JP7097353B2

JP7097353B2 - 生体試料におけるダニ媒介微生物を検出する方法及び固体担体

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Publication number: JP7097353B2
Application number: JP2019516059A
Authority: JP
Inventors: レオナギルバート; クナルガルグ; レーナメリライネン; カノクティププッタラクサ
Original assignee: テズテッドオイ
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2022-07-07
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: RU2018145212A3; US11668714B2; ZA201900013B; RU2018145212A; RU2737896C2; US20190128887A1; AU2017275358B2; JP2019523427A; CN109564220A; EP3252470B1; EP3252470A1; US11353455B2; US20220357323A1; AU2017275358A1; CA3026156A1; WO2017207186A1; CN109564220B

Description

本発明は、ライム病及び他のダニ媒介疾患の検出に関する。本発明は、生体試料における抗体の検出にも関する。特に、本発明は、ダニ媒介疾患（ＴＢＤ）微生物の多重及び多機能検出プラットホームを提供する。

ダニ媒介微生物（ＴＢＭ）は、ダニ咬傷によって宿主に広がる肉眼で見える病原体として定義される。マダニは、感染症伝播の例外的な媒介物であり、ほぼすべての大陸に生息し、全世界の種の数は８５０を超える。欧州と北米の両方で最も一般的なダニ媒介疾患（ＴＢＤ）は、スピロヘータボレリア種に起因するライム病である（非特許文献１、２）。世界的に、ライム病は、２７のＥＵの国々及び中央アジアを含めて、８０か国で風土病である（非特許文献３、４）。ボレリアに加えて、バベシア、リケッチア、エーリキア、バルトネラ、ダニ媒介脳炎ウイルスなどの同時感染する多数の他の細菌及び更にはウイルスが存在する（非特許文献５、６）。米国及び欧州のＣｅｎｔｅｒｏｆＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌは、それぞれ年間３００，０００及び８５，０００件のＴＢＤ症例を報告した。しかし、年間のＴＢＤ症例の総数は、世界保健機構によって強調されているように極めて過小評価されている（非特許文献７）。

発症患者の臨床診断は困難であり得る。というのは、ＴＢＭ感染症は、初期に非特異的熱性疾患として現れ、特定の器官系の関与の有無にかかわらず、インフルエンザ様症状によく似ているからである（非特許文献２、５、８）。治療計画を更に複雑にすることに、マイコプラズマ、クラミジア、エプスタインバーウイルス又は別のウイルスによる二次感染がこれらの患者では一般的である（非特許文献６）。過小評価、誤診、同時感染及び二次感染の結果として、不適当な治療は、疲労、筋肉／関節痛、心血管／認知障害などの重篤な臨床症状を発生させ得る（非特許文献９）。患者は、不適当な診断の結果として重篤な臨床症状を発し、治療は、当該患者らの生活の質の低下を招き、その結果、医療の負担が増える（非特許文献９、１０）。臨床症状は多様で非特異的であるので、信頼できる診断法は、患者の適時かつ正確な治療に最も重要である（非特許文献４、６、１１、１２）。

ダニ媒介感染症診断における難題は、患者の生検材料中に存在する生存可能な病原体の数が少ないために、培養及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの直接検出法を行うことが困難であることである。このため、否定的な結果となり、活動性感染症又は患者が罹患し得る種々の段階の疾患が排除されない（非特許文献２、５、１３）。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの間接的方法は、感染症又は疾患の初期段階では影響力の弱い、又は影響力のない可能性がある、限定的な抗体試験である。異なる細菌種間の交差反応性問題のため、著しい数の偽陽性結果も、これらの抗体に基づく検査では起こる。しかし、陽性特異的抗体応答は、感染症の治療が成功した後に数か月又は数年持続することがある。これらの現法は、第一期のダニ媒介疾患の最高８０％を検出することができず、急性感染症と慢性感染症を識別しない（非特許文献４、１１）。難題に更に加えて、複数のＴＢＭではなく１つのＴＢＭを通常扱う、主にヒト以外の動物に対するＥＬＩＳＡに基づく診断法がある（非特許文献３）。

進行中の診断ツールは、現在の研究の知見を備えていない。近年、ＴＢＤ患者におけるボレリア球状体（非特許文献１４）、ボレリア種分化の重要性（非特許文献１５、１６）、複数菌感染症（非特許文献１２）、及びＩｇＭ免疫機能不全（非特許文献１７）に関する科学的進展は、ＴＢＤについての本発明者らの臨床的理解を喚起した。ボレリア球状体は、ボレリアスピロヘータの多形構造の一つである（非特許文献１４）。長年、ボレリアの多形体は、細胞壁欠損（ＣＷＤ）、Ｌ体、スフェロプラスト、プロトプラスト、栄養繁殖体（ｐｒｏｐａｇｕｌｅｓ）又はシストと呼ばれている（非特許文献５、８、１８～２０）。つい最近、Ｍｅｒｉｌａｅｉｎｅｎらからの電子顕微鏡写真（２０１５）によって、それが球状体（ＲＢ）であると結論づけることによって、ボレリアの多形形態に関する矛盾が解決された。Ｍｅｒｉｌａｅｉｎｅｎら（２０１５）は、ボレリアＲＢをヒト血清中で誘発し、代謝的に不活性であり、独特の生化学的サインを有する、柔軟であるが完全な細胞壁を有する、球状ＲＢを証明した。ボレリアの多形形態に関する臨床所見は繰り返し報告されたが、ＴＢＤにおけるその病原的役割が議論され、論評されてきた。進行中の診断ツールは、ＴＢＤ患者をボレリア球状体については試験しない（非特許文献８、２１～２５）。

現在の診断ツールは、それらが異なる臨床所見を個々に示すので、種々のボレリアスピロヘータを個々に又はまとめて試験することができる（非特許文献１６）。最近、多重ＴＢＤ診断ツールは、種々の組換えボレリアタンパク質を試験することができるが、ＴＢＤは、複数菌感染症として認識され、進行中の診断ツールは、個体を続発性日和見感染症、同時感染、及び感染症に付随する自己免疫状態について診断する用意がされていない（非特許文献５、１３、２２～２５）。

進行中のＴＢＤ検出ツールの落とし穴に対処するために、本発明は、ボレリア属、例えば、ボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリアアフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａａｆｚｅｌｉｉ）及びボレリアガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒｉｎｉｉ）の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原を含む新規固体担体を提供する。本結果は、個体の免疫系がボレリア球状体のみに特異的に応答し、この免疫応答がライム病の持続期に関連し得ることを初めて示すものである。

ＳｔｅｅｒｅＡＣ，ＣｏｂｕｒｎＪ，ＧｌｉｃｋｓｔｅｉｎＬ．ＴｈｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２００４Ａｐｒ４；１１３（８）：１０９３－１０１ＳｔｅｅｒｅＡＣ．Ｌｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２００１Ｊｕｌ４；３４５（２）：１１５－２５ＣｈｏｍｅｌＢ．Ｌｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．Ｒｅｖ－ＯｆｆＩｎｔＥｐｉｚｏｏｔ．２０１５Ａｕｇ６；３４（２）：５６９－７６ＭｅａｄＰＳ．ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓＣｌｉｎＮｏｒｔｈＡｍ．２０１５Ｊｕｎ１；２９（２）：１８７－２１０ＳｔｒｉｃｋｅｒＲＢ，ＪｏｈｎｓｏｎＬ．Ｌｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅｎｅｘｔｄｅｃａｄｅ．ＩｎｆｅｃｔＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔ．２０１１Ｊａｎ６；４：１－９ＢｅｒｇｈｏｆｆＷ．ＣｈｒｏｎｉｃＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅａｎｄＣｏ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓ．ＯｐｅｎＮｅｕｒｏｌＪ．２０１２Ｊａｎ；６：１５８－７８ＬｉｎｄｇｒｅｎＥ，ＪａｅｎｓｏｎＴＧＴ．ＬｙｍｅｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓｉｎＥｕｒｏｐｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｃｌｉｍａｔｅａｎｄｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙａｎｄａｄａｐｔａｔｉｏｎｍｅａｓｕｒｅｓ．ＷＨＯＲｅｇｉｏｎａｌＯｆｆｉｃｅｆｏｒＥｕｒｏｐｅ．ＷＨＯＲｅｇｉｏｎａｌＯｆｆｉｃｅｆｏｒＥｕｒｏｐｅ；２００６；ＥＵＲ／０４（／５０４６２５０）：３４ＤｏｎｔａＳ．ＩｓｓｕｅｓｉｎｔｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅ．ＯｐｅｎＮｅｕｒｏｌｏｇｙＪ．ｂｅｎｔｈａｍ；２０１２；６（１）：１４０－５ＪｏｈｎｓｏｎＬ，ＷｉｌｃｏｘＳ，ＭａｎｋｏｆｆＪ，ＳｔｒｉｃｋｅｒＲＢ．ＳｅｖｅｒｉｔｙｏｆｃｈｒｏｎｉｃＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｏｔｈｅｒｃｈｒｏｎｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ａｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｆｅｓｕｒｖｅｙ．ＰｅｅｒＪ．２０１４Ｊａｎ３；２：ｅ３２２ＡｄｒｉｏｎＥＲ，ＡｕｃｏｔｔＪ，ＬｅｍｋｅＫＷ，ＷｅｉｎｅｒＪＰ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅｃｏｓｔｓ，ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｃａｒｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳＯＮＥ．２０１５Ｊａｎ４；１０（２）：ｅ０１１６７６７ＷｉｌｓｋｅＢ．ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＬｙｍｅｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ．ＡｎｎＭｅｄ．２００５Ｊａｎ６；３７（８）：５６８－７９ＢｒｏｇｄｅｎＫＡ，ＧｕｔｈｍｉｌｌｅｒＪＭ，ＴａｙｌｏｒＣＥ．Ｈｕｍａｎｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｌａｎｃｅｔ．２００５Ｊａｎ６；３６５（９４５５）：２５３－５Ａｇｕｅｒｏ－ＲｏｓｅｎｆｅｌｄＭ，ＷａｎｇＧ，ＳｃｈｗａｒｔｚＩ，ＷｏｒｍｓｅｒＧ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＬｙｍｅＢｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ．ｈｉｇｈｗｉｒｅ；２００５；１８（３）：４８４－５０９ＭｅｒｉｌａｅｉｎｅｎＬ，ＨｅｒｒａｎｅｎＡ，ＳｃｈｗａｒｚｂａｃｈＡ，ＧｉｌｂｅｒｔＬ．ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃｆｏｒｍｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｅｎｇｌ）．２０１５Ｍａｒ；１６１（Ｐｔ３）：５１６－２７ＳｅｉｎｏｓｔＧ，ＧｏｌｄｅＷＴ，ＢｅｒｇｅｒＢＷ，ＤｕｎｎＪＪ，ＱｉｕＤ，ＤｕｎｋｉｎＤＳ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｓｅｎｓｕｓｔｒｉｃｔｏｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＡｒｃｈＤｅｒｍａｔｏｌ．１９９９Ｎｏｖ１；１３５（１１）：１３２９－３３ＤｈｏｔｅＲ，Ｂａｓｓｅ－ＧｕｅｒｉｎｅａｕＡＬ，ＢａｃｈｍｅｙｅｒＣ，ＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｏｖＢ，ＡｓｓｏｕｓＭＶ．［Ｌｙｍｅｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｓｐｅｃｔｓ］．ＰｒｅｓｓｅＭｅｄ．１９９８Ｄｅｃ６；２７（３９）：２０４３－７Ｋａｌｉｓｈ，ＭｃＨｕｇｈ，Ｇｒａｎｑｕｉｓｔ，Ｓｈｅａ，Ｒｕｔｈａｚｅｒ，Ｓｔｅｅｒｅ．ＰｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＭｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ１０－２０ｙｅａｒｓａｆｔｅｒａｃｔｉｖｅＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ．ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓＯｆｆｉｃｉａｌＰｕｂｌＩｎｆｅｃｔＤｉｓＳｏｃＡｍ．ｈｉｇｈｗｉｒｅ；２００１；３３（６）：７８０－５ＭｕｒｓｉｃＶＰ，ＷａｎｎｅｒＧ，ＲｅｉｎｈａｒｄｔＳ，ＷｉｌｓｋｅＢ，ＢｕｓｃｈＵ，ＭａｒｇｅｔＷ．ＦｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ－Ｌ－ｆｏｒｍｖａｒｉａｎｔｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．１９９６Ｊａｎ１；２４（３）：２１８－２６Ｄｏｍｉｎｇｕｅ，Ｗｏｏｄｙ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅ．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ．１９９７；１０（２）：３２０－４４ＭｕｒｇｉａＲ，ＰｉａｚｚｅｔｔａＣ，ＣｉｎｃｏＭ．ＣｙｓｔｉｃｆｏｒｍｓｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｓｅｎｓｕｌａｔｏ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆＲｐｏＳ．ＷｉｅｎＫｌｉｎＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．２００２Ｊｕｌ３；１１４（１３－１４）：５７４－９ＳｃｈｅｎｋＪ，ＤｏｅｂｉｓＣ，ＫｕｅｓｔｅｒｓＵ，ｖｏｎＢａｅｈｒＶ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａＮｅｗＭｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃＭｉｃｒｏｓｐｏｔＡｒｒａｙｆｏｒＳｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＬｙｍｅＢｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ．ＣｌｉｎＬａｂ．２０１５Ｊａｎ４；６１（１１）：１７１５－２５ＬａｈｅｙＬＪ，ＰａｎａｓＭＷ，ＭａｏＲ，ＤｅｌａｎｏｙＭ，ＦｌａｎａｇａｎＪＪ，ＢｉｎｄｅｒＳＲ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＭｕｌｔｉａｎｔｉｇｅｎＰａｎｅｌｆｏｒＩｍｐｒｏｖｅｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＩｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＥａｒｌｙＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５Ｄｅｃ２；５３（１２）：３８３４－４１ＥｍｂｅｒｓＭＥ，ＨａｓｅｎｋａｍｐｆＮＲ，ＢａｒｎｅｓＭＢ，ＤｉｄｉｅｒＥＳ，ＰｈｉｌｉｐｐＭＴ，ＴａｒｄｏＡＣ．ＡＦｉｖｅ－ＡｎｔｉｇｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＢｅａｄ－ｂａｓｅｄＡｓｓａｙｆｏｒＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅ．ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ．２０１６Ｆｅｂ３ＰｏｒｗａｎｃｈｅｒＲＢ，ＨａｇｅｒｔｙＣＧ，ＦａｎＪ，ＬａｎｄｓｂｅｒｇＬ，ＪｏｈｎｓｏｎＢＪ，ＫｏｐｎｉｔｓｋｙＭ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒＬｙｍｅｄｉｓｅａｓｅｕｓｉｎｇＶｌｓＥ１－ＩｇＧａｎｄｐｅｐＣ１０－ＩｇＭａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｅｓｔｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ．２０１１Ｍａｙ；１８（５）：８５１－９ＤｅｓｓａｕＲＢ，ＭｏｌｌｅｒＪＫ，ＫｏｌｍｏｓＢ，ＨｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎＡＪ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｓｓａｙ（ＭｉｋｒｏｇｅｎｒｅｃｏｍＢｅａｄ）ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍＩｇＧａｎｄＩｇＭａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ１３ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｓｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｓｅｎｓｕｌａｔｏｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎｅｕｒｏｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ：ｔｈｅｍｏｒｅｔｈｅｂｅｔｔｅｒ？ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５Ｍａｒ；６４（Ｐｔ３）：２２４－３１

本明細書の一目的は、患者が経験している急性、既往、特に慢性又は持続期のＴＢＤを概説する新規な検出プラットホームを提供することである。さらに、本明細書は、ＴＢＤに付随する複数菌及び免疫機能不全態様を扱うこともできる。

すなわち、一態様においては、本明細書は、生体試料における抗体の存在を検出するための固体担体であって、前記固体担体が、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含み、ここで前記微生物抗原が、ボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原を含む、前記固体担体を提供する。

別の態様においては、本明細書は、生体試料におけるダニ媒介微生物を検出する方法であって、当該方法が以下のステップ：
（ａ）固体担体に固定された微生物抗原と前記微生物抗原に結合した生体試料から生じる抗体とを含む複合体を形成するために、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含む前記固体担体と前記生体試料を接触させるステップであって、ここで前記微生物抗原が、ボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原を含むステップ、及び
（ｃ）ステップ（ａ）で得られた複合体の存在を検出するステップであって、ボレリア属の少なくとも１種の多形性球状体から調製される抗原を含む複合体の存在が、前記生体試料におけるダニ媒介微生物の存在の徴候であるステップ
を含む、前記方法を提供する。

別の態様においては、本明細書は、ライム病の診断に使用するための上で定義した固体担体を提供する。

別の態様においては、本明細書は、生体試料におけるダニ媒介微生物検出用診断アッセイの製造のための上で定義した固体担体の使用を提供する。

（Ａ）すべてのボレリア抗原、（Ｂ）ボレリアスピロヘータのみ、及び（Ｃ）ボレリア球状体のみに対する全ＩｇＭ免疫応答を示す図である。１Ａ及び１Ｂにおいて、略語Ｂｂ、Ｂａ及びＢｇは、それぞれ厳密な意味におけるボレリアブルグドルフェリＢ３１、ボレリアアフゼリＰ１２及びボレリアガリニＦｕｊｉＰ１である。（Ａ）すべてのボレリア抗原、（Ｂ）ボレリアスピロヘータのみ、及び（Ｃ）ボレリア球状体のみに対する全ＩｇＧ免疫応答を示す図である。２Ａ及び２Ｂにおいて、略語Ｂｂ、Ｂａ及びＢｇは、それぞれ厳密な意味におけるボレリアブルグドルフェリＢ３１、ボレリアアフゼリＰ１２及びボレリアガリニＦｕｊｉＰ１である。１種又は複数の微生物抗原に対する（Ａ）ＩｇＭ及び（Ｂ）ＩｇＧ免疫応答の評価を示す図である。ある量の４４３種のヒト血清を使用して、個体が１種の微生物抗原のみ又は複数の微生物抗原に応答するかどうか評価した。さらに、２０種の抗原に対して免疫応答を示さない個体を評価した。個々の微生物抗原に対するＩｇＧ免疫応答を示す図である。ある量の４４３種のヒト血清を使用して、この研究に利用される各微生物抗原に対する免疫応答の総数を評価した。さらに、２０種の抗原に対して免疫応答を示さない個体を評価した。個々の微生物抗原に対するＩｇＭ免疫応答を示す図である。ある量の４４３種のヒト血清を使用して、この研究に利用される各微生物抗原に対する免疫応答の総数を評価した。さらに、２０種の抗原に対して免疫応答を示さない個体を評価した。（Ａ）ボレリアを伴う、及び伴わない、別の微生物に対する個体による全ＩｇＭ免疫応答割合、（Ｂ）ボレリアを伴う、及び伴わない、複数の別の微生物の数に対する個体によるＩｇＭ免疫応答、並びに（Ｃ）ボレリアを伴う、及び伴わない、特定の別の微生物に対する個体によるＩｇＭ免疫応答を示す図である。ある量の４４３種のヒト血清を使用して、ボレリアスピロヘータのみ、ボレリア球状体のみ、又はボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した個体間の複数の別の微生物及びそれらの特定のタイプに対するＩｇＭ免疫応答の頻度を比較した。「別の微生物」という用語は、バルトネラヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｈｅｎｓｅｌａｅ）（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓ）（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ）（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、エーリキアシャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）（Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａａｋａｒｉ）（Ｒ．ａｋａｒｉ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋｂｏｒｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｔｉｓｖｉｒｕｓ）（ＴＢＥＶ）、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、マイコプラズマファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ肺炎（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｈｉｅｖｉｒｕｓ）Ａ１６（ＣＶＡ１６）及びヒトパルボウイルスＢ１９（ＨＢ１９Ｖ）などの同時感染、二次及び自己免疫抗原を含む。（Ａ）ボレリアを伴う、及び伴わない、別の微生物に対する個体による全ＩｇＧ免疫応答割合、（Ｂ）ボレリアを伴う、及び伴わない、複数の別の微生物の数に対する個体によるＩｇＧ免疫応答、並びに（Ｃ）ボレリアを伴う、及び伴わない、特定の別の微生物に対する個体によるＩｇＧ免疫応答を示す図である。ある量の４４３種のヒト血清を使用して、ボレリアスピロヘータのみ、ボレリア球状体のみ、又はボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した個体間の複数の別の微生物及びそれらの特定のタイプに対するＩｇＧ免疫応答の頻度を比較した。「別の微生物」という用語は、バルトネラヘンセレ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ウシ流産菌（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、ネズミバベシア（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、エーリキアシャフェンシス（Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、痘瘡リケッチア（Ｒ．ａｋａｒｉ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、クラミジアトラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、マイコプラズマファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ肺炎（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）及びヒトパルボウイルスＢ１９（ＨＢ１９Ｖ）などの同時感染、二次及び自己免疫抗原を含む。

これまで、既存のＴＢＤ診断ツールは、１つの疾患に対する１つの免疫応答（ＩｇＧ又はＩｇＭ）の選別に依拠し、その知見について二次的確認試験を必要とすることが多い。本明細書は、ボレリア属の種の多形性球状体に対する免疫応答を検出することによって、ライム病の慢性、潜伏又は持続期を検出する手段及び方法を提供する。

少なくとも１８種のボレリア属は、ライム病又はボレリア症を引き起こすことが知られており、マダニによって伝染される^４８。主要なライム病病原体は、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニである。他は、例えば、ボレリアミヤモトイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｍｉｙａｍｏｔｏｉ）、ボレリアタヌキ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｔａｎｕｋｉｉ）、ボレリアツルディ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｔｕｒｄｉ）、ボレリアバレイシアナ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｖａｌａｉｓｉａｎａ）、ボレリアカロライネンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ボレリアアメリカーナ（Ｂｏｒｒｅｌｉａａｍｅｒｉｃａｎａ）、ボレリアルシタニエ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、ボレリアジャポニカ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）及びボレリアシニカ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｓｉｎｉｃａ）である。

多重及び多機能プラットホームとして、本態様は、複数の微生物及び抗体クラスに対して同時に個体を診断するのに使用することができる。ＴＢＤ個体における一次、持続性、二次、同時感染及び自己免疫状態を診断するのに役立つ微生物抗原を、下表１に列挙する。

本発明は、生体試料における抗体の存在を検出するための固体担体であって、前記固体担体が、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含み、ここで前記微生物抗原が、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ、ボレリアガリニなどのボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原を含む、前記固体担体を対象とする。

「多形性」という用語は、本明細書では、微生物学において、環境条件に応じてその形状又はサイズを変える一部の細菌の能力として定義される多形性を指す。本明細書で定義される多形性球状体は、Ｍｅｒｉｌａｅｉｎｅｎら（２０１５）に開示されているように、又は下記実験の項に開示するように誘導することができる。理論に拘泥するものではないが、その形状を多形性球状体（すなわち、平均直径２．８±０．４６μｍの球状細胞）に変える樽状スピロヘータ（すなわち、平均長さ２０μｍの長い螺旋状細胞）の背後にある基礎は、細菌がその環境から生理学的圧力下にあるということである。したがって、細菌の培地条件の変化に加えて、浸透圧などの応力条件もまた、球状体の誘導に役立つ^４７。

以前、Ｂ．ブルグドルフェリの球状体（ＲＢ）は、様々な様式で曖昧に呼ばれていた。これらの用語としては、ＣＷＤ及びＬ体、スフェロプラスト、プロトプラスト、栄養繁殖体及び更にはシストが挙げられる。それにもかかわらず、これらの表示のすべてが同じ球状構造を記述している^１４。

一実施形態においては、ボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原は、ボレリア属の種の多形性球状体に特異的である。

一実施形態においては、固体担体上の固定化抗原は、ボレリア属、例えば、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ又はボレリアガリニの培養多形性球状体の溶解物又は溶解物の一部である。前記固定化抗原は、前記多形性球状体のタンパク質又はペプチド調製物とすることもできる。例えばｐＨシフト、ヒト血清、塩濃度変化の使用によって、調製された微生物細胞からの抗原を含む別の公知の調製物を、本発明に使用することもできる。

急性及び慢性又は持続期のライム病を同時に検出するために、前記固体担体は、ボレリア属、例えば、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニからなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原を、天然スピロヘータ型又はその溶解物において更に含むことができる。

一実施形態においては、天然スピロヘータ型のボレリア属の種からなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原は、天然スピロヘータ型のボレリア属の種に特異的である。

一実施形態においては、アッセイは、１つのあるボレリア種の検出を対象とし、例えば、ここで１）前記固体担体は、ボレリアブルグドルフェリの多形性球状体から調製される固定化抗原及び天然スピロヘータ型のボレリアブルグドルフェリから調製される固定化抗原を含み、２）前記固体担体は、ボレリアアフゼリの多形性球状体から調製される固定化抗原及び天然スピロヘータ型のボレリアアフゼリから調製される固定化抗原を含み、又は３）前記固体担体は、ボレリアガリニの多形性球状体から調製される固定化抗原及び天然スピロヘータ型のボレリアガリニから調製される固定化抗原を含む。

一実施形態においては、ボレリアブルグドルフェリの多形性球状体から調製される固定化抗原は、ボレリアブルグドルフェリの多形性球状体に特異的であり、天然スピロヘータ型のボレリアブルグドルフェリから調製される固定化抗原は、天然スピロヘータ型のボレリアブルグドルフェリに特異的である。

一実施形態においては、ボレリアアフゼリの多形性球状体から調製される固定化抗原は、ボレリアアフゼリの多形性球状体に特異的であり、天然スピロヘータ型のボレリアアフゼリから調製される固定化抗原は、天然スピロヘータ型のボレリアアフゼリに特異的である。

一実施形態においては、ボレリアガリニの多形性球状体から調製される固定化抗原は、ボレリアガリニの多形性球状体に特異的であり、天然スピロヘータ型のボレリアガリニから調製される固定化抗原は、天然スピロヘータ型のボレリアガリニに特異的である。

一実施形態においては、固体担体は、多重アッセイ用に製造され、ここで前記固体担体は、ボレリア属の種、好ましくはボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及び／又はボレリアガリニの多形性球状体から調製される固定化抗原を含む。更なる一実施形態においては、多重アッセイは、天然スピロヘータ型のボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及び／又はボレリアガリニなどのボレリア属の種から調製される固定化抗原も含む。

一実施形態においては、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニの多形性球状体から調製される固定化抗原は、それぞれボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニの多形性球状体に特異的である。

多重アッセイは、マイコプラズマファーメンタンス、マイコプラズマ肺炎、バルトネラヘンセレ、ウシ流産菌、ネズミバベシア、クラミジアトラコマチス、クラミジア肺炎、エーリキアシャフェンシス、コクサッキーウイルスＡ１６、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）及び痘瘡リケッチアからなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原を含むこともできる。

一実施形態においては、マイコプラズマファーメンタンス、マイコプラズマ肺炎、バルトネラヘンセレ、ウシ流産菌、ネズミバベシア、クラミジアトラコマチス、クラミジア肺炎、エーリキアシャフェンシス、コクサッキーウイルスＡ１６、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体、ダニ媒介脳炎ウイルス及び痘瘡リケッチアからなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原は、それぞれマイコプラズマファーメンタンス、マイコプラズマ肺炎、バルトネラヘンセレ、ウシ流産菌、ネズミバベシア、クラミジアトラコマチス、クラミジア肺炎、エーリキアシャフェンシス、コクサッキーウイルスＡ１６、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体、ダニ媒介脳炎ウイルス及び痘瘡リケッチアに特異的である。

前記固体担体は、ガラス又はポリスチレン若しくはポリプロピレンなどのプラスチックでできていてもよい。本明細書の固体担体の例は、抗原マイクロアレイ又はマイクロウェルプレートである。抗原マイクロアレイは、タンパク質チップとしても知られるタンパク質マイクロアレイの形である。マイクロアレイは、その上に数千の種々のタンパク質（この場合、抗原）が分散した空間的位置に固定化されて、高密度タンパク質ドットマトリックスを形成する、固体担体（一般に、ガラス）である。マイクロウェルプレートは、複数の「ウェル」を有する平板であり、ここで各ウェルは、特定の一試料に使用される。マイクロウェルプレートは、臨床診断試験室における標準ツールである。極めて一般的な使用は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）におけるものである。

一実施形態においては、本明細書は、慢性／持続性ライム病などのライム病の診断に使用するための本明細書に定義した固体担体を対象とする。

別の一実施形態においては、本明細書は、生体試料におけるダニ媒介微生物検出用診断アッセイの製造のための本明細書に定義した固体担体の使用を対象とする。一実施形態においては、前記診断アッセイは、患者におけるライム病、例えば患者における慢性／持続性ライム病の検出用である。

「患者」、「個体」又は「ドナー」は、ヒト対象などの哺乳動物対象とすることができる。

本明細書は、生体試料におけるダニ媒介微生物を検出する方法であって、当該方法が以下のステップ：
（ａ）固体担体に固定された微生物抗原と前記微生物抗原に結合した生体試料から生じる抗体とを含む複合体を形成するために、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含む前記固体担体と前記生体試料を接触させるステップであって、ここで前記微生物抗原が、ボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原を含むステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた複合体の存在を検出するステップであって、ここでボレリア属の多形性球状体から調製される抗原を含む複合体の存在が、前記生体試料におけるダニ媒介微生物の存在の徴候であるステップ
を含む、前記方法も対象とする。

一実施形態においては、前記微生物抗原、前記微生物抗原と結合した前記抗体、及び抗抗体試薬の複合体を形成するために、前記固体担体を前記抗抗体試薬と接触させることによって、ステップ（ａ）で得られた複合体の存在を検出する。

本明細書は、単一のキットにおける複数の微生物に対する個体のＩｇＧ及びＩｇＭ又はＩｇＡ応答を特異的に、かつ感度良く選別する機会も提供する。したがって、前記抗抗体試薬を、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＡ抗体とすることができる。例えば、前記抗抗体試薬を、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体とすることができる。

一実施形態においては、前記生体試料は、血液、血清、尿、唾液若しくは涙試料、脳脊髄液試料、又は滑液試料、例えば血清試料である。

一実施形態においては、本方法は、多形性球状体を生成する条件でボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ又はボレリアガリニなどのボレリア属の種を培養し、培養した細胞の溶解を行い、固体担体に溶解物又は溶解物の一部を塗布又は印刷する先行ステップを含む。多形性球状体を生成する前記条件は、Ｍｅｒｉｌａｅｉｎｅｎら（２０１５）に開示され、又は下記実験の項に開示されており、例えばボレリアスピロヘータ細胞を蒸留水中で、若しくは変化する塩濃度において、若しくはヒト血清の存在下でインキュベートし、又は培養を酸性ｐＨにシフトさせる。培養ステップの後、抗原を微生物細胞から産生する別の公知技術も、細胞溶解以外にこの態様に使用することができる。例えば、抗原ペプチド及びタンパク質を、塗布又は印刷ステップ用に前記多形性球状体から調製することができる。

本発明を全般的に記述したが、同じことは、以下の実験の項を参照することによってより容易に理解されるであろう。当該実験の項は、例として提供するものであり、限定することを意図したものではない。本明細書に記載のものと類似又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料については後述する。

実験の項
材料及び方法
血清試料収集の倫理的承認
合計５３２個のヒト血清試料を、ＢｏｒｒｅｌｉｏｓｅＣｅｎｔｒｕｍＡｕｇｓｂｕｒｇ（ＢＣＡ）、ドイツ；ＫｉｎｇＣｈｒｉｓｔｉａｎ１０^ｔｈＨｏｓｐｉｔａｌｆｏｒＲｈｅｕｍａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ、デンマーク；並びにＦｅｄｅｒａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＤｒｕｇｓａｎｄＭｅｄｉｃａｌＤｅｖｉｃｅｓ、ドイツによって認可された欧州の複数の診療所／専門研究室（倫理的承認番号：９５．１０－５６６１－７０６６）；デンマークデータ保護局及びサザンデンマークの領域倫理委員会（倫理的承認番号：Ｓ－２０１１００２９）；並びにＷｅｓｔｅｒｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗｂｏａｒｄ（倫理的承認番号：ＵＳＭＡ２０１４４１）からそれぞれ収集した。５３２個のヒト血清試料のうち、５１個の負の対照をＩｇＧに割り当て、別の５１個の負の対照をＩｇＭに割り当てた。負の対照を利用して、両方の抗体クラスに対して定性的なカットオフ値を確立した。

ＥＬＩＳＡ用抗原の調製
全５３２個のヒト血清試料を、２０種の微生物抗原に対してＩｇＭ及びＩｇＧ抗体応答について試験した。表１には、全２０種の抗原が入っている。ボレリアスピロヘータ、ボレリア球状体及びヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体を、所内で培養し、単離した。ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体を、他で報告された手順に従って培養し、単離した^{２６，２７}。Ｄｒ．ＭａｒｃｏＱｕｅｖｅｎｄｏＤｉａｚ（ＳｌｏｖａｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ）は、痘瘡リケッチア精製及び不活性化溶解物を提供した。残りの１８種の微生物を、凍結乾燥微生物ペプチドとしてＧｅｎｅＣｕｓｔから取り寄せた。１ｍｇ／ｍｌの原液を、痘瘡リケッチア用に調製し、すべての微生物ペプチドを、ＥＬＩＳＡに直接利用するように調製した。

スピロヘータ及び多形型におけるボレリア種の培養及び単離
ボレリア培養物を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。Ｂａｒｂｏｕｒ－Ｓｔｏｅｎｎｅｒ－Ｋｅｌｌｙ（ＢＳＫ）培地を利用して、全３種のボレリア培養物を増殖させた。ＢＳＫ培地を、既報の指示に従って調製した^３９。天然スピロヘータ型のボレリア種を培養し、単離するために、各ボレリア株を、ＢＳＫ培地中で３７℃で５～７日間独立に増殖させた。インキュベーションの後、培養管を５０００ｇで１０分間遠心することによってボレリア細胞を単離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを更に使用するまで－８０℃で貯蔵した^１４。

種々のボレリア球状体株を培養するために、それぞれのボレリアスピロヘータ細胞ペレットを、蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）２ｍｌに再懸濁させた。ボレリアスピロヘータ細胞を、水中で、又は変化する塩濃度において、又は酸性ｐＨにシフトさせて、又はヒト血清の存在下で、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ボレリア細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ボレリア球状体ペレットを更に使用するまで－８０℃で貯蔵した^１４。

・ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体の培養及び単離：
Ｋｉｖｏｖｉｃｈら（２０１０）及びＴｈａｍｍａｓｒｉら（２０１３）は、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９Ｖ）誘導アポトーシス小体の製造、及び本明細書でＢ１９Ｖアポトーシス小体と呼ぶこれらのアポトーシス小体の単離を報告した。手短に述べると、Ｂ１９Ｖ非構造タンパク質（ＮＳ１）を、改変ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター中で高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と一緒にクローン化した。改変ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターを利用して、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ウイルスベクター中で組換えバキュロウイルスを生成した。得られた構造体を、ＡｃＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＮＳ１と称した。Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現系を使用することによって、組換えバキュロウイルスストックを調製した。昆虫細胞ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９細胞ＡＴＣＣＣＲＬ－１７１１、マナサス、ＶＡ）の単層培養物を、ウイルスストック増幅に利用した。ウイルスストックは、組換えバクミドＤＮＡを含んでいた。感染の後（ＰＩ）、３世代のウイルスストックを、各々４８又は７２時間ＰＩで収集した。細胞を遠心分離し、濾過した後、ＨｅｐＧ２細胞の終夜の増殖、及び組換えＡｃＥＧＦＰ又はＡｃＥＧＦＰ－ＮＳ１の形質導入によって、それらの形質導入効率を求めた。ＢＤＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を利用して、ウイルスがアポトーシス小体（ＡｐｏＢｏｄｓ）誘導に更に使用するのに７０％の形質導入効率を有するかどうか検証した。さらに、ＨｅｐＧ２細胞に、第三世代ＡｃＥＧＦＰ－ＮＳ１ウイルスを、形質導入効率７０％で形質導入した。最後に、形質導入の７２時間後、培養における上清を遠心分離し、ペレット化し、更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。

ＥＬＩＳＡに利用するための単離微生物ペレットの処理
ボレリアスピロヘータ、ボレリア球状体及びＢ１９Ｖアポトーシス小体ペレットを、氷上で解凍し、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μｌに再懸濁させた。溶解物を解離し、内容物をＰＢＳに均一に溶解させるために、縦に並んだ全溶液を、１５分間超音波処理し（ＢｒａｎｓｏｎｉＣ２２０）、９９．９℃で１５分間加熱し、再度１５分間超音波処理した。最後に、すべての抗原の１ｍｇ／ｍｌ原液濃縮物を、＋４℃で貯蔵した。

ＥＬＩＳＡ手順
抗原原液（１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤（０．１ＭＮａ_２ＣＯ_３＋０．１ＭＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．５）で１：１００希釈した。希釈体積を、微生物用原液間で２つのペプチド配列で等分した。２つの正の対照、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）及びヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）を、この研究に利用した。さらに、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）及びヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ８２６０）を、互いについて負の対照として互換的に利用した。対照原液（１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤で１：１００希釈した。正及び負の対照を利用して、４５０ｎｍで一貫した光学濃度（ＯＤ）値を維持した。

１００μｌの抗原及び対照を、二つ組で平底９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に塗布し、＋４℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）３００μｌで３回洗浄し、次いで２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７０３０）のＰＢＳ溶液１００μｌを塗布した。＋４℃で終夜インキュベーションした後、２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を廃棄した。さらに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：２００希釈された患者血清１００μｌを添加した。次いで、プレートを２時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ３００μｌで５回洗浄した。マウス抗ヒトＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）又はウサギ抗ヒトＩｇＭ（ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＯｎｌｉｎｅ）と複合化された１００μｌの量の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、プレートにそれぞれ１：１００００又は１：１０００希釈係数で導入した。１．５時間室温でインキュベーションした後、プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ３００μｌで５回洗浄し、次いで３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、１－ＳｔｅｐｕｌｔｒａＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ＃３４０２８）１００μｌを補充した。マウス抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭと複合化されたＨＲＰを前もって補充したプレートを、室温でそれぞれ５分間又は１時間インキュベートした。２ＭＨ_２ＳＯ_４１００μｌを添加することにより、二次抗体とＴＭＢ基質との反応を停止した。さらに、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｘ^４マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０ｍａｎｇｅｒ）を利用して、ＯＤ値を４５０ｎｍで０．１秒測定した。

データ処理
品質保証目的で、各二つ組が互いの３０％範囲内に存在するかを判定した。二つ組がそれらの平均の３０％以内に存在するかを判定する代わりに^４０、二つ組が互いの３０％範囲内に存在するかを判定した。互いの３０％範囲内の二つ組はそれらの平均と無関係であるので、読みの違いは、それらの平均の３０％以内の二つ組と比べて高度に限定的である。１セットの５１個の負の対照をＩｇＧに利用し、別の１セットの５１個の負の対照をＩｇＭに利用して、定性的なカットオフ値を２０種の抗原に対して確立した。抗原に対して、全平均ＯＤ値の平均を全平均ＯＤ値の標準偏差の３倍に加算することによって、カットオフ値を確立した^４１。２０種の抗原に対するカットオフ値を確立し、すべての平均ＯＤ値をそのそれぞれの抗原カットオフ値で除して、データセットを規準化した。すべてのＯＤ値を規準化することによって、光学濃度指数（ＯＤＩ）データセットを、両方の抗体タイプに対して確立した。最後に、それぞれ正又は負を表す１又は０を含む二値データセットにＯＤＩ値を変換した。

変化を、アッセイ内及びアッセイ間変化の計算から評価した^４２。同じプレート上の１個の高力価試料及び１個の低力価試料からの二つ組測定によって、アッセイ内変化を求めた。アッセイ間変化の場合、異なる日に異なる操作者によって行われた異なるプレートからの６個の高力価試料及び６個の低力価試料の測定によって、変化を求めた。

利用した装置
ＮＤ１０００分光光度計（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して、細胞溶解物のタンパク質濃度を２８０ｎｍで測定した。Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｘ^４マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０ｍａｎｇｅｒ）を利用して、ＯＤ値を４５０ｎｍで０．１秒測定した。マイクロプレート洗浄機ＤＮＸ－９６２０Ｇ（ＮａｎｊｉｎｇＰｅｒｌｏｖｅＭｅｄｉｃａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ）を使用して、ＥＬＩＳＡマイクロプレートを洗浄した。

結果
図１及び２は、ボレリアスピロヘータと球状体の組合せ、ボレリアスピロヘータのみ、及びボレリア球状体のみに対する４４３名の個体による免疫応答を示す。ボレリア球状体のみに対するＩｇＭ及びＩｇＧ（図１Ａ及び２Ａ）免疫応答の総数は、ボレリアスピロヘータのみに対するＩｇＭ及びＩｇＧ免疫応答の総数と比較した場合に一貫して多い。また、ボレリアスピロヘータと球状体との様々な組合せに対するＩｇＭ及びＩｇＧ（図１Ａ及び２Ａ）免疫応答の総数は、ボレリアスピロヘータのみ及びボレリア球状体のみに対するＩｇＭ及びＩｇＧ免疫応答の総数と比較した場合に多い。さらに、図１Ｂ及び２Ｂにおいては、様々な種のボレリアスピロヘータは、ボレリアスピロヘータの様々な組合せで記録された免疫応答の総数と比較した場合に多い免疫応答数を示した。同様に、図１Ｃ及び２Ｃにおいては、ボレリア球状体の様々な組合せと比較した場合に多い免疫応答数が、様々な種のボレリア球状体で記録された。図１及び２は、様々な種のボレリアスピロヘータに加えて、様々な種のボレリア球状体が、個体におけるボレリア感染を検出する診断ツールの効率を途方もなく改善するのに役立ち得ることを示唆している。

図１Ａにおいては、ＩｇＭを有する９５名（２１％）、１５名（３％）及び６５名（１５％）の個体が、それぞれボレリアスピロヘータと球状体、ボレリアスピロヘータのみ、及びボレリア球状体のみに応答した。ボレリア球状体のみに対する免疫応答の総数は、ボレリアスピロヘータのみに対する免疫応答の総数と比較した場合に約５倍大きかった。残りの２６８名（６１％）の個体は、いずれのボレリア抗原にも応答しなかった。ボレリア球状体は、天然ボレリアスピロヘータ構造体の休眠又は潜伏した形を示す^{５，９，１４}。ＩｇＭでそれ自体のスピロヘータ構造体よりもボレリア球状体に応答する患者は、ＩｇＭ免疫機能不全が示唆される^１７。同様に、図２Ａにおいては、ＩｇＧを有する１７１名（３８％）、４７名（１１％）及び７１名（１６％）の個体が、それぞれボレリアスピロヘータと球状体、ボレリアスピロヘータのみ、及びボレリア球状体のみに応答した。ボレリア球状体のみに対する免疫応答の総数は、ボレリアスピロヘータのみに対する免疫応答の総数と比較した場合に約２倍大きかった。残りの１５４名（３５％）の個体は、いずれのボレリア抗原にも応答しなかった。ボレリア球状体に対する免疫応答数が多いことは、ボレリアスピロヘータのみを用いた診断キットでは、ボレリア感染の完全であり、信頼できる診断を個体に提供できないことを示唆している。したがって、ＴＢＤ患者を診断するためのボレリアスピロヘータと並んだボレリア球状体の実施は、この研究からの絶対的な新規性である。

ボレリアの異なる株に感染した個体は、異なる治療処置を必要とする^１６。したがって、個体を、種々のボレリア株について診断しなければならない。ボレリアスピロヘータのみ及びボレリア球状体のみに対する免疫応答（図１Ａ及び２Ａ）を更に分けて（図１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ及び２Ｃ）、個々のボレリア株に対する免疫応答の総数がボレリア株の様々な組合せに対する免疫応答の総数を超えるかどうか評価した。個々のボレリア株に対する免疫応答の総数は、ボレリア株の様々な組合せに対する免疫応答の総数と比較した場合に一貫して多かった（図１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ及び２Ｃ）。

図１Ａにおいては、ボレリアスピロヘータのみに応答した１５名（３％）の個体を、図１Ｂにおいて更に分け、評価した。１５名（３％）の個体のうち、１名（７％）、５名（３３％）及び５名（３３％）の個体が、それぞれボレリアブルグドルフェリ（Ｂｂ）、ボレリアアフゼリ（ａｆｚｅｉｌｉｉ）（Ｂａ）及びボレリアガリニ（Ｂｇ）スピロヘータに応答した。さらに、３名（２０％）及び１名（７％）の個体が、それぞれＢａ＋Ｂｇ及びＢｂ＋Ｂａ＋Ｂｇスピロヘータの組合せに応答した。１５名の個体のうち、４名（２７％）の個体が異なるボレリア株の組合せに応答し、一方１１名（７３％）の個体が異なるボレリア株に応答した。同様に、図２Ａにおいては、ボレリアスピロヘータのみに応答した４７名（１１％）の個体を、図２Ｂにおいて更に分け、評価した。４７名（１１％）の個体のうち、３名（６％）、１０名（２１％）及び１３名（２８％）の個体が、それぞれＢｂ、Ｂａ及びＢｇスピロヘータに応答した。さらに、４名（９％）、７名（１５％）及び１０名（２１％）の個体が、それぞれＢｂ＋Ｂｇ、Ｂａ＋Ｂｇ及びＢｂ＋Ｂａ＋Ｂｇスピロヘータの組合せに応答した。４７名（１１％）の個体のうち、２１名（４５％）の個体が異なるボレリア株の組合せに応答し、一方２６名（５５％）の個体が異なるボレリア株に応答した。ＩｇＭ（図１Ｂ）とＩｇＧ（図２Ｂ）との両方において、Ｂｂ＋Ｂａの組合せに対して、免疫応答は記録されなかった。また、図１Ｂにおいては、Ｂｂ＋Ｂｇの組合せに対して、免疫応答は記録されなかった。

図１Ａにおいては、ボレリア球状体のみに応答した６５名（１５％）の個体を、図１Ｃにおいて更に分け、評価した。６５名（１５％）の個体のうち、１６名（２５％）、１２名（１８％）及び１３名（２０％）の個体が、それぞれＢｂ、Ｂａ及びＢｇ球状体に応答した。さらに、９名（１４％）、８名（１２％）及び７名（１１％）の個体が、それぞれＢｂ＋Ｂａ、Ｂｂ＋Ｂｇ及びＢｂ＋Ｂａ＋Ｂｇ球状体の組合せに応答した。６５名（１５％）の個体のうち、２４名（３７％）の個体が異なるボレリア株の組合せに応答し、一方４１名（６３％）の個体が異なるボレリア株に応答した。同様に、図２Ａにおいては、ボレリア球状体のみに応答した７１名（１６％）の個体を、図２Ｃにおいて更に分け、評価した。７１名の個体のうち、４名（６％）、５名（７％）及び３０名（４２％）の個体が、それぞれＢｂ、Ｂａ及びＢｇ球状体に応答した。さらに、２名（３％）、１６名（２２％）、２名（３％）及び１２名（１７％）の個体が、それぞれＢｂ＋Ｂａ、Ｂｂ＋Ｂｇ、Ｂａ＋Ｂｇ及びＢｂ＋Ｂａ＋Ｂｇ球状体の組合せに応答した。７１名の個体のうち、３２名（４５％）の個体が異なるボレリア株の組合せに応答し、一方３９名（５５％）の個体が異なるボレリア株に応答した。ＩｇＭ（図１Ｃ）とＩｇＧ（図２Ｃ）の両方において、Ｂａ＋Ｂｇの組合せに対して、免疫応答は記録されなかった。明らかに、個々のボレリア株に対する免疫応答の総数は、組合せのボレリア株に対する免疫応答の総数を超える（図１Ｂ、１Ｃ、２Ｂ及び２Ｃ）。個々のボレリア株に対する免疫応答数がより多いことは、異なるボレリア株間の異なるエピトープの流布を示唆している^４３。異なるボレリア株を診断ツールから除外すると、その感度が限定され得る^４４。

図３は、１種又は複数の微生物抗原に対する４４３名の個体からのＩｇＭ（３Ａ）及びＩｇＧ（３Ｂ）免疫応答を示し、ＴＢＤにおける複数菌条件の関連性を評価する。世界的に、医学界及び診断業は、麻疹、結核、肝炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び他のものなどの多数の疾患において複数菌感染症を認めた^{１２，４５}。しかし、複数菌感染症に関するＴＢＤ診断の状況は、変わっていない^４６。図３Ａにおいては、２３７名（５３％）の個体が複数の微生物抗原に応答し、一方５３名（１２％）の個体が任意の単一の微生物抗原に応答した。同様に、図３Ｂによって、３４４名（７８％）の個体が複数の微生物抗原に応答し、一方６３名（１４％）の個体が任意の単一の微生物抗原に応答したことが決定された。図３からのＴＢＤにおける複数菌感染症に関する実験的証拠は、ＴＢＤ診断の分野における不可避的なパラダイムシフトを支持するものである。残りの１５３名（３５％）及び３６名（８％）の個体は、それぞれＩｇＭ及びＩｇＧについて試験した場合に微生物抗原に対して免疫を生じなかった。ＩｇＭによって複数の微生物に応答する個体（図３Ａ）は、単一の微生物に応答する個体と比較した場合に約５倍多い。同様に、図３Ｂにおいては、複数の微生物に応答する個体は、単一の微生物に応答する個体と比較した場合に約６倍多い。ＩｇＭによる複数の抗原に対する応答（５３％）（３Ａ）は、免疫機能不全がＴＢＤ個体間の一般的現象であり得ることを示唆している^１７。さらに、図３Ａ及び３Ｂは、複数菌感染症がＩｇＭよりもＩｇＧで観察されるべきより一般的な現象であり得ることを示唆している。

図４及び５は、それぞれ個々の微生物抗原に対するＩｇＭ及びＩｇＧ免疫応答を示す。各抗原に対する免疫応答の総数は、ＩｇＭと比較した場合にＩｇＧにおいて一貫して高かった。ボレリア球状体に対する免疫応答は、そのそれぞれのスピロヘータ株と比較した場合に高いか、同様であった。ボレリア球状体に対する免疫の数がボレリアスピロヘータとの比較において同じであることは、ボレリア球状体が、ボレリア診断ツールの感度を最大にするのに役立ち得ることを示唆している。１３０名（２９％）及び６４名（１４％）にのぼる個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭについて厳密な意味におけるボレリアブルグドルフェリＢ３１に応答し、１６２名（３７％）及び７９名（１８％）の個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭについてボレリアアフゼリＰ１２に応答し、１６１名（３６％）及び９４名（２１％）の個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭについてボレリアガリニＦｕｊｉＰ１に応答し、１５８名（３５％）及び１２０名（２７％）の個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭについて厳密な意味におけるボレリアブルグドルフェリＢ３１球状体に応答し、１６４名（３７％）及び９８名（２２％）の個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭにおいてボレリアアフゼリ（ａｆｚｅｌｌｉ）ｐ１２球状体に応答し、並びに１８０名（４１％）及び８３名（１９％）の個体が、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭについてボレリアガリニＦｕｊｉＰ１２球状体に応答した。

図４及び５においては、ボレリアスピロヘータ／球状体を除いた抗原に対する免疫応答は、個体を二次、同時感染及び自己免疫状態について試験することが必須であることを示唆している。ＩｇＧ及びＩｇＭに対する免疫応答は、以下の通りである：１２５名（２８％）及び５９名（１３％）の個体がそれぞれバルトネラヘンセレに応答し、１２６名（２８％）及び７４名（１６％）の個体がそれぞれネズミバベシアに応答し、１１５名（２６％）及び６５名（１５％）の個体がそれぞれクラミジアトラコマチスに応答し、１１５名（２６％）の個体がそれぞれクラミジア肺炎に応答し、１６７名（３８％）及び１２２名（２８％）の個体がそれぞれマイコプラズマファーメンタンスに応答し、１３７名（３１％）及び５８名（１３％）の個体がそれぞれマイコプラズマ肺炎に応答し、１１５名（２６％）及び７６名（１７％）の個体がそれぞれコクサッキーウイルスＡ１６に応答し、１５０名（３４％）及び１２７名（２９％）の個体がそれぞれサイトメガロウイルスに応答し、２０３名（４６％）及び６８名（１５％）の個体がそれぞれエプスタインバーウイルスに応答し、１２２名（２８％）及び６４名（１４％）の個体がそれぞれウシ流産菌に応答し、１３４名（３０％）及び１０４名（２３％）の個体がそれぞれパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体に応答し、１４２名（３２％）及び７７名（１７％）の個体がそれぞれエーリキアシャフェンシスに応答し、１４９名（３４％）及び７１名（１６％）の個体がそれぞれダニ媒介脳炎ウイルスに応答し、１８４名（４７％）及び１４６名（３３％）の個体がそれぞれ痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｋｅｔｓｉａａｋａｒｉ）に応答し、並びに３６名（８％）及び１５３名（３５％）の個体がそれぞれ２０種の抗原のいずれにも応答しなかった。

図６及び７は、ボレリアスピロヘータ、ボレリア球状体、又はボレリアスピロヘータと球状体の組合せを伴う別の微生物、及びボレリアを伴わない別の微生物に対する、４４３名の個体による免疫応答の違いを示す。本質的に、図６及び７は、複数の別の微生物の数に対する、並びに特にボレリア球状体を伴う、及び伴わない各々の別の微生物に対する免疫応答頻度の違いを示す。ボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答する個体は、複数の別の微生物の数だけでなく、特定の別の微生物に対してもより多大に応答する傾向があることが観察された。図６及び７は、ボレリアスピロヘータ、ボレリア球状体、同時感染、二次感染及び自己免疫抗原の診断ツールが、完全であり、信頼できるＴＢＤ診断を個体に提供することを示唆している。「別の微生物」という用語は、バルトネラヘンセレ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ウシ流産菌（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、ネズミバベシア（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、エーリキアシャフェンシス（Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、痘瘡リケッチア（Ｒ．ａｋａｒｉ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、クラミジアトラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、マイコプラズマファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ肺炎（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、及びヒトパルボウイルスＢ１９（ＨＢ１９Ｖ）など、しかしそれらに限定されない、同時感染、二次及び自己免疫抗原を含む。
図６Ａ及び７Ａにおいては、４４３名の個体のほぼ１／４（２６％）が、ボレリアを伴わない別の微生物に応答した。ボレリアを伴わない別の微生物に対する１１５名（２６％）及び１１８名（２６％）の個体からのＩｇＭ及びＩｇＧ免疫応答は、個体が、ボレリア以外の微生物についても選別されるべきであることを示唆している。さらに、図６Ａ及び７Ａは、ボレリアのみ及びボレリアを伴う別の微生物に対する個体による免疫応答を示す。ボレリアを伴う別の微生物に応答する個体の数が、ボレリア抗原のみに応答する個体の数と比較した場合にかなり多いことが観察された。図６Ａにおいては、４４３名の個体から１０名（２％）、２名（１％）及び５名（１％）の個体が、それぞれボレリア球状体、ボレリアスピロヘータ、及びボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した。しかし、４４３名の個体のうち、５５名（１２％）、１３名（３％）及び９０名（２０％）の個体が、それぞれ別の微生物と一緒のボレリア球状体、ボレリアスピロヘータ、及びボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した。同様に、図７Ａにおいては、４４３名の個体のうち、２３名（５％）、２名（１％）及び１３名（３％）の個体が、それぞれボレリア球状体、ボレリアスピロヘータ、及びボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した。しかし、４４３名の個体のうち、４８名（１１％）、４５名（１０％）及び１５８名（３６％）の個体が、それぞれ別の微生物と一緒のボレリア球状体、ボレリアスピロヘータ、及びボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答した。

図６Ａ及び７Ａにおいては、ボレリア球状体に応答する個体は、ボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合に別の微生物により多大に応答する傾向がある。しかし、ボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答する個体は、ボレリア球状体又はボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合に、別の微生物に約３倍高く応答する傾向がある。ＩｇＭの場合（図６Ａ）、ボレリア球状体を伴う別の微生物に応答する個体の数は、ボレリアスピロヘータを伴う別の微生物に応答する個体の数と比較した場合に約４倍多い。しかし、ＩｇＧの場合（図７Ａ）、ボレリア球状体を伴う別の微生物に応答する個体の数は、ボレリアスピロヘータを伴う別の微生物に応答する個体の数とわずかに類似している。４４３名の個体のうち、５５名（１２％）の個体がボレリア球状体を伴う別の微生物に応答し、一方１３名（３％）の個体がＩｇＭにおいてボレリアスピロヘータを伴う別の微生物に応答した（図６Ａ）。同様に、４８名（１１％）の個体がボレリア球状体を伴う別の微生物に応答し、４５名（１０％）の個体がボレリアスピロヘータを伴う別の微生物に応答した。

図６Ｂ及び７Ｂは、ボレリアを伴う、及び伴わない、別の微生物に応答する個体の微生物負荷の違いを示す。最初に、別の微生物に応答する個体（図６Ａ及び７Ａ）は、両方の抗体クラスにおいて８種を超える微生物に応答しなかった（図６Ｂ及び７Ｂ）。しかし、別の微生物に応答する７５％を超える個体は、３種を超える微生物に応答しなかった。ＩｇＭで別の微生物に応答する１１５名（２６％）の個体のうち（図６Ａ）、９２名（８０％）の個体は、３種を超える微生物に応答しなかった。同様に、ＩｇＧで別の微生物に応答する１１８名（２６％）の個体のうち（図７Ａ）、８９名（７５％）の個体は、３種を超える微生物に応答しなかった。興味深いことに、ボレリアに応答する個体は、ボレリアに対するいかなる応答をも伴わない個体と比較した場合に複数の別の微生物に対してより多大に応答する傾向がある（図６Ｂ及び７Ｂ）。

ＩｇＭでボレリア球状体に応答する個体は、ボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合に複数の別の微生物に対してより多大に応答する傾向がある（図６Ｂ）。逆に、ＩｇＧでボレリアスピロヘータに応答する個体は、ボレリア球状体に応答する個体と比較した場合に複数の別の微生物に対してより多大に応答する傾向がある（図７Ｂ）。しかし、ボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答する個体は、ボレリア球状体又はボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合に複数の微生物に対してより高く応答する傾向が一貫してある。ボレリアスピロヘータと球状体との組合せを伴う別の微生物に応答する５０％を超える個体は、８～１４種の複数の別の微生物に応答した。ボレリアスピロヘータと球状体との組合せを伴う別の微生物に応答する個体の濃度は、両方の抗体クラスにおいて１４種の複数の微生物で最高である（図６Ｂ及び７Ｂ）。ボレリアスピロヘータと球状体との組合せに対してＩｇＭで別の微生物に応答する９０名（２０％）の個体のうち（図６Ａ）、１４名（１６％）の個体が、１４種の別の微生物に応答した（図６Ｂ）。同様に、ボレリアスピロヘータと球状体との組合せに対してＩｇＧで別の微生物に応答する１５８名（３６％）の個体のうち（図７Ａ）、２３名（１５％）の個体が、１４種の別の微生物に応答した（図７Ｂ）。

図６Ｃ及び７Ｃは、ボレリアを伴う、及び伴わない、個々の別の微生物に対する４４３名の個体からの免疫応答の違いを示す。図６Ｂ及び７Ｂにおいて最大の微生物負荷量を示すボレリア抗原はまた、図６Ｃ及び７Ｃにおける個々の別の微生物に対する免疫応答の最も高い頻度を示した。図６Ｂ及び７Ｂから、ボレリア球状体及びボレリアスピロヘータは、それぞれＩｇＭ及びＩｇＧによる個体の最も高い微生物負荷を示した。したがって、ＩｇＭでボレリア球状体に応答する個体は、ボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合にすべての別の微生物に対して平均して５倍高く応答した（図６Ｃ）。さらに、ＩｇＧでボレリアスピロヘータに応答する個体は、ボレリア球状体に応答する個体と比較した場合にすべての別の微生物に対して平均して２倍高く応答した（図７Ｃ）。しかし、ボレリアスピロヘータと球状体との組合せは、両方の抗体クラスにおいて微生物負荷の最大の量を示した（図６Ｂ及び７Ｂ）。したがって、ＩｇＭでボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答する個体は、ボレリア球状体に応答する個体と比較した場合にすべての別の微生物に対して約３倍高く応答した（図６Ｃ）。また、ＩｇＧでボレリアスピロヘータと球状体との組合せに応答する個体は、ボレリアスピロヘータに応答する個体と比較した場合にすべての別の微生物に対して約５倍高く応答した（図７Ｃ）。

アッセイ内及びアッセイ間変化
本方法のアッセイ内及びアッセイ間変化は、それぞれ４．６％及び１５．６％と計算された。

表１：本方法に利用される２０種のダニ媒介微生物抗原のリスト

参考文献

Claims

生体試料における抗体の存在を検出するための固体担体であって、前記固体担体が、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含み、ここで前記微生物抗原が、ボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリアアフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａａｆｚｅｌｉｉ）及びボレリアガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒｉｎｉｉ）の多形性球状体の溶解物から調製される抗原を含み、
前記溶解物が、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニの細胞ペレットの単離により球状体を単離し、前記球状体を超音波処理することにより球状体溶解物を得て、前記球状体溶解物を加熱処理して加熱処理球状体溶解物を得た後、上記加熱処理球状体溶解物の超音波処理により調製された、前記固体担体。
前記固体担体がマイクロウェルプレート又は抗原マイクロアレイである、請求項１に記載の固体担体。
前記固体担体が、天然スピロヘータ型のボレリア属の種からなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原を更に含む、請求項１又は２に記載の固体担体。
天然スピロヘータ型の前記ボレリア属の種が、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアアフゼリ及びボレリアガリニからなる群から選択される、請求項３に記載の固体担体。
前記固体担体が、天然スピロヘータ型のボレリアブルグドルフェリから調製される固定化抗原を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の固体担体。
前記固体担体が、天然スピロヘータ型のボレリアアフゼリから調製される固定化抗原を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の固体担体。
前記固体担体が、天然スピロヘータ型のボレリアガリニから調製される固定化抗原を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の固体担体。
マイコプラズマファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ肺炎、バルトネラヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｈｅｎｓｅｌａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ）、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、エーリキアシャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、コクサッキーウイルスＡ１６、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９アポトーシス小体、ダニ媒介脳炎ウイルス及び痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａａｋａｒｉ）からなる群から調製される少なくとも１種の固定化抗原を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の固体担体。
天然スピロヘータ型のボレリア属の種からなる群から調製される前記抗原が、前記天然スピロヘータ型の溶解物、タンパク質調製物又はペプチド調製物である、請求項３に記載の固体担体。
生体試料におけるダニ媒介微生物を検出する方法であって、前記方法が以下のステップ：
（ａ）固体担体に固定された微生物抗原と前記微生物抗原に結合した生体試料から生じる抗体とを含む複合体を形成するために、前記固体担体上に固定された微生物抗原を含む前記固体担体と前記生体試料を接触させるステップであって、前記微生物抗原が、ボレリア属の種の多形性球状体からなる群から調製される少なくとも１種の抗原を含み、前記固体担体が請求項１～９のいずれか一項に記載の固体担体であるステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた複合体の存在を検出するステップであって、ボレリア属の多形性球状体から調製される抗原を含む複合体の存在が、前記生体試料におけるダニ媒介微生物の存在の徴候であるステップ
を含む、前記方法。
前記微生物抗原、前記微生物抗原と結合した前記抗体、及び抗抗体試薬の複合体を形成するために、前記固体担体を前記抗抗体試薬と接触させることによって、ステップ（ａ）で得られた複合体の存在が検出される、請求項１０に記載の方法。
前記抗抗体試薬が抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＡ抗体である、請求項１１に記載の方法。
前記抗抗体試薬が抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体である、請求項１１又は１２に記載の方法。
前記生体試料が血液若しくは血清試料、唾液試料、脳脊髄液試料、滑液試料又は涙試料である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～９のいずれか一項に記載の固体担体の、生体試料におけるダニ媒介微生物検出用診断アッセイの製造のための使用。
前記診断アッセイが患者におけるライム病の検出用である、請求項１５に記載の使用。
前記診断アッセイが患者における慢性又は持続性ライム病の検出用である、請求項１６に記載の使用。