JP7083866B2 - Skin model - Google Patents
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Description
本願に係る発明は皮膚モデルに関する。 The invention according to the present application relates to a skin model.
皮膚は人体が外気と接する表層から順に表皮、真皮、皮下組織の３層から構成されている。表皮は、ケラチノサイト（角化細胞）という細胞からなり、真皮に近い深部から基底層、有棘層、顆粒層、角質層に分類される。表皮では***によりケラチノサイトが基底層から角層に向けて押し上げられ、表層から順にいわゆる垢として剥がれ落ちる。 The skin is composed of three layers, the epidermis, the dermis, and the hypodermis, in order from the surface layer where the human body comes into contact with the outside air. The epidermis consists of cells called keratinocytes (keratinocytes), and is classified into the basal layer, the stratum spinosum, the stratum granulosum, and the stratum corneum from the deep part near the dermis. In the epidermis, keratinocytes are pushed up from the basal layer toward the stratum corneum by division, and peel off as so-called dirt in order from the surface layer.
真皮は表皮に近い乳頭層と、それより深部に存在する網状層に分類される。乳頭層は主としてコラーゲンから構成される膠原線維とエラスチンから構成される弾性線維、その他の細胞外マトリックス成分を含む。網状層は乳頭層よりも厚く、真皮の大部分を占める層である。網状層もコラーゲンから構成される膠原線維とエラスチンから構成される弾性線維を含むが、乳頭層の膠原線維よりも太く、乳頭層の弾性線維よりも成熟している。 The dermis is classified into the papillary layer near the epidermis and the reticular layer deeper than it. The papillary layer contains collagen fibers composed primarily of collagen, elastic fibers composed of elastin, and other extracellular matrix components. The reticular layer is thicker than the papillary layer and occupies most of the dermis. The reticular layer also contains collagen fibers composed of collagen and elastic fibers composed of elastin, but is thicker than the collagen fibers of the papillary layer and more mature than the elastic fibers of the papillary layer.
乳頭層の上層部には表皮に向けて突出した真皮乳頭突起が形成されている。この真皮乳頭突起の間に表皮層が入り込み、表皮と真皮の間で、真皮層の乳頭層と表皮層が相互にかみ合った凹凸構造が形成されている。 A dermal papilla process protruding toward the epidermis is formed in the upper part of the papillary layer. The epidermis layer is inserted between the papillary lines of the dermis, and an uneven structure is formed between the epidermis and the dermis in which the papillary layer and the epidermis layer of the dermis are meshed with each other.
真皮と表皮の間は基底膜で隔てられているが、真皮と表皮の間では真皮乳頭突起を介してシグナル伝達、老廃物や栄養の輸送などの物質輸送が行われ、真皮と表皮がかみ合うことによって外部からの物理的刺激の緩和作用があるとされる。真皮乳頭突起は加齢や紫外線によって平坦化することが知られているだけでなく（非特許文献１）、皮膚状態（角層水分量、経表皮水分蒸散量、角層細胞面積、皮膚色）と真皮乳頭突起の形状に関連があることも報告されている（特許文献１）。従って、真皮乳頭突起の平坦化が皮膚性状変化の一因であると考えられ、皮膚の状態を正常に保つためには、真皮乳頭突起を適切に維持することが重要と考えられる。一方で、加齢や紫外線のみならず、疾患による真皮乳頭突起の形状変化も存在する。乾癬では真皮乳頭突起が過剰に形成され、光線角化症では真皮乳頭突起は縮小あるいは消失すると言われる（非特許文献２）。さらには、真皮乳頭突起が形成される真皮上においてケラチノサイトの***により表皮が形成されることに鑑み、真皮乳頭突起の形成が生体に近い人工皮膚の作製にも重要であると考えられる。人工皮膚は火傷、外傷など損傷を受けた皮膚の代替または再生のために利用されており、再生医療にとっても、より生体に近い人工皮膚の製造が課題といえる。これらのことから真皮乳頭突起に関する研究を行うための適切な皮膚モデルが必要とされている。 The dermis and epidermis are separated by a basement membrane, but between the dermis and the epidermis, signals are transmitted via the papillary line of the dermis, and substances such as waste products and nutrients are transported, and the dermis and the epidermis engage with each other. It is said that it has a relaxing effect on physical stimuli from the outside. Not only is it known that the papillary line of the dermis is flattened by aging and ultraviolet rays (Non-Patent Document 1), but also the skin condition (water content of the stratum corneum, water evaporation of the transepidermal layer, cell area of the stratum corneum, skin color). It has also been reported that it is related to the shape of the papillary line of the dermis (Papillary Document 1). Therefore, it is considered that the flattening of the dermal papilla process is one of the causes of the change in skin properties, and it is important to properly maintain the dermis papilla process in order to maintain the normal skin condition. On the other hand, not only aging and ultraviolet rays, but also changes in the shape of the dermal papilla process due to diseases exist. It is said that in psoriasis, the dermal papilla process is excessively formed, and in actinic keratosis, the dermal papilla process shrinks or disappears (Non-Patent Document 2). Furthermore, considering that the epidermis is formed by the division of keratinocytes on the dermis where the papillary process of the dermis is formed, it is considered that the formation of the papillary line of the dermis is also important for the production of artificial skin close to the living body. Artificial skin is used to replace or regenerate damaged skin such as burns and trauma, and it can be said that the production of artificial skin closer to a living body is an issue for regenerative medicine. From these facts, an appropriate skin model for conducting research on the papillary process of the dermis is needed.
これまでにもヒトの皮膚を模した種々の皮膚モデルが提案されている。これらの中で、皮膚組織から表皮の細胞層を取り除き作製された平坦な無細胞のヒト由来の培養基材を用いたモデルがあり、この基材上でケラチノサイトを培養した時に真皮乳頭突起が形成されることを示唆する観察像の報告がある（非特許文献３）。しかしながら、該報告は皮膚モデルにおける角層剥離過程の特徴を明らかにすることを目的としたもので、真皮乳頭突起を研究対象としたものではなく、上記皮膚モデルに発現する細胞増殖マーカー（Ｋｉ－６７）、細胞分化マーカー（Ｋｅｒａｔｉｎ１、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）の解析については述べられているものの、真皮乳頭突起の形成について何ら述べられておらず、当然、真皮乳頭突起形成の再現性についても言及されていない。仮に皮膚組織由来の基盤を用いて真皮乳頭突起形成皮膚モデルが作成できたとしても、ヒトの皮膚組織から培養基材を作製する必要があるのでこの培養基材を大量に得ることは供給面で困難であり、入手容易な素材（物質）から簡便に作製し得る培養基材が望まれる。 Various skin models that imitate human skin have been proposed so far. Among these, there is a model using a flat, cell-free human-derived culture substrate prepared by removing the cell layer of the epidermis from the skin tissue, and dermal papilla protrusions are formed when keratinocytes are cultured on this substrate. There is a report of an observation image suggesting that this is done (Non-Patent Document 3). However, the report aims to clarify the characteristics of the stratum corneum peeling process in the skin model, not the dermal papillary line, but the cell proliferation marker (Ki-) expressed in the skin model. 67) Although the analysis of cell differentiation markers (Keratin1, Loriclin) is described, nothing is described about the formation of dermal papilla, and of course, the reproducibility of dermal papilla formation is not mentioned. Even if a dermal papilla projection-forming skin model can be created using a skin tissue-derived substrate, it is necessary to prepare a culture medium from human skin tissue, so obtaining a large amount of this culture medium is a supply aspect. A culture medium that is difficult and can be easily prepared from easily available materials (substances) is desired.
ケラチノサイトの培養基材として一般的にはコラーゲンが広く用いられる。コラーゲンは動物の皮膚、骨、髄血管の壁などに多く含まれている線維状のタンパクである。コラーゲンはそのタイプによっても性質が異なるが、ケラチノサイトの培養基材として主に使用されるのはＩ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは低温かつ酸性条件で可溶化されているが、体温及び中性ｐＨに応答して自己組織化してナノ線維を形成し、線維の絡み合いによるゲルを形成する。コラーゲンが含まれる基材上に形成された皮膚モデルは数多く知られているが（例えば、特許文献２や３）、これらのモデルではいずれも培養されて得られたケラチノサイトの細胞層は平坦であって、これらのモデルは実際の皮膚で見られるような真皮乳頭突起様の突起部を備えた皮膚モデルではない。
Collagen is generally widely used as a culture medium for keratinocytes. Collagen is a fibrous protein that is abundant in animal skin, bones, and walls of medullary blood vessels. Collagen has different properties depending on its type, but type I collagen is mainly used as a culture medium for keratinocytes. Although type I collagen is solubilized at low temperature and under acidic conditions, it self-assembles in response to body temperature and neutral pH to form nanofibers, forming a gel due to the entanglement of the fibers. Many skin models formed on a substrate containing collagen are known (for example,
また、コラーゲンにマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ：登録商標）を混合後、架橋処理して得られた培養基材上でケラチノサイトを培養して得られた皮膚モデルも知られている（非特許文献４）。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性成分からなる調製品（市販品）である。マトリゲルは、主成分であるラミニンの他、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ニドゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ；Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）タンパクと数々の成長因子など、基底膜に含まれる成分を多量に含む。非特許文献４では、０.１４ｗ／ｖ％のコラーゲンと０.５ｗ／ｖ％のマトリゲルを含む混合物に架橋剤を加えて反応させることで、熱安定性が向上したケラチノサイト培養に適した培養基材が得られている。しかしながら、ここにも、真皮乳頭突起様の凸状部を有する培養基材上にケラチノサイト層が培養されたとの記載やその旨の示唆はなく、当該培地でケラチノサイトを実際に培養しても、真皮乳頭突起様の凸状部が形成できなかった（本願明細書実施例中試験例９参照）。 In addition, a skin model obtained by culturing keratinocytes on a culture substrate obtained by mixing collagen with Matrigel (registered trademark) and then cross-linking the cells is also known (Non-Patent Document 4). Matrigel is a preparation (commercially available) consisting of soluble components extracted from Angelbreth-Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma. In addition to laminin, which is the main component, Matrigel contains a large amount of components contained in the basement membrane such as extracellular matrix (ECM) proteins such as type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and nidogen, and various growth factors. In Non-Patent Document 4, a culture medium suitable for keratinocyte culture in which thermal stability is improved by adding a cross-linking agent to a mixture containing 0.14 w / v% collagen and 0.5 w / v% matrigel and reacting them. The material is obtained. However, there is no description or suggestion that the keratinocyte layer was cultured on the culture substrate having the convex portion like the papillary line of the dermis, and even if the keratinocyte is actually cultured in the medium, the dermis A convex portion like a papillary protrusion could not be formed (see Test Example 9 in Examples of the present specification).
一方、マトリゲルを用いて得られた培養基材上で、ある種の腎細胞（ＭＤＣＫ Ｃｅｌｌ）を培養したところ、架橋剤の処理を少なくした場合にはチューリップハット状に細胞層が形成されやすく、得られたチューリップハット状の突起内部にはマトリゲルが存在し、添加する架橋剤の量を増やすと細胞層が平坦化したとの報告がある（非特許文献５）。しかしながら、マトリゲル及びその架橋物上でケラチノサイトを実際に培養しても、チューリップハット状に細胞層が形成されることはなかった（本願明細書実施例中試験例２参照）。また、非特許文献５では、添加する架橋剤の量を増やすと細胞層が平坦化されたことが示されており、架橋の程度を増す、あるいは、マトリゲルのような基底膜マトリックス調製物に当該調製物単独よりも粘度を増すような素材を添加する、すなわち非特許文献５で論じられているところのｖｉｓｃｏｓｉｔｙを上げるような処置を施すことで、細胞がチューリップハット状構造を形成する可能性については、全く予想できなかった。 On the other hand, when certain renal cells (MDCK Cell) were cultured on a culture substrate obtained using Matrigel, a tulip hat-like cell layer was likely to be formed when the treatment with a cross-linking agent was reduced. It has been reported that Matrigel was present inside the obtained tulip hat-shaped protrusions, and that the cell layer was flattened when the amount of the cross-linking agent added was increased (Non-Patent Document 5). However, even when keratinocytes were actually cultured on Matrigel and its crosslinked product, a tulip hat-like cell layer was not formed (see Test Example 2 in Examples of the present specification). Further, Non-Patent Document 5 shows that the cell layer was flattened by increasing the amount of the cross-linking agent added, and the degree of cross-linking was increased, or the basement membrane matrix preparation such as Matrigel was used. Regarding the possibility that cells form a tulip hat-like structure by adding a material having a higher viscosity than the preparation alone, that is, by performing a treatment for increasing the viscosity as discussed in Non-Patent Document 5. Was totally unpredictable.
本願発明の課題は、上記の技術背景に鑑みてなされたものであって、真皮乳頭突起様の突起部を有する新たな皮膚モデルを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a new skin model having a dermal papilla-like protrusion, which has been made in view of the above technical background.
本願発明に係る皮膚モデルは、基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの架橋体を含むゲル状の培養基材と、当該培養基材の表面に形成されたケラチノサイトの細胞層を備え、前記培養基材はその表面から突出した１以上の凸状部を有し、当該凸状部の表面の少なくとも一部にケラチノサイトの細胞層を備えている。 The skin model according to the present invention comprises a gel-like culture medium containing a crosslinked product of protein and fibrous collagen in a basement membrane matrix preparation, and a cell layer of keratinocytes formed on the surface of the culture medium. The culture medium has one or more convex portions protruding from the surface thereof, and has a cell layer of keratinocytes on at least a part of the surface of the convex portions.
本願発明によると従来の皮膚モデルに比べてヒトの皮膚により近い構造を有する皮膚モデルが提供される。これによって、真皮乳頭突起の消失に影響を与える因子等を探索でき得る。また、当該皮膚モデル形成の可否から、真皮乳頭突起の形成に影響を与える因子等を探索できる可能性が得られる。 According to the present invention, there is provided a skin model having a structure closer to that of human skin as compared with a conventional skin model. This makes it possible to search for factors that affect the disappearance of the papillary line of the dermis. In addition, it is possible to search for factors that affect the formation of the dermal papilla process, depending on whether or not the skin model can be formed.
本願発明に係る皮膚モデルは培養基材と当該培養基材の表面に形成されたケラチノサイトの細胞層を備え、培養基材はその表面から突出した凸状部を有し、ケラチノサイトの細胞層はその凸状部の表面の少なくとも一部を覆うようにして形成されている。 The skin model according to the present invention comprises a culture medium and a cell layer of keratinocytes formed on the surface of the culture medium, the culture medium has a convex portion protruding from the surface, and the cell layer of keratinocytes thereof. It is formed so as to cover at least a part of the surface of the convex portion.
培養基材は、当該基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの架橋体を含むゲル状の培養基材である。本願発明において用語「基底膜マトリックス調製物」とは、基底膜を構成する成分を多量に含む組成物を意味する。基底膜は、動物の組織において上皮細胞層と間質細胞層の間や、筋細胞・脂肪細胞及び神経組織の周囲に見られる薄い膜状をした細胞外マトリックスで構成される構造体である。動物種やその存在場所によってその組成は異なるものの、基底膜は、水分を除けば主な成分として、タンパクであるヘパラン硫酸プロテオグリカン、コラーゲンＩＶ（ＩＶ型コラーゲン）などの非線維型コラーゲン，ラミニン，ニドゲンを含み、これら以外にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンやトロンボスポンジン，ヒアルロン酸，フィブロネクチンといったタンパクや糖類を含む。本願発明では基底膜マトリックス調製物として、動物組織である基底膜から調製された調製物が用いられ得るが、基底膜に含まれる成分を多量に含まれるとされるＥＨＳマウス肉腫から調製された組成物である基底膜マトリックス調製物が好ましく使用され得る。基底膜マトリックス調製物の調製方法は特に限定されないが、例えばホモゲナイズしたＥＨＳマウス肉腫から集めた不溶性沈殿物から尿素を含む緩衝液を用いて尿素可溶性画分を得た後透析する方法が挙げられる（参考：ｈｔｔｐ：／／ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ２.ａｇｒ.ｎａｇｏｙａ－ｕ.ａｃ.ｊｐ／ＥＨＳ.ｈｔｍｌ）。また、この方法で得られる基底膜マトリックス調製物の他、ＥＨＳマウス肉腫から調製された各種の市販調製品、例えば、商品名「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」（登録商標：コーニング社製）や同「Ｇｅｌｔｒｅｘ」（登録商標：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、同「Ｃｕｌｔｒｅｘ」（登録商標：トレビゲン社製）なども好適に用いられる。もっとも、動物組織に存在する基底膜であれば動物種を限ることなく使用することができる。調製方法も上記例示方法に限定されず、各種の酵素処理、破砕、抽出、精製等の処理を行うことで調製した基底膜マトリックス調製物を用いることも可能である。 The culture substrate is a gel-like culture substrate containing a crosslinked product of protein and fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation. In the present invention, the term "basement membrane matrix preparation" means a composition containing a large amount of components constituting the basement membrane. The basement membrane is a structure composed of a thin membrane-like extracellular matrix found between epithelial cell layers and stromal cell layers in animal tissues and around muscle cells / adipocytes and nerve tissues. Although its composition varies depending on the animal species and its location, the basal membrane is composed of the proteins heparan sulfate proteoglycan, non-fibronectin such as collagen IV (type IV collagen), laminin, and nidgen as the main components except for water. In addition to these, it contains proteins and sugars such as chondroitin sulfate proteoglycan, thrombospondin, hyaluronic acid, and fibronectin. In the present invention, as the basement membrane matrix preparation, a preparation prepared from the basement membrane, which is an animal tissue, can be used, but a composition prepared from EHS mouse sarcoma, which is said to contain a large amount of components contained in the basement membrane. Basement membrane matrix preparations are preferably used. The method for preparing the basal membrane matrix preparation is not particularly limited, and examples thereof include a method of obtaining a urea-soluble fraction from an insoluble precipitate collected from homogenized EHS mouse sarcoma using a buffer solution containing urea and then dialysis (the method). Reference: http: //precipitation2.agr.nagoya-u.ac.jp/EHS.html). In addition to the basement membrane matrix preparation obtained by this method, various commercially available preparations prepared from EHS mouse sarcoma, such as the trade name "Matrigel" (registered trademark: Corning) and the same "Geltrex" (registered). Trademarks: Thermo Fisher Scientific (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), "Cultrex" (registered trademark: manufactured by Trevigen Co., Ltd.) and the like are also preferably used. However, any basement membrane present in animal tissue can be used without limitation. The preparation method is not limited to the above-mentioned exemplary method, and it is also possible to use a basement membrane matrix preparation prepared by performing various treatments such as enzyme treatment, crushing, extraction, and purification.
本願発明に係る培養基材は、上記の基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンで架橋された架橋体を含むゲル状物であって、実施例に記載の方法で測定した物性値が１０.５Ｐａ・ｓ以上３０.０Ｐａ・ｓ以下である。物性値が３０.０Ｐａ・ｓを越える場合や１０.５Ｐａ・ｓに満たない場合には、培養基材には凸状部が形成されず培養されたケラチノサイトの細胞層は平坦になる傾向にある。培養基材はゲル状、すなわち基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンが架橋体を構成することで培養基材全体が流動性を失った状態のものであり、好ましくは人工皮膚として使用できるように培養基材を作製した培養容器や支持体から剥離できる状態のものである。 The culture substrate according to the present invention is a gel-like substance containing a crosslinked product cross-linked with the protein and fibrous collagen in the above-mentioned basement membrane matrix preparation, and the physical property values measured by the method described in Examples are measured. It is 10.5 Pa · s or more and 30.0 Pa · s or less. When the physical characteristic value exceeds 30.0 Pa · s or less than 10.5 Pa · s, the convex portion is not formed on the culture substrate and the cell layer of the cultured keratinocyte tends to be flat. .. The culture substrate is in the form of a gel, that is, a state in which the protein in the culture medium matrix preparation and fibrous collagen form a crosslinked body, so that the entire culture substrate loses fluidity, and is preferably used as artificial skin. It is in a state where it can be peeled off from the culture vessel or support in which the culture medium is prepared so that it can be removed.
コラーゲンはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲンなど各種の型があり、Ｉ型コラーゲンやＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンなどの線維型コラーゲンと、ＩＶ型コラーゲンなどの非線維型コラーゲンに大別される。本願発明においてはこれらのコラーゲンのうち、Ｉ型コラーゲンやＩＩ型コラーゲンなどの線維型コラーゲンが好ましく用いられる。線維型であれば由来を問わず、各種動物（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類）の真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などに由来したコラーゲン、植物や微生物が生産するコラーゲン、人工的に製造された合成品でもあり得る。 There are various types of collagen such as type I collagen, type II collagen, type III collagen, and type VI collagen. Fibrous collagen such as type I collagen, type II collagen, and type III collagen, and non-fibrous type such as type IV collagen. It is roughly divided into collagen. Of these collagens, fibrous collagen such as type I collagen and type II collagen is preferably used in the present invention. Collagen derived from dermis, ligaments, tendons, bones, cartilage, etc. of various animals (mammals, birds, reptiles, amphibians, fish) regardless of origin, collagen produced by plants and microorganisms, artificially It can also be a manufactured synthetic product.
培養基材に含まれる架橋体は、基底膜マトリックス調製物中のタンパクや線維型コラーゲンが有するアミン基やチオール基，カルボニル基，カルボキシル基などが架橋剤と化学反応を起こして生じたものである。基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの架橋体は、基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの架橋体のみならず、線維型コラーゲンと線維型コラーゲンの架橋体や、基底膜マトリックス調製物中のタンパクと基底膜マトリックス調製物中のタンパクの架橋体を含み得るが、得られる架橋体の具体的な構成は特定できず、おそらくはその全ての架橋体を含み得る。 The crosslinked product contained in the culture substrate is formed by chemically reacting the amine group, thiol group, carbonyl group, carboxyl group, etc. of the protein and fibrous collagen in the base membrane matrix preparation with the crosslinking agent. .. The crosslinked product of protein and fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation is not only the crosslinked product of protein and fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation, but also the crosslinked product of fibrous collagen and fibrous collagen and the basement membrane. It may contain cross-links of the protein in the matrix preparation and the protein in the basement membrane matrix preparation, but the specific composition of the resulting cross-links cannot be specified and may include all of them.
用いられる架橋剤の種類も特に限られるものではなく、例えば、グルタルアルデヒドやホルムアルデヒド，Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド，天然物由来のゲニピンなどが用いられ得る。架橋反応は、各架橋剤に応じて反応条件が選択され、架橋処理されて得られる培養基材の物性値が上記物性値の範囲となるように設定される。 The type of the cross-linking agent used is not particularly limited, and for example, glutaraldehyde, formaldehyde, N-hydroxysuccinimide, genipin derived from a natural product, and the like can be used. In the cross-linking reaction, reaction conditions are selected according to each cross-linking agent, and the physical property values of the culture substrate obtained by the cross-linking treatment are set so as to be within the above-mentioned physical property values.
培養基材は、基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの架橋体を含むが、基底膜マトリックス調製物からタンパクのみを抽出して線維型コラーゲンとの架橋体を得ることもありえる。しかしながら、基底膜マトリックス調製物からタンパクのみを抽出することは実際上困難であるので、培養基材は両者の架橋体の他、架橋に使われなかった基底膜マトリックス調製物中のタンパクや、架橋体に使われなかった線維型コラーゲン、基底膜マトリックス調製物中に含まれる各種の成分を含み得る。従って、培養基材は基底膜マトリックス調製物を含むとも言える。また、培養基材は、これらの成分以外に、水などの媒体やケラチノサイトの培養に用いられる各種因子、例えば上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子のような成長因子やカルシウムのような分化促進因子，酢酸塩やリン酸塩などの緩衝液を構成する成分，エラスチン、フィブリリンなどの皮膚由来成分、細胞成分として線維芽細胞、組織球、肥満細胞などの各種細胞などの任意に添加しえる成分も含み得る。また、基底膜マトリックス調製物中に本来含まれるとされる成分、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンやヘパラン硫酸プロテオグリカン，ＩＶコラーゲン，トロンボスポンジン，ヒアルロン酸，フィブロネクチン，ラミニン，リーリン，ニドゲンなども任意にさらに含ませてもよい。さらに、未反応の架橋剤や、架橋反応の停止に用いられる反応停止剤が含まれる場合がある。反応停止剤は上記の架橋剤に応じて適宜選択されるが、例えばグルタルアルデヒドに対するグリシン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドに対するトリスヒドロキシメチルアミノメタンなど、各種アミノ酸若しくはそれらの塩類が示される。 The culture substrate contains a crosslinked product of protein and fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation, but it is also possible to extract only the protein from the basement membrane matrix preparation to obtain a crosslinked product with fibrous collagen. However, since it is practically difficult to extract only protein from the basement membrane matrix preparation, the culture substrate is not only the crosslinked product of both, but also the protein in the basement membrane matrix preparation that was not used for cross-linking, and cross-linking. It may contain fibrous collagen that has not been used by the body, various components contained in the basement membrane matrix preparation. Therefore, it can be said that the culture substrate contains the basement membrane matrix preparation. In addition to these components, the culture substrate includes various factors used for culturing media such as water and keratinocytes, such as epithelial growth factors, fibroblast growth factors, growth factors such as nerve growth factors, and calcium. Differentiating factors, components constituting buffers such as acetate and phosphate, skin-derived components such as elastin and fibrillin, and various cells such as fibroblasts, tissue spheres, and obese cells as cell components are arbitrarily added. It can also contain ingredients that can be squeezed. In addition, components originally contained in the basement membrane matrix preparation, such as chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, IV collagen, thrombospondin, hyaluronic acid, fibronectin, laminin, lilin, and nidgen, are optionally further contained. May be. Further, it may contain an unreacted cross-linking agent or a reaction terminator used to stop the cross-linking reaction. The reaction terminator is appropriately selected depending on the above-mentioned cross-linking agent, and various amino acids such as glycine for glutaraldehyde and trishydroxymethylaminomethane for N-hydroxysuccinimide or salts thereof are shown.
本願発明に係る培養基材は、基底膜マトリックス調製物と線維型コラーゲン、前記の任意に添加し得る成分を混合し、架橋剤を加えて反応させることで得られる。このとき、得られた培養基材の物性値が１０.５Ｐａ・s以上３０.０Ｐａ・ｓ以下、好ましくは２５.０Ｐａ・ｓ以下、さらに好ましくは２２.０Ｐa・ｓ以下であればよく、このような物性値の範囲となるように基底膜マトリックス調製物中のタンパクや基底膜マトリックス調製物の量と、線維型コラーゲンの量と、架橋剤の量、架橋反応の条件（例えば反応時間）が調整される。なお、本明細書においては、基底膜マトリックス調製物中のタンパク量は、ローリー法により測定された基底膜マトリックス調製物中に含まれる全タンパク量を意図する。ゲル状物の物性値は実施例に記載の方法で求めた場合の測定値を意味する。培養基材の作製は、例えば、基底膜マトリックス調製物や線維型コラーゲン、媒体、その他の培養基材に含ませる任意的成分、架橋剤を含み、最終的に培養基材となる混合液中に、基底膜マトリックス調製物中のタンパク濃度として０.６ｗ／ｖ％以上、好ましくは０.６１ｗ／ｖ％以上であり、１.０ｗ／ｖ％以下好ましくは０.９ｗ／ｖ％以下の基底膜マトリックス調製物と、０.０１ｗ／ｖ％以上０.１ｗ／ｖ％以下の線維型コラーゲンを含むように混合して行われる。従って、例えば、市販品であるＥＨＳマウス肉腫からの調製品である「マトリゲル」（高濃度品でない通常品）を用いる場合、そのタンパク濃度は約１０ｍｇ／ｍＬとされるので、この調製品を用いる場合には６０.０ｗ／ｖ％以上１００.０ｗ／ｖ％以下（なお、マトリゲルを高濃度に配合する場合、タンパク高濃度品（例えばタンパク濃度として約２０ｍｇ／ｍＬを含む市販品）が用いられ得る）の「マトリゲル」と０.０１ｗ／ｖ％以上０.１ｗ／ｖ％以下の線維型コラーゲンを含むように混合される。また、基底膜マトリックス調製物中のタンパクと線維型コラーゲンの比は調製された培養基材の物性値が上記範囲となる限り任意であるが、好ましくは線維型コラーゲン量に対して、基底膜マトリックス調製物中のタンパク量が質量比で６.０以上２０.０以下となるのがよい。 The culture substrate according to the present invention can be obtained by mixing a basement membrane matrix preparation, fibrous collagen, and the above-mentioned optionally-addable component, and adding a cross-linking agent to react. At this time, the physical characteristics of the obtained culture substrate may be 10.5 Pa · s or more and 30.0 Pa · s or less, preferably 25.0 Pa · s or less, and more preferably 22.0 Pa · s or less. The amount of protein and basement membrane matrix preparation in the basement membrane matrix preparation, the amount of fibrous collagen, the amount of cross-linking agent, and the conditions of the cross-linking reaction (for example, reaction time) are set so as to be within the range of such physical property values. It will be adjusted. In addition, in this specification, the amount of protein in a basal membrane matrix preparation is intended to be the total amount of protein contained in the basal membrane matrix preparation measured by the Lowry method. The physical property value of the gel-like substance means a measured value when obtained by the method described in Examples. The culture substrate is prepared, for example, in a mixed solution containing a basement membrane matrix preparation, fibrous collagen, a medium, other optional components to be contained in the culture substrate, and a cross-linking agent, and finally becomes the culture substrate. , The basement membrane as the protein concentration in the basement membrane matrix preparation is 0.6 w / v% or more, preferably 0.61 w / v% or more, and 1.0 w / v% or less, preferably 0.9 w / v% or less. It is carried out by mixing with the matrix preparation so as to contain fibrous collagen of 0.01 w / v% or more and 0.1 w / v% or less. Therefore, for example, when using "Matrigel" (a normal product that is not a high-concentration product), which is a preparation from the commercially available EHS mouse sarcoma, the protein concentration is about 10 mg / mL, so this preparation is used. In some cases, 60.0 w / v% or more and 10.0 w / v% or less (when Matrigel is blended in a high concentration, a protein high concentration product (for example, a commercially available product containing about 20 mg / mL as a protein concentration) is used. (Obtain) "Matrigel" is mixed so as to contain fibrillar collagen of 0.01 w / v% or more and 0.1 w / v% or less. The ratio of protein to fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation is arbitrary as long as the physical properties of the prepared culture substrate are within the above range, but the basement membrane matrix is preferably relative to the amount of fibrous collagen. The amount of protein in the preparation should be 6.0 or more and 20.0 or less by mass ratio.
次に、基底膜マトリックス調製物、線維型コラーゲン及びさらに任意的に添加される成分、媒体を含む混合液に架橋剤を加え、架橋反応を行わせる。基底膜マトリックス調製物中のタンパク量や線維型コラーゲン量などによっても異なるが、加える架橋剤の量は、最終的に培養基材となる混合液中に概ね０.００５ｗ／ｖ％以上０.０２ｗ／ｖ％以下である。架橋する際の反応条件は架橋剤に応じて適宜決定されるが、例えばグルタルアルデヒドであれば４℃～３７℃で１～４８時間インキュベートする。その後、架橋停止剤を加えて架橋反応を停止させ、培養基材となるゲル状物を得る。架橋に際して、得られる培養基材の物性値が上記物性値の範囲内に納まるように架橋反応を行わせる。例えば、架橋剤を過剰に加えて架橋剤が反応系に残った状態で架橋反応を停止させてもよく、所望する物性値となるような量の架橋剤を加えて架橋反応を行わせてもよい。好ましくは、過剰量の架橋剤を加えて十分に架橋反応を起こさせるのがよく、例えば前記量の基底膜マトリックス調製物及び線維型コラーゲンを用いる場合には０.０１ｗ／ｖ％以上０.０２ｗ／ｖ％以下の架橋剤を加えて、２時間以上２４時間程度のインキュベートを行って架橋体を形成させた後に、反応停止剤を加えることが好ましい。反応停止剤を加えた後は反応停止を完結させるために、さらに室温でインキュベートを行う。反応停止剤は架橋後に得られるゲル状物と接触させることになるが、ゲル状物の容積にほぼ影響を与えることなく反応が停止される。この際、反応停止剤や反応停止剤を溶解した溶媒に用いられた液体が残存する場合やゲル状物からの離水も起こりえるが、これらの場合それらが残存したままでも使用できるが、好ましくはゲル状物上に残った液体を除いて使用する。 Next, a cross-linking agent is added to a mixed solution containing the basement membrane matrix preparation, fibrous collagen, and optionally added components and a medium, and a cross-linking reaction is carried out. Although it depends on the amount of protein and fibrous collagen in the basement membrane matrix preparation, the amount of cross-linking agent to be added is approximately 0.005 w / v% or more and 0.02 w in the mixed solution that will be the final culture substrate. It is less than / v%. The reaction conditions for cross-linking are appropriately determined depending on the cross-linking agent. For example, glutaraldehyde is incubated at 4 ° C. to 37 ° C. for 1 to 48 hours. Then, a cross-linking terminator is added to stop the cross-linking reaction to obtain a gel-like substance as a culture medium. At the time of cross-linking, the cross-linking reaction is carried out so that the physical property values of the obtained culture medium are within the range of the above-mentioned physical property values. For example, the cross-linking reaction may be stopped with the cross-linking agent remaining in the reaction system by adding an excessive amount of the cross-linking agent, or the cross-linking reaction may be carried out by adding an amount of the cross-linking agent having a desired physical property value. good. Preferably, it is preferable to add an excessive amount of a cross-linking agent to cause a sufficient cross-linking reaction. For example, when the above-mentioned amount of the basement membrane matrix preparation and fibrous collagen is used, 0.01 w / v% or more and 0.02 w. It is preferable to add a cross-linking agent of / v% or less and incubate for 2 hours or more and 24 hours to form a cross-linked product, and then add a reaction terminator. After adding the reaction terminator, further incubate at room temperature to complete the reaction terminator. The reaction terminator will be brought into contact with the gel-like substance obtained after crosslinking, but the reaction will be stopped with almost no effect on the volume of the gel-like substance. At this time, the liquid used in the reaction terminator or the solvent in which the reaction terminator is dissolved may remain, or water may be separated from the gel-like substance. In these cases, the liquid can be used even if they remain, but it is preferable. Use except for the liquid remaining on the gel.
架橋反応は、下記に述べるケラチノサイトの培養に用いられる培養容器やケラチノサイトの培養に用いられる培養容器とは異なる容器を用いて行い得る。培養容器内で架橋反応を行った場合は反応停止後得られたゲル状物をそのまま培養基材として用いられる。また、別の容器で架橋反応を行った場合には反応停止後得られたゲル状物の適量を培養容器などに移したり、架橋反応を行って得られたゲル状物を培養容器に移した後に反応停止させて培養基材として用いることもできる。 The cross-linking reaction can be carried out using a culture vessel different from the culture vessel used for culturing keratinocytes and the culture vessel used for culturing keratinocytes described below. When the cross-linking reaction is carried out in the culture vessel, the gel-like product obtained after the reaction is stopped is used as it is as the culture substrate. When the cross-linking reaction was carried out in another container, an appropriate amount of the gel-like substance obtained after the reaction was stopped was transferred to a culture vessel or the like, or the gel-like substance obtained by carrying out the cross-linking reaction was transferred to the culture vessel. It can also be used as a culture substrate by stopping the reaction later.
培養基材はケラチノサイトの培養に用いられる。培養は、培養基材が入った培養容器、例えばシャーレやペトリ皿、多数の窪みを備えた培養プレート、チャンバースライド、網状物（例えばナイロンメッシュ）などの支持用インサートを備えた容器中、あるいはプレパラートなどの平板状の支持体に載置された培養基材上で行われる。培養されるケラチノサイトの由来は動物であれば特に制限されるものではないが、本願発明に係る培養基材はケラチノサイトの培養によりその表面に真皮乳頭突起様の凸状部が形成されるので、真皮乳頭突起を有する動物由来、例えばヒトやサル、マウスなどの哺乳類由来のケラチノサイトが好ましく用いられる。もっとも、その他いかなる動物由来のケラチノサイト、場合によってはケラチノサイト以外の細胞を培養し得るのは言うまでもない。さらには、糖尿病、乾癬、光線角化症等の疾患に罹患した患者由来の細胞（好ましくはケラチノサイト）を用いることも可能である。 The culture substrate is used for culturing keratinocytes. Culturing can be performed in a culture vessel containing the culture substrate, such as a petri dish or petri dish, a culture plate with numerous indentations, a chamber slide, a container with supporting inserts such as a mesh (eg, nylon mesh), or in preparation. It is performed on a culture substrate placed on a flat plate-shaped support such as. The origin of the keratinocyte to be cultured is not particularly limited as long as it is an animal, but the culture substrate according to the present invention has a dermis papillary-like convex portion formed on the surface by culturing the keratinocyte. Keratinocytes derived from animals having papillary lines, such as mammals such as humans, monkeys, and mice, are preferably used. However, it goes without saying that cells other than keratinocytes derived from any other animal, and in some cases other than keratinocytes, can be cultured. Furthermore, it is also possible to use cells (preferably keratinocytes) derived from patients suffering from diseases such as diabetes, psoriasis and actinic keratosis.
培養方法は一般的にケラチノサイトを培養する場合と同様に行えばよく、例えばケラチノサイトを含む培養液を培養基材上に播種したり、培養基材上にケラチノサイトを載置した後、培養容器に入れた培養液とともにインキュベートする。培養液には、使用されるケラチノサイトに適切な培養液が用いられるが、ヒト由来のケラチノサイトを培養する場合であれば、例えばＥｐｉＬｉｆｅ ＫＧ２ （クラボウ）、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）のような培養液があげられる。培養条件も通常のケラチノサイトの培養と同様の条件でよく、例えば３７℃で数時間から４８時間、長い場合には１週間程度である。 The culturing method may be generally the same as that for culturing keratinocytes. For example, a culture medium containing keratinocytes is sown on a culture substrate, or keratinocytes are placed on a culture substrate and then placed in a culture vessel. Incubate with the culture medium. As the culture medium, an appropriate culture medium is used for the keratinocytes used, but when culturing human-derived keratinocytes, for example, a culture medium such as EpiLife KG2 (Kurabo) or Humania-KG2 (Kurabo) can be used. can give. The culture conditions may be the same as those for normal keratinocyte culture, for example, at 37 ° C. for several hours to 48 hours, and in the longest case, about one week.
培養の結果、培養基材の表面にはその一部分が盛り上がるようにして培養基材からなる凸状部が形成されるとともに、当該凸状部の表面の少なくとも一部を覆うケラチノサイトの細胞層が形成される。１つの培養容器（若しくは１つの窪み）に形成される凸状部は１つとは限らず、複数の凸状部が形成される場合もある。ケラチノサイトの細胞層は、形成された凸状部表面の少なくとも一部を覆っていればよく、ケラチノサイトの細胞層が培養基材からなる凸状部を形成させ得る割合、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは凸状部の表面の全体を覆う細胞層が形成されていることが好ましい。そして、ケラチノサイトの細胞層は、凸状部の表面のみならず凸状部と連続してその周囲の培養基材表面にも形成され、凸状部の周囲を取り囲む、つまりチューリップハット状にケラチノサイトの細胞層が形成されることが望ましい。形成されたケラチノサイトの細胞層は通常１層であるが、部分的若しくは全体に２層、３層及びそれ以上の複数層であっても差し支えない。また、一部のケラチノサイトの細胞が培養基材の内部、特に凸状部の内部に存在するものであっても差し支えない。 As a result of culturing, a convex portion made of the culture substrate is formed on the surface of the culture substrate so that a part thereof is raised, and a cell layer of keratinocyte covering at least a part of the surface of the convex portion is formed. Will be done. The number of convex portions formed in one culture vessel (or one depression) is not limited to one, and a plurality of convex portions may be formed. The cell layer of keratinocyte may cover at least a part of the surface of the formed convex portion, and the ratio at which the cell layer of keratinocyte can form the convex portion made of the culture substrate, preferably 70% or more, and more. It is preferable that 80% or more, more preferably a cell layer covering the entire surface of the convex portion is formed. The cell layer of keratinocyte is formed not only on the surface of the convex portion but also on the surface of the culture medium around the convex portion continuously, and surrounds the periphery of the convex portion, that is, the keratinocyte in the shape of a tulip hat. It is desirable that a cell layer be formed. The cell layer of the formed keratinocyte is usually one layer, but it may be partially or wholly composed of two layers, three layers, or a plurality of layers or more. Further, some keratinocyte cells may be present inside the culture medium, particularly inside the convex portion.
複数の凸状部の間には連続したケラチノサイトの細胞層が存在することが好ましいが、不連続なケラチノサイトの細胞層が存在しても差し支えない。下記に述べるように、例えば皮膚の真皮乳頭突起の消長に関する因子を調べる場合には、ケラチノサイトの細胞層が不連続であっても形成されている凸状部が１つのみでも差し支えない。また、人工皮膚として使用する場合には、ケラチノサイトの細胞層の面積が大きいほど好ましく、複数の凸状部を有するものが望ましい。凸状部と凸状部の間が不連続となったケラチノサイトの細胞層が形成された場合には、例えば、レーザーピンセット等を用いて１つの凸状部と当該凸状部の周囲の培養基材と当該培養基材上のケラチノサイトの細胞層を切り取り、他の凸状部の周囲にケラチノサイトの細胞層が互いに接触し、又は近接させるように移動して更に培養することで、複数の凸状部を有し、かつケラチノサイトの細胞層が連続した１枚のシート状の皮膚モデルが作製され得る。 It is preferable that a continuous keratinocyte cell layer is present between the plurality of convex portions, but a discontinuous keratinocyte cell layer may be present. As described below, for example, when investigating factors related to the fate of the dermal papillary process of the skin, even if the cell layer of keratinocytes is discontinuous, only one convex portion may be formed. When used as artificial skin, the larger the area of the cell layer of keratinocyte, the more preferable, and the one having a plurality of convex portions is desirable. When a discontinuous keratinocyte cell layer is formed between the convex portions, for example, a laser tweezers or the like is used to form one convex portion and a culture medium around the convex portion. A plurality of convex shapes are formed by cutting out the cell layer of keratinocytes on the material and the culture medium, moving the cell layers of keratinocytes so as to be in contact with each other or close to each other around the other convex portions, and further culturing the cells. A single sheet-like skin model having a portion and a continuous cell layer of keratinocytes can be prepared.
こうして作製された培養基材や皮膚モデルは、皮膚の真皮乳頭突起の形成や消失に関与すると考えられる因子の解明に使用され得る。すなわち、各種因子を接触させた後あるいは接触させながら培養基材上でケラチノサイトを培養して本願発明に係る皮膚モデルの成否や、凸状部の形成（細胞層を含めて）の程度を判定することで、真皮乳頭突起の形成への影響、例えば突起形成を阻害、促進又は形成された凸状部の消失を抑制する因子であるかどうか、又は影響の強弱の評価あるいは推定ができる。この際、ケラチノサイトの培養条件は上記で述べた皮膚モデルの作製時とほぼ同様の培養条件が好ましいが、それと異なる条件で培養することもできる。また、作製された皮膚モデルに各種因子を接触させた後あるいは接触させながら、皮膚モデルを更に培養して皮膚モデル、特に細胞層を含めた凸状部の消失の有無やその程度を判定することで、真皮乳頭突起の消失や維持に関与する因子であるかどうかの評価あるいは推定ができる。この際、皮膚モデルの培養条件は上記で述べたような皮膚モデルの作製時と同じ条件が好ましいが、ケラチノサイトが培養可能であると考えられ得る限りこれと異なる条件であってもよい。また、消失や維持に関与するか否かどうかを調べるための培養には培養液を用いることなく恒温でインキュベートすることも含まれる。 The cultured substrate and skin model thus prepared can be used to elucidate the factors that are considered to be involved in the formation and disappearance of the dermal papillary process of the skin. That is, after or while contacting various factors, keratinocytes are cultured on a culture substrate to determine the success or failure of the skin model according to the present invention and the degree of formation of convex portions (including the cell layer). Therefore, it is possible to evaluate or estimate the influence on the formation of the papillary dermal papilla, for example, whether or not it is a factor that inhibits, promotes or suppresses the disappearance of the formed convex portion, or the strength of the influence. At this time, the culture conditions for keratinocytes are preferably substantially the same as those at the time of producing the skin model described above, but they can also be cultured under different conditions. In addition, after or while contacting the prepared skin model with various factors, the skin model is further cultured to determine the presence or absence and the degree of disappearance of the skin model, especially the convex portion including the cell layer. Therefore, it is possible to evaluate or estimate whether or not it is a factor involved in the disappearance and maintenance of the dermal papilla process. At this time, the culture conditions of the skin model are preferably the same as those at the time of producing the skin model as described above, but may be different conditions as long as it can be considered that keratinocytes can be cultured. Incubation at a constant temperature without using a culture medium is also included in the culture for investigating whether or not it is involved in disappearance or maintenance.
評価あるいは推定の対象となる被検因子は、紫外線や赤外線などの電磁波、オゾンなどの気体、過酸化水素や各種抗酸化剤などの化学物質や動植物抽出物のような組成物、熱(加温や冷却)や湿度(加湿や乾燥)等の外部環境など特に制限はない。また、一度の実施に用いられる被検因子は１つに限られず、複数の因子、例えば、形成を阻害すると判定ないし推定された因子と当該因子を阻害すると予想されうる因子の双方など複数の被検因子でもあり得る。また、被験因子と、真皮乳頭突起の形成を阻害すると既に評価されている因子や真皮乳頭突起の消失若しくは維持に貢献すると既に評価する因子を組み合わせて用いることもできる。 The test factors to be evaluated or estimated are electromagnetic waves such as ultraviolet rays and infrared rays, gases such as ozone, chemical substances such as hydrogen peroxide and various antioxidants, compositions such as animal and plant extracts, and heat (heating). There are no particular restrictions on the external environment such as cooling) and humidity (humidifying and drying). In addition, the test factor used at one time is not limited to one, and a plurality of factors such as a plurality of factors, for example, both a factor determined or presumed to inhibit the formation and a factor expected to inhibit the factor. It can also be a test factor. In addition, a test factor can be used in combination with a factor that has already been evaluated to inhibit the formation of the dermal papilla process or a factor that has already been evaluated to contribute to the disappearance or maintenance of the dermal papilla process.
前者の真皮乳頭突起の形成に関与する因子であるかどうかの評価あるいは推定を行う場合において、被験因子との接触は培養の結果として凸状部形成への影響が観察できる方法であればいかなる方法やいかなる時期でもよい。例えば、培養前にケラチノサイトの細胞と接触させること、ケラチノサイトの細胞の存在しない状態で培養基材と接触させること、また培養開始直前や培養中にケラチノサイト及び／又は培養基材に接触させることが示される。接触も被検因子に応じて適切な方法が選択される。被験因子が化学物質や組成物の場合には、例えばケラチノサイトの前培養液中に混入すること、培養基材中に混入すること、培養液中に混入することが示される。また、被験因子が紫外線や赤外線などの電磁波、オゾンなどの気体の場合には、例えば前培養中のケラチノサイトに照射もしくは曝露させること、ケラチノサイトのない状態で培養基材に照射もしくは曝露させること、電磁波の照射下や気体の存在下で連続的に培養すること、あるいは電磁波を間欠的に照射すること、気体を間欠的に存在させて培養することが示される。その結果、真皮乳頭突起の形成に関与すると考えられる因子を探ることができる。 In the former case of evaluating or estimating whether or not the factor is involved in the formation of the dermal papilla process, contact with the test factor is any method as long as the effect on the formation of the convex portion can be observed as a result of the culture. Or at any time. For example, it has been shown to contact with keratinocyte cells before culturing, contact with a culture substrate in the absence of keratinocyte cells, and contact with keratinocytes and / or a culture substrate immediately before the start of culture or during culture. Is done. As for contact, an appropriate method is selected according to the test factor. When the test factor is a chemical substance or composition, it is shown to be mixed in, for example, a preculture solution of keratinocyte, a mixture in a culture substrate, or a mixture in a culture solution. When the test factor is an electromagnetic wave such as ultraviolet rays or infrared rays, or a gas such as ozone, for example, irradiation or exposure to keratinocytes in preculture, irradiation or exposure to a culture substrate in the absence of keratinocytes, electromagnetic waves. It is shown that the cells are continuously cultured under the irradiation of the gas or in the presence of a gas, or that the cells are intermittently irradiated with electromagnetic waves, or that the gas is intermittently present and cultured. As a result, it is possible to search for factors that are thought to be involved in the formation of the papillary process of the dermis.
後者の真皮乳頭突起の消失に関与する因子であるかどうかの評価あるいは推定を行う場合において、被験因子との接触は、本願発明に係る皮膚モデルに対して被験因子を接触させることができればいかなる方法でもよい。接触は被検因子に応じて適切な方法が選択される。化学物質や組成物の場合には、皮膚モデルに対して、例えば被験因子の溶液をケラチノサイトの細胞層に注いで接触させることやケラチノサイトの培養液に混合して接触させることが挙げられる。また、紫外線や赤外線などの電磁波、オゾンなどの気体の場合には、それらを皮膚モデルに照射若しくは曝露させることが示される。また、前者の評価と後者の評価いずれの場合にかかわらず、接触は一時的な接触、連続的な接触、間欠的な接触のいずれでもよい。 In the case of evaluating or estimating whether or not the latter factor is involved in the disappearance of the dermal papilla process, the contact with the test factor is any method as long as the test factor can be brought into contact with the skin model according to the present invention. But it may be. The appropriate method of contact is selected according to the test factor. In the case of chemical substances and compositions, for example, a solution of a test factor may be poured into a cell layer of keratinocytes and contacted with the skin model, or mixed with a culture solution of keratinocytes and contacted with the skin model. In the case of electromagnetic waves such as ultraviolet rays and infrared rays, and gases such as ozone, it is shown that the skin model is irradiated or exposed. Further, regardless of whether the former evaluation or the latter evaluation is performed, the contact may be a temporary contact, a continuous contact, or an intermittent contact.
凸状部の形成及び細胞層の形成は培養後の培養基材を３次元的に観察することで確認できる。例えば細胞基材中のみに含まれる成分、例えば基底膜マトリックス調製物中のラミニンを染色できる染色剤、例えば一次抗体である抗ラミニン抗体と二次抗体を用いて蛍光染色を行い、次いでケラチノサイトを染色する蛍光染色剤を用いて染色を行った後、３次元蛍光顕微鏡を用いて３次元構造を観察すればよい。また、その他適宜な方法によって観察してもよい。 The formation of the convex portion and the formation of the cell layer can be confirmed by observing the cultured substrate after culturing three-dimensionally. For example, fluorescent staining is performed using a component contained only in the cell substrate, for example, a stain capable of staining laminin in a basal membrane matrix preparation, for example, an anti-laminin antibody which is a primary antibody and a secondary antibody, and then keratinocytes are stained. After staining with the fluorescent dyeing agent, the three-dimensional structure may be observed using a three-dimensional fluorescence microscope. Further, it may be observed by other appropriate methods.
本願発明に係る皮膚モデルは人工皮膚としても使用され得る。この場合は、前記培養容器中で作製された皮膚モデルを培養容器から取り出し、ヒトを含めた各種動物の皮膚損傷部分に適用できる。また、皮膚の損傷部分への適用は、熱傷や外傷などにより皮膚の欠損又は皮下組織まで欠損した創面に対して、作製した皮膚モデルを載置若しくは貼付することで行われる。載置若しくは貼付することで、創面の保護や創傷の治癒を促進する。また、培養基材を人工皮膚の代替として用いることもできる。ヒトを含めた各種動物の皮膚損傷部分に培養基材を作成若しくは別途作製した培養記載を皮膚損傷部位に載置し、その上にケラチノサイトを播種、培養することで皮膚モデルを適用することもできる。もちろん、本願発明に係る培養基材、好ましくはシート状に作製された培養基材を例えば皮膚の損傷部分に載置して被覆材とし使用してもよい。その際、当該培養基材の上にケラチノサイトを含む培養液、好ましくは粘性を付与して流動性をほぼ失わせた培養液を塗布するなどして、損傷部分を被覆することも考えられる。 The skin model according to the present invention can also be used as artificial skin. In this case, the skin model prepared in the culture vessel can be taken out from the culture vessel and applied to the skin-damaged portion of various animals including humans. In addition, application to the damaged part of the skin is performed by placing or attaching the prepared skin model to the wound surface in which the skin is defective or the subcutaneous tissue is also defective due to burns or trauma. Placement or application promotes wound protection and wound healing. In addition, the culture medium can be used as a substitute for artificial skin. It is also possible to apply a skin model by creating a culture substrate on the skin-damaged part of various animals including humans or placing a culture description prepared separately on the skin-damaged part, and seeding and culturing keratinocytes on it. .. Of course, the culture substrate according to the present invention, preferably the culture substrate prepared in the form of a sheet, may be placed on a damaged portion of the skin and used as a covering material. At that time, it is also conceivable to coat the damaged portion by applying a culture solution containing keratinocytes, preferably a culture solution having been imparted with viscosity and having almost no fluidity, on the culture substrate.
次に下記の実施例に基づいて本願発明をさらに詳細に説明するが、本願発明は下記の実施例に限られないのは言うまでもない。 Next, the invention of the present application will be described in more detail based on the following examples, but it goes without saying that the invention of the present application is not limited to the following examples.
〔培養基材の調製〕
表１に示す基材素材を用いて各種の培養基材を作製した。線維型コラーゲンとして、市販のＩ型コラーゲンの０.３ｗ／ｖ％溶液（倉敷紡績社製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｔｙｐｅ－Ａ）とｐＨ７.４の１０×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：１３７０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、８１ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ4、２６.８ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１４.７ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含む水溶液）を８：１で混合した溶液を用いた。基底膜マトリックス調製物は、市販のマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、標準Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス調製物：タンパク濃度１０ｍｇ／ｍＬ）は、氷冷下で２時間放置して解凍した溶液を用いた。架橋剤としてグルタルアルデヒドの０．１ｗ／ｖ％水溶液を、架橋停止剤としてグリシンの２ｗ／ｖ％水溶液を用いた。
[Preparation of culture medium]
Various culture substrates were prepared using the substrate materials shown in Table 1. As fibrous collagen, a commercially available 0.3 w / v% solution of type I collagen (Cellmatic (registered trademark) Type-A manufactured by Kurashiki Spinning Co., Ltd.) and 10 × PBS (Phosphate-Buffered Saline: 1370 mmol / L) having a pH of 7.4 An aqueous solution containing NaCl, 81 mmol / L Na 2 HPO 4 , 26.8 mmol / L KCl, and 14.7 mmol / L KH 2 PO 4 ) were mixed at an ratio of 8: 1. As the basement membrane matrix preparation, a commercially available Matrigel (standard Matrigel® basement membrane matrix preparation manufactured by Corning Inc .: protein concentration 10 mg / mL) was left to stand for 2 hours under ice-cooling and thawed. .. A 0.1 w / v% aqueous solution of glutaraldehyde was used as the cross-linking agent, and a 2 w / v% aqueous solution of glycine was used as the cross-linking terminator.
線維型コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）の溶液と基底膜マトリックス（マトリゲル）の溶液、架橋剤溶液を最終的に表１及び表２に示す量となるように混合し、水で全量を１００ｗ／ｖ％とした。各表には混合液中のＩ型コラーゲン量，マトリゲル中のタンパク量、グルタルアルデヒド量がそれぞれ濃度として示されている。この混合液１５０μＬを、８ウェルタイプのチャンバースライド（ＩＷＡＫＩ社製、１０ｍｍ×１０ｍｍ）の各ウェルに注入し、４℃で１２時間インキュベートした。その後、３７℃で０.５時間～２４時間インキュベートしてゲル状物を得た。次いで、各ウェル当たり架橋停止剤である２ｗ／ｖ％グリシン水溶液２００μＬを加え３７℃で２時間インキュベートした後、ゲル状物上の液体を排除して、培養基材を保持したチャンバースライドを得た。 The solution of fibrous collagen (type I collagen), the solution of basement membrane matrix (Matrigel), and the cross-linking agent solution are finally mixed so as to be the amounts shown in Tables 1 and 2, and the total amount is 100 w / v% with water. And said. In each table, the amount of type I collagen in the mixed solution, the amount of protein in Matrigel, and the amount of glutaraldehyde are shown as concentrations. 150 μL of this mixture was poured into each well of an 8-well type chamber slide (10 mm × 10 mm manufactured by IWAKI) and incubated at 4 ° C. for 12 hours. Then, the mixture was incubated at 37 ° C. for 0.5 to 24 hours to obtain a gel. Then, 200 μL of a 2 w / v% glycine aqueous solution as a cross-linking terminator was added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours, and then the liquid on the gel was removed to obtain a chamber slide holding the culture substrate. ..
〔物性値の測定〕
前記割合で線維型コラーゲン溶液と基底膜マトリックス調製物の溶液、架橋剤並びに架橋停止剤を用いてゲル状の培養基材を表１、表２の割合となるように内径１０ｍｍ、長さ７５ｍｍのガラス製試験管（ＡＳ ＯＮＥ社製）内で作製した。このとき、培養基材上に残存した架橋停止剤の溶液などの液体があればそれを取り除いた。その後、試験管を垂直に立てた状態で試験管の口部を食品包装用ラップフィルムで覆い３７℃で３０分間静置した。その後、ゲル状物の温度が低下しないようにできるだけ速やかに２０～２５℃の室温下でＢ型粘度計（ＴＶＢ１０形粘度計、東機産業：ローターＭ４、回転速度６ｒｐｍ、測定時間１分）を用いて粘度を測定し、ゲル状物の物性値とした。
[Measurement of physical properties]
Using the fibrous collagen solution, the basement membrane matrix preparation solution, the cross-linking agent, and the cross-linking terminator at the above ratios, the gel-like culture substrate was prepared with an inner diameter of 10 mm and a length of 75 mm so as to have the ratios shown in Tables 1 and 2. It was manufactured in a glass test tube (manufactured by AS ONE). At this time, if there was a liquid such as a solution of the cross-linking inhibitor remaining on the culture substrate, it was removed. Then, with the test tube upright, the mouth of the test tube was covered with a food packaging wrap film and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. After that, use a B-type viscometer (TVB10 type viscometer, Toki Sangyo: rotor M4, rotation speed 6 rpm,
〔ケラチノサイトの培養〕
新生児由来正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績社製）を培養液中１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養液であるＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２（倉敷紡績社製）に分散し、上記で調製したチャンバースライドの培養基材上に各ウェルあたり２００μＬを播種した。３７℃、５％ＣＯ２の存在下で７２時間培養を行った後、得られたケラチノサイトの細胞層の観察を行った。
[Culturing keratinocytes]
Normal human epidermal keratinocytes derived from newborns (manufactured by Kurabo Industries Ltd.) were dispersed in the culture medium Humandia KG2 (manufactured by Kurabo Industries Ltd.) so as to have 1 × 10 5 Cells / mL in the culture medium, and the chamber slide prepared above was used. 200 μL of each well was seeded on the culture substrate. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 72 hours, the cell layer of the obtained keratinocyte was observed.
〔ケラチノサイト細胞層の観察〕
チャンバースライドから培地を除去し、各ウェル当たり１００μＬのＰＢＳ（－）でチャンバースライドを１回洗浄した。次いでＰＢＳ（－）に溶解した０.５ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の溶液１００μＬを各ウェルに添加した。室温下で１５分間放置した後、各ウェル当たり１００μＬのＰＢＳ（－）を用いた洗浄を３回繰り返した。予め調製しておいたアクチン染色液（２.５ｗ／ｖ％のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ溶液 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｗｉｔｈ １ｖ／ｖ％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－）溶液））の１００μＬを各ウェルに添加し、室温下で２０分間放置してアクチンを染色した。その後１７０μＬの３ｖ／ｖ％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－）を添加し２０分間反応させてブロッキングした。そこに、１次抗体（抗ラミニン抗体 ウサギ宿主抗体（Ｌ９３９３ Ｓｉｇｍａ））の溶液（ＰＢＳ（－）による１００倍希釈液）を７０μＬ添加し、室温で２時間反応させた。次いでＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ （Ｔ－ＰＢＳ）で５分間接触させることを３回繰り返して洗浄を行った。蛍光標識された２次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ （Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））の溶液（ＰＢＳ（－）による２００倍希釈液）を７０μＬ添加して室温で４５分間反応させた。再びＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔ－ＰＢＳ）を５分間接触させることを３回繰り返して洗浄した。さらに１００μＬのＰＢＳ（－）で３回洗浄した。そして、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ （Ａｑｕａ ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１滴添加して、ケラチノサイトの細胞層とゲルの観察を行った。
[Observation of keratinocyte cell layer]
Medium was removed from the chamber slides and the chamber slides were washed once with 100 μL PBS (−) per well. Then 100 μL of a 0.5 v / v% Triton X-100 solution dissolved in PBS (−) was added to each well. After standing at room temperature for 15 minutes, washing with 100 μL PBS (−) per well was repeated 3 times. Each well contains 100 μL of a pre-prepared actin stain (2.5 w / v% Alexa Fluor® 488 Phalloidin solution (Thermo Fisher Scientific, with 1 v / v% BSA in PBS (-) solution)). And left at room temperature for 20 minutes to stain actin. Then 170 μL of 3v / v% BSA in PBS (−) was added and reacted for 20 minutes for blocking. To this, 70 μL of a solution of a primary antibody (anti-laminin antibody rabbit host antibody (L9393 Sigma)) (100-fold diluted solution with PBS (−)) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours. Then, contact with Wash buffer (T-PBS) for 5 minutes was repeated 3 times for washing. Add 70 μL of a solution (200-fold diluted solution with PBS (-)) of a fluorescently labeled secondary antibody (Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Addorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 (Thermovisher)) at room temperature. Reacted for minutes. The wash buffer (T-PBS) was contacted again for 5 minutes and washed three times. Further, the cells were washed 3 times with 100 μL of PBS (−). Then, one drop of Mounting Fluid (Aqua poly / Mount, Digital Biosystems) was added, and the cell layer and gel of keratinocytes were observed.
蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００， ＫＥＹＥＮＣＥ）のセクショニングモードで３次元構造の観察を行った。画像の解析は画像解析ソフト（ＢＺ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＫＥＹＥＮＣＥ）で行った。その観察結果を表１及び表２に示す。また、代表的な顕微鏡による観察画像を図１～図４に示す。真皮乳頭突起様の凸状部が形成され凸状部の表面全体に細胞層が形成された場合（突起様構造）を○、真皮乳頭突起様の凸状部が形成されずに培養基材表面に平面状に細胞層が形成された場合を×で表１及び表２に示した。 The three-dimensional structure was observed in the sectioning mode of a fluorescence microscope (BZ-X700, KEYENCE). Image analysis was performed with image analysis software (BZ-X Analyzer, KEYENCE). The observation results are shown in Tables 1 and 2. Further, the observation images by a typical microscope are shown in FIGS. 1 to 4. When a dermal papilla-like convex portion is formed and a cell layer is formed on the entire surface of the convex portion (projection-like structure), ○, the surface of the culture medium without forming the dermal papilla-like convex portion. The cases where the cell layer was formed in a planar shape are shown in Tables 1 and 2 with x.
図１及び図３は試験例５に示した培養基材を用いた場合、図２及び図４は試験例９に示した培養基材を用いた場合の観察結果である。緑色の蛍光（画像では白っぽく表されている）はケラチノサイトの蛍光染色を示し細胞の局在を示している。マトリゲルが含まれる試験例ではマトリゲルの主成分であるラミニンの染色（赤色）及び観察された形状から凸状部の有無並びに細胞層の形状を判断した。 1 and 3 are observation results when the culture medium shown in Test Example 5 is used, and FIGS. 2 and 4 are observation results when the culture medium shown in Test Example 9 is used. Green fluorescence (shown whitish in the image) indicates fluorescent staining of keratinocytes and indicates cell localization. In the test example containing Matrigel, the presence or absence of convex portions and the shape of the cell layer were determined from the staining (red) of laminin, which is the main component of Matrigel, and the observed shape.
試験例４～６並び試験例１４～１６では緑色に示した細胞層が凸状に示されており、凸状部の下には培養基材中ラミニンの染色も凸状に確認された（図１、図３参照）。また、真皮乳頭突起様の凸状部が形成された場合（試験例４～６、１４～１６）ではその全てにおいてその周囲、すなわちチャンバースライドの各ウェル内全体にも平面状の細胞層が形成されており、所望される皮膚モデルが得られた。その一方、試験例１や２、試験例７～１３では、ラミニンの染色が平面的に観察され、細胞の染色も平面的な層に観察された（図２、図４参照）。 In Test Examples 4 to 6 and in Test Examples 14 to 16, the cell layer shown in green was shown in a convex shape, and the staining of laminin in the culture medium was also confirmed to be convex under the convex portion (Fig.). 1. See Fig. 3). In addition, when a dermal papilla-like convex portion is formed (Test Examples 4 to 6 and 14 to 16), a planar cell layer is formed around the convex portion, that is, in the entire well of the chamber slide. And the desired skin model was obtained. On the other hand, in Test Examples 1 and 2 and Test Examples 7 to 13, laminin staining was observed in a planar manner, and cell staining was also observed in a planar layer (see FIGS. 2 and 4).
〔凸状部形成に与える因子評価１〕
凸状部の形成に与える因子として、真皮乳頭突起の形成に負の影響を与えることが知られている過酸化水素を用いて評価を行った。
表１の試験例５と同様の組成に基づき実施例１と同様にして培養基材を保持したチャンバースライドを作製した。次に、実施例１に用いたヒト表皮ケラチノサイトを１００μＭの過酸化水素水に２時間曝露した。その後、実施例１と同様にして曝露後のケラチノサイトを培養基材上に播種し、実施例１と同様にして培養を行った。
[Evaluation of factors given to the formation of convex parts 1]
As a factor affecting the formation of the convex portion, hydrogen peroxide, which is known to have a negative effect on the formation of the dermal papilla process, was used for evaluation.
Based on the same composition as in Test Example 5 in Table 1, a chamber slide holding the culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1. Next, the human epidermal keratinocytes used in Example 1 were exposed to 100 μM hydrogen peroxide solution for 2 hours. Then, the exposed keratinocytes were inoculated on the culture substrate in the same manner as in Example 1, and the culture was carried out in the same manner as in Example 1.
実施例１と同様にしてケラチノサイトによる細胞層の顕微鏡観察を行ったところ、真皮乳頭突起様の凸状部は形成されずに、培養基材上には平面状の細胞層が形成された。また、通常のケラチノサイト培養用の線維型コラーゲンのみからなる培地を用いて、曝露後のケラチノサイトを培養したところ、正常に培養が行われ、細胞増殖や細胞形態への影響は観察されなかった。 When the cell layer was observed under a microscope with keratinocytes in the same manner as in Example 1, a planar cell layer was formed on the culture substrate without forming a convex portion like a papillary line of the dermis. In addition, when keratinocytes after exposure were cultured using a medium consisting only of fibrous collagen for normal keratinocyte culture, the culture was performed normally, and no effect on cell proliferation or cell morphology was observed.
〔凸状部形成に与える因子評価２〕
凸状部の形成に与える因子として、真皮乳頭突起の形成に負の影響を与えることが知られている紫外線を用いて評価を行った。
[
As a factor affecting the formation of the convex portion, the evaluation was performed using ultraviolet rays, which are known to have a negative effect on the formation of the dermal papilla process.
表１の試験例５と同様の組成に基づき実施例１と同様にして培養基材を保持したチャンバースライドを作製した。次に、実施例１に用いたヒト表皮ケラチノサイトを培養基材上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で２４時間培養を行った。その後紫外線照射（ＵＶ－Ｂ ２０ｍＪ）を培養基材上から照射した。その後同様の条件で４８時間培養した。 Based on the same composition as in Test Example 5 in Table 1, a chamber slide holding the culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1. Next, the human epidermal keratinocytes used in Example 1 were inoculated on a culture substrate and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. After that, ultraviolet irradiation (UV-B 20 mJ) was applied from above the culture substrate. Then, the cells were cultured under the same conditions for 48 hours.
実施例１と同様にしてケラチノサイトの細胞層の顕微鏡観察を行ったところ、真皮乳頭突起様の凸状部は形成されずに、培養基材上には平面状の細胞層が形成された。 When the cell layer of keratinocyte was observed under a microscope in the same manner as in Example 1, a planar cell layer was formed on the culture substrate without forming a convex portion like a papillary line of the dermis.
〔培養基材の調製〕
表１の試験例５と同様の組成に基づき実施例１と同様にして培養基材を保持したシャーレ（５５ｃｍ２）を作成した。次に、実施例１に用いたヒト表皮ケラチノサイトを培養基材上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の存在下で７２時間培養を行い、シャーレ上に作成された人工皮膚に使用し得る皮膚モデルを得た。
[Preparation of culture medium]
Based on the same composition as in Test Example 5 in Table 1, a petri dish (55 cm 2 ) holding the culture medium was prepared in the same manner as in Example 1. Next, the human epidermal keratinocytes used in Example 1 can be seeded on a culture substrate, cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 72 hours, and used for artificial skin prepared on a petri dish. Obtained a skin model.
Claims (14)
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性成分からなる基底膜マトリックス調製物とI型コラーゲンを混合する工程と、
前記混合物に対して架橋剤を加えて反応させる工程と、
を含み、
前記混合する工程において
０.０１ｗ／ｖ％以上０.１ｗ／ｖ％以下のI型コラーゲンと、０.６ｗ／ｖ％以上１.０ｗ／ｖ％以下のＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性成分からなる基底膜マトリックス調製物を含むようにＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性成分からなる基底膜マトリックス調製物とI型コラーゲンを混合する製造方法。 A method for producing a culture medium having a physical characteristic value of 10.5 Pa · s or more and 30.0 Pa · s or less.
A step of mixing type I collagen with a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components extracted from Angelbreth-Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma .
The step of adding a cross-linking agent to the mixture and reacting with the mixture, and
Including
In the mixing step, type I collagen of 0.01 w / v% or more and 0.1 w / v% or less and Angelbreth -Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma of 0.6 w / v% or more and 1.0 w / v% or less. A production method for mixing type I collagen with a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components extracted from Engelbreth-Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma so as to contain a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components extracted from.
前記培養基材は１以上の凸状部を有し、当該凸状部の表面の少なくとも一部にケラチノサイトの細胞層を備え、
前記培養基材は請求項３～４の何れか１項に記載の培養基材である皮膚モデル。 A gel-like culture substrate having a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components extracted from Engelbreth-Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma and a crosslinked body of type I collagen , and keratinocytes formed on the surface of the culture substrate. With a cell layer of
The culture medium has one or more convex portions, and a cell layer of keratinocytes is provided on at least a part of the surface of the convex portions.
The skin model in which the culture medium is the culture medium according to any one of claims 3 to 4 .
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した可溶性成分からなる基底膜マトリックス調製物とI型コラーゲンを混合する工程と、
当該混合物に対して架橋剤を加えて反応させる工程と、
前記反応により得られたゲル状物の表面にケラチノサイトを播種する工程と、
を含み、
前記ゲル状物の物性値が１０.５Ｐａ・ｓ以上３０.０Ｐａ・ｓである皮膚モデルの作製方法。 A method for producing a skin model in which a gel-like culture medium having at least a convex portion protruding from the surface of the substrate is provided with a cell layer of keratinocytes on at least one portion of the surface of the convex portion.
A step of mixing type I collagen with a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components extracted from Angelbreth-Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma .
The step of adding a cross-linking agent to the mixture and reacting it,
The step of sowing keratinocytes on the surface of the gel-like substance obtained by the above reaction, and
Including
A method for producing a skin model in which the physical characteristic value of the gel-like substance is 10.5 Pa · s or more and 30.0 Pa · s.
に記載の皮膚モデルの作製方法。 The mixture was extracted from type I collagen of 0.01 w / v% or more and 0.1 w / v% or less and Angelbreth -Holm-Swarn (EHS) mouse sarcoma of 0.6 w / v% or more and 1.0 w / v% or less. 7. Claim 7 comprising a basement membrane matrix preparation consisting of soluble components.
The method for producing a skin model described in 1.
ケラチノサイトと、少なくとも当該培養前又は前記培養中に被検因子を接触させる工程と、
前記培養基材の表面への凸状部の形成の成否及び／又は当該凸状部の表面への細胞層の形成の成否又はその程度を判定する工程、
を含む方法。 A step of culturing keratinocytes on the culture medium according to any one of claims 3 to 4 is provided.
The step of contacting the keratinocyte with the test factor at least before or during the culture,
A step of determining the success or failure of the formation of a convex portion on the surface of the culture medium and / or the success or failure of the formation of a cell layer on the surface of the convex portion, or the degree thereof.
How to include.
当該工程後に前記培養基材の表面の凸状部の消失の有無及び／又は当該凸状部の表面の細胞層の消失の有無又はその程度を判定する工程、
を含む方法。 The step of contacting the skin model according to any one of claims 1, 2 and 6 with the test factor,
A step of determining whether or not the convex portion on the surface of the culture substrate has disappeared and / or whether or not the cell layer on the surface of the convex portion has disappeared or the degree thereof after the step.
How to include.
A dressing made of the culture medium according to any one of claims 3 to 4 or the culture medium obtained by the method according to claim 5 .
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| WO2020111265A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | 株式会社 資生堂 | Pigmentation skin model and method for producing same, and method for evaluating factor for treating or preventing pigmentation of skin |
-
2020
- 2020-06-11 JP JP2020101725A patent/JP7083866B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biochemical and Biophysical Research Communications，2010年11月12日，Vol. 403，p. 298-304，doi:10.1016/j.bbrc.2010.11.021 |
| 日本眼科学会雑誌，2006年03月15日，Vol. 111 臨時増刊号，p. 285 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021193910A (en) | 2021-12-27 |
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