JP7104930B2 - Method for determining cells suitable for maintenance culture and infection evaluation of malaria parasites using blood cell-like cells derived from immortalized erythrocyte progenitor cells - Google Patents
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Description
本発明は、血球を介在するウィルス・菌・原虫などの微生物の維持、培養または評価に適した細胞を不死化したヒト赤血球前駆細胞から調製したヒト赤血球様細胞群から選択し、決定する方法に関する。 The present invention relates to a method for selecting and determining cells suitable for maintaining, culturing, or evaluating microorganisms such as viruses, bacteria, and protozoa that mediate blood cells from a human erythroid cell group prepared from immortalized human erythroid progenitor cells. .
感染症研究において、研究対象が血球を介在する場合、例えばマラリア原虫のように血球内で増殖する場合、献血由来の、もしくはヒト以外の動物種の血液を利用して研究対象の培養および評価が行われている。しかし、少子高齢化社会の進行に伴う献血者総数の減少により、将来的に研究用への血液提供が不足する事態が危惧されている。 In infectious disease research, when the research target is mediated by blood cells, such as malaria parasites that proliferate within blood cells, culture and evaluation of the research target using blood derived from blood donations or non-human animal species is required. It is done. However, due to the decrease in the total number of blood donors accompanying the progress of the declining birthrate and aging society, there is concern that the blood donation for research will be insufficient in the future.
また、一般的に、血液細胞を用いた感染症研究は、献血や廃棄する状態の輸血パックまたは動物の血液にある赤血球などを使用するために、評価ごとに異なる血液細胞を使用することになる。そのため、試験の再現性担保が難しい場合もある。特に、感染症は、特定の遺伝子変異した場合、感染もしくは重篤化に対して抵抗性を獲得する事例が多数存在する。例えば、１１番目染色体に変異が入った、いわゆる鎌型赤血球症患者はマラリアに対して疾患抵抗性を示すことが知られている。このように、感染症に対して疾患抵抗性を示す遺伝子を背景に持つ血液を、メカニズム研究や新薬・ワクチン開発などのために使用したいと考える場合、血球細胞の確保が難しい。 Also, infectious disease research using blood cells generally uses different blood cells for each evaluation, such as red blood cells in blood transfusion packs in a state of donation or disposal, or animal blood. . Therefore, it may be difficult to ensure the reproducibility of the test. In particular, there are many cases in which infectious diseases acquire resistance to infection or aggravation when specific gene mutations occur. For example, so-called sickle cell disease patients with mutations in chromosome 11 are known to exhibit disease resistance to malaria. In this way, it is difficult to secure blood cells when it is desired to use blood with a background of genes showing disease resistance against infectious diseases for mechanism research, new drug/vaccine development, and the like.
さらに、感染症研究の対象となるウィルス・菌・原虫などの微生物については、血球を介在することは判明しているものの、培養・増殖に適した条件については未だ明らかにされていない。そのため、献血血液から感染に適した細胞を分画などにより抽出して用いられている場合にも、研究対象の培養にどの細胞群が適しているか不明である場合もあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が困難な研究対象も多く報告されている。 Furthermore, although it is known that microorganisms such as viruses, fungi, and protozoa, which are the subject of infectious disease research, mediate blood cells, conditions suitable for culturing and proliferation have not yet been elucidated. Therefore, even if cells suitable for infection are extracted from donated blood by fractionation, etc., it may be unclear which cell group is suitable for the culture of the research subject. There have been many reports of research subjects for which it is difficult to
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養を実現させるための方法として、例えば、Ｔｒａｇｅｒらにより、献血由来の、もしくは廃棄輸血パックより分画した赤血球を用いて熱帯熱マラリア原虫をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できることが報告されている（非特許文献１）。本報告以降、多くの研究者らが改良法を報告し、献血等によるヒト生体由来の赤血球などを使用して研究対象をｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養し、それらを用いて感染症研究・薬剤・ワクチン開発が行われてきた。 As a method for realizing in vitro culture, for example, Trager et al. reported that Plasmodium falciparum can be cultured in vitro using red blood cells derived from donated blood or fractionated from waste transfusion packs. (Non-Patent Document 1). Since this report, many researchers have reported improved methods, culturing research subjects in vitro using erythrocytes derived from human organisms such as blood donations, etc., and using them for infectious disease research, drugs, and vaccines. development has taken place.
また、臍帯血・骨髄・末梢血由来の造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて血球細胞、更には赤血球へと分化できることが報告されている（特許文献１）。また、ＥＳ・ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導を行うことにより赤血球を調製する方法も報告されている（特許文献２）。さらに、臍帯血由来の造血幹細胞を分化誘導させて赤血球細胞を調製し、熱帯熱マラリア原虫の感染に用いた例がいくつかの研究グループより報告されている（非特許文献２）。しかし、これらの方法は、分化誘導に期間を要し、赤血球の供給量が少なく研究に必要な量を継続的に提供し続けるのは難しく、費用が高額となるという問題があった。この問題を解決する方法として、造血幹細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、又はそれらから分化した細胞に遺伝子導入を行い、不死化赤血球前駆細胞を作製し、より効率的に赤血球を調製する方法が報告されている（非特許文献３～７）。また、不死化した赤血球前駆細胞から得られた脱核した赤血球細胞も記載されている（特許文献３）が、本細胞は、脱核した赤血球に感染することが判明している研究対象にしか利用できなかった。 In addition, it has been reported that hematopoietic stem cells derived from cord blood, bone marrow, and peripheral blood can be differentiated in vitro into blood cells and further into erythrocytes (Patent Document 1). A method for preparing erythrocytes by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as ES/iPS cells has also been reported (Patent Document 2). Furthermore, some research groups have reported examples of using hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood to differentiate to prepare erythrocytes for infection with Plasmodium falciparum (Non-Patent Document 2). However, these methods have the problems that it takes a long time to induce differentiation, the amount of erythrocytes to be supplied is small, it is difficult to continuously provide the amount necessary for research, and the cost is high. As a method to solve this problem, a method of producing immortalized erythroid progenitor cells by gene transfer into hematopoietic stem cells, ES cells, iPS cells, or cells differentiated from them, and more efficiently preparing red blood cells has been reported. (Non-Patent Documents 3-7). Enucleated erythrocytes obtained from immortalized erythroid progenitor cells have also been described (Patent Document 3), but these cells are only used in research subjects that have been found to be infected with enucleated erythrocytes. was not available.
このように、研究対象となるウィルス・菌・原虫などの赤血球介在型感染性微生物に適したヒト血球様細胞群を特定できれば、それを人工的に調製して提供することが可能となり、赤血球介在型感染性微生物培養のための細胞の安定供給や、赤血球介在型感染性微生物に関する研究の再現性の問題を改善することができると考えられる。しかし、これまで、赤血球介在型感染性微生物については、血球を介在することは知られているものの、血球により感染や維持培養の効率が異なるかどうかを検討された例はなく、またどの様な状態の血球が感染や維持培養に適するかは同定されていなかった。 In this way, if it is possible to identify human blood cell-like cell groups suitable for erythrocyte-mediated infectious microorganisms such as viruses, bacteria, and protozoa to be studied, it will be possible to artificially prepare and provide them. It is believed that the problem of stable supply of cells for culturing infectious microorganisms and reproducibility of research on erythrocyte-mediated infectious microorganisms can be improved. However, although it is known that erythrocyte-mediated infectious microorganisms mediated by blood cells, there has been no study to determine whether the efficiencies of infection and maintenance culture differ depending on blood cells. It has not been identified whether the condition's blood cells are suitable for infection or maintenance culture.
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、感染症研究を行うためのヒト赤血球様細胞群を決定する方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a method for determining a human erythroid cell group for researching infectious diseases.
本発明者らは、感染症研究に適した人工細胞を提供する方法を模索すべく、ヒト臍帯血由来又はＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞由来の細胞に遺伝子を導入して得られた不死化ヒト赤血球前駆細胞株を分化誘導させて、複数の分化状態が混在した細胞群を調製し、赤血球介在型感染性微生物を感染させる実験を繰り返し行った。その結果、細胞の分化状態が感染効率や感染した細胞の生存率に影響を与えることを見出した。そして、このような分化状態が混在した細胞群を用いることにより、赤血球介在型感染性微生物に適した細胞を決定することができ、それにより血球を介在する感染症、熱帯熱マラリアなどの原虫研究に適した細胞を人工的に作製し、使用できることを見出すことに成功した。 In order to find a method of providing artificial cells suitable for infectious disease research, the present inventors obtained immortalized human erythrocyte precursors obtained by introducing genes into cells derived from human umbilical cord blood or ES cells or iPS cells. Differentiation of cell lines was induced to prepare cell populations in which multiple differentiation states were mixed, and experiments were repeated in which the cells were infected with erythrocyte-mediated infectious microorganisms. As a result, we found that the state of cell differentiation affects the infection efficiency and survival rate of infected cells. By using such a group of cells with mixed differentiation states, it is possible to determine cells suitable for erythrocyte-mediated infectious microorganisms. We succeeded in discovering that we can artificially create and use cells suitable for
具体的には、本発明者らは、熱帯熱マラリア原虫が調製した赤血球様細胞に侵入することを確認した。ギムザ染色など染色手法を用い確認したところ、この感染は脱核前の未熟な段階のヒト赤血球様細胞に認められた。すなわち、生体由来の成熟した赤血球ではなく、このように分化度の混在した赤血球様細胞群を用いることで、感染血球が未知である研究対象について、より適した細胞群を見いだすことができた。 Specifically, the present inventors confirmed that Plasmodium falciparum invades prepared erythroid cells. This infection was found in immature stages of human erythroid cells prior to enucleation, as confirmed using staining techniques such as Giemsa staining. That is, by using such a mixedly differentiated erythroid-like cell population instead of mature erythrocytes derived from the living body, it was possible to find a more suitable cell population for a research subject in which infected blood cells were unknown.
また、調製した細胞を、赤血球にかわり感染評価に使用した際に、細胞死や原虫死が観測された。よって、決定された細胞に適した培養条件について検討した結果、感染評価に適した培養条件が存在することを見出した。これにより、決定された細胞を適切に感染評価に用いることを達成できた。 When the prepared cells were used instead of erythrocytes for infection evaluation, cell death and parasite death were observed. Therefore, as a result of examining culture conditions suitable for the determined cells, it was found that culture conditions suitable for infection evaluation exist. This made it possible to use determined cells appropriately for infection assessment.
具体的には、本発明は以下の発明に関する。
（１） 所望の赤血球介在型感染性微生物による感染、培養および／又は評価に適した細胞を決定する方法であって、
血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物を調製すること、
前記細胞に前記微生物を感染させること、
前記微生物が感染した細胞を選択すること、
選択された細胞の分化の程度を判定すること、および
判定された分化の程度の細胞を所望の赤血球介在型感染性微生物による感染、培養および／又は評価に適した細胞として決定することを含む方法。
（２） 前記、前記微生物が感染した細胞を選択する工程が、前記微生物が感染した細胞のうち、最も生存率の高い細胞を選択することにより行われる、（１）に記載の方法。
（３） 前記微生物が、原虫である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記微生物が、マラリア原虫である、（３）に記載の方法。
（５） 前記微生物が、熱帯熱マラリア原虫である、（４）に記載の方法。
（６） 前記血球前駆細胞が、不死化した血球前駆細胞である、（１）～（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７） 前記赤血球前駆細胞が、ヘモグロビンを産出し、かつ、ＣＤ２３５ａ陽性である前駆細胞である、（６）に記載の方法。
（８） 赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物が、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞との混合物である、（１）～（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９） 細胞培養の培地中に、選択時の細胞生存率が感染前の生存細胞数の８０％以上となるように糖およびアルブミンを添加し、又はｐＨを調整することを含む、（１）～（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０） 前記糖がグルコースである、（９）に記載の方法。
（１１） 前記糖の濃度が、１５０ｍｇ／ｍｌ以上である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２） 前記糖の濃度が、１５０ｍｇ／ｍｌ以上５００ｍｇ／ｍｌ以下である、（１１）に記載の方法。
（１３） 前記アルブミンの濃度が０．５～２．０％である、（９）～（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４） 血球前駆細胞の赤血球細胞へ分化誘導がドキシサイクリンを含有しない培地で血球前駆細胞を培養することにより行われる、（１）～（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５） 所望の赤血球介在型感染性微生物を維持培養する方法であって、
血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物を調製すること、
前記細胞に前記微生物を感染させること、
感染した細胞の分化の程度から所望の赤血球介在型感染性微生物による感染および培養に適した細胞を選択すること、
選択された細胞を回収すること、
回収された細胞を培養すること含む方法。
（１６） マラリア原虫を培養する方法であって、有核赤血球にマラリア原虫を感染させること、および感染させた有核赤血球を培養することを含む方法。
（１７） 前記有核赤血球が血球前駆細胞をドキシサイクリンを含有しない培地で９日間以上培養して得られる細胞である、（１６）に記載の方法。
（１８） マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫である、（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９） （１）～（１４）のいずれか１項に記載の方法により決定された、前記所望の赤血球介在型感染性微生物の培養に用いるための血球様細胞。
（２０） 不死化した血球前駆細胞から分化誘導された細胞群であって、ＣＤ２３５ａ陽性の赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞を含有し、前記分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞が少なくとも、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞とを含む、細胞組成物。
（２１） 所望の赤血球介在型感染性微生物による感染、培養および／又は評価に適した細胞をスクリーニングするためのキットであって、（２０）に記載の細胞組成物を含有するキット。
Specifically, the present invention relates to the following inventions.
(1) A method for determining cells suitable for infection, culture and/or evaluation with a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism comprising:
Preparing a mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythrocyte progenitor cells to enucleated erythrocytes by inducing differentiation of hemocyte progenitor cells into erythroid cells;
infecting the cell with the microorganism;
selecting cells infected with said microorganism;
determining the degree of differentiation of selected cells; and determining cells of the determined degree of differentiation as cells suitable for infection, culture and/or evaluation with a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism. .
(2) The method according to (1), wherein the step of selecting cells infected with the microorganism is performed by selecting cells with the highest survival rate among the cells infected with the microorganism.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the microorganism is a protozoan.
(4) The method according to (3), wherein the microorganism is Plasmodium.
(5) The method according to (4), wherein the microorganism is Plasmodium falciparum.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the blood cell progenitor cells are immortalized blood cell progenitor cells.
(7) The method according to (6), wherein the erythrocyte progenitor cells are hemoglobin-producing and CD235a-positive progenitor cells.
(8) Any one of (1) to (7), wherein the mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythroid progenitor cells to enucleated erythrocytes is a mixture of DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cells. The method described in .
(9) adding sugar and albumin to the medium for cell culture, or adjusting the pH so that the cell viability at the time of selection is 80% or more of the number of viable cells before infection; (1) The method according to any one of (8).
(10) The method according to (9), wherein the sugar is glucose.
(11) The method according to (9) or (10), wherein the sugar concentration is 150 mg/ml or more.
(12) The method according to (11), wherein the sugar concentration is 150 mg/ml or more and 500 mg/ml or less.
(13) The method according to any one of (9) to (12), wherein the concentration of albumin is 0.5-2.0%.
(14) The method according to any one of (1) to (13), wherein differentiation of blood cell progenitor cells into erythroid cells is induced by culturing the blood cell progenitor cells in a doxycycline-free medium.
(15) A method for maintaining and culturing a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism, comprising:
Preparing a mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythrocyte progenitor cells to denucleated erythrocytes by inducing differentiation of hemocyte progenitor cells into erythroid cells;
infecting the cell with the microorganism;
selecting cells suitable for infection and culture with the desired erythrocyte-mediated infectious microorganism from the degree of differentiation of the infected cells;
recovering the selected cells;
A method comprising culturing the harvested cells.
(16) A method of culturing malaria parasites, comprising infecting nucleated red blood cells with malaria parasites and culturing the infected nucleated red blood cells.
(17) The method according to (16), wherein the nucleated red blood cells are cells obtained by culturing blood cell progenitor cells in a doxycycline-free medium for 9 days or more.
(18) The method according to (16) or (17), wherein the malaria parasite is Plasmodium falciparum.
(19) Blood cell-like cells for use in culturing the desired erythrocyte-mediated infectious microorganism determined by the method according to any one of (1) to (14).
(20) A group of cells induced to differentiate from immortalized hemocyte progenitor cells, containing at least two types of cells with different degrees of differentiation from CD235a-positive erythroid progenitor cells to enucleated erythrocytes, wherein the degree of differentiation is A cell composition, wherein at least two different types of cells comprise at least DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cells.
(21) A kit for screening cells suitable for infection, culture and/or evaluation with a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism, the kit comprising the cell composition of (20).
本発明により、血球を介在する広範な感染症において、赤血球介在型感染性微生物の研究・評価が可能となる。例えば、ヒト献血由来の血球材料では培養・評価が難しく研究することが難しかった疾患に対しても、本発明を使用することで培養・評価が可能になり、感染症研究・感染症薬・ワクチン開発を行うことが可能となる。また、感染率や生存率から感染細胞を決定し、当該細胞が得られるよう分化条件等を最適化させることで、当該細胞を人工的に大量に調製することができる。更に、分化条件、例えば分化日数を変化させることにより、種々の混在する細胞や状態を作り出せる。これにより、赤血球介在型感染性微生物の感染に適した赤血球の分化の程度が不明である場合でも感染および培養することができる。更には、当該赤血球介在型感染性微生物に最適な状態の細胞群を決定することができる。さらに、赤血球様細胞群の中の感染に適した細胞あるいはその群の遺伝子、表面マーカーや形状などを精査することで、新たなメカニズムや創薬ターゲットを見出すことが可能になり、感染症研究を進捗させ、新薬開発やワクチン開発に役立てることが可能となる。また、赤血球様細胞群を使用することで、血液を使用した感染症薬の開発において、赤血球細胞群間の誤差の少ない薬剤スクリーニング評価を可能にする。スクリーニングに使用する被検化合物としては、特に制限はなく、低分子化合物のみならずペプチドや抗体などでも評価可能である。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ヒト赤血球様細胞群を使用した評価が可能な感染症研究においては、例えば使用動物に免疫不全マウスなどを用いヒト赤血球系細胞を用いた評価ができる環境下などでは、特に制限することなく評価することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention enables research and evaluation of erythrocyte-mediated infectious microorganisms in a wide range of infectious diseases mediated by blood cells. For example, the use of the present invention enables culturing and evaluation of diseases that have been difficult to culture and evaluate with blood cell materials derived from human blood donations, making it possible to study infectious diseases, infectious disease drugs, and vaccines. Development is possible. In addition, by determining infected cells from the infection rate and survival rate and optimizing the differentiation conditions and the like so as to obtain the cells, the cells can be artificially prepared in large quantities. Furthermore, by changing the differentiation conditions, such as the number of days of differentiation, various mixed cells and states can be produced. This allows infection and culture even when the degree of red blood cell differentiation suitable for infection with red blood cell-mediated infectious microorganisms is unknown. Furthermore, it is possible to determine the cell population in the optimal state for the erythrocyte-mediated infectious microorganism. Furthermore, close examination of the cells suitable for infection in the erythroid cell group or the genes, surface markers, shapes, etc. of the group will make it possible to discover new mechanisms and drug discovery targets, which will lead to the development of infectious disease research. It will be possible to make progress and use it for new drug development and vaccine development. In addition, by using the erythroid cell group, drug screening evaluation with less error between erythroid cell groups becomes possible in the development of drugs for infectious diseases using blood. The test compound used for screening is not particularly limited, and not only low-molecular-weight compounds but also peptides and antibodies can be evaluated. In addition, not only in vitro but also in vivo, in infectious disease research that can be evaluated using human erythroid cells, for example, immunodeficient mice can be used for evaluation using human erythroid cells. It can be evaluated without any particular limitation under environmental conditions.
一態様において、本発明は、所望の赤血球介在型感染性微生物による感染に適した細胞を決定する方法であって、
血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物を調製すること、
前記細胞に前記微生物を感染させること、
前記微生物が感染した細胞を選択すること、
選択された細胞の分化の程度を判定すること、および
決定された分化の程度の細胞を所望の赤血球介在型感染性微生物による感染に適した細胞として決定することを含む方法に関する。
In one aspect, the invention provides a method for determining cells suitable for infection by a desired erythrocyte-mediated infectious organism, comprising:
Preparing a mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythrocyte progenitor cells to enucleated erythrocytes by inducing differentiation of hemocyte progenitor cells into erythroid cells;
infecting the cell with the microorganism;
selecting cells infected with said microorganism;
determining the degree of differentiation of selected cells; and determining cells of the determined degree of differentiation as cells suitable for infection by a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism.
＜赤血球介在型感染性微生物＞
本明細書において、「赤血球介在型感染性微生物」とは、その生存・増殖過程において赤血球への感染が含まれるウィルス、菌、および原虫などを意味する。このような赤血球介在型感染性微生物としては、マラリアを引き起こすプラスモジウム属の原虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、鳥マラリア、猿マラリア、偶蹄類マラリアなどのマラリア原虫、バベシア属の原虫、タイレリア属の原虫、パルボウィルスなどが含まれる。
<Erythrocyte-mediated infectious microorganisms>
As used herein, the term "erythrocyte-mediated infectious microorganisms" means viruses, fungi, protozoa, and the like that involve infection of red blood cells during their survival and proliferation processes. Examples of such erythrocyte-mediated infectious microorganisms include protozoa of the genus Plasmodium that cause malaria, such as Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, avian malaria, monkey malaria, Malaria parasites such as artiodactyl malaria, protozoa of the genus Babesia, protozoa of the genus Theileria, and parvoviruses are included.
＜赤血球前駆細胞＞
本発明に使用する赤血球前駆細胞は、ヘモグロビンを産出し、かつ、ＣＤ２３５ａ陽性である前駆細胞であり、好ましくは、不死化されたヒト赤血球前駆細胞であり、特に制限はなく公知の手法を適宜選択して作製することができる。例えば、増殖に関与する遺伝子を導入しておき、外的刺激に応答して発現調整させ、長期に渡り増殖を行う方法などが報告されている。また、ＭｙｃやＢｃｌ遺伝子群など増殖に関与する遺伝子や、ヒトパピローマウィルス１６型遺伝子群などを導入し外的刺激に応答して発現を調節する方法や、初期化する４因子（ｃＭｙｃ，Ｏｃｔ４，Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２）の一部とｐ５３ｓｈＲＮＡを導入する方法により不死化ヒト赤血球前駆細胞を作製する方法が報告されており、これらを選択して作製することもできる。「赤血球前駆細胞」は、赤血球系細胞への分化能のみを有し、他の血液系細胞、例えば血小板・白血球などへの分化能を喪失している細胞を意味する。また、「ヒト不死化赤血球前駆細胞株」は、遺伝子等の発現操作などにより、細胞***を無制限に繰り返すことのできる、ヒト赤血球前駆細胞を意味する。
<Erythrocyte progenitor cells>
The erythrocyte progenitor cells used in the present invention are progenitor cells that produce hemoglobin and are CD235a positive, preferably immortalized human erythroid progenitor cells. can be made by For example, a method has been reported in which a gene involved in proliferation is introduced, the expression is adjusted in response to an external stimulus, and the cell proliferates over a long period of time. In addition, a method of introducing genes involved in proliferation such as Myc and Bcl gene clusters, a human papillomavirus type 16 gene cluster and the like to regulate expression in response to external stimuli, and four reprogramming factors (cMyc, Oct4, Klf4 , Sox2) and p53 shRNA have been reported to produce immortalized human erythroid progenitor cells, and these cells can also be selected and produced. "Erythrocyte progenitor cells" means cells that have only the ability to differentiate into erythroid cells and have lost the ability to differentiate into other blood lineage cells, such as platelets and leukocytes. In addition, "human immortalized erythrocyte progenitor cell line" means human erythrocyte progenitor cells that can repeat cell division indefinitely by gene expression manipulation or the like.
「赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物」とは、赤血球系の細胞に見られる表面マーカーであるＣＤ２３５ａやＣＤ７１は発現しているものの、その発現割合が混在している細胞を意味する。つまりそれは赤血球に分化していく過程にある細胞群ではあるが、未熟な細胞、例えばより赤芽球に近い細胞、から成熟に近い細胞、例えば脱核赤血球までが混在する。本混合物は、脱核赤血球まで分化していない赤血球様細胞を含む。好ましくは、本細胞混合物は、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞との混合物である。 "A mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythroid progenitor cells to enucleated erythrocytes" means that CD235a and CD71, which are surface markers found in erythroid cells, are expressed, but the expression ratio is Means mixed cells. In other words, although it is a group of cells in the process of differentiating into erythrocytes, immature cells, such as cells closer to erythroblasts, and cells closer to maturity, such as denucleated erythrocytes, coexist. The mixture contains erythroid cells that have not differentiated to enucleated red blood cells. Preferably, the cell mixture is a mixture of DRAQ5-positive and DRAQ5-negative cells.
血球前駆細胞から赤血球細胞への分化誘導は、外的刺激を除去し、強制発現させていた細胞増殖能を低下させることにより徐々に赤血球様細胞へと分化誘導を行い調製することができる。例えば、テトラサイクリン発現誘導システムを組み込んだ場合はドキシサイクリン刺激を除去した環境下、培地や栄養細胞との共培養などにより、ヒト赤血球様細胞群を調整することができる。例えば、研究対象としてマラリア原虫を使用する場合、通常１～３０日間、好ましくは９～１８日間培養する。分化条件、例えば分化日数は、目的とする赤血球介在型感染性微生物に応じて適宜選択することができる。 Differentiation induction from blood cell progenitor cells to erythroid cells can be prepared by gradually inducing differentiation into erythroid cells by removing external stimuli and reducing the cell proliferation ability that has been forcibly expressed. For example, when a tetracycline expression induction system is incorporated, a human erythroid cell group can be prepared by co-culturing with a medium or nutrient cells under an environment where doxycycline stimulation is removed. For example, when malaria parasites are used as research subjects, they are usually cultured for 1 to 30 days, preferably 9 to 18 days. Differentiation conditions, for example, the number of days for differentiation, can be appropriately selected according to the target erythrocyte-mediated infectious microorganism.
赤血球前駆細胞から赤血球細胞への分化誘導に用いられる培地としては、例えばＩＭＤＭ溶液、ＲＰＭＩ溶液、α－ＭＥＭ溶液、ＤＭＥＭ溶液が挙げられる。培養に添加できる成分としては、ヒト血漿タンパク質画分、ウシ胎児やヒト血清、グルコース・Ｄ－マンニトールなど糖類、バリンなどアミノ酸、アデニンなど核酸塩基、リン酸水素ナトリウム、ミフェプリストン、α－トコフェロール、リノール酸、コレステロール、亜セレン酸ナトリウム、ヒトホロトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミン、２－メルカプトエタノール、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ等が含まれていてもよい。更に必要に応じ、抗生物質や無機塩類を加えてもよい。 Examples of the medium used for inducing the differentiation of erythroid progenitor cells into erythroid cells include IMDM solution, RPMI solution, α-MEM solution, and DMEM solution. Components that can be added to the culture include human plasma protein fractions, fetal bovine serum and human serum, sugars such as glucose and D-mannitol, amino acids such as valine, nucleic acid bases such as adenine, sodium hydrogen phosphate, mifepristone, α-tocopherol, Linoleic acid, cholesterol, sodium selenite, human holotransferrin, human insulin, ethanolamine, 2-mercaptoethanol, EPO, TPO, SCF and the like may be included. Further, if necessary, antibiotics and inorganic salts may be added.
また、赤血球細胞に分化誘導させる際、調製する細胞群の分化の進み具合の構成比を変化させるために栄養細胞との共培養を行ってもよい。共培養の期間は、分化誘導期間と同じ期間に限定されるものではない。栄養細胞としては、骨髄系細胞や繊維芽細胞、例えば、ＯＰ９細胞、ＭＳ－５細胞、ＭＥＦ、ＳＮＬ７６／７細胞、ＰＡ６細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｍ１５細胞、１０Ｔ１／２細胞等が挙げられる。これら栄養細胞は、細胞***停止薬剤（マイトマイシンＣ等）の処理や放射線照射により細胞***を停止させたものを使用する事が好ましい。 In addition, when inducing differentiation into erythrocytes, co-cultivation with nutrient cells may be performed in order to change the composition ratio of the cell group to be prepared according to the progress of differentiation. The co-culture period is not limited to the same period as the differentiation induction period. Nutrient cells include myeloid cells and fibroblasts such as OP9 cells, MS-5 cells, MEFs, SNL76/7 cells, PA6 cells, NIH3T3 cells, M15 cells and 10T1/2 cells. It is preferable to use vegetative cells whose cell division has been stopped by treatment with a cell division arresting agent (such as mitomycin C) or irradiation.
また、２種類以上の異なる分化条件（例えば、分化日数）で調製することにより、２種類以上の異なる混在比のヒト赤血球様細胞群を調製することもできる。 In addition, human erythroid cell populations with two or more different mixing ratios can be prepared by preparing under two or more different differentiation conditions (for example, differentiation days).
一態様において、本発明は、上述の方法により調製された、不死化した血球前駆細胞から分化誘導された細胞群であって、ＣＤ２３５ａ陽性の赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞を含有し、前記分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞が少なくとも、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞とを含む、細胞組成物に関する。本細胞組成物は、任意の赤血球介在型感染性微生物の感染に適した分化段階の細胞を決定するために用いることができる。また、本細胞組成物は、赤血球細胞を媒介とする微生物の研究に用いることもできる。 In one aspect, the present invention provides a cell group induced to differentiate from immortalized hemocyte progenitor cells prepared by the method described above, wherein at least different degrees of differentiation from CD235a-positive erythroid progenitor cells to denucleated erythrocytes The present invention relates to a cell composition containing two types of cells, wherein the at least two types of cells with different degrees of differentiation include at least DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cells. The cell compositions can be used to determine differentiation stage cells suitable for infection with any erythrocyte-mediated infectious organism. The cell compositions can also be used in red blood cell-mediated microbial studies.
更に、本発明は、前段落記載の細胞組成物を含有する、所望の赤血球介在型感染性微生物による感染、培養および／又は評価に適した細胞をスクリーニングするためのキットに関する。当該キットは、前記細胞組成物の他、パッケージ、説明書を含んでいてもよい、また任意で培養用培地や培養添加物を含んでいてもよい。 Furthermore, the present invention relates to a kit for screening cells suitable for infection, culture and/or evaluation with a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism containing the cell composition described in the preceding paragraph. In addition to the cell composition, the kit may contain a package, instructions, and optionally culture medium and culture additives.
細胞混合物への赤血球介在型感染性微生物の感染および感染した細胞の選択は、調製した細胞混合物を含む培地を遠心分離させ、ペレット状にして得られた細胞を用いて、生体血液を使用した感染症研究と同様の公知の方法で行うことができる。例えば、マラリア原虫感染研究の場合、調整した細胞混合物を、あらかじめマラリア原虫が感染した赤血球が存在する９６穴プレートなどの評価ウェルに添加し、一定時間培養後、例えば２４、４８，又は７２時間後に、ギムザ染色による固定化と顕微鏡観察により、又は、抗体などを用いたフローサイトメトリー解析により行うことができる。更に、感染した細胞の選択は、細胞又は原虫の生存率の高い細胞を選ぶことにより行うことができる。２種類以上の異なる赤血球様細胞群に感染させた場合、その結果を比較・統合することにより、どの状態の赤血球様細胞もしくは細胞群が感染研究に適しているかを決定してもよい。 Infection of the cell mixture with erythrocyte-mediated infectious organisms and selection of infected cells involves centrifuging the medium containing the prepared cell mixture and pelleting the resulting cells for infection using living blood. It can be performed by a known method similar to disease research. For example, in the case of malaria parasite infection studies, the adjusted cell mixture is added to an evaluation well such as a 96-well plate in which erythrocytes previously infected with malaria parasite are present, and cultured for a period of time, such as 24, 48, or 72 hours. , immobilization by Giemsa staining and microscopic observation, or flow cytometric analysis using an antibody or the like. In addition, selection of infected cells can be performed by selecting cells or cells with high protozoan viability. When infected with two or more different erythroid cell populations, the results may be compared and combined to determine which erythroid cells or cell populations are suitable for infection studies.
感染を行う際の培地としては、例えばＩＭＤＭ溶液、ＲＰＭＩ溶液、α－ＭＥＭ溶液、ＤＭＥＭ溶液が挙げられる。また、添加物として、ヒトまたはウシ血漿タンパク質画分、ウシ胎児血清やヒト血清、グルコース、Ｄ－マンニトールなど糖類、アミノ酸、アデニンなど核酸塩基、リン酸水素ナトリウム、α－トコフェロール、リノール酸、コレステロール、亜セレン酸ナトリウム、ヒトホロトランスフェリン、ヒトインスリン、エタノールアミン、２－メルカプトエタノール、ＥＰＯ、ＴＰＯ等が含まれていてもよい。更に必要に応じ無機塩類を加えてもよい。好ましくは、細胞培養の培地中に、選択時の細胞生存率が感染前の生存細胞数の８０％以上となるように糖（好ましくは、グルコース）およびアルブミンを添加し、又はｐＨを調整する。ここで、添加される糖の濃度としては、１５０ｍｇ／ｍｌ以上とすることができ、好ましくは、１５０ｍｇ／ｍｌ以上５００ｍｇ／ｍｌ以下である。また、添加されるアルブミンの濃度は、０．５～２．０％とすることができる。 Examples of media for infection include IMDM solution, RPMI solution, α-MEM solution, and DMEM solution. In addition, as additives, human or bovine plasma protein fractions, fetal bovine serum and human serum, glucose, sugars such as D-mannitol, amino acids, nucleic acid bases such as adenine, sodium hydrogen phosphate, α-tocopherol, linoleic acid, cholesterol, Sodium selenite, human holotransferrin, human insulin, ethanolamine, 2-mercaptoethanol, EPO, TPO, and the like may also be included. Furthermore, inorganic salts may be added as necessary. Preferably, sugar (preferably glucose) and albumin are added to the medium for cell culture, or the pH is adjusted so that the cell viability at the time of selection is 80% or more of the number of viable cells before infection. Here, the concentration of sugar to be added can be 150 mg/ml or more, preferably 150 mg/ml or more and 500 mg/ml or less. Also, the concentration of albumin to be added can be 0.5 to 2.0%.
選択された細胞の分化の程度の判定は、例えば、形態観察（有核か脱核かなど）や表面マーカー分析により行うことができる。分化の程度は厳密に判定する必要はなく、例えば、有核赤血球又は脱核赤血球のいずれであるかを決定することにより決定されてもよい。また、ＦＡＣＳ解析などの表面抗原解析やＤＮＡアレイなどの遺伝子解析により、細胞を決定することもできる。 The degree of differentiation of the selected cells can be determined, for example, by morphological observation (nucleated or enucleated, etc.) and surface marker analysis. The degree of differentiation need not be strictly determined, and may be determined, for example, by determining whether it is a nucleated or enucleated red blood cell. Cells can also be determined by surface antigen analysis such as FACS analysis or genetic analysis such as DNA array.
別の態様において、本発明は、上述の方法により決定された、前記所望の赤血球介在型感染性微生物の培養に用いるための血球様細胞に関する。当該細胞は、有核赤血球又は脱核赤血球のいずれであるか、分化誘導期間、表面マーカーＣＤ２３５ａやＣＤ７１の発現割合、およびＤＲＡＱ５陽性か陰性かのいずれか１種類の特徴又は任意の数の特徴の組み合わせにより定義されていてもよい。 In another aspect, the invention relates to blood cell-like cells for use in culturing said desired erythrocyte-mediated infectious microorganism determined by the method described above. The cells are either nucleated red blood cells or enucleated red blood cells, differentiation induction period, surface marker CD235a and CD71 expression ratio, and DRAQ5 positive or negative Any one type of characteristic or any number of characteristics It may be defined by a combination.
別の態様において、本発明は、所望の赤血球介在型感染性微生物を維持培養する方法であって、
血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、赤血球前駆細胞から脱核赤血球まで分化の程度の異なる少なくとも２種類の細胞の混合物を調製すること、
前記細胞に前記微生物を感染させること、
感染した細胞の分化の程度から所望の赤血球介在型感染性微生物による感染および培養に適した細胞を選択すること、
選択された細胞を回収すること、
回収された細胞を培養すること含む方法に関する。
In another aspect, the present invention provides a method for maintaining and culturing a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism, comprising:
Preparing a mixture of at least two types of cells with different degrees of differentiation from erythrocyte progenitor cells to enucleated erythrocytes by inducing differentiation of hemocyte progenitor cells into erythroid cells;
infecting the cell with the microorganism;
selecting cells suitable for infection and culture with a desired erythrocyte-mediated infectious microorganism from the degree of differentiation of the infected cells;
recovering the selected cells;
A method comprising culturing harvested cells.
本発明の赤血球介在型感染性微生物を維持培養する方法において、細胞混合物の調製、微生物の感染、並びに、感染および培養に適した細胞の選択は、上述の所望の赤血球介在型感染性微生物による感染に適した細胞を決定する方法に準じて行うことができる。選択された細胞の回収は、当該細胞に特異的な表現型や表面マーカーを利用して当業者周知の細胞回収方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーやフローサイトメトリーを利用して回収することができる。 In the method for maintaining and culturing an erythrocyte-mediated infectious microorganism of the present invention, the preparation of a cell mixture, infection with a microorganism, and selection of cells suitable for infection and culture involve infection with the desired erythrocyte-mediated infectious microorganism described above. It can be performed according to the method for determining cells suitable for The selected cells can be collected using cell collection methods well known to those skilled in the art, such as affinity chromatography and flow cytometry, using phenotypes and surface markers specific to the cells.
また、本発明は、マラリア原虫を培養する方法であって、有核赤血球にマラリア原虫を感染させること、および感染させた有核赤血球を培養することを含む方法に関する。好ましくは、本方法における有核赤血球は、ドキシサイクリンを含有しない培地中で血球前駆細胞を９日間以上培養して得られる有核赤血球である。 The present invention also relates to a method of culturing malaria parasites, comprising infecting nucleated red blood cells with malaria parasites and culturing the infected nucleated red blood cells. Preferably, the nucleated red blood cells in this method are nucleated red blood cells obtained by culturing blood cell progenitor cells in a doxycycline-free medium for 9 days or more.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本実施例において用いた細胞、培養液およびマラリア原虫は以下の通りである。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail based on examples below, but the present invention is not limited to the following examples. All documents cited throughout this application are hereby incorporated by reference in their entirety. In addition, the cells, culture medium, and malaria parasites used in this example are as follows.
（不死化赤血球前駆細胞株）
ヒト不死化赤血球前駆細胞は、既報を参考に作製した。詳しくは、多能性幹細胞より誘導した赤血球前駆細胞に、マウス不死化造血幹細胞として報告されている遺伝子（Ｍｙｃ，Ｍｙｂ，Ｈｏｂ８，ＴＬＸ１，Ｅ２Ａ－ｐｂｘ１，ＭＬＬ，Ｌｊｘ２，ＲＡＲＡ，Ｈｏｘａ９，Ｎｏｔｃｈ１，ｖ－ｒａｆ／ｖ－ｍｙｃ，ＭＹＳＴ３－ＮＣＯＡ２，Ｅｖｉ１，ＨＯＸＢ６，ＨＯＸＢ４，β－ｃａｔｅｎｉｎ，Ｉｄ１）もしくは、ヒト不死化赤血球前駆細胞報告にある遺伝子を導入し作製した。不死化赤血球前駆細胞株の維持は、ドキシサイクリンの添加有無による不死化遺伝子の発現制御で行った。作製したヒト不死化赤血球前駆細胞株は、１×１０６個ずつ凍結ストックし、２０継代を目処に新しい細胞に交換した。冷凍ストックから起こした細胞は、２継代以上維持培養を行い、細胞の状態回復を観察したのちに、分化誘導へと使用した。不死化赤血球前駆細胞の維持は、既報の方法を参考に、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン、１０ＩＵ／ｍｌ ＥＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１５％ＦＢＳ，１％ＩＴＳ，１％ＰＳＧ，０．１％アスコルビン酸，０．１％ＭＴＧ含有ＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）（以下、「ドキシサイクリン含有培地」という）を用いて、３７℃５％ＣＯ２インキュベータにて培養し、３日に一度培地交換を行うことで維持した。
(immortalized erythrocyte progenitor cell line)
Human immortalized erythroid progenitor cells were prepared with reference to previous reports. Specifically, genes reported as immortalized mouse hematopoietic stem cells (Myc, Myb, Hob8, TLX1, E2A-pbx1, MLL, Ljx2, RARA, Hoxa9, Notch1, v -raf/v-myc, MYST3-NCOA2, Evi1, HOXB6, HOXB4, β-catenin, Id1) or genes reported in human immortalized erythrocyte progenitor cells. The immortalized erythroid progenitor cell line was maintained by controlling the expression of the immortalizing gene with or without the addition of doxycycline. The prepared human immortalized erythrocyte progenitor cell lines were frozen stocked at 1×10 6 cells and replaced with new cells at around 20 passages. The cells raised from the frozen stock were maintained and cultured for two or more passages, and after observing the state recovery of the cells, they were used for induction of differentiation. For maintenance of immortalized erythroid progenitor cells, 1 μg/ml doxycycline, 10 IU/ml EPO, 50 ng/ml SCF, 15% FBS, 1% ITS, 1% PSG, 0.1% ascorbic acid, Using an IMDM solution containing 0.1% MTG (manufactured by SIGMA) (hereinafter referred to as "doxycycline-containing medium"), culture in a 37°C 5% CO 2 incubator, and maintain by exchanging the medium once every 3 days. did.
（フィーダー細胞）
ヒト赤血球様細胞群を調製するためにフィーダー細胞を使用する方法もある。赤血球細胞の調製を支援するフィーダー細胞としては、ＭＳ－５、１０Ｔ１／２、ＯＰ－９細胞などが用いられることが多い。本実施例に用いたヒト赤血球用細胞群を調製するために、ＯＰ－９細胞（ＡＴＣＣ社）を使用した。ＯＰ－９細胞の維持培養は、同社技術資料に基づき２０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）にて行った。ＯＰ－９細胞をフィーダー細胞として使用する際、あらかじめマイトマイシンで増殖しないよう処置したものをディッシュに播種し使用した。ヒト赤血球用細胞群調製の際、培地交換ごとにフィーダー細胞を交換しても構わないが、分化終了時まで交換することなく同じフィーダー細胞を使用した。
(feeder cells)
There is also a method of using feeder cells to prepare human erythroid cell populations. MS-5, 10T1/2, OP-9 cells and the like are often used as feeder cells to support the preparation of red blood cells. OP-9 cells (ATCC) were used to prepare the human erythrocyte cell group used in this example. The OP-9 cells were maintained and cultured in a 20% FBS-containing α-MEM solution (manufactured by SIGMA) based on the company's technical data. When OP-9 cells were used as feeder cells, the cells were previously treated with mitomycin to prevent proliferation and then seeded on a dish. During the preparation of the human erythrocyte cell group, the feeder cells may be replaced each time the medium is replaced, but the same feeder cells were used without replacement until the end of differentiation.
（ヒト赤血球様細胞群の調製法）
ヒト赤血球様細胞群の調製は、ヒト不死化赤血球前駆細胞を目的の細胞数に拡大培養した後、フィーダー細胞なしあるいはフィーダー細胞（ＯＰ－９細胞など）上で、不死化遺伝子の発現制御することで行った。より詳しくはドキシサイクリンを含まない（ドキシサイクリン非含有とすることで、不死化遺伝子の発現が制御され分化へと進む）、１０ＩＵ／ｍｌ ＥＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１５％ＦＢＳ，１％ＩＴＳ，１％ＰＳＧ，０．１％アスコルビン酸，０．１％ＭＴＧ含有ＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）（以下、「ドキシサイクリン非含有分化培地」という）を用いて調製した。調製はバックやリアクターでも可能であるが、１０ｃｍもしくは１５ｃｍディッシュを数枚用いた。まず、１×１０８個以上のヒト赤血球様細胞群を調製するため、あらかじめ不死化赤血球前駆細胞を１～２週間かけ必要細胞数の２～５倍量程度までドキシサイクリン含有培地を用いて拡大培養した。その後、培地をドキシサイクリン非含有分化培地に交換した不死化赤血球前駆細胞を１５ｃｍディッシュ数枚に播種し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２下で、インキュベータにて３日に１度、ドキシサイクリン非含有培地に交換した。必要に応じて培地交換ごとにフィーダー細胞を新しいものに交換し、また分化段階において培地交換時に測定する細胞数に合わせディッシュのサイズも１５ｃｍから１０ｃｍへ変更し、任意の分化日数の持つヒト赤血球様細胞群を調製した。
(Method for preparing human erythroid cell group)
The human erythroid cell group is prepared by expanding human immortalized erythroid progenitor cells to the desired number of cells, and then controlling the expression of the immortalizing gene without feeder cells or on feeder cells (OP-9 cells, etc.). I went with More specifically, it does not contain doxycycline (by not containing doxycycline, the expression of the immortalizing gene is controlled and differentiation proceeds), 10 IU/ml EPO, 50 ng/ml SCF, 15% FBS, 1% ITS, 1% It was prepared using an IMDM solution containing PSG, 0.1% ascorbic acid, and 0.1% MTG (manufactured by SIGMA) (hereinafter referred to as "doxycycline-free differentiation medium"). Several 10 cm or 15 cm dishes were used, although the preparation could be done in a bag or reactor. First, in order to prepare a human erythroid cell population of 1×10 8 or more, immortalized erythroid progenitor cells are cultured in advance using doxycycline-containing medium for 1 to 2 weeks to 2 to 5 times the required number of cells. did. After that, the medium was replaced with a doxycycline-free differentiation medium, and the immortalized erythroid progenitor cells were seeded in several 15 cm dishes and placed in an incubator under 5% CO 2 and 5% O 2 once every 3 days without doxycycline. changed to medium. If necessary, the feeder cells are replaced with new ones every time the medium is replaced, and the size of the dish is changed from 15 cm to 10 cm according to the number of cells to be measured at the time of medium replacement in the differentiation stage. A cell population was prepared.
（調製した細胞の確認法）
調製した細胞がヒト赤血球様細胞であること、分化段階が混在していることなどを確認するために、細胞濃縮による色の評価、表面マーカーの測定、ギムザ染色などによる形態観察などを感染評価前に行った。細胞濃縮による色の評価は、遠沈管で細胞を回収した際の目視における細胞の色で測定した。表面マーカー測定は、ＣＤ７１抗体、ＣＤ２３５ａ抗体、並びにＤＲＡＱ５（いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて、ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社のフローサイトメーターＣａｎｔｏＩＩを使用して行った。また染色については、市販の染色液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、公知の染色法に基づきギムザ染色もしくはメイギムザ染色をし、光学顕微鏡（４００～１０００倍）にて測定した。
(Confirmation method of prepared cells)
In order to confirm that the prepared cells are human erythroid cells and that the differentiation stages are mixed, color evaluation by cell concentration, measurement of surface markers, morphological observation by Giemsa staining, etc. are performed before infection evaluation. went to Evaluation of the color by cell concentration was measured by visually observing the color of the cells when the cells were collected in a centrifuge tube. Surface marker measurements were performed using a CD71 antibody, a CD235a antibody, and DRAQ5 (both from Biolegend) using a flow cytometer CantoII from BD Bioscience. As for staining, Giemsa staining or May Giemsa staining was performed using a commercially available staining solution (Sigma) based on a known staining method, and measurement was performed with an optical microscope (400 to 1000 times).
（ヒト赤血球様細胞群の感染評価施設への移送）
ヒト赤血球様細胞群の調製施設と感染評価施設が同一施設にあるのが望ましいが、移送が必要な場合もある。調製したヒト赤血球様細胞群を感染評価施設へ移送する場合、下記条件で移送した。調製した赤血球用細胞群を、移送開始直前に各１×１０８個程度をＴ－２５フラスコに移し替え、ドキシサイクリン非含有分化培地で満たし容器を密閉した状態でバイオパウチに内包したのちｉＰ－ＴＥＣプレミアボックス（サンプラテック社）に入れ移送した。実施例における細胞移送は、同ボックスの恒温剤により３６℃前後で行った。また、密閉せずフィルターキャップを使用する場合には、バイオパウチにアネロパック（三菱ガス株式会社製）を同封しＯ２並びにＣＯ２濃度を制御しながら輸送した。
(Transfer of human erythroid cell group to infection evaluation facility)
Although it is preferable that the human erythroid cell population preparation facility and the infection assessment facility be in the same facility, transportation may be necessary. When transporting the prepared human erythroid cell group to the infection evaluation facility, it was transported under the following conditions. About 1×10 8 cells of the prepared erythrocyte cell group were transferred to a T-25 flask just before the start of transfer, filled with a doxycycline-free differentiation medium, enclosed in a biopouch with the container sealed, and then iP-TEC. It was transported in a premier box (Sun Platec). Cell transfer in the examples was carried out at around 36° C. with a thermostat in the same box. When a filter cap was used without sealing, an aneropack (manufactured by Mitsubishi Gas Co., Ltd.) was enclosed in the biopouch and transported while controlling the O 2 and CO 2 concentrations.
（ヒト赤血球様細胞群の使用）
移送先到着後、速やかにヒト赤血球様細胞群をＴ－２５フラスコから遠沈管に移し替え、回収した細胞を評価に使用した。即時使用しない場合においては、分化状態・混在割合は変化するもののディッシュに移し替え、３日おきにドキシサイクリン非含有分化培地で交換し、培養を継続するか、あるいは即時使用時と類似の分化状態・混在割合にするため冷蔵保存した。
(Use of human erythroid cell group)
After arriving at the transfer destination, the human erythroid cell group was promptly transferred from the T-25 flask to a centrifuge tube, and the recovered cells were used for evaluation. If the cells are not used immediately, the cells are transferred to a dish although the differentiation state and mixing ratio may change, and the culture medium is replaced with a doxycycline-free differentiation medium every three days to continue culturing. It was refrigerated to obtain a mixed ratio.
（熱帯熱マラリア原虫）
感染評価には、熱帯熱マラリア原虫として、クローン化したＭＳ８２２－Ｇ８株を使用した。熱帯熱マラリア原虫は、公知の方法に基づき維持培養した。評価前日に維持培養していた赤血球をＳｏｒｂｉｔｏｌ－Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ処理（熱帯熱マラリア原虫の維持培養時に混在する赤血球への感染を排除）をした。
(Plasmodium falciparum)
For infection evaluation, the cloned MS822-G8 strain was used as Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum was maintained and cultured according to a known method. The erythrocytes that had been maintained and cultured on the day before evaluation were treated with sorbitol-neuraminidase (to eliminate infection with erythrocytes mixed during the maintenance and culture of Plasmodium falciparum parasite).
（評価培地）
評価培地としては、ヒポキサンチン、ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）に、炭酸水素ナトリウム（最終濃度０．２２５％）、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および、ＡｌｂｕＭａｘ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を０．５％から１．５％添加した培地を使用した。比較に使用した、ドキシサイクリン非含有分化培地には、１０ＩＵ／ｍｌ ＥＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１５％ＦＢＳ，１％ＩＴＳ，１％ＰＳＧ，０．１％アスコルビン酸，０．１％ＭＴＧ含有ＩＭＤＭ溶液（ＳＩＧＭＡ社）にＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを１．５％添加した。
(Evaluation medium)
As the evaluation medium, RPMI1640 medium (SIGMA) containing hypoxanthine and HEPES (SIGMA) was added with sodium bicarbonate (final concentration 0.225%), 25 µg/ml gentamicin, and AlbuMax II (Thermo Fisher Scientific). A medium supplemented with 0.5% to 1.5% of was used. The doxycycline-free differentiation medium used for comparison included an IMDM solution containing 10 IU/ml EPO, 50 ng/ml SCF, 15% FBS, 1% ITS, 1% PSG, 0.1% ascorbic acid, and 0.1% MTG. (SIGMA) was added with 1.5% of AlbuMax II.
（ヒト赤血球様細胞を用いた熱帯熱マラリア原虫感染評価）
各状態（リング、トロホゾイト、シゾント）の原虫感染率を測定した、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（０．５×１０７ｃｅｌｌｓ）、遠心分離にて濃縮させたヒト赤血球様細胞群（０．５×１０７ｃｅｌｌｓ）、およびヒト赤血球（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ処理をしていない）を混合して３７℃、５％ＣＯ２下、評価培地中で培養した。０、２４、および４８時間後の熱帯熱マラリア原虫感染をギムザ染色法、また免疫染色法にて評価した。公知のプロトコールに従い市販の染色液を用いて、ギムザ染色もしくはメイギムザ染色をし、高倍顕微鏡にて測定した。免疫染色法はＤＮＡをＤＡＰＩで染色し、マラリア原虫タンパク質（ＰｆＨＳＰ７０）をＰｆＨＳＰ７０抗体で染色し、赤血球膜をＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ抗体で染色して評価した。
(Evaluation of Plasmodium falciparum infection using human erythroid cells)
Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (0.5 × 10 7 cells), human erythroid-like cells concentrated by centrifugation (0.5 × 10 7 cells) and human erythrocytes (not treated with neuraminidase) were mixed and cultured in an evaluation medium at 37° C. under 5% CO 2 . Plasmodium falciparum infection after 0, 24, and 48 hours was evaluated by Giemsa staining and immunostaining. Giemsa staining or May Giemsa staining was performed using a commercially available staining solution according to a known protocol, and measurements were made with a high-magnification microscope. In the immunostaining method, DNA was stained with DAPI, malaria parasite protein (PfHSP70) was stained with PfHSP70 antibody, and erythrocyte membrane was stained with Glycophorin A antibody for evaluation.
（実施例１）分化段階の異なるヒト赤血球様細胞の調製方法
（１）フィーダー細胞上、１２日間分化誘導
ヒト不死化赤血球前駆細胞（３×１０８個）をマイトマイシン処置したＯＰ－９細胞上に播種し、ドキシサイクリン非含有分化培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。３日おきに培地を交換し、１２日間分化誘導させた。
(Example 1) Method for preparing human erythroid cells with different differentiation stages (1) Differentiation induction on feeder cells for 12 days Human immortalized erythroid progenitor cells (3 x 10 8 cells) were placed on mitomycin-treated OP-9 cells. Seeded and cultured in doxycycline-free differentiation medium at 37° C., 5% CO 2 . The medium was exchanged every 3 days, and differentiation was induced for 12 days.
（２）フィーダー細胞上、１７日間分化誘導
ヒト不死化赤血球前駆細胞（１×１０７個）をマイトマイシン処置したＯＰ－９細胞上に播種し、ドキシサイクリン非含有分化培地中、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２下で培養した。３日おきに培地を交換し、１７日間分化誘導させた。
(2) Induction of Differentiation on Feeder Cells for 17 Days Human immortalized erythroid progenitor cells (1×10 7 cells) were seeded on mitomycin-treated OP-9 cells and placed in doxycycline-free differentiation medium at 37° C., 5% CO. 2. Cultured under 5% O2 . The medium was exchanged every 3 days, and differentiation was induced for 17 days.
（３）フィーダー細胞なし、３日間分化誘導
ヒト不死化赤血球前駆細胞（３×１０８個）を、フィーダー細胞を使用せず、ドキシサイクリン非含有分化培地中、３７℃、５％ＣＯ２で３日間分化誘導させた。
(3) Differentiation induction without feeder cells for 3 days Human immortalized erythroid progenitor cells (3 × 10 8 cells) were induced for 3 days at 37°C, 5% CO 2 in a doxycycline-free differentiation medium without using feeder cells. Differentiation was induced.
（４）フィーダー細胞上、３０日間分化誘導
ヒト不死化赤血球前駆細胞（３×１０８個）をマイトマイシン処置したＯＰ－９細胞上に播種し、ドキシサイクリン非含有分化培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３日おきに培地を交換し、３０日間分化誘導させた。
(4) Induction of Differentiation on Feeder Cells for 30 Days Human immortalized erythroid progenitor cells (3×10 8 cells) were seeded on mitomycin-treated OP-9 cells and placed in doxycycline-free differentiation medium at 37° C., 5% CO. 2 was cultured. The medium was exchanged every 3 days, and differentiation was induced for 30 days.
図１に（１）の方法により分化誘導させたヒト赤血球様細胞の性質を確認した結果を示す。この結果は、得られたヒト赤血球様細胞が赤血球系細胞に特異的な表面マーカー（ＣＤ７１およびＣＤ２３５ａ）を発現する細胞であることを示す。種々のＣＤ２３５ａの発現量が混在していることから、赤血球系細胞でありながら、分化段階の異なる細胞がある一定の比率で混在している事が示唆された。 FIG. 1 shows the results of confirming the properties of human erythroid cells differentiated by the method (1). This result indicates that the obtained human erythroid cells are cells that express surface markers (CD71 and CD235a) specific for erythroid cells. Since various CD235a expression levels were mixed, it was suggested that cells at different stages of differentiation were mixed at a certain ratio even though they were erythroid cells.
図２に（２）にて１７日間分化誘導させたヒト赤血球様細胞の性質を確認した結果を示す。同様に、赤血球系細胞に特異的な表面マーカー（ＣＤ２３５ａ）を発現する細胞であり、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞との混合物であることを示す。図２に示すように、赤血球系細胞でありながら、分化段階が異なる細胞がある一定の比率で混在している事が示唆された。 FIG. 2 shows the results of confirming the properties of the human erythroid cells that were induced to differentiate for 17 days in (2). Similarly, the cells express a surface marker (CD235a) specific to erythroid cells, and are a mixture of DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cells. As shown in FIG. 2, it was suggested that, although they are erythroid cells, cells with different differentiation stages are mixed at a certain ratio.
図３に（１）および（４）の方法で調製された細胞（それぞれ、分化日数１２日目（Ｄａｙ１２）および３０日目（Ｄａｙ３０））を沈殿させた写真を示す。これらの写真から、いずれの細胞もヘモグロビンを合成し赤血球様細胞であることを確認した。 Fig. 3 shows photographs of precipitated cells prepared by methods (1) and (4) (differentiation day 12 (Day 12) and differentiation day 30 (Day 30), respectively). From these photographs, it was confirmed that all cells synthesized hemoglobin and were erythroid cells.
（実施例２）調製したヒト赤血球様細胞の移送
実施例１の（１）および（３）で調製した細胞を、感染評価可能施設へ移送した。分化させた細胞をそれぞれ、移送開始直前に各１×１０８個程度をＴ－２５フラスコに移し替え、容器に入れ移送した。移送時間は２４時間程度であり、容器内に同封した記録温度計により移送時温度は３６℃前後の恒温であることを確認した。また、移送後（約２４時間後）細胞生存率は８０％以上であり、ギムザ染色により細胞の状態に変化は認められなかった。
(Example 2) Transfer of prepared human erythroid cells The cells prepared in (1) and (3) of Example 1 were transferred to an infection-evaluable facility. About 1×10 8 cells of each differentiated cell were transferred to a T-25 flask just before the start of transfer, placed in a container, and transferred. The transfer time was about 24 hours, and it was confirmed by a recording thermometer enclosed in the container that the temperature during transfer was a constant temperature of about 36°C. After transfer (about 24 hours later), the cell viability was 80% or more, and Giemsa staining showed no change in the state of the cells.
図４に感染評価前のヒト赤血球様細胞群のギムザ染色図を示す。ギムザ染色図により、少なくとも２つ以上の分化状態の混在する細胞であることを示唆する。（黒矢印：核が大きく分化状態が未熟と思われる細胞。白矢印：核が小さく血球分化がより進んだ状態と思われる細胞） FIG. 4 shows a Giemsa staining diagram of human erythroid cell group before infection evaluation. A Giemsa staining diagram suggests that the cell is a mixture of at least two differentiation states. (Black arrows: cells with large nuclei that appear to be in an immature state of differentiation. White arrows: cells that have small nuclei and appear to be in a more advanced state of hematopoietic differentiation.)
（実施例３）調製したヒト赤血球様細胞の保存
調製したヒト赤血球様細胞を即時使用しない場合、特に一定時間かけて移送した後に使用する際に、細胞保存による影響を調べるため、細胞保存検討をした。実施例１（１）で調製した細胞を、Ｔ－２５フラスコに移し変え密閉し、インキュベータの中で２４時間保持した（移送時間として想定）のち、細胞生存率を測定したところ９１％であった。ディッシュに移し替え、４℃にて冷蔵保存し、１日後、および３日後に細胞生存率を測定したところ、それぞれ、８６％、および９０％であった。
(Example 3) Preservation of prepared human erythroid cells When the prepared human erythroid cells are not used immediately, especially when they are used after being transported for a certain period of time, cell preservation should be examined in order to examine the effect of cell preservation. did. The cells prepared in Example 1 (1) were transferred to a T-25 flask, sealed, and held in an incubator for 24 hours (assumed as transfer time), and then the cell viability was measured to be 91%. . The cells were transferred to a dish and stored in a refrigerator at 4° C. After 1 day and 3 days, the cell viability was measured and found to be 86% and 90%, respectively.
（実施例４）評価培地による感染率への影響の検討
ヒト赤血球様細胞の調製培地（ドキシサイクリン非含有分化培地）と、評価培地が異なる組成であることから、用いる評価培地の検討を行った。上述のヒト赤血球様細胞を用いた熱帯熱マラリア原虫感染評価方法に従い、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球（約１％）を用いた場合、ヒト血清非含有評価培地に、ヒト血清の代わりにＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを添加した培地、および、ドキシサイクリン非含有分化培地にＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを添加した培地で評価を行った。
(Example 4) Examination of the influence of the evaluation medium on the infection rate Since the preparation medium for human erythroid cells (doxycycline-free differentiation medium) and the evaluation medium have different compositions, the evaluation medium to be used was examined. According to the above-mentioned method for evaluating Plasmodium falciparum infection using human erythroid cells, when using red blood cells (about 1%) infected with Plasmodium falciparum, in a human serum-free evaluation medium, AlbuMax instead of human serum AlbuMax II supplemented medium and doxycycline-free differentiation medium supplemented with AlbuMax II were evaluated.
表１に熱帯熱マラリア原虫を用いた培地の検討結果を示す。その結果、評価培地にＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを１．０％、１．５％入れた時が適切な原虫の増殖が認められた。一方、ドキシサイクリン非含有分化培地では、原虫の感染率が低下することが判明した。 Table 1 shows the results of examining media using Plasmodium falciparum. As a result, appropriate proliferation of protozoa was observed when AlbuMax II was added to the evaluation medium at 1.0% and 1.5%. On the other hand, the doxycycline-free differentiation medium was found to reduce the protozoan infection rate.
（実施例５）評価培地による細胞生存率への影響の検討
実施例２により移送したヒト赤血球様細胞群（分化誘導開始後Ｄａｙ４およびＤａｙ１３）を、実施例４と同じ培地中で培養し、細胞生存率について測定した。
(Example 5) Examination of the effect of evaluation medium on cell viability The human erythroid cell group transferred in Example 2 (Day 4 and Day 13 after the start of differentiation induction) was cultured in the same medium as in Example 4, and the cells Viability was measured.
表２に調製したヒト赤血球様細胞を用いた評価培地検討結果について記載する。より分化日数の浅い細胞では生存率が低く、分化誘導開始後Ｄａｙ１３のヒト赤血球様細胞群と熱帯熱マラリア原虫感染評価培地（ＡｌｂｕＭａｘ ＩＩ含有：１．０％）の場合の生存率が適切であることが判明した。そのため、評価培地として熱帯熱マラリア原虫感染培地にＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを１．０％含有したものを使用することに決定した。 Table 2 shows the results of examination of evaluation medium using prepared human erythroid cells. The survival rate is low for cells with a shallow number of days of differentiation, and the survival rate in the case of a human erythroid cell group and Plasmodium falciparum infection evaluation medium (containing AlbuMax II: 1.0%) on Day 13 after the start of differentiation induction is appropriate. It has been found. Therefore, it was decided to use Plasmodium falciparum infection medium containing AlbuMax II at 1.0% as the evaluation medium.
（実施例６）生存率低下に影響する因子の検討
実施例２により移送したヒト赤血球様細胞群（分化誘導開始後Ｄａｙ１３）が評価培地中で生存率が低下した原因を調べるために、継時的に培地中のグルコース濃度を測定した。その結果、ヒト赤血球様細胞は赤血球と比較して、より継時的にグルコースを消費することが判明した。評価培地中のグルコースが減少したために、エネルギー供給が行われずヒト血球様細胞の生存率に影響することが示唆された。長期間、感染評価を行う際の評価培地中のグルコース濃度が重要であることが示唆された。
(Example 6) Examination of Factors Affecting Decrease in Survival Rate The glucose concentration in the medium was measured systematically. As a result, human erythroid cells were found to consume glucose over a longer period of time than red blood cells. It was suggested that the viability of human hemocyte-like cells was affected due to the lack of energy supply due to the decrease in glucose in the assay medium. It was suggested that the glucose concentration in the evaluation medium is important for long-term infection evaluation.
表３に感染評価した際の継時的な培地中のグルコース濃度測定の結果を示す。表中、０時間は、分化誘導開始後Ｄａｙ１３の細胞を濃縮して、感染評価開始時点の培養液中濃度を示す。比較として、赤血球を使用した感染評価時の培地中グルコース濃度を示す。 Table 3 shows the results of measuring the glucose concentration in the medium over time when evaluating the infection. In the table, 0 hour indicates the concentration in the culture medium at the start of infection evaluation, obtained by concentrating the cells on Day 13 after the initiation of differentiation induction. As a comparison, medium glucose concentrations during infection assessment using red blood cells are shown.
（実施例７）ヒト赤血球様細胞を用いた感染評価
（ｉ）調整した熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（０．５×１０７個，原虫感染率３．６％（リング：０．１８％，トロホゾイト／シゾント：３．４１％））、（ｉｉ）感染評価施設移送後、遠心分離で濃縮させた血球様細胞群（０．５×１０７個）、および（ｉｉｉ）ヒト赤血球（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ処理をしていない,０．５×１０７個）を混合して３７℃、５％ＣＯ２下、評価培地中で培養した。評価培地としては、ヒポキサンチン、ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）に、炭酸水素ナトリウム（最終濃度０．２２５％）、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および、１．０％ＡｌｂｕＭａｘ ＩＩを添加した培地を使用した。０、２４、および４８時間後の熱帯熱マラリア原虫感染をギムザ染色法にて評価した。図５に赤血用細胞群と熱帯熱マラリア原虫との感染プロトコール図について記載する。
(Example 7) Evaluation of infection using human erythroid cells (i) Prepared erythrocytes infected with Plasmodium falciparum (0.5 × 10 7 cells, protozoan infection rate 3.6% (ring: 0.18%, trophozoites / schizont: 3.41%)), (ii) a hemocyte-like cell cluster (0.5 × 10 7 cells) enriched by centrifugation after transfer to an infection evaluation facility, and (iii) human red blood cells (Neuraminidase-treated). 0.5 × 10 7 cells (not 0.5 × 10 7 cells) were mixed and cultured in an evaluation medium at 37°C under 5% CO 2 . As the evaluation medium, sodium bicarbonate (0.225% final concentration), 25 µg/ml gentamicin, and 1.0% AlbuMax II were added to RPMI1640 medium (SIGMA) containing hypoxanthine and HEPES (SIGMA). A culture medium was used. After 0, 24 and 48 hours, Plasmodium falciparum infection was evaluated by Giemsa staining. FIG. 5 shows a diagram of an infection protocol between the erythroid cell group and Plasmodium falciparum.
図６に細胞群添加０，２４，および４８時間後のギムザ染色の写真を示す。図６に示すとおり、熱帯熱マラリア原虫が有核赤血球に侵入するのも確認でき、有核赤血球が熱帯熱マラリア原虫の感染に適していることが見いだされた（黒矢印：マラリア原虫が侵入した細胞）。このことは熱帯熱マラリア原虫に限らず、微生物の増殖などに赤血球系を介在する感染症において、対象となる微生物にとってより好ましい状態の血球細胞を提供することができることを示唆する。 FIG. 6 shows photographs of Giemsa staining 0, 24, and 48 hours after addition of the cell group. As shown in FIG. 6, it was confirmed that Plasmodium falciparum invades nucleated red blood cells, and it was found that nucleated red blood cells are suitable for infection with Plasmodium falciparum (black arrow: Plasmodium falciparum has invaded cell). This suggests that, not only Plasmodium falciparum parasite, but also in infectious diseases in which proliferation of microorganisms and the like is mediated by the erythroid system, blood cells in a more favorable state for target microorganisms can be provided.
Claims (10)
不死化した 血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞との混合物を調製すること、
前記混合物に前記マラリア原虫を感染させることであって、感染後の細胞培養の培地は、選択時の細胞生存率が感染前の生存細胞数の８０％以上となるように糖およびアルブミンを添加し、又はｐＨを調整することを含み、血清不含であること、
前記マラリア原虫が感染した細胞を選択すること、
選択された細胞の分化の程度を判定すること、および
判定された分化の程度の細胞をマラリア原虫による感染、培養および／又は評価に適した細胞として決定することを含む方法。 malaria parasite A method for determining cells suitable for infection, culture and/or evaluation by
immortalized By inducing differentiation of blood cell progenitor cells into red blood cells,DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cellspreparing a mixture of
Saidblendto saidmalaria parasiteto infectwherein the medium for cell culture after infection includes adding sugar and albumin or adjusting the pH so that the cell viability at the time of selection is 80% or more of the number of viable cells before infection, be serum-free,
Saidmalaria parasiteselecting cells infected with
determining the degree of differentiation of the selected cells, and
cells of the determined degree of differentiationmalaria parasitedetermining cells as suitable for infection, culture and/or evaluation by.
不死化した 血球前駆細胞を赤血球細胞へ分化誘導させることにより、ＤＲＡＱ５陽性細胞とＤＲＡＱ５陰性細胞との混合物を調製すること、
前記混合物に前記マラリア原虫を感染させることであって、感染後の細胞培養の培地は、選択時の細胞生存率が感染前の生存細胞数の８０％以上となるように糖およびアルブミンを添加し、又はｐＨを調整することを含み、血清不含であること、
感染した細胞の分化の程度からマラリア原虫による感染および培養に適した細胞を選択すること、
選択された細胞を回収すること、
回収された細胞を培養すること含む方法。
malaria parasite A method for maintaining and culturing the
immortalized By inducing differentiation of blood cell progenitor cells into red blood cells,DRAQ5-positive cells and DRAQ5-negative cellspreparing a mixture of
Saidblendto saidmalaria parasiteto infectwherein the medium for cell culture after infection includes adding sugar and albumin or adjusting the pH so that the cell viability at the time of selection is 80% or more of the number of viable cells before infection, be serum-free,
From the degree of differentiation of infected cellsmalaria parasiteselecting cells suitable for infection and culture with
recovering the selected cells;
A method comprising culturing the harvested cells.
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