JP7098331B2 - 昆虫の一過性受容体電位チャネルに直接結合する化合物を同定する方法 - Google Patents

昆虫の一過性受容体電位チャネルに直接結合する化合物を同定する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、2015年6月19日に出願された米国仮特許出願第62/182,037号の合衆国法典第35巻第119条(e)による出願日の利益を主張する。
配列表の提出
本出願に関連する配列表は、EFS-Webを介して電子フォーマットで提出され、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前はPF78630_SEQLISTである。テキストファイルの大きさは619KBであり、テキストファイルは2015年6月18日に作成された。
本発明は、概して、1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)タンパク質複合体及び/若しくはチャネル並びに/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/若しくはチャネルに直接結合する薬剤を決定する方法に関する。本発明はまた、昆虫防除の組成物及び方法、並びに1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)タンパク質複合体及び/若しくはチャネル並びに/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/若しくはチャネルに直接結合することができる化合物を含む殺虫剤組成物の作用様式の分類に関する。本発明はさらに、昆虫防除の組成物及び方法、並びに1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)タンパク質複合体及び/若しくはチャネル並びに/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/若しくはチャネルに直接結合することができる化合物を含む殺虫剤組成物の作用様式の分類に関する。本発明はさらになお、昆虫防除の組成物及び方法、並びに1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)タンパク質複合体及び/若しくはチャネル並びに/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/若しくはチャネルに直接結合することができる化合物を含む殺虫剤組成物の作用様式の分類に関し、ここで、化合物はまた、1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルを調節することができる。
ほとんど全ての作物、植物、及び商業的農業地帯は、植物害虫による攻撃を受けやすい。植物害虫は、世界の商業的に重要な農作物の損失の主な要因であり、農業従事者に対する経済的苦難と、世界の多くの地域での地域住民のための栄養欠乏の両方をもたらす。言い換えれば、害虫は、ヒトの農業、食料供給、収穫後の貯蔵、園芸、動物の健康及び公衆衛生に多大な損失及び損害の原因となる。
これらの昆虫の防除は進歩してきたが、これらの昆虫は防除措置に適応して回避できるようになったことから、結果として耐性の昆虫集団が生じている。結果として、害虫の摂食及び他の行動の基礎となるメカニズムのより良い理解が依然として必要とされる。このような知識は、害虫による、作物、植物、及び商業的農業分野に対する攻撃を介在又は防止するための薬剤及び戦略の設計を可能にする。
広範囲の化学殺有害生物剤及び殺虫剤が、農業に重大な植物害虫を防除又は根絶するために広く使用されてきた。しかしながら、有効な代替の殺虫剤の同定及び/又は開発にかなり関心がある。このように、新規な殺虫剤をスクリーニングするための有効な方法が望ましい。
次に、必要とされるものは、昆虫の行動を調節し、1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)及び/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合する薬剤のスクリーニング、及びいくつかの場合において、殺虫剤として作用し得る薬剤のスクリーニングに使用可能である新規な方法である。
一実施形態において、本発明は、候補化合物が1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)及び/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合するかどうかを決定する方法に関する。この方法は、細胞に位置し、細胞に由来し、細胞により産生され又は無細胞系で産生され得る、1つ以上のNanchungタンパク質、一過性受容体電位(TRP)及び/又は一過性受容体電位V(TRPV)タンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを提供するステップ、1つ以上のNanchungタンパク質、TRPタンパク質、及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを候補化合物と接触させるステップ、並びに1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに対する候補化合物の結合親和性を決定するためにアッセイするステップを含み得、ここで、候補化合物の結合親和性は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合する候補化合物の能力を示す。
例えば、特定の実施形態において、結合アッセイステップは、以下:(1)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、標識されていてもよく又は標識されていなくてもよい化合物と接触させるステップ;(2)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに結合している化合物の濃度を測定するステップ;(3)1つ以上の化合物の平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(4)Kdが、以下の方法:(I)(a)最大結合(Bmax)及び(b)最大結合の50%に到達するために必要とされる標識された化合物の濃度、(II)蛍光分極アッセイ、(III)表面プラズモン共鳴、(IV)等温熱量測定、(VI)Schild分析のうちの1つ以上を用いて決定され得;(5)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに対して高親和性を有する標識された化合物と接触させるステップ;(6)ステップ1の標識された化合物の存在下で、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを候補化合物と接触させるステップ;(7)標識された化合物の結合が0%に近づくまで、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに接触するために利用可能な候補化合物の量を増加させるステップ;(8)以下の方法:(I)(a)候補化合物の不存在下で、結合した標識された化合物の量を決定し、(b)結合した標識された化合物の量を50%減少させるのに必要とされる候補化合物の濃度を決定すること、(II)蛍光分極アッセイ、及び/又は(III)Schild分析のうちの1つ以上を用いて、競合アッセイについての平衡阻害定数(Ki)及び/又は平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(9)候補化合物の阻害定数を他の候補化合物と比較するステップ;(10)候補化合物の阻害定数を標識された化合物の解離定数と比較するステップのうちの少なくとも1つを含み得る。
第2の実施形態において、本発明は、以下の結合アッセイ及び/又は機能的アッセイの1つ以上を使用して、殺虫剤抵抗性対策委員会(IRAC)による候補化合物の作用様式の分類を決定する方法に関する。例えば、特定の実施形態において、機能的アッセイを使用して、候補化合物が1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節因子として作用するかどうかを決定し得、結合アッセイを使用して、候補化合物が、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに、より具体的には1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位に直接結合するかどうかを決定し得る。
機能的アッセイが、以下の:(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ、(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、及び/又は(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップのうちの少なくとも1つを含んでもよい。好ましくは、候補化合物は、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20%調節し得る。候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子であり得る。代替として、候補化合物は、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子であり得る。候補化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子であり得る。
結合アッセイは、以下:(1)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、標識されていてもよく又は標識されていなくてもよい化合物と接触させるステップ;(2)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに結合している化合物の濃度を測定するステップ;(3)1つ以上の化合物の平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(4)Kdが、以下の方法:(I)(a)最大結合(Bmax)及び(b)最大結合の50%に到達するために必要とされる標識された化合物の濃度、(II)蛍光分極アッセイ、(III)表面プラズモン共鳴、(IV)等温熱量測定、(VI)Schild分析のうちの1つ以上を用いて決定され得;(5)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに対して高親和性を有する標識された化合物と接触させるステップ;(6)ステップ1の標識された化合物の存在下で、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを候補化合物と接触させるステップ;(7)標識された化合物の結合が0%に近づくまで、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに接触するために利用可能な候補化合物の量を増加させるステップ;(8)以下の方法:(I)(a)候補化合物の不存在下で、結合した標識された化合物の量を決定し、(b)結合した標識された化合物の量を50%減少させるのに必要とされる候補化合物の濃度を決定すること、(II)蛍光分極アッセイ、及び/又は(III)Schild分析のうちの1つ以上を用いて、競合アッセイについての平衡阻害定数(Ki)及び/又は平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(9)候補化合物の阻害定数を他の候補化合物と比較すること;(10)候補化合物の阻害定数を標識された化合物の解離定数と比較するステップのうちの少なくとも1つを含み得る。
本明細書中に記載される方法において、1つ以上のTRPチャネル及び/又はTRPVチャネルは、複合体中に1つ以上のTRPタンパク質及び/又は1つ以上のTRPVタンパク質を含み得る。本明細書中に記載される方法において、1つ以上の昆虫TRPチャネル及び/又はTRPVチャネルは、1つ以上のNanchungタンパク質、Inactiveタンパク質、TRPタンパク質、TRPVタンパク質、NanchungとInactiveタンパク質との複合体、NanchungとTRPVタンパク質との複合体、及び/又はNanchungとTRPタンパク質との複合体を含み得る。明確にするために、TRP及び/又はTRPVチャネルはまた、人工膜及び/又は無細胞系に挿入される、Nanchungタンパク質及び細胞膜に見出される任意の他のTRPチャネルタンパク質を含み得る。Nanchung、TRP及び/又はTRPVタンパク質及び/又はタンパク質複合体は、細胞膜、溶液、又は無細胞系に見出され得ることを理解するべきである。TRP及び/又はTRPVチャネルは、1つ以上の細胞膜、1つ以上の細胞膜片内に含まれ、細胞系で産生され、無細胞系で産生され、及び/又はペトリ皿中の培養細胞由来、又は実験動物若しくは実験昆虫に由来する細胞若しくは組織由来であり得ることを理解するべきである。候補化合物が昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルに直接結合するかどうかを決定する目的で、TRP及び/又はTRPVチャネルは、1つ以上のNanchung、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体を含み得る。
Nanchung及びInactiveタンパク質はともに昆虫のTRPVタンパク質であることを理解するべきである。しかしながら、Nanchungはまた、TRPタンパク質と複合体を形成し得る。TRP及び/又はTRPV複合体中で共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率は、好ましくは約3:1～約1:3、より好ましくは約1:1である。TRP及び/又はTRPV複合体中に共発現されるNanchungタンパク質とTRPタンパク質の比率は、好ましくは約3:1～約1:3、より好ましくは約1:1である。候補化合物は、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せであり得る。
この方法はさらに、これらの追加のステップ:1つ以上の哺乳動物のTRPチャネルを提供するステップ;1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVチャネルを、候補化合物又は別個の標識された化合物であり得る標識された化合物及び/又は候補化合物と接触させるステップ;1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVチャネルに対する標識された化合物及び/又は候補化合物の結合親和性を決定するためにアッセイするステップのうちの1つ以上を含み得、ここで、1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVチャネルに対する結合親和性がほとんどないか又は全くないことは、1つ以上のNanchungタンパク質、昆虫のTRPチャネル及び/又はTRPVチャネルに選択的に結合するものとして候補化合物を同定する。昆虫は、農業有害生物/園芸有害生物又は病原媒体物又は寄生虫であり得る。
別の実施形態において、上記の方法は、標識された化合物として以下の化合物:アフィドピロペン、ピメトロジン、及び/又はピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態のうちの1つ以上を使用してもよい。
さらに別の実施形態において、本発明は、上記の方法によって選択された候補化合物に関する。候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害又は増加させる調節因子であり得る。候補化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子であり得る。さらになお、候補化合物は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル、具体的には1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位を調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物は、1つ以上の昆虫のNanchungタンパク質、昆虫のTRPタンパク質及び/又は昆虫のTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル、具体的には該1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位をさらに調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物は、1つ以上の節足動物のNanchungタンパク質、節足動物のTRP及び/又は節足動物のTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル、具体的には該1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位をさらに調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物は、1つ以上の軟体動物のNanchungタンパク質、軟体動物のTRPタンパク質及び/又は軟体動物のTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル、具体的には該1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位をさらに調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物は、1つ以上の線虫のNanchungタンパク質、線虫のTRP及び/又は線虫のTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネル、具体的には該1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル上の同じ部位をさらに調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物は、1つ以上の有害生物のNanchungタンパク質、有害生物のTRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルをさらに調節及び/又はこれに直接結合し得る。候補化合物はさらに、1つ以上の哺乳動物のNanchungタンパク質、哺乳動物のTRP及び/又は哺乳動物のTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネル及び/又は他の非標的/非有害生物種を調節及び/又はこれに直接結合することができなくてもよい。
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている方法の1つ以上によって同定された候補化合物を含有する組成物に関する。
別の実施形態において、本発明は、昆虫又は昆虫の生息地、摂食源及び/又は環境/生息地に、本明細書に記載されている方法の1つ以上によって選択される候補化合物又は上記の方法の1つ以上によって選択される化合物を含む組成物を適用することを含む昆虫を防除する方法に関する。化合物は、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの阻害剤であり得る。化合物は、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの活性化剤であり得る。化合物は、昆虫のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVチャネルに直接結合し得る。昆虫は、農業/園芸の有害生物、病原媒体物又は寄生虫であり得る。
アフィドピロペン、ピメトロジン(PM)、ピリフルキナゾン(PFQ)及びそのN-脱アセチル化形態(dPFQ)の分子構造を示す図である。 アメリカバッタ(アメリカイナゴ(Schistocerca Americana))におけるアフィドピロペン及びピメトロジン(PM)の効果を示す写真である。 Nan及びIavを共発現する哺乳動物細胞において、アフィドピロペン、ピメトロジン(PM)及びピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)によるCa2+動員の活性化を示すが、親ハムスター細胞(細胞は、目的とする遺伝子又はタンパク質による感染前の細胞である)及びNanchung又はInactiveだけを発現する細胞において活性化はないことを示す図である。 アフィドピロペン、ピメトロジン(PM)及びピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)が、Nanchung及びInactiveを共発現する哺乳動物細胞において膜脱分極応答を誘起するが、親ハムスター細胞並びにNanchung若しくはInactiveだけを発現する細胞においては誘起しないことを実証するグラフである。 ピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)が、Nanchung及びInactiveを共発現するカエル卵母細胞において電流を誘起するが、Nanchung又はInactiveだけを発現する卵母細胞においては誘起しないことを実証するグラフである。 Nanchung及びInactiveを共発現する細胞におけるアフィドピロペン、ピメトロジン(PM)及びピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)によって誘起されるカルシウム応答の用量反応関係を示す図である。 哺乳動物のTRRV4チャネルを活性化しないアフィドピロペンを示す図である。 Nan及びIavを共発現する膜への[3H]-アフィドピロペンの特異的結合を示す図である。 図8Aは、Nanタンパク質への[3H]-アフィドピロペン飽和結合、及びIavの存在下での結合親和性の増加を示す図である。図8Bは、図8Aにおいて同定された飽和結合のスキャッチャード変換を示す図である。 図9Aは、ピメトロジン(PM)とピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)はともに、Nan+Iav膜への結合について[3H]-アフィドピロペンと競合することを示す図である。図9Bは、ピメトロジン(PM)とピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態(dPFQ)はともに、Nanのみの膜への結合から[3H]-アフィドピロペンと競合することを示す図である。 配列番号1に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号2に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号3に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号4に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号5に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号6に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号7に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号8に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号9に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号10に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号11に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号12に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号13に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号14に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号15に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号16に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号17に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号18に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号19に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号20に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号21に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号22に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号23に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号24に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号25に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号26に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号27に対応し、図において特定された受託番号を有する異なる種からのNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。 配列番号54に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号55に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号56に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号57に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号58に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号59に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号60に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号61に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号62に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号63に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号64に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号65に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号66に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号67に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号68に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号69に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号70に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号71に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号72に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号73に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号74に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号75に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号76に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号77に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号78に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号79に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号80に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号28に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号29に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号30に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号31に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号32に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号33に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号34に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号35に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号36に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号37に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号38に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号39に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号40に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号41に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号42に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号43に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号44に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号45に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号46に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号47に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号48に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号49に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号50に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号51に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号52に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号53に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。 配列番号81に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号82に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号83に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号84に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号85に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号86に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号87に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号88に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号89に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号90に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号91に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号92に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号93に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号94に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号95に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号96に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号97に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号98に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号99に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号100に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号101に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号102に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号103に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号104に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号105に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 配列番号106に対応し、図中に特定される受託番号を有する異なる種からのInactive(Iav)タンパク質のアミノ酸配列を与える。 Nanタンパク質の配列アラインメントを示す図である(全てそれぞれ、出現する順番に、配列番号59、60、63、58、57、56、54、74、73、75、66、70、110、68、及び111、配列番号64の残基1～448と560～900、並びに配列番号76、79、62、77、72、78、71、80、65、及び61)。 図116-1の続きである。 図116-2の続きである。 図116-3の続きである。 図116-4の続きである。 図116-5の続きである。 図116-6の続きである。 図116-7の続きである。 図116-8の続きである。 図116-9の続きである。 Iavタンパク質の配列アラインメントを示す図である(全てそれぞれ、出現する順番に、配列番号84及び85、配列番号86の残基1～916、954～1102と1167～1216、並びに配列番号83、82、81、101、104、100、99、92、98、93、90、89、94、95、88、102、112、103、105、106、96、87、及び91)。 図117-1の続きである。 図117-2の続きである。 図117-3の続きである。 図117-4の続きである。 図117-5の続きである。 図117-6の続きである。 図117-7の続きである。 図117-8の続きである。 図117-9の続きである。 図117-10の続きである。 図117-11の続きである。 図117-12の続きである。 図117-13の続きである。 図117-14の続きである。 図117-15の続きである。 Nanタンパク質に関するアラインメントツリーを示す図である。 Iavタンパク質に関するアラインメントツリーを示す図である。
図及び本発明の好ましい実施形態の詳細な説明
I.一般的考察
一過性受容体電位(TRP)チャネルは、細胞の恒常性の調節に関与するチャネルの大規模かつ重要なクラスを構成する。本発明は、限定されないが、昆虫におけるTRPVチャネルを含む、少なくとも1つのTRPファミリーメンバーに結合し及び/又はそれを調節する1つ以上の化合物を同定又は含む方法及び組成物を提供する。
具体的には、本発明は、1つ以上の昆虫のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合し、並びに/あるいは1つ以上の昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルを調節することができる候補化合物を同定する方法を提供する。昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節は、細胞におけるカルシウム恒常性、ナトリウム恒常性、細胞内カルシウムレベル、膜分極(静止膜電位)、及び/又は陽イオンレベルを調節し得る。1つ以上の昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルを調節することができる化合物は、限定されないが、昆虫防除を含む多数の態様において有用である。化合物が昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルに直接結合することを知ることは、昆虫の管理計画及び抵抗性の昆虫集団の発生を防止するのに重要である。
本発明はさらに、Nanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体、及び/又はチャネルに対して高親和性を有する化合物として、アフィドピロペン、PM及び/又はdPFQを同定し、そのため、上記化合物の1つ以上が、本明細書に記載される競合結合アッセイの目的のために、標識された化合物として本明細書に提示される方法において使用することができる。
本発明はまた、有害生物を処置するための殺虫剤としての使用のための、本明細書において同定される候補化合物を含む組成物を提供する。本発明は、本明細書において同定される候補化合物をそれらの作用様式によって分類することをさらに含む。
理論に束縛されることなしに、昆虫のTRP及び/又はTRPVの調節は、昆虫の摂食行動を増加又は減少させ得る感覚ニューロン調節を生じさせるシグナル伝達経路を誘発し、昆虫における昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルのこのような調節(例えば、活性化)は、飢餓による昆虫の死をもたらすこのような昆虫の摂食行動の減少をもたらす場合がある。したがって、再び理論に束縛されることなしに、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルを調節する(例えば、活性化する)化合物は、殺虫剤として使用することができると考えられる。
TRPチャネルは、ヒトにおいて見出されない、少なくとも7つのグループ:TRPC(カノニカル)、TRPV(バニロイド)、TRPM(メラスタチン)、TRPP(ポリシスチン類)、TRPML(ムコリピン類)、TRPA(アンキリン)及びTRPN(メカノセンサーポテンシャルCなし)に分類されている。
TRPCグループは、配列相同性及び機能的類似性に基づいて、4つのサブファミリー(TRPC1、TRPC4,5、TRPC3,6,7及びTRPC2)に分けることができる。
現在、哺乳動物のTRPVファミリーは6つのメンバーを有する。TRPV5及びTRPV6は、TRPV1、TRPV2、TRPV3又はTRPV4に対するよりも、互いにより密接に関連付けられる。TRPA1は、TRPV3に最も密接に関連付けられ、TRPV5及びTRPV6に対するよりもTRPV1及びTRPV2により密接に関連付けられる。昆虫は、哺乳動物のTRPV5及びTRPV6に最も密接に関連している、Nanchung(Nan)及びInactive(Iav)というTRPVファミリーの2つのメンバーのみを有する。TRPVは、例えば、昆虫(ショウジョウバエ(Drosophila)属、トリボリウム(Tribolium)属、シラミ(Pediculus)属、イエカ(Culex)属、及びハマダラカ(Anopheles)属)、甲殻類(ミジンコ(Daphnia pulex))、線虫(カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans))、軟体動物(ジャンボアメフラシ(Aplysia californica)、ナスビカサガイ(Lottia gigantea))、及び哺乳動物(ヒト、マウス、ラット、サル及びチンパンジー)を含む多数の生物において発現する。
軟体動物、線虫、節足動物、より具体的には昆虫のTRPVチャネルは、Nanchung及び/又はInactiveタンパク質(又はそれらのホモログ)によって代表される。NanchungとInactiveタンパク質は複合体を形成し(Nesterovら2015)、昆虫の聴覚に関与している(Matsuuraら、2009)。しかしながら、Nanchungは、他のTRPタンパク質と複合体を形成し得る。
TRPMファミリーは8つのメンバーを有する。構成要素は、以下の設定時のメンバーであるTRPM1(メラスタチン又はLTRPC1)、TRPM3(KIAA1616又はLTRPC3)、TRPM7(TRP-PLIK、ChaK(1)、LTRPC7)、TRPM6(ChaK2)、TRPM2(TRPC7又はLTRPC2)、TRPM8(Trp-p8又はCMR1)、TRPM5(Mtr1又はLTRPC5)、及びTRPM4(FLJ20041又はLTRPC4)を含む。
TRPAファミリーの唯一の哺乳動物メンバーはTRPA1であるが、一方、昆虫はこのファミリーの少なくとも4つのメンバー:TRPA1、Painless、Pyrexia、及びWaterwitchを含む。
TRPMLファミリーは、TRPML1(ムコリピン1)、TRPML2(ムコリピン2)、及びTRPML3(ムコリピン3)を含むムコリピン類からなる。
TRPPファミリーは、チャネルの2つのグループ:6個の膜貫通ドメインを有することが予測されるもの及び11個の膜貫通ドメインを有することが予測されるものからなる。TRPP2(PKD2)、TRPP3(PKD2L1)、TRPP5(PKD2L2)は全て、6個の膜貫通ドメインを有することが予測される。TRPP1(PKD1、PC1)、PKD-REJ及びPKD-1L1は全て、11個の膜貫通ドメインを有するものと考えられる。昆虫はTRPPファミリーの唯一のメンバーを有し、これはいくつかの種に存在しない。
本発明者らは、アフィドピロペンがNanchungタンパク質に単独で又は他のTRP及び/若しくはTRPVタンパク質との複合体で直接結合することを発見した。さらに、本発明者らは、昆虫のNanchungタンパク質、複合体に組み込まれたNanchungタンパク質を有するTRPVタンパク質複合体又は関連する昆虫のTRPタンパク質複合体に直接結合するさらなる化合物を同定する方法を開発した。さらになお、本発明者らは、アフィドピロペンが、昆虫のNanchungタンパク質、複合体に組み込まれたNanchungタンパク質を有するTRPVタンパク質複合体又は関連する昆虫のTRPタンパク質複合体に直接結合することができる候補化合物を同定するのに有用な化合物であることを確認した。このような化合物の同定は、殺虫剤として機能し、有害生物管理プログラムにおいて有用であり得る適切な化合物の同定を導き得る。
さらになお、本発明者らは、Nanchungタンパク質とInactiveタンパク質の両方がタンパク質複合体中に存在する場合、いくつかの化合物が結合親和性を増大させることを発見した。したがって、1つ以上のNanchungタンパク質を含む1つ以上のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体に直接結合する化合物を同定することは有益であり得る。さらに、1つ以上のNanchungタンパク質及び1つ以上のInactiveタンパク質を含む1つ以上のTRPタンパク質複合体に直接結合する化合物を同定することは有益であり得る。また、1つ以上のNanchungタンパク質、及び/又はTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合する化合物を同定することは有益であり得る。同定された化合物を殺虫剤として使用することは有益であり得る。1つ以上のNanchungタンパク質、及び/又はTRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合し、有害生物種のTRP及び/又はTRPVチャネルを調節するが、哺乳動物及び/又は他の非有害生物種の1つ以上のNanchungタンパク質、及び/又はTRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合せず及び/又は調節しないことが見出され得る化合物を同定することは、さらに有益であり得る。
II.定義:
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料は、本開示の主題の実施又は試験において使用可能であるが、代表的な方法、装置、及び材料をここに記載する。
用語「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「1つ以上」を指す。したがって、例えば、「1つの細胞」(例えば「1つの哺乳動物細胞」)への言及は、複数のこのような細胞(例えば、培養中の複数の哺乳動物細胞)を含む。
本明細書で使用するとき、用語「約」は、質量、重量、時間、体積、濃度若しくはパーセンテージの値又は量に言及するとき、特定の量から、いくつかの実施形態において±20%、いくつかの実施形態において±10%、いくつかの実施形態において±5%、いくつかの実施形態において±1%、いくつかの実施形態において±0.5%、及びいくつかの実施形態において±0.1%の変動を包含することが意図され、したがって、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切である。
用語「昆虫」、「害虫」又は「植物害虫」は、植物と関連していることが公知であり、その関連の結果として、植物の健康及び活力に有害作用を引き起こす昆虫綱のクラスの多数の、通常は小さい節足動物のいずれか1つを指す。本明細書で使用される植物なる用語は、根、茎、葉及び種子などの植物全体及び植物の一部分、並びに該植物又は植物の一部分内の細胞及び組織を包含する。用語「昆虫」、「害虫」又は「植物害虫」は、本出願にわたり互換的に使用される。
用語「有害生物」及び/又は「有害生物種」とは、植物と関連していることが知られており、その関連の結果として、植物の健康及び活力に有害作用を生じさせる、昆虫綱の多数の、通常は小さい節足動物のいずれか1つを指す。さらに、これらの用語は、植物と関連していることが知られており、その関連の結果として、植物の健康及び活力に有害作用を生じさせる、軟体動物、線虫、他の節足動物綱を含むことを指す。さらに、用語は、節足動物、腹足類及び線虫を含み、限定されないが、鱗翅目(Lepidoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、コハチノスツヅリガ(Achroia grisella)、アクレリス属の種(Acleris spp.)、例えば、A.フィンブリアーナ(A. fimbriana)、A.グロベラナ(A. gloverana)、A.バリアナ(A. variana);リークモス(Acrolepiopsis assectella)、オオケンモン(Acronicta major)、アドキソファイエス属の種(Adoxophyes spp.)、例えば、A.シルトセマ(A. cyrtosema)、A.オラーナ(A. orana);ナガジロシタバ(Aedia leucomelas)、ヤガ属の種(Agrotis spp.)、例えば、A.エキスクラマチオニス(A. exclamationis)、A.フコサ(A. fucosa)、A.イプシロン(A. ipsilon)、A.オルトゴマ(A. orthogoma)、A.セゲツム(A. segetum)、A.スブテラネア(A. subterranea);アラバマ・アルギラセア(Alabama argillacea)、アレウロジクス・ジスペルスス(Aleurodicus dispersus)、アルソフィラ・ポメタリア(Alsophila pometaria)、アンペロファーガ・ルビギノサ(Ampelophaga rubiginosa)、アミエロイス・トランシテラ(Amyelois transitella)、アナカンプシス・サルシテラ(Anacampsis sarcitella)、アナガスタ・クエーニエラ(Anagasta kuehniella)、アナルシア・リネアテラ(Anarsia lineatella)、アニソータ・セナトリア(Anisota senatoria)、アンテラエア・ペルニイ(Antheraea pernyi)、アンチカルシア(=テルメシア)属の種(Anticarsia (=Thermesia) spp.)、例えば、A.ゲンマタリス(A. gemmatalis);アパメア属の種(Apamea spp.)、アプロアエレマ・モジセラ(Aproaerema modicella)、アルキプス属の種(Archips spp.)、例えば、A.アルギロスピラ(A. argyrospila)、A.フスコクプレアヌス(A. fuscocupreanus)、A.ロサナ(A. rosana)、A.キシロセアヌス(A. xyloseanus);リンゴヒメシンクイ(Argyresthia conjugella)、アルギロプロス属の種(Argyroploce spp.)、アルギロタエニア属の種(Argyrotaenia spp.)、例えば、A.ベルチナナ(A. velutinana);アテチス・ミンダラ(Athetis mindara)、アウストロアスカ・ヴィリジグリセア(Austroasca viridigrisea)、ガンマキンウワバ(Autographa gamma)、アウトグラファ・ニグリシグナ(Autographa nigrisigna)、バラスラ・ブラッシカエ(Barathra brassicae)、ベデリア属の種(Bedellia spp.)、ボナゴタ・サルブリコラ(Bonagota salubricola)、ボルボ・キンナラ(Borbo cinnara)、ブキュラトリクス・スルベリエラ(Bucculatrix thurberiella)、ブパルス・ピニアリウス(Bupalus piniarius)、ブッセオラ属の種(Busseola spp.)、カコエシア属の種(Cacoecia spp.)、例えば、C.ムリナナ(C. murinana)、C.ポダナ(C. podana);カクトブラスチス・カクトルム(Cactoblastis cactorum)、カドラ・カウテラ(Cadra cautella)、カリンゴ・ブラジリエンシス(Calingo braziliensis)、カロプチリス・テイボラ(Caloptilis theivora)、カプア・レティクラーナ(Capua reticulana)、カルポシナ属の種(Carposina spp.)、例えば、C.ニポネンシス(C. niponensis)、C.ササキイ(C. sasakii);セフス属の種(Cephus spp.)、カエトクネマ・アリヅラ(Chaetocnema aridula)、ケイマトビア・ブルマタ(Cheimatobia brumata)、キロ属の種(Chilo spp.)、例えば、C.インジクス(C. Indicus)、C.スップレッサリス(C. suppressalis)、C.パルテルス(C. partellus);ニセリンゴハマキモドキ(Choreutis pariana)、コリストネウラ属の種(Choristoneura spp.)、例えば、C.コンフリクタナ(C. conflictana)、トウヒノシントメハマキ(C. fumiferana)、アトボシハマキ(C. longicellana)、C.ムリナナ、C.オッシデンタリス(C. occidentalis)、C.ロサセアナ(C. rosaceana);クリソデイキシス(=プソイドプルシア)属の種(Chrysodeixis (=Pseudoplusia) spp.)、例えば、C.エリオソマ(C. eriosoma)、C.インクルデンス(C. includens);シルフィス・ウニプンクタ(Cirphis unipuncta)、クリシア・アンビグエラ(Clysia ambiguella)、クナファロセルス属の種(Cnaphalocerus spp.)、コブノメイガ(Cnaphalocrocis medinalis)、クネファシア属の種(Cnephasia spp.)、コキルイス・ホスペス(Cochylis hospes)、ツツミノガ属の種(Coleophora spp.)、オオアメリカモンキチョウ(Colias eurytheme)、コノッポモルファ属の種(Conopomorpha spp.)、コノツラチェラス属の種(Conotrachelus spp.)、コピタルシア属の種(Copitarsia spp.)、ガイマイツヅリガ(Corcyra cephalonica)、ハムシモドキ(Crambus caliginosellus)、シバツトガ(Crambus teterrellus)、クロシドセマ(=エピノチア)・アポレマ(Crocidosema (=Epinotia) aporema)、シダリマ(=ジアファニア)・ペルスペクタリス(Cydalima (=Diaphania) perspectalis)、シジア(=カルポカプサ)属の種(Cydia (=Carpocapsa) spp.)、例えば、コドリンガ(C. pomonella)、C.ラチフェレアナ(C. latiferreana);ダラカ・ノクツイデス(Dalaca noctuides)、ダタナ・インテゲリマ(Datana integerrima)、ダシキラ・ピニコラ(Dasychira pinicola)、デンドロリムス属の種(Dendrolimus spp.)、例えば、D.ピニ(D. pini)、D.スペクタビリス(D. spectabilis)、D.シビリクス(D. sibiricus);デスミア・フネラリス(Desmia funeralis)、ダイアファニア属の種(Diaphania spp.)、例えば、D.ニチダリス(D. nitidalis)、D.ヒアリナタ(D. hyalinata);ジアトラエア・グランジオセラ(Diatraea grandiosella)、ダイアトラエア・サッカラリス(Diatraea saccharalis)、ジフテラ・フェスチバ(Diphthera festiva)、エアリアス属の種(Earias spp.)、例えば、E.インスラナ(E. insulana)、E.ビッテラ(E. vittella);エクジトロファ・アウランチアヌ(Ecdytolopha aurantianu)、エギラ(=キシロミゲス)・クリアリス(Egira (=Xylomyges) curialis)、モロコシマダラメイガ(Elasmopalpus lignosellus)、エルダナ・サッカリナ(Eldana saccharina)、ブドウヒメハマキ(Endopiza viteana)、エンノモス・スブシグナリア(Ennomos subsignaria)、エオロイマ・ロフチニ(Eoreuma loftini)、エフェスチア属の種(Ephestia spp.)、例えば、E.カウテラ(E. cautella)、E.エルテラ(E. elutella)、スジコナマダラメイガ(E. kuehniella);エピノチア・アポレマ(Epinotia aporema)、リンゴウスチャイロハマキ(Epiphyas postvittana)、エランニス・チリアリア(Erannis tiliaria)、エリオノタ・トラキス(Erionota thrax)、エチエラ属の種(Etiella spp.)、ユーリア属の種(Eulia spp.)、ブドウホソハマキ(Eupoecilia ambiguella)、ユープロクティス・クリソロエア(Euproctis chrysorrhoea)、ユークソア属の種(Euxoa spp.)、エベトリア・ボウリアナ(Evetria bouliana)、ファロンタ・アルビリネア(Faronta albilinea)、フェルティア属の種(Feltia spp.)、例えば、F.スブテラネアン(F. subterranean);ハチノスツヅリガ(Galleria mellonella)、グラシラリア属の種(Gracillaria spp.)、グラホリタ属の種(Grapholita spp.)、例えば、G.フネブラナ(G. funebrana)、ナシヒメシンクイ(G. molesta)、リンゴコシンクイ(G. inopinata);ハリシドタ属の種(Halysidota spp.)、ハリシナ・アメリカナ(Harrisina americana)、ヘジレプタ属の種(Hedylepta spp.)、ヘリコベルパ属の種(Helicoverpa spp.)、例えば、オオタバコガ(H. armigera)(=ヘリオティス・アルミゲラ(Heliothis armigera))、H.ゼア(H. zea)(=ヘリオティス・ゼア(Heliothis zea));ヘリオティス属の種(Heliothis spp.)、例えば、タバコガ(H. assulta)、H.スブフレキサ(H. subflexa)、H.ビレセンス(H. virescens);ヘルラ属の種(Hellula spp.)、例えば、H.ウンダリス(H. undalis)、H.ロガタリス(H. rogatalis);ヘロコベルパ・ゲロトポエオン(Helocoverpa gelotopoeon)、ヘミロイカ・オリビア(Hemileuca oliviae)、クロオビクロノメイガ(Herpetogramma licarsisalis)、ヒベルニア・デホリアリア(Hibernia defoliaria)、ホフマノフィラ・シュードスプレテラ(Hofmannophila pseudospretella)、ホモエオソマ・エレクテルム(Homoeosoma electellum)、チャハマキ(Homona magnanima)、ヒペナ・スカブラ(Hypena scabra)、アメリカシロヒトリ(Hyphantria cunea)、ヒポノメウタ・パデラ(Hyponomeuta padella)、ヒポノメウタ・マリネルス(Hyponomeuta malinellus)、カキヴォリア・フラヴォファスシアタ(Kakivoria flavofasciata)、ケイフェリア・リコペルシケラ(Keiferia lycopersicella)、ランブジナ・フィセラリア・フィセラリア(Lambdina fiscellaria fiscellaria)、ランブジナ・フィセラリア・ルグブロサ(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、ランプロセマ・インジカタ(Lamprosema indicata)、ラスペイレシア・モレスタ(Laspeyresia molesta)、マメシンクイガ(Leguminivora glycinivorella)、レロデア・オイファラ(Lerodea eufala)、ロイシノデス・オーボナリス(Leucinodes orbonalis)、ヤナギドクガ(Leucoma salicis)、ロイコプテラ属の種(Leucoptera spp.)、例えば、L.コフェエラ(L. coffeella)、L.シテラ(L. scitella);ロイミニボラ・リシニボレラ(Leuminivora lycinivorella)、リトコレチス・ブランカルデラ(Lithocolletis blancardella)、リトファン・アンテナータ(Lithophane antennata)、ラッチア・オクト(Llattia octo)(=アミナ・アキシス(Amyna axis))、ロベシア・ボトラナ(Lobesia botrana)、ロホカンパ属の種(Lophocampa spp.)、ロキサグロチス・アルビコスタ(Loxagrotis albicosta)、ロキソステグ属の種(Loxostege spp.)、例えば、L.スチクチカリス(L. sticticalis)、L.セレラリス(L. cereralis);リマントリア属の種(Lymantria spp.)、例えば、マイマイガ(L. dispar)、ノンネマイマイ(L. monacha);モモハモグリガ(Lyonetia clerkella)、リオネチア・プルニホリエラ(Lyonetia prunifoliella)、マラコソマ属の種(Malacosoma spp.)、例えば、M.アメリカヌム(M. americanum)、M.カリホルニクム(M. californicum)、M.コンストリクツム(M. constrictum)、オビカレハ(M. neustria);マメストラ属の種(Mamestra spp.)、例えば、ヨトウガ(M. brassicae)、M.コンフィグラタ(M. configurata);マムストラ・ブラッシカ(Mamstra brassicae)、マンズカ属の種(Manduca spp.)、例えば、M.キンクマクラタ(M. quinqu
emaculata)、タバコスズメガ(M. sexta);マラスミア属の種(Marasmia spp)、マルマラ属の種(Marmara spp.)、マメノメイガ(Maruca testulalis)、メガロピグ・ラナタ(Megalopyge lanata)、メランクラ・ピクタ(Melanchra picta)、ウスイロコノマチョウ(Melanitis leda)、モキス属の種(Mocis spp.)、例えば、M.ラピテス(M. lapites)、M.レパンダ(M. repanda);モシス・ラチペス(Mocis latipes)、モノクロア・フラガリア(Monochroa fragariae)、アワヨトウ(Mythimna separata)、ネマポゴン・クロアセラ(Nemapogon cloacella)、ネオロイシノデス・エレガンタリス(Neoleucinodes elegantalis)、ネピチア属の種(Nepytia spp.)、ニムフラ属の種(Nymphula spp.)、オイケチクス属の種(Oiketicus spp.)、マエウスキノメイガ(Omiodes indicata)、サツマイモノメイガ(Omphisa anastomosalis)、ナミスジフユナミシャク(Operophtera brumata)、オルギア・プソイドツガタ(Orgyia pseudotsugata)、オリア属の種(Oria spp.)、オルタガ・チリサリス(Orthaga thyrisalis)、オストリニア属の種(Ostrinia spp.)、例えば、O.ヌビラリス(O. nubilalis);イネクビホソハムシ(Oulema oryzae)、パレアクリタ・ベルナタ(Paleacrita vernata)、マツキリガ(Panolis flammea)、パルナラ属の種(Parnara spp.)、パパイペマ・ネブリス(Papaipema nebris)、パピリオ・クレスホンテス(Papilio cresphontes)、パラミエロイス・トランスイテラ(Paramyelois transitella)、ブドウスカシバ(Paranthrene regalis)、パイサンジシア・アルコン(Paysandisia archon)、ペクチノフォラ属の種(Pectinophora spp.)、例えば、P.ゴッシピエラ(P. gossypiella);ニセタマナヤガ(Peridroma saucia)、ペリロイコプテラ属の種(Perileucoptera spp.)、例えば、P.コフェエラ(P. coffeella);ファレラ・ブセファラ(Phalera bucephala)、フリガニジア・カリホルニカ(Phryganidia californica)、フソリマエア属の種(Phthorimaea spp.)、例えば、P.オペルクレラ(P. operculella);ミカンコハモグリ(Phyllocnistis citrella)、フィロノリクテル属の種(Phyllonorycter spp.)、例えば、P.ブランカルデラ(P. blancardella)、P.クラタエゲラ(P. crataegella)、ホソスジキンモンホソガ(P. issikii)、キンモンホソガ(P. ringoniella);ピエリス属の種(Pieris spp.)、例えば、オオモンシロチョウ(P. brassicae)、モンシロチョウ(P. rapae)、エゾスジグロシロチョウ(P. napi);ピロクロシス・トリプンクタタ(Pilocrocis tripunctata)、プラチペナ・スカブラ(Plathypena scabra)、プラチノタ属の種(Platynota spp.)、例えば、P.フラベダナ(P. flavedana)、P.イダオイサリス(P. idaeusalis)、P.スツルタナ(P. stultana);プラチプチリア・カルズイダクチルア(Platyptilia carduidactyla)、ヒメシジミ(Plebejus argus)、ノシメマダラメイガ(Plodia interpunctella)、プルシア属の種(Plusia spp)、プルテッラ・マクリペンニス(Plutella maculipennis)、コナガ(Plutella xylostella)、ポンチア・プロトジカ(Pontia protodica)、プライス属の種(Prays spp.)、プロデニア属の種(Prodenia spp.)、プロキセヌス・レピゴン(Proxenus lepigone)、シュードアレティア属の種(Pseudaletia spp.)、例えば、P.セクアキス(P. sequax)、P.ウニプンクタ(P. unipuncta);ピラウスタ・ヌビラリス(Pyrausta nubilalis)、ラキプルシア・ヌ(Rachiplusia nu)、リキア・アルビコスタ(Richia albicosta)、リゾビウス・ヴェントラリス(Rhizobius ventralis)、リアキオニア・フルストラナ(Rhyacionia frustrana)、サブロデス・アエグロタタ(Sabulodes aegrotata)、スキズラ・コンシンナ(Schizura concinna)、スコエノビウス属の種(Schoenobius spp.)、タテジマホソマイコガ(Schreckensteinia festaliella)、スキルポファガ属の種(Scirpophaga spp.)、例えば、イッテンオオメイガ(S. incertulas)、S.インノタタ(S. innotata);スコティア・セゲツム(Scotia segetum)、セサミア属の種(Sesamia spp.)、例えば、イネヨトウ(S. inferens)、トビイロトラガ(Seudyra subflava)、バクガ(Sitotroga cerealella)、テングハマキ(Sparganothis pilleriana)、リンゴハイイロハマキ(Spilonota lechriaspis)、リンゴシロヒメハマキ(S. ocellana)、スポドプテラ(=ランフィグマ)属の種(Spodoptera (=Lamphygma) spp.)、例えば、S.エリダニア(S. eridania)、S.エキシグア(S. exigua)、ツマジロクサヨトウ(S. frugiperda)、S.ラチスファシア(S. latisfascia)、エジプトヨトウ(S. littoralis)、ハスモンヨトウ(S. litura)、S.オミトガリ(S. omithogalli);スチグメラ属の種(Stigmella spp.)、ストモプテリクス・サブセシヴェラ(Stomopteryx subsecivella)、ランタナシジミ(Strymon bazochii)、ワタノメイガ(Sylepta derogata)、シナンセドン属の種(Synanthedon spp.)、例えば、S.エキシチオサ(S. exitiosa)、テシア・ソラニヴォラ(Tecia solanivora)、テレヒン・リクス(Telehin licus)、タウマトポエア・ピチオカンパ(Thaumatopoea pityocampa)、タウマトチビア(=クリプトフレビア)・ロイコトレタ(Thaumatotibia (=Cryptophlebia) leucotreta)、タウメトポエア・ピチオカンパ(Thaumetopoea pityocampa)、テクラ属の種(Thecla spp.)、テレシミマ・アンペロファガ(Theresimima ampelophaga)、チリンテイナ属の種(Thyrinteina spp)、チルデニア・インコンスピクエラ(Tildenia inconspicuella)、チネア属の種(Tinea spp.)、例えば、T.クロアセラ(T. cloacella)、イガ(T. pellionella);コイガ(Tineola bisselliella)、トルトリクス属の種(Tortrix spp.)、例えば、T.ビリダナ(T. viridana);トリコファガ・タペトゼラ(Trichophaga tapetzella)、トリコプルシア属の種(Trichoplusia spp.)、例えば、イラクサギンウワバ(T. ni);ツタ(=スクロビパルプラ)・アブソルタ(Tuta (=Scrobipalpula) absoluta)、ウデア属の種(Udea spp.)、例えば、U.ルビガリス(U. rubigalis)、
U.ルビガリス(U. rubigalis);ビラコラ属の種(Virachola spp.)、ヨーロッパリンゴスガ(Yponomeuta padella)、及びゼイラフェラ・カナデンシス(Zeiraphera canadensis);鞘翅目(Coleoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、アカリンマ・ビタタム(Acalymma vittatum)、インゲンマメゾウムシ(Acanthoscehdes obtectus)、アドレタス属の種(Adoretus spp.)、アゲラスティカ・アルニ(Agelastica alni)、ナガタマムシ属の種(Agrilus spp.)、例えば、A.アンキシウス(A. anxius)、アオナガタマムシ(A. planipennis)、アカバナガタマムシ(A. sinuatus);カバイロコメツキ属の種(Agriotes spp.)、例えば、トビイロムナボソコメツキ(A. fuscicollis)、A.リネアツス(A. lineatus)、A.オブスクルス(A. obscurus);ガイマイゴミムシダマシ(Alphitobius diaperinus)、アンフィマルス・ソルスチチアリス(Amphimallus solstitialis)、アニサンドルス・ジスパル(Anisandrus dispar)、アニソプリア・アウストリアカ(Anisoplia austriaca)、アノビウム・プンクタツム(Anobium punctatum)、アノマラ・コルプレンタ(Anomala corpulenta)、ヒメコガネ(Anomala rufocuprea)、ゴマダラカミキリ属の種(Anoplophora spp.)、例えば、ツヤハダゴマダラカミキリ(A. glabripennis);アンソノマス属の種(Anthonomus spp.)、例えば、トウガラシゾウムシ(A. eugenii)、ワタミハナゾウムシ(A. grandis)、リンゴハナゾウムシ(A. pomorum);マルカツオブシムシ属の種(Anthrenus spp.)、アフトナ・ユーホリダエ(Aphthona euphoridae)、アピオン属の種(Apion spp.)、アポゴニア属の種(Apogonia spp.)、アソウス・ハエモロイダリス(Athous haemorrhoidalis)、アトマリア属の種(Atomaria spp.)、例えば、A.リネアリス(A. linearis);ヒメカツオブシムシ属の種(Attagenus spp.)、ウリハムシ(Aulacophora femoralis)、ブラストファガス・ピニペルダ(Blastophagus piniperda)、ブリトファガ・ウンダタ(Blitophaga undata)、ブルキディウス・オブテクタス(Bruchidius obtectus)、ブルーカス属の種(Bruchus spp.)、例えば、B.レンチス(B. lentis)、B.ピソルム(B. pisorum)、B.ルフィマヌス(B. rufimanus);ビクチスクス・ベツラ(Byctiscus betulae)、ヒメスギカミキリ(Callidiellum rufipenne)、カロピストリア・フロリデンシス(Callopistria floridensis)、アズキマメゾウムシ(Callosobruchus chinensis)、カメラリア・オーリデラ(Cameraria ohridella)、カメノコハムシ(Cassida nebulosa)、セロトマ・トリフルカタ(Cerotoma trifurcata)、キンイロハナムグリ(Cetonia aurata)、ケウトリンクス属の種(Ceuthorhynchus spp.)、例えば、C.アッシミリス(C. assimilis)、C.ナピ(C. napi);ケトクネマ・ティビアリス(Chaetocnema tibialis)、クレオヌス・メンディクス(Cleonus mendicus)、コノデルス属の種(Conoderus spp.)、例えば、C.ベスペルチヌス(C. vespertinus);スモモゾウムシ(Conotrachelus nenuphar)、コスモポリテス属の種(Cosmopolites spp.)、コステリトラ・ジーランディカ(Costelytra zealandica)、クリオセリス・アスパラギ(Crioceris asparagi)、サビカクムネヒラタムシ(Cryptolestes ferrugineus)、ヤナギシリジロゾウムシ(Cryptorhynchus lapathi)、クテニセラ属の種(Ctenicera spp.)、例えば、C.デストルクトル(C. destructor);シギゾウムシ属の種(Curculio spp.)、シリンドロコプツルス属の種(Cylindrocopturus spp.)、コガネカブト属の種(Cyclocephala spp.)、ダクチルイスパ・バリイ(Dactylispa balyi)、デクテス
・テキサヌス(Dectes texanus)、デルメステス属の種(Dermestes spp.)、ジアブロティカ属の種(Diabrotica spp.)、例えば、D.ウンデシンプンクタタ(D. undecimpunctata)、D.スペシオサ(D. speciosa)、D.ロンギコルニス(D. longicornis)、D.セミプンクタタ(D. semipunctata)、D.ビルギフェラ(D. virgifera);ジアプレペス・アッブレビアテス(Diaprepes abbreviates)、ディコクロシス属の種(Dichocrocis spp.)、ディクラディスパ・アルミゲラ(Dicladispa armigera)、アブデルスツノカブト(Diloboderus abderus)、ジオカランドラ・フルメンチ(Diocalandra frumenti)(ジオカランドラ・スチグマチコリサ(Diocalandra stigmaticollis))、エナファロデス・ルフルス(Enaphalodes rufulus)、エピラクナ属の種(Epilachna spp.)、例えば、インゲンテントウ(E. varivestis)、オオニジュウヤホシテントウ(E. vigintioctomaculata);エピトリックス属の種(Epitrix spp.)、例えば、タバコノミハムシ(E. hirtipennis)、E.シミラリス(E. similaris);オイテオラ・フミリス(Eutheola humilis)、ユーチノボトルス・ブラシリエンシス(Eutinobothrus brasiliensis)、ファウスチヌス・クバエ(Faustinus cubae)、セマルヒョウホンムシ(Gibbium psylloides)、オオツノコクヌストモドキ(Gnathocerus cornutus)、ハイマダラノメイガ(Hellula undalis)、ヘテロニカス・アラトル(Heteronychus arator)、ヒラモルファ・エレガンス(Hylamorpha elegans)、ヒロビウス・アビエチス(Hylobius abietis)、オウシュウイエカミキリ(Hylotrupes bajulus)、ヒペラ属の種(Hypera spp.)、例えば、H.ブルンネイペンニス(H. brunneipennis)、アルファルファタコゾウムシ(H. postica);ヒポメセス・スクアモスス(Hypomeces squamosus)、ハイポセネムス属の種(Hypothenemus spp.)、ヤツバキクイムシ(Ips typographus)、ラクノステルナ・コンサングイネア(Lachnosterna consanguinea)、タバコシバンムシ(Lasioderma serricorne)、コゴメゴミムシダマシ(Latheticus oryzae)、ラトリジウス属の種(Lathridius spp.)、レマ属の種(Lema spp.)、例えば、L.ビリネアタ(L. bilineata)、L.メラノプス(L. melanopus);レプチノタルサ属の種(Leptinotarsa spp.)、例えば、コロラドハムシ(L. decemlineata);レプチスパ・ピグマエア(Leptispa pygmaea)、リモニウス・カリホルニカス(Limonius californicus)、イネミズゾウムシ(Lissorhoptrus oryzophilus)、リクサス属の種(Lixus spp.)、ルペロデス属の種(Luperodes spp.)、リクタス属の種(Lyctus spp.)、例えば、L.ブルノイス(L. bruneus);リオゲニス・フスクス(Liogenys fuscus)、マクロダクチルウス属の種(Macrodactylus spp.)、例えば、M.スブスピノスス(M. subspinosus);マラデラ・マトリダ(Maladera matrida)、メガプラチプス・ムタテス(Megaplatypus mutates)、メガスセリス属の種(Megascelis spp.)、メラノツス・コンムニス(Melanotus communis)、チビケシキスイ属の種(Meligethes spp.)、例えば、M.アエノイス(M. aeneus);メロロンタ属の種(Melolontha spp.)、例えば、M.ヒッポカスタニ(M. hippocastani)、M.メロロンタ(M. melolontha);メタマシウス・ヘミプテルス(Metamasius hemipterus)、ミクロテカ属の種(Microtheca spp.)、ミグドルス属の種(Migdolus spp.)、例えば、M.フリアヌス(M. fryanus)、ヒゲナガカミキリ属の種(Monochamus spp.)、例えば、マツノマダラカミキリ(M. alternatus);ナウパクツス・キサンソグラフス(Naupactus xanthographus)、ニプトゥス・ホロレウクス(Niptus hololeucus)、オベリア・ブレビス(Oberia brevis)、オエモナ・ヒルタ(Oemona hirta)、サイカブト(Oryctes rhinoceros)、ノコギリヒラタムシ(Oryzaephilus surinamensis)、オリザファガス・オリザエ(Oryzaphagus oryzae)、オチオリンクス・スルカタス(Otiorrhynchus sulcatus)、オチオリンクス・オバタス(Otiorrhynchus ovatus)、オチオリンクス・スルカタス(Otiorrhynchus sulcatus)、オウレマ・メラノプス(Oulema melanopus)、オウレマ・オリゼエ(Oulema oryzae)、コアオハナムグリ(Oxycetonia jucunda)、ファエドン属の種(Phaedon spp.)、例えば、ダイコンハムシ(P. brassicae)、P.コクレアリア(P. cochleariae);ホラカンタ・レクルバ(Phoracantha recurva)、フィロビウス・ピリ(Phyllobius pyri)、フィロペルタ・ホルチコラ(Phyllopertha horticola)、フィロファガ属の種(Phyllophaga spp.)、例えば、P.ヘレリ(P. helleri);キスジノミハムシ属の種(Phyllotreta spp.)、例えば、P.クリソセファラ(P. chrysocephala)、P.ネモルム(P. nemorum)、P.ストリオラタ(P. striolata)、P.ビッツラ(P. vittula);フィロペルタ・
ホルチコラ(Phyllopertha horticola)、マメコガネ(Popillia japonica)、プレムノトリペス属の種(Premnotrypes spp.)、キボシカミキリ(Psacothea hilaris)、プシリオデス・クリソセファラ(Psylliodes chrysocephala)、オオコナナガシンクイ(Prostephanus truncates)、ナガスネトビハムシ属の種(Psylliodes spp.)、プチナス属の種(Ptinus spp.)、プルガ・サルトナ(Pulga saltona)、リゾペルタ・ドミニカ(Rhizopertha dominica)、リンコホルス属の種(Rhynchophorus spp.)、例えば、R.ビリネアツス(R. billineatus)、ヤシオオオサゾウムシ(R. ferrugineus)、ヤシオサゾウムシ(R. palmarum)、R.ホエニシス(R. phoenicis)、R.ブルネラツス(R. vulneratus);サペルダ・カンジダ(Saperda candida)、スコリツス・スケビレウィ(Scolytus schevyrewi)、シホホルス・アクプンクタツス(Scyphophorus acupunctatus)、アカアシチビコフキゾウムシ(Sitona lineatus)、コクゾウムシ属の種(Sitophilus spp.)、例えば、S.グラナリア(S. granaria)、ココクゾウムシ(S. oryzae)、コクゾウムシ(S. zeamais);スフェノフォラス属の種(Sphenophorus spp.)、例えば、S.レビス(S. levis);ジンサンシバンムシ(Stegobium paniceum)、ステルネクス属の種(Sternechus spp.)、例えば、S.スブシグナツス(S. subsignatus);ストロホモルフス・クテノツス(Strophomorphus ctenotus)、シンフィレテス属の種(Symphyletes spp.)、タニメカス属の種(Tanymecus spp.)、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)、テネブリオイデス・マウレタニクス(Tenebrioides mauretanicus)、トリボリウム属の種(Tribolium spp.)、例えば、コクヌストモドキ(T. castaneum);トロゴデルマ属の種(Trogoderma spp.)、チキアス属の種(Tychius spp.)、キシロトレカス属の種(Xylotrechus spp.)、例えば、X.ピロデルス(X. pyrrhoderus);及び、ザブルス属の種(Zabrus spp.)、例えば、Z.テネブリオイデス(Z. tenebrioides);双翅目(Diptera)の目(order)からの昆虫、例えば、ヤブカ属の種(Aedes spp.)、例えば、ネッタイシマカ(A. aegypti)、ヒトスジシマカ(A. albopictus)、A.ベキサンス(A. vexans);メキシコミバエ(Anastrepha ludens)、ハマダラカ属の種(Anopheles spp.)、例えば、A.アルビマヌス(A. albimanus)、A.クルシアンス(A. crucians)、A.フレエボルニ(A. freeborni)、ガンビエハマダラカ(A. gambiae)、A.ロイコスフィルス(A. leucosphyrus)、A.マクリペンニス(A. maculipennis)、A.ミニムス(A. minimus)、A.クアドリマクラツス(A. quadrimaculatus)、A.シネンシス(A. sinensis);バクトロセラ・インバデンス(Bactrocera invadens)、ビビオ・ホルツラヌス(Bibio hortulanus)、カリフォラ・エリスロセファラ(Calliphora erythrocephala)、カリフォラ・ビシナ(Calliphora vicina)、チチュウカイミバエ(Ceratitis capitata)、オビキンバエ属の種(Chrysomyia spp.)、例えば、C.ベッジアナ(C. bezziana)、C.ホミニボラキス(C. hominivorax)、C.マセラリア(C. macellaria);クリソプス・アトランチクス(Chrysops atlanticus)、クリソプス・ディスカリス(Chrysops discalis)、クリソプス・シラセア(Chrysops silacea)、コクリオミイヤ属の種(Cochliomyia spp.)、例えば、ラセンウジバエ(C. hominivorax);コンタリニア属の種(Contarinia spp.)、例えば、C.ソルギコラ(C. sorghicola);コルディロビア・アンスロポファガ(Cordylobia anthropophaga)、イエカ属の種(Culex spp.)、例えば、C.ニグリパルプス(C. nigripalpus)、C.ピピエンス(C. pipiens)、C.キンクファシアツス(C. quinquefasciatus)、C.タルサリス(C. tarsalis)、C.トリタエニオリンクス(C. tritaeniorhynchus);クリコイデス・フレンス(Culicoides furens)、クリセタ・イノルナタ(Culiseta inornata)、クリセタ・メラヌラ(Culiseta melanura)、クテレブラ属の種(Cuterebra spp.)、ウリミバエ(Dacus cucurbitae)、ダカス・オレアエ(Dacus oleae)、ダイコンタマバエ(Dasineura brassicae)、ダシノイラ・オキシコッカナ(Dasineura oxycoccana)、デリア属の種(Delia spp.)、例えば、D.アンチク(D. antique)、D.コアルクタタ(D. coarctata)、D.プラツラ(D. platura)、D.ラジクム(D. radicum);ヒトヒフバエ(Dermatobia hominis)、ショウジョウバエ属の種(Drosophila spp.)、例えば、オウトウショウジョウバエ(D. suzukii)、ファニア属の種(Fannia spp.)、例えば、ヒメイエバエ(F. canicularis);ガステロフィルス属の種(Gastraphilus spp.)、例えば、G.インテスチナリス(G. intestinalis);ゲオミザ・チプンクタタ(Geomyza tipunctata)、ツェツェバエ属の種(Glossina spp.)、例えば、G.フシペス(G. fuscipes)、G.モルシタンス(G. morsitans)、G.パルパリス(G. palpalis)、G.タキノイデス(G. tachinoides);ノサシバエ(Haematobia irritans)、ハプロジプロシス・エクエストリス(Haplodiplosis equestris)、ヒッペラテス属の種(Hippelates spp.)、ヒレミア属の種(Hylemyia spp.)、例えば、H.プラツラ(H. platura);ウシバエ属の種(Hypoderma spp.)、例えば、H.リネアタ(H. lineata);ヒッポボスカ属の種(Hyppobosca spp.)、トウヨウイネクキミギワバエ(Hydrellia philippina)、レプトコノプス・トレンス(Leptoconops torrens)、リリオミザ属の種(Liriomyza spp.)、例えば、L.サチバ(L. sativae)、マメハモグリバエ(L. trifolii);キンバエ属の種(Lucilia spp.)、例えば、L.カプリナ(L. caprina)、L.クプリナ(L. cuprina)、ヒロズキンバエ(L. sericata);リコリア・ペクトラリス(Lycoria pectoralis)、マンソニア・ティティラヌス(Mansonia titillanus)、マイエチオラ属の種(Mayetiola spp.)、例えば、M.デストルクトル(M. destructor);ムスカ属の種(Musca spp.)、例えば、M.アウツムナリス(M. autumnalis)、イエバエ(M. domestica);オオイエバエ(Muscina stabulans)、オエストルス属の種(Oestrus spp.)、例えば、ヒツジバエ(O. ovis);オポミザ・フロルム(Opomyza florum)、オシネラ属の種(Oscinella spp.)、例えば、O.フリット(O. frit);オルセオリア・オリゼ(Orseolia oryzae)、ペゴミア・ヒソシアミ(Pegomya hysocyami)、フェレボトムス・アルゲンチペス(Phlebotomus argentipes)、ホルビア属の種(Phorbia spp.)、例えば、P.アンチクア(P. antiqua)、P.ブラッシカ(P. brassicae)、P.コアルクタタ(P. coarctata);フィトミザ・ギムノストマ(Phytomyza gymnostoma)、プロシムリウム・ミクスタム(Prosimulium mixtum)、ニンジンサビバエ(Psila rosae)、プソロフォラ・コロムビアエ(Psorophora columbiae)、プソロフォラ・ディスカラ(Psorophora discolor)、ラゴレチス属の種(Rhagoletis spp.)、例えば、ヨーロッパオウトウミバエ(R. cerasi)、R.シングラート(R. cingulate)、R.インジフェレンス(R. indifferens)、ブルーベリーミバエ(R. mendax)、R.ポモネラ(R. pomonella);リベリア・クアドリファシアタ(Rivellia quadrifasciata)、ニクバエ属の種(Sarcophaga spp.)、例えば、S.ハエモロイダリス(S. haemorrhoidalis);シムリウム・ヴィッタツム(Simulium vittatum)、シトジプロシス・モセラナ(Sitodiplosis mosellana)、サシバエ属の種(Stomoxys spp.)、例えば、サシバエ(S. calcitrans);アブ属の種(Tabanus spp.)、例えば、T.アトラツス(T. atratus)、T.ボビヌス(T. bovinus)、T.リネオラ(T. lineola)、T.シミリス(T. similis);タンニア属の種(Tannia spp.)、テコジプロシス・ジャポネンシス(Thecodiplosis japonensis)、チプラ・オレラセア(Tipula oleracea)、チプラ・パルドサ(Tipula paludosa)、及びウォールファールチア属の種(Wohlfahrtia spp);総翅目(Thysanoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、バリオトリプス・ビフォルミス(Baliothrips biformis)、ジクロモトリプス・コルベッチ(Dichromothrips corbetti)、ジクロモトリプス亜種(Dichromothrips ssp.)、エキノトリプス・アメリカヌス(Echinothrips americanus)、エネオトリプス・フラベンス(Enneothrips flavens)、フランクリニエラ属の種(Frankliniella spp.)
、例えば、F.フスカ(F. fusca)、ミカンキイロアザミウマ(F. occidentalis)、F.トリチシ(F. tritici);ヘリオスリップス属の種(Heliothrips spp.)、ヘルシノスリップス・フェモラリス(Hercinothrips femoralis)、カコスリップス属の種(Kakothrips spp.)、コスモスアザミウマ(Microcephalothrips abdominalis)、トラフアザミウマ(Neohydatothrips samayunkur)、ペゾトリプス・ケリアヌス(Pezothrips kellyanus)、リピフォロスリップス・クルエンタッツス(Rhipiphorothrips cruentatus)、スキルトスリップス属の種(Scirtothrips spp.)、例えば、S.シトリ(S. citri)、チャノキイロアザミウマ(S. dorsalis)、S.ペルセア(S. perseae);ステンカエトトリプス属の種(Stenchaetothrips spp)、タエニオスリップス・カルダモニ(Taeniothrips cardamoni)、ナシアザミウマ(Taeniothrips inconsequens)、スリップス属の種(Thrips spp.)、例えば、T.イマギネス(T. imagines)、T.ハワイイエンシス(T. hawaiiensis)、T.オリザ(T. oryzae)、ミナミキイロアザミウマ(T. palmi)、T.パルビスピヌス(T. parvispinus)、ネギアザミウマ(T. tabaci);半翅目(Hemiptera)の目(order)からの昆虫、例えば、アシッジア・ジャマトニカ(Acizzia jamatonica)、アクロステルヌム属の種(Acrosternum spp.)、例えば、A.ヒラル(A. hilare);アシルトシポン属の種(Acyrthosipon spp.)、例えば、A.オノブリキス(A. onobrychis)、A.ピスム(A. pisum);カラマツカサアブラムシ(Adelges laricis)、ツガカサアブラムシ(Adelges tsugae)、アデルホコリス属の種(Adelphocoris spp.)、例えば、A.ラピズス(A. rapidus)、A.スペルブス(A. superbus);アエネオラミア属の種(Aeneolamia spp.)、アゴノセナ属の種(Agonoscena spp.)、アウラコルサム・ソラニ(Aulacorthum solani)、ミカンクロトゲコナジラミ(Aleurocanthus woglumi)、アレウローデス属の種(Aleurodes spp.)、アレウロジクス・ジスペルセス(Aleurodicus disperses)、アレウロロブス・バロデンシス(Aleurolobus barodensis)、アレウロスリクサス属の種(Aleurothrixus spp.)、アムラスカ属の種(Amrasca spp.)、アナサ・トリスティス(Anasa tristis)、アンテスティオプシス属の種(Antestiopsis spp.)、アヌラフィス・カルドゥイ(Anuraphis cardui)、アオニディエラ属の種(Aonidiella spp.)、アファノスティグマ・ピリ(Aphanostigma piri)、アフィドゥラ・ナスツルチイ(Aphidula nasturtii)、アフィス属の種(Aphis spp.)、例えば、マメアブラムシ(A. craccivora)、マメクロアブラムシ(A. fabae)、A.ホルベシ(A. forbesi)、ワタアブラムシ(A. gossypii)、A.グロッスラリア(A. grossulariae)、A.マイジラジシス(A. maidiradicis)、ヨーロッパリンゴアブラムシ(A. pomi)、ニワトコアブラムシ(A. sambuci)、A.スクネイデリ(A. schneideri)、A.スピラエコラ(A. spiraecola);フタテンヒメヨコバイ(Arboridia apicalis)、アリルス・クリタツス(Arilus critatus)、アスピディエラ属の種(Aspidiella spp.)、アスピディオトゥス属の種(Aspidiotus spp.)、アタヌス属の種(Atanus spp.)、アウラカスピス・ヤスマツイ(Aulacaspis yasumatsui)、アウラコルサム・ソラニ(Aulacorthum solani)、バクテリセラ・コッケレリ(Bactericera cockerelli)(パラトリオザ・コッケレリ(Paratrioza cockerelli))、ベミシア属の種(Bemisia spp.)、例えば、B.アルゲンチホリイ(B. argentifolii)、B.タバシ(B. tabaci)(アレウローデス・タバシ(Aleurodes tabaci));ブリッサス属の種(Blissus spp.)、例えば、B.ロイコプテルス(B. leucopterus);ブラキカウズス属の種(Brachycaudus spp.)、
例えば、B.カルズイ(B. cardui)、ムギワラギクオマルアブラムシ(B. helichrysi)、B.ペルシカ(B. persicae)、B.プルニコラ(B. prunicola);ブラキコルス属の種(Brachycolus spp.)、ブラキコリネラ・アスパラギ(Brachycorynella asparagi)、ブレビコリネ・ブラシカエ(Brevicoryne brassicae)、リンゴキジラミ属の種(Cacopsylla spp.)、例えば、C.フルグラリス(C. fulguralis)、C.ピリコラ(C. pyricola)(プシラ・ピリ(Psylla piri));カリギポナ・マルギナータ(Calligypona marginata)、カロコリス属の種(Calocoris spp.)、キャンピロンマ・リビダ(Campylomma livida)、カピトフォルス・ホルニ(Capitophorus horni)、カルネオセファラ・フルギーダ(Carneocephala fulgida)、カベレリウス属の種(Cavelerius spp.)、セラプラステス属の種(Ceraplastes spp.)、ケラトバクナ・ラニゲラ(Ceratovacuna lanigera)、セロプラステス・セリフェルス(Ceroplastes ceriferus)、セロシファ・ゴッシピイ(Cerosipha gossypii)、カエトシフォン・フラガエフォリ(Chaetosiphon fragaefolii)、キオナスピス・テガレンシス(Chionaspis tegalensis)、クロリタ・オヌキイ(Chlorita onukii)、クロマフィス・ジュグランディコラ(Chromaphis juglandicola)、クリソムファルス・フィクス(Chrysomphalus ficus)、シカヅリナ・ムビラ(Cicadulina mbila)、キメクス属の種(Cimex spp.)、例えば、C.ヘミプテルス(C. hemipterus)、トコジラミ(C. lectularius);ココミティルス・ハリ(Coccomytilus halli)、コッカス属の種(Coccus spp.)、例えば、C.ヘスペリズム(C. hesperidum)、カンキツカタカイガラムシ(C. pseudomagnoliarum);コリツカ・アルクアタ(Corythucha arcuata)、クレオンティアデス・ディルタス(Creontiades dilutus)、クリプトミズス・リビス(Cryptomyzus ribis)、クリソンファルス・アオニズム(Chrysomphalus aonidum)、クリプトミズス・リビス(Cryptomyzus ribis)、クテナリタイナ・スパツラタ(Ctenarytaina spatulata)、シルトペルチス・ノタツス(Cyrtopeltis notatus)、ダルブルス属の種(Dalbulus spp.)、ダシヌス・ピペリス(Dasynus piperis)、ジアレウローデス属の種(Dialeurodes spp.)、例えば、D.シトリホリイ(D. citrifolii);ダルブルス・マイジス(Dalbulus maidis)、ディアフォリーナ属の種(Diaphorina spp.)、例えば、ミカンキジラミ(D. citri);ディアスピス属の種(Diaspis spp.)、例えば、D.ブロメリア(D. bromeliae);ディケロプス・フルカツス(Dichelops furcatus)、ディコノコリス・ヘウエッティ(Diconocoris hewetti)、ドラリス属の種(Doralis spp.)、ドレイフシア・ノルドマニアナ(Dreyfusia nordmannianae)、ドレイフシア・ピセア(Dreyfusia piceae)、ドロシカ属の種(Drosicha spp.)、ディサフィス属の種(Dysaphis spp.)、例えば、オオバコアブラムシ(D. plantaginea)、D.ピリ(D. pyri)、D.ラジコラ(D. radicola);ジサウラコルツム・プソイドソラニ(Dysaulacorthum pseudosolani)、ディスデルカス属の種(Dysdercus spp.)、例えば、D.シングラツス(D. cingulatus)、D.インテルメジウス(D. intermedius);ディスミコックス属の種(Dysmicoccus spp.)、エデッサ属の種(Edessa spp.)、ゲオコリス属の種(Geocoris spp.)、ミドリヒメヨコバイ属の種(Empoasca spp.)、例えば、E.ファバ(E. fabae)、E.ソラナ(E. solana);エピジアスピス・レペリイ(Epidiaspis leperii)、エリオソマ属の種(Eriosoma spp.)、例えば、リンゴワタムシ(E. lanigerum)、E.ピリコラ(E. pyricola);エリトロネウラ属の種(Erythroneura spp.)、ユーリガステル属の種(Eurygaster spp.)、例えば、E.インテグリセプス(E. integriceps);ユーセリス・ビロバタス(Euscelis bilobatus)、ユースキスツス属の種(Euschistus spp.)、例えば、E.ヘロース(E. heros)、E.インピクチベントリス(E. impictiventris)、E.セルブス(E. servus);フィオリニア・テア(Fiorinia theae)、ゲオコックス・コッフェアエ(Geococcus coffeae)、グリカスピス・ブリンブレコンベイ(Glycaspis brimblecombei)、ハリオモルファ属の種(Halyomorpha spp.)、例えば、クサギカメムシ(H. halys);ヘリオペルティス属の種(Heliopeltis spp.)、ホマロジスカ・ビトリペンニス(=H.コアグラタ)(Homalodisca vitripennis(=H. coagulata))、ホルキアス・ノビレルス(Horcias nobilellus)、モモコフキアブラムシ(Hyalopterus pruni)、チシャミドリアブラムシ(Hyperomyzus lactucae)、ワタフキカイガラムシ属の種(Icerya spp.)、例えば、イセリアカイガラムシ(I. purchase);イディオケルス属の種(Idiocerus spp.)、イディオスコプス属の種(Idioscopus spp.)、ラオデルファクス・ストリアテルス(Laodelphax striatellus)、レカニウム属の種(Lecanium spp.)、レカノイデウス・フロッシッシムス(Lecanoideus floccissimus)、レピドサフェス属の種(Lepidosaphes spp.)、例えば、リンゴカキカイガラムシ(L. ulmi);レプトコリサ属の種(Leptocorisa spp.)、レプトグロサス・フィロプス(Leptoglossus phyllopus)、ニセダイコンアブラムシ(Lipaphis erysimi)、リグス属の種(Lygus spp.)、例えば、L.ヘスペルス(L. hesperus)、L.リネオラリス(L. lineolaris)、L.プラテンシス(L. pratensis);マコネリコックス・ヒルスツス(Maconellicoccus hirsutus)、マルカリナ・ヘレニカ(Marchalina hellenica)、マクロペス・エクスカバツス(Macropes excavatus)、マクロシフム属の種(Macrosiphum spp.)、例えば、M.ロサ(M. rosae)、M.アベナ(M. avenae)、M.オイホルビア(M. euphorbiae);マクロステレス・クアドリリネアツス(Macrosteles quadrilineatus)、マハナルバ・フィムブリオラタ(Mahanarva fimbriolata)、タイワンマルカメムシ(Megacopta cribraria)、ソラマメヒゲナガアブラムシ(Megoura viciae)、メラナフィス・ピラリウス(Melanaphis pyrarius)、ヒエノアブラムシ(Melanaphis sacchari)、メラノカリス(=チノカリス)・カリアエホリア(Melanocallis (=Tinocallis) caryaefoliae)、メトカルフィエラ属の種(Metcafiella spp.)、メトポロフィウム・ジルホヅム(Metopolophium dirhodum)、モネリア・コスタリス(Monellia costalis)、モネリオプシス・ペカニス(Monelliopsis pecanis)、ミゾカリス・コリルイ(Myzocallis coryli)、ムルガンチア属の種(Murgantia spp.)、ミズス属の種(Myzus spp.)、例えば、ワケギコブアブラムシ(M. ascalonicus)、M.セラシ(M. cerasi)、M.ニコチアナ(M. nicotianae)、モモアカアブラムシ(M. persicae)、M.バリアンス(M. varians);ナソノビア・リビスニグリ(Nasonovia ribis-nigri)、ネギアブラムシ(Neotoxoptera formosana)、ネオメガロトムス属の種(Neomegalotomus spp)、ネホテティクス属の種(Nephotettix spp.)、例えば、N.マラヤヌス(N. malayanus)、クロスジツマグロヨコバイ(N. nigropictus)、N.パルブス(N. parvus)、N.ビレセンス(N. virescens);ネザラ属の種(Nezara spp.)、例えば、ミナミアオカメムシ(N. viridula);トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、ニシウス・フットニ(Nysius huttoni)、オエバルス属の種(Oebalus spp.)、例えば、O.プグナキス(O. pugnax);オンコメトピア属の種(Oncometopia spp.)、オルテジア・プラエロンガ(Orthezia praelonga)、オキシカラエヌス・ヒアリニペンニス(Oxycaraenus hyalinipennis)、ヤマモモコナジラミ(Parabemisia myricae)、パルラトリア属の種(Parlatoria spp.)、パルテノレカニウム属の種(Parthenolecanium spp.)、例えば、ミズキカタカイガラムシ(P. corni)、P.ペルシカ(P. persicae);ペムフィグス属の種(Pemphigus spp.)、例えば、P.ブルサリウス(P. bursarius)、P.ポプリベナ(P. populivenae);ペレグリヌス・マイディス(Peregrinus maidis)、クロフツノウンカ(Perkinsiella saccharicida)、フェナコッカス属の種(Phenacoccus spp.)、例えば、P.アセリス(P. aceris)、メキシココナカイガラムシ(P. gossypii);フロエオミズス・パセリニイ(Phloeomyzus passerinii)、ホップイボアブラムシ(Phorodon humuli)、フィロクセラ属の種(Phylloxera spp.)、例えば、P.デバスタトリキス(P. devastatrix)、ピエスマ・クアドラタ(Piesma quadrata)、ピエゾドラス属の種(Piezodorus spp.)、例えば、P.グイルジニイ(P. guildinii);ピナスピス・アスピディストラエ(Pinnaspis aspidistrae)、プラノコッカス属の種(Planococcus spp.)、例えば、ミカンコナカイガラムシ(P. citri)、P.フィクス(P. ficus);プロサピア・ビシンクタ(Prosapia bicincta)、ナシガタカタカイガラムシ(Protopulvinaria pyriformis)、プサルス・セリアツス(Psallus seriatus)、シューダシスタ・ぺルセア(Pseudacysta persea)、クワシロカイガラムシ(Pseudaulacaspis pentagona)、シュードコッカス属の種(Pseudococcus spp.)、例えば、クワコナカイガラムシ(P. comstocki);プシラ属の種(Psylla spp.)、例えば、リンゴキジラミ(P. mali);プテロマルス属の種(Pteromalus spp.)、プルビナリア・アミグダリ(Pulvinaria amygdali)、ピリラ属の種(Pyrilla spp.)、クアドラスピディオツス属の種(Quadraspidiotus spp.)、例えば、ナシマルカイガラムシ(Q. perniciosus);クエサダ・ギガス(Quesada gigas)、ラストロコッカス属の種(Rastrococcus spp.)、レデュビウス・セニリス(Reduvius senilis)、リゾエクス・アメリカヌス(Rhizoecus americanus)、ロドニウス属の種(Rhodnius spp.)、ロパロミズス・アスカロニクス(Rhopalomyzus ascalonicus)、ロパロシファム属の種(Rhopalosiphum spp.)、例えば、ニセダイコンアブラムシ(R. pseudobrassicas)、リンゴクビレアブラムシ(R. insertum)、トウモロコシアブラムシ(R. maidis)、ムギクビレアブラムシ(R. padi);サガトデス属の種(Sagatodes spp.)、サールベルゲラ・シンギュラリス(Sahlbergella singularis)、サイセティア属の種(Saissetia spp.)、サッパフィス・マラ(Sappaphis mala)、サッパフィス・マリ(Sappaphis mali)、スカプトコリス属の種(Scaptocoris spp.)、スカホイデス・ティタヌス(Scaphoides titanus)、ムギミドリアブラムシ(Schizaphis graminum)、シゾネウラ・ラヌギノサ(Schizoneura lanuginosa)、スコチノフォラ属の種(Scotinophora spp.)、セレナスピヅス・アルティキュラツス(Selenaspidus articulatus)、シトビオン・アベナエ(Sitobion avenae)、ソガタ属の種(Sogata spp.)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)、ソルベア・インスラリス(Solubea insularis)、スピッシスチルス・フェスチヌス(=スティクトセファラ・フェスティナ)(Spissistilus festinus(=Stictocephala festina))、ナシグンバイ(Stephanitis nashi)、ツツジグンバイ(Stephanitis pyrioides)、トサカグンバイ(Stephanitis takeyai)、テナラファラ・マレイエンシス(Tenalaphara malayensis)、テトラロイロデス・ペルセア(Tetraleurodes perseae)、テリオアフィス・マクラート(Therioaphis maculate)、チアンタ属の種(Thyanta spp.)、例えば、T.アッセラ(T. accerra)、T.ペルジトル(T. perditor);ティブラカ属の種(Tibraca spp.)、トマスピス属の種(Tomaspis spp.)、トキソプテラ属の種(Toxoptera spp.)
、例えば、コミカンアブラムシ(T. aurantii);トリアレウロデス属の種(Trialeurodes spp.)、例えば、T.アブチロネア(T. abutilonea)、T.リシニ(T. ricini)、オンシツコナジラミ(T. vaporariorum);サシガメ属の種(Triatoma spp.)、トリオーザ属の種(Trioza spp.)、チフロシバ属の種(Typhlocyba spp.)、ウナスピス属の種(Unaspis spp.)、例えば、ニセヤノネカイガラムシ(U. citri)、ヤノネカイガラムシ(U. yanonensis);及びブドウネアブラムシ(Viteus vitifolii);膜翅目(Hymenoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、アカントミオプス・インテルジェクツス(Acanthomyops interjectus)、カブラハバチ(Athalia rosae)、アッタ属の種(Atta spp.)、例えば、A.カピグアラ(A. capiguara)、A.セファロテス(A. cephalotes)、A.セファロテス(A. cephalotes)、A.ラエビガタ(A. laevigata)、A.ロブスタ(A. robusta)、A.セキスデンス(A. sexdens)、A.テキサナ(A. texana)、マルハナバチ属の種(Bombus spp.)、コツブアリ属の種(Brachymyrmex spp.)、オオアリ属の種(Camponotus spp.)、例えば、C.フロリダヌス(C. floridanus)、C.ペンシルバニクス(C. pennsylvanicus)、C.モドク(C. modoc);ハダカアリ(Cardiocondyla nuda)、カリビオン属の種(Chalibion sp)、シリアゲアリ属の種(Crematogaster spp.)、ダシムチラ・オッシデンタリス(Dasymutilla occidentalis)、ディプリオン属の種(Diprion spp.)、ドリコベスプラ・マクラータ(Dolichovespula maculata)、ドリミルメキス属の種(Dorymyrmex spp.)、クリタマバチ(Dryocosmus kuriphilus)、ホルミカ属の種(Formica spp.)、ホプロカンパ属の種(Hoplocampa spp.)、例えば、H.ミヌタ(H. minuta)、H.テスツジネア(H. testudinea);イリドミルメキス・フミリス(Iridomyrmex humilis)、ケアリ属の種(Lasius spp.)、例えば、トビイロケアリ(L. niger)、アルゼンチンアリ(Linepithema humile)、リオメトプム属の種(Liometopum spp.)、レプトシブ・インバサ(Leptocybe invasa)、ヒメアリ属の種(Monomorium spp.)、例えば、イエヒメアリ(M. pharaonis)、ヒメアリ(Monomorium)、ニルアンドリア・フルバ(Nylandria fulva)、オオハリアリ(Pachycondyla chinensis)、ヒゲナガアメイロアリ(Paratrechina longicornis)、パラベスプラ属の種(Paravespula spp.)、例えば、P.ゲルマニカ(P. germanica)、P.ペンシルバニカ(P. pennsylvanica)、P.ブルガリス(P. vulgaris);オオズアリ属の種(Pheidole spp.)、例えば、ツヤオオズアリ(P. megacephala);シュウカクアリ属の種(Pogonomyrmex spp.)、例えば、P.バルバツス(P. barbatus)、P.カリホルニクス(P. californicus)、ポリステス・ルビギノサ(Polistes rubiginosa)、プレノレピス・インパイルス(Prenolepis impairs)、プソイドミルメキス・グラシリス(Pseudomyrmex gracilis)、スケリプロン属の種(Schelipron spp.)、シレキス・シアノイス(Sirex cyaneus)、トフシアリ属の種(Solenopsis spp.)、例えば、アカカミアリ(S. geminata)、ヒアリ(S.invicta)、S.モレスタ(S. molesta)、S.リクテリ(S. richteri)、S.キシロニ(S. xyloni)、スフェシウス・スペシオスス(Sphecius speciosus)、スフェキス属の種(Sphex spp.)、コヌカアリ属の種(Tapinoma spp.)、例えば、アワテコヌカアリ(T. melanocephalum)、T.セッシル(T. sessile);シワアリ属の種(Tetramorium spp.)、例えば、T.カエスピツム(T. caespitum)、T.ビカリナツム(T. bicarinatum)、スズメバチ属の種(Vespa spp.)、例えば、V.クラブロ(V. crabro);クロスズメバチ属の種(Vespula spp.)、例えば、V.スクアモサール(V. squamosal);コカミアリ(Wasmannia auropunctata)、クマバチ属の種(Xylocopa sp);直翅目(Orthoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、ヨーロッパイエコオロギ(Acheta domesticus)、カリプタマス・イタリカス(Calliptamus italicus)、オーストラリアトビバッタ(Chortoicetes terminifera)、コイトフィルス属の種(Ceuthophilus spp.)、ジアストランメナ・アシナモラ(Diastrammena asynamora)、ドシオスタウラス・マロッカナス(Dociostaurus maroccanus)、グリロタルパ属の種(Gryllotalpa spp.)、例えば、G.アフリカナ(G. africana)、G.グリルロタルパ(G. gryllotalpa);グリルルス属の種(Gryllus spp.)、ヒエログリフス・ダガネンシス(Hieroglyphus daganensis)、クラウッサリア・アングリフェラ(Kraussaria angulifera)、トノサマバッタ属の種(Locusta spp.)、例えば、トノサマバッタ(L. migratoria)、L.パルダリナ(L. pardalina);メラノプルス属の種(Melanoplus spp.)、例えば、M.ビビッタツス(M. bivittatus)、M.フェムルブルム(M. femurrubrum)、M.メキシカヌス(M. mexicanus)、M.サングイニペス(M. sanguinipes)、ロッキートビバッタ(M. spretus);アカトビバッタ(Nomadacris septemfasciata)、オエダレウス・セネガレンシス(Oedaleus senegalensis)、スカプテリスクス属の種(Scapteriscus spp.)、シストセルカ属の種(Schistocerca spp.)、例えば、アメリカイナゴ(S. americana)、サバクトビバッタ(S. gregaria)、ステモペルマツス属の種(Stemopelmatus spp.)、クラズミウマ(Tachycines asynamorus)、及びゾノゼラス・バリエガタス(Zonozerus variegatus);蛛形綱(Arachnida)の綱(Class)からの有害生物、例えば、ダニ類(Acari)、例えば、以下の科(family)、ヒメダニ科(Argasidae)、マダニ科(Ixodidae)及びヒゼンダニ科(Sarcoptidae)、例えば、キララマダニ属の種(Amblyomma spp.)(例えば、A.アメリカヌム(A. americanum)、A.バリエガツム(A. variegatum)、A.マクラツム(A. maculatum))、ナガヒメダニ属の種(Argas spp.)、例えば、A.ペルシク(A. persicu))、ウシマダニ属の種(Boophilus spp.)、例えば、B.アンヌラツス(B. annulatus)、B.デコロラツス(B. decoloratus)、B.ミクロプルス(B. microplus)、カクマダニ属の種(Dermacentor spp.)、例えば、D.シルバルム(D. silvarum)、D.アンデルソニ(D. andersoni)、D.バリアビリス(D. variabilis)、イボマダニ属の種(Hyalomma spp.)、例えば、H.トルンカツム(H. truncatum)、マダニ属の種(Ixodes spp.)、例えば、マダニ(I. ricinus)、I.ルビクンズス(I. rubicundus)、I.スカプラリス(I. scapularis)、I.ホロシクルス(I. holocyclus)、I.パシフィクス(I. pacificus)、クリイロコイタマダニ(Rhipicephalus sanguineus)、オルニトドルス属の種(Ornithodorus spp.)、例えば、O.モウバタ(O. moubata)、O.ヘルムシ(O. hermsi)、O.ツリカタ(O. turicata)、イエダニ(Ornithonyssus bacoti)、オトビウス・メグニニ(Otobius megnini)、ワクモ(Dermanyssus gallinae)、プソロプテス属の種(Psoroptes spp.)、例えば、P.オビス(P. ovis)、コイタマダニ属の種(Rhipicephalus spp.)、例えば、クリイロコイタマダニ(R. sanguineus)、R.アッペンジクラツス(R. appendiculatus)、リピセファラス・エベルトシ(Rhipicephalus evertsi)、リゾグリフス属の種(Rhizoglyphus spp.)、サルコプテス属の種(Sarcoptes spp.)、例えば、ヒゼンダニ(S. Scabiei);及び科(Family)フシダニ科(Eriophyidae)、例えば、アセリア属の種(Aceria spp.)、例えば、A.シェルドニ(A. sheldoni)、A.アントコプテス(A. anthocoptes)、アカリツス属の種(Acallitus spp.)、アクロプス属の種(Aculops spp.)、例えば、トマトサビダニ(A. lycopersici)、ミカンサビダニ(A. pelekassi);アクルス属の種(Aculus spp.)、例えば、A.スクレクテンダリ(A. schlechtendali);コロメルス・ビチス(Colomerus vitis)、ナシサビダニ(Epitrimerus pyri)、ミカンサビダニ(Phyllocoptruta oleivora);エリオフィテス・リビス(Eriophytes ribis)及びエリオフィエス属の種(Eriophyes spp.)、例えば、エリオフィエス・シェルドニ(Eriophyes sheldoni);科(Family)ホコリダニ科(Tarsonemidae)、例えば、ヘミタルソネムス属の種(Hemitarsonemus spp.)、シクラメンホコリダニ(Phytonemus pallidus)及びポリファゴタルソネムス・ラタス(Polyphagotarsonemus latus)、ステノタルソネムス属の種(Stenotarsonemus spp.)、ステネオタルソネムス・スピンキ(Steneotarsonemus spinki);科(Family)ヒメハダニ科(Tenuipalpidae)、例えば、ブレビパルプス属の種(Brevipalpus spp.)、例えば、B.ホエニシス(B. phoenicis);科(Family)ハダニ科(Tetranychidae)、例えば、エオテトラニクス属の種(Eotetranychus spp.)、エウテトラニクス属の種(Eutetranychus spp.)、オリゴニクス属の種(Oligonychus spp.)、ペトロビア・ラテンス(Petrobia latens)、テトラニカス属の種(Tetranychus spp.)、例えば、ニセナミハダニ(T. cinnabarinus)、T.エバンシ(T. evansi)、T.カンザワイ(T. kanzawai)、T.パシフィクス(T. pacificus)、T.ファソイルス(T. phaseulus)、T.テラリウス(T. telarius)及びT.ウルチカ(T. urticae);クローバービラハダニ(Bryobia praetiosa);パノニカス属の種(Panonychus spp.)、例えば、リンゴハダニ(P. ulmi)、ミカンハダニ(P. citri);メタテトラニクス属の種(Metatetranychus spp.)及びオリゴニクス属の種(Oligonychus spp.)、例えば、O.プラテンシス(O. pratensis)、O.ペルセア(O. perseae)、ヴァサテス・リコペルシキ(Vasates lycopersici);ラオイエラ・インジカ(Raoiella indica)、科(Family)サトウダニ科(Carpoglyphidae)、例えば、カルポグリフス属の種(Carpoglyphus spp.);ペンタレイダ属の種(Penthaleidae spp.)、例えば、ハロチデウス・デストルクトル(Halotydeus destructor);科(Family)ニキビダニ科(Demodicidae)及びその種、例えば、ニキビダニ属の種(Demodex spp.);科(Family)トロンビシデア(Trombicidea)、例えば、ツツガムシ属の種(Trombicula spp.);科(Family)オオサシダニ科(Macronyssidae)、例えば、オルノトニッスス属の種(Ornothonyssus spp.);科(Family)シラミダニ科(Pyemotidae)、例えば、ピエモテス・トリチシ(Pyemotes tritici);ケナガコナダニ(Tyrophagus putrescentiae);科(Family)コナダニ科(Acaridae)、例えば、アシブトコナダニ(Acarus siro);科(Family)真正クモ目(Araneida)、例えば、クロゴケグモ(Latrodectus mactans)、テゲナリア・アグレスチス(Tegenaria agrestis)、キラカンチウム属の種(Chiracanthium sp)、リコサ属の種(Lycosa sp)、オオヒメグモ(Achaearanea tepidariorum)及びドクイトグモ(Loxosceles reclusa);線形動物門(Nematoda)の門(Phylum)からの有害生物、例えば、植物寄生線虫、例えば、ネコブセンチュウ(root-knot nematodes)、ネコブセンチュウ属の種(Meloidogyne spp.)、例えば、M.ハプラ(M. hapla)、M.インコグニタ(M. incognita)、M.ジャバニカ(M. javanica);嚢腫形成線虫(cyst-forming nematodes)、グロボデラ属の種(Globodera spp.)、例えば、ジャガイモシストセンチュウ(G. rostochiensis);ヘテロデラ属の種(Heterodera spp.)、例えば、H.アベナ(H. avenae)、ダイズシストセンチュウ(H. glycines)、テンサイシストセンチュウ(H. schachtii)、H.トリホリイ(H. trifolii);タネコブセンチュウ(Seed gall nematodes)、アングイナ属の種(Anguina spp.);茎及び葉線虫(Stem and foliar nematodes)、アフェレンコイデス属の種(Aphelenchoides spp.)、例えば、A.ベッセイ(A. besseyi);刺毛線虫(Sting nematodes)、ベロノライムス属の種(Belonolaimus spp.)、例えば、B.ロンギカウダツス(B. longicaudatus);マツの線虫(Pine nematodes)、ブルサフェレンクス属の種(Bursaphelenchus spp.)、例えば、B.リグニコルス(B. lignicolus)、マツノザイセンチュウ(B. xylophilus);リング線虫(Ring nematodes)、クリコネマ属の種(Criconema spp.)、クリコネメラ属の種(Criconemella spp.)、例えば、C.キセノプラキス(C. xenoplax)及びC.オルナタ(C. ornata);及び、クリコネモイデス属の種(Criconemoides spp.)、例えば、クリコネモイデス・インホルミス(Criconemoides informis);メソクリコネマ属の種(Mesocriconema spp.);ナミクキセンチュウ(Stem and bulb nematodes)、ジチレンクス属の種(Ditylenchus spp.)、例えば、イモグサレセンチュウ(D. destructor)、ナミクキセンチュウ(D. dipsaci);オール線虫(Awl nematodes)、ドリコドルス属の種(Dolichodorus spp.);ラセ
ン線虫(Spiral nematodes)、ヘリオコチレンクス・マルチシンクツス(Heliocotylenchus multicinctus);鞘及び鞘様線虫(Sheath and sheathoid nematodes)、ヘミシクリオホラ属の種(Hemicycliophora spp.)及びヘミクリコネモイデス属の種(Hemicriconemoides spp.);ヒルシュマンニエラ属の種(Hirshmanniella spp.);ヤリ線虫(Lance nematodes)、ホプロアイムス属の種(Hoploaimus spp.);ニセネコブ線虫(False rootknot nematodes)、ナコッブス属の種(Nacobbus spp.);ハリ線虫(Needle nematodes)、ロンギドルス属の種(Longidorus spp.)、例えば、L.エロンガツス(L. elongatus);ネグサレ線虫(Lesion nematodes)、プラチレンクス属の種(Pratylenchus spp.)、例えば、P.ブラキウルス(P. brachyurus)、P.ネグレクツス(P. neglectus)、キタネグサレセンチュウ(P. penetrans)、P.クルビタツス(P. curvitatus)、P.ゴオデイ(P. goodeyi);ネモグリ線虫(Burrowing nematodes)、ラドホルス属の種(Radopholus spp.)、例えば、R.シミリス(R. similis);ラドホルス属の種(Rhadopholus spp.);ロドフォルス属の種(Rhodopholus spp.);ニセフクロ線虫(Reniform nematodes)、ロチレンクス属の種(Rotylenchus spp.)、例えば、R.ロブスツス(R. robustus)、R.レニホルミス(R. reniformis);スクテロネマ属の種(Scutellonema spp.);ユミハリセンチュウ(Stubby-root nematode)、トリコドルス属の種(Trichodorus spp.)、例えば、T.オブツスス(T. obtusus)、T.プリミチブス(T. primitivus);パラトリコドルス属の種(Paratrichodorus spp.)、例えば、P.ミノル(P. minor);スタント線虫(Stunt nematodes)、チレンコリンクス属の種(Tylenchorhynchus spp.)、例えば、T.クライトニ(T. claytoni)、T.ズビウス(T. dubius);ミカンネ線虫(Citrus nematodes)、チレンクルス属の種(Tylenchulus spp.)、例えば、ミカンネセンチュウ(T. semipenetrans);オオハリセンチュウ(Dagger nematodes)、キシフィネマ属の種(Xiphinema spp.);及び他の植物寄生線虫種;等翅目(Isoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、カロテルメス・フラビコリス(Calotermes flavicollis)、コプトテルメス属の種(Coptotermes spp.)、例えば、イエシロアリ(C. formosanus)、C.ゲストロイ(C. gestroi)、C.アシナシホルミス(C. acinaciformis);コルニテルメス・クムランス(Cornitermes cumulans)、クリプトテルメス属の種(Cryptotermes spp.)、例えば、C.ブレビス(C. brevis)、C.カビフロンス(C. cavifrons);グロビテルメス・スルフレウス(Globitermes sulfureus)、ヘテロテルメス属の種(Heterotermes spp.)、例えば、H.アウロイス(H. aureus)、H.ロンギセプス(H. longiceps)、H.テヌイス(H. tenuis);ロイコテルメス・フラビペス(Leucotermes flavipes)、オドントテルメス属の種(Odontotermes spp.)、インシシテルメス属の種(Incisitermes spp.)、例えば、アメリカカンザイシロアリ(I. minor)、I.スニデル(I. Snyder);マルギニテルメス・フッバルジ(Marginitermes hubbardi)、マストテルメス属の種(Mastotermes spp.)、例えば、M.ダルウィニエンシス(M. darwiniensis)、ネオカプリテルメス属の種(Neocapritermes spp.)、例えば、N.オパクス(N. opacus)、N.パルブス(N. parvus);ネオテルメス属の種(Neotermes spp.)、プロコルニテルメス属の種(Procornitermes spp.)、ゾオテルモプシス属の種(Zootermopsis spp.)、例えば、Z.アングスチコリス(Z. angusticollis)、Z.ネバデンシス(Z. nevadensis)、レティキュリテルメス属の種(Reticulitermes spp.)、例えば、R.ヘスペルス(R. hesperus)、R.チビアリス(R. tibialis)、ヤマトシロアリ(R. speratus)、R.フラビペス(R. flavipes)、R.グラッセイ(R. grassei)、R.ルシフグス(R. lucifugus)、R.サントネンシス(R. santonensis)、R.ビルギニクス(R. virginicus);テルメス・ナタレンシス(Termes natalensis)、ゴキブリ目(Blattaria)の目(order)からの昆虫、例えば、ブラッタ属の種(Blatta spp.)、例えば、B.オリエンタリス(B. orientalis)、B.ラテラリス(B. lateralis);チャバネゴキブリ属の種(Blattella spp.)、例えば、B.アサヒナ(B. asahinae)、B.ゲルマニカ(B. germanica);ロイコファエア・マデラエ(Leucophaea maderae)、パンクロラ・ニベア(Panchlora nivea)、ゴキブリ属の種(Periplaneta spp.)、例えば、ワモンゴキブリ(P. americana)、コワモンゴキブリ(P. australasiae)、トビイロゴキブリ(P. brunnea)、クロゴキブリ(P. fuligginosa)、ヤマトゴキブリ(P. japonica);チャオビゴキブリ(Supella longipalpa)、パルコブラッタ・ペンシルバニカ(Parcoblatta pennsylvanica)、オイリコチス・フロリダナ(Eurycotis floridana)、オガサワラゴキブリ(Pycnoscelus surinamensis)、ノミ目(Siphonoptera)の目(order)からの昆虫、例えば、セジオプシルラ・シンプレス(Cediopsylla simples)、セラトフィラス属の種(Ceratophyllus spp.)、クテノセファリデス属の種(Ctenocephalides spp.)、例えば、ネコノミ(C. felis)、イヌノミ(C. canis)、ケオプスネズミノミ(Xenopsylla cheopis)、ヒトノミ(Pulex irritans)、イヌハジラミ(Trichodectes canis)、スナノミ(Tunga penetrans)、及びヨーロッパネズミノミ(Nosopsyllus fasciatus)、総尾目(Thysanura)の目(order)からの昆虫、例えば、セイヨウシミ(Lepisma saccharina)、クテノレピスマ・ウルバナ(Ctenolepisma urbana)、及びマダラシミ(Thermobia domestica)、唇脚綱(Chilopoda)の綱(Class)からの有害生物、例えば、ゲオフィラス属の種(Geophilus spp.)、スクティゲラ属の種(Scutigera spp.)、例えば、スクティゲラ・コレオプトラタ(Scutigera coleoptrata);倍脚綱(Diplopoda)の綱(Class)からの有害生物、例えば、ブラニウルス・グツラツス(Blaniulus guttulatus)、ジュルス属の種(Julus spp.)、ナルセウス属の種(Narceus spp.)、コムカデ綱(Symphyla)の綱(Class)からの有害生物、例えば、スクチゲレラ・イマクラタ(Scutigerella immaculata)、革翅目(Dermaptera)の目(order)からの昆虫、例えば、ヨーロッパクギヌキハサミムシ(Forficula auricularia)、トビムシ目(Collembola)の目(order)からの昆虫、例えば、シロトビムシ属の種(Onychiurus spp.)、例えば、オニキウルス・アルマツス(Onychiurus armatus)、等脚目(Isopoda)の目(order)からの有害生物、例えば、ダンゴムシ(Armadillidium vulgare)、ホンワラジムシ(Oniscus asellus)、ワラジムシ(Porcellio scaber)、シラミ目(Phthiraptera)の目(order)からの昆虫、例えば、ダマリニア属の種(Damalinia spp.)、シラミ属の種(Pediculus spp.)、例えば、アタマジラミ(Pediculus humanus capitis)、コロモジラミ(Pediculus humanus corporis)、ペジクルス・フマヌス・フマヌス(Pediculus humanus humanus);ケジラミ(Pthirus pubis)、ハエマトピヌス属の種(Haematopinus spp.)、例えば、ウシジラミ(Haematopinus eurysternus)、ブタジラミ(Haematopinus suis);リノグナツス属の種(Linognathus spp.)、例えば、ウシホソジラミ(Linognathus vituli);ウシハジラミ(Bovicola bovis)、ニワトリハジラミ(Menopon gallinae)、ニワトリオオハジラミ(Menacanthus stramineus)及びケブカウシジラミ(Solenopotes capillatus)、トリコデクテス属の種(Trichodectes spp.)を含む。本明細書において特定される化合物及び/又は組成物により防除され得る、さらなる有害生物の種の例は:軟体動物門(Mollusca)の門(Phylum)、双殻綱(Bivalvia)の綱(Class)から、例えば、ドレイセナ属の種(Dreissena spp.);綱(Class)腹足綱(Gastropoda)、例えば、アリオン属の種(Arion spp.)、ビオンファラリア属の種(Biomphalaria spp.)、ブリヌス属の種(Bulinus spp.)、デロセラス属の種(Deroceras spp.)、ガルバ属の種(Galba spp.)、リムナエア属の種(Lymnaea spp.)、オンコメラニア属の種(Oncomelania spp.)、ポマセア・カナリクラタ(Pomacea canaliclata)、オカモノアラガイ属の種(Succinea spp.);蠕虫(helminths)の綱(Class)から、例えば、ズビニ鉤虫(Ancylostoma duodenale)、セイロン鉤虫(Ancylostoma ceylanicum)、アシロストーマ・ブラジリエンシス(Acylostoma braziliensis)、鉤虫属の種(Ancylostoma spp.)、アスカリス・ルブリコイデス(Ascaris lubricoides)、カイチュウ属の種(Ascaris spp.)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、ブルギア・ティモリ(Brugia timori)、ブノストマム属の種(Bunostomum spp.)、カベルティア属の種(Chabertia spp.)、クロノルキス属の種(Clonorchis spp.)、クーペリア属の種(Cooperia spp.)、ディクロコエリウム属の種(Dicrocoelium spp.)、ディクチオカウルス・フィラリア(Dictyocaulus filaria)、広節裂頭条虫(Diphyllobothrium latum)、メジナ虫(Dracunculus medinensis)、単包条虫(Echinococcus granulosus)、多包条虫(Echinococcus multilocularis)、ヒト蟯虫(Enterobius vermicularis)、カンテツ属の種(Faciola spp.)、ヘモンクス属の種(Haemonchus spp.)、例えば、捻転胃虫(Haemonchus contortus);ヘテラキス属の種(Heterakis spp.)、小型条虫(Hymenolepis nana)、ヒオストロングルス属の種(Hyostrongulus spp.)、ロア・ロア(Loa Loa)、ネマトディルス属の種(Nematodirus spp.)、エソファゴストムム属の種(Oesophagostomum spp.)、オピスソルキス属の種(Opisthorchis spp.)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、オステルタギア属の種(Ostertagia spp.)、パラゴニムス属の種(Paragonimus spp.)、スキストソメン属の種(Schistosomen spp.)、ストロンギロイデス・フエレボルニ(Strongyloides fuelleborni)、ストロンギロイデス・ステルコラリス(Strongyloides stercora lis)、ストロニロイデス属の種(Stronyloides spp.)、無鉤条虫(Taenia saginata)、有鉤条虫(Taenia solium)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、トリキネラ・ナティバ(Trichinella nativa)、トリキネラ・ブリトビ(Trichinella britovi)、トリキネラ・ネルソニ(Trichinella nelsoni)、トリキネラ・シュードプシラリス(Trichinella pseudopsiralis)、トリコストロングルス属の種(Trichostrongulus spp.)、トリクリス・トリクリア(Trichuris trichuria)、バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti)を含む。
用語「非有害生物」及び/又は「非標的」種とは、上記で定義された「有害生物」及び/又は「有害生物種」として分類されない他の全ての動物を指す。
用語「核酸」とは、糖、リン酸並びにプリン若しくはピリミジンのいずれかである塩基を含有するモノマー(ヌクレオチド)から構成される、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸、保存的に修飾されているそれらの改変体、相補的配列、及び縮重コドン置換を包含する。
用語「核酸」又は「核酸分子」はまた、遺伝子、オープンリーディングフレーム(ORF)、cDNA、並びに遺伝子、核酸分子、核酸断片、核酸セグメント若しくはポリヌクレオチドによってコードされるmRNAと互換的に使用され得る。
用語「遺伝子」は、幅広く使用され、生物学的機能と関連している核酸の任意のセグメントを指す。このようにして、遺伝子は、それらの発現に必要とされるコード配列及び/又は調節配列を含む。例えば、「遺伝子」とは、調節配列を含む、mRNA、機能性RNA、又は特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「遺伝子」はまた、例えば、他のタンパク質について認識配列を形成する、非発現DNAセグメントを含む。「遺伝子」は、目的とする供給源からのクローニング又は公知若しくは予測される配列情報からの合成を含む、種々の供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
用語「遺伝子送達」又は「遺伝子導入」とは、外来DNAを標的細胞に確実に導入するための方法又はシステムを指し、注入、形質導入、トランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーションを含む。このような方法は、遺伝子の一過性又は長期の発現をもたらすことができる。
用語「形質導入」は、例えば、アデノウイルスベクターなどの複製欠損ウイルスベクターを介して、インビボ又はインビトロのいずれかのレシピエント細胞へのDNA分子の送達を指す。
用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞による外来DNAの取り込みを指すように使用される。外因性DNAが細胞の細胞原形質膜を横切って導入された場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。トランスフェクションは、適切な細胞に、プラスミドベクター及び他の核酸分子などの1つ以上の外因性DNA部分を導入するために使用することができる。この用語は、遺伝物質の安定な取り込みと一過性の取り込みの両方を指す。
用語「形質転換」及び/又は「トランスフェクション」とは、異種DNAを細胞に導入するためのプロセスを指す。形質転換細胞は、形質転換/トランスフェクションプロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫もまた包含することが理解される。
用語「注入」とは、シリンジ及び針を用いて異種DNA又はRNAを細胞に導入するプロセスを指す。
用語「ベクター」とは、ヘルパーウイルスなどの、適正な制御要素と関連しているときに複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝的要素を指す。このように、この用語は、クローニング及び発現媒体、並びに複製欠損ウイルスベクターを含む。
用語「発現ベクター」及び「発現カセット」とは、典型的には、終止シグナルに作動可能に連結された、目的とするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を指向することができる核酸分子を指す。また、典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列を含む。コード領域は、通常、目的とするポリペプチド(複数可)をコードするが、また、センス又はアンチセンス方向で、目的とする機能的RNA、例えばアンチセンスRNA又は非翻訳RNAをコードすることができる。目的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得、これは、その成分の少なくとも1つが他の成分の少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在しているものであり得るが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであり得る。しかしながら、典型的には、発現カセットは宿主に対して異種である、すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は、宿主細胞中に天然に存在せず、形質転換事象により宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入された。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下であり得るか、又は宿主細胞がある特定の外部刺激に暴露されたときにのみ、転写を開始する誘導性プロモーターの調節下にあり得る。植物などの多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、器官、又は発生段階に特異的であり得る。
用語「アデノウイルス」とは、アデノウイルス血清型由来のベクターを指す。アデノウイルスは、***している及び***していない、広範囲の哺乳動物細胞を感染させることができる二本鎖DNAウイルスである。アデノウイルスDNAは約36,000bpの線状である。遺伝子送達のために最も広く使用されているアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE1及びE3領域が欠失している複製欠損ベクターである。E1欠失ウイルスは、トランスでE1をコードしたタンパク質を提供する、HEK-293などの補完細胞で増殖する。E1/E3欠失アデノウイルスは、最大7.5キロバイトの外来DNAを収容することができる。アデノウイルスゲノム中に外来DNAを組み込む古典的な方法は、哺乳動物細胞における相同組換えを伴う。本実施例において記載されるように、より効率的な方法は、アデノウイルスゲノムの大部分を含有する大きなプラスミドと小さなシャトルプラスミドの間での大腸菌(Escherichia coli)における相同組換えを伴う。シャトルプラスミドは、ウイルスゲノムにおいて標的とされるべき領域に相同な配列によって隣接される発現カセットを含有する。次に、組換えAdゲノムは、制限消化により線状化され、E1補完哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され、ウイルス粒子を生成する(Douglas JT.、Methods Mol Biol. 2004; V246:3～14)。毒性遺伝子を含有するアデノウイルスを生成するために、特別なアデノウイルスベクターが開発され、ここでは、外来遺伝子の発現はウイルス生成中に抑制される。これらのシステムの1つは、SpeAd Ad-tetoシステムと呼ばれ、例えば、Welgen, Inc.によって提供される。
用語「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(tTA)は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン及び関連化合物の存在下又は不存在下で、核酸発現を制御するために使用される融合タンパク質を指す。tTAは、転写を活性化することができる任意のドメインに融合したTetリプレッサー(TetR)を含む。tTAは、アデノウイルスのC末端部分に融合したTetRを含んでもよい。
用語「作動可能に連結された」とは、物理的又は機能的に関連している2つの核酸配列を指す。例えば、プロモーター又は調節DNA配列は、調節DNA配列がコードDNA配列又は構造DNA配列の発現レベルに影響を及ぼすように、2つの配列が位置付けられた場合、RNA又はポリペプチドをコードするDNA配列に「作動可能に連結される」と言われる。プロモーターはまた、RNAポリメラーゼが転写に十分な条件下でプロモーターに結合するときに、ヌクレオチド配列が転写される場合に、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されると言われる。
用語「単離された」とは、核酸又はポリペプチドに適用される場合、核酸又はポリペプチドが、天然の状態で関連付けられる他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、乾式又は水溶液のいずれかであり得るが、均一な状態であり得る。均質性、及び分子が単離されているかどうかは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定することができる。調製物中に存在する優勢種であるポリペプチドは、実質的に単離されている。用語「単離された」とは、核酸又はポリペプチドが、電気泳動ゲル中で本質的に1つのバンドを生じることを示す。具体的には、それは、核酸又はポリペプチドが、いくつかの実施形態において少なくとも約50%純粋、いくつかの実施形態において少なくとも約85%純粋、いくつかの実施形態において少なくとも約99%純粋であることを意味する。
用語「標識」及び「標識された」とは、分子への、分光、放射線学又はその他の方法により検出することができる部分の結合を指す。したがって、用語「標識」又は「標識された」とは、生体分子などの分子に、検出可能なマーカーの、場合より共有結合的若しくは非共有結合的、組み込み又は結合を指す。生体分子を標識する種々の方法は当該技術分野において公知であり、使用することができる。生体分子用の標識の例としては、限定されないが、以下の放射性同位体、蛍光標識、重原子、酵素標識又はレポーター遺伝子、化学発光基、及びビオチニル基が挙げられる。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。利用することができる蛍光プローブとしては、限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート;フルオレセインジクロロトリアジン及びフルオレセインのフッ素化類似体;カルボン酸ナフトフルオレセイン及びそのスクシンイミジルエステル;カルボキシローダミン6G;ピリジルオキサゾール誘導体;Cy2、3、3.5、5、5.5及び7;フィコエリトリン;フィコエリトリン-Cyコンジュゲート;スクシンイミジルエステル、カルボン酸、イソチオシアネート、塩化スルホニル及びダンシル塩化物の蛍光種、例えば、プロピオン酸スクシンイミジルエステル、及びペンタン酸スクシンイミジルエステル;カルボキシテトラメチルローダミンのスクシンイミジルエステル;ローダミンレッド-Xスクシンイミジルエステル;テキサスレッドスルホニルクロリド;テキサスレッド-Xスクシンイミジルエステル;テキサスレッド-Xナトリウムテトラフルオロフェノールエステル;レッド-X;テキサスレッド色素;テトラメチルローダミン;リサミンローダミンB;テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート;ナフトフルオレセイン;クマリン誘導体(例えば、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、及びメトキシクマリン);ピレン類;ピリジルオキサゾール誘導体;ダポキシル色素;カスケードブルー及びイエロー色素;ベンゾフランイソチオシアネート;ナトリウムテトラフルオロフェノール;4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン;アレクサ蛍光体(例えば、350、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700及び750);水素の同位体(例えば、トリチウム同位体、3H)、炭素の同位体(例えば、14C)、緑色蛍光タンパク質;黄色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質が挙げられる。ピーク励起波長及び発光波長は、これらの化合物について変化し、特定の用途のための特定の蛍光プローブの選択は、励起波長及び/又は発光波長に基づいて、部分的に行うことができる。
本明細書で使用するとき、用語「候補化合物」又は「試験化合物」とは、Nanchungタンパク質、NanchungとTRPタンパク質との複合体、Nanchungタンパク質とIavタンパク質との複合体に結合し、Nanchungタンパク質を発現する昆虫のTRPVチャネル及び/又は昆虫のTRPチャネルを調節する能力についてスクリーニングされるべき化合物の集合体を指す。候補化合物は、多数の種類の化学分子を包含し得、例えば、有機又は無機小分子、多糖、生物学的巨大分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及び誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及び誘導体、生物学的材料(例えば、細菌、植物、菌類、又は動物細胞若しくは組織)から作製された抽出物、天然に存在する若しくは合成の組成物、又はこれらの組合せが挙げられる。一般的に、候補化合物は、約50～500,000の分子量を有することができるが、これに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「小分子」は、「天然物様」である化合物を指すが、しかし、用語「小分子」は、「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、典型的には、いくつかの炭素-炭素結合を含有し、約50ダルトンを超えるが、約5000ダルトン(5kD)未満の分子量を有することによって特徴付けられる。好ましくは、小分子は、3kD未満、さらにより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。いくつかの場合において、小分子は、700ダルトンに等しい又はそれ未満の分子質量を有することが好ましい。
いくつかの実施形態において、候補化合物は、合成分子であってもよい。用語「合成分子」とは天然に存在しない分子を指す。
特定の実施形態において、候補化合物は、天然に存在する分子であってもよい。このような天然に存在する分子は、精製又は未精製形態で、すなわち生物学的供給源から得られるように、使用されてもよい。用語「天然に存在する」とは、ヒトによって人工的に生産されたものとは区別されるように、天然において見出される実体(例えば、細胞、生体分子など)を指す。例えば、実験室でヒトによって意図的に変更又は単離されていない自然状態での生物に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然に存在している。このように、アミノ酸配列又は核酸配列が天然に見出されるアミノ酸配列又は核酸配列と同一であったとしても、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列は、組換え分子によってコードされる又はその中に存在する場合、「天然に存在しない」と考えられる。
実施される特定の実施形態に依存して、候補化合物は、溶液中に遊離して提供されてもよく、又は担体、若しくは固体支持体、例えばビーズに結合されてもよい。多数の適切な固体支持体が、候補化合物の固定化に用いることができる。適切な固体支持体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン(すなわち、セファデックス、セファロースとして市販されている)、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸共重合体、ガラスビーズ、アミノ酸共重合体、エチレン-マレイン酸共重合体、ナイロン、シルクなどが挙げられる。さらに、本明細書に記載される方法について、候補化合物は、個々に又はグループでスクリーニングされてもよい。グループスクリーニングは特に有用であり、この場合、有効な候補化合物のヒット率は、所与のグループについて1を超える肯定的な結果を期待しないように低いものであることが予想される。
可能性のある候補化合物は何百万もある。小分子、ポリマー及びゲノムに基づくライブラリーを開発するための方法は公知であり、例えば、Dingら、J. Am. Chem. Soc. 124: 1594～1596 (2002)及びLynnら、J. Am. Chem. Soc. 123: 8155～8156 (2001)に記載されている。多数の小分子ライブラリーが当該技術分野において公知であり、市販されている。市販の化合物ライブラリーは、例えば、ArQule、Pharmacopia、graffinity、PanVera、Vitas-M Lab、Biomol International及びOxfordから得ることができる。これらのライブラリーは、本明細書に記載されているスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることができる。また、NIH Roadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network (MLSCN)からの10,000個の化合物及び86,000個の化合物からのライブラリーなどの化合物ライブラリーを用いることができる。化合物ライブラリーの包括的なリストは、www.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htmで見出すことができる。化学物質ライブラリー又は化合物ライブラリーは、通常、ハイスループットスクリーニング又は工業生産に最終的に使用される格納された化学物質の集合体である。化学物質ライブラリーは、一連の格納された化学物質という簡単な言葉で構成することができる。それぞれの化学物質は、化学構造、純度、量、及び化合物の物理化学的特徴などの情報を使用してある種のデータベースに格納された関連する情報を有する。
用語「調節」とは、本発明のTRPV(例えば、昆虫TRPV)チャネルなどの生体分子の任意の又は全ての化学的及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性の増加、減少、又は他の変更を指す。したがって、用語「調節」とは、本明細書で使用するとき、このような活性又は特性のアップレギュレーション(すなわち、活性化又は刺激)とダウンレギュレーション(すなわち、阻害又は抑制)の両方を指す。当業者によって理解されるように、TRPVチャネルなどの生体分子の化学的及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性の調節は、細胞内における生体分子の発現の増加又は減少に起因し得る。したがって、用語「調節する」及びその文法的な変形は、直接的な調節(例えば、ポリペプチドに対する阻害剤の結合を介した、ポリペプチドの化学的活性及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性の阻害)と、並びに間接的な調節(例えば、TRPVチャネルなどのタンパク質の発現のアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーション、又は生物学的効果を生じさせるために本開示の主題の生体分子とともに作用する生体分子の阻害若しくは刺激)の両方を包含することが意図される。
本明細書において互換的に使用される用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」とは、その大きさや機能に関わらず、20種のタンパク質アミノ酸又はアミノ酸類似体のポリマーを指す。「タンパク質」は、多くの場合、相対的に大きなポリペプチドを参照して使用され、「ペプチド」は、多くの場合、小ポリペプチドを参照して使用されるが、当該技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、変化する。特に断りのない限り、用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用するとき、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、及びこれらの他の同等物、改変体、及び類似体が含まれる。
TRPチャネルという用語は、以下:Nanchungタンパク質、TRPタンパク質及び/又はInactiveタンパク質のうちの1つ以上から形成されるチャネル及び/又はタンパク質複合体を指す。TRPVチャネル及び/又はTRPVタンパク質複合体は、TRPチャネル及び/又はTRPタンパク質複合体の一種であることを理解するべきである。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、TRPタンパク質の一種であるTRPVタンパク質の一種である。TRPタンパク質は、昆虫の細胞膜;哺乳動物の細胞膜に見出され;遊離細胞系に由来し;細胞培養によって産生され;及び/又はNanchungタンパク質、TRPタンパク質及び/又はInactiveタンパク質のうちの1つ以上をコードする遺伝子を含むように遺伝子的に改変されている(DNA及び/又はRNAのいずれか又は両方を含む)、限定されないが、カエルの卵、昆虫細胞、及び/又は哺乳動物細胞などの細胞によって産生され得る。本明細書に開示されるTRPタンパク質は、哺乳動物のTRPタンパク質及び/又は節足動物のTRPタンパク質及び/又は線虫のTRPタンパク質及び/又は軟体動物のTRPタンパク質であり得ることを理解するべきである。Nanchung及びInactiveタンパク質は、限定されないが、昆虫などの節足動物並びに軟体動物及び/又は線虫において見出され得ることをさらに理解するべきである。TRP及び/又はTRPVチャネルは、1つ以上のTRP及び/若しくはTRPVタンパク質複合体から形成され;2つ以上のTRP及び/若しくはTRPVタンパク質複合体から形成され;3つ以上のTRP及び/若しくはTRPVタンパク質複合体から形成され、並びに/又は4つ以上のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体から形成され得ることを理解するべきである。
用語「結合親和性」とは、受容体との結合を形成する化合物の能力を指す。本発明の目的で、平衡定数は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRPチャネル及び/又はTRPVチャネルとの1つ以上の化合物の結合親和性を決定するために使用される。解離定数(Kd)は、標識された化合物の飽和結合アッセイにおいて測定される特定のタイプの平衡定数である。それは、平衡状態で受容体部位の半分に結合する標識された化合物のモル濃度である。解離定数が低いほど、Nanchungタンパク質、Nanchung TRPタンパク質複合体、及び/又はNanchung Inactiveタンパク質複合体に対する候補化合物の結合親和性が高くなる。阻害定数(Ki)は、非標識の化合物と標識された化合物との競合結合を用いて測定される特定のタイプの平衡定数である。それは、標識された化合物が存在しない場合、平衡状態で受容体の50%を占める、競合する非標識の化合物のモル濃度である。それは、Cheng-Prusoffの式:Ki=IC50/(1+[L]/Kd)を用いて計算することができ、式中、IC50は、標識された化合物の特異的結合を50%低下させる、競合する非標識の化合物のモル濃度である。この式において、[L]はアッセイにおける標識された化合物のモル濃度であり;Kdは標識された化合物の平衡解離定数である。飽和結合アッセイに加えて、平衡解離定数Kdは、限定されないが、
1.結合及び解離速度定数の使用、Kd=Koff/Kon
2.蛍光分極アッセイの使用
3.表面プラズモン共鳴の使用
4.等温熱量測定の使用
5.Schild分析の使用
を含む複数の方法において測定することができる。
表面プラズモン共鳴及び等温熱量測定は、Kdを測定するために標識された化合物を必要としない。さらに、競合アッセイについて、Ki及び/又はKd(競合アッセイについて)は、Cheng-Prusoff式、蛍光分極、及び/又はSchild分析の1つ以上を用いて計算することができる。化合物について計算されたKd及びKi値は類似していなければならないが、実験誤差に起因して、値は、実験誤差の程度に依存して、2つの値の2倍未満の差又は2つの値の3倍未満の差を有してもよいことを理解するべきである。
本出願の目的のための用語「種特異的結合」とは、昆虫のTRP及び/又はTRPVタンパク質対脊椎動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質に対する化合物の優先的結合を指す。
用語「高親和性」及び/又は「高結合親和性」とは、平衡解離定数(Kd)及び/又は平衡阻害定数(Ki)が3×10-7M未満若しくはそれに等しい、3×10-8M未満若しくはそれに等しい、及び/又は30×10-12M未満若しくはそれに等しいものとして計算される化合物を指す。Kd又はKiが低いほど、化合物に対する結合親和性は高くなる。
用語「作用様式」とは、殺虫剤抵抗性対策委員会(IRAC)により化合物及び/又は組成物を、(a)そのグループの他の殺虫剤と同じ機能を示し、(b)そのグループの他の化合物及び/又は組成物と同じ、特定のタンパク質、タンパク質複合体及び/又はタンパク質チャネル上の部位に直接結合する、化合物及び/又は組成物に基づく適切なグループに分類することを指す。
III.スクリーニング法
本発明者らは、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルが、昆虫の摂食行動をブロックし、したがって、殺虫剤として有用である化合物を同定するために使用され得ることを発見した。このように、一実施形態において、本発明は、候補化合物が昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法に関する。本明細書において、昆虫のTRPチャネルは、それらがイオンチャネルを形成するように、1つ以上のTRPタンパク質との複合体中に1つ以上のNanchungタンパク質を含むことを理解するべきである。さらに、昆虫のTRPVチャネルは、それらがイオンチャネルを形成するように、Inactiveタンパク質を含むが、これに限定されない、1つ以上のTRPVタンパク質との複合体中に1つ以上のNanchungタンパク質を含むことを理解するべきである。本発明者らはさらに、1つ以上のNanchungタンパク質、TRPタンパク質複合体及び/又はTRPVタンパク質複合体に直接結合する化合物を同定する方法を発見した。さらに、本発明者らは、化合物のアフィドピロペンが1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合し、1つ以上のTRP及び/又はTRPVタンパク質チャネルの調節因子として作用することを実証した。節足動物、軟体動物及び/又は線虫のTRP及び/又はTRPVチャネルは、それらがイオンチャネルを形成するように、1つ以上のTRP及び/又はTRPVタンパク質との複合体中に1つ以上のNanchungタンパク質を含むことを理解するべきである。
本明細書において同定される方法は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを提供するステップ;第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ;昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節をアッセイするステップを含み、ここで、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節は、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節因子として候補化合物を同定する。TRP及び/又はTRPVチャネルの調節は、当業者に周知である従来のインビトロ法及びインビボ法を用いてアッセイされてもよい。例えば、特定の実施形態において、アッセイするステップは、(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップを含んでもよい。例えば、カルシウム応答は、Ca2+の取り込みを評価することによって、あるいは蛍光色素、例えばFluo-4又はFura-2、又は蛍光タンパク質、例えばカメレオン(Cameleon)を使用することによって、(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位を、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と比較すること、(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を、TPRVチャネルの調節がないことを示すカルシウムイオン動員参照レベルと比較すること、及び/又は(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を、TPRVチャネルの調節がないことを示す膜電位参照レベルと比較すること、(7)標準的な電気生理学的方法、例えば電位クランプ又はパッチクランプを用いて、候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるイオン電流を、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるイオン電流と比較することによって測定され得る。この同じアッセイは、脊椎動物、節足動物、軟体動物、線虫又は任意の他の生物からのTRP及び/又はTRPVチャネル上で行うことができることを理解するべきである。このような試験により、調節因子として働く候補化合物がそれらの系であるか否かを決定することができ、したがって、候補化合物を殺虫剤として使用することによる潜在的な環境への影響を決定する助けとなる。
好ましくは、候補化合物は、第1の細胞においてカルシウムイオン動員又は膜電位、又はイオン電流を、参照レベルと比較して少なくとも10%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも20%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも30%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも40%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも50%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも60%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも70%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも75%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも80%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも85%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも90%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも95%調節することができる。
さらに、TRPVチャネルの活性化は、イオンフラックスの変化を測定する様々な他の従来のアッセイを用いてアッセイすることができ、例えば、限定されないが、パッチクランプ技術、全細胞電流の測定、放射標識したイオンフラックスアッセイ、及び電位感受性色素を用いた蛍光アッセイ(Zhengら、2004)などが挙げられる。
また、昆虫TRPVチャネルの調節は、機能的、化学的及び物理的効果を決定するための様々な他のインビトロアッセイ及びインビボアッセイを用いて評価することができ、例えば、ペプチド、有機小分子及び脂質などの他の分子への昆虫のTRPVの結合を測定すること、昆虫TRPVタンパク質及び/又はmRNAレベルを測定すること、又は昆虫TRPVポリペプチドの他の態様、例えば、転写レベル若しくは生理学的変化を測定することが挙げられる。
本発明者らはさらに、1つ以上のNanchungタンパク質及び/又はTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合し、したがって殺虫剤として有用である化合物を同定することは有益であると決定した。このように、一実施形態において、本発明は、候補化合物が、種特異的な方式で1つ以上のNanchungタンパク質及び/又はTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合するかどうかを決定する方法に関する。結合アッセイ、飽和アッセイ及び競合アッセイの2つのバリエーションがある。飽和アッセイは、以下:(1)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルを化合物と接触させるステップであって、化合物は標識されていてもよく又は標識されていなくてもよい、ステップ;(2)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに結合した、標識された化合物及び/又は標識されていない化合物の濃度を測定するステップ;(3)1つ以上の標識された化合物及び/又は標識されていない化合物についての平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(4)ここでKdが、(a)最大結合(Bmax)及び(b)最大結合の50%に到達するのに必要とされる化合物の濃度を用いて決定され得る、のうちの少なくとも1つを含み得る。
競合アッセイは、以下:(1)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、標識されていてもよく又は標識されていなくてもよい化合物と接触させるステップ;(2)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに結合している化合物の濃度を測定するステップ;(3)1つ以上の化合物の平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(4)ここで、Kdは、以下の方法:(I)(a)最大結合(Bmax)及び(b)最大結合の50%に到達するために必要とされる標識された化合物の濃度、(II)蛍光分極アッセイ、(III)表面プラズモン共鳴、(IV)等温熱量測定、(VI)Schild分析のうちの1つ以上を用いて決定され得;(5)1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに対して高親和性を有する標識された化合物と接触させるステップ;(6)ステップ1の標識された化合物の存在下で、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを候補化合物と接触させるステップ;(7)標識された化合物の結合が0%に近づくまで、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに接触するために利用可能な候補化合物の量を増加させるステップ;(8)以下の方法:(I)(a)候補化合物の不存在下で、結合した標識された化合物の量を決定し、(b)結合した標識された化合物の量を50%減少させるのに必要とされる候補化合物の濃度を決定すること、(II)蛍光分極アッセイ、及び/又は(III)Schild分析のうちの1つ以上を用いて、競合アッセイについての平衡阻害定数(Ki)及び/又は平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;(9)候補化合物の阻害定数を他の候補化合物と比較するステップ;(10)候補化合物の阻害定数を標識された化合物の解離定数と比較するステップのうちの1つ以上を含み得る。
1つ以上のNanchungタンパク質、TRPタンパク質複合体及び/又はチャネル及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルへの結合は、候補化合物が1つ以上のNanchungタンパク質、TRPタンパク質複合体及び/又はチャネル及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに直接結合するかどうかを決定するために、様々なインビトロ及びインビボのアッセイを用いて評価することができる。殺虫剤の分子標的の同定は、それらのスペクトル、健康及び環境への影響、並びに昆虫抵抗管理を評価するために不可欠である。ピメトロジン(PM)及びピリフルキナゾン(PFQ)は、植物を吸う昆虫、例えば、アブラムシ及びコナジラミの協調及び摂食を妨害することによって作用する2つの構造的に関連した商業的な殺虫剤(化学構造を図1に示す)である(Casida及びDurkin、2013;Maienfisch、2012)。ピリフルキナゾンは、水溶液中で自発的に脱アセチル化することができる。ピリフルキナゾンの脱アセチル化形態(dPFQ)は、親化合物よりも有意に強力であることが示され、これは、ピリフルキナゾンが脱アセチル化によって活性化されるプロドラッグであることを示唆する(Nesterovら、2015)。したがって、本発明においてはdPFQを使用したが、しかしながら、ピリフルキナゾンを同様に使用され得ることを理解するべきである。
アフィドピロペンは、これまで知られていない作用様式を有する新しい殺虫剤化合物である。アフィドピロペン及びピメトロジンは化学構造が大きく異なっているが(図1)、それらは毒性を示す類似の昆虫のスペクトルを有し、同様の行動症状、例えば、アブラムシにおける摂食阻害を引き起こす(Leichterら、2013)。しかしながら、アフィドピロペン及びピメトロジンが同じ位置に結合し、したがって同じ作用様式を有するものとして分類されるかどうかは不明であった。
TRP及び/又はTRPV(一過性受容体電位)タンパク質は、様々な細胞型においてヘテロ及びホモ四量体のカチオンチャネルを形成する(Venkatachalam及びMontell、2007)。ピメトロジン及びピリフルキナゾンは、昆虫の身体部位の相対的位置を感知するストレッチ受容器(Kavlie及びAlbert、2013)を連続的に配置した弦音器官(Nesterovら、2015)のTRPVチャネルを過度に刺激し、最終的にサイレンシングにすることによってショウジョウバエの協調及び聴覚を妨げた(Kamikouchiら、2009;Sunら、2009)。ピメトロジン及びピリフルキナゾンはNanchungタンパク質のみに結合することが見出されたが、ピメトロジン及びピリフルキナゾンの調節効果は、弦音ニューロンにおいて共存し、機能的なイオンチャネルを形成する2つのTRPVタンパク質、Nanchung(Nan)及びInactive(Iav)の同時存在を必要とした(Nesterovら、2015、PCT/US2014/071489、これらは参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
本発明は、アフィドピロペン、ピメトロジン及び脱アセチル化ピリフルキナゾンが、これらのタンパク質チャネル上の同じ部位に直接的に結合することによって、TRPチャネルを直接調節することを示す。さらに、本発明は、候補化合物がこれらのタンパク質、タンパク質複合体及び/又はタンパク質チャネル上の同じ部位に直接結合するかどうかを決定する方法を特定する。候補化合物の結合位置及び親和性を決定することは、化合物の作用様式の分類を支援し、抵抗性の昆虫集団を発生させるリスクの減少をもたらし得る、より良好な昆虫管理及び防除を可能にする。
本発明はまた、Nanchungタンパク質とInactiveタンパク質の両方の存在下で、ピメトロジン、脱アセチル化ピリフルキナゾン及びアフィドピロペンの結合親和性が増加したことを見出した。また、本発明は、アフィドピロペンが、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルの両方の存在下でのみ調節活性を示すことを見出した。本発明はまた、アフィドピロペンが、Nanchungタンパク質及びTRPタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルの両方の存在下で調節活性を示すことを見出した。さらに、本発明は、Nanchungタンパク質、Nanchung-TRPタンパク質複合体、Nanchung-TRPタンパク質チャネル、Nanchung-TRPVタンパク質複合体、Nanchung-TRPVタンパク質チャネル、Nanchung-Inactiveタンパク質複合体、及びNanchung-Inactiveタンパク質チャネルに対する高い結合親和性を有するものとしてアフィドピロペンを特定した。したがって、本発明は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はタンパク質チャネルに対して高い結合親和性を有する標識された化合物、例えば、アフィドピロペン、ピメトロジン及び/又は脱アセチル化ピリフルキナゾンを、本明細書に記載される競合アッセイを用いて候補化合物の結合親和性を計算するために使用することができることを特定する。
先に述べたように、候補化合物は、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料(例えば、細菌、植物、菌類、動物細胞、動物組織)から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せであってもよい。
一般的に、候補化合物は、TRP及び/若しくはTRPVチャネルの活性を調節し、並びに/又はTRP及び/若しくはTRPVタンパク質への結合を示し得る任意の濃度で試験することができる。いくつかの実施形態において、候補化合物は、約0.01nM～約1000mMの範囲の濃度で試験され得る。特定の他の実施形態において、化合物は、約100μM～約1000μMの範囲で試験され得る。特定のさらなる実施形態において、候補化合物は、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.0mM又は2mM超で試験され得る。候補化合物の他の範囲及び濃度もまた適切であり得る。
いくつかの実施形態において、候補化合物は、2つ以上の異なる濃度で試験されてもよい。好ましくは、試験される最高濃度は、用いられる最低濃度と比較して、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍高い。例えば、候補化合物は、0.1mM、0.5mM、及び1mMで試験することができ、最高濃度は、使用される最低濃度の少なくとも10倍の濃度である。
一般的に、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルは、昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネル及び/又はタンパク質の結合親和性及び/又は活性を測定する前に、任意の適切な期間、候補化合物と接触させることができる。例えば、昆虫TRPVチャネルは、昆虫のTRP及び/又はTRPVの活性及び/又は結合を測定する前に、少なくとも5秒間、少なくとも10秒間、少なくとも15秒間、少なくとも30秒間、少なくとも45秒間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも4分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも60分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間又はそれを超えて候補化合物と接触されてもよい。いくつかの実施形態において、昆虫TRPVを候補化合物と接触させた瞬間に、活性を測定することができる。
いくつかの実施形態において、昆虫のTRPVチャネルの活性は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルへの候補化合物の結合とともに、一定の期間にわたって測定することができる。例えば、活性は、少なくとも5秒間、少なくとも10秒間、少なくとも15秒間、少なくとも30秒間、少なくとも45秒間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも4分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも60分間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、又はそれ以上の期間、測定され得る。測定期間は、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルが候補化合物と接触する前に、1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルが候補化合物と最初に接触される時点で、又は1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルが候補化合物と最初に接触された後の期間後に開始することができる。1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルは、活性及び/又は結合が測定されている間、候補化合物と連続的に接触させてもよい。
いくつかの実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPVチャネルの活性化及び/又は結合に対して、500nM未満若しくはそれに等しい、250nM未満若しくはそれに等しい、100nM未満若しくはそれに等しい、50nM未満若しくはそれに等しい、10nM未満若しくはそれに等しい、1nM未満若しくはそれに等しい、0.1nM未満若しくはそれに等しい、0.01nM未満若しくはそれに等しい、又は0.001nM未満若しくはそれに等しい有効濃度EC50を有する。
いくつかの実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPVチャネルの阻害及び/又は結合について、500nM未満又はそれに等しい、250nM未満又はそれに等しい、100nM未満又はそれに等しい、50nM未満又はそれに等しい、10nM未満又はそれに等しい、1nM未満又はそれに等しい、0.1nM未満又はそれに等しい、0.01nM未満又はそれに等しい、又は0.001nM未満又はそれに等しいIC50を有する。
特定の実施形態において、候補化合物は、TRP及び/又はTRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である。
特定の他の実施形態において、候補化合物は、昆虫及び/又は他の有害生物のTRP及び/又はTRPVチャネルを活性化する調節因子である。
好ましくは、候補化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である。
特定の実施形態において、候補化合物は、Nanchungタンパク質に直接結合する。
特定の他の実施形態において、候補化合物は、1つ以上のNanchungタンパク質及び1つ以上のTRPタンパク質からなる複合体に直接結合する。
好ましくは、候補化合物は、1つ以上のNanchung及びInactiveタンパク質複合体に直接結合する。
特定の実施形態において、候補化合物が哺乳動物特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルと比較して、昆虫特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルを優先的に調節及び/又はこれに結合するかどうかを決定するために、本方法は、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPチャネルを発現する第2の細胞を提供することをさらに含んでもよい。第2の細胞は、候補化合物と接触されてもよく、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPチャネルの調節及び/又は結合は、本明細書でも記載された、当該技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。アッセイするステップの後、昆虫のTRPV及び/又はTRPチャネルの調節及び/又は結合は、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPチャネルの調節及び/又は結合と比較されてもよく、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPチャネルと比較して、昆虫特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルの調節及び/又は結合の増加を示す候補化合物は、昆虫のTRPV及び/又はTRPチャネルの選択的調節因子及び/又は結合剤として候補化合物を特定する。この方法は、他の種間の優先的な結合、並びに/又は有害生物種への結合及び同様に非有害生物への非結合を決定するために使用され得ることを理解するべきである。
用語「優先的な調節」とは、昆虫特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルの活性又は他の特性が、参照レベル又は哺乳動物特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルと比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%又はそれを超えて調節されることが意図されている。
用語「優先的結合」とは、昆虫特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルの平衡結合定数(Kd又はKi)が、参照レベル又は哺乳動物特異的なTRPV及び/又はTRPチャネルに対して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%又はそれ以上減少することを意味する。
特定の他の実施形態において、TRPV及び/又はTRPチャネルの非選択的調節因子及び/又は結合剤が特定され得る。TRPV及び/又はTRPタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルの調節因子及び/又は結合剤に関連する用語「非選択的」とは、化合物が、様々な生物における1つ以上のTRPV及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルを調節し及び/又はこれに直接結合することができることを意味し、例えば、化合物が、節足動物、例えば昆虫と、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルの両方を調節することができることを意味する。
特定の他の実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPチャネル調節因子及び/又は結合剤であり、哺乳動物特異的なTRPの活性を調節せず、及び/又は哺乳動物特異的なTRPに結合せず、例えば、試験化合物は、哺乳動物特異的なTRPVチャネルに対して有意な効果がない。
特定の実施形態において、1つ以上のNanchungタンパク質、TRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルは生物学的細胞内にある。いくつかの実施形態において、哺乳動物のTRPV及び/又はTRPチャネルは生物学的細胞にある。用語「生物学的細胞」又は「細胞」は、本明細書で使用するとき、一般的に理解される意味を有する。細胞内で、Nanchungタンパク質、TRPV及び/又はTRPチャネルは、細胞中の内因性遺伝子から、又は細胞にトランスフェクトされた少なくとも1つのベクターから発現させることができる。培養された細胞、又は動物から直接得られた細胞、例えばカエルの卵母細胞又は組織全体のいずれかは、Nanchung、TRP及び/又はTRPVタンパク質及び/又はチャネルの供給源として用いることができることを理解するべきである。好ましくは、TRPVチャネルタンパク質、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、細胞内で共発現される。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、様々な比率で共発現され得、好ましくは第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率は、約3:1～約1:3、より好ましくは約1:1である。Nanchungタンパク質は他のTRPチャネルタンパク質と組み合わせることができ、このシナリオにおけるNanchungタンパク質への結合は、殺虫剤として作用する候補化合物の目的に類似の効果を有することを理解するべきである。Nanchungタンパク質及びTRPタンパク質は、様々な比率で共発現され得、好ましくは、第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とTRPタンパク質の比率は、約3:1～約1:3、より好ましくは約1:1である。
特定の実施形態において、1つ以上のNanchungタンパク質、TRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルは、無細胞系で形成される。用語「無細胞系」とは、本明細書で使用するとき、細胞内で起こる生物学的反応を研究するために使用され、一方で、全細胞で見出される複雑な相互作用を減少させるインビトロ系を意味する。細胞内画分は超遠心分離によって単離して、他の細胞成分の多くが存在しない場合の反応において使用され得る分子機構を提供することができる。無細胞生物システムは、以下:リボソーム;及び/又は目的とする1つ以上のタンパク質をコードするDNA及び/又はRNA;膜;及び1つ以上の酵素及び/又は補酵素の1つ以上を混合することによって調製することができる。無細胞生物システムは、産業的用途に適したいくつかの利点を有する。インビトロの生物システムを容易に制御することができる。無細胞系は、速いタンパク質合成の代替選択肢を提供し、非常に高い生成物収率は、通常、副産物の形成及び細胞塊の合成なしで達成される。
特定の実施形態において、タンパク質Nanchung、TRP及び/又はInactiveの1つ以上をコードする遺伝子を含有するように遺伝的に改変された細胞は、本明細書に記載されている方法の目的でTRP及び/又はTRPVチャネル複合体を産生するために使用され得る。
特定の実施形態において、タンパク質Nanchung、TRP及び/又はInactiveの1つ以上をコードする核酸をカエル卵母細胞又は他の細胞(親細胞)に導入して、本明細書に記載されている方法の目的でTRP及び/又はTRPVチャネル複合体を産生し得る。
本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用される昆虫のTRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルは、任意の昆虫のTRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネル又はそのホモログ又はその保存的改変体であり得る。例えば、TRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルは、ショウジョウバエのTRPV及び/又はTRPチャネルスーパーファミリーの他のメンバーであり得る。TRPV及び/又はTRPタンパク質複合体及び/又はチャネルの他の供給源はまた、本発明の方法による使用に適していてもよい。
昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルは、1つ以上のNanchungタンパク質と関連していると考えられ、1つ以上のInactiveタンパク質もまた含むことができる。スクリーニングアッセイにおいて使用される哺乳動物TRP及び/又はTRPVチャネルは、任意の哺乳動物のTRP又はそのホモログ、好ましくは昆虫のTRPVチャネルに類似したTRPVチャネルであり得る。
いくつかの実施形態において、Nanchung核酸配列は、a)配列番号1～27(図10～36)からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号1～27(図10～36)の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択されてもよい。このような断片は、UTR、コアプロモーター、イントロン、エンハンサー、シスエレメント、又は任意の他の調節要素であり得る。
いくつかの実施形態において、Inactive核酸配列は、a)配列番号28～53(図64～89)からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号28～53(図64～89)の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択されてもよい。このような断片は、UTR、コアプロモーター、イントロン、エンハンサー、シスエレメント、又は任意の他の調節要素であり得る。
ヒト、マウス、ラット、若しくはハムスターのTRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5又はTRPV6
開示されているポリヌクレオチドは、宿主細胞においてNanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の発現を提供することができる。
特定の実施形態において、Nanchungタンパク質配列は、a)配列番号54～80(図37～63)からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、b)配列番号54～80(図37～63)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド、及びc)a)又はb)のポリペプチドの断片又は保存的改変体からなる群から選択されてもよい。
特定の実施形態において、Inactiveタンパク質配列は、a)配列番号81～106(図90～115)からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、b)配列番号81～106(図90～115)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド、及びc)a)又はb)のポリペプチドの断片又は保存的改変体からなる群から選択されてもよい。
Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の配列アラインメントをそれぞれ図116及び117に示す。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質のファミリー分布ツリーをそれぞれ図118及び119に示す。
本明細書で使用するとき、「パーセント配列同一性」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、この場合、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して、付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含んでよい。このパーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出される。同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、BLASTなどの一般的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の範囲内にある種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって、最適なアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書で使用するとき、用語「保存的改変体」とは、第1のアミノ酸が、例えば、同様のサイズ、電荷、疎水性又は水素結合能力であり得る、少なくとも1つの類似した生化学的特性を有する第2のアミノ酸又はアミノ酸類似体によって置き換えられるアミノ酸配列を指す。例えば、第1の疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンなどの第二(同一でない)の疎水性アミノ酸又はそれらの類似体で保存的に置換することができる。同様に、第1の塩基性アミノ酸は、アルギニン若しくはリジンなどの第2の(同一でない)塩基性アミノ酸、又はその類似体で保存的に置換され得る。同様に、第1の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの第2の(同一でない)酸性アミノ酸又はそれらの類似体で保存的に置換され得、又はフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸は、第2の芳香族アミノ酸若しくはアミノ酸類似体、例えばチロシンで保存的に置換され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれを超えるアミノ酸の保存的改変置換を含む。典型的に、保存的改変体は、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれを超える、野生型ペプチド配列の活性を保持する。
例示的な保存的改変置換としては、限定されないが、D-ala、Gly、Aib、β-Ala、Acp、L-Cys又はD-Cysによるアラニン(A)の置き換え、D-Arg、Lys、D-Lys、ホモ-Arg、D-ホモ-Arg、Met、Be、D-Met又はD-Ileによるアルギニン(R)の置き換え、D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln又はD-Glnによるアスパラギン(N)の置き換え、D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln又はD-Glnによるアスパラギン酸(D)の置き換え、D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr又はD-Thrによるシステイン(C)の置き換え、D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp又はD-Aspによるグルタミン(Q)の置き換え、D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln又はD-Glnによるグルタミン酸(E)の置き換え、Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala又はAcpによるグリシン(G)の置き換え、D-Ile、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met又はD-Metによるイソロイシン(I)の置き換え、D-Leu、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met又はD-Metによるロイシン(L)の置き換え、D-Lys、Arg、D-Arg、ホモ-Arg、D-ホモ-Arg、Met、D-Met、Ile、D-Ile、Orn又はD-Ornによるリジン(K)の置き換え、D-Met、S-Me-Cys、Be、D-Ile、Leu、D-Leu、Val又はD-Valによるメチオニン(M)の置き換え、D-Phe、Tyr、D-Thr、L-Dopa、His、D-His、Trp、D-Trp、トランス-3,4若しくは5-フェニルプロリン、AdaA、AdaG、シス-3,4若しくは5-フェニルプロリン、Bpa、又はD-Bpaによるフェニルアラニン(F)の置き換え、D-Pro、L-I-チオアゾリジン-4-カルボン酸、又はD-若しくは-L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸(米国特許第4,511,390号)によるプロリン(P)の置き換え、D-Ser、Thr、D-Thr、アロ-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、L-Cys、又はD-Cysによるセリン(S)の置き換え、D-Thr、Ser、D-Ser、アロ-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、Val、又はD-Valによるスレオニン(T)の置き換え、D-Tyr、Phe、D-Phe、L-Dopa、His、又はD-Hisによるチロシン(T)の置き換え、及びD-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met、AdaA、又はAdaGによるバリン(V)の置き換えが挙げられる。
昆虫又は哺乳動物のTRPVチャネルの保存的改変体は、当該技術分野において公知のペプチド配列を改変するための方法に従って調製することができ、このような方法を集めている参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor、又はCurrent Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. New Yorkにおいて見出すことができるものを含み得る。
また、TRPV及び/又はTRPチャネルの保存的改変体は、TRPV及び/又はTRPポリペプチドをコードする核酸の改変によって作製されてもよい。
特定の実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングであってもよい。ハイスループットスクリーニング(HTS)とは、ロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体操作デバイス、及び感度の良い検出器を使用する科学実験のための方法を指す。ハイスループットスクリーニング又はHTSは、研究者に数百万個の生化学的、遺伝的又は薬理学的な試験を迅速に行うことを可能にする。HTSは、当該技術分野において、例えば、米国特許第5,976,813号、第6,472,144号、第6,692,856号、第6,824,982号、及び第7,091,048号において周知である。
HTSは、候補化合物のライブラリーに対してアッセイのスクリーニングを実行するために、自動化を使用する。アッセイは、特異的な活性についての試験であり、通常、生化学的又は生物学的メカニズムの阻害又は刺激である。具体的には、アッセイは、昆虫TRPVチャネルの阻害又は刺激のためのスクリーニングである。典型的なHTSスクリーニングライブラリー又は「デッキ」は、100,000個から2,000,000個超の化合物を含有することができる。
HTSの主な実験器具又は試験容器は、小さな容器であるマイクロタイタープレートであり、通常、使い捨てであり、ウェルと呼ばれる小さな、オープンディボットのグリッドを特徴とするプラスチックで作製されている。HTS用の現在のマイクロプレートは、一般的に、384ウェル、1536ウェル又は3456ウェルのいずれかを有する。これらは全て96の倍数であり、8×12の9mm間隔のウェルを有する元の96ウェルマイクロプレートを反映する。
アッセイ用に準備するために、研究者は、彼らが実験を行うことを望む適切な試薬を用いて、プレートの各ウェルを満たす。ウェル中で化合物を吸収し、化合物に結合し、又は他には化合物と反応する(又は反応しない)のを可能にするためにいくらかのインキュベーション時間が経過した後、手動又は機械のいずれかにより、全てのプレートのウェルにわって測定が行われる。研究者が、(例えば)コンピュータが容易に自ら決定することができない変化を求めるために顕微鏡を用いている場合に、手動測定が多くの場合必要である。そうでなければ、特殊化された自動化分析機械は、電流測定又は電圧測定、比色測定、放射能カウントなどの、ウェル上で多数の実験を行うことができる。この場合において、機械は、数値のグリッドとして各々の実験の結果を出力し、各数値が単一ウェルから得られた値に対してマッピングする。大容量の分析機械は、このように数分間隔で数十のプレートを測定することができ、非常に迅速に数千の実験データ点を生じさせる。
IV.製剤、適用及び使用
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物を提供する。本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物の類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩並びに選択された化合物を含む製剤はまた、本明細書に含まれることを理解するべきである。
本発明の方法によって決定若しくは特定される化合物又は化合物群は、例えば、昆虫の摂食行動を調節することによって、昆虫を防除する方法に使用することができる。特定されたその化合物、類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩はまた、本明細書において「活性剤」又は「有効成分」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、化合物は、昆虫の摂食行動を調節する。本明細書で使用するとき、用語「摂食行動」とは、昆虫などの生物が食物を得るプロセスを指す。理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVの調節は、昆虫の摂食行動を減少させ得る運動ニューロン調節を生じさせるシグナル伝達経路を誘発し、昆虫における昆虫TRPVチャネルのこのような調節は、飢餓による昆虫の死をもたらすこのような昆虫の摂食行動の減少をもたらす場合がある。したがって、再び理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVチャネルを調節する(例えば、活性化又は阻害する)化合物は、殺虫剤として使用することができると考えられる。摂食行動の減少は、特定の場所で昆虫を破壊し、したがって、このような昆虫を制御するために使用することができる。このようにして、いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されているスクリーニング方法によって特定された化合物を用いた、昆虫におけるTRPVイオンチャネル又はファミリーメンバーの調節を含む。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているスクリーニング方法によって特定された化合物を用いて、昆虫における摂食行動を調節することにより昆虫を防除する方法を提供する。昆虫を制御するための方法との関連で使用される場合、本明細書に記載されているスクリーニング方法により特定された化合物は、このような化合物の類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩を含む。
一実施形態において、本明細書に記載されている方法及び活性剤は、農業有害生物又は園芸有害生物である昆虫に利用可能である。
農業有害生物の例としては、限定されないが、アブラムシ(Aphids)(マメクロアブラムシ(Aphis fabae)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、リンゴアブラムシ(Aphis pomi)、ジャガイモヒゲナガアブラムシ(Aulacorthum solani)、ダイコンアブラムシ(Brevicoryne brassicae)、ジサフィス・プランタギネア(Dysaphis plantaginea)、チューリップヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum euphorbiae)、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum rosae)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、レタスヒゲナガアブラムシ(Nasonovia ribisnigri)を含む);コナジラミ(アレウロデス属の種(Aleurodes spp.)、ベミシア属の種(Bemisia spp.)、ジアレウロデス属の種(Dialeurodes spp.)、トリアレウロデス属の種(Trialeurodes spp.)を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、シファンタ属の種(Siphanta spp.)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)を含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種(Amrasca spp.)、エンポアスカ属の種(Empoasca spp.)を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種(Aspidiotus spp.)、アカホシマルカイガラムシ(Chrysomphalus aonidum)、ワタフキカイガラムシ(Icerya purchase)、ニセヤノネカイガラムシ(Unaspis citri)を含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種(Maconellicoccus spp.)、パラコッカス属の種(Paracoccus spp.)、プラノコッカス属の種(Planococcus spp.)を含む);花粉甲虫(Pollen beetle)(カルポフィルス属の種(Carpophilus spp.)、メリゲテス属の種(Meligethes spp.)を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種(Caliothrips spp.)、フランクリニエラ属の種(Frankliniella spp.)、シルトスリップス属の種(Scirtothrips spp.)、スリップス属の種(Thrips spp.)を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種(Bactericera spp.)、カコプシラ属の種(Cacopsylla spp.)、ミカンキジラミ(Diaphorina citri)、パラトリオザ・コケレリ(Paratrioza cockerelli)を含む)が挙げられる。
例えば、野菜及びアブラナ作物は、以下の害虫:アブラムシ、トビイロウンカ(brown plant hopper)、アルファルファシャクトリムシ、アワヨトウ幼虫、シロイチモジヨトウ(beet armyworm)、アーティチョークのトリバガ(plume moth)、キャベツ青虫(cabbage budworm)、キャベツシャクトリムシ、ハイマダラノメイガ(cabbage webworm)、アメリカタバコガ幼虫(corn earworm)、セロリ葉を食べる昆虫(celery leafeater)、クロスストリップトキャベツワーム(cross-striped cabbagewon)、セイヨウアワノメイガ(european corn borer)、コナガ(diamondback moth)、グリーンクローバーワーム(green cloverworm)、外来種の青虫、メロンワーム(melonworm)、雑食性ハマキムシ、メイガ科幼虫、リンドワーム群(rindworm complex)、キシタクロテンヒトリ(saltmarsh caterpillar)、ダイズシャクトリムシ、オオタバコガ幼虫、トマトフルーツワーム(tomato fruitworm)、トマトホーンワーム(tomato hornworm)、トマトのギョウチュウ、ヤガ科幼虫(velvetbean caterpillar)、及びイエローストリップトアーミーウォーム(yellow-striped armyworm)の1つ以上による病虫害に感受性である。
同様に、アルファルファ、牧草及びサイレージなどの穀物飼料及び干し草作物は、多くの場合、ヨトウムシ、シロイチモジヨトウ(beef annyworm)、アルファルファキャタピラー(alfalfa caterpillar)、ヨーロピアンスキッパー(European skipper)、様々なシャクトリムシとウェブワーム、並びにイエローストリップトアーミーウォームなどの有害生物によって攻撃される。
果樹及びつる植物の作物は、多くの場合、アケマスフィンクスモス(achema sphinx moth)、アモルビア(amorbia)、ヨトウムシ、柑橘類のネキリムシ、バナナセセリ(banana skipper)、クロネハイイロハマキ幼虫(blackheaded fireworm)、ブルーベリーリーフローラー(blueberry leafroller)、エダシャクトリ、チェリーフルーツワーム(cherry fruitworm)、柑橘類のネキリムシ、クランベリーガードラー(cranberry girdler)、東テンマクケムシ(eastern tent caterpillar)、アメリカシロヒトリ、アメリカシロヒトリ、ハシバミのハマキムシ、ハシバミのウェブワーム、果樹のハマキムシ、ブドウホソハマキ(grape berry moth)、グレープリーフフォールダー(grape leaffolder)、グレープリーフスケルトナイザー(skeletonizer)、グリーンフルーツワーム(green fruitworm)、ガモソスバトラチェドラコモサエ(gummosos-batrachedra commosae)、マイマイガ、ヒッコリーシュックワーム(hickory shuckworm)、ホーンワーム(hornworm)、シャクトリムシ、ネーベルオレンジワーム(navel orangeworm)、オブリキバンデッドリーフローラー(obliquebanded leafroller)、雑食性ハマキムシ(orrinivorous leafroller)、雑食性シャクトリムシ、オレンジのハマキガ、オレンジドッグ(orangedog)、ナシヒメシンクイ(oriental fruit moth)、パンデミスのハマキムシ(pandemis leafroller)、キバガ科幼虫(peach twig borer)、ピカンナットケースベアラー(pecan nut casebearer)、レッドバンディドのハマキムシ(redbanded leafroller)、レッドハンプトキャタピラー(redhumped caterpillar)、ラフスキンドネキリムシ(roughskinned cutworm)、キシタクロテンヒトリ、スパンワーム(spanworm)、テンマクケムシ(tent caterpillar)、テクラテクラバシリデス(thecla-thecla basilides)、オオタバコガ幼虫、ハマキガ(tortrix moth)、タフティドアップルバドモス(tufted apple budmoth)、バリアゲイティドリーフローラー(variegated leafroller)、ウォルナットキャタピラー(walnut caterpillar)、西テンマクケムシ(western tent caterpillar)、及びイエローストリップトアーミーウォーム(yellowstriped annyworm)による攻撃及び立ち枯れ(defoliation)の影響を受けやすい。
キャノーラ/菜種、マツヨイグサ、メドウフォーム、トウモロコシ(飼料用トウモロコシ、スイートコーン、ポップコーン)、ワタ、ホップ、ホホバ、ピーナッツ、イネ、ベニバナ、小粒穀物(オオムギ、オートムギ、ライムギ、コムギなど)、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、及びタバコなどの作物は、多くの場合、ヨトウムシ、アジアンコーンボーラー(asian corn borer)及び他のコーンボーラー、バンディドサンフラワーモス(banded sunflower moth)、シロイチモジヨトウ、ボールワーム(bollworm)、キャベツシャクトリムシ、コーンルートワーム(corn rootworm)(サザン種及びウエスタン種を含む)、コットンリーフパーフォレイター(cotton leaf perforator)、コナガ、セイヨウアワノメイガ(european corn borer)、グリーンクローバーワーム、ヘッドモス(headmoth)、ヘッドワーム(headworm)、外来種の青虫、シャクトリムシ(アナカンプトデス属の種(Anacamptodes spp.)を含む)、オブリキバンデッドリーフローラー、雑食性リーフタイヤー(omnivorous leaftier)、ポッドウォリン(podworin)、ポッドワーム(podworm)、キシタクロテンヒトリ、サウスウエスタンコーンボーラー(southwestern corn borer)、ダイズシャクトリムシ、スポッティドネキリムシ(spotted cutworm)、サンフラワーモス(sunflower moth)、オオタバコガ幼虫、タバコスズメガ幼虫、ヤガ科幼虫を含む昆虫による病虫害の標的となる。花壇用植物、花、観賞植物、野菜、及びコンテナ苗(container stock)は、しばしば、ヨトウムシ、アザレアモス(azalea moth)、シロイチモジヨトウ、コナガ、エロモス(ello moth)(スズメガ幼虫)、フロリダファーンキャタピラー(Florida fern caterpillar)、イオメダマヤママユ(Io moth)、シャクトリムシ、オレアンダーモス(oleander moth)、雑食性ハマキムシ(omnivorous leafroller)、雑食性シャクトリムシ、及びタバコなどの多数の害虫の餌とされる。林木、果樹、観賞用樹木、及び実のなっている樹木(nut-bearing tree)、並びに低木類、及びその他の苗木は、多くの場合、ミノムシ、クロネハイイロハマキ幼虫(blackheaded budworm)、シロバネドクガ、カリフォルニアオークワーム(California oakworm)、ベイマツドクガ(douglas fir tussock moth)、エルムスパンワーム(elm spanworm)、アメリカシロヒトリ、果樹のハマキムシ(fruit tree leafroller)、グリーンストリップトメイプルワーム(greenstriped mapleworm)、マイマイガ、ジャックパイン青虫、ミモザウェブワーム、パインバタフライ(pine butterfly)、レッドハンプトキャタピラー(redhumped caterpillar)、サドルバックキャタピラー(saddleback caterpillar)、サドルプロミネントキャタピラー(saddle prominent caterpillar)、春期及び秋期に発生するエダシャクトリ(spring and fall cankerworm)、トウヒノシントメハマキ幼虫(spruce budworm)、テンマクケムシ、ハマキガ、並びに西洋ドクガ(western tussock moth)などの種々の害虫からの攻撃を受けやすい。
同様に、芝草は、多くの場合、ヨトウムシ、ソドウェブワーム(sod webworm)、及びトロピカルソドウェブワーム(tropical sod webworm)などの有害生物による攻撃を受ける。
本明細書に記載されている方法はまた、有害生物防除に適用可能であり、ここで、有害生物は、昆虫ではなく、むしろ、例えば、線虫、ナメクジ又はカタツムリであることが想定される。
一実施形態では、本明細書に記載されている方法はまた、寄生虫である昆虫に適用可能である。いくつかの昆虫寄生虫の例としては、アオムシサムライコマユバチ、コマユバチ(Braconidae)科;ヒメバチ類(Ichneumonid Wasps)、ヒメバチ(Ichneumonidae)科;コバチ類(Chalcid Wasps)、コバチ科(Chalcidae);ヤドリバエ類(Tachinid Flies)、ヤドリバエ(Tachonidae)科が挙げられる。
特定の他の実施形態において、本明細書に記載されている方法はまた、病害媒体物である昆虫に適用可能であってもよい。媒体物は、感染又は疾患を引き起こすために、宿主生物に細菌又はウイルスなどの病原体を導入することができる生物である。例示的な病害媒体物には、限定されないが、蚊、ダニ、ノミ目(ノミ)、双翅目(ハエ)、シラミ目(シラミ)及び半翅目(半翅類の昆虫)が含まれる。
殺虫剤使用に適した化合物が特定されると、有効成分又はそれらを含む製剤は、標的昆虫(すなわち、幼虫、蛹及び/又は成体)に、又は昆虫がいる場所(locus)に直接適用されてもよい。一実施形態において、有効成分又は有効成分を含有する製剤及び/又は組成物は、成体昆虫に直接適用される。一実施形態において、活性剤は、標的昆虫の幼虫及び/又は蛹に直接適用される。別の実施形態において、有効成分は、昆虫がいる場所に適用される。
疎水性部分を組み込んだ化合物が昆虫の上皮に浸透するため、活性剤は疎水性部分とコンジュゲートされ得る。疎水性部分としては、限定されないが、脂質及びステロールが挙げられる。
一実施形態において、有効成分又は有効成分を含む製剤は、スプレーとして適用されてもよい。例えば、有効成分は、農薬の空中散布における農業用スプレー、刺咬昆虫を防除するための環境スプレー、又は刺咬昆虫の局在化防除のための局所的スプレーとして適用され得る。有効成分は、エアロゾル製剤などのスプレー適用の目的で製剤化することができる。スプレー塗布は、スプレーポンプを用いて成し遂げることができる。有効成分はまた、顆粒製剤中のデンプン、小麦粉及びグルテンなどの材料内にカプセル化されてもよい。
特定の実施形態において、有効成分又は有効成分を含む製剤は、農業及び/又は環境の昆虫防除に使用される場合、有機リン酸、合成ピレスロイド、カルバメート類、塩素化炭化水素などの他の殺虫剤及び/又は殺有害生物剤と併せて適用することができる。
有効成分は、ルーチン試験によって決定される所望の応答を誘導するのに有効な量で投与することができる。実際の有効量は、当然に、特定の有効成分、標的昆虫及びその発育段階、適用技術、所望の効果、及び効果の持続時間に応じて変化し、当業者によって容易に決定することができる。「有効成分の有効量」とは、昆虫TRPVチャネルを調節する(活性化する又は阻害する)、例えば、所望の昆虫防除を達成するために昆虫の摂食行動を調節する、有効成分の量を指す。
製剤方法は、当業者に周知であり、また、参照により全体として本明細書に組み込まれるKnowles, D A (1998) Chemistry and technology of agricultural formulations. Kluwer Academic、Londonに見出される。当業者は、当然に、適用の処方及び様式が、所与の適用における有効成分の活性に影響を及ぼし得ることを認識する。したがって、農業用及び/又は園芸用使用に関して、TRPV阻害剤及び/又はアゴニストは、適用の所望の様式に応じて、相対的に大きな粒子サイズ(例えば、8/16若しくは4/8USメッシュ)の顆粒として、水溶性若しくは水分散性の顆粒として、粉末状ダストとして、水和剤として、乳化可能な濃縮物として、水性エマルジョンとして、溶液として、懸濁濃縮物として、カプセル懸濁液として、可溶性(液体)濃縮物として、可溶性粉末として、他の公知のタイプの農業的に有用な製剤のいずれかとして製剤化されてもよい。本明細書において特定された量は、あたかも「約」という用語が、特定された量の前に置かれているかのように、近似であることだけが意図されることを理解するべきである。
これらの製剤は、昆虫防除が望まれる領域において、水希釈スプレー、又はダスト、又は顆粒のいずれかとして適用することができる。製剤は、有効成分、例えば昆虫TRPV阻害剤の0.1重量%、0.2重量%又は0.5重量%程度に少ないものから95重量%以上に多いものまでを含有してもよい。
「ダスト」は、有効成分と、タルク、天然粘土、珪藻土、クルミの殻及び綿実粉などの粉末、並びに毒物の分散剤及び担体として作用する他の有機固体及び無機固体などの微粉固体との自由流動性混合物である。これらの微粉固体は約50ミクロン未満の平均粒径を有する。本明細書に有用な典型的なダスト製剤は、90部、80部、70部、60部、50部、40部、30部、20部、好ましくは10部又はそれ未満の有効成分、例えば昆虫TRPV阻害剤又は昆虫TRPVアゴニストを含有するものである。一実施形態において、ダスト製剤は、1部以下の有効成分、及び99部以上のタルクを含んでもよい。
製剤として有用である水和剤は、水又は他の分散剤中に容易に分散する、微粉粒子の形態である。水和剤は、最終的に、昆虫防除が、乾燥ダストとして、又は水若しくは他の液体中のエマルジョンとしてのいずれかで必要とされる場所に適用される。水和剤用の典型的な担体には、フラー土、カオリン粘土、シリカ、及び他の吸収性が高く、容易に湿らせる無機希釈剤が含まれる。水和剤は、典型的には、担体の吸収性に応じて、約5～80%の有効成分を含有するように調製され、通常、分散を容易にするために、少量の湿潤剤、分散剤又は乳化剤を含有する。例えば、有用な水和剤の製剤は、80.0部の有効成分、17.9部のパルメット粘土、及び1.0部のリグノスルホン酸ナトリウム、並びに湿潤剤として0.3部のスルホン化脂肪族ポリエステルを含有する。追加の湿潤剤及び/又は油は、植物の葉上の分散を容易にするためにタンクミックスに添加してもよい。
他の有用な製剤は、水又は他の分散液中に分散可能な均一な液体組成物である乳化可能な濃縮物(EC)であり、全体として、有効成分、及び液体若しくは固体の乳化剤からなっていてもよく、又はキシレン、重質芳香族ナフサ、イソホロン、若しくは他の非揮発性有機溶媒などの液体担体も含有してもよい。殺虫剤適用に関して、これらの濃縮物は、水又は他の液体担体中に分散され、通常、処理されるべき領域にスプレーとして適用される。本質的な有効成分の重量%は、組成物が適用される方式に応じて異なってもよいが、一般的には、殺虫剤組成物に対して、0.5～95重量%の有効成分を含む。
流動性製剤は、有効成分が液体担体に、一般的には水に懸濁していることを除いて、ECと同様である。ECなどの流動性剤は、少量の界面活性剤を含んでもよく、典型的には、組成物の、0.5～95重量%の範囲で、しばしば10～50重量%の範囲で有効成分を含有する。殺虫剤適用に関して、流動性剤は、水又は他の液体ビヒクル中に希釈してもよく、典型的には、スプレーとして適用される。
農業用及び/又は園芸用製剤に使用される典型的な湿潤剤、分散剤又は乳化剤としては、限定されないが、アルキル及びアルキルアリールスルホン酸塩及び硫酸塩並びにそれらのナトリウム塩;アルキルアリールポリエーテルアルコール;硫酸化高級アルコール;ポリエチレンオキシド;スルホン化動物油及び植物油;スルホン化石油;多価アルコールの脂肪酸エステル及びこのようなエステルのエチレンオキシド付加生成物;及び長鎖メルカプタン及びエチレンオキシドの付加生成物を含んでもよい。有用な表面活性剤の多数の他のタイプは、商業的に利用可能である。表面活性剤は、使用時に、典型的には、組成物の1～15重量%を含む。
他の有用な製剤には、水、コーンオイル、灯油、プロピレングリコール、又は他の適切な溶媒などの比較的不揮発性な溶媒中の有効成分の懸濁液が含まれる。
特定の実施形態において、殺虫剤適用のための製剤としては、アセトン、アルキル化ナフタレン、キシレン、又は他の有機溶媒などの、所望の濃度で完全に溶解する、溶媒中の有効成分という単純な溶液を含んでもよい。
有効成分を相対的に粗い粒子上に有する顆粒製剤は、空中散布用又はカバークロップキャノピーの浸透用に特に有用である。また、加圧されたスプレー、典型的には、有効成分が、低沸点分散溶媒担体の気化の結果として微粉形態に分散されているエアロゾルを使用してもよい。水溶性又は水分散性顆粒は、自由流動性、ほこりっぽくなく、容易な水溶性又は水混和性である。田畑での農業従事者による使用では、顆粒製剤、乳化可能な濃縮物、流動性濃縮物、水性エマルジョン、溶液などは、およそ0.1%又は0.2%～1.5%又は2%の範囲で有効成分の濃度を与えるために水で希釈されてもよい。
非常に最も頻繁に使用されるのは、水と混合し、次にスプレーとして適用するための水混和性製剤である。水混和性のより古い製剤としては、乳化可能な濃縮物、水和剤、水溶性(液体)濃縮物、及び可溶性粉末が含まれる。減少又は全く有害でない溶媒と改善された安定性を有する、より新しい非粉末製剤としては、懸濁濃縮物、カプセル懸濁液、及び顆粒水和剤が含まれる。このような製剤は、好ましくは、溶液及び懸濁液、例えば、水性懸濁液及び溶液、エタノール性懸濁液及び溶液、水性/エタノール性懸濁液及び溶液、生理食塩水、及びコロイド状懸濁液である。
代替として、スプレー可能なワックスエマルジョン製剤を用いることができる。製剤は、約0.01重量%～75重量%の量で有効成分を含有する。水性ワックスエマルジョンは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第6,001,346号に広く記載されている。本明細書に記載されている方法のTRPV阻害剤は、空中スプレー又はバックパックスプレー適用における使用に適した粘度を有することができる。
生分解性ワックス担体は、製剤の少なくとも約10重量%を構成する。生分解性ワックス担体は、パラフィン、ミツロウ、植物系ワックス、例えば大豆ワックス(大豆系)、及び炭化水素系ワックス、例えばGulf Wax Householdパラフィンワックス;パラフィンワックス、平均融点53℃(ヘキサコサン)、高分子量炭化水素)、カルナウバワックス、ラノリン、シェラックワックス、ヤマモモワックス、サトウキビワックス、微結晶、オゾケライト、セレシン、モンタン、キャンデリラワックス、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
製剤はまた、約1重量%～約10重量%の量の乳化剤を含有してもよい。適切な乳化剤には、レシチン及び変性レシチン、モノ及びジグリセリド、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、脂肪酸、脂質などを含む。乳化剤は、組成物の乳化特性を与え又は改善する。乳化剤は、当該技術分野において周知である多数の製造物から選択することができ、限定されないが、ソルビタンモノラウレート(無水ソルビトールステアレート、分子式C24H46O6)、ARLACEL 60、ARMOTAN MS、CRILL 3、CRILL K3、DREWSORB 60、DURTAN 60、EMSORB 2505、GLYCOMUL S、HODAG SMS、IONET S 60、LIPOSORB S、LIPOSORB S-20、MONTANE 60、MS 33、MS33F、NEWCOL 60、NIKKOL SS 30、NISSAN NONION SP 60、NONION SP 60、NONION SP 60R、RIKEMAL S 250、ソルビタンc、ソルビタンステアレート、SORBON 60、SORGEN 50、SPAN 55、及びSPAN 60が挙げられる;使用され得る他のソルビタン脂肪酸エステルは、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエートを含む。
特定の実施形態において、製剤は、摂食刺激物質(phagostimulant)、例えば、コーン油、糖蜜、グリセロール、又はコーンシロップ、タンパク質性物質(タンパク質又は加水分解されたタンパク質)、スクロースのような糖、又は食品ベース構成成分、例えば、トリメチルアミン、プトレシン、細菌又は酵母菌の揮発性物質又は代謝産物、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、又は他のアンモニア放出化合物を含むことができる。酢酸蒸気は、揮発酢酸を生成する化合物によって提供され得、例えば、酢酸水溶液、氷酢酸、氷(濃縮)酢酸、又はアンモニア生成化合物、例えば、制限されないが、水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどがある。
特定の実施形態において、有効成分を製剤化することができ、及び/又は1つ以上の第2の化合物とともに適用することができる。例えば、TRPV阻害剤及びTRPVアゴニストの種々の組合せはより大きな利点を得るために使用することができる。例えば、TRPV阻害剤とTRPVアゴニストの両方を同時に適用してもよい。このように、一実施形態において、本明細書に記載されている製剤は、TRPV阻害剤とTRPVアゴニストの両方を含むことができる。一実施形態において、2つ以上の活性剤を一緒に製剤化することができる。代替の実施形態において、一緒に製剤化される2つ以上の活性剤は、全てがTRPV阻害剤である又は全てがTRPVアゴニストである。このような組合せは、特定の利点を与えることができ、例えば、限定されないが、昆虫又は非昆虫有害生物のより大きな防除に相乗効果を発揮し、適用率を下げ、それにより環境及び作業者の安全性への何らかの影響を最小限にし、より広範囲の昆虫及び非昆虫有害生物を防除し、哺乳動物及び魚類などの非有害生物種による寛容を改善することが挙げられる。他の第2の化合物としては、限定されないが、殺虫剤、殺有害生物剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良剤、又は他の農園芸化学物質が含まれる。製剤は、組成物の約0.002重量%～約25重量%の量でこのような第2の化合物を含んでもよい。
特定の実施形態において、本発明の製剤は、視覚誘因物質、例えば食品着色剤を含有してよい。
種々の添加剤もまた、製剤に組み込むことができる。これらの添加剤は、典型的には、担体材料の物理的特徴を変化及び/又は増強させ、したがって、有効成分の放出速度及び量、気候条件からのワックス組成物の保護などの特定の要件を有する組成物を設計するのに適している。これらの添加剤は、典型的には、約0.001重量%～約10重量%、より典型的には1～6重量%の量で添加される、とりわけ、可塑剤、揮発抑制剤、酸化防止剤、脂質、種々の紫外線遮断剤及び吸収剤、又は抗菌剤である。
可塑剤、例えば、グリセリン又は大豆油は、組成物の物理的特性に影響を及ぼし、環境破壊への耐性を広げることができる。
酸化防止剤、例えば、ビタミンE、BHA(ブチル化ヒドロキシアニソール)、BHT(ブチル化ヒドロキシトルエン)、及び分解から生物活性剤を保護する他の酸化防止剤は、約0.1重量%～約3重量%の量で添加されてもよい。
β-カロテン、リグニン又はp-アミノ安息香酸などの紫外線遮断剤は、光分解から生物活性剤を保護し、約1重量%～約3重量%の量で添加することができる。
ソルビン酸カリウム、硝酸塩、亜硝酸塩、及びプロピレンオキシドなどの抗菌剤は、微生物による破壊から生物活性剤を保護し、約0.1重量%～約2重量%の量で添加されてもよい。
また、アジュバントを製剤に添加することができる。「アジュバント」は、殺虫剤の性能を改善する、殺虫製剤とは別に、スプレータンクに添加される任意の物質として広く定義される。これらは、限定されないが、湿潤-散布剤、ステッカー、浸透剤、相溶性剤、緩衝剤などを含むことができる。
他の化合物及び材料もまた添加することができるが、ただし、それらは、有効成分の活性を実質的に妨害しない。添加剤が有効成分の活性を実質的に妨害するか否かは、標準的な試験形式によって決定することができ、化合物が添加されていない有効成分の組成物の効力と、化合物が添加された有効成分の組成物の効力を直接比較することを伴う。
昆虫は、TRP及び/又はTRPVチャネル活性化化合物を摂取した後に食べるのを止めることが発見された。例えば、TRPVイオン依存性チャネルアゴニストの摂取は、昆虫に食べるのを止めさせる可能性がある。したがって、一実施形態において、化合物は、昆虫用の食物源を用いて製剤化されてもよく、例えば、昆虫の食餌中の化合物と製剤化されてもよい。別の実施形態において、化合物は、スクロースを用いて製剤化することができる。理論に束縛されることなしに、昆虫は、このような混合物を餌にし、食べるのを止める。
特定の実施形態において、活性剤は、昆虫の摂食場所に適用されてもよい。これは、昆虫摂食を阻害し、昆虫の飢餓をもたらす。一実施形態において、活性剤は、昆虫がいる場所、例えば、摂食場所にスプレーとして適用される。活性剤は、昆虫及び/又は有害生物(軟体動物、線虫及び/又は節足動物)摂食源に適用され、餌若しくはトラップで使用され、及び/又は有害生物自体に直接適用され得る。
一実施形態において、活性剤は、捕虫器に適用されてもよい。例えば、捕虫器は活性剤で被覆されてもよく、又は捕虫器に活性剤を含む昆虫食を入れておいてもよい。
TRPVチャネルのNanchungサブユニット及びInactiveサブユニットの核酸配列、並びに対応するアミノ酸配列、それらの起源及び受託番号(可能な場合)は、以下の表1にまとめられる。細胞内にNanchungタンパク質とInactiveタンパク質が共発現されると、機能的TRPVチャネルが形成され得る。
Figure 0007098331000001
Figure 0007098331000002
Figure 0007098331000003
Figure 0007098331000004
Figure 0007098331000005
アデノビリオンは、本発明のアデノウイルス発現ベクターを含み、以下の方法を用いて産生することができる。アデノビリオンは、目的とするタンパク質、例えば、Nanchung、Inactive、TRP及び/又はTRPVタンパク質を発現するために使用される細胞を生成するために使用され得る。
アデノウイルスを作製する方法は、一般的に、目的とする遺伝子(例えば、Nan又はIav)を含有するベクターを、産生細胞に導入するステップを伴う。目的とする遺伝子を含有するベクターは、当業者に公知の標準的なトランスフェクション技術を用いて産生細胞に導入されてもよい(Zoltukhinら、Gene Therapy、6:973-985、1999)。産生細胞(パッケージング細胞)によって産生されたアデノウイルスは、目的とする細胞を形質導入するために使用される。目的とする細胞は、所望のタンパク質を産生する。
好ましくは、アデノビリオンは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入法に従って、感染の適切な多重度で細胞に添加される。投与するアデノビリオンの力価は、標的細胞の種類及び特定のウイルスベクターに依存して変化することができ、過度の実験を行うことなしに当業者によって決定され得る。
細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Sf9(ATCC番号CRL-1711)細胞又はシュナイダー(Schneider)2(S2)細胞(Life Technologies、番号R690-07(必要であれば、目的とする遺伝子を昆虫細胞に導入するために、とりわけ、トランスフェクション技術を使用することができる)、アフリカツメガエル(African clawed frog)(アフリカツメガエル(Xenopus laevis))の卵母細胞(目的とする遺伝子を導入するために、注入技術を使用することができる)、又は哺乳動物細胞株、例えば、マウス、ハムスター、ヒトの細胞株(目的とする遺伝子を哺乳動物細胞に導入するために、いくつかの技術を使用することができ、限定されないが、トランスフェクション、アデノウイルス、レトロウイルス、及び/又はエレクトロポレーションなどを含む)、あるいは、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を通常発現しない任意の他の細胞株であってもよい。本発明のベクター発現系を用いた使用に適した哺乳動物細胞株の一例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO-K1)細胞(ATCC番号CCL-61)が含まれる。
特定の実施形態において、細胞株は、3:1、2:1、1:1、1:2、及び1:3の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。好ましくは、細胞株は、1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。
いくつかの実施形態において、TRPVチャネルをコードする組換え核酸配列を発現する細胞は、限定されないが、本明細書に開示されているTRPVチャネルタンパク質などの昆虫TRPVチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された細胞である。当業者に公知である細胞を形質転換するための方法としては、限定されないが、ウイルスベクターを用いた感染、リポフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びトランスフェクションが挙げられる。代表的な方法に関する詳細な手法は、Sambrook & Russell、2001及びそこに引用された参考文献に見出すことができる。有用な発現ベクター、及びこのようなベクターを細胞内に導入する方法又はコードされたポリペプチドの発現はまた、当業者に公知である。例えば、プラスミド発現ベクターは、カルシウム-リン酸を媒介としたトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介としたトランスフェクション、リポフェクション、ポリブレン若しくはポリリジンを媒介としたトランスフェクション、エレクトロポレーションによって、又は抗体、グラミシジンS、人工的なウイルスエンベロープ若しくは他の細胞内担体へのコンジュゲーションによって、細胞内に導入することができる。ウイルス発現ベクターは、例えば、感染又は形質導入によって、又はリポソーム中にカプセル化することによって、発現可能な形態で細胞内に導入され得る。
昆虫TRPVチャネル遺伝子産物をコードする組換え核酸配列を発現する細胞が生成された場合、これらの細胞は、次に、TRP及び/又はTRPVチャネルを介して細胞内でイオン輸送を調節する能力について候補化合物を試験するのに用いることができる。細胞内でイオン輸送を試験するための例示的な方法は、上述され、及び以下の実施例の部おいて示された。他の適用可能な方法は、本開示を考慮すれば、当業者に公知である。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］化合物が1つ以上のNanchungタンパク質に直接結合するかどうかを決定する方法であって、
(a)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
(b)前記1つ以上のNanchungタンパク質と1つ以上の化合物を接触させるステップ;及び
(c)前記1つ以上のNanchungタンパク質への前記1つ以上の化合物の結合親和性を決定するステップ
を含む、方法。
［実施形態２］前記1つ以上のNanchungタンパク質と複合体を形成する、1つ以上のTRPタンパク質をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］前記1つ以上のTRPタンパク質が、1つ以上のTRPVタンパク質である、実施形態２に記載の方法。
［実施形態４］前記1つ以上のTRPVタンパク質が、Inactiveタンパク質である、実施形態３に記載の方法。
［実施形態５］前記1つ以上のNanchungタンパク質が、1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルを形成する、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。
［実施形態６］さらに、前記1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルが、昆虫TRP及び/又はTRPVチャネルである、実施形態５に記載の方法。
［実施形態７］前記1つ以上の化合物が、少なくとも1つの候補化合物を含む、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
［実施形態８］前記候補化合物が、標識された化合物である、実施形態７に記載の方法。
［実施形態９］前記1つ以上の化合物が、少なくとも1つの標識された化合物及び少なくとも1つの候補化合物を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
［実施形態１０］前記標識された化合物が、前記1つ以上のNanchungタンパク質に対して高い結合親和性を有する、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１１］前記結合親和性が、K d 及び/又はK i を含む1つ以上の平衡結合定数を用いて決定される、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１２］前記1つ以上のNanchungタンパク質への前記標識された化合物の結合親和性が、3×10 -7 M未満又はそれに等しい平衡解離定数(K d )を有する、実施形態９～１１のいずれかに記載の方法。
［実施形態１３］前記1つ以上のNanchungタンパク質への前記標識された化合物の結合親和性が、3×10 -8 M未満又はそれに等しい平衡解離定数(K d )を有する、実施形態９～１２のいずれかに記載の方法。
［実施形態１４］前記1つ以上のNanchungタンパク質への前記標識された化合物の結合親和性が、30×10 -12 M未満又はそれに等しい平衡解離定数(K d )を有する、実施形態９～１３のいずれかに記載の方法。
［実施形態１５］前記1つ以上の化合物のうちの少なくとも1つが、トリチウム同位体で標識されている、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。
［実施形態１６］前記標識された化合物が、アフィドピロペンである、実施形態１５に記載の方法。
［実施形態１７］化合物を分類する方法であって、
(1)結合アッセイステップであって、1つ以上のNanchungタンパク質を1つ以上の候補化合物によって接触させ、前記1つ以上のNanchungタンパク質に対する前記1つ以上の候補化合物についての結合親和性を決定する、ステップ、
(2)前記化合物を含む殺虫剤化合物について作用様式の分類を同定するステップ
を含む方法。
［実施形態１８］候補化合物を分類する方法が、
1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルを1つ以上の候補化合物と接触させる調節因子アッセイステップであって、アッセイは、前記1つ以上の候補化合物が前記1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節因子として作用するかどうかを決定するために使用される、ステップ
をさらに含む、実施形態１７に記載の方法。
［実施形態１９］結合ステップが、以下:
(a)以下:Nanchungタンパク質、Inactiveタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネル、のうちの1つ以上を提供するステップ;
(b)前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルを1つ以上の化合物と接触させるステップ;
(c)前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに結合している前記1つ以上の化合物の量を測定するステップ;
(d)前記1つ以上の化合物の平衡解離定数(K d )を計算するステップ;
(e)前記K d が、以下の方法:(I)(a)最大結合(B max )及び(b)最大結合の50%に到達するために必要とされる化合物の濃度、(II)化合物の結合速度(K on )及び解離速度(K off )を測定すること、ここでK d =K off /K on である、(III)蛍光分極アッセイ、(IV)表面プラズモン共鳴、(V)等温熱量測定、(VI)Schild分析のうちの1つ以上を用いて決定され得;
(f)前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルを、前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルに対して高親和性を有する標識された化合物と接触させるステップ;
(g)前記1つ以上の標識された化合物の存在下で、前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルを少なくとも1つの候補化合物と接触させるステップ;
(h)標識された化合物の結合が0%に近づくまで、前記1つ以上のNanchungタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質複合体及び/又はチャネルと接触するために利用可能な前記少なくとも1つの候補化合物の量を増加させるステップ;
(i)以下の方法:(I)(a)前記候補化合物の不存在下で、結合した標識された化合物の量を決定し、(b)前記結合した標識された化合物の量を50%減少させるのに必要とされる前記候補化合物の濃度を決定すること、(II)蛍光分極アッセイ、及び/又は(III)Schild分析のうちの1つ以上を用いて、競合アッセイについての平衡阻害定数(K i )及び/又は平衡解離定数(K d )を計算するステップ;
(j)前記候補化合物の阻害定数を、他の候補化合物の阻害定数と比較するステップ;
(k)前記候補化合物の阻害定数を、標識された化合物の解離定数と比較するステップ;
(l)前記1つ以上のNanchungタンパク質、Inactiveタンパク質、TRP及び/又はTRPVタンパク質、タンパク質複合体及び/又はチャネルに対して高親和性を有する1つ以上の候補化合物を同定するステップ
のうちの1つ以上を含む、実施形態１７又は１８に記載の方法。
［実施形態２０］候補化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、実施形態１８に記載の方法。
［実施形態２１］候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。
［実施形態２２］候補化合物が哺乳動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質に直接結合するかどうかを決定する方法であって、
(a)1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質を提供するステップ;
(b)前記1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質を、1つ以上の化合物と接触させるステップ;
(c)前記1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質に対する前記1つ以上の化合物の結合親和性を計算するステップ;及び
(d)前記1つ以上の哺乳動物のTRP及び/又はTRPVタンパク質に対する前記1つ以上の化合物の結合親和性を、昆虫のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体に対する前記1つ以上の化合物の結合親和性と比較するステップ
を含み、ここで、哺乳動物の1つ以上のTRP及び/又はTRPVタンパク質と比較した、昆虫のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体に対する前記1つ以上の化合物の結合親和性の増加は、前記昆虫のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体に選択的に結合するものとして前記1つ以上の化合物を同定し、ここで、前記結合親和性は、K d 及び/又はK i を含む1つ以上の平衡結合定数を用いて決定される、方法。
［実施形態２３］前記1つ以上の化合物が、1つ以上の候補化合物を含む、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２４］前記1つ以上の化合物が、1つ以上の標識された化合物を含む、実施形態２３に記載の方法。
［実施形態２５］前記標識された化合物が、1つ以上の候補化合物を含む、実施形態２４に記載の方法。
［実施形態２６］前記1つ以上の標識された化合物が、トリチウム同位体で標識されている、実施形態２４又は２５に記載の方法。
［実施形態２７］前記1つ以上の化合物が、前記1つ以上のNanchungタンパク質に対して増加した結合親和性を有し、K i 又はK d が、前記哺乳動物のTRPタンパク質に対して10倍低い、実施形態２６に記載の方法。
［実施形態２８］1つ以上の昆虫のTRP及び/又はTRPVタンパク質複合体に直接結合する1つ以上の化合物を含む組成物。
［実施形態２９］実施形態１～２８のいずれかに記載の方法によって選択される1つ以上の化合物を含む組成物。
［実施形態３０］前記1つ以上の化合物が、1つ以上の昆虫のTRP及び/又はTRPVチャネルのための調節因子として作用する、実施形態２８又は２９に記載の組成物。
［実施形態３１］前記1つ以上の化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子として作用する、実施形態２８～３０のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３２］前記1つ以上の化合物が、アフィドピロペンを含む、実施形態２８～３１のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３３］昆虫、昆虫の生息地、餌、トラップ及び/又は昆虫の摂食源のうちの1つ以上に、実施形態２８～３２のいずれかに記載の組成物を適用することを含む、昆虫を防除する方法。
［実施形態３４］前記化合物が、昆虫TRPチャネルの阻害剤である、実施形態３３に記載の方法。
［実施形態３５］前記化合物が、昆虫TRPチャネルの活性化因子である、実施形態３３又は３４に記載の方法。
［実施形態３６］昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病原媒体物又は寄生虫である、実施形態３３～３５のいずれかに記載の方法。
［実施形態３７］農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ(Aphis fabae)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、リンゴアブラムシ(Aphis pomi)、ジャガイモヒゲナガアブラムシ(Aulacorthum solani)、ダイコンアブラムシ(Brevicoryne brassicae)、ジサフィス・プランタギネア(Dysaphis plantaginea)、チューリップヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum euphorbiae)、チューリップヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum euphorbiae)、イバラヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum rosae)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、レタスヒゲナガアブラムシ(Nasonovia ribisnigri)を含む);コナジラミ(アレウロデス属の種(Aleurodes spp.)、ベミシア属の種(Bemisia spp.)、ジアレウロデス属の種(Dialeurodes spp.)、トリアレウロデス属の種(Trialeurodes spp.)を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、シファンタ属の種(Siphanta spp.)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)を含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種(Amrasca spp.)、エンポアスカ属の種(Empoasca spp.)を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種(Aspidiotus spp.)、アカホシマルカイガラムシ(Chrysomphalus aonidum)、ワタフキカイガラムシ(Icerya purchase)、ニセヤノネカイガラムシ(Unaspis citri)を含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種(Maconellicoccus spp.)、パラコッカス属の種(Paracoccus spp.)、プラノコッカス属の種(Planococcus spp.)を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種(Carpophilus spp.)、メリゲテス属の種(Meligethes spp.)を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種(Caliothrips spp.)、フランクリニエラ属の種(Frankliniella spp.)、シルトスリップス属の種(Scirtothrips spp.)、スリップス属の種(Thrips spp.)を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種(Bactericera spp.)、カコプシラ属の種(Cacopsylla spp.)、ミカンキジラミ(Diaphorina citri)、パラトリオザ・コケレリ(Paratrioza cockerelli)を含む)からなる群から選択される、実施形態３６に記載の方法。
［実施形態３８］化合物が1つ以上のNanchungタンパク質上の同じ部位に直接結合するかどうかを決定する方法であって、
(a)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
(b)前記1つ以上のNanchungタンパク質を、アフィドピロペン、ピメトロジン、ピリフルキナゾン及び/又はN-脱アセチル化ピリフルキナゾンからなる群から選択される1つ以上の化合物と接触させるステップ;
(c)前記1つ以上のNanchungタンパク質を、1つ以上の候補化合物と接触させるステップ;及び
(c)前記1つ以上のNanchungタンパク質に対する前記1つ以上の候補化合物の結合親和性を決定するステップ
を含む、方法。
以下の実施例は、例証的な実施形態を提供する。本開示及び当業者の一般的レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図しており、多数の変化、改変及び変更は、本開示の主題の範囲から逸脱することなく用いることができることを理解する。
アフィドピロペンについての調節例
[実施例I]
アフィドピロペン及びピメトロジンは、バッタの特徴的な後肢伸長を誘発する。
ピメトロジン(PM)の注入は、大腿弦音器官の機械感覚ニューロンのサイレンシングに起因する現象である、バッタ(トノサマバッタ(Locusta migratoria))における特徴的な後肢伸長を生じることが示された(Ausbornら、2005)。本発明において、本発明者らは、この化合物をアメリカバッタ(アメリカイナゴ)に注入することにより、アフィドピロペンが昆虫の弦音器官を同じように標的化するかどうかを試験し、この注入がピメトロジンと同様に後肢伸長を誘発することを見出した(図2)。これは、ピメトロジン及びアフィドピロペンが、同じ分子標的に作用し得ることを示唆した。
[実施例II]
アフィドピロペンはショウジョウバエのTRPVチャネルを活性化する。
ピメトロジン(PM)、ピリフルキナゾン及びN-脱アセチル化ピリフルキナゾン(dPFQ)は、昆虫のTRPVチャネル、Nan及びIavを発現するアデノウイルスで同時感染させたCHO細胞(ハムスター細胞)においてカルシウム動員及び膜脱分極を誘発した(Nesterovら、2013;Nesterovら、2015)。同様のアプローチを用いて、本発明者らは、昆虫のTRPVチャネル、Nan及びIavを発現するアデノウイルスで同時感染させた細胞において、アフィドピロペンが類似の応答を誘起することを見出した。これらの研究において、2つの異なるアッセイが用いられた:一つ(図3)は、カルシウムプローブであるfluo-4(Marshallら、2013)によるカルシウム動員をモニターした;一方、もう一つ(図4)は、蛍光電圧インジケータ(Zhengら、2004)を用いてアゴニスト誘導性のプラズマ脱分極を測定した。両方のアッセイにおいて、アフィドピロペン、ピメトロジン及びN-脱アセチル化ピリフルキナゾンは、Nan及びIavウイルスで同時感染させた細胞においてのみカルシウム動員及び膜脱分極応答を引き起こしたが、親細胞では引き起こさず(例えば、Nan及び/又はIavで感染させなかったハムスター細胞)、並びにNan及び/又はIavだけを発現する細胞においても引き起こさなかった。カルシウム動員アッセイにおいて、用量依存曲線(図5)は、アフィドピロペン、N-脱アセチル化ピリフルキナゾン及びピメトロジンについて、それぞれ1.0nM、64nM及び51nMの最大半有効濃度(EC50)をもたらした。
[実施例III]
N-脱アセチル化ピリフルキナゾンはエンドウアブラムシ(pea aphid)のTRPVチャネルを活性化する
他の昆虫種由来のTRPVチャネルの活性化がまた、Nan及びIavサブユニットの同時存在を必要とするかどうかを決定するために、二電極電圧クランプ電気生理学を用いて、エンドウアブラムシであるエンドウヒゲナガアブラムシ(Acyrthosiphon pisum)由来のNan及びIav mRNAを注入したアフリカツメガエル(カエル)の卵母細胞におけるチャネル開口を測定した。電流-電圧試験を実施し、電流をある範囲の保持電位にわたって測定した。N-脱アセチル化ピリフルキナゾンは、NanとIavの両方を発現する卵母細胞においてのみ内外の電流応答を誘起したが(図4a)、Nan及びIav単独では誘起しなかった。
[実施例IV]
アフィドピロペンは哺乳動物のTRPV4チャネルを活性化しない
アフィドピロペン効果の受容体種特異性についての洞察を得るために、CHO細胞(ハムスター細胞)を、マウスのTRPVチャネル、mTRPV4を発現するアデノウイルスを用いて形質導入した。図6に示すように、TRPV4アゴニストであるGSK1016790A(Thorneloeら、2008)は、これらの細胞において強力なカルシウム応答を誘起したが、一方、アフィドピロペンは、mTRPV4を発現する細胞を活性化できなかった。GSK1016790Aは、TRPV4チャネルの公知の強力なアゴニストである。したがって、本発明者らは、アフィドピロペンが、昆虫のTRPVチャネルの調節因子であるが、哺乳動物のTRPV4チャネルを調節しないという点において、種特異的殺虫剤であることを見出した。TRPV4チャネルは、昆虫のTRPVチャネルの最も近いオルソログの1つである。それは、配列類似性及び公知のアゴニストの利用可能性に基づいて使用することが選択された。
直接結合例
[実施例V]
アフィドピロペンは昆虫のTRPVチャネルに直接結合する
Nan及びIavを共発現する細胞から調製された膜へのトリチウム標識されたアフィドピロペンの特異的結合は、膜の量の増加に対して線形関係を示したが、一方、親細胞膜への結合は、使用した膜の量に関わらず低いままであった(図7)。Nan-Iav膜への飽和結合(図8)は、2つの結合部位の存在を明らかにした:1つは非常な高親和性(Kd=0.032nM、Bmax=87fmol/mg膜タンパク質)であり、もう1つは低親和性(Kd=2.3nM、Bmax=167fmol/mg膜タンパク質)であった。Nanだけの細胞から調製された膜において、より低い親和性部位だけが検出されたが(Kd=2.1nM、Bmax=242fmol/mg膜タンパク質)、Iavだけの細胞から調製された膜においては、特異的結合は観察されなかった。このデータから、本発明者らは、Nanタンパク質が、アフィドピロペンの主要な結合界面を形成し、一方、Iavの存在は、結合親和性を高めるための促進因子として作用し得ることを見出した。
[実施例VI]
ピメトロジン及びピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態は結合に関して[3H]-アフィドピロペンと競合する。
Nan-Iav複合体から[3H]-アフィドピロペンを置換するピメトロジン及びピリフルキナゾンのN-脱アセチル化形態の能力を評価するために(図9A)、低濃度の[3H]-アフィドピロペン(0.05nM)、すなわち、[3H]-アフィドピロペンのNanだけの膜への結合が無視できる条件下で実験を行った(図8)。ピメトロジン、N-脱アセチル化ピリフルキナゾン及び標識されていないアフィドピロペンの両方は、単純な動力学(ヒル値≒-1)で高親和性部位から[3H]-アフィドピロペンを完全に取り除き、これは、試験された3つの化合物が全て同じ結合部位を共有することを示す。注目すべきことに、標識されていないアフィドピロペンについて、置換アッセイ(図9A)で測定された60pMのKi値は、飽和結合実験(図8)で[3H]-アフィドピロペンについて得られた32pMのKd値に近く、これは2倍未満の差であり、これらの2つの値の近い類似性を例証する。N-脱アセチル化ピリフルキナゾン及びピメトロジンは、アフィドピロペンよりも有意に低い結合親和性を示し、N-脱アセチル化ピリフルキナゾン及びピメトロジンについてKi値はそれぞれ9nM及び50nMであり、これは、機能的アッセイ(図5)においてこれらの化合物のより低い効力と相関する。このデータに基づいて、本発明者らは、アフィドピロペンが、ピメトロジン及びdPFQと同じ部位に直接結合することを見出した。これは、これらの3つの化合物が同じ作用様式を有することを意味する。
標識されていないアフィドピロペンを用いた、Nanだけを発現する膜からの[3H]-アフィドピロペンの置換(図9B)は3.1nMのKi値をもたらし、これは[3H]-アフィドピロペンによる飽和結合から計算された2.1nMのKd値に近い(図8)。ピメトロジン及びN-脱アセチル化ピリフルキナゾンは、Nanだけの部位から明らかに[3H]-アフィドピロペンを置換したが、これらの化合物の高濃度での溶解性が低く、競合結合曲線が底部プラトーに到達するのを防止し、Ki値の正確な決定を妨げた。それにも関わらず、3つの化合物は全て、高親和性Nan-Iav複合体についてと同じ、低親和性Nanだけの部位についての効力順位(アフィドピロペン>N-脱アセチル化ピリフルキナゾン≧ピメトロジン)を明らかに示した。したがって、Iavタンパク質の共発現は、一方ではアフィドピロペンと、他方ではピメトロジン及びN-脱アセチル化ピリフルキナゾンとの間に顕著な構造的相違があるにも関わらず、全ての3つの殺虫剤に対する結合親和性を増加させるようである(図1)。本発明者らは、Inactiveタンパク質の存在が、アフィドピロペンに加えて、N-脱アセチル化ピリフルキナゾン及びピメトロジンに対する結合親和性を増加させることを見出した。
要約すると、上記実施例における機能的アッセイと結合アッセイの組合せを用いて、本発明者らは、以下のことを実証した:i)昆虫のTRPVチャネルは、候補殺虫剤であるアフィドピロペンの直接分子標的である;ii)TRPVタンパク質のアフィドピロペン結合部位は、2つの市販の殺虫剤であるピメトロジン及びN-脱アセチル化ピリフルキナゾンと共有され、3つ全ての化合物の同じ作用様式を示す;iii)3つ全ての化合物の結合親和性を測定した;iv)Nanchungタンパク質は、3つ全ての化合物の主要な結合界面を形成し、一方、Inactiveタンパク質の存在は結合親和性を増加させる;(v)昆虫のTRPVチャネルを直接標的とすることによって作用する殺虫剤として使用し得る候補化合物を同定するために使用することができる新しい方法を開発した;(vi)アフィドピロペンは、これらの方法において使用され、同じ作用様式を有する新しい候補化合物の同定を支援し得る。
ピメトロジン及びGSK10116790AをSigmaから得、ピリフルキナゾンをChemService Inc.(West Chester、PA)から得、N-脱アセチル化ピリフルキナゾンをWako Pure Chemical Industries, LTD(Richmond、VA)から得、アフィドピロペンをBASFで合成した。トリチウム標識したアフィドピロペン(19Ci/mmol)は、RC TRITEC AG(Teufen、Germany)によってカスタムメイドされた。
肢伸長アッセイ
アメリカバッタ(アメリカイナゴ)をHojun Song博士(セントラルフロリダ大学)から入手した。試験化合物(100%DMSO中10mM)又はビヒクル(100%DMSO)を、ハミルトンシリンジを用いて、腹側間葉鞘を介した注射によて投与した(動物あたり3μl)。化合物の効果を注射後40～60分で評価した。
CHO-K1細胞におけるNan及びIavの異種発現
それらのカルボキシル末端に融合FLAGタグ及びAcGFP蛍光タンパク質を有するNan、Iav及びmTRPV4を産生させるために、ショウジョウバエのNan(NCBI NM_001274904.1)及びIav(NCBI NM_132125.1)をコードする相補的DNA(cDNAs)は、Life Technologies(Grand Island、NY)によって合成され、C末端にFLAG抗体タグをコードする配列が付加された。C末端のFLAGエピトープ配列を含むマウスTRPV4(NCBI NM_001274904.1)のcDNAをOrigene(Rockville、MD)から購入した。昆虫cDNAは、哺乳動物細胞において発現させるためにコドン最適化された。Nan-FLAG及びIav-FLAG cDNAは、改変されたpAcGFP1-Hyg-N1ベクター(Clontech、京都、日本)のBglII及びHindIII部位にサブクローニングされ、これは、AcGFP部分のC末端にFLAGタグを含んだ(pAcGFP1-Hyg-N1-FLAG)。mTRPV4-FLAG cDNAは、プライマー5'-GGACTTTCCAAAATGTCG-3'(配列番号108)及び5'-CCGGCCGTTTATCACTACAGAATTCGAAGCTTAACCTTATCGTCGTCATCCTTGTA-3'(配列番号109)を用いてPCR増幅され、続いて、BglII及びHindIIIで消化され、pAcGFP1-Hyg-N1-FLAGベクターにサブクローニングされた。これらのクローニング手順は、各Nan、Iav及びマウスTRPV4のカルボキシル末端に2つのFLAGエピトープタグが隣接するAcGFPタンパク質を付加した。
そのカルボキシル末端に融合HAエピトープ及びmCherry蛍光タンパク質を有するNanを産生させるために、コドン最適化されたnan cDNAは、プライマー5'-GCTGGTTTAGTGAACCGTCAG-3'及び5'-CCGCGGTACCGTCGACTGCAGAATTCGAAGCTTAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGAAGTTGTTGTTGTCGCTGCACTCGGACTTGGG-3'を用いてPCR増幅させ、NanのC末端にHAエピトープタグを付加した。PCR産物をXhoI及びHindIIIで消化し、mCherry部分のC末端にHAタグを含む改変されたpmCherry-N1ベクター(Clontech)にサブクローニングした。このクローニング手順は、NanのC末端に2つのHAエピトープタグが隣接するmCherryタンパク質を付加した。
アデノウイルスを産生させるために、エピトープタグ化Nan及びIavをXhoI及びNotIで消化し、アデノウイルスシャトルベクターpENTCMV1-TetO(Welgen Inc.、Worceter、MA)の同じ部位にサブクローニングした。エピトープタグ化mTRPV4をBglIIで消化し、クレノウで平滑末端化し、XbaIで消化した。断片をpENTCMV1-TetOのPmeI及びXbaI部位にサブクローニングした。タグ化Nan、Iav又はmTRPV4発現構築物を含有するpENTCMV1-TetOベクターをLR Clonase II(Life Technologies)で処理し、残りのアデノウイルスゲノムを含有するpAdREPプラスミド(Welgen)にライゲートした。pENTCMV1-TetOベクターは、改変されたCMVプロモーター内に2つのTetリプレッサー結合部位を含み、これは、Tetリプレッサーを発現する細胞中の目的とする遺伝子の転写を抑制する。組換え産物を大腸菌(Escherichia coli)細胞に形質転換し、陽性クローンを選択し、コスミドDNAを単離した。コスミドDNAをPac Iで消化し、次に、Tetリプレッサーを産生するHEK293-TetR細胞(Postleら、1984)にトランスフェクトし、アデノウイルスパッケージング細胞によるTRPチャネルの発現を防止した。アデノウイルスを大規模培養物から精製し、ウイルス力価をウイルス粒子/mL=260nmでの吸収×1.1×1014として計算した。
カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞におけるNan及びIavの異種発現
Nan及びIavコード配列は、QIAGEN Onestep RT-PCRキット(カタログ番号210212)及びプライマーnan-Ap開始5'-GCCACCATGGGTAACACCGAGAGCAATG-3'、nan-Ap停止5'-TTATTCATTTGCTTTTAGATTAAATGTCCC-3'、iav-Ap開始5'-GCCACCATGGGAAATTCTTGTGCGAG-3'及びiav-Ap停止5'-TCAGAAATCGTCGTTGGG-3'を用いて、エンドウアブラムシ(エンドウヒゲナガアブラムシ)の触角の総RNAからRT-PCR増幅され、卵母細胞の発現ベクターpGH19にクローニングされた。転写用の直鎖cDNA鋳型は、ベクター特異的プライマー5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTG-3'及び5'-GACACTATAGAATACTCAAGCTAGCCTCGAGG-3'を用いて、これらの構築物からのPCR増幅によって生成された。これらのプライマーは、T7プロモーター、及びPCR産物中のpGH19に見出されるアフリカツメガエルグロブリン-XI遺伝子由来の3'UTR配列を含むように設計された。PCR条件は、95℃で4分の1サイクル、95℃で30秒間、55℃で30秒間及び65℃で4分間の35サイクル、並びに68℃で6分間の1サイクルであった。
インビトロ転写は、T7ポリメラーゼmMessage mMachineキット(Ambion)を用いて行った。アフリカツメガエルの卵巣は、Xenopus1, Inc.(Dexter、MI)から得た。葉(lobe)を部分的に切開し、卵母細胞リンゲル液(pH 7.5、mM単位で:NaCl 82.5、KCl 2、MgCl2 1、HEPES 5)中に溶解させた1型コラゲナーゼ(Alfa Aesar)で濾胞除去されるまで消化した。濾胞除去された卵母細胞を2時間、ND-96+(pH7.5、mM単位で:NaCl 96、KCl 2、MgCl2 1、CaCl2 1.8、HEPES 5、ピルビン酸Na 2.5及びゲンタマイシン50μg/mL)中で洗浄し、インキュベートし、その後、RNA注入した。ステージIV及びVの卵母細胞に、Nanoject自動注射器(3-00-203-X、Drummond Scientific)を用いてNan、Iav又は両方からのRNAを注入した。各サブユニットの1対1の発現について、各サブユニットについて0.15ngのRNAを50nLのRNAse不含水(3ng/μL)中で同時注入した。単一サブユニットのRNA注入について、30ngのRNAを50nL(600ng/μL)の水中で注入して、単一サブユニットの最大発現を確実にした。任意の測定又は比較ステップの前に、卵母細胞をND-96+中で17℃にてインキュベートし、培地を毎日交換した。さらなる試験ステップは、RNA注入の3日後及び/又は卵母細胞による十分なタンパク質産生の後に行われた。
カルシウムイメージング及び膜脱分極アッセイ
組換えTRPチャネルの等しい発現レベルを可能にするアデノウイルスの力価及び最適な細胞応答が以前に確立された(Nesterovら、2015)。ハムスターCHO-K1細胞は、AcGFP-Iav、mCherry-Nan、AcGFP-IavとmCherry-Nanの1:1混合物(細胞あたり4000個のウイルス粒子)又はAcGFP-mTRPV4(細胞あたり400個のウイルス粒子)を発現するアデノウイルスで感染させた。細胞を、100μlの培地中、40,000細胞/ウェルの密度で、ポリ-D-リジンでコーティングされた96ウェルプレート(Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany)上に播種された。細胞を一晩37℃で、続いて3日間25℃に保った。播種の2日後に培地を交換した。FLIPR-TETRA装置(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いてCa2+動員と膜電位の変化の両方を測定した。Ca2+動員は、fluo-4AM(Life Technologies)を用いて測定された。細胞は、4μM fluo-4AM、5mMプロベネシド、20mM CaCl2、及び0.02%プルロニックを含有する50μlのハンクス緩衝塩溶液(HBSS)で2時間、25℃で充填された。次に、色素を捨て、50μlのHBSSを添加した。試験化合物をDMSOに溶解し、50μlのHBSS中の細胞に添加して、0.2%のDMSO最終濃度を得た。470～495nm/515～575nmの励起/発光波長で1秒間隔で10分間、蛍光をモニターした。HBSSに溶解させた独自の膜電位色素(Molecular Devices、カタログ番号R8042)を用いて細胞を2時間、充填した以外は、同様の手順を用いて膜電位の変化を測定した。色素充填溶液を捨て、50μlの20mM HEPES、11.1mMグルコース、125mM NaCl、及び2.5mM KCl、及び20mM CaCl2で置き換えた。DMSOに溶解させた試験化合物を、50μlの同溶液中の細胞に添加し、0.2%のDMSO最終濃度を得た。510～545nm/565～625nmの励起/発光で1秒間隔で10分間、蛍光をモニターした。
GraphPad Prism(GraphPadソフトウェア)を用いてEC50値を計算した。
アフリカツメガエルの卵母細胞の二電極電圧クランピング
卵母細胞をND-96浴溶液(mM単位で:NaCl 96、KCl 2、MgCl2 1、CaCl2 1.8、及びHEPES 5、pH 7.5)で満たされたRC-8レコーディングチャンバー(Warner Instruments)に入れた。3M KClで満たされ、0.9～1.4MΩの間の抵抗を有するガラス微小電極を使用して、PatchMasterレコーディングソフトウェアv.2x73.5(HEKA)によって制御されるTurbo Tec 10-C増幅器(npi)及びITC-16コンピュータインターフェース(InstruTech)を通して卵母細胞を電圧クランプした。卵母細胞をND-96生理食塩水で2mL/分(重力供給)で灌流した。N-脱アセチル化ピリフルキナゾン(dPFQ)を、ND-96及び0.1%DMSOで希釈した10μM dPFQで浴溶液を切り替えることによって、細胞上で直接同じ灌流ラインを通して送達した。電圧ステップの間に、卵母細胞を-20mVで保持した。10秒ごとに、電圧は+40mVまでステップアップされ、平衡後の電流を測定し、チャートレコーディングとして経時的にプロットした(図4a)。単一及び共発現サブユニットの電流電圧関係は、-20mVの保持電位から-100～+60mVの間の電圧まで電圧をステップすることによって誘発される電流を測定することによって決定された。チャートレコーディング及びIV試験は、Patchmasterからエクスポートされ、分析され、Prism 6(GraphPad)でプロットされた。チャートレコーディング電流は、各細胞の初期電流(I/I0)に対して標準化された。N-脱アセチル化ピリフルキナゾンは、NanとIavの両方を発現する卵母細胞においてのみ内向き及び外向きの電流応答を誘起したが(図4a)、Nan又はIav単独を発現する卵母細胞では内向き又は外向きの電流応答は誘起されなかった。したがって、候補化合物が昆虫のTRPVチャネルの調節因子であるかどうかを決定する方法は、昆虫のTRPVチャネルを発現する第1の細胞を提供するステップであって、その第1の細胞はアフリカツメガエルの卵母細胞であり得る、ステップ;第1の細胞を候補化合物と接触させるステップであって、候補化合物はdPFQであり得る、ステップ;及び昆虫のTRPVチャネルの調節をアッセイするステップであって、調節は、昆虫のTRPVチャネルの調節因子として候補化合物を同定する、ステップを含み得、さらに、アッセイステップは、以下:候補化合物の不存在下での第1の細胞間の電流と候補化合物の存在下での第1の細胞における電流とを比較するステップ;及び/又は候補化合物の存在下であって、1つ以上のNanchungタンパク質及び1つ以上のInactiveタンパク質を有する第1の細胞間の電流と、候補化合物の存在下であって、1つ以上のNanchungタンパク質及び/又は1つ以上のInactiveタンパク質を有しない第1の細胞の電流を比較するステップのうちの少なくとも1つを含む。
膜調製
CHO-K1細胞は、AcGFPでタグ化されたNan及びIavを単独で、又は1:1の混合物として発現するアデノウイルス(細胞あたり4000個のウイルス粒子)で形質導入された。アデノウイルスで形質導入された細胞は、T175フラスコ(Greiner)あたり10×106細胞で播種され、37℃で18時間保ち、続いて25℃で72時間インキュベートした。培地を形質導入の24時間後及び72時間後に交換した。細胞をPBSで2回リンスし、Versene溶液(Life Technologies)中で10分間、室温にてインキュベートした。脱着した細胞を300×gで10分間ペレット化し、1%(wt/vol)のプロテアーゼ阻害剤混合物(Halt; Thermo Fisher)を含む8mLの氷冷20mM Hepes(pH 7.3)に再懸濁した。氷上で10分後、細胞を超音波処理によりホモジナイズした。試料を300×gで10分間遠心分離し、上清を回収し、2時間、50,000×gで遠心分離した。膜を0.5mLの50mM HEPES、100mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2、pH7.4に再懸濁し、-80℃で保存した。タンパク質含量をブラッドフォード法を用いて決定した。
[3H]-アフィドピロペン結合アッセイ
結合緩衝液(50mM HEPES、100mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2、pH 7.4)中で平衡結合アッセイを行った。反応を96ウェルのU底ポリプロピレンプレート中で行った。Tween(登録商標)-20(アッセイ中の最終濃度0.0025%)を含有する結合緩衝液に再懸濁させた100μLの膜を、エタノールに溶解した[3H]-アフィドピロペン及び指示があればDMSOに溶解した試験化合物を含有する結合緩衝液の200μl(飽和結合実験)又は800μl(リガンド置換実験)のいずれかと組み合わせた。エタノール及びDMSOの最終濃度は、飽和結合実験及び競合実験の両方において、それぞれ0.2%及び0.25%に保たれた。典型的には、データポイントあたり60～100μgの膜を使用した。室温で3時間のインキュベーション後、アッセイ混合物は、0.1%ポリエチレンイミンで予め濡らしたMultiscreen HTS + 96 Hi Flow FCフィルター(EMD Millipore)で濾過された。フィルターを200μlの氷冷結合緩衝液で3回洗浄し、シンチレーションカクテルを添加し、Wallac 1450 Microbetaカウンターを用いて放射活性を測定した。500倍過剰の標識していないアフィドピロペンの存在下で非特異的結合を測定した。典型的には、リガンド枯渇は全リガンドの10%未満を占めた。飽和結合研究において、49pM及び97.7pMに等しい最低濃度の[3H]-アフィドピロペンで、リガンドの枯渇はそれぞれ19%及び14%であった。それは、遊離リガンドの濃度が総マイナス結合濃度と等しいと仮定することによって修正された。GraphPad Prism(GraphPadソフトウェア)を用いて非線形回帰分析を行い、Cheng-Prusoff法(Cheng及びPrusoff, 1973)によりKi値を計算した。
したがって、上記の詳細な説明は、限定するというよりはむしろ例証とみなされることが意図され、本発明の精神及び範囲を定義することを意図しているのは、全ての均等物を含む、以下の特許請求の範囲であることが理解される。
参考文献
Figure 0007098331000006
Figure 0007098331000007
Figure 0007098331000008

Claims (11)

  1. 化合物が1つ以上のNanchungタンパク質に直接結合するかどうかを決定する方法であって、
    (a)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
    (b)前記1つ以上のNanchungタンパク質と1つ以上の化合物を接触させるステップ;及び
    (c)前記1つ以上のNanchungタンパク質への前記1つ以上の化合物の結合親和性を決定するステップ
    を含む、方法。
  2. 前記1つ以上のNanchungタンパク質と複合体を形成する、1つ以上のTRPタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記1つ以上のTRPタンパク質が、1つ以上のTRPVタンパク質である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記1つ以上のTRPVタンパク質が、Inactiveタンパク質である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記1つ以上のNanchungタンパク質が、1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルを形成する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. さらに、前記1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルが、昆虫TRP及び/又はTRPVチャネルである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記1つ以上の化合物が、少なくとも1つの標識された化合物及び少なくとも1つの候補化合物を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 化合物を作用様式について分類する方法であって、
    (1)結合アッセイステップであって、1つ以上のNanchungタンパク質を1つ以上の候補化合物によって接触させ、前記1つ以上のNanchungタンパク質に対する前記1つ以上の候補化合物についての結合親和性を決定する、ステップ、
    (2)前記1つ以上の候補化合物の平衡解離定数(K d )及び/又は平衡阻害定数(K i )に基づいて前記候補化合物を含む殺虫剤化合物について作用様式の分類を同定するステップ
    を含み、前記結合アッセイステップが、以下の(a)並びに/あるいは(b):
    (a)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
    前記1つ以上のNanchungタンパク質を1つ以上の候補化合物と接触させるステップ;
    前記1つ以上のNanchungタンパク質に結合している前記1つ以上の候補化合物の量を測定するステップ;並びに
    前記1つ以上の候補化合物の平衡解離定数(Kd)を計算するステップであって、前記Kdが、以下の方法:(I)(a)最大結合(Bmax)及び(b)最大結合の50%に到達するために必要とされる化合物の濃度、(II)化合物の結合速度(Kon)及び解離速度(Koff)を測定すること、ここでKd=Koff/Konである、(III)蛍光分極アッセイ、(IV)表面プラズモン共鳴、(V)等温熱量測定、(VI)Schild分析、のうちの1つ以上を用いて決定され得る、ステップを含む;並びに/あるいは
    (b)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
    前記1つ以上のNanchungタンパク質を、前記1つ以上のNanchungタンパク質に対して高親和性を有する標識された化合物と接触させるステップ;
    前記1つ以上の標識された化合物の存在下で、前記1つ以上のNanchungタンパク質を少なくとも1つの候補化合物と接触させるステップ;
    標識された化合物の結合が0%に近づくまで、前記1つ以上のNanchungタンパク質と接触するために利用可能な前記少なくとも1つの候補化合物の量を増加させるステップ;
    以下の方法:(I)(a)前記候補化合物の不存在下で、結合した標識された化合物の量を決定し、(b)前記結合した標識された化合物の量を50%減少させるのに必要とされる前記候補化合物の濃度を決定すること、(II)蛍光分極アッセイ、及び/又は(III)Schild分析のうちの1つ以上を用いて、競合アッセイについての平衡阻害定数(Ki)及び/又は平衡解離定数(Kd)を計算するステップ;
    前記候補化合物の阻害定数を、他の候補化合物の阻害定数と比較するステップ;
    前記候補化合物の阻害定数を、標識された化合物の解離定数と比較するステップを含む、方法。
  9. 前記方法が、
    1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルを1つ以上の候補化合物と接触させる調節因子アッセイステップであって、アッセイは、前記1つ以上の候補化合物が前記1つ以上のTRP及び/又はTRPVチャネルの調節因子として作用するかどうかを決定するために使用される、ステップ
    をさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 化合物が1つ以上のNanchungタンパク質上の同じ部位に直接結合するかどうかを決定する方法であって、
    (a)1つ以上のNanchungタンパク質を提供するステップ;
    (b)前記1つ以上のNanchungタンパク質を、アフィドピロペン、ピメトロジン、ピリフルキナゾン及び/又はN-脱アセチル化ピリフルキナゾンからなる群から選択される1つ以上の化合物と接触させるステップ;
    (c)前記1つ以上のNanchungタンパク質を、1つ以上の候補化合物と接触させるステップ;及び
    (d)前記1つ以上のNanchungタンパク質に対する前記1つ以上の候補化合物の結合親和性を決定するステップ
    を含む、方法。
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