JP7119044B2 - 抗ヒト間葉系幹細胞老化およびその幹細胞性特徴増強方法 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞および再生医療分野に属し、長期インビトロ増幅過程における抗ヒト間葉系幹細胞老化およびその幹細胞性特徴増強方法に関する。

近年、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、その胚性幹細胞様特性および傍分泌能力により、ヒト疾患の治療において非常に重要であり、幹細胞と再生医学の理想的な細胞由来源となっている（Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１２；３５：２１３－２１．）。米国臨床試験登録センターの記録により、ＭＳＣで治療され得る疾患は１００種類以上あり、特に治療困難な病気に対して良好な応用見込みを有する（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１９；９：１７－２７．）。しかし、人体組織に由来する間葉系幹細胞の数は限られており、臨床的最小治療用量に必要な細胞数（１０^６－１０^７細胞／ｋｇ、成年の１回の治療用量：１０^８－１０^９）に達することが困難である（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１８； ２１：２８９－３６）。したがって、インビトロ増幅はＭＳＣ数不足を解決する主要途径ではない（Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２０１９；３：９０－１０４．）。しかし、長期体外培養によりＭＳＣ増殖潜在能力の低下を招き、最終的には***停滞を引き起こし（Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００９；３２：１１７－２６）、さらに、増幅環境ストレスにより損傷してＭＳＣ老化を引き起こし、ＭＳＣ長期***増殖による加齢性老化により細胞増殖分化遺伝子タンパク質が変化し、増幅されたＭＳＣの自己更新、増殖能力、分化潜在能力、免疫調節、遊走およびホーミング能力などの生物学的特性の進行性喪失を引き起こす（Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８，４０：１０１２７５；Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１８；２８：５９５－６０７）。また、老化細胞が大量の老化関連分泌表現型因子を分泌することで周囲健康細胞の老化を引き起こし、老化ＭＳＣを患者に注入すると、幹細胞の臨調治療効果に直接影響を与え、免疫拒絶、健康細胞がん化などの潜在的な治療リスクもある（Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８， ４０：１０１２７５；Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１８；２８：５９５－６０７）。例えば、加齢性老化により、ＭＳＣサイトカインおよびケモカイン受容体（ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ－６Ｒ）などの発現の低下を引き起こし（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９；１５：４２－９．）、これにより、炎症性疾患中の治療効果は若いＭＳＣよりも遥かに低い（ＡｍＪＲｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１４；１８９：７８７－９８）。したがって、ＭＳＣの長期インビトロ増幅による細胞老化問題は、ＭＳＣの大規模臨床応用がまだ達成されていない根本的、基本的で重要な一般的な科学的問題および主なボトルネックであり、緊急に解決する必要のある世界的な問題でもある。

文献によると、ＭＳＣは、様々なサイトカイン、成長因子およびケモカインを放出することにより微環境および周囲細胞の機能を調節することができる。同様にＭＳＣ周囲環境における細胞、細胞外マトリックスなどもＭＳＣの生物学的機能を調節することができる（Ｃｅｌｌ．２０１８；１７５：９０８－９２０．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１６；３１：９４９－５９）。生体組織が損傷した後、免疫システムが活性化されて病原体の侵入を抑制するとともに、幹細胞は増殖および分化により損傷を修復し、組織の完全性および定常状態を回復させる。この過程において、細胞内、細胞間および細胞と周囲環境の情報交換を活性化または調整する必要があり、免疫システムは損傷修復過程において重要な作用を奏する（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１７；７４：２３４５－６０）。免疫システムは、外来抗原の識別と除去に加えて、体内の変異した腫瘍細胞、老化細胞、その他の体内の有害成分を監視することができる。免疫システムは創傷治癒にも有利である（Ｍｅｄｉａｔ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１６；２０１６：２８５６２１３．）。歳をとった後、生体の免疫システムは若年成人と比べ顕著に退化し、外部損傷の修復能力も顕著に低下する。また、研究によると、胸腺は、免疫機能と内分泌機能の両方を備えた二重器官であり、動物の胸腺を除去した後、老化モデルを構築することができる（Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．２００１；１２２：１５９１－６１１．）。したがって、免疫システムの退化は、生体の老化を引き起こす。しかし、幹細胞老化仮説によると、成体幹細胞の老化および消耗は、組織器官老化および老化関連疾患の重要な誘因である（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７； ３１７：８０３－６）。免疫システム退化による生体老化と生体成体幹細胞の老化との間の関係についての科学的問題は、まだ完全には明らかではない。正常組織において、生体の成体幹細胞は増殖停止状態にあるが、生体が損傷した後、増殖および分化により損傷組織を修復するように損傷部位の成体幹細胞を刺激し、組織修復過程において免疫細胞の損傷部位への遊走を伴う。したがって、本発明者は、免疫細胞が局所幹細胞増殖および分化過程において重要な作用を奏することを推測した。研究により、天然リンパ球はＩＬ－２２を分泌することにより腸管幹細胞を刺激し、さらに損傷腸管上皮細胞を修復することが発見された（Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５２８：５６０－４）。最近の報告（Ｎａｔｕｒｅ．２０１９；５７１：２０５－１０）により、ＣＤ８タンパク質を発現する殺傷性Ｔ細胞は血液脳関門を突破し、老化マウスの脳に浸潤して神経幹細胞の増殖と分化を干渉することができる。しかし、免疫細胞の老化幹細胞に対する調節作用については、今まで報告はない。

本発明は、安全であり、長期インビトロ増幅過程に効果的に適用される抗ヒトＭＳＣ衰老およびその幹細胞性特徴増強方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するために、本発明では、ヒト末梢血中の免疫細胞とヒトＭＳＣとを細胞間接触または非接触方式で共培養する。

本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞は、身体検査を受けたドナーから採取、分離して得られたものである。ヒト末梢血免疫細胞は、ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣ中のＰＢＭ、またはＰＢＭＣ中のＰＢＬを含む。

本発明に記載のヒトＭＳＣは、健康、満期で帝王切開で出産した女性に由来する新鮮な臍帯、羊膜、臍帯血から分離して得られたものであり、羊膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣおよび臍帯血ＭＳＣを含む。

本発明に記載のＰＢＭＣと老化ヒトＭＳＣの細胞－細胞接触共培養での細胞比率は１：１－４００：１であり、１００以上：１の細胞比率である場合、ＭＳＣの老化マーカーβ－ガラクトシダーゼ発現の逆転はより強い。

本発明に記載のヒトＰＢＭＣと老化ヒトＭＳＣとの細胞－細胞共培養方式は、接触共培養および非接触共培養を含み、接触共培養は、ＭＳＣの老化マーカーβ－ガラクトシダーゼ発現をより良好に逆転することができる。

本発明に記載の２６歳－７４歳の異なるドナーに由来のＰＢＭＣと老化ヒトＭＳＣとの細胞－細胞接触共培養は、ＭＳＣの老化マーカーβ－ガラクトシダーゼ発現に対する逆転に対して統計的な差異がない。

本発明に記載の３種類のヒト末梢血免疫細胞と老化ヒトＭＳＣとを細胞間接触方式で共培養することにより、ＭＳＣの老化マーカーβ－ガラクトシダーゼ発現を逆転することができ、ＰＢＬの効果は最も高い。

本発明に記載のＰＢＬと若いヒトＭＳＣまたは老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触方式で共培養することにより、ヒトＭＳＣの老化を遅延または逆転でき、細胞老化マーカーβ－ガラクトシダーゼ、Ｐ１６およびＰ２１などの発現を顕著に低下させることができる。

本発明に記載のＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触で共培養することにより、老化ＭＳＣの細胞周期を調節し、Ｇ１期にある細胞の比率を減少させ、Ｓ期にある細胞の比率を増加させることができる。

本発明に記載のＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触で共培養することにより、ＭＳＣの増殖能力を顕著に増強させ、増殖細胞核抗原ＰＣＮＡの発現を促進することができる。

本発明に記載のＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触で共培養することにより、ＭＳＣの自己更新能力を向上でき、ヒトＭＳＣクローン形成を顕著に促進し、１０倍以上向上できる。

本発明に記載のＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触で共培養することにより、ＭＳＣ幹細胞性マーカーＯｃｔ４の発現を顕著に増強させ、ヒトＭＳＣの多方向分化（骨形成細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への分化を含む）能力を向上させることができる。

本発明に記載のＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触で共培養して増幅されたＭＳＣを疾患動物モデルに使用することより、免疫拒絶反応が発生せず、安全で有効である。

本発明では、主に老化（加齢性老化）したヒトＭＳＣを研究対象とし、それとヒト末梢血中の免疫細胞（末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｕｅｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）、ＰＢＭＣ中の末梢血単球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ，ＰＢＭ）および末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＰＢＬ）を含む）とを細胞－細胞接触または非接触の方式で共培養することにより、老化ヒトＭＳＣの老化特徴を顕著に逆転し、非老化ヒトＭＳＣの加齢性老化を遅延し、β－ガラクトシダーゼ、Ｐ１６およびＰ２１などの細胞老化マーカーの発現を減少できることが発見された。また、老化ＭＳＣの細胞周期を調節し、Ｇ１期にある細胞の比率を減少させ、Ｓ期にある細胞の比率を増加させることができる。さらに、この方法により、老化ヒト間葉系幹細胞の幹細胞性特徴、例えば、自己更新能力、増殖能力および多方向分化潜在能力を顕著に増強できる。そして、ヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬと老化ヒトＭＳＣとを細胞－細胞接触の方式で共培養して増幅されたＭＳＣを疾患モデルの治療に使用することにより、免疫拒絶がなく、治療効果は顕著である。幹細胞の長期インビトロ増幅過程における環境ストレス、酸化ストレス損傷による老化および増殖性老化という問題を解決することができ、大きな応用の見通しがある。

ヒトＭＳＣの表現型同定（ヒト羊膜ＭＳＣを例とする）である。図１Ａは、フローサイトメトリーによる表面分子マーカーの検出である。図１Ｂは、免疫細胞化学染色によるビメンチンおよびケラチンＣＫ１９の検出である。 異なる細胞比率でＰＢＭＣと老化ＭＳＣを接触共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 ＰＢＭＣと老化ＭＳＣとを異なる方式（接触および非接触）で共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 異なる年齢帯のドナーに由来するＰＢＭＣと老化ＭＳＣを接触共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 ヒト末梢血の異なる免疫細胞と老化ＭＳＣとを接触共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 ＰＢＬとヒト臍帯間葉系幹細胞とを共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 ＰＢＬとヒト臍帯血間葉系幹細胞とを共培養した後の、βガラクトシダーゼ陽性細胞（老化細胞）数の変化である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを接触共培養した後、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出された老化ＭＳＣ中の老化マーカーＰ２１およびＰ１６タンパク質の発現の変化である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを接触共培養した後、フローサイトメトリーにより分析された老化ＭＳＣの細胞周期の変化である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを接触共培養した後、ＥＤＵキットにより検出された老化ＭＳＣ増殖能力の変化である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを１５日間接触共培養した後の老化ＭＳＣのクローン形成能力の実験である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを接触共培養した後、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出された老化ＭＳＣ中の増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現変化である。 ＰＢＬと老化ＭＳＣとを接触共培養した後の、骨形成、軟骨および脂肪細胞への老化ＭＳＣの分化能力の変化である。 ＰＢＬと非老化ＭＳＣとを１２日間長期接触共培養した後、βガラクトシダーゼ染色により検出されたＭＳＣ老化に対する遅延作用である。 ＰＢＬと非老化ＭＳＣとを１２日間長期接触共培養した後、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出されたＭＳＣ中の老化マーカーＰ２１およびＰ１６タンパク質の発現レベルである。 潰瘍性結腸炎マウスモデルに対するＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養により得られたＭＳＣの治療効果の評価である。図１６Ａはマウスの体重変化を示す。図１６Ｂは、マウス疾患活動性指標（ＤＡＩ）のスコアを示す。図１６Ｃは病理学的観察を示す。図１６Ｄは病理学スコアを示す。

本発明の実施をより十分に説明し、本発明の目的、技術的手段および利点をより明確にするために、以下、図面および実施例により本発明の技術的手段をさらに詳しく説明する。異なる組織由来のＭＳＣは結果に影響を与えない（実施例７を参照）。本実施例では、主にヒト羊膜ＭＳＣを用いて説明する。理解できるように、ここで説明する具体的な実施例は、本発明の実施を解釈するものに過ぎず、本発明を制限するものではない。また、本発明の実施計画は、遵義医学院付属病院論理委員会の審査に合格した（論理審査番号：ＫＬＬＹ－２０１７－００３）。

＜実施例１＞ヒト間葉系幹細胞の分離培養および同定
満期帝王切開により得られた健康で新鮮な胎盤から羊膜組織を剥離し、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（最終濃度はペニシリン：１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００ＩＵ／ｍＬ、使用直前に調製）を含むＤ－ＰＢＳ溶液で残留血痕および粘液を繰り返し洗浄した。約１ｃｍ^２のサイズで羊膜を切った後、５０ｍＬ遠心管に分注し、羊膜組織体積の約２倍の０．０２％ＥＤＴＡ－２Ｎａ含有０．０５％トリプシン消化液を加え、３７°Ｃ恒温水槽において１８５ｒｐｍで約３０分間回転消化し、３００メッシュのステンレス鋼濾過網で濾過し、上清を捨て、上記ステップを１回繰り返した。消化後の羊膜組織を１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤ－ＰＢＳ液で１回洗浄し、等体積の０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含む０．５ｍｇ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ消化液を加え、３７°Ｃ、１９０ｒｐｍで１～１．５時間回転消化することで羊膜破片を完全に綿状に消化し、３００メッシュの篩網で濾過し、細胞濾液を収集し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿はヒト羊膜間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＡ－ＭＳＣ）であった。１０％ＦＢＳを含む低糖ＤＭＥＭ完全培地で細胞を再懸濁し、Ｔ７５細胞培養フラスコに接種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２、８５－１００％空気、飽和湿度の条件下で恒温培養し、細胞コンフルエンスが８０％以上に達した後、継代培養を行い、第３継代（Ｐ３）または第９継代（Ｐ９）細胞を収集し、実験に用いた。また、組織ブロック付着法により新鮮なヒト臍帯組織からヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣ－ＭＳＣｓ）を分離し、密度勾配遠心分離法により新鮮なヒト臍帯血からヒト臍帯血間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を分離した。得られたＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４およびＣＤ２９などの間葉細胞表面分子を高発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＨＬＡ－ＤＲなどの造血幹細胞マーカー並びにＭＨＣクラスＩＩ細胞表面分子を発現しなかった（図１Ａ）。免疫細胞化学染色法により検出した結果、この細胞は間葉細胞マーカーであるビメンチンを高発現し、上皮細胞マーカーであるケラチンＣＫ１９を発現せず（図１Ｂ）、典型的な間葉細胞の表現型を有する。

＜実施例２＞ヒト末梢血から免疫細胞の分離
通常の身体検査を受けている人から新鮮な末梢血を採取し、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した。適量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍＬ遠心管に加え、管壁に沿って等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した血液をゆっくりと加え、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。中間のバフィーコート層を吸い取り、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。滅菌Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、上清を捨て、細胞沈殿物を１０％ＦＢＳ含有低糖ＤＭＥＭ培地で懸濁させ、ＰＢＭＣ免疫細胞を得た。末梢血単球（ＰＢＭ）がプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭおよび末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＰＢＭＣから分離した。

＜実施例３＞老化細胞に対する異なる細胞比率でのＰＢＭＣと老化ＭＳＣとの接触共培養の逆転作用の比較
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０^４／ウェルの密度で１２ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。ＰＢＭＣの密度は、それぞれ１０^４、１０^５、１０^６、２×１０^６、３×１０^６および４×１０^６／ウェルであり、ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養の細胞比率は、それぞれ１：１、１０：１、１００：１、２００：１、３００：１および４００：１であった。ＰＢＭＣとＭＳＣを７２時間共培養した後、βガラクトシダーゼ染色により陽性老化ＭＳＣの数を測定した。結果（図２）から分かるように、第１０継代に培養された老化ＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ－１０」と略する）対照群におけるβガラクトシダーゼ陽性細胞率は（７７．０７±７．２３）％であり、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ－１０＝１：１または１０：１である場合、老化対照群と比べ、βガラクトシダーゼ陽性率には顕著な変化がなく、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ－１０が１００：１に達した場合、βガラクトシダーゼ陽性率は下がり始め、７７．０７％から２２．６１％に下がり、ＰＢＭＣと老化ＭＳＣの共培養細胞比率が継続的に高くなる場合においても、そのβガラクトシダーゼ陽性率は、対照群に比べ、下がる傾向にあり、細胞比率が３００：１である場合に効果が最も高く、βガラクトシダーゼ陽性細胞率はわずかな（２０．０７±３．０７）％であった（表１）。したがって、ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養では、細胞比率が１００：１－４００：１である場合、老化ＭＳＣはいずれも若返り、老化を逆転する作用を有する。

注：ＭＳＣ－１０群のβガラクトシダーゼ陽性細胞率は（７７．０７±７．２３）％であり、ＭＳＣ－１０に比べ、^＊＊ｐ＜０．０１であった。

＜実施例４＞老化細胞に対するＰＢＭＣと老化ＭＳＣの接触および非接触共培養の逆転作用の比較
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０^４／ウェルの密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４０１）の下室に接種し、下室または上室にそれぞれ１０^６個の新たに分離されたＰＢＭＣを加え、ＭＳＣと共培養し、７２時間後に下室の細胞を観察し、βガラクトシダーゼ染色により老化陽性細胞を検出した。結果（図３）から分かるように、ＰＢＭＣとＭＳＣ細胞の接触および非接触共培養のいずれにおいても、老化ＭＳＣ中のβガラクトシダーゼの陽性染色率は顕著に低下し、老化細胞は若返り、老化を逆転する作用を奏した。そのうち、接触共培養の逆転効果は非接触共培養よりも高かった。

＜実施例５＞老化細胞に対する異なる年齢ドナーに由来のＰＢＭＣと老化ＭＳＣの接触共培養の逆転作用の比較
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０^４／ウェルの密度で１２ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に、異なる年齢帯のドナーから新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。老化ＭＳＣ（ＭＳＣ－１０）とＰＢＭＣを７２時間共培養した後、βガラクトシダーゼ染色により老化陽性細胞を検出した。結果（図４）から分かるように、老化ＭＳＣ群では、βガラクトシダーゼ染色陽性率は（６９．７５±４．７９）％であるのに対し、異なる年齢帯のドナーに由来のＰＢＭＣを老化ＭＳＣ群に加えた後、いずれも共培養系におけるβガラクトシダーゼ染色陽性率が低下し、老化細胞が若返り、老化を逆転する作用を奏した。しかし、異なる年齢帯のドナーに由来するＰＢＭＣと老化ＭＳＣを共培養した後、そのβガラクトシダーゼ染色陽性細胞率の平均値は（１９．５６±４．２０）％から（２０．８４±４．３５）％であり（表２）、老化に対する逆転作用は、群間で統計的な差異が認められなかった。

注：ＭＳＣ－１０群のβガラクトシダーゼ陽性細胞率は（６９．７５±４．７９）％であり、ＭＳＣ－１０に比べ、^＊＊ｐ＜０．０１であった。

＜実施例６＞老化細胞に対するヒト末梢に由来の異なる免疫細胞と老化ＭＳＣの接触共培養の逆転作用の比較
密度勾配遠心分離法により身体検査を受けているヒトの末梢血からＰＢＭＣを分離し、２×１０^６／ウェルの密度で１２ウェル細胞培養プレートに接種し、２時間後、ＰＢＭがプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭとＰＢＬをＰＢＭＣから分離した。さらに、第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０^４／ウェルの密度でそれぞれＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬを含む１２ウェル細胞培養プレートに接種し、７２時間共培養した後、βガラクトシダーゼ染色により共培養系における老化ＭＳＣに対するＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬの影響を検出した。結果（図５）から分かるように、ＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬのいずれを老化ＭＳＣと共培養した後、βガラクトシダーゼ染色の陽性（老化細胞）率が効果的に減少され、老化細胞が若返り、老化を逆転する作用を奏した。老化細胞ＭＳＣ－１０群のβガラクトシダーゼ陽性細胞率は（７１．６０±２．４９）％であり、ＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬのそれぞれと共培養した後のβガラクトシダーゼ陽性細胞率は順に（１７．５２±２．２４）％、（３３．６７±４．７７）％および（１１．３９±２．１７）％であり（表３）、つまり、これらの免疫細胞の老化逆転衰効果は順にＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであった。

注：ＭＳＣ－１０に比べ、^＊＊ｐ＜０．０１であった。ＰＢＭ＋ＭＳＣ－１０に比べ、^＃＃ｐ＜０．０１であった。ＰＢＭＣ＋ＭＳＣ－１０に比べ、^＆ｐ＜０．０５であった。

＜実施例７＞老化細胞に対するＰＢＬと臍帯および臍帯血に由来の老化ＭＳＣとの接触共培養の逆転作用
組織ブロック付着法により新鮮な臍帯組織からヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈＵＣ－ＭＳＣｓ）を分離し、別途に密度勾配遠心分離法により新鮮な臍帯血からヒト臍帯血間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を分離し、いずれもパンクレアチンを用いて継代培養により純粋化し、第９継代細胞を収集して実験に用いた。第９継代の複製老化を示したｈＵＣ－ＭＳＣおよびｈＵＣＢ－ＭＳＣを取り、１０^４／ウェルの密度で１２ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、βガラクトシダーゼ染色により老化ｈＵＣ－ＭＳＣおよび老化ｈＵＣＢ－ＭＳＣ老化特徴を逆転するＰＢＬの能力を検出した。結果から分かるように、ＰＢＬと上記老化したヒト羊膜ＭＳＣの接触共培養の結果と同様に、ＰＢＬと老化ｈＵＣ－ＭＳＣの接触共培養は、老化ｈＵＣ－ＭＳＣの老化特徴を顕著に逆転することができ（図６）、ＰＢＬと老化ｈＵＣＢ－ＭＳＣの接触共培養は、老化ｈＵＣＢ－ＭＳＣの老化特徴を顕著に逆転することができる（図７）。したがって、老化ヒトＭＳＣの老化特徴を逆転するＰＢＬの効果はＭＳＣが由来する組織に制限されず、他の組織、例えば血液に由来のＭＳＣに対しても老化逆転効果を有し、それを若返りすることができる。以下、主にヒト羊膜ＭＳＣを例として、老化ＭＳＣの老化の逆転および長期インビトロ増幅による非老化ＭＳＣの老化の遅延に対するＰＢＬ共培養の作用を調査し、その生物学的特性および機能を評価した。

＜実施例８＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣの老化マーカータンパク質Ｐ２１およびＰ１６の発現を低下させることができる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、２×１０^５の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより老化マーカーＰ２１およびＰ１６タンパク質の発現状況を分析した。結果（図８）から分かるように、ＰＢＬと老化ＭＳＣを共培養した後、共培養系中のＭＳＣの老化マーカータンパク質Ｐ２１およびＰ１６の発現が顕著に低下した。

＜実施例９＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣの細胞周期を調節することができる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、２×１０^５の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、滅菌Ｄ－ＰＢＳで細胞を６回洗浄し、パンクレアチンで消化した後、低速遠心分離により細胞を収集し、ＤＮＡ含有量検出キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，ＣＡ１５１０）により細胞周期を検出した。結果（図９）から分かるように、ＰＢＬと老化ＭＳＣを共培養した後、共培養系中のＭＳＣの細胞周期が顕著に調節された。具体的には、Ｇ１期にある細胞の比率が減少し、Ｓ期にある細胞比率が増加した。これは、老化ＭＳＣ細胞の再***および増殖を示している。

＜実施例１０＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣの増殖能力および自己更新能力を回復できる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、３×１０^３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、ＥＤＵキットによりＰＢＬの老化ＭＳＣ増殖能力に対する影響を検出した。結果（図１０）から分かるように、ＰＢＬと老化ＭＳＣを共培養した後、そのＥＤＵ陽性細胞率は３．５４％から１２．３１％に上がり（表４）、老化ＭＳＣの増殖能力は顕著に向上した。

注：ＭＳＣ－１０に比べ、^＊＊ｐ＜０．０１であった。

＜実施例１１＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣのクローン形成能力を増強できる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、２００細胞／皿の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、６日ごとに液体を交換し、１５日間共培養した後、クリスタルバイオレット染色により老化ＭＳＣの細胞コロニーの形成を観察し、撮影して記録した。結果（図１１）から分かるように、ＰＢＬと老化ＭＳＣを１５日間共培養した後、細胞コロニーが顕著に増加したことが観察され、そのコロニー形成率は１０倍以上増加した（表５）。したがって、この方法は、老化ＭＳＣの自己更新能力を回復できる。

注：ＭＳＣ－１０に比べ、^＊＊ｐ＜０．０１であった。

＜実施例１２＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣの増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現を増強できる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、２×１０^５の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現状況を分析した。結果（図１２）から分かるように、ＰＢＬと老化ＭＳＣを共培養した後、老化ＭＳＣ中の増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルは顕著に向上した。

＜実施例１３＞ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養は、老化ＭＳＣの多方向分化能力を向上できる。
第９継代にインビトロで連続増幅され、複製老化を示したＭＳＣを取り、２×１０^４／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＬを加え、７２時間共培養した後、細胞コンフルエンスが８０％に達した時に、骨分化、および軟骨分化培地に交換し、細胞コンフルエンスが１００％に達した時に、脂肪生成分化培地に交換した。誘導分化過程において、２１日目まで３日ごとに液体を交換し、トルイジンブルーで染色し、軟骨形成分化細胞外マトリックスグリコサミノグリカンの生成を検出し、アリザリンレッドＳ染色法により骨形成分化石灰化結節の生成を検出し、オイルレッドＯ染色により脂肪生成分化脂肪滴の形成を検出した。結果（図１３）から分かるように、トルイジンブルー染色によりＰＢＬ処理後の老化ＭＳＣは強い軟骨マトリックスグリコサミノグリカン生成能力を有することが検出され、アリザリンレッドＳ染色はより強い石灰化結節形成能力を有することを示し、オイルレッドＯ染色はより多い鮮紅色脂肪滴が生成したことを示している。したがって、この方法は、老化ＭＳＣの骨形成、脂肪生成分化および軟骨形成分化を増強させる能力を有する。

＜実施例１４＞ＰＢＬと非老化ＭＳＣの長期接触共培養は、ＭＳＣ老化を遅延できる。
対数増殖期にある第３継代のＭＳＣを取り、１０^３／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４日ごとに液体を交換し、１２日間連続培養した後、細胞を取り出し、βガラクトシダーゼ染色により老化陽性細胞を検出した。結果（図１４）から分かるように、１２日間インビトロで連続培養した後、ＭＳＣは、細胞体が扁平になり広くなり、かつ６８．５％と高いβガラクトシダーゼ陽性染色率を示した。これは、長期インビトロ増幅培養はｈＡＭＳＣｓの老化を招くことを示している。しかし、ＰＢＬとＭＳＣを１２日間共培養した後、その細胞形態は依然として長紡錘形で渦状に成長し、βガラクトシダーゼ陽性染色率が僅か３．９％であった。したがって、この方法は、長期インビトロ増幅過程におけるＭＳＣ老化の発生を顕著に遅延できる。

＜実施例１５＞ＰＢＬと非老化ＭＳＣの長期接触共培養は、ＭＳＣ発現老化マーカータンパク質Ｐ２１およびＰ１６を顕著に減少できる。
対数増殖期にある第３継代のＭＳＣを取り、１０^４の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４日ごとに液体を交換し、１２日間連続培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより老化マーカータンパク質Ｐ２１およびＰ１６の発現状況を分析した。結果（図１５）から分かるように、ＰＢＬとＭＳＣを１２日間共培養した後、ＭＳＣの老化マーカータンパク質Ｐ２１およびＰ１６の発現レベルは非共培養群よりも顕著に低かった。

＜実施例１６＞疾患モデルに対するＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養により増幅されたＭＳＣの治療効果
３％ＤＳＳを自由飲食させることにより潰瘍性結腸炎マウスモデルを構築し、４０匹のＣ５７マウス（５～７週齢）を１０匹／群でランダムにＮｏｒｍａｌ、ＤＳＳ、ＤＳＳ＋ＭＳＣ－１０、ＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣ－１０の４群に分けた。ＤＳＳ＋ＭＳＣ－１０群およびＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣ－１０群では、ＤＳＳを食べさせ始めた時にそれぞれＰ１０およびリンパ球で７２時間処理した後のＰ１０ ＭＳＣ（１×１０^７／匹）を腹腔内注射した。ＮｏｒｍａｌおよびＤＳＳ群のマウスに同時に等体積の滅菌ＰＢＳを注射した。観察期間で、毎日定時で体重を秤り、死亡状況を記録し、下痢便、血便などの現象があるか否かを観察した。マウス体重、下痢、便血および死亡状況に基づいて疾患活動性指標（ＤＡＩ）を算出した。ＭＳＣ注射の１０日後、マウスを安楽死させ、結腸を取り、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で一晩固定し、パラフィン包埋し、４ｍの切片に切り出し、ＨＥ染色した。顕微鏡で結腸組織の炎性細胞浸潤および陰窩と杯状細胞の構造を観察し、組織病理学的スコアを行った。結果から分かるように、ＤＳＳを食べさせた５日目に、マウスは、体重減少、下痢便、血便などを含む炎症性結腸炎の重篤な症状が現れ始め、７日目に死亡し始めた（図１６）。組織学的分析により、ＤＳＳを食べさせることによりマウスの結腸粘膜が重度の炎症と損傷が発生したことが示された（図１６Ｃ、Ｄ）。潰瘍性結腸炎マウスに対するＰ１０ ＭＳＣ注射の治療効果はＤＳＳ群と同様に、比較的重篤な体重減少、血便が発生し、結腸組織の病理学的観察により重篤な炎性細胞浸潤および陰窩と杯状細胞構造の喪失が観察された。しかし、ＰＢＬと老化ＭＳＣの接触共培養により増幅されたＰ１０ ＭＳＣを注射した後、ＤＳＳ誘導の体重減少、血便、結腸炎症および損傷を顕著に軽減でき（図１６）、免疫拒絶反応による死亡が発生せず、治療効果が顕著であった。

Claims (7)

1. ヒト末梢血中の免疫細胞と老化ヒト間葉系幹細胞とを細胞間接触または非接触の方式で共培養し、前記ヒト末梢血中の免疫細胞と老化ヒト間葉系幹細胞との比率は１００：１～４００：１であり、
   前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血単核細胞、ヒト末梢血単球およびヒト末梢血リンパ球を含む、ことを特徴とする老化ヒト間葉系幹細胞の老化特徴を逆転させる方法。
2. 前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血リンパ球である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 老化ヒト間葉系幹細胞の老化特徴を顕著に逆転させ、β－ガラクトシダーゼ、Ｐ１６およびＰ２１タンパク質細胞の衰老マーカーの発現を減少させることができる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記方法は、老化ヒト間葉系幹細胞の細胞周期を調節し、顕著にＧ１期にある細胞の比率を減少させ、Ｓ期にある細胞の比率を増加させ、老化細胞の増殖能力を向上させる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 自己更新能力、増殖能力および多方向分化潜在能力を含む老化ヒト間葉系幹細胞の幹細胞性特徴を顕著に増強できる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 共培養方式により得られるヒト間葉系幹細胞は疾患モデルの治療に使用され、免疫拒絶反応が発生しない、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 臨床的にヒト間葉系幹細胞の長期インビトロ増幅に使用されることにより、大量で高品質のヒト間葉系幹細胞が得られる、ことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

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