JP7093300B2 - リボソームディスプレイ複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
このように、ポリペプチドに、環状化のための修飾試薬や抗がん剤といった機能性分子が連結したポリペプチドライブラリを作製する技術が注目される。
以下、本発明を示す。
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される1以上の反応性アミノ酸残基を含み、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記mRNA分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、
上記リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いて上記mRNA分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、上記mRNA分子および上記リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、
上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含むことを特徴とする方法。
前記ヘテロ原子含有極性基が、-O-、-S-、-NR1-(式中、R1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-CO-、-COO-、-CONR2-(式中、R2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-N=N-、又は-SO2-であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記[2]または[3]に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
B1が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる1種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
B2及びB3がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
B1又はB2が前記Aと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記[4]に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
のいずれかで表される上記[5]に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
前記式(1)の修飾試薬でaが2以上であり、
未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させる前記工程で、ポリペプチド鎖と修飾試薬の間に環を形成する上記[2]~[7]のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される1以上の反応性アミノ酸残基を含み、且つ、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記mRNA分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであることを特徴とするリボソームディスプレイ複合体。
前記ヘテロ原子含有極性基が、-O-、-S-、-NR1-(式中、R1は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-CO-、-COO-、-CONR2-(式中、R2は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-N=N-、又は-SO2-であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基である上記[15]に記載のリボソームディスプレイ複合体。
B1が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる1種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
B2及びB3がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
B1又はB2が前記Axと結合しており、
ヘテロ原子含有極性基及び置換基が前記と同じ意味である上記[16]に記載のリボソームディスプレイ複合体。
で表される上記[17]に記載のリボソームディスプレイ複合体。
前記式(2)の修飾構造でaが2以上であり、
ポリペプチド鎖と式(2)の修飾構造とで環が形成されている上記[14]~[19]のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
本工程では、リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いてmRNA分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、mRNA分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を得る。
以上の様にして未修飾ポリペプチド鎖、mRNA分子およびリボソームを含むリボソーム複合体を製造した後、本工程では、その未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、未修飾ポリペプチド鎖を修飾する。未修飾ポリペプチド鎖を含むリボソーム複合体を製造してから修飾試薬と反応させると、RD複合体が維持されたまま(すなわちリボソームにおけるポリペプチドとmRNAの接着機能を阻害することなく)、極めて簡便な工程でポリペプチド鎖を化学修飾できる。
なお前記式(1a)~(1f)で表される化合物は、機能性基C(蛍光色素、標識単位のいずれかを含む基)を有し、機能性基Cは、B1、B2、B3のいずれかに結合している。また、水溶性向上のため、スルホン酸基(-SO2-OH)やスルホン酸塩基(-SO2-O-M+)などの水溶性置換基を有していてもよい。M+としては、ナトリウムイオンやカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンを挙げることができる。
(1)RNAライブラリの作製
本(1)項では、NNK法を用い、(NNK)10[式中、NはA、U、GまたはCを示し、KはGまたはUを示し、NNKはすべてのコドンに対応する]の配列を含む配列を有するRNAを1012以上含むRNAライブラリを作製する方法について説明する。
再構成型無細胞タンパク質合成キット(ジーンフロンティア社製「PURE frex(登録商標)」)を用い、上記RNAライブラリからリボソームディスプレイ(RD)複合体を調製した。別途、ストレプトアビジン-磁性粒子(「NanoLinkTM Streptavidin Magnetic Beads」Solulink社製)5μLを、150μLに希釈した。上記RD複合体反応液と、抗FLAG(登録商標) M2抗体結合アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社製,20μL)を混合し、4℃で60分間攪拌した。ペプチド部分にFLAG配列を有するRD複合体が選択的に結合した抗FLAG M2抗体結合アガロースビーズを回収した。
上記で回収したアガロースビーズを80μLに希釈した後、還元剤として10mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(4μL)(終濃度0.5mM)と、修飾試薬として40mM 1,3-ジブロモ-2-プロパノン(4μL)(終濃度2mM)を添加し、4℃で3時間環化反応させた。なお、このとき還元剤の添加は必須ではない。環化反応後、FLAGペプチドを添加することにより、RD複合体をアガロースビーズから分離した。
別途、上記ストレプトアビジン-磁性粒子希釈液(5μL)に、ヒートショックタンパク質であるHSP90にビオチンを結合させたものをモル比が1:1となるように混合し、4℃で攪拌することで、磁性粒子にHSP90を結合させた。また、比較のために、HSP90を結合させない以外は同様にして磁性粒子懸濁液を調製した。
配列の濃縮が確認されたラウンドの全長鎖DNAを鋳型として、Taq polymeraseを用いてPCRを行うことで、末端にAを付加した。この突出末端とクローニングキット(Promega社製「pGEM T Easy Cloning Kit」)を用いて、付属のプラスミドDNAにライゲーションした。得られたプラスミドを用いて、JM109 competent cellを形質転換し、培養した。培養により形成されたコロニーから抽出した各クローンのプラスミドを用いて、上記全長鎖DNAのアミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配列のうち、ランダム部分(NNK部分)の配列を表12に示す。
上記(5)にて獲得した各クローンのHSP90に対する親和性の確認を行った。具体的には、上記(5)で合成した各クローンの全長DNAを鋳型とし、上記(1)と同様にしてRNAを合成し、上記(2)と同様にリボソームディスプレイ複合体を作製した。また、その一部のポリペプチドを、上記(3)と同様にして環化した。得られた各リボソームディスプレイ複合体のHSP90に対する親和性を、上記(4)と同様にして調べた。回収した複合体の量を定量することで、各クローンのHSP90に対する親和性を求めた。結果を図3に示す。図3中のアルファベットは、上記表12中の配列記号に相当する。
再構成型無細胞タンパク質合成キット(ジーンフロンティア社製「PURE frex(登録商標)」)を用い、反応液50μLに、FLAG配列、His6配列およびTEVプロテアーゼサイトをコードする塩基配列を有するRNA(配列番号8)2.5×1013分子を混合し、37℃で35分間反応させることによりRD複合体を作製し、反応液に抗FLAG(登録商標) M2抗体結合アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社製,2μL)を加えてRD複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス(2-カルボキシエチル)ナトリウム塩(pH7,終濃度0.5mM)と、図4に示す各修飾試薬を終濃度2mMで加え、4℃で3時間攪拌することによりビーズ上でRD複合体中のペプチドを環化した。反応後、FLAGペプチド(配列:DYKDDDDK,5mg)を加えることによりRD複合体をビーズから遊離させた。反応液からビーズを分離除去し、Mg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(pH7.5,100μL)を加えて複合体を解離させた後、His-tagビーズでペプチド鎖を精製した。精製したポリペプチドをTEVプロテアーゼで切断した後、環状化部位を含みN末端がホルミル化されている断片ペプチド(配列番号9)の分子量をMALDI-TOFMSで測定した。修飾試薬の化学構造と得られたマススペクトルチャートを図4に示す。図4中、(a)は修飾試薬を添加しない反応液のマススペクトルチャートであり、(e)はRNAを用いない以外は同様に反応させた反応液のマススペクトルチャートでありバックグラウンドのシグナルを示すものである。また、白矢印は未環化ペプチド鎖のピークを示し、黒矢印は環化ペプチド鎖のピークを示す。
RNAとして配列番号10の塩基配列を有するものを用い、修飾試薬として図5に示すものを用いた以外は上記実施例2と同様にして、環化反応を行った。結果を図5に示す。
RNAとして配列番号11塩基配列を有するものを用い、修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用い、反応液のpHを7.4、7.7または8.0に変更した以外は上記実施例2と同様にして、環化反応を行った。反応液のpHが7.4の場合の結果を図6に、pHが7.7の場合の結果を図7に、pHが8.0の場合の結果を図8に示す。
配列番号12~14のアミノ酸配列をコードするRNAと修飾試薬としてスベリン酸ジサクシンイミジルを用いた以外は上記実施例2と同様にして、環化反応を行った。配列番号12のアミノ酸配列の結果を図9に、配列番号13のアミノ酸配列の結果を図10に、配列番号14のアミノ酸配列の結果を図11に示す。
配列番号13のペプチド配列をコードするRNAを用い、修飾試薬としてEZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher社製)を用いた以外は上記実施例2と同様にして、ペプチドへの修飾を行った。図12に示すとおり、ビオチン化されたことを示唆するシグナルを得た。このペプチド配列は2つのリジンを含むため、1つビオチン化されたペプチドに加え(黒矢印)、2つビオチンが導入されたペプチドも検出できた(斜線矢印)。このように、本実験でも、1分子または2分子の修飾試薬がポリペプチド鎖に結合していると考えられる。
配列番号12のペプチド配列をコードするRNAを用い、修飾試薬として1,3-ジブロモ-2-プロパノンまたはEZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher社製)を用いた以外は上記実施例2と同様にして、ビオチン修飾されたRD複合体を作製した。ビオチン化された複合体に上記ストレプトアビジン-磁性粒子希釈液(5μL)を加え、磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収した。回収した磁性粒子に0.05MのEDTAを加えることにより、磁性粒子上のHSP90に結合しているRD複合体からRNAを解離させた。磁気スタンドを用いて磁性粒子を除去した後、RNA濃縮・精製キット(QIAGEN社製「RNeasy MinElute Cleanup Kit」)によりRNAを精製した。各修飾試薬で修飾した場合のRNA回収量を定量RT-PCRで測定し、修飾試薬なしで行った条件での回収量をバックグラウンドとして、相対的に比較した。結果を図13に示す。図13に示す結果の通り、RD複合体に対してNHS-PEG4-Biotinでのビオチン化が進行し、RNAが回収できたことを示唆する結果を得た。
(1)条件1
再構成型無細胞タンパク質合成キット(ジーンフロンティア社製「PURE frex(登録商標)」)を用い、反応液50μLに含まれるリボソームに、還元剤としてトリス(2-カルボキシエチル)ナトリウム塩(pH7,終濃度0.5mM)と、修飾試薬として1,3-ジブロモ-2-プロパノンを終濃度2mMで加え、4℃で3時間反応した。次いで、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットのリボソーム以外の因子(反応液50μLに必要量)と、RNA(配列番号8)2.5×1012分子を加えて混合し、37℃で35分間反応させることによりRD複合体の調製を行った。この反応液に抗FLAG(登録商標) M2抗体結合アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社製,2μL)を加えて、RD複合体を結合させた。ここでは何も加えずに、4℃で3時間攪拌した。攪拌後、FLAGペプチド(配列:DYKDDDDK,5mg)を加えることによりRD複合体をビーズから遊離させた。得られたRD複合体の量を、定量RT-PCRで求めた。結果を図14に示す。
条件2では、上記実施例と同様に、RD複合体を作製した後に修飾試薬を作用させた。具体的には、上記再構成型無細胞タンパク質合成キットを用い、反応液50μLに含まれるリボソームに対して、修飾試薬を加えずに4℃で3時間インキュベーションした。次いで、条件1と同様の操作によりRD複合体を調製し、この反応液に抗FLAG(登録商標) M2抗体結合アガロースビーズ(Sigma-Aldrich社製,2μL)を加えてRD複合体を結合させた。さらに、還元剤としてトリス(2-カルボキシエチル)ナトリウム塩(pH7,終濃度0.5mM)と、修飾試薬として1,3-ジブロモ-2-プロパノンを終濃度2mMで加え、4℃で3時間攪拌することによりビーズ上でRD複合体の修飾を行った。なお、添加した修飾試薬(1,3-ジブロモ-2-プロパノン)の量は、RD複合体1モルに対して1,000,000倍モルとなる。反応後、FLAGペプチド(配列:DYKDDDDK,5mg)を加えることによりRD複合体をビーズから遊離させた。得られたRD複合体の量を、定量RT-PCRで求めた。結果を図14に示す。
Claims (14)
- ポリペプチド鎖、mRNA分子およびリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体を製造するための方法であって、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される1以上の反応性アミノ酸残基を含み、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記mRNA分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、
上記リボソームを利用した無細胞ペプチド合成系を用いて上記mRNA分子を翻訳し、未修飾ポリペプチド鎖、上記mRNA分子および上記リボソームを含むリボソーム複合体を得る工程、および、
上記未修飾ポリペプチド鎖に含まれる上記側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させることにより、上記未修飾ポリペプチド鎖を修飾する工程を含み、
前記修飾試薬が、下記式
Aは、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、又はチオール基を表し、
B1が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる1種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
B2及びB3がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
B1又はB2が前記Aと結合しており、
前記ヘテロ原子含有極性基が、-O-、-S-、-NR 1 -(式中、R 1 は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-CO-、-COO-、-CONR 2 -(式中、R 2 は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-N=N-、又は-SO 2 -であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基であり、
nは1以上の整数を表し、
B1、B2、B3のいずれか一つ以上には、機能性基の1つ以上が結合していてもよい)
のいずれかで表される化合物であることを特徴とする方法。 - 前記Aがハロゲン化アルキルであるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である請求項1に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基からなる群より選択される2以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記修飾試薬でAの数が2以上であり、
未修飾ポリペプチド鎖に含まれる側鎖反応性官能基と修飾試薬とを反応させる前記工程で、ポリペプチド鎖と修飾試薬の間に環を形成する請求項1または2に記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。 - 前記ポリペプチド鎖が100~5000アミノ酸残基からなる請求項1~3のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のN末端から2番目~C末端から30番目の位置に有する請求項1~4のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記ポリペプチド鎖がN末端から2番目~C末端から30番目の位置に1~30アミノ酸残基のランダム配列を含む請求項1~5のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである請求項1~6のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体の製造方法。
- ポリペプチド鎖、mRNA分子およびリボソームを含み、
上記ポリペプチド鎖は、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、及びトリプトファン残基からなる群より選択される1以上の反応性アミノ酸残基を含み、且つ、当該反応性アミノ酸残基の側鎖反応性官能基が修飾されているものであり、
上記mRNA分子は、上記ポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであり、
前記側鎖反応性官能基の修飾構造が、下記式
Axは、ハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、カルベン含有基、ジスルフィド結合含有基、又はチオール基が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖と反応して形成される結合基を表し、
前記に同じであり、
B1が炭素原子間にヘテロ原子含有極性基が挿入されていてもよく置換基を有していてもよい鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族環から選ばれる1種以上を単独で又は組み合わせて有する基であり、
B2及びB3がそれぞれ独立してヘテロ原子含有極性基であり、
B1又はB2が前記Axと結合しており、
前記ヘテロ原子含有極性基が、-O-、-S-、-NR 1 -(式中、R 1 は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-CO-、-COO-、-CONR 2 -(式中、R 2 は水素原子、炭化水素基、又は連結基末端の結合手を表す)、-N=N-、又は-SO 2 -であり、
前記脂肪族炭化水素基の置換基が、ハロゲノ基、アリール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、又はヒドロキシ基であり、
前記芳香族環の置換基がハロゲノ基、アルキル基、アラルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基、又はカルボキシアルキル基であり、
nは1以上の整数を表し、
B1、B2、B3のいずれか一つ以上には、機能性基の1つ以上が結合していてもよい)
のいずれかで表される化学構造であることを特徴とするリボソームディスプレイ複合体。 - 前記Axがハロゲン化アルキルと、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はトリプトファン残基の側鎖とが形成する化学結合であるとき、このハロゲノ基が結合する炭素原子が、カルボニル基のα位の炭素原子、又は芳香族環に直結する炭素原子である請求項8に記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記ポリペプチド鎖が、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、およびトリプトファン残基からなる群より選択される2以上の反応性アミノ酸残基を含み、
前記修飾構造でaが2以上であり、
ポリペプチド鎖と前記修飾構造とで環が形成されている請求項8または9に記載のリボソームディスプレイ複合体。 - 前記ポリペプチド鎖が100~5000アミノ酸残基からなる請求項8~10のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記反応性アミノ酸残基を、前記ポリペプチド鎖のN末端から2番目~C末端から30番目の位置に有する請求項8~11のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記ポリペプチド鎖がN末端から2番目~C末端から30番目の位置に1~30アミノ酸残基のランダム配列を含む請求項8~12のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
- 前記リボソームが、大腸菌由来のリボソームである請求項8~13のいずれかに記載のリボソームディスプレイ複合体。
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