JP7117772B2

JP7117772B2 - Method for producing skin anti-aging agent and elastase inhibitor

Info

Publication number: JP7117772B2
Application number: JP2018152382A
Authority: JP
Inventors: 雅彦谷口; 能庸村上; きみ江馬場; 昌義藤田; 真弓大岡
Original assignee: 株式会社健康素材研究所
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2022-08-15
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: JP2020026408A

Description

本発明は、皮膚のたるみや皺などの老化現象を抑制ないし防止するための皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a skin anti-aging agent and an elastase inhibitor for suppressing or preventing aging phenomena such as skin sagging and wrinkles.

身体の老化の要因は、加齢や酸化、糖化、ストレス、過度な運動などが挙げられるが、肌の老化は、これらに加えて、紫外線によるダメージが挙げられる。紫外線の皮膚へのダメージは、表皮ではＵＶＢによる炎症、真皮ではＵＶＡによるコラゲナーゼやエラスターゼの誘導・亢進が知られている。コラゲナーゼはコラーゲンを、エラスターゼはエラスチンをそれぞれ変性（分解）するため、これらの作用の亢進は、しわやたるみの原因となるといわれている。
そこで、皮膚のたるみや皺などの老化を防止するために、エラスチンの分解酵素であるエラスターゼの活性を阻害するエラスターゼ阻害剤や、コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの活性を阻害するコラゲナーゼ阻害剤が種々提案されている（例えば、特許文献１，２参照）。 Factors of physical aging include aging, oxidation, glycation, stress, excessive exercise, etc. In addition to these, skin aging includes damage caused by ultraviolet rays. UV damage to the skin is known to be inflammation due to UVB in the epidermis and induction/enhancement of collagenase and elastase due to UVA in the dermis. Collagenase denatures (degrades) collagen and elastase denatures (degrades) elastin, respectively, and the enhancement of these actions is said to cause wrinkles and sagging.
Therefore, in order to prevent aging such as sagging and wrinkles of the skin, there are various elastase inhibitors that inhibit the activity of elastase, which is an elastin-degrading enzyme, and collagenase inhibitors that inhibit the activity of collagenase, which is a collagen-degrading enzyme. It has been proposed (for example, see Patent Documents 1 and 2).

一方、ダイオウウラボシ（ウラボシ目ウラボシ科フレボディウム属（ダイオウウラボシ属）、学名：Ｐｈｌｅｂｏｄｉｕｍａｕｒｅｕｍ、別名：Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ）は、中米原産のシダ植物の一種である。その水抽出エキスおよびエタノール含有水抽出エキスは、光老化防止作用があることが知られており、紫外線照射による皮膚角化細胞での炎症の抑制作用や、皮膚線維芽細胞でのマトリックスメタロプロテアーゼ産生亢進作用などの報告がある。
しかし、皮膚の老化関連酵素に対する阻害作用に関する研究は進んでいない。また、水系抽出エキスに含まれていない成分については評価もなされておらず、現在のダイオウウラボシエキスの抽出法では、水系抽出物を抽出した後の残渣は廃棄されている。 On the other hand, Phlebodium aureum (Phlebodium aureum, scientific name: Phlebodium aureum, also known as Polypodium leucotomos) is a kind of fern native to Central America. Its water extract and ethanol-containing water extract are known to have anti-photoaging effects, such as inhibition of inflammation in skin keratinocytes due to ultraviolet irradiation and matrix metalloprotease production in skin fibroblasts. There are reports of enhancement effects, etc.
However, research on its inhibitory action on skin aging-related enzymes has not progressed. In addition, the components that are not contained in the water-based extract have not been evaluated, and in the current extraction method for Rheumatoid arthritis extract, the residue after the water-based extract is extracted is discarded.

特開２００３－３４２１２３号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-342123 特開２０１６－０１１２５９号公報JP 2016-011259 A

本発明は、新規な皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel skin anti-aging agent and an elastase inhibitor.

本発明者は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物が、水抽出物や含水アルコール抽出物（以下、「水系抽出物」と総称する）よりも高い皮膚老化防止作用、エラスターゼ阻害活性を有することを見出した。また、これらの活性本体が、水及び含水アルコールに不溶な成分に含まれていることを確認した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。 The inventors of the present invention have found that an extract of Rhubarb purpurea using a water-free organic solvent exhibits higher skin anti-aging activity and elastase inhibitory activity than water extracts and hydroalcoholic extracts (hereinafter collectively referred to as "aqueous extracts"). found to have In addition, it was confirmed that these active substances are contained in components that are insoluble in water and hydrous alcohol. The present invention has been completed based on such findings.

すなわち、本発明の皮膚老化防止剤の製造方法は、ダイオウウラボシの酢酸エチルによる抽出物を有効成分として用いる皮膚老化防止剤の製造方法である。
本発明のエラスターゼ阻害剤の製造方法は、ダイオウウラボシの酢酸エチルによる抽出物を有効成分として用いるエラスターゼ阻害剤の製造方法である。 That is, the method for producing a skin anti-aging agent of the present invention is a method for producing a skin anti-aging agent using , as an active ingredient, an extract of Rhizoma melanoma with ethyl acetate .
The method for producing an elastase inhibitor of the present invention is a method for producing an elastase inhibitor using , as an active ingredient, an extract of Rhizoma melanoma with ethyl acetate .

本発明によれば、従来用いられてきた水系抽出物よりも有効に皮膚の老化を抑制ないし防止することができる。また、従来廃棄されてきた水及び含水アルコールに不溶な成分を有効利用することができる。 According to the present invention, skin aging can be suppressed or prevented more effectively than conventionally used aqueous extracts. In addition, it is possible to effectively utilize components insoluble in water and hydrous alcohol, which have conventionally been discarded.

以下、本発明にかかる皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。 Hereinafter, the skin anti-aging agent and elastase inhibitory agent according to the present invention will be described in detail. It can be changed as appropriate within the scope of

本発明で用いるダイオウウラボシは、中米原産のシダ植物の一種である。
使用する部位については、特に限定されず、例えば、全草を使用してもよいし、茎、根、葉などの一部を使用してもよい。地上部、特に葉や茎を用いることが好ましい。 Rhizophora aboshi used in the present invention is a kind of fern native to Central America.
The site to be used is not particularly limited, and for example, the whole plant may be used, or a part of the stem, root, leaf, or the like may be used. It is preferable to use aerial parts, especially leaves and stems.

本発明の製造方法により得られた皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤において、抽出物を各種用途に用いる際には、抽出溶媒を含む液状のまま用いても良いし、濃縮して用いても良い。また、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥などの公知の方法により乾燥させて固体状として用いても良い。
また、必要に応じて、抽出操作後、精製処理を行っても良い。 In the skin anti-aging agent and elastase inhibitory active agent obtained by the production method of the present invention, when the extract is used for various purposes, it may be used as it is in a liquid state containing an extraction solvent, or it may be used after being concentrated. good. Alternatively, it may be dried by a known method such as freeze drying, vacuum drying, or spray drying and used as a solid.
Moreover, you may perform a refinement|purification process after extraction operation as needed.

ところで、本発明者は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物の活性成分を調べている中で、水及び含水アルコールへの不溶な成分に、水系抽出物の活性成分よりも高い活性成分が含まれているという結果を得た。
すなわち、本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、「ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする」という捉え方とは別に、「ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする」という捉え方もできる。
この場合、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分として得る方法としては、ダイオウウラボシを水不含有機溶媒により抽出するという上記方法の他に、ダイオウウラボシの水抽出や含水アルコール抽出における残渣を利用することも考えられる。すなわち、そのような残渣をそのまま、あるいは粉砕したり、水不含有機溶媒で抽出を行ったりして、各種用途に利用しても良い。 By the way, the inventor of the present invention, while investigating the active ingredients of the extract of Rhubarb serrata with a water-free organic solvent, found that the ingredients insoluble in water and hydrous alcohol contained higher active ingredients than those of the aqueous extract. I got the result that contains
That is, the skin anti-aging agent and elastase inhibitory active agent of the present invention, apart from the idea that "the extract of Rhizoma melanoma with a water-free solvent of Rhizoma melanoma as an active ingredient", "water and hydrous alcohol It is also possible to think that the active ingredient is an ingredient that is insoluble in
In this case, in addition to the above-mentioned method of extracting Rhizoma serrata with a water-free solvent, water extraction of Rhizoma serrata or hydrous alcohol It is also conceivable to use the residue from the extraction. That is, such residues may be used as such, or after pulverization or extraction with a water-free solvent, for various purposes.

本発明の製造方法により得られた皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、経口投与、経皮投与のいずれの投与経路で用いても良く、化粧品、健康食品（飲料も含む）、食品添加剤、サプリメント、医薬用組成物などの原料として用いることができる。
例えば、前記抽出物（抽出溶媒を含む液状、その濃縮物又はそれらを乾燥した固体状等、使用形態は問わない）を健康食品、添加剤、サプリメントなどの原料として用いたり、前記抽出物をクリーム、乳液、軟膏、化粧水、パック、浴用剤などの原料として用いたりすることができる。 The skin anti-aging agent and elastase inhibitory agent obtained by the production method of the present invention may be used by any administration route of oral administration or transdermal administration, and may be used in cosmetics, health foods (including beverages), and food additives. , supplements, and pharmaceutical compositions.
For example, the extract (liquid containing an extracting solvent, its concentrate, or dried solid, etc., regardless of the form of use) can be used as a raw material for health foods, additives, supplements, etc., or the extract can be used as a cream. , milky lotion, ointment, lotion, pack, bath agent, etc.

本発明の製造方法により得られた皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤を各種用途の原料として用いる場合、各種用途に常用される基材や薬剤と組み合わせて処方することができる。 When the skin anti-aging agent and elastase inhibitory agent obtained by the production method of the present invention are used as raw materials for various applications, they can be formulated in combination with base materials and agents commonly used for various applications.

以下、実施例を用いて、本発明にかかる皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤について詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例及び比較例で用いたダイオウウラボシは、乾燥ダイオウウラボシである。 The skin anti-aging agent and elastase inhibitory agent according to the present invention will be described in detail below using examples, but the present invention is not limited to these examples. It should be noted that the Rhubarb beetle used in the following examples and comparative examples is dried Rheum beetle.

〔実験１〕
実験１では、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物が、皮膚老化防止剤として有用であること、特に酢酸エチル抽出物に高いエラスターゼ阻害作用が認められることを示す。 [Experiment 1]
Experiment 1 shows that the water-free organic solvent extract of Rhubarb purpurea is useful as a skin anti-aging agent, especially that the ethyl acetate extract has a high elastase inhibitory effect.

＜実施例１＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料２，４００ｇに対して、酢酸エチル７Ｌを添加し、還流抽出を行った。この操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、９３．６ｇの酢酸エチル抽出エキスを得た。 <Example 1>
The aerial part of Rhizophora bosi was shredded.
7 L of ethyl acetate was added to 2,400 g of this sample, and reflux extraction was performed. This operation was repeated three times.
The resulting extract was concentrated under reduced pressure to obtain 93.6 g of ethyl acetate extract.

＜参考例１＞
実施例１の酢酸エチル７Ｌによる還流抽出操作の後の試料残渣に対して、さらにメタノール７Ｌを添加し還流抽出する操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、３４５．２ｇのメタノール抽出エキスを得た。 < Reference example 1 >
7 L of methanol was further added to the sample residue after the reflux extraction operation with 7 L of ethyl acetate in Example 1, and the operation of reflux extraction was repeated three times.
The resulting extract was concentrated under reduced pressure to obtain 345.2 g of methanol extract.

＜比較例１＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料３００ｇに対して、水とエタノールの混合溶媒（３０体積％エタノール、以下単に「３０％エタノール」という）３Ｌを添加し、還流抽出を行った。
得られた抽出物を減圧濃縮し、２２．５ｇの３０％エタノール抽出エキスを得た。 <Comparative Example 1>
The aerial part of Rhizophora bosi was shredded.
To 300 g of this sample, 3 L of a mixed solvent of water and ethanol (30% by volume ethanol, hereinafter simply referred to as "30% ethanol") was added, and reflux extraction was performed.
The resulting extract was concentrated under reduced pressure to obtain 22.5 g of 30% ethanol extract.

＜性能評価試験１＞
上記実施例１，参考例１及び比較例１の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性及びコラゲナーゼ阻害活性、一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害を評価した。 <Performance evaluation test 1>
The extracts of Example 1, Reference Example 1 and Comparative Example 1 were evaluated for elastase inhibitory activity, collagenase inhibitory activity, and nitric oxide (NO) production inhibition.

（エラスターゼ阻害活性）
実施例１及び参考例１の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。反応のための緩衝液は、５０ｍＭトリス・１Ｍ塩化ナトリウム塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．８）を用いた。
９６穴マイクロプレートに、試料５０μｌ、緩衝液で調製した合成基質Ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（１ｍＭ）１００μｌ、緩衝液で調製したブタ膵臓由来エラスターゼ（０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）５０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
反応後、基質の分解生成物であるｐ－ニトロアニリンの生成量を、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００－｛［（試料あり・酵素ありの吸光度）－（試料あり・酵素なしの吸光度）］／［（陰性対照試料・酵素ありの吸光度）－（陰性対照試料あり・酵素なしの吸光度）］×１００｝ (Elastase inhibitory activity)
The extract samples of Example 1 and Reference Example 1 were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), and the extract sample of Comparative Example 1 was dissolved in a reaction buffer. A 50 mM Tris/1 M sodium chloride hydrochloride buffer (pH=7.8) was used as a buffer for the reaction.
50 μl of sample, 100 μl of synthetic substrate Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (1 mM) prepared in buffer, and 50 μl of porcine pancreas-derived elastase (0.5 units/ml) prepared in buffer were placed in a 96-well microplate. and reacted at 37° C. for 1 hour.
After the reaction, the amount of p-nitroaniline, a decomposition product of the substrate, was determined by measuring the absorbance at 405 nm.
The inhibition rate (%) was determined by the following formula.
Inhibition rate (%) = 100-{[(absorbance with sample/with enzyme)-(absorbance with sample/without enzyme)]/[(absorbance with negative control sample/enzyme)-(with negative control sample/enzyme absorbance without)] × 100}

（コラゲナーゼ阻害活性）
実施例１及び参考例１の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
予め氷冷した中和用バッファー（４００ｍＭ塩化ナトリウム・１０ｍＭ塩化カルシウム含有１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））に、同じく予め氷冷したＦＩＴＣ標識コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）を等量添加し、コラーゲン溶液を中和した。
１．５ｍｌマイクロチューブに中和済蛍光標識Ｉ型コラーゲン２５μｌ、試料２５μｌ、Ｉ型コラゲナーゼ（１ｕｎｉｔ／ｍｌ）５０μｌを加え、３５℃で２時間反応した。
反応後、５０％エタノール水溶液に溶解した４０ｍＭのＯ－フェナントロリン液を加え、反応を停止した。これに蒸留水で２倍希釈した中和用バッファー１００μｌを加え、３５℃で３０分間反応した。さらに、抽出液（１００％エタノール：０．６７Ｍ塩化ナトリウム含有・０．１７Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝９．５）＝７：３）を５０μｌ加え撹拌した。５，０００ｒｐｍ・１０分間遠心分離し、上清を採取し、酵素により遊離したＦＩＴＣ量を励起光４９５ｎｍ・測定波長５２０ｎｍで測定し、酵素活性を求めた。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００－｛［（試料あり・酵素ありの蛍光強度）－（試料あり・酵素なしの蛍光強度）］／［（陰性対照試料・酵素ありの蛍光強度）－（陰性対照試料あり・酵素なしの蛍光強度）］×１００｝ (Collagenase inhibitory activity)
The extract samples of Example 1 and Reference Example 1 were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), and the extract sample of Comparative Example 1 was dissolved in a reaction buffer.
An equal amount of ice-cooled FITC-labeled collagen (1 mg/ml) was added to an ice-cooled neutralization buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 400 mM sodium chloride and 10 mM calcium chloride), and collagen The solution was neutralized.
25 μl of neutralized fluorescence-labeled type I collagen, 25 μl of sample, and 50 μl of type I collagenase (1 unit/ml) were added to a 1.5 ml microtube and reacted at 35° C. for 2 hours.
After the reaction, 40 mM O-phenanthroline dissolved in 50% ethanol aqueous solution was added to terminate the reaction. To this was added 100 μl of a neutralization buffer diluted 2-fold with distilled water, and reacted at 35° C. for 30 minutes. Further, 50 μl of extract (100% ethanol:0.67M sodium chloride-containing 0.17M Tris-HCl buffer (pH=9.5)=7:3) was added and stirred. After centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was collected, and the amount of FITC liberated by the enzyme was measured with an excitation light of 495 nm and a measurement wavelength of 520 nm to determine enzyme activity.
The inhibition rate (%) was determined by the following formula.
Inhibition rate (%) = 100-{[(fluorescence intensity with sample/with enzyme)-(fluorescence intensity with sample/without enzyme)]/[(negative control sample/fluorescence intensity with enzyme)-(negative control sample Fluorescence intensity with/without enzyme)] × 100}

（一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害）
実施例１及び参考例１の抽出試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、比較例１の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
９６穴マイクロプレートの各穴に、ＲＡＷ２６４細胞（１．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ）を播種後、試料希釈液とリポ多糖（ＬＰＳ：終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え、全量２００μＬで培養、２４時間後に培養上清を回収した。対照試料は、実施例１及び参考例１の抽出物の場合はＤＭＳＯを、比較例１の抽出物の場合はリン酸緩衝液を用いた。
ＮＯ産生は、培養上清中の亜硝酸をＧｒｉｅｓｓ試薬を用いて間接的に測定した。
阻害率（％）は、以下の式で求めた。
阻害率（％）＝１００－｛［（試料あり・ＬＰＳありのＮＯ濃度）－（試料あり・ＬＰＳなしのＮＯ濃度）］／［（対照試料・ＬＰＳありのＮＯ濃度）－（対照試料あり・ＬＰＳなしのＮＯ濃度）］×１００｝ (Nitric oxide (NO) production inhibition)
The extract samples of Example 1 and Reference Example 1 were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), and the extract sample of Comparative Example 1 was dissolved in a reaction buffer.
After seeding RAW264 cells (1.0×10 ⁵ cells) in each well of a 96-well microplate, sample diluent and lipopolysaccharide (LPS: final concentration 1 μg/ml) were added and cultured in a total volume of 200 μL. Culture supernatant was collected. As a control sample, DMSO was used for the extracts of Example 1 and Reference Example 1 , and phosphate buffer was used for the extract of Comparative Example 1.
NO production was measured indirectly using the Griess reagent for nitrous acid in the culture supernatant.
The inhibition rate (%) was determined by the following formula.
Inhibition rate (%) = 100-{[(NO concentration with sample/with LPS)-(NO concentration with sample/without LPS)]/[(control sample/NO concentration with LPS)-(with control sample/ NO concentration without LPS)] × 100}

＜実験１の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表１～３に示す。 <Results and Discussion of Experiment 1>
The results of the above measurements are shown in Tables 1-3 below.

実施例１，参考例１及び比較例１の結果を比較すると、水不含有機溶媒による抽出物には、水系抽出物よりも高いコラゲナーゼ阻害作用および抗炎症作用が認められ、皮膚老化防止剤の有効成分として利用できることが分かった。
実施例１及び比較例１の結果から、酢酸エチルによる抽出物の活性が特に高いことが分かる。そして、実施例１では、エラスターゼ阻害作用についても、水系抽出物よりも高い結果となっていることが分かる。
なお、酢酸エチル抽出エキスやメタノール抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることに鑑みると、水不含有機溶媒による抽出物、特に酢酸エチルによる抽出物には、上記効果をもたらす非常に活性の高い成分が含有されていると推測される。 Comparing the results of Example 1, Reference Example 1 and Comparative Example 1, it was found that the water-free organic solvent extract had higher collagenase inhibitory activity and anti-inflammatory activity than the water-based extract. It was found that it can be used as an active ingredient.
From the results of Example 1 and Comparative Example 1, it can be seen that the activity of the extract with ethyl acetate is particularly high. Moreover, in Example 1, it can be seen that the elastase inhibitory action is also higher than that of the aqueous extract.
In view of the fact that ethyl acetate extracts and methanol extracts contain an extremely large amount of chlorophyll for which no effect can be expected, extracts using water-free organic solvents, especially ethyl acetate extracts, do not have the above effects. It is speculated that it contains highly active ingredients that bring about

〔実験２〕
実験２では、種々の溶媒を用いた抽出エキスのエラスターゼ阻害活性を評価することにより、酢酸エチル以外の水不含有機溶媒による抽出物においても、エラスターゼ阻害活性及び皮膚老化防止作用が認められることを示す。 [Experiment 2]
In Experiment 2, by evaluating the elastase inhibitory activity of extracts extracted using various solvents, it was found that extracts using water-free organic solvents other than ethyl acetate also exhibited elastase inhibitory activity and skin anti-aging effects. show.

＜参考例２＞
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料１０ｇに対して、メタノール２００ｍＬを添加し、還流抽出を行った。この操作を３回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、９９７．１ｍｇのメタノール抽出エキスを得た。 < Reference example 2 >
The aerial part of Rhizophora bosi was shredded.
200 mL of methanol was added to 10 g of this sample, and reflux extraction was performed. This operation was repeated three times.
The resulting extract was concentrated under reduced pressure to obtain 997.1 mg of methanol extract.

＜参考例３＞
メタノール２００ｍＬに代えてアセトン２００ｍＬを用いたこと以外は、参考例２と同様にして、３１９．０ｍｇのアセトン抽出エキスを得た。 < Reference example 3 >
319.0 mg of an acetone extract was obtained in the same manner as in Reference Example 2 , except that 200 mL of acetone was used instead of 200 mL of methanol.

＜参考例４＞
メタノール２００ｍＬに代えてクロロホルム２００ｍＬを用いたこと以外は、参考例２と同様にして、１７４．６ｍｇのクロロホルム抽出エキスを得た。 < Reference example 4 >
174.6 mg of a chloroform extract was obtained in the same manner as in Reference Example 2 , except that 200 mL of chloroform was used instead of 200 mL of methanol.

＜参考例５＞
メタノール２００ｍＬに代えてアセトニトリル２００ｍＬを用いたこと以外は、参考例２と同様にして、２３９．３ｍｇのアセトニトリル抽出エキスを得た。 < Reference example 5 >
239.3 mg of an acetonitrile extract was obtained in the same manner as in Reference Example 2 , except that 200 mL of acetonitrile was used instead of 200 mL of methanol.

＜参考例６＞
メタノール２００ｍＬに代えてジエチルエーテル２００ｍＬを用いたこと以外は、参考例２と同様にして、７１．９ｍｇのジエチルエーテル抽出エキスを得た。 < Reference example 6 >
71.9 mg of diethyl ether extract was obtained in the same manner as in Reference Example 2 , except that 200 mL of diethyl ether was used instead of 200 mL of methanol.

＜性能評価試験２＞
上記参考例２～６の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験１と同様である。 <Performance evaluation test 2>
Each extract of Reference Examples 2 to 6 was evaluated for elastase inhibitory activity. The evaluation method is the same as that of the performance evaluation test 1.

＜実験２の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表４に示す。 <Results and Discussion of Experiment 2>
The results of the above measurements are shown in Table 4 below.

実験２の結果から、阻害率の程度の違いはあるものの、酢酸エチル以外の種々の水不含有機溶媒による抽出物においても、エラスターゼ阻害作用が認められた。
各抽出溶媒の沸点は、酢酸エチル７７．１℃、メタノール６４．５℃、アセトン５６．１℃、クロロホルム６１．２℃、アセトニトリル８１．６℃、ジエチルエーテル３４．４℃であり、沸点６０℃以上の有機溶媒を用いることが高い活性成分を抽出するのに有利であることが分かった。
なお、これらの抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることから、表４に示す阻害率が低い参考例においても必ずしも活性が非常に低いということを意味するものではなく、むしろ、活性の高い成分が含有されていると推測される。
また、上述の参考例１と参考例２の関係について誤解を避けるため、説明すると、まず、上述の参考例１のメタノール抽出エキスは、酢酸エチル抽出物の残渣に対してメタノール抽出を行ったものであるのに対し、参考例２のメタノール抽出エキスはダイオウウラボシから直接メタノール抽出を行ったものである。参考例１の抽出エキスにエラスターゼ阻害作用が認められないという結果は、酢酸エチルに不溶でメタノールに可溶な成分にはエラスターゼ阻害作用は認められないということを意味するに過ぎず、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められないということを意味するものではない。そして、参考例２は、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められることを示している。 From the results of Experiment 2, the elastase inhibitory activity was also observed in the extracts with various water-free organic solvents other than ethyl acetate, although there was a difference in the degree of inhibition.
The boiling points of the respective extraction solvents are ethyl acetate 77.1°C, methanol 64.5°C, acetone 56.1°C, chloroform 61.2°C, acetonitrile 81.6°C, and diethyl ether 34.4°C. It was found that the use of the above organic solvents is advantageous for extracting high active ingredients.
In addition, since these extracts contain a very large amount of chlorophyll, which cannot be expected to be effective, even the reference examples with a low inhibition rate shown in Table 4 do not necessarily mean that the activity is very low. , rather, it is presumed to contain highly active ingredients.
In order to avoid misunderstanding about the relationship between Reference Example 1 and Reference Example 2 , first, the methanol extraction extract of Reference Example 1 is obtained by subjecting the residue of the ethyl acetate extract to methanol extraction. In contrast, the methanol-extracted extract of Reference Example 2 was obtained by directly extracting methanol from Rhubarb spp. The result that no elastase inhibitory action was observed in the extract of Reference Example 1 simply means that no elastase inhibitory action was observed in the components that were insoluble in ethyl acetate but soluble in methanol. It does not mean that the methanol extract has no elastase inhibitory activity. Reference Example 2 shows that the methanol extract of Rhizoma medicinalis has an elastase inhibitory effect.

〔実験３〕
実験３では、上記参考例における各種抽出エキスの水溶出分及び３０％エタノール抽出物についてエラスターゼ阻害活性を評価することにより、水不含有機溶媒における活性成分が、従来の水系抽出物における活性成分とは異なる成分である可能性が高いことを示す。 [Experiment 3]
In Experiment 3, by evaluating the elastase inhibitory activity of the water elution and 30% ethanol extract of various extracts in the above reference example , the active ingredient in the water-free solvent was compared with the active ingredient in the conventional aqueous extract. indicates that there is a high possibility that they are different components.

＜比較例２＞
実施例１の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに４ｍｇ／ｍｌになるように、水を加え、５０℃、８００ｒｐｍで６０分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例２とした。 <Comparative Example 2>
The ethyl acetate extract of Example 1 was weighed, water was added so as to make it 4 mg/ml, and the mixture was shaken at 50° C. and 800 rpm for 60 minutes. A supernatant of the above solvent was collected and referred to as Comparative Example 2.

＜比較例３＞
実施例１の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに４ｍｇ／ｍｌになるように、３０％エタノール水溶液を加え、５０℃、８００ｒｐｍで６０分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例３とした。 <Comparative Example 3>
The ethyl acetate extract of Example 1 was weighed, and a 30% aqueous ethanol solution was added so as to give a concentration of 4 mg/ml, followed by shaking at 50° C. and 800 rpm for 60 minutes. A supernatant of the above solvent was collected and referred to as Comparative Example 3.

＜比較例４＞
参考例１のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、メタノール抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例４とした。 <Comparative Example 4>
In the same manner as in Comparative Example 2 except that the methanol extract of Reference Example 1 was used, the water eluted portion of the methanol extract was collected and designated as Comparative Example 4.

＜比較例５＞
参考例１のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、メタノール抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例５とした。 <Comparative Example 5>
A 30% ethanol-eluted portion of the methanol-extracted extract was collected in the same manner as in Comparative Example 3 except that the methanol-extracted extract of Reference Example 1 was used.

＜比較例６＞
参考例２のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、アセトン抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例６とした。 <Comparative Example 6>
The acetone extract was collected in the same manner as in Comparative Example 2 except that the acetone extract of Reference Example 2 was used.

＜比較例７＞
参考例２のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、アセトン抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例７とした。 <Comparative Example 7>
A 30% ethanol-eluted portion of the acetone extract was collected in the same manner as in Comparative Example 3 except that the acetone extract of Reference Example 2 was used.

＜比較例８＞
参考例３のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、クロロホルム抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例８とした。 <Comparative Example 8>
In the same manner as in Comparative Example 2 except that the chloroform-extracted extract of Reference Example 3 was used, the water-eluted portion of the chloroform-extracted extract was collected and designated as Comparative Example 8.

＜比較例９＞
参考例３のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、クロロホルム抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例９とした。 <Comparative Example 9>
A 30% ethanol-eluted portion of the chloroform-extracted extract was collected in the same manner as in Comparative Example 3 except that the chloroform-extracted extract of Reference Example 3 was used.

＜比較例１０＞
参考例４のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例１０とした。 <Comparative Example 10>
In the same manner as in Comparative Example 2 except that the acetonitrile extract of Reference Example 4 was used, the water eluted portion of the acetonitrile extract was collected and designated as Comparative Example 10.

＜比較例１１＞
参考例４のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例１１とした。 <Comparative Example 11>
A 30% ethanol-eluted portion of the acetonitrile extract was collected in the same manner as in Comparative Example 3 except that the acetonitrile extract of Reference Example 4 was used.

＜比較例１２＞
参考例５のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例２と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例１２とした。 <Comparative Example 12>
A water eluted portion of the diethyl ether extract was collected in the same manner as in Comparative Example 2 except that the diethyl ether extract of Reference Example 5 was used.

＜比較例１３＞
参考例５のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例３と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの３０％エタノール溶出分を採取し、比較例１３とした。 <Comparative Example 13>
A 30% ethanol eluted portion of the diethyl ether extract was collected in the same manner as in Comparative Example 3 except that the diethyl ether extract of Reference Example 5 was used.

＜性能評価試験３＞
上記比較例２～１３の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験１と同様である。 <Performance evaluation test 3>
Each of the extracts of Comparative Examples 2 to 13 was evaluated for elastase inhibitory activity. The evaluation method is the same as that of the performance evaluation test 1.

＜実験３の結果及び考察＞
上記測定の結果を下表５に示す。 <Results and Discussion of Experiment 3>
The results of the above measurements are shown in Table 5 below.

実験３の結果から、各種溶媒抽出物における活性成分が、主として、水及び含水アルコールに不溶な成分であることが確認できた。
従来は、水系溶媒の抽出物が活用されてきたが、その残渣は廃棄されてきた。しかし、上記結果から、水及び含水アルコールに不溶な成分にも高い活性を有する成分が含まれていることが分かり、これにより、水系抽出エキス製造の際に従来廃棄されてきた水及び含水アルコールに不溶な成分を有効に利用することが可能となった。 From the results of Experiment 3, it was confirmed that the active ingredients in various solvent extracts were mainly insoluble in water and hydrous alcohol.
Conventionally, an extract of an aqueous solvent has been utilized, but the residue has been discarded. However, from the above results, it was found that even components insoluble in water and hydrous alcohol contained components with high activity. It has become possible to effectively utilize insoluble components.

Claims

ダイオウウラボシの酢酸エチルによる抽出物質を有効成分として用いる皮膚老化防止剤の製造方法。 A method for producing a skin anti-aging agent using, as an active ingredient, a substance extracted with ethyl acetate from Rhizoma melanoma.

ダイオウウラボシの酢酸エチルによる抽出物質を有効成分として用いるエラスターゼ阻害活性剤の製造方法。 A method for producing an elastase inhibitory active ingredient using, as an active ingredient, a substance extracted with ethyl acetate from Rhizoma melanoma.