JP7107450B1 - 立体的細胞構造体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2020年8月20日に日本に出願された特願2020-139260号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1] 少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、1.0×10-8mg/mL以上2.5×10-2mg/mL未満である、製造方法。
[2] 前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも1回行った後に行う、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、[1]~[3]のいずれか一項に記載の製造方法。
[5] 前記混合物中における前記高分子電解質の濃度が、1.0×10-8mg/mL以上2.5×10-2mg/mL未満である、[1]~[4]のいずれか一項に記載の製造方法。
[6] 前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、[1]~[5]のいずれか一項に記載の製造方法。
[7] 前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、1.5×104個/mm2以上1.5×105個/mm2以下である、[1]~[6]のいずれか一項に記載の製造方法。
[8] 少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、前記細胞外マトリックス成分の含有量が、0.01質量%以上30質量%以下である、立体的細胞構造体。
[9] 前記立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、1.5×104個/mm2以上1.5×105個/mm2以下である、[8]に記載の立体的細胞構造体。
[10] 厚みが5μm以上200μm以下である、[8]又は[9]に記載の立体的細胞構造体。
細胞集合体の懸濁は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、及びプレート等の適当な容器中で行うことができる。
[1] 少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンであり、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、1.0×10-8mg/mL以上2.5×10-2mg/mL未満である、製造方法。
[2] 前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも1回行った後に行う、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 前記高分子電解質が、ヘパリンである、[1]~[3]のいずれか一項に記載の製造方法。
[5] 前記混合物中における前記高分子電解質の濃度が、1.0×10-8mg/mL以上2.5×10-2mg/mL未満である、[1]~[4]のいずれか一項に記載の製造方法。
[6] 前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、[1]~[5]のいずれか一項に記載の製造方法。
[7] 前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、1.5×104個/mm2以上1.5×105個/mm2以下である、[1]~[6]のいずれか一項に記載の製造方法。
[8] 少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンであり、前記細胞外マトリックス成分の含有量が、0.01質量%以上30質量%以下である、立体的細胞構造体。
[9] 前記立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、1.5×104個/mm2以上1.5×105個/mm2以下である、[8]に記載の立体的細胞構造体。
[10] 厚みが5μm以上200μm以下である、[8]又は[9]に記載の立体的細胞構造体。
[11] 前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、[8]~[10]のいずれか一項に記載の立体的細胞構造体。
[12] 前記高分子電解質が、ヘパリンである、[8]~[11]のいずれか一項に記載の製造方法。
[13] [8]~[10]のいずれか一項に記載の立体的細胞構造体の製造方法における、高分子電解質の使用。
(立体的細胞構造体の形成1)
1.38×107細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)及び2.1×105細胞のGFP導入ヒト臍帯静脈内皮細胞(GFP-HUVEC)を、0.8mg/mL、0.4mg/mL、又は0.2mg/mLのヘパリン/50mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.4)0.5mLと、同濃度のコラーゲン/50mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.4)0.5mLと、10%ウシ胎児血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培地)1mLと、の混合液に懸濁した。この結果、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度は、それぞれ、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mLとなった。さらに、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度がそれぞれ0.05mg/mLの混合液を、さらにDMEM培地で段階的に2倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ、0.025mg/mL又は1.25×10-2mg/mLとなる混合液を調製し、同様に上記正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)及びGFP導入ヒト臍帯静脈内皮細胞(GFP-HUVEC)を懸濁した。さらに、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度がそれぞれ0.05mg/mLの混合液を、さらにDMEM培地で段階的に5倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ、1.0×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10-7mg/mL、又は2.6×10-8mg/mLとなる混合液を調製し、同様に上記正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)及びGFP導入ヒト臍帯静脈内皮細胞(GFP-HUVEC)を懸濁した。
培養開始時から8日間経過後に、立体的細胞構造体を10%ホルマリン溶液で固定後、CD31抗体(DAKO社製、JC70A M082329)と二次抗体(Invitrogen社製、A-11001)とを用いて、血管内皮細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡(PerkinElmer社製、Operetta CLS)を用いて血管網構造形成の有無を観察した。図1は、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、又は0.0125mg/mLの場合の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。図2は、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ0.05mg/mL、1.0×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10-7mg/mL、又は2.6×10-8mg/mLの場合の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。図1及び図2中、「ヘパリン/コラーゲン終濃度」はヘパリン及びコラーゲンの終濃度を示す。図1及び図2の顕微鏡観察の結果から、血管網構造形成の有無を評価した。評価は以下の基準で行った。その結果を表1に示す。
血管網構造が立体的細胞構造体の全体で形成されている:A
血管網構造が立体的細胞構造体の一部で形成されていない:B
血管網構造が立体的細胞構造体の全体で形成されていない:C
続いて、各立体的細胞構造体の厚さを測定した。厚さの測定は、切片画像の中央部の一箇所と両端部の二箇所の計三箇所をImage Jを用いて算出し、その算術平均値を立体的細胞構造体の厚さとした。表2に、立体的細胞構造体の厚さの測定結果を示す。
(立体的細胞構造体の形成2)
0.2mg/mLのヘパリン/50mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.4)0.5mLと、0.2mg/mLのコラーゲン/50mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.4)0.5mLと、10%ウシ胎児血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培地)1mLと、の混合液を調製した。この混合液を、さらにDMEM培地で4倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ1.25×10-2mg/mLとなる混合液を調製し、1.38×107細胞のNHDF及び2.1×105細胞のGFP-HUVECを懸濁し、混合物2-1を得た。
Claims (4)
- 少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、ヘパリンと、コラーゲンと、を混合して混合物を得る工程と、
得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記ヘパリン、及び前記コラーゲンを含む細胞集合体を集める工程と、
前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、
前記混合物中におけるヘパリン及びコラーゲンの濃度が、それぞれ2.6×10 -8 mg/mL以上1.25×10 -2 mg/mL以下である、製造方法。 - 前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも1回行った後に行う、請求項1に記載の製造方法。
- 前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、1.5×104個/mm2以上1.5×105個/mm2以下である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
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