５．５２ｇを水１００ｍＬに溶かし、１Ｎ－ＮａＯＨでＰＨ６．１に調製した。
（Ｂ）ＤＰＰＨ（１，１－ジフェニルー２－ピクリルヒドラジル）１５．７ｍｇをエタノール１００ｍｌに溶解した。
（Ｃ）精製水
〔Ｔｒｏｌｏｘ溶液の調製〕
Ｔｒｏｌｏｘ２５ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１０ｍｌに溶解し、１０ｍＭ溶液を作成した。
〔ＤＰＰＨ試験〕
測定は１２．５倍希釈した試料１０μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌ中に加え、次いでＤＰＰＨ溶液１９０μｌを迅速に加え混合した。３０分後、各ｗｅｌｌの吸光度を５４０ｎｍで測定した。試験溶液のＴｒｏｌｏｘ当量は、０．１５６ｍＭ、０．３１３ｍＭ、０．６２５ｍＭ、１.２５ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭのＴｒｏｌｏｘ溶液１０μｌをとり、ＤＰＰＨ溶液１９０μｌを加え混合し、３０分後の５４０ｎｍの吸光度を測定し、Ｔｒｏｌｏｘ濃度と５４０ｎｍの吸光度値の検量線を作成した。試験溶液の５４０ｎｍの吸光度値から、検量線によりＴｒｏｌｏｘ当量を算出した。標準物質として使用するＴｒｏｌｏｘは、トコフェロールと類似した構造を有する物質である。Ｔｒｏｌｏｘを１とした場合、α-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロールは、それぞれ０．５０、０．７４、１．３６を示すといわれているので、Ｔｒｏｌｏｘ当量が０．５以上であれば、十分な抗酸化効果であると言える。

表１に示すようにモダマ葉抽出物では細胞あたりのメラニン量が６３．１％と、精製水に比べて精製水と約３７％減少しており、細胞内におけるメラニン分解が顕著に促進されることが確認された。一方、シソ葉抽出物には高い抗酸化作用やメラニン生成抑制効果が良く知られているが、メラニン分解促進効果は認められなかった。そのため、抗酸化作用およびメラニン生成抑制効果はメラニン分解促進効果と連動しないものであると考えられた。

本発明のモダマ葉抽出物は、表皮細胞における細胞内メラニン分解を促進する効果を有しており、紫外線、加齢に起因する色素沈着を迅速に改善することが期待できる。

Claims (3)

1. モダマ葉抽出物を有効成分として含有するメラニン分解促進剤。
2. モダマ葉抽出物を有効成分として含有するメラニン分解促進美白化粧料。
3. 表皮細胞内に存在するメラニンの分解を促進する美容方法であって、モダマ葉抽出物を含有する組成物を皮膚に塗布する美容方法。