JP7078952B2 - 液体クロマトグラフィー用分離剤ならびに分離カラム、及びこれらを用いた生体高分子の分離精製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、タンパク質などの生体由来高分子（以下、生体高分子ともいう。）の分離または精製に有用な液体クロマトグラフィー用分離剤ならびに分離カラム、及びこれらを用いた生体高分子の分離精製方法に関するものである。
液体クロマトグラフィーでは、認識サイトを導入した吸着剤を分離剤として利用し、これらを充填した分離カラムによって、目的とする化合物を吸着し、溶離液への溶解度の違いから脱離しながらの分離を連続的に行う。
例えば、非特許文献１に示すように、三環芳香属炭化水素程度の小さな化合物を分離する場合には、基材の表面に前記認識サイトとしてフラーレン等を直接結合した分離剤を用いて分離することができる。
また、前記基材の表面にグラフェン等を固定する非特許文献２のような方法も考えられている。
このような従来の方法でタンパク質やペプチドの様な生体高分子を分離する場合、該生体高分子は糸まり状の立体構造を持っているので、前述した液体クロマトグラフィー用分離剤の表面、あるいは前記分離剤表面に結合した前記認識サイトが作用できるのは、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、立体構造を有する前記生体高分子の表層部位に限られている。
そのため、例えばタンパク質へ特徴的な性質を与えるアシル化、アセチル化、アルキル化、アミド化、ビオチニル化、ホルミル化、カルボキシル化、グルタミル化、グリコシル化、グリシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、イソプレニル化、リポイル化、リン酸化、ラセミ化、ユビキチン化、ニトロシル化などの翻訳後修飾による特徴的な部位が前記生体高分子の立体構造の深部に存在する場合には、この特徴的な部位を指標とした前記生体高分子の分離または精製が困難である。
このような理由から、例えばタンパク質へ翻訳後修飾によって糖鎖が結合した場合では、糖鎖によりもたらされる特徴を解析し、その働きを理解するために、従来は、例えば、特許文献１に示すように、液体クロマトグラフィーによる分離分析の前処理として、タンパク質分解酵素によって試料に含まれるタンパク質を小さな断片にまで分解した後、脱糖鎖酵素により糖鎖を切り出す、あるいはタンパク質へ直接脱糖鎖酵素処理をして直接糖鎖を切り出した後に分離分析するなど、前記生体高分子の構造を破壊する処理が行われている。
しかしながら、従来の方法では、タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解や、分解後のタンパク質分解酵素の除去、脱糖鎖酵素による糖鎖切り出し処理、バッファ置換等の操作が必要であるので、時間や手間がかかるだけでなく、貴重な試料をロスしてしまうという問題がある。
また、前述した従来の手法では分析対象とするタンパク質を分解しているので、試料に含まれるタンパク質とそのタンパク質に含まれる糖鎖など翻訳後修飾により与えられた構造の情報を解析出来たとしても、ターゲットとなる糖鎖などを含むタンパク質修飾体を分離し精製することは出来ておらず、立体構造と特徴的な部位によりもたらされるタンパク質本来の機能を直接解析し、活用することができない問題がある。
そのため、タンパク質医薬品として利用される免疫グロブリンなどはタンパク質に結合した糖鎖の違いにより免疫作用など薬効が異なるとされているものの、現状は糖鎖構造の違いや特徴をターゲットとした分離や精製がなされておらず、予期できない副作用等の危険性をはらんでおり、単一の糖鎖構造を有するタンパク質分離または精製方法が求められている。
特開２００７－０１０４９５号公報
"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｃ６０－ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ ｂｏｎｄｅｄ ｏｐｅｎ－ｔｕｂｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈｏｔｏ／ｔｈｅｒｍａｌ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ π－π ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ"，Ｔ．Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １３２３，１７４－１７８（２０１４） "Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｐｈｏｔｏｃｏｕｐｌｉｎｇ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｍｍｏｂｉｌａｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ"，Ｔ．Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ．， ２７（１５）， ９３７２－９３７８，Ａｕｇ ２， ２０１１．
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであって、本来の立体構造を保ったまま目的の特徴を指標としてタンパク質やペプチド等の生体高分子を分離できる液体クロマトグラフィー用分離剤を提供することを主な目的とする。
本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離剤は、基材と、タンパク質など生体高分子の特徴を認識して作用する化合物を含む認識サイト（吸着サイトともいう。）と、前記基材に前記認識サイトを結合するスペーサとを具備するものであり、前記スペーサが前記認識サイトをターゲットである生体高分子の立体構造深部へ到達させ作用させる長さのものであることを特徴とする。
このような液体クロマトグラフィー用分離剤によれば、前記スペーサによって認識サイトが前記生体高分子の立体構造深部へ入り込むことができ、認識サイトが該生体高分子表面だけでなく、立体構造深部に埋もれている部分の特徴についても認識して吸着できるので、前記生体高分子を分解することなく本来の立体構造を保ったまま、目的の特徴を指標として分離することができる。
本発明の具体的な実施態様としては、前記スペーサの長さが１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の長さであるものが挙げられる。
前記スペーサが２量体以上の重合体である、合成ポリマーを含むものであれば、前記スペーサの長さのコントロールが容易で、前記スペーサの長さを均一なものにできるので、生体高分子分離の際の再現性を向上することができる。
前記スペーサがエーテル結合、エステル結合、アミド結合、尿素結合、ウレタン結合など親水性の結合部位を含む親水性の高い合成ポリマーを含むものであれば、前記生体高分子を溶解している溶媒との馴染みが良く、また比較的柔軟性が高いので、前記生体高分子の立体構造深部に前記認識サイトがより入り込みやすい。
前記認識サイトが、例えば、カーボン微小構造体などの有機π電子系化合物であれば、該有機π電子系化合物が糖鎖などの官能基を認識して吸着するので、糖鎖を指標として糖タンパク質を含む前記生体高分子を分離することができる。
前記認識サイトがフラーレンであれば、球状の構造体であるフラーレンの直径がおよそ１ｎｍであり、例えば、タンパク質などの生体高分子と比べて十分に小さく、立体構造を持つタンパク質の深部に容易に入り込むことができるので、糖鎖などの特徴部分がタンパク質等の立体構造深部に埋もれている場合であっても、糖鎖を認識して吸着することができる。
また、ここで言うフラーレンとはＣ６０に限らず、Ｃ７０やＣ８０などの類縁体またはフラーレン誘導体を指す。
本発明の具体的な実施態様としては、前記基材が金属酸化物、カーボン、多糖類、合成ポリマーからなる群より選ばれた少なくとも一種又は複数の化合物を含むものが挙げられる。
前記基材がシリカゲルを含むものであれば、シリカゲルによる高い分離能と、認識サイトによる目的の特徴を指標とした分離能を組み合わせて、高精度で特徴的な分離が可能である。
前記基材がシリカゲル連続多孔質体であれば、シリカゲル粒子を前記基材としている場合と比較して、前記基材の空隙率が高く、高分子の保持時間を適度に短縮できるので、より高分子領域まで高い分解能で分離できる。
また、シリカゲル粒子を前記基材とする場合と比較して、前記基材の空隙率が高く、カラム内を流れる液体の流速を上げた場合でもカラム内圧の上昇を抑えることができるので、より高速での生体高分子分離が可能である。
本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離剤を充填した液体クロマトグラフィー用分離カラムによっても本発明と同様の効果を奏することができる。
基材と、生体高分子の特徴を認識して吸着する認識サイトと、前記基材に認識サイトを結合するスペーサとを具備するものであり、前記スペーサが前記認識サイトをターゲットとなる生体高分子の立体構造深部に到達させ作用させる長さのものであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離剤を用いた生体高分子の分離方法によっても本発明と同様の効果を奏することができる。
本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離剤ならびに分離カラムによれば、前記スペーサによって前記認識サイトに含まれる化合物がタンパク質やペプチド等の生体高分子の立体構造深部に入り込むことができ、前記認識サイトが該生体高分子の表層部だけでなく、立体構造深部に埋もれている部位の特徴についても認識して吸着または分離できるので、前記生体高分子を分解することなく本来の立体構造を保ったまま、目的の特徴を指標とした前記生体高分子の分離や精製をすることができる。
本発明の一実施形態に係る液体クロマトグラフィー用分離剤によるタンパク質認識の模式図。 本実施形態に係る液体クロマトグラフィー用分離剤の製造手順を示す図。 本実施形態に係るフラーレンと糖鎖との相互作用イメージを示す図。 実施例１における液体クロマトグラフィーの結果を表す図。 実施例２における液体クロマトグラフィーの結果を表す図。 実施例３における液体クロマトグラフィーの結果を表す図。 実施例４における液体クロマトグラフィーの結果を表す図。 実施例４における質量分析の結果を表す図。 実施例４における質量分析の結果を表す図。 実施例５における液体クロマトグラフィーの結果を表す図。
以下、本発明の一実施形態を、図面を用いて説明する。
本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離カラムは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置に取り付けて使用する液体クロマトグラフィー用カラムである。
前記液体クロマトグラフィー用分離カラムは、例えば、内径が０．１ｍｍ、長さが３０ｃｍ程度の市販のガラスキャピラリー管内部に前記液体クロマトグラフィー用分離剤１を保持したキャピラリーカラムである。
前記液体クロマトグラフィー用分離剤１は、図１（ｃ）に示すように、前記液体クロマトグラフィー用分離剤１の骨格となる基材１１と、ターゲットとなる生体高分子である、例えば糖タンパク質２の特徴部分である、例えば、糖鎖２１を認識して吸着する認識サイト（吸着サイトとも言う。）１２と、前記基材１１と認識サイト１２とを結合するスペーサ１３とを備えたものである。
前記基材１１は、例えば、シリカゲルを主な成分とするものであり、本実施形態では３次元網目構造を持つ連続多孔質体であるモノリス型シリカゲルを使用している。本実施形態では、前記シリカゲルの表面に、例えば、シランカップリング剤である（３－ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｌｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（以下、ｓｉｌａｎｅとも言う。）を結合したものを前記基材１１としている。
前記認識サイト１２は、前記液体クロマトグラフィー用分離剤１に特徴的な吸着性能を持たせるために前記基材１１表面、例えば、モノリス型シリカゲルの細孔内部に固定されるものであり、生体高分子の特徴を認識して作用する化合物１２Ａと該化合物を前記スペーサ１３に固定する結合試薬１２Ｂとを備えたものである。
前記生体高分子の特徴を認識して作用する化合物１２Ａは、この実施形態では、例えば、炭素微小構造体の一種であるフラーレンＣ６０である。
前記フラーレンＣ６０は、直径がおよそ１ｎｍの球状グラファイトカーボンであり、表面にπ電子を豊富に持つので、例えば、糖タンパク質２に存在する糖鎖２１を認識して吸着することができると考えられているものである。
フラーレンの固定化量としては、例えば、基材１１であるシリカゲル１００重量部に対して、１５重量部のフラーレンを固定化する。
前記結合試薬１２Ｂは、この実施形態では、例えば、４－ａｚｉｄｏ２，３，５，６－ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（以下、ＰＦＰＡとも言う。）である。
前記スペーサ１３は、前記認識サイト１２に含まれる、例えば、フラーレンを、ターゲットとなる生体高分子、例えば、糖タンパク質２の立体構造深部に埋もれている糖鎖２１に到達させるものであり、その一端が前記基材１１と結合し、他端が前記認識サイト１２に結合した例えば、長さがおよそ２ｎｍのものである。
前記スペーサ１３の素材としては、柔軟性を持つ、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとも言う。）等の直鎖状の親水性合成ポリマーが適している。
また、このスペーサ１３の両端には前記基材１１及び前記認識サイト１２とそれぞれ結合するための結合基が設けられている。
この結合基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基などを挙げることができる。
前記液体クロマトグラフィー用分離剤１は、図２に示したような手順で作製することができる。
具体的には、まず、前記基材１１であるモノリス型シリカゲルを保持したキャピラリーカラムを１．０ＭＨＣｌ、水で洗浄して基材１１のシラノール基を活性化した後に、メタノールで置換し、キャピラリー内を窒素ガスで乾燥させる。そこに、トルエン溶媒１０％（ｖ／ｖ）で希釈したｓｉｌａｎｅを送液し、モノリス型シリカゲル表面へシランを結合させる。
そこに、前記結合試薬１２Ｂである、例えば、ＰＦＰＡと、前記スペーサ１３である、例えば、ＰＥＧを結合させた試薬の、例えば、トルエン溶液（１０％ｖ／ｖ）を１０μｌ／ｈの流速で２４時間流す。
次に、例えば、トルエンを溶媒とした前記生体高分子の特徴を認識して作用する化合物１２Ａである、例えば、３６ｍＭフラーレンＣ６０溶液をキャピラリー内に満たし、２４時間室温に置いた後、さらに１４０℃で７２時間加熱する。
最後に、ジクロロベンゼン等の溶媒を送液し、反応しなかったフラーレンＣ６０を取り除く。
前記生体高分子の特徴を認識して作用する化合物１２Ａと、前記結合試薬１２Ｂと、前記スペーサ１３と、前記基材１１とを結合させる順番は、前述した手順に限らず、どのような順で結合させても良い。
このようにして作成された液体クロマトグラフィー用分離カラム１を使用した液体クロマトグラフィーによる生体高分子の分離方法は以下のようなものである。
グラジエント式ナノフロー液体クロマトグラフィー装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ、ダイオネクス社）に取り付けたキャピラリーカラムをまず分析時に使用する溶離液にて洗浄し、ターゲットとなる生体高分子である糖タンパク質２を含む試料をキャピラリーカラムに導入する。
ここでのターゲットである生体高分子とは、分離の対象となる糖タンパク質２などの生体高分子であり、前記認識サイト１２によって認識され吸着された結果、分離されるもののことである。
次にＴＦＡを体積比にて０．１％含む超純水ならびに１－プロパノールによる溶離液を、例えば、３００ｎｌ／分の流量にてキャピラリーカラムに送り込み、溶離液によって溶出する糖タンパク質２を液体クロマトグラフィー装置が備える蛍光検出器や、紫外吸光検出器あるいは質量分析器などを用いて検出する。
この時、キャピラリーカラムの洗浄操作や、試料の導入、溶離液の導入や流量の制御等は、前記液体クロマトグラフィー装置が備えるポンプ等の制御装置や制御プログラムを利用するものとする。
このような構成の液体クロマトグラフィー用分離カラム１によれば、前記スペーサ１３によって、シリカゲルの表面又は細孔内部に空間的に配置されたフラーレンが、ターゲットとなる糖タンパク質２の表面だけでなく、立体構造深部に存在する糖鎖２１についても認識して吸着するので、糖タンパク質２を分解することなく、本来の立体構造を保ったまま液体クロマトグラフィーにより分離することができる。
前記スペーサ１３として、ポリエチレングリコールを使用しているので、基材１１に対して前記認識サイト１２であるフラーレンのπ電子を損なうことなく水溶媒への親和性を高めることができる。
前記スペーサ１３の長さがＣ１６程度の長さであるので、比較的大きな糖タンパク質２の立体構造深部にも前記認識サイト１２であるフラーレンが入り込みやすい。
前記スペーサ１３がポリエチレングリコールであるので、構造的に柔軟性が高く、糖タンパク質２の立体構造深部にフラーレンが入り込みやすい。
前記スペーサ１３がポリエチレングリコールの重合体であるので、前記スペーサ１３の長さをコントロールしやすく、前記スペーサ１３の長さを目的の長さにコントロールし、かつ均一に揃えやすい。
また、ポリエチレングリコールは生体毒性が低い物質であるので、扱いやすい。
また、前記認識サイト１２であるフラーレンが直径およそ１ｎｍであり、ターゲットとなる糖タンパク質２の大きさに比べて十分に小さく、糖タンパク質２の立体構造深部に入り込みやすい。
フラーレンは、図３に示すように、その表面に豊富に存在するπ電子によって糖鎖２１のＣＨ基を認識すると考えられており、糖鎖２１に含まれるＣＨ基の数や方向等によって吸着効率が変化し、糖鎖２１の違いを識別することができるので、糖タンパク質２を糖鎖２１の種類や数によって精度良く分離できる。
糖タンパク質２を糖鎖２１の違いによって精度良く分離できるので、糖タンパク質２のバイオ医薬品としての品質を向上することができる。
具体的に説明すると、糖タンパク質２は、例えば、抗体医薬品、免疫抑制剤、抗癌剤として期待されているものであり、薬効はタンパク質部分２２によるものであり、効き方は糖鎖２１部分の構造等によって決まっていると考えられている。
しかし、これら糖タンパク質２の糖鎖２１部分の違いを認識して精度良く分離することは難しく、従来バイオ医薬品として使用されているものは、糖鎖２１構造や数の違うものが混在したものである。
本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離剤１によれば、糖鎖２１の構造や数の違いによって精度良く分離することができるので、バイオ医薬品の品質を向上することが可能であり、薬効をさらに厳密にコントロールすること等も可能であると考えられる。
前記フラーレンに対して化学修飾を行うことで、異なった吸着特性を持たせることも容易にできるので、さらに吸着能を変化させたり、調節したりすることができる。
本実施形態に係る液体クロマトグラフィー用分離剤１は、高速液体クロマトグラフィー装置で使用可能な市販のキャピラリーカラムに保持して使用することができるものであるので、従来の液体クロマトグラフィー装置を使用して簡単な操作で糖タンパク質２を本来の立体構造を保ったまま分離することができる。
また、前記液体クロマトグラフィー装置を、例えば、オンラインで高分解能質量分析計と接続することもできる。
基材１１として、シリカゲルの連続多孔質体であるモノリス型シリカゲルを使用しているので、粒子状のシリカゲルを基材１１とした場合に比べてキャピラリーカラム内の圧力の上昇を抑えることができ、より高速での糖タンパク質２分離が可能である。
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態では、糖タンパク質２をターゲット生体高分子としているが、前記認識サイト１２を変えることで、さまざまな特徴を持つタンパク質などをターゲット生体高分子とすることができる。
前記基材１１はモノリス型シリカゲルに限らず、全多孔性シリカゲル粒子、表層多孔性シリカゲル粒子、あるいは無孔性シリカゲル粒子でも良いし、シリカゲルに限らず、ガラス、チタニア、ジルコニア、アルミナ等の金属酸化物、アガロース、デキストラン又はこれらの誘導体などの多糖類、アクリルアミド、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）などのポリマー、又は活性炭等のカーボン素材などを主な成分とするものでも、これらを複数種類組み合わせたものでも良い。
前記液体クロマトグラフィー用カラムの形状は、キャピラリーカラムを採用しているが、キャピラリーカラムに限らず、例えば、液体クロマトグラフィー装置に装着可能なロッドタイプのカラムとしても良い。
また、パックドカラムに限らず、ユーザーが使用時に本発明にかかる液体クロマトグラフィー用分離剤１をオープンカラムやスピンカラムに充填するものとしても良い。
前記認識サイト１２にフラーレンＣ６０を用いているが、その他のフラーレンでも良い。また、フラーレンに限らず、フラーレンと同様にπ電子を有し、糖鎖２１を認識して吸着する性質を持つカーボンナノチューブやグラフェンなどの炭素微小構造体でも良い。
フラーレンは化学修飾により、その性質を改変することができるので、例えば、糖鎖２１に対する吸着性の向上や、認識特異性の向上等を図ることができる。
フラーレンの固定化量は、１００重量部の基材１１に対して、フラーレン１５重量部に限らず、例えば、１００重量部の基材１１に対してフラーレン５重量部以上５０重量部以下であれば糖鎖２１を十分に認識して吸着することができる。
フラーレンの固定化量を増減させることで、糖鎖２１への吸着性が変化するので、前記液体クロマトグラフィー用分離剤１の分離特性を調節することができる。
また、前記認識サイト１２は、これらの炭素微小体に限らず、レクチンなど糖鎖２１あるいは生体高分子へのアフィニティーの高い天然あるいは合成化合物を含むものでも良い。
前記スペーサ１３は、ポリエチレングリコールに限らず、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレア結合、ウレタン結合など親水性の結合部位を含む親水性ポリマーであれば良い。
また、前記結合基についても、水酸基、アミノ基、カルボキシル基に限らず、直鎖状の炭化水素部分の一端を基材１１に結合し、他端を前記認識サイト１２と結合できるものであれば良い。
前記スペーサ１３の長さは、２ｎｍのものに限らず、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下のものであれば良い。
また、前記スペーサ１３の長さが１ｎｍ以上１０ｎｍ以下のものであれば、よりターゲット生体高分子の立体構造の深部に吸着剤が届きやすいので、好ましい。
例えば、ポリエチレングリコールを前記スペーサ１３として使用する場合には、２量体のポリエチレングリコールの長さがおよそ１ｎｍである。
その他、本発明は、前記実施形態に限られること無く、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１では、スペーサを介してフラーレンを固定化したシリカモノリスキャピラリーカラムによるタンパク質の分離特性を調べた。
本実施例で使用したカラムは、基材１１であるモノリス型シリカゲルにＰＦＰＡ－ＰＥＧ－ｓｉｌａｎｅを介してフラーレンＣ６０を固定した液体クロマトグラフィー用分離剤１を担持させたものである。
本実施例では、前記スペーサ１３がＰＥＧ２００（長さ約２ｎｍ）であるカラムを使用した。このカラムを以下、ＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラムと呼ぶ。
また、比較カラムとして、モノリス型シリカゲルに前記スペーサを介さずに直接フラーレンＣ６０を固定したカラム（以下、Ｃ６０結合型カラムとも言う。）及びＣ１８型カラムを使用した。
カラムサイズは、本実施例では、内径０．１ｍｍ、長さ３０ｃｍとした。
この実施例では、試料として、ウシ血清アルブミン水溶液０．１１ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチジャパン）を使用した。
ウシ血清アルブミンは、タンパク質研究の分野において、モデルタンパク質として広く使用されている糖鎖を持たないタンパク質であり、その分子量は約６万７千である。
また、ウシ血清アルブミンは、比較的疎水性が高いタンパク質であることが知られている。
このウシ血清アルブミンをＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラム、Ｃ６０結合型カラムならびにＣ１８型カラムにて液体クロマトグラフィー分離を行った結果を、それぞれ図４（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示す。
横軸は、溶出時間を示し、縦軸は溶出したタンパク質の吸光度を示している。
高速液体クロマトグラフィー装置としては、グラジエント式ナノフロー液体クロマトグラフィー装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ、ダイオネクス社）を使用した。
また、分析条件としては、次の条件を適用した。
サンプル注入量：０．５μｌ
移動相（Ａ）：水＋ギ酸（１％ｖ／ｖ）
移動相（Ｂ）：（アセトニトリル／イソプロパノール＝５０／５０）＋ギ酸（１％ｖ／ｖ）
送液流量：３００ｎｌ／分
カラム温度：６０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
グラジエント条件：３％－４３％Ｂ（６０分）
図４（ａ）に示すように、スペーサを介さずにモノリス型シリカゲルに直接フラーレンＣ６０を結合したＣ６０結合型カラムでは、ウシ血清アルブミンのピークを検出することができなかった。
一方で、図４（ｂ）に示すように、モノリス型シリカゲルにスペーサを介してフラーレンＣ６０を結合したＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラムでは、ウシ血清アルブミンと思われるピークが検出された。
このＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラムの結果は、図４（ｃ）に示す、分離精製で一般に利用されるＣ１８型カラムのウシ血清アルブミンの溶出パターンとよく一致している。
Ｃ６０結合型カラムでは溶出できなかったウシ血清アルブミンが、ＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラムでは問題なく抽出できた要因としては、例えば、親水性のスペーサを有するＰＥＧ２００－Ｃ６０結合型カラムでは、スペーサの無いＣ６０結合型カラムに比べて、親水性のスペーサの影響でタンパク質との結合が強くなりすぎないことや、スペーサ部分に溶出液が入り込みやすいこと等が考えられる。
以上の結果から、スペーサを介してモノリス型シリカゲルにフラーレンＣ６０を固定化したカラムによれば、従来タンパク質の分離精製に一般的に利用されているＣ１８型カラムと同等の分離性能でタンパク質を分離できることが分かった。
また、スペーサを介してモノリス型シリカゲルにフラーレンＣ６０を固定化したカラムによれば、疎水性が高くカラムへの吸着力が高いウシ血清アルブミンのようなタンパク質であっても、比較的マイルドな条件での分離が可能であることが分かった。
次に、実施例２では、前述のフラーレンを固定化したシリカモノリスキャピラリーカラムによる、糖タンパク質の分離特性を調べた。
この実施例で使用したカラムは、内径が０．１ｍｍ、長さが３１ｃｍのＰＥＧ２００－Ｃ６０型カラムである。
比較カラムとしては、内径が０．１ｍｍ、長さが３１ｃｍのＣ１８型カラムを使用した。
試料として、抗ウイルス作用や抗菌作用を有するコンアルブミン（シグマアルドリッチジャパン）を使用した。
コンアルブミン（オボトランスフェリンとも呼ぶ）は分子量約７万６千の糖タンパク質であり、重量のうち約２％の糖鎖を含有している。これをＰＥＧ２００－Ｃ６０型カラムならびにＣ１８型カラムにて液体クロマトグラフィー分離を行った結果を、それぞれ図５（ａ）及び（ｂ）に示す。
横軸は、溶出時間を示し、縦軸は溶出した糖タンパク質の吸光度を示している。
高速液体クロマトグラフィー装置としては、グラジエント式ナノフロー液体クロマトグラフィー装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ、ダイオネクス社）を使用した。
また、分析条件としては、次の条件を適用した。
移動相（Ａ）Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ＝１００／０．１
移動相（Ｂ）１－プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ＝９０／１０／０．１
送液流量：３００ｎｌ／分
カラム温度：６０℃
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
グラジエント条件：
（フラーレン型カラム）３％Ｂ－（２分）－３％Ｂ－（３分）－１７％Ｂ―（５０分）－３０％Ｂ
（Ｃ１８型カラム）３％Ｂ－（２分）－３％Ｂ－（３分）－２３％Ｂ―（５０分）－３６％Ｂ
図５の結果から、分離精製で一般に利用されるＣ１８型カラムに対して、ＰＥＧ２００をスペーサに使用したフラーレン型カラムでは、同一サンプルであるにも関わらずＣ１８型カラムと比べて検出ピークの本数または挙動が異なることが分かった。
この結果から、本発明にかかる液体クロマトグラフィー用分離カラムを使用すれば、従来では作用出来なかった糖タンパク質深部の構造変化を認識して、糖タンパク質を分解することなく、そのままの形で分離できることが確認できた。
次に、本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離カラムを用いた液体クロマトグラフィーによって、抗体タンパク質の分離特性を調べた。
試料として、抗体医薬品のモデル研究に利用されるウシ血清γグロブリン（ナカライテスク）を使用した。
γグロブリンは免疫グロブリンとして知られる分子量約１５万の抗体タンパク質であり、糖鎖など翻訳後修飾による構造の違いによって免疫効果が異なるため、特殊な製法により作られたγグロブリンは抗体医薬品として利用されている。
これをＰＥＧ２００－Ｃ６０型カラムならびにＣ１８型カラムにて液体クロマトグラフィー分離を行った結果を、それぞれ図６（ａ）及び（ｂ）に示す。
なお、横軸は、溶出時間を示し、縦軸は溶出したタンパク質の吸光度を示している。
分析装置及び分析条件は、実施例２と同様のものを使用した。
図６の結果から、Ｃ１８型カラムに対して、ＰＥＧスペーサによりフラーレンを結合したカラムでは、検出ピークの本数ならびに溶出挙動が異なることが分かる。
このことから、本発明にかかる液体クロマトグラフィー用分離カラムを使用すれば、従来では作用出来なかった免疫グロブリン深部の構造変化を認識して免疫グロブリンを分離できることが確認できた。
実施例４では、スペーサとしてＰＥＧ６００を使用したＰＥＧ６００－Ｃ６０結合型カラムを用いた液体クロマトグラフィーを行い、さらに溶出したタンパク質について質量分析を行って糖タンパク質の分離ができているかを確認した。
試料としては、様々な糖鎖構造を有するものが混在していることが知られているモノクローナル抗体、ｍＡｂチェックスタンダード（０．１ｍｇ／ｍＬ、ウォーターズ社）を使用した。
これをＰＥＧ６００－Ｃ６０型カラムならびにＣ１８型カラムにて液体クロマトグラフィー分離を行った結果が、それぞれ図７（ａ）及び（ｂ）である。
なお、この図７において、横軸は溶出時間を示し、縦軸は溶出したタンパク質のイオン検出値を示している。
カラムサイズは、本実施例では、内径が０．１ｍｍ、長さが２５０ｍｍとした。
分析装置は実施例１と同じものを使用した。
また、分析条件としては、以下の条件を適用した。
サンプル注入量：０．５μｌ
移動相（Ａ）：水＋１％ギ酸（ｖ／ｖ）
移動相（Ｂ）：（アセトニトリル／イソプロパノール＝５０／５０）＋１％ギ酸（ｖ／ｖ）
送液流量：４００ｎｌ／分
カラム温度：６０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
グラジエント条件：２５％－３５％Ｂ（５０分）
この液体クロマトグラフィーの結果、図７に示したように、ＰＥＧ６００－Ｃ６０型カラムではブロードなピーク、Ｃ１８型カラムではシャープなピークとともにテーリングが確認された。
次に、図７（ａ）及び（ｂ）それぞれについて、図８及び図９に示すように範囲１、範囲２及び範囲３のそれぞれのタンパク質画分について、フーリエ変換型精密質量分析計（Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して質量電荷比（ｍ／ｚ）を計測した。
質量分析による分析条件は以下の通りである。
スキャンレンジ：８００－３，０００ ｍ／ｚ
フラグメンテーション：インソースＣＩＤ ６０．０ｅＶ
レゾリューション：１７，５００
極性：ポジティブ
マイクロスキャン：１０
ＡＧＣ：５ｅ６
スプレー電圧：２．１５ｋＶ
キャピラリー温度：３２５℃
Ｓ－ｌｅｎｓ：９０．０
得られた質量電荷比（ｍ／ｚ）を元に、ソフトウェア(Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０）によるデコンボリューション処理を行うことによりタンパク質の分子量を求めた。
このデコンボリューション処理の条件は、以下の通りである。
Ｉｎｔａｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓモード
ｍ／ｚレンジ：２，０００－３，０００
アウトプットマスレンジ：１００，０００－１６０，０００
マストレランス：２０ｐｐｍ
ターゲットマス：１５０，０００
電荷レンジ：１０－１００
図８に示すように、ＰＥＧ６００－Ｃ６０型カラムで得られたピークを範囲１～３で抽出し質量分析を行ったところ、範囲により異なる質量情報が得られた。
ｍＡｂチェックスタンダードの試料カタログ情報より、糖鎖を含まない場合のタンパク質分子量は約１４．５万であり、糖鎖との結合により約１４．８－１４．９万の分子量となる。
図８のピーク前方の範囲１で得られた分子量は約１４．５万であり、糖鎖の解離したタンパク質が溶出していると考えられる。一方、ピーク後半の範囲２、３での分子量は約１４．８万であり、かつ、範囲２と範囲３で異なる分子量値が示されたことから、糖鎖構造の異なるモノクローナル抗体が分離されていると考えられる。
これに対し、図９に示すように、Ｃ１８型カラムで得られたピーク範囲１～３においては、メインピークである範囲１とその後に続く範囲２ならびに範囲３ではほぼ同じ分子量の値が示された。
そのため、Ｃ１８型カラムで見られたピーク形状の変化や溶出挙動は分子量の違い（糖鎖種類の違いなど）による分離はされなかったと考えられる。
以上の結果から、親水性スペーサを利用したフラーレン結合型カラムは水系の溶媒中に存在する糖タンパク質を糖鎖の種類や構造に基づいて分離精製する特徴を有することが示された。
次に、本発明に係る液体クロマトグラフィー用分離カラムを用いた液体クロマトグラフィーによって、糖鎖の違いを識別する実験を行った。
スペーサを有しないフラーレン結合キャピラリーカラム（以下、Ｃ６０結合型カラムともいう。）ならびにＣ１８型カラムを使用して、グルコース単糖からグルコースが２３個連なったオリゴ糖までの、さまざまな長さの糖鎖を試料として用い、糖タンパク質分析で使用される分離条件にて、これらの分離を試みた結果をそれぞれ図１０（ａ）及び（ｂ）に示す。
ここで、サンプル名中の数字はグルコースの結合数を表しており、例えば、Ｇ１はグルコース１量体を、Ｇ２はグルコース２量体をそれぞれ表す。
また、クロマトグラフィー条件は次の通りであり、糖タンパク質分析と同等の条件を適用している。
なお、液体クロマトグラフィー装置として、グラジエント式ナノフロー液体クロマトグラフィー装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ｎａｎｏ、ダイオネクス社）を使用した。
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ＝１００／０．１
移動相Ｂ：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１
流量：５００ ｎｌ／分
カラム温度：４０℃
検出波長：３３０ ｎｍ
サンプル：２－ＡＢグルコースホモポリマー
注入量：５００ ｎｌ
グラジエント：５－５０％Ｂ（８０分リニア）
図１０（ａ）に示すように、本発明に係るフラーレン結合型キャピラリーカラムにおいては、グルコースが１０量体程度まで多数連なったオリゴ糖に対して、糖鎖の長さを非常に感度良く認識し分離出来ることが分かった。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、Ｃ１８型キャピラリーカラムでは単糖及び２糖のオリゴ糖については、シャープなピークが確認され、分離出来るものの、それ以上の高分子量の糖鎖については分離出来ないことが分かった。
このように、本発明に係るフラーレン結合型液体クロマトグラフィー用分離カラムによれば、タンパク質の分離条件において、糖鎖の違いを非常に感度良く認識して分離できることが分かった。
１・・・分離剤
１１・・・基材
１２・・・認識サイト
１２Ａ・・・生体高分子の特徴を認識して作用する化合物
１３・・・スペーサ
２・・・タンパク質

Claims (11)

  1. 基材と、立体構造深部に糖鎖を有する糖タンパク質である生体高分子の立体構造深部の糖鎖を認識して作用する化合物として生体高分子の立体構造深部へ入り込むことができる大きさの炭素微小構造体を含む認識サイトと、前記基材に前記認識サイトを結合するスペーサとを具備するものであり、
    前記スペーサが前記認識サイトをターゲットである生体高分子の立体構造深部へ到達させ作用させる長さのものであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離剤。
  2. 前記スペーサの長さが１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の長さであることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  3. 前記スペーサが２量体以上の重合体を含むものであることを特徴とする請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  4. 前記スペーサである重合体にエーテル結合、エステル結合、アミド結合、尿素結合、ウレタン結合を含むことを特徴とする請求項１、２又は３記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  5. 前記認識サイトが、有機π電子系化合物を含むものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  6. 前記認識サイトがフラーレンを含むものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  7. 前記基材が金属酸化物、カーボン、合成ポリマーからなる群より選ばれた少なくとも一種又は複数の化合物を含むものであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  8. 前記基材がシリカゲルを含むものであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  9. 前記基材がシリカゲル連続多孔質体を含むものであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤。
  10. 請求項１乃至９のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用分離剤を充填したことを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離カラム。
  11. 基材と、立体構造深部に糖鎖を有する糖タンパク質である生体高分子の立体構造深部の糖鎖を認識して作用する化合物として生体高分子の立体構造深部へ入り込むことができる大きさの炭素微小構造体を含む認識サイトと、前記基材に前記認識サイトを結合するスペーサとを具備するものであり、前記スペーサが前記認識サイトをターゲットである生体高分子の立体構造深部へ到達させ作用させる長さのものであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離剤を用いた生体高分子の分離方法。
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