JP7109424B2 - 体液に基づくセルフリーDNA(cfDNA)アッセイを通して臓器損傷状態を査定するための新規のイムノプローブに基づく方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年8月17日に出願された米国仮出願第62/376,299号に基づく優先権を主張するものであり、その開示は、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる。
2600万人の米国人が、慢性腎疾患(CKD)、ならびに臓器移植、例えば、腎移植または肺移植の拒絶および機能障害に関連したもののような臓器損傷に罹患している。これらの損傷の処置は、極めて高コストである。例えば、年間メディケア支出の28パーセント、575億ドルが、CKDの処置に費やされている。しかしながら、これらの多くについて、臨床症状が出現するまで、損傷がいつ切迫するかを予測する手段は存在しない。これらの疾患に関連したコストの大きい割合が、より重度の臓器損傷をもたらし、より高度のより高価な治療的介入を必要とする、早期検出の欠如によるものである。腎臓病理の早期検出の方法は、医療費の低下およびより効果的な治療的介入を可能にするであろう。
[本発明1001]
細胞溶解を阻害しかつ体液中のヌクレアーゼを阻害するために十分な濃度で、ホルムアルデヒドドナー、キレート剤、アウリントリカルボン酸、およびポリエチレングリコール(PEG)を含む、溶液。
[本発明1002]
ホルムアルデヒドドナーがジアゾリジニル尿素である、本発明1001の溶液。
[本発明1003]
キレート剤がEDTAである、本発明1001の溶液。
[本発明1004]
アジ化ナトリウムをさらに含む、本発明1001の溶液。
[本発明1005]
緩衝剤を含む、本発明1001または1004の溶液。
[本発明1006]
体液試料をさらに含む、本発明1001~1005のいずれかの溶液。
[本発明1007]
体液試料が、臓器移植を受けたことがあるかまたは腎疾患を有する患者に由来する、本発明1001~1006のいずれかの溶液。
[本発明1008]
臓器移植が腎移植である、本発明1007の溶液。
[本発明1009]
以下の工程を含む、体液試料中のセルフリーDNA(cfDNA)内のAluコピー数を検出する方法:
ヒトから体液試料を得る工程;
体液試料からcfDNAを抽出する工程;
核酸プローブに相補的であるcfDNAに核酸プローブがハイブリダイズすることを可能にする条件下で、cfDNAを核酸プローブと接触させることによって、反応混合物を形成させる工程であって、核酸プローブが、3'末端および5'末端を有する核酸配列を有し、核酸プローブが、SEQ ID NO:1の20~292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端が、検出可能な標識に共有結合で連結されている、工程;
該プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を定量化し、それによって、体液試料中のセルフリーDNA(cfDNA)内のAluコピー数を検出する工程。
[本発明1010]
前記プローブがSEQ ID NO:2の少なくとも50個の連続ヌクレオチドに相補的である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
反応混合物を形成させる前に本発明1001の溶液を体液試料と混合する工程をさらに含む、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
体液試料が尿試料であり、
前記方法が、反応混合物中のクレアチニンの量を定量化する工程をさらに含む、
本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、尿試料中のクレアチニンの量に対して正規化して、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得る工程を含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
ハイブリダイズしたcfDNAの正規化された量を、腎臓状態を示すカットオフ値と比較する工程をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの検出された量またはcfDNAの正規化された量がカットオフ値より大きい場合、患者が腎損傷を有すると決定する工程
をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
ヒトが腎移植を受けたことがある患者であり、腎損傷が、患者が急性拒絶エピソードを有することを示す、本発明1015の方法。
[本発明1017]
ヒトが腎移植を受けたことがある患者であり、
前記方法が、cfDNAの正規化された量と、尿試料が患者から採取された時点での腎臓移植からの期間とに基づき、腎臓の健康を決定するための予測スコアを生成する工程をさらに含む、
本発明1015の方法。
[本発明1018]
予測スコアが予測スコアのカットオフ値より大きい時、患者が急性拒絶エピソードを有すると決定される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
尿試料が、BKウイルス性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、急性尿細管壊死、IgA疾患、および糖尿病性腎疾患からなる群より選択される疾患によって引き起こされた腎損傷を有すると推測される個体に由来する、本発明1014の方法。
[本発明1020]
CXCL10の量を定量化する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1021]
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な50~150ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1022]
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な70~100ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1023]
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な80~90ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1024]
ヌクレオチド配列が正確に81個のヌクレオチドを有する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
検出可能な標識がビオチンであり、
前記方法が、ストレプトアビジンと連結されたシグナル生成剤と、検出可能な標識とを接触させる工程を含む、
本発明1009~1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
シグナル生成剤が、化学発光、色、または蛍光を生成する、本発明1009の方法。
[本発明1027]
患者の腎移植受容から0~400日後または10~100日後または20~50日後または移植腎の寿命中に、尿試料が採取される、本発明1009~1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
(i)尿試料から抽出された未増幅のセルフリーDNA(cfDNA)と、
(ii)核酸配列を有し3'末端および5'末端を有する核酸プローブと
を含む反応混合物であって、
核酸プローブがSEQ ID NO:1の20~292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端が検出可能な標識に共有結合で連結されている、反応混合物。
[本発明1029]
臓器移植が肺移植である、本発明1007の溶液。
[本発明1030]
体液試料が気管支肺胞洗浄(BAL)液試料であり、
前記方法が、BAL液の全体積を定量化する工程をさらに含む、
本発明1009の方法。
[本発明1031]
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、全BAL液試料体積に対して正規化して、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得る工程を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
ハイブリダイズしたcfDNAの正規化された量を、肺状態を示すカットオフ値と比較する工程をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プローブにハイブリダイズしたcfDNAの検出された量またはcfDNAの正規化された量が、カットオフ値より大きい場合、患者が肺損傷を有すると決定する工程
をさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
ヒトが肺移植を受けたことがある患者であり、肺損傷が、患者が拒絶エピソードを有することを示す、本発明1033の方法。
[本発明1035]
以下の工程を含む、臓器損傷を検出する方法:
損傷を有すると推測されるかまたは損傷を発症する可能性が高い臓器から採取された体液試料において、cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を測定する工程であって、1種または複数種のマーカーが、
(i)1種または複数種の炎症マーカー、
(ii)1種または複数種のアポトーシスマーカー、
(iii)全タンパク質、および
(iv)DNAメチル化マーカーのうちの1つまたは複数
からなる群より選択される、工程;
cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を使用して、ITスコアを得る工程;
ITスコアが所定のカットオフより高い場合、患者が臓器に損傷を有するかまたは患者が臓器に損傷を発症し得ることを決定する工程。
定義
「a」、「an」、または「the」という用語には、本明細書中で使用されるように、一つのメンバーを含む局面が含まれるのみならず、複数のメンバーを含む局面も含まれる。例えば、単数形「a」、「an」、および「the」には、前後関係が他のことを明白に指示しない限り、複数の指示が含まれる。従って、例えば、「細胞(a cell)」との言及には、複数のそのような細胞が含まれ、「薬剤(the agent)」との言及には、当業者に公知の一つまたは複数の薬剤の言及が含まれ、他も同様である。
個体における腎損傷状態、即ち、腎損傷の有無を査定するために使用され得る組成物および方法が、提供される。そのような査定は、医学的問題に取り組むためのより多くの薬物治療の投与、またはもはや医学的に必要でない場合の薬物治療の減少(停止を含む)のような、いつ個体が医学的介入を必要とするかを診断するために役立つ。例えば、本明細書中に記載された組成物および方法は、いつ個体が腎移植または腎疾患による腎損傷を有するかを決定するために使用され得る。
肺損傷状態、即ち、個体における肺損傷の有無を査定するために使用され得る組成物および方法が、本明細書中に提供される。そのような査定は、医学的問題に取り組むためのより多くの薬物治療の投与、またはもはや医学的に必要でない場合の薬物治療の減少(停止を含む)のような、いつ個体が医学的介入を必要とするかを診断するために役立つ。例えば、本明細書中に記載された組成物および方法は、いつ個体が肺移植による肺損傷を有するかを決定するために使用され得る。
いくつかの局面において、体液セルフリーDNA(「cfDNA」)を安定化することができる保存試薬カクテルが提供される。いくつかの態様において、保存カクテルは、ホルムアルデヒドドナーおよびカルシウムキレート剤のようなキレート剤を含む溶液である。ホルムアルデヒドドナーの非限定的な例には、ジアゾリジニル尿素およびイミダゾリジニル尿素が含まれる。キレート剤の非限定的な例には、EDTAおよびEGTAが含まれる。いくつかの態様において、溶液は、PEG、アウリントリカルボン酸の一方または両方をさらに含む。いくつかの態様において、溶液は、アジ化ナトリウムおよび緩衝剤をさらに含む。緩衝剤の非限定的な例には、PBS、TAPS、ビシン、トリス、トリシン、HEPES、TES、MOPS、PIPES、カコジル酸、およびMESが含まれる。いくつかの態様において、溶液は、ヌクレアーゼによるcfDNAの分解を防止しかつ/または細胞溶解を阻害することによって、体液(例えば、尿)を保存することができる濃度で、それぞれの成分を含む。cfDNAの安定化に加えて、溶液は、体液中に存在する細胞の安定化を通してゲノムDNA混入を防止することもできる。様々な分子量のPEGおよび様々な型のEDTAを、前記の所望の特性を提供するため、このカクテルにおいて使用することができる。一つの態様において、カクテルにおいて使用されるPEGは、PEG 35,000である。一つの態様において、EDTAは、Na2EDTAである。一つの態様において、EDTAは、K2EDTAである。一つの態様において、EDTAは、K3EDTAである。
Alu遺伝子は、癌を有する患者においてcfDNAの量を査定するため、様々な領域の増幅について広範に研究されている(Biol Proced Online(2013);Park et al.,Oncol Lett(2012))。一つの局面において、本発明は、cfDNA内のAluリピートにハイブリダイズする標識された核酸プローブを使用することによって、体液中のcfDNAの量を査定する方法を提供する。
の少なくとも20~300個、例えば、20~292個、20~180個、50~150個、70~100個、80~90個の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらに完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
の少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、または81個の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらに完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、本方法は、(事前に増幅されていない)cfDNAを固体支持体に連結する工程、Aluリピートに特異的なプローブをcfDNAにハイブリダイズさせる工程、未結合のプローブを除去(例えば、洗浄して除去)する工程、次いで、特異的にハイブリダイズしているプローブの量を検出し、それによって、試料中のcfDNAの量を決定する工程を含む。
個体、例えば、臓器損傷を有すると推測される個体に由来する体液試料、例えば、尿またはBALを、医療従事者によって推奨される任意の様式で収集することができ、例えば、中間尿を無菌容器に収集することができる。いくつかの態様において、次いで、細胞成分を除去し、それによって、セルフリー試料を作製するため、遠心分離を通して試料を加工する。任意で、試料は、緩衝液(例えば、PBSもしくはトリス)および/または前記の保存カクテルと混合されてもよい。試料は、さらなる分析まで、-80℃で保管されてもよい。いくつかの態様において、前記の保存カクテルが、混合物を作製するため、体液試料に添加される。いくつかの態様において、混合物は、cfDNAの抽出のため、等分され得る。
セルフリーDNAを抽出する方法は、当技術分野において周知であり、市販のキット、例えば、Qiagen(Valencia,California)のQIAamp(登録商標)Circulating Nucleic Acids Kitが、容易に入手可能である。通常細胞片を分解し、DNaseおよびRNaseを除去するため、試料を処理して、溶解物を作製することができる。例えば、溶解物をDNA結合カラムに通すことによって、溶解物中のDNAを抽出することができ、結合したDNAを水または緩衝液で溶出させることができる。任意で、溶出液のアリコートを、回収されたcfDNAの濃度を決定するために採取することができる。
核酸プローブのcfDNA内のAluリピートとのハイブリダイゼーションアッセイは、マルチウェルプレート、例えば、96穴プレート、例えば、96穴LUMITRAC 600(Greiner Bio-One)を含むが、これに限定されるわけではない、任意の反応容器において実施され得る。ハイブリダイゼーションアッセイは、対費用効果が高く、より高次(例えば、384/バッチ)に多重化され得るため、標的核酸を事前に増幅することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ、即ち、検出可能な標識にコンジュゲートされたプローブのハイブリダイゼーションを使用して、cfDNAを検出するアッセイは、PCRに基づくアプローチと比較して望ましい。さらに、プローブは、断片長に関係なく、体液中の一本鎖および二本鎖の全てのcfDNAを検出するため、ハイブリダイゼーションアプローチは、cfDNAのより完全でより正確な定量化を可能にする。
検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出する方法は、当技術分野において周知であり、本方法は、シグナルを生成するために利用される化学反応の性質に依って変動する。前記のように、いくつかの態様において、検出可能な標識は、それ自体、適切な装置、例えば、プレートリーダを使用して直接読み取り可能なシグナルを生成するシグナル生成剤である。いくつかの態様において、検出可能な標識は、シグナルを間接的に生成するものであり、シグナルを生成するためには、シグナル生成剤にコンジュゲートされた標識の結合パートナーを含む溶液がプレートに添加される。シグナル生成剤には、例えば、酵素または酵素基質、反応基、色素または有色粒子のような発色団、生物発光モエティ、リン光モエティ、または化学発光モエティを含む発光モエティ、および蛍光モエティが含まれる。一つの態様において、検出可能な標識はビオチンであり、結合パートナーはストレプトアビジンであり、シグナル生成剤は西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。この具体的な態様において、シグナルは、当技術分野において周知の方法によって容易に検出され定量化され得る化学発光シグナルである。
本明細書中に開示されたcfDNAの定量化を、尿タンパク質の測定と組み合わせることができる。一つの具体的な態様において、尿タンパク質はクレアチニンである。クレアチニンは、吸光度に基づく方法であるヤッフェ反応を使用して測定され得る。mgクレアチニン/デシリットル尿でアウトプットを与えるQuantiChrom(商標)Creatinine Assay Kit(BioAssay Systems)のような、クレアチニンを測定するための市販のアッセイが、容易に入手可能である。例えば、www.bioassaysys.com/Datasheet/DICT.pdfを参照されたい。いくつかの態様において、尿クレアチニン測定は、尿試料中のcfDNAの抽出および定量化の前または後に行われる。いくつかの態様において、尿クレアチニン測定およびcfDNA定量化は、例えば、クレアチニンを測定するための尿試料を、これらの尿試料から抽出されたcfDNAと同一のマイクロプレートに置くことによって、同一のマルチウェルプレート(しかし異なるウェル)において実施される。同一のプレート/アッセイにおけるクレアチニンおよびcfDNAの測定は、cfDNAの増幅生成物の量を読み取るための一つのアッセイとクレアチニンレベルを読み取るための一つのアッセイとを必要とする従来のPCR法と比較して、時間およびコストを節約する。
臓器損傷の検出の感度および/または特異度をさらに改善するため、付加的な公知のマーカーを測定することができる。いくつかの態様において、付加的なマーカーには、1種または複数種の組織炎症マーカー、例えば、CXCL10、例えば、腎臓における炎症が含まれる。いくつかの態様において、CXCL10が検出され定量化される。例えば、最初に、捕獲抗体をプレートに吸着させ、次いで、試料中のCXCL10が捕獲されることを可能にするため、試料を添加する、サンドイッチELISAアプローチを使用して、CXCL10を測定する方法は、周知である。その後、捕獲されたCXCL10に結合する検出抗体を添加する。これを、文献において周知の一般的な二次抗体-HRPコンジュゲーションアプローチを使用して、検出することができる。標準濃度の精製されたCXCL10タンパク質によって、標準曲線を生成する。CXCL10の測定のための市販のキット、例えば、R&D systemsのHuman CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kitは、容易に入手可能である。尿CXCL10は、cfDNA測定の前または後に測定され得る。例えば、最初にマイクロプレート内の指定されたウェルにCXCL10捕獲抗体をコーティングし、これらの指定されたウェルに、CXCL10を測定するための尿試料を置くことによって、尿CXCL10をcfDNAと同一のマルチウェルプレートにおいて測定することもできる。
本方法は、多様なアッセイデバイスおよび/またはフォーマットで使用され得る。アッセイデバイスには、例えば、(ターゲティング剤またはその他の結合試薬を含み得る)アッセイ試薬が、アッセイモジュールのウェル、チャンバー、またはアッセイ領域に、アッセイの進行中に添加されるかまたは予め負荷される、アッセイプレート、カートリッジ、マルチウェルアッセイプレート、反応容器、試験管、キュベット、フローセル、アッセイチップ、ラテラルフローデバイス等が含まれ得る。これらのデバイスは、特異的結合アッセイ、例えば、イムノアッセイまたは免疫クロマトグラフィアッセイのための多様なアッセイフォーマットを利用することができる。例示的なアッセイデバイス、例えば、マイクロウェルプレートおよびフォーマット、96穴プレートフォーマットは、本明細書中に後に記載される。
a.cfDNAの量に基づく臓器の健康の決定
いくつかの態様において、個体の臓器の健康の決定は、体液試料中のcfDNAの量を、臓器損傷状態を示すカットオフ値または予測確率推定値と比較する工程を含む。カットオフ値は、所定の値または予測確率推定値、例えば、医療従事者によって推奨された値であり得る。状況に依って、決定のためのカットオフ値を確立することが、いくつかのケースにおいて、必要であり得る。本明細書中に開示された方法を実施するためのそのようなカットオフ値を確立するためには、臓器移植術後に臓器損傷を有していない個体の群のような、健康な個体の群が選択される。これらの個体は、適用可能な場合、本発明の方法を使用して臓器損傷状態を決定する目的のため、適切なパラメータの範囲内である。例えば、個体は、類似した年齢、性別、および比較可能な健康状態を有していてよい。
ある種の態様において、臓器移植を受けたことがある患者が臓器損傷を有するか否かを診断するため、または患者が臓器損傷を将来発症する可能性を予測するため、予測スコア、即ち、ITスコアが使用される。臓器移植後に発生した臓器損傷は、典型的には、移植された臓器に対する急性拒絶エピソードに関連している。
腎疾患に関連した腎損傷のケースにおいて、KITスコアは適用可能でなく、決定は、前記のcfDNA/クレアチニン比に基づく。いくつかのケースにおいて、cfDNAプレートに多重化され得る他のバイオマーカー、例えば、CXCL10の追加が、検出のための予測モデルの作出において適用可能であり得る。本方法は、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、IgA腎症、および初期糖尿病性腎疾患、BKウイルス性腎炎(BKVN)、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、糸球体腎炎(GN)、急性尿細管壊死(ATN)、IgA疾患、および糖尿病性腎疾患のような腎疾患を検出するために使用され得る。図4Cは、BKVNを有する患者を、疾患を有しないものから分離するための、cfDNA/クレアチニン比の使用を示す。
いくつかの態様において、例えば、ラテラルフローアッセイから検出された、本明細書に記載された1種または複数種のマーカー、例えば、cfDNA、クレアチニンからのシグナルは、コンピュータデバイス、カメラ、またはスマートフォンに送信される。いくつかの態様において、シグナルは、加工のため、スマートフォンアプリケーションに送信される。
体液中のcfDNAレパートリーのより完全なカバー度を提供するため、cfDNAの長い断片長および極めて短い断片長の両方を捕獲することができるよう、Aluリピートを標的とする核酸プローブのため、<100bpの長さを選択した。この具体的なアッセイにおいて、プローブ長は、81bpであったが(図2)、18~22bpのPCRプライマーによって通常利用されるもののような、より短い長さも、同様に機能するはずである。
を設計し合成した。これを、ストレプトアビジン-HRPおよび化学発光基質(SuperSignal(商標)ELISA Femto Substrate)溶液を使用した化学発光に基づく検出系を使用して、cfDNAを定量化するために使用した(図3)。
超音波処理されたゲノムDNAを含有している尿においてDNA安定化溶液の有効性を試験するため、本発明者らは、QiaAMP DNA Blood Mini Kit(Qiagen)を使用して、全血からゲノムDNAを精製し、強度設定3で、Model 550 probe Sonic Dismembrator(ThermoFisher Scientific)を使用して、10分間、超音波処理した。サイクルを、10秒オンおよび20秒オフに設定した。得られたおよそ150~250塩基対の断片サイズを確立するため、1%ゲル電気泳動上で試料を実行した。超音波処理によって、本発明者らは、移植拒絶におけるcfDNAを最も良く表す範囲である、およそ150~250塩基対というサイズのDNA断片を獲得した(図1)。次に、本発明者らは、10g/Lジアゾリジニル尿素、20g/Lポリエチレングリコール、1mMアウリントリカルボン酸、10mM K2EDTA、10mMアジ化ナトリウム、および1×リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4を含有している保存溶液を製剤化した。実験は、DNAの完全性の保存のためのDNA保存溶液の有効性を試験するために設計された。断片化されたゲノムDNA(およそ150~250塩基対のサイズ)を、保存溶液と共に尿を含有している1000μLチューブおよび保存溶液なしで尿を含有している1000μLチューブに添加した。実験を、4℃および室温で、平行して実行した。図1は、DNA保存溶液の非存在下では、72時間で完全にDNAが分解され崩壊するが、DNA保存溶液が、72時間までのDNA完全性の維持を助ける様子を証明する電気泳動図を示す。
a.試料収集
移植術後期間の異なる時点において、腎移植を受けた3人の患者(患者#1~#3)から、中間尿試料を無菌容器に収集した。患者#1に由来する尿試料は、1日目、16日目、22日目、51日目、および180日目に採取され;患者#2に由来する尿試料は、23日目、41日目、および103日目に採取され;患者#3に由来する尿試料は、100日目、132日目、185日目、および337日目に採取された。リストされた時点において、尿の収集に加えて、急性拒絶を確認するため、生検材料を採取する。例えば、この研究における患者#1についてのリストされた時点は、22日目である。尿試料を、H2O中の20μlの溶出体積で、製造業者の説明書に従って、QiaAmp(登録商標)Circulating Nucleic Acids Kit(Qiagen)によって抽出するため、2mLに等分した。
患者#1~#3を含む研究の前に、腎移植を受けかつ生検によって確認される腎損傷を有しなかった9人の患者からのデータに基づき、cfDNA/クレアチニン比のカットオフ値を確立した。これらの9人の患者に由来する尿試料からのcfDNAおよびクレアチニンの量は、本明細書中に記載されるように決定された。最初に、尿クレアチニン値をmg/mLに変換し、セルフリーDNA値を、このクレアチニン測定値によって割り、[GE/mg]の単位を有するcfDNA/クレアチニンを得た。GE(ゲノム当量)とは、6.6pgのヒトDNAとして定義される。移植術後日数に対するcfDNA/クレアチニン比を、図7に示されるようにプロットし、移植後時間に依存する95%予測バンド(点線)を、以下の方程式によって指数関数的減衰曲線としてモデル化した。
cfDNA/クレアチニン[GE/mg] = 10^((5.612-4.007)*EXP(-0.05977*(移植後日数))+4.007)/100
肺移植を受けた76人の患者に由来する気管支肺胞洗浄(BAL)液試料を、安定期間中または拒絶エピソード中に、無菌容器に収集した。BAL液を、H2O中の20μLの溶出体積で、製造業者の説明書に従い、QIAamp Circulating Nucleic Acids Kit(Qiagen)によって抽出するため、400μLに等分した。実施例2に開示されるように、cfDNAを測定した。
図13は、腎損傷の複数の原因を有する490の臨床的な患者試料のデータセットに基づく、腎損傷の査定のためのITスコア(「KIT」)を示す例示的な態様を提供する。結果として得られたKITスコアは、cfDNA、クレアチニン、CXCL10、クラスタリン、タンパク質、およびDNAメチル化マーカーの完全な測定値を有する299の臨床的な患者試料のサブセットに基づいていた;111のII型糖尿病、71の免疫、50の腎結石、20の移植拒絶、19の高血圧、および28の対照。結果として得られたKITスコアは、腎損傷の検出のための91%を超える感度および特異度(AUC=96.9%)を有していた。図14A~Eは、一般化線形モデル適合の結果および関連ROC曲線を提供する。これらの結果は、腎損傷の確率を示すことに加えて、基礎をなすアルゴリズムが、各疾患原因;即ち、II型糖尿病、免疫応答、腎結石、移植拒絶、および高血圧による腎損傷の確率を正確に提供し得ることを例示する。これらのデータについて、結果として得られたアルゴリズムは、腎損傷の各原因の検出のための92%を超える感度および特異度(AUC>99.4%)を示した。
Claims (27)
- 以下の工程を含む、腎損傷を検出するための方法:
尿試料を得る工程;
(i)尿試料由来のcfDNAを、核酸プローブと接触させて、尿試料由来のcfDNAを測定する工程であって、該核酸プローブがAluリピートにハイブリダイズするように構成されているヌクレオチド配列を含む、工程;
(ii)尿試料由来の炎症マーカーを、それに対する抗体と接触させて、尿試料由来の炎症マーカーを測定する工程;
(iii)尿試料由来のアポトーシスマーカーを、それに対する抗体と接触させて、尿試料由来のアポトーシスマーカーを測定する工程;
(iv)尿試料由来のクレアチニンを、検出試薬と接触させて、尿試料由来のクレアチニンを測定する工程;
(v)尿試料由来の全タンパク質マーカーを、検出試薬と接触させて、尿試料由来の全タンパク質を測定する工程;
(vi)尿試料由来のメチル化DNAを、5-メチルシトシンを認識する抗体と接触させて、尿試料由来のメチル化DNAを測定する工程;
工程(i)~(vi)から得られた測定値を分析して、腎損傷を示すスコアを生成する工程;および
該スコアを用いて腎損傷を検出する工程であって、該スコアが、90%より大きい、受信者動作特性曲線の下面積(AUC)で、腎損傷を検出するために使用される、工程。 - 前記炎症マーカーがCXCL10であり、前記アポトーシスマーカーがクラスタリンである、請求項1記載の方法。
- 前記スコアが、工程(i)~(vi)からの測定値を非線形モデルに入力することにより生成される、請求項1または2記載の方法。
- 前記核酸プローブが、SEQ ID NO:1の少なくとも20~300個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 全タンパク質に対する検出試薬が、比色試薬である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
- クラスタリンに対する抗体が、ELISAに基づくアッセイの一部である、請求項2~5のいずれか一項記載の方法。
- CXCL10に対する抗体が、ELISAに基づくアッセイの一部である、請求項2~6のいずれか一項記載の方法。
- 核酸プローブと接触させる前に、cfDNAが増幅されていない、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。
- 工程(i)~(vi)の前に、尿試料が溶液で安定化されている、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。
- 安定化溶液が、細胞溶解を阻害しかつ尿試料中のヌクレアーゼを阻害するために十分な濃度で、ホルムアルデヒドドナーおよびキレート剤を含む、請求項9記載の方法。
- 前記スコアが、腎損傷の推定確率を表す複合値である、請求項1~10のいずれか一項記載の方法。
- 前記スコアが、0~100にスケーリングされている、請求項11記載の方法。
- 前記スコアが、少なくとも91%の感度と少なくとも91%の特異度で、腎損傷を検出するために使用される、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。
- 前記非線形モデルが、腎結石、免疫複合体、癌、糖尿病、および移植拒絶を含む、腎損傷の複数の原因を有する対象と対照を評価することによって生成される、請求項3記載の方法。
- 前記非線形モデルが、少なくとも400の試料を評価することによって生成される、請求項14記載の方法。
- 移植術後期間の異なる時点において、対象から複数の尿試料を得る工程をさらに含む、請求項1~15のいずれか一項記載の方法。
- 尿試料由来のcfDNAを核酸プローブと接触させることにより、固定化cfDNA/核酸プローブ複合体が生じる、請求項1~16のいずれか一項記載の方法。
- 検出基質を含む溶液と前記複合体を接触させる工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 前記検出基質が、化学発光基質である、請求項18記載の方法。
- クラスタリンに対する抗体が、マイクロウェルに基づくアッセイにおいて使用される、請求項2~19のいずれか一項記載の方法。
- CXCL10に対する抗体が、マイクロウェルに基づくアッセイにおいて使用される、請求項2~20のいずれか一項記載の方法。
- 腎損傷に罹患している対象が、医学的介入を必要としているかどうかの決定を補助するための方法であって、請求項1~21のいずれか一項記載の方法によって生成されたスコアを得る工程、および生成されたスコアを所定のカットオフ値と比較する工程を含み、所定のカットオフ値より高い生成されたスコアが、該対象に対する医学的介入の必要性を示す、方法。
- 前記医学的介入が、対象へ免疫抑制薬を投与することまたは対象への免疫抑制薬の投与量を変更することを含む、請求項22記載の方法。
- 前記免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、mTOR阻害剤、ステロイド、または導入剤である、請求項23記載の方法。
- 前記免疫抑制薬が、タクロリムス、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、アザチオプリン、シロリムス、プレドニゾン、サイモグロブリン、IL2受容体遮断薬、およびベラタセプトからなる群より選択される、請求項23または24記載の方法。
- 移植術後期間の異なる時点において、対象から複数の尿試料を得る工程をさらに含む、請求項22~25のいずれか一項記載の方法。
- 前記cfDNAが、核酸プローブと接触する前に増幅されていない、請求項1~26のいずれか一項記載の方法。
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