JP7092310B2 - 複数の再生毛包原基の製造方法、毛包組織含有シートの製造方法、毛髪再生用キット及び発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法 - Google Patents
複数の再生毛包原基の製造方法、毛包組織含有シートの製造方法、毛髪再生用キット及び発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、2017年8月22日に、日本に出願された特願2017-159661号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
具体的には、例えば、体性に由来する複数の細胞種を、Wntシグナル活性化剤を添加した培養液を備えるスフェロイド容器に播種することで、原始的な毛包器官を形成する方法(例えば、特許文献1参照)が挙げられる。
また、例えば、間葉系細胞から実質的になる第1の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的になる第2の細胞集合体と、をゲル内で区画化して配置することで毛包原基を構築し、化学繊維等のガイドを挿入した後、それを移植することで毛包器官を再生する方法(例えば、特許文献2参照)が挙げられる。
一方、最近、多血小板血漿抽出物を含む培養液を用いて間葉系細胞を培養し、該間葉系細胞を生まれつき毛の生えないマウスの皮膚に移植することで、高い毛髪再生能が実現できることが明らかとなった(例えば、非特許文献1参照)。
また、本発明者らは、これまで、特許文献3に示すように、間葉系細胞及び上皮系細胞から構成された毛包原基を大量に製造すべく、酸素透過性に優れた培養容器を用いた培養方法に着目してきた。しかしながら、従来から間葉系細胞又は上皮系細胞それぞれの機能を損なわずに培養するために用いられる培地成分は各種知られているものの、上記培養容器を用いて毛包原基を製造する際に、優れた毛髪再生効率を有する毛包原基を大量に得るために必要な特定の培地成分については知られていない。
よって、上記の従来の製造方法よりも、毛髪再生効率が高く、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の複数の再生毛包原基を製造可能な方法が求められていた。
本発明の第1態様に係る複数の再生毛包原基の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備える方法であり、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。
前記毛包原基形成工程において、さらに、血管を構築しうる細胞を前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞と同時に播種してもよい。
前記血管を構築しうる細胞が血管内皮細胞であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子であってもよい。
前記培地中の前記線維芽細胞増殖因子の含有量が1ng/mL以上500ng/mL以下であってもよい。
前記培地は前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を含んでもよい。
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下であってもよい。
前記生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンであってもよい。
上記第3態様に係る毛髪再生用キットは、さらに、培地を備えてもよい。
前記培地が間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される1種類以上であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿であってもよい。
本発明の一実施形態に係る複数の再生毛包原基の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子(Fibroblast Growth Factor;FGF)を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程である。また、前記マイクロ凹版は、規則的な配置の微小凹部からなり、且つ、酸素透過性を有する材質からなる。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞(例えば、胚性幹(ES)細胞、胚性生殖(EG)細胞、人工多能性(iPS)幹細胞等)から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞の由来としては、動物であればよく、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。
哺乳動物しては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類;イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット(ヌードラットも包含する)、マウス(ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する)、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、細胞の由来としては、ヒトであることが特に好ましい。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の製造方法等により作製された毛包原基を意味する。
本明細書において、「複数の再生毛包原基」とは、上述の再生毛包原基が複数集まった状態のものを意味する。本実施形態の製造方法では、簡便に、複数の上述の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した複数の再生毛包原基を得ることができる。また、複数の再生毛包原基はそれぞれの毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
これに対し、本実施形態の製造方法では、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、マイクロ凹版内で、FGFを含む培地を用いて、当該マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から酸素を供給しながら共培養することにより、簡便に、複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列しており、優れた毛髪再生効率を有する複数の再生毛包原基を得ることができる。
本実施形態の製造方法における毛包原基形成工程は、間葉系細胞及び上皮系細胞から毛包原基を微小凹部内に形成させる工程である。具体的には、まず、間葉系細胞1及び上皮系細胞2を含む細胞混合懸濁液を調製する。このとき、間葉系細胞1及び上皮系細胞2の混合比は、間葉系細胞:上皮系細胞=1:2~2:1であることが好ましく、1:1.5~1.5:1であることがより好ましく、1:1であることがさらに好ましい。
この場合、毛包原基形成工程は、マイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞及び血管を構築しうる細胞を含む細胞混合懸濁液を播種し、FGFを含む培地を用いて、マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から酸素を供給しながら共培養することにより、微小凹部内に毛包原基を形成させる工程である。
中でも、血管を構築し得る細胞としては、血管内皮細胞であることが好ましい。
血管を構築しうる細胞の由来としては、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞の由来として例示したものと同様のものが挙げられる。
まず、上皮系細胞2が肥厚し、間葉系細胞1側に陥入することで、間葉系細胞1及び血管を構築し得る細胞3のスフェロイドを包み込み、上皮系細胞2、間葉系細胞1及び血管を構築し得る細胞3からなる混合スフェロイド6aが形成される。続いて、混合スフェロイド6a内に置いて、上皮性細胞2は毛母原基を形成し、間葉系細胞1及び血管を構築し得る細胞3のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成する。これにより、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基6bが形成される。この毛包原基6bでは、毛乳頭が毛母原基6bに増殖因子を提供しており、毛母原基6bの分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。また、このとき、毛包原基6bの間葉系細胞側、すなわち毛乳頭の内部では、血管を構築し得る細胞3が毛細血管構造7を構築している。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基6bが分化し、毛包を形成していてもよい。
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版4は、複数の微小凹部5が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版4は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例1に記載の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版4における微小凹部5の密度は、20個/cm2以上500個/cm2以下であることが好ましく、50個/cm2以上250個/cm2以下であることがより好ましく、100個/cm2以上200個/cm2以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴(特に、ヒトを含む霊長類の毛穴)の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。後述するとおり、この規則的な配置且つ高密度の毛包原基をそのままの配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植することで、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。また、複数の再生毛包原基の上記密度は、移植に用いた場合における治療的に有効量であると考えられる。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む混合細胞集塊(以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。)を収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、20μm以上1mm以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、1mm以下であってよい。
得られる毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版の微小凹部の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版の微小凹部を調製すればよい。
・FGF
本実施形態の製造方法で用いられる培地は、FGFを含むものである。
また、培地に含まれるFGFは、FGFのみからなるものであってもよく、又は、FGFを主成分とした混合物であってもよい。
FGFとして具体的には、例えば、FGF1(酸性FGF、aFGF)、FGF3、FGF2(塩基性FGF、bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10等が挙げられる。培地は、これらのFGFを1種含んでもよく、2種以上組み合わせて含んでいてもよい。
中でも、FGFとしては、FGF2(塩基性FGF、bFGF)であることが好ましい。
FGFがFGFを主成分とした混合物である場合、具体的には、例えば、多血小板血漿(Platelet Rich Plasma;PRP)等が挙げられる。
なお、本明細書において、「多血小板血漿(Platelet Rich Plasma;PRP)」とは、その一般的な意味において用いられる広い範囲の用語であり、末梢血よりも高い濃度の血小板が血漿に再懸濁されたものである。典型的には、50万個/mm3以上120万個/mm3以下の血小板を含む。
ここで、「PDGF」とは血小板由来増殖因子(Platelet derived growth factor)のことであり、血管新生、すなわち既に存在する微少血管から新たな血管を形成する作用を有する。
「TGF-β」とは、形質転換成長因子β (Transforming growth fac or β)を意味する。
「VEGF」とは、血管内皮細胞増殖因子(Vascular endothelial growth factor)を意味する。
「PF-4/β-TG」とは、血小板第4因子(platelet factor-4)/β-トロンボグロブリン(β-thromboglobulin)を意味し、ともに血小板の活性化に伴い循環血中に放出されるものである。
PRPは、FGFを含む各種成長因子を分泌することから、PRPを含む培地を用いて毛包原基を培養することで、これらの成長因子が毛包原基に作用し、優れた毛髪再生効率を達成することができる。
本実施形態の製造方法において用いられる培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分(無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン)等を含む基本培地であればよい。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。
一般的に、培地中の炭水化物(好ましくは、D-グルコース)の濃度としては、0.5g/L以上2g/Lであることが好ましい。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は0.05g/L以上1g/L以下(通常、0.1g/L以上0.75g/L以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、0.001g/L以上1g/L(通常、0.01g/L以上0.15g/L以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば0.1μg/mL以上100μg/mL以下であればよい。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば2質量%以上10質量%以下であればよい。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子(Epidermal growth factor;EGF)、インスリン様成長因子-1(Insulin-like growth factor-1;IGF-1)、マクロファージ由来成長因子(Macrophage-derived growth factor;MDGF)、血小板由来成長因子(Platelet-derived growth factor;PDGF)、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor;VEGF)等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば1ng/mL以上10μg/mL以下であればよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば1ng/mL以上10μg/mL以下であればよい。
間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地:上皮系細胞増殖用培地=1:2~2:1であることが好ましく、1:1.5~1.5~1であることがより好ましく、1:1であることがさらに好ましい。
公知の基本培地(任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモン等は不含)として具体的には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI-1640、Basal Medium Eagle(BME)、DMEM:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)、Glasgow MEM(G-MEM)等が挙げられる。
また、任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモンを含む公知の基本培地として具体的には、例えば、毛乳頭細胞増殖培地(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium;DPCGM)(Promo Cell社製)等が挙げられる。
上皮系細胞用基本培地(上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモン不含)としてより具体的には、例えば、HuMedia-KB2(クラボウ社製)、角化細胞基本培地2(Keratinocyte Basal Medium 2)(Promo Cell社製)、EpiLife(登録商標) Medium(Thermo Fisher SCIENTIFIC社製)等が挙げられる。
また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、HuMedia-KG2(クラボウ社製)、角化細胞増殖培地2(Keratinocyte Growth Medium 2)(Promo Cell社製)等が挙げられる。
間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地:上皮系細胞増殖用培地:血管内皮細胞増殖用培地=1:1:1であることが好ましい。
血管内皮細胞用基本培地(血管内皮細胞増殖因子、並びに、必要に応じて任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモン不含)としてより具体的には、例えば、EBM-2 Basal Medium(Lonza社製)、内皮細胞基本培地(Endothelial Cell Basal Medium)(Promo Cell社製)、内皮細胞基本培地2(Endothelial Cell Basal Medium2)(Promo Cell社製)等が挙げられる。
また、血管内皮細胞増殖因子、任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモンを含む血管内皮細胞増殖用培地としては、例えば、EGM2(Lonza社製)、内皮細胞増殖培地(Endothelial Cell Growth Medium)(Promo Cell社製)、内皮細胞増殖培地2(Endothelial Cell Growth Medium 2)(Promo Cell社製)等が挙げられる。
本発明の一実施形態に係る毛包組織含有シートの製造方法は、上述の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を、前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える方法である。
本実施形態の製造方法における転写工程は、マイクロ凹版の微小凹部内に形成された毛包原基を、微小凹部内に保持しながら、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程である。
また、転写工程において用いられる毛包原基の形成方法については、上述の複数の再生毛包原基の製造方法に記載の方法と同様の方法が挙げられる。
次いで、マイクロ凹版から毛包原基6を含むゲル化した生体適合性ハイドロゲル9を取り外すことで、毛包組織含有シート10が得られる。
この場合、転写工程は、内部に毛細血管構造を有する毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程である。
まず、微小凹部5内の培地8bを除去し、生体適合性ハイドロゲル9を含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲル9をゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲル9の濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば37℃のC02インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
次いで、マイクロ凹版から毛包原基6bを含むゲル化した生体適合性ハイドロゲル9を取り外すことで、毛包組織含有シート10が得られる。
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
支持体の材質としては、移植後に、毛包原基の上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。支持体の材質として具体的には、例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、及びガラス繊維等の化学繊維、並びに天然の動物繊維(生体由来の毛髪等)や植物繊維等を挙げられる。支持体の材質としてより具体的には、例えば、ナイロン糸やステンレス線等を挙げられる。
支持体の直径及び長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば、5μm以上100μm以下であってよく、20μm以上50μm以下であってよい。また、長さは、例えば、1mm以上10mm以下であってよく、4mm以上6mm以下であってよい。
本発明の一実施形態に係る複数の再生毛包原基の移植方法は、上述の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の毛包原基を、前記微小凹部の規則的な配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植する工程を備える方法である。
毛包原基は、例えば、上述の微小凹部と同様の規則的な配置である複数のチップ、ニードル、又はノズルを有するマルチピペットを用いて吸引する。次いで、被験動物の毛包欠損部に規則的な配置のまま毛包原基を移植する。規則的な配置を保つことにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。マルチピペットは手動のものでもよく、全自動のものでもよい。
なお、被験動物としては、ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
また、移植する部位としては、被験動物の真皮層内に移植することが好ましく、毛包形成及びその後の毛髪再生効率が優れることから、真皮及び皮下組織の境界面より上方とすることがより好ましい。また、移植創上端部に毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節すると、さらに被験動物の上皮系細胞との連続性を高めることができるため、好ましい。
本実施形態の毛包組織含有シートは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛包組織含有シートの大きさは、被験動物の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛包組織含有シートと移植対象部位とを固定してもよい。
一実施形態において、本発明は、治療的に有効量の上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を含む毛包再生治療剤を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、治療的に有効量の上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートを含む毛包再生治療剤を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を製造するための上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基の使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を製造するための上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートの使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症(Androgenetic Alopecia:AGA)、女子男性型脱毛症(Female Androgenetic Alopecia:FAGA)、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
本発明の一実施形態に係る毛髪再生用キットは、マイクロ凹版と、FGFと、を備える。また、前記マイクロ凹版は、規則的な配置の微小凹部を備え、且つ、酸素透過性を有する材質からなる。
前記培地としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、本実施形態の毛髪再生用キットが備える培地としては、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される1種類以上であることが好ましい。
本実施形態の毛髪再生用キットを用いて複数の再生毛包原基の製造するために、間葉系細胞及び上皮系細胞のみを用いる場合は、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地であることが好ましい。
本実施形態の毛髪再生用キットを用いて複数の再生毛包原基の製造するために、間葉系細胞、上皮系細胞及び血管を構築し得る細胞を用いる場合は、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地であることが好ましい。
前記間葉系細胞増殖用培地、前記上皮系細胞増殖用培地及び前記血管内皮系細胞増殖用培地としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記生体適合性ハイドロゲルとしては、上述の毛包組織含有シートの製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記器具として具体的には、例えば、ピンセット、マルチピペット等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、支持体を備えていてもよい。
支持体としては、上述の毛包組織含有シートの製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本発明の一実施形態に係る発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法は、以下の工程1~3を備える方法である。
工程1:間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程
工程2:培養容器に、前記候補物質に接触させた前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞、並びに、対照として前記候補物質に接触させていない間葉系細胞及び上皮系細胞をそれぞれ播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養することにより、前記培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程
工程3:前記候補物質と接触させた毛包原基において、前記対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合、前記候補物質を発毛促進物質と判断し、前記対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合、発毛抑制物質であると判断し、前記対照原基と毛幹様構造が形成された時期が同じ場合、発毛抑制物質及び発毛抑制物質のいずれでもないと判断する工程
本実施形態のスクリーニング方法を構成する各工程について、以下に詳細を説明する。
工程1は、間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程である。
間葉系細胞及び上皮系細胞としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、間葉系細胞及び上皮系細胞に加えて、さらに、血管を構築し得る細胞も同時に候補物質に接触させてもよい。
血管を構築し得る細胞としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書において、「候補物質」には、例えば、有機又は無機の化合物(特に、低分子量の化合物) 、タンパク質、ペプチド等が含まれる。
接触条件としては、特別な限定はなく、細胞混合懸濁液中の各細胞が生存可能な条件であればよい。具体的には、例えば、25℃以上40℃未満(好ましくは、37℃)の温度で、5%CO2環境下等が挙げられる。
工程2は、培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程である。
工程2として具体的には、まず、培養容器に、候補物質と接触させた間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞混合懸濁液を注入する。また、対照として、候補物質とさせていない間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞混合懸濁液も準備し、培養容器に注入する。
培養容器の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、より短時間で毛包原基を形成できることから、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム(例えば、ポリジメチルシロキサン(poly(dimethylsiloxane):PDMS)等)等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
後述の実施例に示すように、FGFの添加有無にかかわらず、培養から3日程度で毛包原基が形成される。さらに、培養を続けることで、FGFを含まない培地を用いた毛包原基では、毛幹様構造が形成されるまで培養開始から12日程度要する。これに対し、FGFを含有する培地を用いた毛包原基では、毛幹様構造が形成されるまで培養開始から8日程度と短時間で形成される。また、培養容器内というin vitro試験系において、毛包原基が毛幹様構造を形成し得ることは、今回、本発明者らが初めて見出したことである。
工程3は、前記毛包原基における毛幹様構造の形成状態から前記候補物質を発毛促進物質又は発毛抑制物質であると判断する工程である。
候補物質と接触していない毛包原基(以下、「対照毛包原基」と称する場合がある)において毛幹様構造が形成されたタイミングと比較することで、候補物質を発毛促進物質又は発毛抑制物質と判断することができる。具体的には、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合には、候補物質が発毛促進物質であると判断できる。一方、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合又は毛幹様構造が形成されていない場合、候補物質が発毛抑制物質であると判断できる。また、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基と同程度の培養日数で毛幹様構造が形成された場合には、候補物質は、発毛促進作用及び発毛抑制作用のいずれも有しないと判断できる。
1.マイクロ凹版の作製
マイクロ凹版の作製方法の概略図を図5に示す。具体的には、CADソフト(V Carve Pro 6.5)を用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計した。続いて、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した(工程(I))。この凹鋳型にエポキシ樹脂(クリスタルリジン:日新レジン社製)を流しこみ(工程(II))、1日硬化させた後(工程(III))、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した(工程(IV))。続いて、形成した凸鋳型を6cmディッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を流し込み(工程(V))、固化した(工程(VI))。続いて、離型することで、PDMSに規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版を作製した(工程(VII))。なお、マイクロ凹版のパターンデザインは、日本人の頭髪の平均毛包密度に合わせて作製した。マイクロ凹版のサイズとして具体的には、高さ1cm、2cm×2cm四方の容器の底面に直径約1mm、高さ500μmのウェルが約100ウェル/cm2の密度で配置された容器が得られた。
次に、多血小板血漿(Platelet Rich Plasma;PRP)を調製した。具体的には、まず、吸引麻酔下で妊娠マウスを開腹し、26G注射針を心臓に突き刺し、約1mLの血液をシリンジに採取した(この時、シリンジにあらかじめ血液抗凝固剤ACD-A液を0.1mL加えておいた)。なお、血液抗凝固剤ACD-A液の組成は、2.2wt%クエン酸Na、0.8wt%クエン酸2水和物及び2.2wt%グルコースである。続いて、採取した血液を1560×gで10分間遠心することで、沈殿した赤血球を除去し、上清を得た。さらに、得られた上清を2340×gで10分間遠心することで、PRPを回収した。回収したPRPと10wt%の塩化カルシウム溶液を7:1で混合し、ゲルを形成させた。形成したゲルを16100×gで10分遠心することで、活性型PRP(PRP-releasate;PRPr)溶液を回収した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
胎齢18日齢のC57BL/6マウス胎児より背部皮膚を採取し、豊島らが報告した方法(非特許文献2)を一部改変した方法を用いて、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。より具体的には、妊娠マウスC57BL/6jjclの子宮内の胎齢18日齢のマウス胎児の背部皮膚を採取し、Dispase(登録商標)II(Wako社製)による処理を4℃で30rpmの振盪条件で1時間行い、上皮層と間葉層とを分離した。次いで、上皮層は100U/mLのコラゲナーゼ(Wako社製)による処理を2時間、さらにトリプシンによる処理を10分行い、上皮系細胞を単離した。一方、間葉層は100U/mLのコラゲナーゼ(Wako社製)による処理を2時間行い、間葉系細胞を単離した。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が4×103cells/ウェルずつ(全細胞数8×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地(以下、「PRPr+」と称する場合がある)の組成は、以下の表1に示すとおりである。また、対照として、活性型PRP(PRPr)溶液を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「PRPr-」と称する場合がある)を用いて、同様に3日間培養した。培地交換は毎日行った。
培養開始から3日目に、倒立型位相差顕微鏡(IX-71、MI-IBC OLYMPUS社製)を用いて観察した。結果を図6A(PRPr+)及び図6B(PRPr-)に示す。
(2)でPRPr+又はPRPr-条件下で形成された毛包原基について、発毛に関連するマーカー遺伝子(Versican遺伝子、Nexin遺伝子、Igfbp5遺伝子及びTgfβ2遺伝子)の発現を評価した。
まず、PRPr+又はPRPr-条件下で形成された毛包原基をそれぞれ15mLチューブに回収し、各毛包原基が沈殿したら、1mLの溶液となるように上澄みの培地を除去した。次いで、1mLとなった各毛包原基を含む溶液を1.5mLマイクロチューブに移しかえた。
次いで、4℃、5000rpmで、3分間遠心した。この操作は、残存する培地を捨てるため、各毛包原基を沈殿させると同時に、遠心分離機内の予冷のために行った。次いで、上清(培地)を捨てた後、Buffer RLTを350μL加え、よくピペッティングした。次いで、ピペッティング後の溶液をQIA Shredderスピンカラムに回収し、4℃、10000rpmで、2分間遠心した。次いで、QIA Shredderスピンカラムの上部を捨て、コレクションチューブ内の溶液に70%エタノールを350μL加え、RNeasyスピンカラムに移した。次いで、4℃、10000rpmで、15秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Buffer RW1を700μL加え、4℃、10000rpmで、15秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Buffer RPEを500μL加え、4℃、10000rpmで、15秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Buffer RPEを500μL加え、4℃、10000rpmで、2分間遠心した。次いで、新しい2mLコレクションチューブに遠心後のカラムを移し、4℃、10000rpmで、1分間遠心した。これは、残存するBuffer RPEを除去するために行った。次いで、1mLマイクロチューブに遠心後のカラムを移し、RNase free waterを30μL加え、4℃、10000rpmで、1分間遠心した。次いで、遠心後のカラムが設置された1mLマイクロチューブに、再度RNase free waterを30μL加え、4℃、10000rpmで、1分間遠心し、RNA溶解液を得た。
次いで、得られたRNA溶解液のRNA濃度を測定し、それぞれ150μg/mLとなるように希釈した。次いで、RNA希釈液を65℃で、5分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。次いで、マイクロチューブに下記表2に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表2において、RNAとは、PRPr+又はPRPr-条件下で形成された毛包原基のRNA溶解液を示す。
このことから、PRPrが毛包原基の培養において毛髪再生を促進する可能性が示唆された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例1で得られたPRPr+条件下で形成された毛包原基をヌードマウス皮内にパッチ法を用いて移植した。動物の飼育及び動物実験は、横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。対照として、PRPr-条件下で形成された毛包原基についても同様に移植した。
具体的には、まず、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を行い、背部をイソジンで消毒した。次いで、Vランスマイクロメス(日本アルコン社製)を用いて、皮膚表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した。次いで、実施例1で得られたPRPr+条件下で形成された毛包原基各30個/1箇所、又はPRPr-条件下で形成された毛包原基各30個/1箇所を合計3箇所(合計90個)の移植創に挿入した。移植から3週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図8A(PRPr+)及び図8B(PRPr-)に示す。
以上のことから、多血小板血漿を含む培地で培養した毛包原基が高い毛包誘導能を有することが示された。
続いて、PRPr内に豊富に含まれる毛髪再生因子である線維芽細胞成長因子2(Fibroblast Growth Factor 2;FGF2)に着目し、毛包原基への添加による毛包誘導能の向上について検討した。なお、FGF2は、脱毛症治療法の一つであるHARG治療にも用いられている。また、一般的に、PRPr中にFGF2は250ng/mL程度含まれており、実施例1で毛包原基の形成時に使用された培地中のFGF2濃度は約15ng/mLであった。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
続いて、96ウェルマイクロプレート(住友ベークライト社製、Primesurface(登録商標) 96U Plate)に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1.5×103cells/ウェルずつ(全細胞数3×103cells/ウェル)となるように注入し、培養した。使用した培地(以下、「FGF2+」と称する場合がある)の組成は、以下の表5に示すとおりである。また、対照として、繊維芽細胞成長因子2(FGF2)を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「FGF2-」と称する場合がある)を用いて、同様に培養した。培地交換は2~3日おきに行った。
培養開始から毎日、倒立型位相差顕微鏡(IX-71、MI-IBC OLYMPUS社製)を用いて観察した。結果を図10に示す。図10において、FGF2不含培地を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞については、培養23日目の顕微鏡像を示す。一方、FGF2含有培地を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞については、培養10日目の顕微鏡像を示す。
その後、FGF2+条件下で形成された毛包原基では、培養8日目に毛幹様構造の形成が観察された。一方、FGF2-条件下で形成された毛包原基では、培養12日目に同様の毛幹様構造の形成が観察された。
以上のことから、in vitro試験系において、FGF2の添加により毛包原基での毛髪再生が促進され、早期に毛幹様構造が観察されたと考えられる。in vitro試験系において、この毛包原基での毛幹様構造の形成は、非常に興味深い現象である。よって、発毛因子であるFGFにより毛幹様構造の形成が促進されたことから、発毛剤の評価ツール等、発毛促進作用又は発毛抑制作用を有する候補化合物のスクリーニングへの応用も期待できる。
(2)でFGF2+又はFGF2-条件下で形成された毛包原基(培養10日目)について、発毛に関連するマーカー遺伝子(Versican遺伝子及びTgfβ2遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(4-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、FGF2+条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNA、及びFGF2-条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子、Tgfβ2遺伝子及びGAPDH遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。結果を図11に示す。
このことから、FGF2が毛包原基の培養において毛髪再生を促進する可能性が示唆された。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
次に、多血小板血漿(不活性型PRP)(以下、単に、「PRP」と称する場合がある)を調製した。具体的には、まず、吸引麻酔下で妊娠マウスを開腹し、26G注射針を心臓に突き刺し、約1mLの血液をシリンジに採取した(この時、シリンジにあらかじめ血液抗凝固剤ACD-A液を0.1mL加えておいた)。なお、血液抗凝固剤ACD-A液の組成は、2.2wt%クエン酸Na、0.8wt%クエン酸2水和物及び2.2wt%グルコースである。続いて、採取した血液を1560×gで10分間遠心することで、沈殿した赤血球を除去し、上清を得た。さらに、得られた上清を2340×gで10分間遠心することで、PRP(不活性型PRP)を回収した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が4×103cells/ウェルずつ(全細胞数8×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表6に示すとおりである。また、対照として、多血小板血漿溶液を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「PRP-」又は「PRP-(0%)」と称する場合がある)を用いて、同様に3日間培養した。培地交換は毎日行った。
培養開始から3日目に、倒立型位相差顕微鏡(IX-71、MI-IBC OLYMPUS社製)を用いて観察した。結果を図12に示す。
(2)においてPRP+(5%)条件下で形成された組織体又はPRP-条件下で形成された毛包原基(培養3日目)について、発毛に関連するマーカー遺伝子(Versican遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(4-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、PRP+(5%)条件下で形成された組織体のRNAの逆転写産物であるcDNA、及び、PRP-条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子及びGAPDH遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。結果を図13に示す。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
実施例1の「2.」と同様の方法を用いて、多血小板血漿(活性型PRP(PRPr))溶液を調製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が4×103cells/ウェルずつ(全細胞数8×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表7に示すとおりである。また、対照として、FGF2を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「FGF2-/PRPr-」と称する場合がある)、及び、FGF2を含有せず、活性型PRP溶液と間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを表7に示す混合比で混合した培地(以下、「FGF2-/PRPr+」と称する場合がある)を用いて、同様に3日間培養した。培地交換は毎日行った。
(2)において各条件下で形成された毛包原基(培養3日目)について、発毛に関連するマーカー遺伝子(Versican遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(3-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、各条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子及びGAPDH遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。結果を図14(FGF2+のみ)及び図15(FGF2-/PRPr-、FGF2-/PRPr+及びFGF2+(10ng/mL))に示す。なお、図14及び図15において、「Vcan」とは、Versicanの略称である。
また、図15から、FGF2+(10ng/mL)条件下で培養した毛包原基は、FGF2-/PRPr+条件下で培養した毛包原基よりもVersican遺伝子の発現が高く、3倍以上の発現量であった。
以上のことから、PRPrに含まれる含有成分のうち、FGF2が毛包再生の促進への寄与が高いことが示唆された。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
実施例1の「2.」と同様の方法を用いて、多血小板血漿(活性型PRP(PRPr))溶液を調製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
RFP遺伝子導入ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(RFP-HUVEC)(以下、単に「血管内皮細胞」と称する場合がある。)はコンフルエントになるまで培養しておいた。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、上皮系細胞、間葉系細胞及び血管内皮細胞の細胞混合懸濁液を、上皮系細胞及び間葉系細胞がそれぞれ4×103cells/ウェルずつ、並びに、血管内皮細胞が1×103cells/ウェル(全細胞数9×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表8に示すとおりである。また、対照として、FGF2を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「FGF2-/PRPr-」と称する場合がある)、及び、FGF2を含有せず、活性型PRP溶液と間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを表8に示す混合比で混合した培地(以下、「FGF2-/PRPr+」と称する場合がある)を用いて、同様に3日間培養した。培地交換は毎日行った。
培養開始から3日目に、倒立型蛍光顕微鏡(DP-71、OLYMPUS社製)を用いて観察した。結果を図16に示す。
(3)において各条件下で形成された毛包原基(培養3日目)について、発毛に関連するマーカー遺伝子(Versican遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(5-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、各条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子及びGAPDH遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。結果を図17に示す。
マウス胎児から採取された細胞では毛髪再生能が高く、成体に成長するほどその能力が落ちることが報告されている。そこで、マウス成体から採取された細胞を用いて、毛包原基を製造する場合でのFGFの添加量を検討した。
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
豊島らが報告した方法(非特許文献2)を一部改変した方法を用いて、成体マウスの顎鬚毛包から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1×104cells/ウェルずつ(全細胞数2×104cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表9に示すとおりである。また、対照として、FGF2を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを1:1で混合した培地(以下、「FGF2-」と称する場合がある)を用いて、同様に3日間培養した。培地交換は毎日行った。
(2)において各条件下で形成された毛包原基(培養3日目)について、毛髪再生効率の指標であって、間葉系細胞のマーカー遺伝子である(Versican遺伝子)、及び、毛髪再生効率の指標であって、上皮系細胞のマーカー遺伝子(Wnt10b遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(3-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、各条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子のプライマー、及び、以下の表10に示すWnt10b遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。代表的な結果として、10ng/mL、50ng/mL及び100ng/mLのFGF2条件下で培養した毛包原基での各遺伝子の相対的な発現量を図18に示す。なお、図18において、「Vcan」とは、Versicanの略称である。
また、図18から、FGF2+(100ng/mL)条件下で培養した毛包原基は、FGF2+(10ng/mL)条件下で培養した毛包原基よりもVersican遺伝子及びWnt10b遺伝子の発現が高く、3倍以上の発現量であった。
以上のことから、成体から採取された細胞を用いた場合には、FGF2をより多く添加することが有効であることが示唆された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例5で得られた毛包原基のうち、FGF2+(10ng/mL及び100ng/mL)条件下で形成された毛包原基をそれぞれヌードマウス皮内に、試験例1と同様に、パッチ法を用いて移植した。対照として、FGF2-(0ng/mL)条件下で形成された毛包原基についても同様に移植した。
移植から3週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図19に示す。
また、図示しないが、実施例5と同様の方法を用いて、FGF2+(200ng/mL)条件下で形成された毛包原基をヌードマウス皮内に移植した結果、毛髪の再生が確認された。
PRPr中には、FGF以外にも各種サイトカインが含まれることが知られている。そこで、FGFの代わりに、PDGF又はVEFGを添加した培地を用いて、毛包原基を製造する場合でのマーカー遺伝子の発現量を検討した。
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が4×103cells/ウェルずつ(全細胞数8×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成としては、間葉系細胞培養培地(DMEM+10%FBS+1%P/S)と上皮系細胞培養培地(HuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製))とを1:1で混合した培地に、FGF、PDGF又はVEGFをそれぞれ0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL又は100ng/mLとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。
(2)において各条件下で形成された毛包原基(培養3日目)について、毛髪再生効率の指標であって、間葉系細胞のマーカー遺伝子である(Versican遺伝子)、及び、毛髪再生効率の指標であって、上皮系細胞のマーカー遺伝子(Wnt10b遺伝子)の発現を評価した。
実施例1の(4-1)と同様の方法を用いて、RNA溶解液を調製した。
(3-1)で得られたRNA溶解液について、実施例1の(4-2)と同様方法を用いて、RT-PCRを行い、各条件下で形成された毛包原基のRNAの逆転写産物であるcDNAをそれぞれ得た。得られたcDNAについて、上記表3に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表4に示すVersican遺伝子のプライマー、及び、上記表10に示すWnt10b遺伝子のプライマーを用いて、PCRを行った。結果を図20A~20Eに示す。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞の準備及び上皮系細胞の採取
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から上皮系細胞を採取した。間葉系細胞として、ヒト毛乳頭細胞(PromoCell社製)を用いた。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が4×103cells/ウェルずつ(全細胞数8×103cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成としては、ヒト毛乳頭細胞増殖培地(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium;DPCGM)(Promo cell社製)と上皮系細胞培地(HuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製))とを1:1で混合した培地に、FGFを10ng/mLとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から3日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例7で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例1と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から18日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図21に示す。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
間葉系細胞として、ヒト毛乳頭細胞(PromoCell社製)を用いた。また、上皮系細胞として、ヒト表皮ケラチノサイト(CELLnTEC社製)を用いた。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1×104cells/ウェルずつ(全細胞数2×104cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成としては、DPCGM(Promo cell社製)と上皮系細胞培地(HuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製))とを1:1で混合した培地に、FGFを10ng/mLとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から3日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例8で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例1と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から14日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図22に示す。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
実施例1の「3.(1)」と同様の方法を用いて、マウス胎児から上皮系細胞を採取した。ヒト脱毛症患者から承諾を得て、ヒト脱毛症患者の正常頭皮片を採取し、当該正常頭皮片から毛乳頭細胞を分離し、間葉系細胞として用いた。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1×104cells/ウェルずつ(全細胞数2×104cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成としては、DPCGM(Promo cell社製)と上皮系細胞培地(HuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製))とを1:1で混合した培地に、FGFを100ng/mLとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から3日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例9で得られた毛包原基をそれぞれヌードマウス皮内に、試験例1と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から16日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図23Aに、移植から50日後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図23Bに示す。
また、移植から50日後のヌードマウスの移植部に再生された毛髪の電子顕微鏡像を図23Cに示す。図23Cから、再生毛髪は、ヒト生体の毛髪と類似したキューティクル構造を有することが確認された。
さらに、移植から13日目、50日目、60日目及び78日目までのヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図23Dに示す。図23Dから、移植部において、移植から少なくとも78日目まで毛周期が維持されることが確認された。
以上のことから、脱毛症患者の正常頭皮由来の毛乳頭細胞を用いても、毛髪が再生できることが確かめられた。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
ヒト脱毛症患者から承諾を得て、ヒト脱毛症患者の正常頭皮片を採取し、当該正常頭皮片から毛乳頭細胞及び表皮ケラチノサイトを分離し、それぞれ間葉系細胞及び上皮系細胞として用いた。
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1×104cells/ウェルずつ(全細胞数2×104cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。使用した培地の組成としては、DPCGM(Promo cell社製)と上皮系細胞培地(HuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製))とを1:1で混合した培地に、FGFを100ng/mLとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から3日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。
(1)ヌードマウスへの皮下移植
実施例10で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例1と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から30日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図24に示す。
以上のことから、脱毛症患者の正常頭皮由来の毛乳頭細胞及び表皮ケラチノサイトを用いても、毛髪が再生できることが確かめられた。
Claims (15)
- 規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む細胞混合懸濁液を注入することにより前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記細胞混合懸濁液に含まれる前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞を前記線維芽細胞増殖因子を含む培地中で凝集させて、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる複数の再生毛包原基の製造方法。 - 前記毛包原基形成工程において、さらに、血管を構築しうる細胞を前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞と同時に播種する請求項1に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 前記血管を構築しうる細胞が血管内皮細胞である請求項2に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項1~3のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 前記培地中の前記線維芽細胞増殖因子の含有量が1ng/mL以上200ng/mL以下である請求項1~4のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 前記培地が前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を含む請求項1~5のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える毛包組織含有シートの製造方法。
- 前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である請求項7に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
- 前記生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンである請求項7又は8に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の方法に用いるための毛髪再生キットであって、
規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版と、
線維芽細胞増殖因子と、
を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる毛髪再生用キット。 - さらに、培地を備える請求項10に記載の毛髪再生用キット。
- 前記培地が間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される1種類以上である請求項11に記載の毛髪再生用キット。
- 前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項10~12のいずれか一項に記載の毛髪再生用キット。
- 前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を備える請求項10~13のいずれか一項に記載の毛髪再生用キット。
- 間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程1と、
培養容器に、前記候補物質に接触させた前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞を含む細胞混合懸濁液、並びに、対照として前記候補物質に接触させていない間葉系細胞及び上皮系細胞を含む細胞混合懸濁液をそれぞれ播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養することにより、前記細胞混合懸濁液に含まれる前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞を前記線維芽細胞増殖因子を含む培地中で凝集させて、前記培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程2と、
前記候補物質と接触させた毛包原基において、前記対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合、前記候補物質を発毛促進物質と判断し、前記対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合、発毛抑制物質であると判断し、前記対照原基と毛幹様構造が形成された時期が同じ場合、発毛抑制物質及び発毛抑制物質のいずれでもないと判断する工程3と、
を備える発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法。
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