JP7077343B2

JP7077343B2 - 操作された遺伝子を含む発現ベクター

Info

Publication number: JP7077343B2
Application number: JP2019569265A
Authority: JP
Inventors: ショージ，ステファニー; チャールズウォーカー，マシュー; エムクルマン，ディミトリ; スノーボール，アルバート; シャブロル，エロディ
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2022-05-30
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: ES2902774T3; JP2020527941A; WO2018229254A1; GB201709551D0; US20210000977A1; US11779658B2; EP3638796B1; EP3638796A1; PL3638796T3

Description

本出願は、２０１７年６月１５日出願の英国特許出願公開第１７０９５５１．４号（その内容及び要素は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる）からの優先権を主張する。

技術分野
本発明は、概して、てんかん及び類似の神経学的障害の治療に使用され得るカリウムチャネルをコードする操作された遺伝子を伴う方法及び材料に関する。

背景技術
全世界で６千万人を超える人々がてんかんに罹患している（Ngugi et al., 2010）。最適な治療を受けたとしても、約３０％に薬剤療法耐性が残る（Kwan et al., 2011；Picot et al., 2008）。過去２０年間の新たな抗てんかん薬剤の開発は、難治性てんかんにほとんど効果がなく、発作の抑制が不十分な人々は、引き続き主要な併存症、社会的排除及び年率０．５～１％のてんかん突然不慮死（ＳＵＤＥＰ）を経験する（Devinsky, 2011；Hoppe and Elger, 2011）。手術により難治性てんかん患者が発作から解放されることもあるが、それが適さない症例は、９０％を超える。新皮質焦点てんかんは、言語、視覚又は微細運動制御に関与する皮質のエロクエント領域の損傷リスクが高いため、外科的介入が特に不適である（Schuele and Lueders, 2008）。焦点新皮質てんかんの人々は、多くの場合、通常、待期的であるごくわずかな治療の選択肢が残されているにすぎない。したがって、新たな治療を開発する緊急の必要性が存在する。

遺伝子療法は、有望な選択肢の１つであるが（Kullmann et al., 2014）、ウイルスベクターを用いて、安定であり、予測可能であり且つ安全なトランスジーン発現を達成するという大きい課題が残されている。これまで、ＣＮＳ障害に対するレンチベクターを用いた臨床試験は、酵素欠損に対する造血幹細胞のエクスビボ治療に主に制限されてきたが（Biffi et al., 2013, 2013；Cartier et al., 2009）、線条体に注入されたレンチベクターを用いる最近の試験によりパーキンソン病において安全性及び耐容性が実証され、Ｌ－ＤＯＰＡの必要量の減少の証拠がいくらか示されている（Palfi et al., 2014）。

てんかんに対する遺伝子療法の研究は、初期には、十分に説明されないことの多い急性誘発発作に重点が置かれた（Galanopoulou et al., 2012）。しかしながら、側頭葉てんかんモデルでアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に主に重点が置かれたより最近のストラテジーにより、てんかん原性傷害（てんかん原性）後の発作の発生を減衰可能であることが示された（Bovolenta et al., 2010；Haberman et al., 2003；Kanter-Schlifke et al., 2007；Lin et al., 2006；McCown, 2006；Noe’et al., 2012；Richichi et al., 2004；Woldbye et al., 2010）。

カリウムイオンチャネルは、通常、ニューロトランスミッターの発火及び放出を行うニューロンの傾向を低減する。ウイルスベクターを用いて脳に導入した場合、それらは、齧歯動物において脳興奮性の抑制及び実験てんかんの治療のツールとして有効である。

したがって、カリウムチャネル遺伝子療法は、ヒトてんかん及びニューロンが過剰発火する他の神経精神医学的疾患、例えば慢性疼痛の治療に有望である。

カリウムチャネルとてんかんなどの神経学的障害との関連は、説明されてきている（D’Adamo et al., 2013）。ニューロン興奮性をモジュレートする遺伝子のアップ又はダウンレギュレーションに基づく遺伝子療法ストラテジーは、電位療法として説明されてきている（Wykes and Lignani, 2017）。

ラット運動皮質への破傷風毒素（ＴｅＮＴ）注入により誘発された持続性部分てんかん（ＥＰＣ）モデルにおける遺伝子療法への以前のアプローチは、説明されてきている（Kaetzel et al., 2014；Wykes et al., 2012）。このモデルでは、病理学的高頻度皮質脳波（ＥＣｏＧ）活動が顕著であるが、離散長期持続性発作が稀である。ＫＣＮＡ１によりコードされるヒトカリウムチャネルＫｖ１．１のレンチウイルス過剰発現は、運動皮質において病理学的高頻度活動の低減にきわめて有効であった（Wykes et al., 2011 & 2012）。Ｋｖ１．１過剰発現は、内因性ニューロン興奮性及びトランスデュース錐体ニューロンからのグルタメート放出の両方を低減することがインビトロ研究により示された（Heeroma et al., 2009；Wykes et al., 2012）。重要なことは、両方の効果がグレード分けされたことである。すなわち、ニューロン興奮性もニューロトランスミッター放出も完全には消失しなかった。しかしながら、興奮性及びトランスミッター放出に対するこうしたグレード分けされた効果並びに運動皮質における病理学的ＥＣｏＧ活動の低減を脳の他の部分から生じるより一般的なより長期持続性の焦点発作に外挿可能であるかは、依然として不明である。

Streit et al. (2011 & 2014)は、Ｋｖ１．１チャネルが酵素的ＲＮＡ脱アミノ化を受けて内側孔腔に位置する単一アミノ酸交換を有するチャネル（Ｋｖ１．１^{Ｉ４００Ｖ}）を形成すると記載している。

したがって、てんかんなどの神経学的疾患を治療するための改善された遺伝子療法ツールの必要性が当技術分野に依然として存在する。

発明の開示
本発明者らは、予想外にも、組合せにより、コードＫｖ１．１タンパク質の翻訳及び活性の増強並びに細胞内のＫＣＮＡ１遺伝子発現の検出の改善が可能である、ＫＣＮＡ１遺伝子に対するいくつかの改変を行った。簡潔に述べると、本発明者らは、編集されたカリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む発現ベクターの設計及び試験を行った。本明細書で実証されるように、本発明の操作されたＫＣＮＡ１遺伝子は、機能性Ｋｖ１．１チャネルを生成すると共に、レンチウイルスベクターにパッケージした場合、ランダム化盲検化前臨床試験でラットに投与したときに発作頻度を有意に低減可能であった。

本発明の態様は、本明細書に添付の特許請求の範囲に規定される。

一態様では、本発明は、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルであって、ヒト細胞において編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの発現を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に結合された編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む発現ベクターであって、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２に示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む、発現ベクターを提供する。一実施形態では、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。

本発明は、ウイルス粒子及び本明細書で明らかにされるウイルス粒子を作製するインビトロ方法も提供する。

さらに、本発明は、本明細書で明らかにされるウイルスベクターと、本明細書で明らかにされる１つ以上のウイルスパッケージングベクター及びウイルスエンベロープベクターとを含むキットを提供する。

さらに、本発明は、人体又は動物体の治療の方法に使用するための、本明細書で明らかにされるウイルス粒子を提供する。

さらに、本発明は、本明細書で明らかにされる細胞内における操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの存在を確認する方法及び本明細書で明らかにされるウイルス粒子を投与された対象から得られた細胞内における操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの存在を確認するインビトロ又はエクスビボ方法を提供する。

本発明は、本明細書で明らかにされる発現ベクターを含む細胞も提供する。

さらに、本発明は、本明細書で明らかにされる核酸も提供する。

ここで、本発明のいくつかの特定の態様をより詳細に考察する。

発現ベクター
本発明は、本明細書で明らかにされるプロモーターに作動可能に結合された編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む発現ベクターを提供する。

本明細書で用いられる発現ベクターは、細胞内で外来遺伝物質の移入及び発現に使用されるＤＮＡ分子である。かかるベクターは、発現されるタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に結合されたプロモーター配列を含む。「プロモーター」とは、それが作動可能に結合されたＤＮＡ配列の転写を指令するのに十分な最小ＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター」は、細胞型特異的発現を制御できるプロモーター依存遺伝子発現に十分なプロモーターエレメントを包含することも意図され、かかるエレメントは、天然遺伝子の５’又は３’領域に位置し得る。

発現ベクターは、終止コドン及び発現エンハンサーも含み得る。いずれの適当なベクター、プロモーター、エンハンサー及び終止コドンも、本発明に係る発現ベクターから編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルを発現するために使用され得る。適当なベクターとしては、プラスミド、バイナリーベクター、ファージ、ファージミド、ウイルスベクター及び人工染色体（例えば、酵母人工染色体又は細菌人工染色体）が挙げられる。以下にさらに詳細に記載されるように、好ましい発現ベクターとしては、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。

発現ベクターは、レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を追加的に含み得る。レポータータンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。レポーター遺伝子は、それ自体のプロモーターに作動可能に結合し得るか、又はより好ましくは本発明に係る操作されたＫＣＮＡ１遺伝子と同一のプロモーターに作動可能に結合し得る。後者の例として、ＫＣＮＡ１遺伝子及びレポーター遺伝子は、Ｔ２Ａペプチドなどの２Ａペプチドをコードする配列の両側に位置し得る。２Ａペプチドは、リボソーム媒介翻訳時にペプチド結合形成を障害することにより、単一プロモーターからのマルチシストロニック遺伝子発現を可能にする短い（約２０アミノ酸）配列である（Szymczak and Vignali, 2005）。操作されたＫＣＮＡ１遺伝子と同一のプロモーターに作動可能に結合されたレポーター遺伝子を有することにより、ＫＣＮＡ１遺伝子発現の信頼できるインジケーターとして作用すると考えられる。レポーター遺伝子を含む発現ベクターは、動物モデル用途などの前臨床用途に特に有用であり得る。その場合、それは、遺伝子発現の局在化の評価に役立つように使用可能である。

他の実施形態では、発現ベクターは、レポータータンパク質をコードする配列が欠如している。これは、例えば、規制上の理由で好ましいこともある。本発明の実施形態では、本発明のＫＣＮＡ１遺伝子のレポート又は検出は、さまざまな方法において－例えば、その操作された配列に基づいて達成され得る。

一般的に言えば、当業者は、組換え遺伝子発現のためにベクターの構築及びプロトコルの設計を行うことが十分に可能である。以上に記載の本発明のエレメントに加えて、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含めて、適切なレギュラトリー配列を含有する適当なベクターの選択又は構築が可能である。細胞内のポリペプチド発現に適当な分子生物学技術は、当技術分野で周知である。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, (1995, and periodic supplements)を参照されたい。

本明細書で用いられる「作動可能に結合された」という用語は、選択された遺伝子及びプロモーターがプロモーターの影響下又は制御下で遺伝子（すなわちポリペプチドコード）の発現の位置決めを行うように共有結合された状況を含む。そのため、プロモーターが細胞内で遺伝子からＲＮＡへの転写を引き起こすことが可能であれば、プロモーターは、操作されたＫＮＣＡ１遺伝子に作動可能に結合された状態である。次いで、適切な場合、得られたＲＮＡ転写物を所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳し得る。プロモーターは、哺乳動物細胞内で作動可能に結合された遺伝子の発現を行うのに好適である。好ましくは、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。

ＫＣＮＡ１遺伝子及びＫｖ１．１カリウムチャネル
ＫＣＮＡ１（カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーＡメンバー１、ＫＶ１．１、ＨＢＫ１及びＲＢＫ１としても知られる遺伝子ＩＤ３７３６）は、ヒトＫｖ１．１カリウムチャネル（カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーＡメンバー１としても知られる）をコードするヒト遺伝子である。「野生型ＫＣＮＡ１遺伝子」とは、ヒト細胞に見いだされ、且つヒトＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする核酸分子を意味する。ＫＣＮＡ１遺伝子は、コード配列の上流又は下流にレギュラトリー配列を含み得る。野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列は、非コード５’及び３’非翻訳領域（５’及び３’ＵＴＲ）を含めてＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００２１７．２に提供される。野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００２１７．２の位置１１０６～２５９３に対応する配列番号４のヌクレオチド配列を有する。

Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、ショウジョウバエシェーカーチャネルに系統発生学的に関連する電圧ゲート遅延カリウムチャネルである。野生型Ｋｖ１．１カリウムチャネルのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００２０８．２に等しい配列番号５のアミノ酸配列を有する。電圧依存カリウムチャネルは、電圧に反応してカリウム選択孔の開閉を行うことにより興奮性をモジュレートする。多くの場合、カリウムイオンフローは、細胞内粒子が孔を塞いたときに中断可能であり、これは、速い不活性化として知られるプロセスである。Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、６つの推定膜貫通セグメントを有し、第５及び第６のセグメント間のループが孔を形成する。

細胞内の正常生成時、細胞内のＫＣＮＡ１ＲＮＡのいくつかは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）により編集されて、第６の膜貫通ドメイン内に位置し、イオン伝導孔の内側前庭をライニングする単一位置Ｉ４００にイソロイシン／バリン（Ｉ／Ｖ）の再コードイベントを引き起こす（Hoopengardner et al., Science 301(5634):832-6, 2003）。負の膜電位では、未編集Ｉ４００を含有するチャネルは、その編集（Ｖ４００）カウンターパートの約１／２０の速度で不活性化から回復する（Bhalla et al., 2004）。

本発明は、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの発現に関与する。

「編集されたＫｖ１．１カリウムチャネル」は、機能性Ｋｖ１．１カリウムチャネルであるが、以上に記載のイソロイシン／バリン突然変異を含有する。何らかの特定の理論により拘束されることを望むものではないが、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルを提供すると、細胞内で通常行われるＡＤＡＲ依存ＲＮＡ編集ステップに依拠することなく編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルが細胞に直接提供されるため、有利であると考えられる。こうした編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、その未編集対照物よりも不活性化からの回復がかなり速いと考えられる。

さらに、通常、ＫＣＮＡ１ＲＮＡのすべてが細胞内で編集されるとは限らない。Hoopengardner et al., Science 301(5634):832-6, 2003（特に図３を参照されたい）に記載されるように、行われるＲＮＡ編集の量は、尾状核内の約１７％から髄質内の約７７％に至るまでヒト神経系のさまざまな領域にわたり変化する。例えば、前頭皮質内では、ＫＣＮＡ１ＲＮＡの約２０％が編集されると考えられる。すなわち、ＫＣＮＡ１ＲＮＡの約８０％は、脳のこの領域内に未編集の状態で残る。

本明細書の実施例に示されるように、編集されたＫｖ１．１チャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を提供することにより、ランダム化盲検化前臨床試験でラットに投与したときに発作頻度を効率的に低減可能であった。

本明細書で用いられる場合、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号２に示されるアミノ酸残基４００に対応する位置（「編集位置」）にバリンアミノ酸残基も含有する。いくつかの好ましい実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列を有する。

配列番号２に示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、当技術分野で公知の方法により同定可能である。例えば、編集位置は、配列番号２のアミノ酸配列と対象とする編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルのアミノ酸配列との間の配列アライメントにより同定可能である。その際、かかる配列アライメントを用いて、少なくともアライメントで配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基４００の編集位置の近傍又はそれと同一の位置にある対象とする編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの編集位置を同定可能である。

機能性Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、カリウムチャネルの通常の活性を保持するタンパク質であり、例えば、チャネルは、電圧に反応して開閉可能である。Ｋｖ１．１カリウムチャネルが機能性であることを試験する方法は、当技術分野で公知であり、そのいくつかは、本明細書に記載されている。簡潔に述べると、Ｋｖ１．１カリウムチャネルが機能性であることを確認するのに適当な方法は、Ｋｖ１．１カリウムチャネルをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることと、パッチクランピングなどの電気生理学的技術を用いてカリウムチャネルの電流を記録することとを含む。

野生型Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号５に示されるように位置３７９にチロシンアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２に示されるアミノ酸残基３７９に対応する位置にチロシンアミノ酸残基を含む。

他の実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２に示されるアミノ酸残基３７９に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む。このアミノ酸配列を有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの例は、配列番号１４に示される。何らかの特定の理論により拘束されることを望むものではないが、Ｙ３７９Ｖ突然変異は、カリウムチャネルの機能性を変化させることなくテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）に対するＫｖ１．１チャネルの感度を低減すると考えられる。例えば、こうした感度の変化により、トランスジェニックＫｖ１．１チャネルをその野生型カウンターパートからパッチクランプ電気生理学実験で薬理学的に単離可能である（Heeroma et al. 2009）。

本発明では、「操作されたＫＣＮＡ１遺伝子」が使用される。操作されたＫＣＮＡ１遺伝子は、本明細書に記載の野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列と異なるが、依然として機能性Ｋｖ１．１カリウムチャネルをコードする。本明細書で用いられる場合、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。

以上に記載したように、本発明の実施形態は、配列番号１４に示されるように位置３７９にバリンアミノ酸残基を含む編集されたカリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む。配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子の例は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなるヌクレオチド配列を有するか、又は配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の配列同一性を有する。

細胞型特異的プロモーター
従来の研究は、ラットにおいて興奮性ニューロンに対する強いバイアスが実証された強いウイルスプロモーター（ＣＭＶ）を用いてＫＣＮＡ１の過剰発現を駆動することに依拠した（Wykes et al., 2013）。しかしながら、ＣＭＶプロモーターなどの非特異的プロモーターの使用に伴う安全上の問題が存在する。例えば、てんかんの場合、問題は、興奮性ニューロン、例えば介在ニューロン以外の細胞内におけるカリウムチャネル過剰発現の可能性であり、これにより局所興奮性の減衰ではなく増悪によって発作活動を悪化させる可能性がある。したがって、安全性を改善する方法は、Ｋｖ１．１カリウムチャネルの発現を特定の細胞型に制限することであろう。しかしながら、特に編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルを発現する場合、細胞型特異性を駆動するプロモーターが、インビボで機能的効果を有するのに十分な発現を提供するかは明らかでない。

本発明者らは、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子の結果として改善される発現が、細胞型特異的プロモーターを用いてこの遺伝子の発現を駆動可能であることを意味することを見いだした。

そのため、いくつかの実施形態では、プロモーターは、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの細胞型特異的発現を駆動する細胞型特異的プロモーターである。細胞型特異的プロモーターは、対象細胞型において他の細胞型よりも多くの発現を駆動するプロモーターである。例えば、細胞型特異的プロモーターがニューロンに特異的である場合、これは、ニューロンにおいてグリア細胞などの他の細胞型よりも多くの発現を駆動するであろう。好ましくは、細胞型特異的プロモーターとは、発現の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は最も好ましくは１００％が他の細胞型ではなく対象細胞型において行われることを意味する。

遺伝子及びタンパク質の発現及び局在化を決定する方法は、当技術分野で公知である。それらは、ＲＮＡ転写物を検出するアッセイ、例えば本明細書に記載のハイブリダイゼーション法及びタンパク質を検出する方法、例えば免疫組織化学的方法を含む。細胞型特異的プロモーターの細胞型特異性を評価するかかる方法の１つは、ＲＮＡ転写物又はタンパク質と特定の細胞型に対するマーカーとのオーバーラップを比較することであろう。例えば、細胞型特異的プロモーターがニューロンに特異的であると考えられる場合、このプロモーターに作動可能に結合された対象遺伝子に対するＲＮＡ又はタンパク質の局在化は、ニューロンに対する公知の免疫組織化学的マーカー、例えばＮｅｕＮ及びグリア細胞に対するもの、例えばＧＦＡＰの局在化とのオーバーラップに関して比較可能である。対象遺伝子とニューロンとの間で対象遺伝子とグリア細胞との間よりも多くのオーバーラップが観測された場合、プロモーターは、ニューロン細胞型特異的プロモーターと見なされるであろう。

使用される細胞型特異的プロモーターは、標的となる細胞型に依存するであろう。例えば、神経学的障害を治療する場合、ニューロン及びグリア細胞などの神経系細胞を標的とすることが好ましいであろう。特に好ましい例では、細胞型特異的プロモーターは、ニューロンに特異的である。換言すると、それは、ニューロンにおいてグリア細胞よりも高レベルの発現を駆動する。いくつかの場合、細胞型特異的プロモーターは、グルタミン酸作動性ニューロンなどの興奮性ニューロンに特異的である。興奮性ニューロンの例は、錐体ニューロンである。グルタミン酸作動性ニューロンは、グルタミン酸作動性細胞に特異的なマーカー、例えばｖＧｌｕｔ１、ｖＧｌｕｔ２、ＮＭＤＡＲ１、ＮＭＤＡＲ２Ｂ、グルタミナーゼ、グルタミンシンテターゼを検出することにより同定可能である。何らかの特定の理論により拘束されることを望むものではないが、グルタミン酸作動性ニューロンにおける操作されたＫＣＮＡ１遺伝子の細胞型特異的発現は、ニューロン過興奮性を伴う疾患、特にてんかんの治療に有用であると考えられる。

神経系細胞型特異的プロモーターの好ましい例は、ヒトＣＡＭＫ２Ａ（αＣａＭキナーゼＩＩ遺伝子）プロモーターである。ＣＡＭＫ２Ａプロモーターは、発現を興奮性ニューロンにバイアスすると共に、さらにＧＡＢＡ作動性細胞（介在ニューロンとしても知られる）にごくわずかな発現をもたらすことが知られている（Dittgen et al., 2004；Yaguchi et al., 2013)。したがって、ＣＡＭＫ２Ａプロモーターは、興奮性ニューロンに特異的な細胞型特異的プロモーターの例である。ＣＡＭＫ２Ａプロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有し得る。代替的に、ＣＡＭＫ２Ａプロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有し得る。

ニューロンに特異的であると考えられる他のプロモーターは、ＶＧＬＵＴ１プロモーターである（Zhang et al. Brain Research 1377:1-12, 2011（少なくともプロモーター配列及び関連配列に関して参照により本明細書に組み込まれる））。Zhang et al.に記載されるように、ラットＶＧＬＵＴ１上流プロモーター又は第１のイントロンは、基本プロモーターへの融合後、グルタミン酸作動性特異的発現をもたらす。ラットにおいてグルタミン酸作動性ニューロンに特異的であることが示されたプロモーターのさらなる例は、ＰＡＧプロモーターである（Rasmussen et al. Brain Research 1144: 19-32, 2007（少なくともプロモーター配列及び関連配列に関して参照により本明細書に組み込まれる））。

他の神経系細胞型特異的プロモーターとしては、ＮＳＥプロモーター（Liu H. et al., Journal of Neuroscience. 23(18):7143-54, 2003及びPeel AL. et al., Gene Therapy. 4(1): 16-24, 1997）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Kessler MA. et al., Brain Research. Molecular Brain Research. 112(l-2):8-23, 2003）、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター（Kessler MA. et al Biochemical & Biophysical Research Communications. 288(4):809-18, 2001）、ニューロフィラメント遺伝子（重鎖、中鎖、軽鎖）プロモーター（Yaworsky PJ.et al. , Journal of Biological Chemistry. 272(40):25112-20, 1997）が挙げられる（それらは、すべて少なくともプロモーター配列及び関連配列に関して参照により本明細書に組み込まれる）。さらなる適当なプロモーターは、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターである（Kuegler et al“Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.”Gene Therapy. 10(4):337-47 2003)を参照されたい）。

Ｎａｖ１．７及びＮａｖ１．８ナトリウムチャネルは、疼痛で重要な役割を果たすと考えられるため、それらのプロモーターは、慢性疼痛などの疾患の治療に使用可能である。Ｎａｖ１．７をコードするヒト遺伝子は、ＳＣＮ９Ａであり、ＳＣＮ９Ａプロモーターの同定及び使用は、例えば、Diss et al. Molecular and Cellular Neuroscience. 37(3): 537-47, 2008に記載されている。Ｎａｖ１．８をコードするヒト遺伝子は、ＳＣＮ１０Ａであり、ＳＣＮ１０Ａの同定及び使用は、例えば、Puhl & Ikeda, Journal of Neurochemistry. 106(3): 1209-24, 2008に記載されている。これらの参照文献は、少なくともプロモーター配列及び関連配列に関して参照により本明細書に組み込まれる。

ウイルスベクター
本発明に使用するのに好ましい発現ベクターは、レンチウイルスベクター又はＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである。特に好ましい発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、典型的にはウイルス粒子にアセンブルしたとき、感染のために長いインキュベーション時間を有することにより特徴付けられ、且つ有糸***後のニューロンなどの非***細胞に感染可能である特別なタイプのレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、一般的には、迅速で安定で且つ空間制限された発現をもたらす（Lundberg et al., 2008）。これは、焦点発作がエロクエント皮質に非常に近い脳領域から生じることの多いてんかんなどの疾患の治療に最適であり得る。加えて、レンチベクターの大きいパッケージング能力によりプロモーター－トランスジーンの組合せの選択肢が増えるため（Kantor et al., 2014）、発現の特異性をさらに増加させることが可能である。

レンチウイルスベクターは、レンチウイルスファミリーのウイルスに由来するウイルス核酸骨格に基づく。天然に見いだされるレンチウイルスの感染プロセスは、当業者に周知である。何らかの特定の理論により拘束されることを望むものではないが、これについて簡単な説明をここに提供する。レンチウイルスは、レトロウイルスである。すなわち、それは、一本鎖ＲＮＡゲノムとリバーストランスクリプターゼ酵素とを有する。この一本鎖ＲＮＡゲノムは、宿主細胞の外膜への付着を促進する突出した糖タンパク質を有するウイルスエンベロープ内にパッケージされる。ウイルスゲノム内には、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子領域をはじめとする核酸配列が存在する。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスＲＮＡゲノムの逆転写に必要とされるリバーストランスクリプターゼ酵素と、宿主細胞ゲノム内へのウイルスゲノムの効率的インテグレーションに必要とされるインテグラーゼ酵素とをコードする。ｅｎｖ遺伝子は、各種エンベロープタンパク質をコードし、且つｇａｇ遺伝子は、各種構造タンパク質をコードする。

感染時、ウイルス物質が宿主細胞に注入されると、ウイルスリバーストランスクリプターゼは、ウイルスＲＮＡゲノムの逆転写を行ってウイルスＤＮＡゲノムを形成する。次いで、ウイルスＤＮＡは、宿主細胞のゲノムに導入される。そこから、宿主細胞は、転写及び翻訳を行って、宿主細胞からバーストされ、且つ他の宿主細胞への感染を継続可能であるウイルス粒子を形成する。

レンチウイルスベクターは、野生型レンチウイルスゲノムから非必須配列並びにウイルスの複製及び病原性に関与するゲノム領域を除去してパッケージング及びプロセシングに必要なエレメントを含有する複製欠損ベクターをもたらすことにより開発されてきた（Shaw & Cornetta, Biomedicines 2(1): 14-35, 2014）。

本明細書で用いられる場合、レンチウイルスベクターとは、ＲＮＡに転写される操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を生成するのに十分なレンチウイルス遺伝子を含み、且つＲＮＡがレンチウイルスエンベロープタンパク質及びパッケージングタンパク質と共に発現時にウイルス粒子にパッケージされているＤＮＡ発現ベクターを意味する。典型的には、レンチウイルスベクターは、ＳＩＶ及びＨＩＶなどのレンチウイルスの５’及び３’長末端反復（ＬＴＲ）領域を含有する。５’ＬＴＲは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして作用可能である。いくつかのレンチウイルスベクターでは、Ｕ３領域などの５’ＬＴＲプロモーターの部分は、他のプロモーター、一般的にはＣＭＶプロモーター又はＳＶプロモーターなどの構成プロモーターにより置き換えられる。レンチウイルスベクターは、細菌プラスミド部分、ウイルスベクターＲＮＡパッケージング及び細胞内輸送に必要とされる追加のレンチウイルスエレメント、マーカー遺伝子並びにそれらのレギュレーションのためのエレメント、任意選択的なクロマチン制御エレメント、及び使いやすいプラスミドＤＮＡ再操作用部位も含有し得る。

好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターは、５’→３’方向に順にＣＭＶエンハンサー／プロモーター、トランケート５’ＬＴＲ、ＨＩＶ－１パッケージングシグナル、Ｒｅｖ反応エレメント、セントラルポリプリントラクト及びセントラル終止配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）、細胞型特異的プロモーター（例えば、ヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーター）、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後レギュラトリーエレメント及び３’ＬＴＲを含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする配列を含有する。ＧＦＰをコードする配列を含有するレンチウイルスベクターの例は、配列番号７に示される。他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする配列が欠如している。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号９又は配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号９又は配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。配列番号９は、位置３７９にチロシンを有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする一方、配列番号１１は、位置３７９にバリンを有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号１０又は配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、配列番号１０又は配列番号１２のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。配列番号１０は、位置３７９にチロシンを有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする一方、配列番号１２は、位置３７９にバリンを有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を追加的に含む。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、非インテグレーティングレンチウイルスベクター（ＮＩＬＶ）である。これらのベクターから生成されるベクター粒子は、そのウイルスゲノムを細胞のゲノムにインテグレートしないため、一過的発現が必要とされる用途又は静止細胞などの持続エピソーム発現に有用である。ＮＩＬＶは、インテグラーゼ酵素の突然変異により、又は５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲを変化させてインテグラーゼがこれら配列を結合しないようにすることにより形成可能である。こうした改変は、逆転写及び核へのプレインテグレーション複合体の輸送に影響を及ぼすことなくインテグラーゼ活性を排除する。何らかの特定の理論により拘束されることを望むものではないが、ＮＩＬＶが細胞に入ったとき、レンチウイルスＤＮＡは、エピソームとして核内に残るように残留して有糸***後の細胞などの細胞内で持続発現をもたらすと予想される。本明細書で実証されるように、ＮＩＬＶと、ＣＡＭＫ２Ａなどの細胞型特異的プロモーターとの組合せ使用は、発現をニューロンなどの特定の細胞型に効果的に標的化可能であることを意味する。

ＮＩＬＶを生成する方法は、Shaw & Cornetta Biomedicines 2(1): 14-35, 2014（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インテグレーションの阻害に使用される突然変異の例としては、インテグラーゼ酵素のＤ６４突然変異、例えばＤ６４Ｖ置換が挙げられる。インテグレーションを阻害するのに適当なこうした及び他の改変例は、例えば、Shaw & Cornetta, Biomedicines 2(1): 14-35, 2014の表１に記載されている。

ウイルス粒子
本発明は、レンチウイルス粒子を作製するインビトロ方法も含む。一実施形態では、本方法は、本明細書に記載のレンチウイルスベクターで哺乳動物細胞をトランスデュースし、細胞内で粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質を発現させることと、トランスデュース細胞を培養培地中で培養することであって、それにより細胞が、培地中に放出されるレンチウイルス粒子を生成する、培養することとを含む。適当な哺乳動物細胞の例は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞である。

ウイルス粒子の形成及び機能に必要とされるレンチウイルス成分をすべてコードする単一発現ベクターを使用することが可能である。しかしながら、ほとんどの場合、レンチウイルスベクター粒子を形成する各種遺伝成分を分離するために、宿主細胞内に安定にインテグレートされる複数のプラスミド発現ベクター又は個別の発現カセットが利用される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする発現カセットが哺乳動物細胞内に安定にインテグレートされた。これらの実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルスベクターでこうした細胞をトランスデュースすれば、さらなる発現ベクターを添加することなくレンチウイルス粒子の生成を引き起こすのに十分である。

他の実施形態では、インビトロ方法は、複数の発現ベクターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードするウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする１つ以上の発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスデュースすることを含む。

適当なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質並びにこれらのタンパク質をコードする発現ベクターの例は、市販品として入手可能であり、当技術分野で周知である。一般的には、ウイルスパッケージング発現ベクター又は発現カセットは、ベクター粒子形成及びベクター処理に必要とされるタンパク質をコードするＨＩＶ－１のｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ及びｔａｔ遺伝子領域を発現する。一般的には、ウイルスエンベロープ発現ベクター又は発現カセットは、ＶＳＶ－Ｇなどのエンベロープタンパク質を発現する。いくつかの場合、パッケージングタンパク質は、１つがＲｅｖをコードし、且つ１つがＧａｇ及びＰｏｌをコードする２つの個別のベクターで提供される。レンチウイルスベクター並びにその関連するパッケージングベクター及びエンベロープベクターの例としては、Dull, T. et al.,“A Third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system”J. Virol 72(11):8463-71 (1998)（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。

ウイルスエンベロープ発現ベクターの例は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合されたｖｓｖ－ｇ遺伝子を含有するｐＭＤＧ－ＶＳＶ－Ｇである。このベクターの構築は、Kafri et al. 1999 J Virol. 73(1): 576-584（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

ウイルスパッケージング発現ベクターの例は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合されたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子を含有するｐＣＭＶｄＲ８．７４である。このウイルスパッケージング発現ベクターは、例えば、プラスミド番号２２０３６としてAddgene（Cambridge、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手可能である。

以上に説明したように、いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング発現ベクターは、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである。例えば、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターは、突然変異体Ｄ６４Ｖインテグラーゼなどの非機能性（例えば、突然変異）インテグラーゼ酵素をコードし得る。非機能性インテグラーゼを有するこうしたベクターから生成されたベクター粒子は、そのウイルスゲノムを細胞のゲノム中に効率的にインテグレートしない。インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターの例は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合されたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子を含有し、且つｐｏｌ遺伝子が突然変異体Ｄ６４ＶインテグラーゼをコードするｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖである。ｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖは、そのインテグラーゼコード配列にアスパラギン酸^６４－バリン突然変異を有する第二世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）パッケージングプラスミドである。この突然変異は、野生型レベルと比較してゲノムインテグレーションを１／１０，０００に低減する（Leavitt et al. 1996）。このベクターの構築及び使用は、Leavitt et al. 1996 and Yanez-Munoz et al. Nature Medicine. 12(3): 348-53, 2006（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

ウイルス粒子の放出後、ウイルス粒子を含む培養培地を採取し得ると共に、任意選択的にウイルス粒子を培養培地から分離し得る。任意選択的にウイルス粒子を濃縮し得る。

生成及び任意選択的濃縮後、例えば細胞への投与に使用できる状態及び／又は治療に使用できる状態において－８０℃で凍結することにより、ウイルス粒子を貯蔵し得る。

本発明は、ウイルス粒子、例えば本明細書に記載の方法によって生成されたものも提供する。本明細書で用いられる場合、ウイルス粒子は、哺乳動物細胞などの細胞に感染可能であるウイルスエンベロープ内にパッケージされたＲＮＡゲノムを含む。ウイルス粒子は、インテグラーゼ欠損であり得る。例えば、それは、突然変異体インテグラーゼ酵素を含有し得るか、又は本明細書に記載されるように５’及び／又は３’ＬＴＲに変異を含有し得る。

キット
本発明は、本明細書に記載のレンチウイルスベクターと、本明細書に記載の１つ以上のパッケージング及びエンベロープ発現ベクターとを含むキットも提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング発現ベクターは、本明細書に記載のｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖベクターなどのインテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである。

障害
本明細書に記載のウイルスベクター及びウイルス粒子は、医薬として使用するためのものでもあり得る。例えば、本明細書に記載のウイルス粒子は、遺伝子療法に使用され得る。

本発明は、人体又は動物体の治療のための医薬の製造するための、本明細書に記載のウイルス粒子の使用、人体又は動物体の治療に使用するための、本明細書に記載のウイルス粒子及び本明細書に記載のウイルス粒子を、それを必要とする個体に投与することを含む治療の方法を提供する。

特定の実施形態では、ウイルス粒子は、神経学的障害の治療に使用される。限定されるものではないが、神経学的障害の例としては、発作障害（例えば、てんかん）、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、振戦及び他の運動障害、慢性疼痛、片頭痛並びにニューロン興奮性の変化を伴う他の神経精神医学的疾患、例えば大鬱病、双極性障害、不安及び統合失調症が挙げられる。

特定の実施形態では、神経学的障害は、神経系過興奮性を伴う。限定されるものではないが、神経系過興奮性を伴う神経学的障害の例としては、発作障害（例えば、てんかん）、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、振戦及び他の運動障害、慢性疼痛、片頭痛、大鬱病、双極性障害、不安及び統合失調症が挙げられる。

好ましい実施形態では、治療は、てんかん、慢性疼痛、鬱病又はパーキンソン病を対象とする。

特に好ましい実施形態では、治療は、てんかん、例えば特発性、症候性及び原因不明のてんかんを対象とする。てんかんは、新皮質てんかんであり得る。本明細書に記載の治療は、てんかん原性活動をクエンチ又はブロックするために使用され得る。治療は、発作の頻度を低減するために使用され得る。治療は、ニューロンにおける神経系興奮性を一時的に又は永久的に低減するために使用され得る。

投与及び投与量
本明細書に記載のウイルス粒子は、脳内にウイルス粒子を直接注入するなどのさまざまな方法で対象に送達可能である。例えば、治療は、大脳皮質内、特に新皮質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。治療は、障害に機能的に関連すると考えられる脳内の位置にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。例えば、治療がてんかんを対象とする場合、これは、運動皮質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得、治療が慢性疼痛を対象とする場合、これは、後根神経節内にウイルス粒子を直接注入することを含み得、治療がパーキンソン病を対象とする場合、これは、黒質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。特定の投与方法及び投与部位は、自らの共通一般知識及び当業者に公知の技術を用いて投与技術も選択するであろう医師の自由裁量に委ねられるであろう。

本発明は、複数の同定された遺伝子座に同時に直接注入することにより複数のてんかん焦点を治療するためにも使用され得る。

患者は、薬剤耐性又は医学的難治性のてんかんを有すると診断された者、すなわち抗てんかん薬剤の適正投与にもかかわらずてんかん発作が継続する者であり得る。

対象は、脳の新皮質の単一領域が罹患している明確な焦点てんかんを有すると診断された者であり得る。焦点てんかんは、例えば、発生異常又は後続の脳卒中、腫瘍、穿通性脳傷害若しくは感染から生じ得る。

ウイルス粒子の投与後、レシピエント個体は、治療される疾患又は障害の症状の低減を呈し得る。例えば、てんかんなどの発作障害を有する治療される個体では、レシピエント個体は、発作の回数の低減を呈し得る。これは、個体の疾患病態に有益な影響を及ぼし得る。

病態の治療に関連して本明細書で用いられる「治療」という用語は、一般的には、何らかの所望の治療効果、例えば病態の進行の阻害が達成されるヒトの治療及び療法を意味し、進行速度の低減、進行速度の停止、病態の退縮、病態の寛解及び病態の治癒を含む。予防手段（すなわち予防、防止）としての治療も含まれる。

ウイルス粒子は、治療有効量で送達可能である。

本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、所望の治療レジメンに従って投与したときに合理的な便益／リスク比に見合って何らかの所望の治療効果を生じるのに有効なウイルス粒子の量を意味する。

同様に、本明細書で用いられる「予防有効量」という用語は、所望の治療レジメンに従って投与したときに合理的な便益／リスク比に見合って何らかの所望の予防効果を生じるのに有効なウイルス粒子の量を意味する。

本明細書に関連して、「予防」とは、完全な成功、すなわち完全な保護又は完全な防止に限定するものと理解すべきではない。より正確には、これに関連して、予防とは、特定の病態の遅延、軽減又は回避を支援することにより健康を保つことを目的として症候性病態の検出前に施される対策を意味する。

ウイルス粒子を単独で使用（例えば、投与）することが可能であるが、多くの場合、例えば薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を用いて組成物又は製剤として提示することが好ましい。

本明細書で用いられる「薬学的に許容可能」という用語は、合理的な便益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴うことなく、その対象（例えば、ヒト）の組織に接触させて使用するのに好適である健全な医学的判断の範囲内の化合物、成分、材料、組成物、剤形などを意味する。各担体、希釈剤、賦形剤などは、製剤の他の成分に適合可能であるという意味でも「許容可能」でなければならない。

いくつかの実施形態では、組成物は、唯一の活性成分として本明細書に記載のウイルス粒子と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる医薬組成物（例えば、製剤、調製物、医薬品）である。

国際公開第２００８０９６２６８号に記載されるように、ウイルス粒子の送達を利用する遺伝子療法の実施形態では、単位用量は、投与されるウイルス粒子の用量により計算され得る。ウイルス用量は、特定数のウイルス粒子又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウイルスを含む実施形態では、特定の単位用量は、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３又は１０^１４ｐｆｕを含む。粒子用量は、感染欠損粒子の存在に起因していくらか高いことができる（１０～１００倍）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法又は治療は、症候性であるか又は疾患修飾性であるかにかかわらず他の療法と組み合わされ得る。

「治療」という用語は、例えば、逐次的に又は同時に２つ以上の治療又は療法が組み合わされる組合せ治療及び療法を含む。

例えば、本明細書に記載の化合物を用いた治療と、１つ以上（例えば、１、２、３、４つ）の他の作用剤又は療法とを組み合わせることが有益であり得る。

共療法の適切な例は、当業者であれば本明細書の開示に基づいて分かるであろう。典型的には、共療法は、治療される個体の診断に従って本明細書に記載の疾患の治療で治療効果を与え得ると考えられる、当技術分野で公知のいずれかのものであり得る。例えば、てんかんは、根底にある病因を直接治療することにより寛解可能であることもあるが、異常放電及び発作を抑制するフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、カルバマゼピン、クロバザム及びトピラマートなどの抗痙攣薬剤は、従来の治療の主力である（Rho & Sankar, 1999, Epilepsia 40: 1471-1483）。

特定の組合せは、自らの共通一般知識及び当業者に公知の投与レジメンを用いて投与量も選択するであろう医師の自由裁量に委ねられるであろう。

作用剤（すなわちウイルス粒子＋１つ以上の他の作用剤）は、同時に又は逐次的に投与され得ると共に、個別のさまざまな用量スケジュール及びさまざまな経路で投与され得る。例えば、逐次的に投与する場合、正確な投与レジメンを治療剤の性質に見合うようにして、短い時間インターバル（例えば、５～１０分間の間隔）又はより長いインターバル（例えば、１、２、３及び４時間以上の間隔並びに必要に応じてより長い間隔）で作用剤を投与可能である。

ＫＣＮＡ１の存在を確認する方法
本発明は、細胞内における操作されたＫＣＮＡ１の存在を確認する方法も提供する。

正常ヒト脳カリウムチャネルの過剰発現は、他の膜タンパク質を用いた遺伝子療法の臨床移行を潜在的に制限する免疫反応のリスクを回避する。しかしながら、ヒトカリウムチャネルの正常遺伝子配列を用いた臨床移行の制限は、その発現を脳内に存在するバックグラウンドの内因性チャネルと対比して検出することが困難であることにある。

操作されたＫＣＮＡ１遺伝子の配列は、細胞内に見いだされる野生型ＫＣＮＡ１遺伝子と異なるため、この遺伝子がＲＮＡに転写された場合、それは、ユニークＲＮＡ配列（「ＲＮＡフィンガープリント」）を内蔵する。このＲＮＡフィンガープリントは、ＲＮＡ標的化技術によるトランスジーン発現の特異的追跡を可能にする。さもなければ、トランスジェニックＫＣＮＡ１と内因性ＫＣＮＡ１との識別はできないであろう。これは、蛍光タグ又は免疫原性を潜在的にもたらし得るエピトープをコードする配列を含む必要なしに操作されたＫＣＮＡ１遺伝子発現の局在化を決定することが重要である場合に特に有用である。

例えば、操作されたＫＣＮＡ１遺伝子で治療された患者から取り出された組織を調べることにより、ＫＣＮＡ１ＲＮＡが存在する場所及び細胞型（予想通りの興奮性ニューロン又は抑制性ニューロン若しくはグリア細胞）を決定することが可能である。かかる組織は、例えば、てんかん遺伝子療法の不奏功イベント時にてんかん手術から又は死後に得ることが可能である。このデータは、前臨床投与量計算、生体内分布研究、規制当局の承認及びカリウムチャネル遺伝子療法のさらなる臨床開発に有用であると予想される。

そのため、一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の発現ベクターで細胞をトランスデュースするか、又は操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの発現を可能にする条件下において、本明細書に記載のウイルス粒子を細胞に投与することと、ハイブリダイズアッセイを用いて細胞内における操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの存在を検出することとを含む。本方法は、インビトロ又はエクスビボで、例えば細胞培養で又は人体若しくは動物体から外植された細胞内で行うことが可能である。代替的に、本方法は、例えば、ヒト又は動物の対象の細胞にウイルス粒子を投与した後、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて細胞内における操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの存在を検出するためにヒト又は動物の対象から細胞又は組織を取り出す場合、インビボで行うことが可能である。

いくつかの実施形態では、発現されたＫＣＮＡ１遺伝子の局在化を調べるために、本発明のウイルス粒子で治療された対象から細胞又は組織を取り出す。かかる組織は、例えば、てんかん遺伝子療法の不奏功イベント時にてんかん手術から又は死後に得ることが可能である。

本発明は、本明細書に記載のウイルス粒子を投与された対象から得られた細胞内における操作されたＫＣＮＡ１の存在を確認するインビトロ又はエクスビボ方法も提供する。本方法は、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて細胞内における操作されたＫＣＮＡ１ＲＮＡの存在を検出することを含む。

ハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で公知であり、一般的には、相補的核酸プローブを使用することを含む（例えば、標識化プローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術）。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、蛍光標識プローブなどの標識プローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーションアッセイである。

本明細書で用いられる場合、「プローブ」という用語は、相補的核酸を検出するために使用される核酸を意味する。典型的には、プローブは、ＲＮＡプローブである。

１７～３０塩基のオリゴヌクレオチドに適当な選択的ハイブリダイゼーション条件は、４２℃の６×ＳＳＣ中における一晩のハイブリダイゼーション及び４２℃～６５℃の一連の漸増温度の６×ＳＳＣ中における洗浄を含む。特定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算する一般式の１つは、（Sambrook et al., 1989）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－６００／二本鎖中＃ｂｐである。

細胞
本発明は、以上に記載の核酸又はベクターを含む細胞も提供する。いくつかの実施形態では、この細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）２９３である。

核酸及び配列変異体
本発明は、本明細書で明らかにされる編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む核酸も提供する。核酸に存在する操作されたＫＣＮＡ１遺伝子及び編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、発現ベクターに関連して本明細書に記載された所要の特徴及び配列同一性を有し得る。

アライメント及びパーセントアミノ酸同一性又はヌクレオチド配列同一性の計算は、当業者に公知の各種方法により、例えばClustalW 1.82、T-coffee、Megalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成可能である。かかるソフトウェアを使用する場合、かかるソフトウェアを使用する場合、好ましくは、デフォルトパラメーター、例えばギャップペナルティー及び伸長ペナルティーが使用される。ClustalW 1.82のデフォルトパラメーターは、タンパク質ギャップオープンペナルティー＝１０．０、タンパク質ギャップエクステンションペナルティー＝０．２、タンパク質マトリックス＝Gonnet、タンパク質／ＤＮＡエンドギャップ＝－１、タンパク質／ＤＮＡ GAPDIST＝４である。

次いで、多重アライメントから（Ｎ／Ｔ）×１００としてパーセント同一性を計算可能である。式中、Ｎは、２つの配列が等しい残基を共有する位置の数であり、且つＴは、比較した位置の全数である。代替的に、（Ｎ／Ｓ）×１００としてパーセント同一性を計算可能である。式中、Ｓは、比較される短い方の配列の長さである。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、デノボで合成し得るか、又は天然アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列若しくはそれらの誘導体であり得る。

遺伝暗号の縮重に起因して、いずれかの核酸配列を、それによりコードされるタンパク質の配列に実質的な影響を及ぼすことなく変異又は変化させて、その機能性変異体を提供可能であることは明らかである。適当なヌクレオチド変異体は、配列内で同一のアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変異させてサイレント変化をもたらす配列を有するものである。他の適当な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸に類似した生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により配列の全部又は一部を変化させて保存的変化をもたらすものである。例えば、小さい非極性疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが挙げられる。大きい非極性疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。本明細書に記載されるように、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの適当な変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸残基４００に対応する位置のアミノ酸残基以外のいずれかのアミノ酸にアミノ酸置換を含有可能である。

本明細書のいずれの副題も、便宜上含まれるにすぎず、決して本開示を限定するものと解釈すべきではない。

ここで、限定されるものではないが、以下の図面及び実施例を参照して本発明をさらに説明する。本発明の他の実施形態は、これらに照らして当業者に想到されるであろう。

本明細書で引用したすべての参照文献の開示は、当業者が使用して本発明を実施し得る程度まで、本出願をもって相互参照により本明細書に特定的に組み込まれる。

図
焦点新皮質てんかんの視覚皮質ＴｅＮＴモデルの特徴付け。Ａ．長い持続時間及び経時的進展を示す成体雄スプラーグドーリーラットの代表的発作（リスターフーデッドラット及びロング－エバンスラットの代表的発作に関しては、図２を参照されたい）。拡大セクションは、指定の時間で得られる。Ｂ．３週でプラトーまで増加した後に５週で頻度低下を示す５週間にわたり記録された９匹の動物の発作回数／週。Ｃ．同一の期間にわたる累積発作頻度（／日）。Ｄ．約１００ｓの安定持続時間まで初期上昇を示す同一の期間にわたる発作持続時間（／週）。Ｅ．１０２回のランダムに選択されたエレクトログラフィー発作の動作相関（ｎ＝８匹の動物、ｎ＝１０２回の発作）。ＥＣｏＧトレースに対してタイムロックされたビデオ記録を用いてすべての動作を神経学者により評価した。動作相関が「未知」である１１例の症例では、動物が敷料下で見えなかったか又はビデオ信号が中断されたかのいずれかであった。データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。焦点新皮質てんかんのＴｅＮＴ視覚皮質モデルは、系統特異的ではない。リスターフーデッドラット、ロング－エバンスラット及びスプラーグドーリーラットの代表的発作。Ｋｖ１．１過剰発現は、焦点新皮質てんかんの視覚皮質モデルで発作頻度を低減する。Ａ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターによる神経系トランスダクションは、注入部位の周りの狭い皮質柱に制限される。Ｂ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクター（下側トレース）又はＧＦＰのみの対照（上側トレース）による治療後の２匹の動物の代表的発作。Ｃ．全５週間の記録にわたり同一の動物が経験したすべての発作のラスタープロット。パネルＢに提示された発作は、アスタリスクによりマークされている。Ｄ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクター（ｎ＝８）又はそのＧＦＰのみの対照（ｎ＝８）で治療されたラットの発作頻度（／週）。各週で経験した発作回数を、治療前の週（週ＢＩ）に各動物が経験された数で規格化した。ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターは、治療後の週で規格化発作頻度を有意に低減した。Ｅ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクター又はそのＧＦＰのみの対照で治療されたラットの累積発作頻度（／日）。累積発作回数を、治療前の７日間に各動物が経験した数に規格化した。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターによるＫｖ１．１過剰発現は、発作間スパイキングを抑制する。Ａ．発作間スパイクのＥＣｏＧトレース例。Ｂ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクター（ｎ＝８）又はそのＧＦＰのみの対照（ｎ＝７）で治療されたラットの累積発作間スパイク頻度（／日）。累積発作間スパイク数を、治療前の７日間に各動物が経験した数に規格化した。発作間スパイクの頻度は、ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターによる治療により有意に低減された（マンホイットニーＵ検定で比較した２８日目の累積値、ｐ＝０．０４）。臨床移行のための最適化ＫＣＮＡ１遺伝子療法の設計及び特徴付け。Ａ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１パイロットベクター（ｉ）、最適化ＥＫＣベクター（ｉｉ）、及びそのレポーターのみの対照（ｉｉｉ）のレンチウイルストランスファープラスミドマップ。略号：ＲＳＶ－ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＬＴＲ－長末端反復、ＨＩＶ－１Ψ－ＨＩＶ－１パッケージングシグナル、ＲＲＥ－Ｒｅｖ反応エレメント、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ－セントラルポリプリントラクト及びセントラル終止配列、ＥＦ１α－伸長因子１αプロモーター、ＷＰＲＥ－ウッドチャック肝炎ウイルス転写後レギュラトリーエレメント。Ｂ．最適化ＥＫＣトランスファープラスミドからの機能性Ｋｖ１．１チャネルの異種発現。（ｉ）：ＥＫＣトランスファープラスミドがトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ－２ａ細胞の代表的な電流－時間トレース。（ｉｉ）：ＥＫＣトランスファープラスミドがトランスフェクトされた細胞（Ｋｖ、ｎ＝１３）、ｄｓｃＧＦＰのみの対照プラスミドがトランスフェクトされた細胞（Ｇ、ｎ＝８）及び非トランスフェクト対照（ＵＴ、ｎ＝１０）の平均電流密度対電圧のプロット。挿入図：＋２０ｍＶまでの電圧ステップ時の３つの群間の電流密度の差を示すヒストグラム（Ｋｖ対ＵＴ：ｐ＝０．００１３、Ｋｖ対Ｇ：ｐ＝０．００１２、ＵＴ対Ｇ：ｐ＝０．８２、ｎｓ＝有意でない、ゲイムス・ハウエル事後検定を併用したウェルチの一元配置ＡＮＯＶＡ）。（ｉｉｉ）：ＥＫＣトランスファープラスミドがトランスフェクトされた細胞の平均規格化コンダクタンス対電圧のプロット。データを単一ボルツマン関数で当てはめた。－２８．２ｍＶのＶ_０．５（半値コンダクタンスの電圧）は、ＣＭＶ駆動野生型ＫＣＮＡ１がトランスフェクトされたヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞から得られた値（－３２．８±０．９ｍＶ）に類似している（Tomlinson et al., 2013）。エラーバーは、すべてＳＥＭを表す。Ｃ．ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１ベクターのものに類似したトランスダクションのパターンを示す１．２５μｌ（約３×１０^６感染単位（ＩＵ））のＥＫＣレンチベクターが左視覚皮質に注入されたラットの脳スライスの明視野画像（左側）及び蛍光画像（右側）。Ｄ．ＥＫＣ発現の細胞型特異性の免疫組織化学的評価。（ｉ）：ｄｓｃＧＦＰを発現するレンチベクタートランスデュースニューロンと、ＧＦＡＰが染色されたアストロサイトとの間のオーバーラップは存在しなかった。（ｉｉ）：ｄｓｃＧＦＰ＋細胞と、ＮｅｕＮが染色されたニューロンとの間に１００％のオーバーラップが存在した。（ｉｉｉ）：ｄｓｃＧＦＰ＋細胞と、ＧＡＤ６７が染色された抑制性介在ニューロンとの間に最小限のオーバーラップが観測された。ＥＫＣレンチベクタートランスダクションの皮質内の広がり。１．２５μｌ（約３×１０^６ＩＵ）のＥＫＣレンチベクターが注入されたラット脳の６つの逐次的左半球視覚皮質スライス（厚さ７０μｍ）の明視野画像及び蛍光画像。スライスは、左上（頭側）から右下（尾側）に秩序化されている。スケールバーは、明視野画像及び蛍光画像に対してそれぞれ６００μｍ及び２００μｍを表す。ＥＫＣ遺伝子療法は、盲検化ランダム化前臨床試験で発作頻度をロバストに低減する。Ａ．ＥＫＣレンチベクター（下側トレース）又はそのｄｓｃＧＦＰのみの対照（上側トレース）による治療後の２匹の動物の代表的発作。Ｂ．全５週間の記録にわたり同一の動物が経験したすべての発作のラスタープロット。パネルＡに提示された発作は、アスタリスクによりマークされている。Ｃ．ＥＫＣレンチベクター（ｎ＝７）又はそのレポーターのみの対照（ｎ＝１１）で治療されたラットの規格化発作頻度（／週）。ＥＫＣレンチベクターは、治療後の週で発作頻度を有意に低減した。Ｄ．ＥＫＣレンチベクター又はそのレポーターのみの対照で治療されたラットの規格化累積発作頻度（／日）。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。

例
実施例１－てんかん遺伝子療法における操作されたカリウムチャネル遺伝子の送達の実証
材料及び方法
分子生物学
標準的サブクローニング技術を用いてレンチウイルストランスファープラスミドを構築した。GeneOptimizer（登録商標）ソフトウェアを用いてヒト発現に関してＫＣＮＡ１のコドン最適化を行い、GeneArt（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）を用いて合成した。プラスミドは、すべて使用前に完全にシーケンスした。

電圧クランプ記録
S. Hart（UCL Institute of Child Health）の実験室からギフトとしてＮｅｕｒｏ－２ａ細胞を得た。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Thermo Fisher Scientific）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）及び１％非必須アミノ酸（Sigma）が補足されたGibco（登録商標）ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋GlutaMAX（商標）（Thermo Fisher Scientific）中で細胞を成長させた。３７℃の加湿５％ＣＯ_２雰囲気中で培養物を対数増殖期に維持した。製造業者の説明書に従ってTurboFect（商標）トランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いてトランスフェクションを実施した。トランスフェクト細胞を１３ｍｍボロシリケートガラスカバースリップ（ＶＷＲ）上にプレーティングした。UMPLFLN 10×及びLUMPLFLN 40×水浸対物レンズ（オリンパス）を備えたＢＸ５１ＷＩ固定ステージ直立顕微鏡のチャンバー内にカバースリップを配置した。次の組成（ｍＭ単位）：１４０ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ_２、２ＭｇＣｌ_２、１０ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５、オスモル濃度約３０１ｍＯｓｍ／Ｌ）を有する細胞外溶液の静止浴中にカバースリップを液浸した。P-97 Flaming/Brownマイクロピペットプラー（Sutter Instrument Company）を用いて２．０～３．０ＭΩのチップ抵抗になるようにフィラメント入りボロシリケートガラスマイクロピペット（GC150-F; Warner Instruments）を牽引した。次の組物（ｍＭ単位）：１４０ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、１０ＥＧＴＡ（ｐＨ７．３５、オスモル濃度約２９１ｍＯｓｍ／Ｌ）の細胞内溶液をマイクロピペットに充填した。波長４８８ｎｍの光で励起される蛍光マーカーｄｓｃＧＦＰ発現によりトランスフェクト細胞を同定した。全細胞パッチクランプ構成を用いて電圧クランプ下で巨視的電流を記録した。使用した電圧ステッププロトコルは、次の通りであった。すなわち、細胞を－８０ｍＶの静止電位に保持し、１０ｍＶの増分で＋２０ｍＶまで行う２００ｍｓの脱分極ステップにより電流を誘起する。ベースラインに戻す前、－１００ｍＶまでの４０ｍｓの過分極ステップを含めた。WinWCPソフトウェア（J. Dempster, University of Strathclyde）及びAxon Multiclamp 700B増幅器（Molecular Devices）を用いて、データを３ｋＨｚでフィルターし、１０ｋＨｚで取得した。予測成分及び補正成分を８０％に調整し、バンド幅を１．２ｋＨｚに設定して、全体にわたり直列抵抗補償を利用した。１０ＭΩを超える直列抵抗の細胞を分析から除外した。すべての記録を室温（２３～２６℃）で行った。＋４．１ｍＶであると計算された液界電位は、未補正のままにした。リーク電流は、最小限であり、減算せずにそのままにした。

分析のため、各電圧ステップの最後の４０ｍｓで定常状態電流として誘起電流を得た。ベースライン保持電流を減算した後、細胞キャパシタンスで除算して電流密度値を生成した。規格化コンダクタンスを計算するために、各電圧ステップの電流密度をステップ電位－カリウム逆転電位（－９１．３４ｍＶ）で除算した。これにより生のコンダクタンス値を生成し、膜電位のステップワイズ変化に付随するＫ^＋駆動力の変動に関して補正する。各ＥＫＣトランスフェクト細胞の生のコンダクタンス対電圧のプロットを、式：

で与えられる個別ボルツマン関数で当てはめた。式中、Ｇは、コンダクタンスであり、Ｖは、電圧であり、Ａ_１は、初期（最小）コンダクタンスであり、Ａ_２は、最終（最大）コンダクタンスであり、Ｖ_０．５は、半値コンダクタンスの電圧であり、且つｋは、勾配係数である。生のコンダクタンス値をそれ自体のボルツマン関数のＡ_１及びＡ_２に規格化した。

生のコンダクタンス値をそれ自体のボルツマン関数のＡ_１及びＡ_２に規格化した。次いで、各ＥＫＣトランスフェクト細胞で規格化コンダクタンスを電圧に対してプロットし、再び個別ボルツマン関数で当てはめた。結果に提示された平均調整Ｒ^２値及びＶ_０．５値は、こうした当てはめから取り出された。図５Ｂｉｉｉでは、細胞を横切る平均規格化コンダクタンスを電圧に対してプロットした後、最終ボルツマン関数で当てはめた。慣例に従って、この当てはめで調整されたＲ^２値及びＶ_０．５値は、報告しなかった。

レンチウイルス合成
ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターは、Wykes et al., 2012で使用されるものと等しく、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する。

１０％熱不活性化ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補足されたGibco（登録商標）ＤＭＥＭ＋GlutaMAX（商標）中でＨＥＫ２９３プロデューサー細胞を成長させた。３７℃の加湿５％ＣＯ_２雰囲気中で培養物を対数増殖期に維持した。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher Scientific）を用いて３～４日ごとに細胞をスプリットしたが、１５継代を超えて成長させなかった。レンチウイルス合成では、細胞を約７０％の集密度まで成長させ、ｐＭＤＧ－ＶＳＶ．Ｇ、ｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖ及びＥＫＣトランスファープラスミド又はそのｄｓｃＧＦＰのみの対照のいずれかと共に一過的に共トランスフェクトした。ｐＭＤＧ－ＶＳＶ．Ｇ及びｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖは、A.J. Thrasher and W. Qasim（UCL Institute of Child Health）の実験室からギフトとして得た。ｐＭＤＧ（ＶＳＶ－Ｇ）は、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプされたレンチベクターは、広い指向性を呈し、超遠心分離時に機械的破壊に対して比較的耐性である（Burns et al., 1993）。ｐＣＭＶｄＲ８．７４^Ｄ６４Ｖは、そのインテグラーゼコード配列にアスパラギン酸^６４－バリン突然変異を有する第二世代ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）パッケージングプラスミドである。この突然変異は、野生型レベルと比較してゲノムインテグレーションを１／１０，０００に低減する（Leavitt et al., 1996）。エンベローププラスミド対パッケージングプラスミド対トランスファープラスミドの質量比は、１：２．５：１．５であった。トランスフェクションは、１００μｇの全プラスミドＤＮＡ当たり約１６０μｌのLipofectamine（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。１８時間後にトランスフェクション培地を除去して新鮮培地で置き換えた。トランスフェクションの４０時間後及び６０時間後に２つの培地採取物を採取した。各採取時に細胞脱離を最小限に抑えるように特別な注意を払った。採取された培地を４℃において１０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによりプレクリーニングし、０．４５μｍミクロ細孔に通して濾過し、４℃で貯蔵した。次の組成（ｍＭ単位）：５０トリス－ＨＣｌ、１００ＮａＣｌ、０．５ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４、１０％ｗ／ｖスクロース）を有するスクロース溶液上に培地をオーバーレイし、４℃において２０，０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。上清を廃棄し、レンチウイルスペレットを無菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。レンチウイルスサスペンジョンをアリコートに分けて液体窒素中でスナップ凍結した後、－８０℃で長期貯蔵を行った。Lenti-X（商標）p24迅速力価キット（Clontech）を用いてウイルス力価の概算値を得た。各ウイルスの３つの個別アリコートを用いて各力価測定をトリプリケートで実施した。推定力価は、２．４２×１０^９ＩＵ／ｍｌ（ＥＫＣ）及び４．２６×１０^９ＩＵ／ｍｌ（対照）であった。

外科手順
実験は、すべてUnited Kingdom Animal (Scientific Procedures) Act 1986に準拠して実施した。成体雄ラット（スプラーグドーリー、ロング－エバンス又はリスターフーデッド、３００～４００ｇ）を麻酔して定位フレーム（Kopf）に配置した。１５ｎｇのＴｅＮＴ（G. Schiavo（UCL Institute of Neurology）の実験室からのギフト）を１００ｎｌｍｉｎ^－１の速度において１．０μｌの最終体積で右視覚皮質の層５に注入した（座標：ブレグマの側方３ｍｍ、後方７ｍｍ、軟膜から深さ１．０ｍｍ）。ＥＣｏＧトランスミッター（A3028E、Open Source Instruments、ＭＡ、ＵＳＡ）を注入部位の上方に位置決めされた硬膜下頭蓋内記録電極と共に皮下に植え込んだ。参照電極を対側頭蓋骨内に植え込んだ。１１又は１４日後にレンチウイルスベクターを送達するためにカニューレ（Plastics One）を注入部位の上方に位置決めした。各ラットは、発作焦点に直接注入された最大２．０μｌのレンチウイルスの投与を受けた。ＴｅＮＴが注入された動物を研究継続期間にわたりファラデーケージに個別に収容した。

ＥＣｏＧ取得及び分析
術後６週間までＥＣｏＧを連続記録した。Open Source Instrumentsから購入したハードウェア及びソフトウェアを用いてデータを取得した。発作の検出方法は、モデルの特徴付け、パイロット研究及び最終前臨床実験により異なっていた。モデルの特徴付けでは、神経学者による全ＥＣｏＧデータセットの連続観測により発作を検出した。パイロット研究では、最初にＥＣｏＧトレースを１ｓのエポックに分割した。４つのメトリック（パワー、コーストライン、インターミッテンシー及びコヒーレンス）を各エポックで定量し、それらの値を、発作活動を表すものとしてビデオにより検証されたエポックのユーザー管理ライブラリーのものと比較した（Wykes et al., 2012）。対応する値は、発作活動を含有するものとして同定された５つ以上の逐次エポックのすべての例を回収した統合スクリプトに供給した。統合出力中の発作は、すべて実験者により検証された。最終前臨床試験では、各エポックに対して６つのメトリック（パワー、コーストライン、インターミッテンシー、コヒーレンス、アシンメトリー及びリズム）を定量し、統合スクリプトを用いることなく対応する値をすべて発作活動に関してチェックした。この実験の発作回数は、治療に対して盲検化された実験者により実測された。すべてのデータセットに対して、発作の最小持続時間を１０ｓに設定した。

動作発作の評価
エレクトログラフィー発作の動作相関の評価は、神経学者により行った。５週間の記録から発作をランダムに選択し、ＥＣｏＧトレースにタイムロックされたトップダウンビデオ映像を用いて関連動作を観察した。

免疫組織化学
レンチウイルス注入１週間後、最後にラットをナトリウムペントバルビタール（Euthatal、Merial）で麻酔し、低温（４℃）ヘパリン処理ＰＢＳ（８０ｍｇ／リットルヘパリンナトリウム塩、Sigma）及び続いてＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Santa Cruz Biotechnology）を経心的に灌流させた。脳を摘出して４℃の４％ＰＦＡ中でさらに２４時間にわたり後固定した。ＰＢＳ中で洗浄後、振動ミクロトーム（Leica）を用いて脳を７０μｍ冠状切片にスライスした。ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム（Sigma）中４℃でスライスを浮遊貯蔵した。抗体染色では、切片をＰＢＳ＋０．３％トリトンＸ－１００（Sigma）中で２０分間透過化した後、ＰＢＳ＋０．３％トリトンＸ－１００（Sigma）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma）及び４％ヤギ血清（Sigma）中で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ＋０．３％トリトンＸ－１００及びウサギ抗ＮｅｕＮ（１：７５０希釈、ab177487、Abcam）、マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００希釈、MAB3402、Merck Millipore）又はマウス抗ＧＡＤ６７（１：５００希釈、MAB5406、Merck Millipore）一次抗体中、４℃で切片を一晩インキュベートした。ＰＢＳ中で１０分間洗浄を３回行った後、ＰＢＳ＋関連Alexa Fluor（登録商標）５９４コンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギ（A-11037、Thermo Fisher Scientific）又はヤギ抗マウス（A-11005、Thermo Fisher Scientific）、両方とも１：７５０希釈）中、室温でスライスを３時間インキュベートした。ＰＢＳ中で１０分間洗浄をさらに３回行った後、Vectashield（登録商標）HardSet（商標）封入媒体（Vector Laboratories）及びボロシリケートガラスカバースリップ（VWR）を用いて、スライスをプレーンガラス顕微鏡スライド（Thermo Fisher Scientific）上にマウントした。２つの顕微鏡：2.5×、10×及び40×EC Plan-Neofluar非液浸対物レンズを備えたAxio Imager A1蛍光顕微鏡（Axiovision LEソフトウェア）又は40×及び63×EC Plan-Neofluar油浸対物レンズ（Zeiss）を備えた倒立LSM 710共焦点レーザー走査顕微鏡（ZEN 2009ソフトウェア）の１つを用いて明視野画像及び蛍光画像を取得した。共焦点顕微鏡では、ｄｓｃＧＦＰ及びAlexa Fluor（登録商標）594をそれぞれアルゴンの４８８ｎｍ線及び５６１ｎｍ線又はダイオードポンプ固体（ＤＰＳＳ）レーザーで励起した。画像処理は、すべてImageJソフトウェアを用いて実施した。複合画像は、MosaicJ ImageJプラグインを用いてアセンブルした。

統計
治療データ（図３Ｄ、７Ｃ）の有効性は、動物のランダム効果（自己回帰共分散）と、治療群、週及び治療群と週との間の相互作用の固定効果とを含む一般化対数線形混合モデルを用いて分析した。マンホイットニーＵ検定を用いて治療前の週の発作回数（図７Ｃ）を比較した。ウェルチの一元配置ＡＮＯＶＡ及び続いてゲイムス・ハウエル事後検定を用いて＋２０ｍＶの電流密度（図５Ｂｉｉ）を比較した。

結果
視覚皮質へのＴｅＮＴの注入は、離散発作を有する焦点てんかんモデルを生成する
マウスで開発されたモデルから始めて（Mainardi et al., 2012）、本発明者らは、９匹の成体雄スプラーグドーリーラットの視覚皮質へのＴｅＮＴの注入により引き起こされる発作のエレクトログラフィー的特徴、時間的進展及び動作相関を特徴付けた。運動皮質へのＴｅＮＴ注入後に見られる短時間のほぼ連続したてんかん様放電とはきわめて対照的に（Wykes et al., 2012）、視覚皮質への注入は、離散自発発作を生成した（図１Ａ）。発作は、ＴｅＮＴ注入の約４日後に現れ、７～１０日間にわたり頻度が増加し、２～３週間でプラトーに達し、５又は６週間後にほとんどの動物で消散した（図１Ｂ、Ｃ）。各動物が経験した全発作回数は、かなり変動した。平均発作持続時間は、経時的に進展し、最初の週の５０ｓ弱からその次の４週の約１００ｓまで増加した（図１Ｄ）。タイムロックビデオＥＣｏＧを利用して、発作のランダムに選択されたサブセットの動作相関を同定した（ｎ＝１０２、図１Ｅ）。１１例の発作（１０．８％）では、記録が中断されたため又は動物がその環境向上材料に入って見えない状態であったため、関連動作は観察不能であった。残りの発作は、すべて観察可能な動作相関を有していた。４５例の発作（４４．１％）では、これらは、繊細であり、瞬きの繰返し、動揺の急増又は積極的探索動作を含んでいた。１９例の発作（１８．６％）では、片側運動関与、例えば対側肢の単収縮が観測され、さらなる６例（５．９％）では、両側運動症状が見られた。２１例の発作（２０．６％）は、完全な両側強直間代発作に発展した。焦点新皮質てんかんのこのモデルは、系統特異的ではなかった。リスターフーデッドラット及びロング－エバンスラットの両方で類似の発作が引き起こされた（図２）。

パイロット試験は、ＫＣＮＡ１遺伝子療法が自発発作を低減するのに十分であることを示す
本発明者らは、ＥＰＣモデル（Wykes et al., 2012）で当初使用されたＣＭＶ駆動Ｋｖ１．１ベクター（ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１）がこうしたより長くより複雑な発作に対して効果を維持するかどうかを求めた。ＴｅＮＴ注入の２週間後、自発発作が確定されてから、動物を２つの群にランダムに分割し、あらかじめ植え込まれたカニューレを介してＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクター又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみを発現する対照レンチベクターのいずれかを注入した。ＥＣｏＧ記録をさらに４週間継続した。すでに観測されているように（Wykes et al., 2012）、ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターは、ニューロンの狭い皮質柱内に導入された（図３Ａ）。全発作回数の変動が大きいことを考慮して、２つの治療群間の発作頻度を比較するために、各週に経験した発作回数を治療前の週（ベースライン週（ＢＩ））に各動物が経験した数に規格化した。ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターは、治療後の週の規格化発作頻度を有意に低減した（０～３週にわたる一般化対数線形混合モデル、治療×週相互作用効果：Ｆ（１，６０）＝６９．４９９、ｐ＜０．００１、図３Ｄ）。治療効果は、迅速に出現した。２つの治療群の累積１日発作頻度のプロットは、レンチベクター注入の３日以内に発散し始める（図３Ｅ）。Ｋｖ１．１過剰発現は、発作持続時間に影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。

てんかんは、いくつかの併存症を伴う。これらの中には、側頭葉てんかんで発作間放電に強くに相関する認知障害が含まれる（Holmes GL 2013；Bragatti JA et al 2014；Dinkelacker V et al 2016）。同様に、新皮質では、発作間活動が正常脳機能に有意な撹乱を引き起こす可能性がある。発作頻度の抑制に加えて、ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターによるＫｖ１．１過剰発現は、てんかん原性に合致するもう１つのシグネチャーである発作間放電の頻度を有意に低減した（図４）。

焦点新皮質てんかんの本発明者らのモデルは、系統特異的ではなかったため（図２）、この初期の試験は、３つの異なる系統（スプラーグドーリー、リスターフーデッド及びロング－エバンス）の１６匹の動物を含んでいた。ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１治療の好影響が少数のリスターフーデッド動物及びロング－エバンス動物によりバイアスされないことを保証するために、スプラーグドーリー動物のみで発作頻度データを再分析した。小さいサンプルサイズにもかかわらず（６例の治療対５例の対照）、ＣＭＶ－ＫＣＮＡ１レンチベクターは、治療後の週で規格化発作頻度を依然として有意に低減した（０～３週の一般化対数線形混合モデル、治療×週相互作用効果：Ｆ（１，４０）＝４．８５１、ｐ＝０．０３３）。したがって、このパイロット試験は、ＫＣＮＡ１の過剰発現が離散自発発作回数を低減するのに十分であることを強く示唆する。

臨床移行に最適化された遺伝子療法ツールの設計及び特徴付け
ＫＣＮＡ１遺伝子療法を診療に近づけるために、本発明者らは、新たなレンチウイルストランスファープラスミドを設計した（図５Ａｉｉ）。発現を興奮性ニューロンにバイアスするために、元のＣＭＶ－ＫＣＮＡ１構築物（図５Ａｉ）のＣＭＶプロモーターを１．３ｋｂのヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーター（ｈＣＡＭＫ２Ａ）で置き換えた（Dittgen et al., 2004；Yaguchi et al., 2013）。ＫＣＮＡ１遺伝子をヒト細胞における発現にコドン最適化し、通常、ＲＮＡ編集により形成されるＩ４００Ｖアミノ酸変化を導入するように突然変異させた。Ｉ４００Ｖ置換は、Ｋｖ１．１チャネルが不活性化から回復する速度の２０倍増加を誘発する（Bhalla et al., 2004）。前臨床評価では、ｄｓｃＧＦＰレポーター遺伝子をＴ２Ａペプチドにより操作されたカリウムチャネル（ＥＫＣ）遺伝子に結合させた。これにより、単一プロモーターからの二重タンパク質発現を可能にする。

本発明者らのＥＫＣレンチウイルストランスファープラスミド（図５Ａｉｉ）の顕著な成分としては、以下のものが挙げられる。
１）１．２ｋｂの上流ＤＮＡに結合されたＣＡＭＫ２Ａの１００ｂｐの５’非翻訳領域を含む１．３ｋｂのヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーター（ｈＣＡＭＫ２Ａ）。類似のサイズのネズミＣａｍｋ２ａプロモーターは、レンチウイルス注入されたラットバレル皮質（Dittgen et al., 2004）及び霊長動物運動皮質（Yaguchi et al., 2013）において錐体ニューロン特異的遺伝子発現を駆動することが示されている。これは、霊長動物の鼻皮質（Lerchner et al., 2014）又は運動皮質（Yaguchi et al., 2013）へのレンチウイルス注入後にグリア内で優先的にトランスジーン発現を駆動することが知られる本発明者らのパイロットベクターのＣＭＶプロモーターとは対照的である。
２）チャネル不活性化性を改変するためにアデニン^１９９８＞グアニン点突然変異を有するコドン最適化ＫＣＮＡ１からなる操作されたカリウムチャネル遺伝子。コドン最適化は、Ｋｖ１．１発現の増加の利点を超えて有用である。それは、ＲＮＡ標的化技術によるトランスジーン発現の特異的追跡を可能にする。さもなければ、トランスジェニックＫＣＮＡ１と内因性ＫＣＮＡ１との識別はできないであろう。蛍光レポータータンパク質のコード配列がやむを得ず欠如したベクターを用いるとき、さらに翻訳パイプラインに沿ってかかる追跡が特に有用であることが証明されるであろう。負の膜電位では、未編集Ｉ^４００を含有するチャネルは、その編集（Ｖ^４００）カウンターパートの約１／２０の速度で不活性化から回復する（Bhalla et al., 2004）。不活性化からより速く回復するＫｖ１．１チャネルは、神経系興奮性を弱めると予想されるため、本発明者らは、Ａ^１９９８Ｇ点突然変異を意図的に導入することにより本発明者らのコドン最適化ＫＣＮＡ１におけるＲＮＡ編集をあらかじめ回避することを決定した。
３）Ｔ２ＡペプチドによりＥＫＣに結合されたきわめて明るいｄｓｃＧＦＰレポーター遺伝子。２Ａペプチドは、リボソーム媒介翻訳時にペプチド結合形成を障害することにより単一プロモーターからのマルチシストロニック遺伝子発現を可能にする短い（約２０アミノ酸）配列である（Szymczak and Vignali, 2005）。重要なこととして、２Ａペプチドの両側の遺伝子は、翻訳が同時に行われて１：１の比で発現される。したがって、レポーター発現は、治療トランスジーン発現の非常に信頼できるインジケーターとしての役割を果たす。この構成は、治療及びレポーターのトランスジーンが個別の識別可能なプロモーターの転写制御下に配置された本発明者らのパイロットベクターのものとは対照的である。

これらの実験に使用されるＥＫＣトランスファープラスミドは、配列番号７に示された配列を有する。ｄｓｃＧＦＰのみの対照トランスファープラスミドの配列は、配列番号８に示された配列を有する。

機能性Ｋｖ１．１チャネルを生成するように最適化トランスファープラスミドをデコード可能であるかを決定するために、ＥＫＣ又はｄｓｃＧＦＰのみの対照のトランスファープラスミドをＮｅｕｒｏ－２ａ細胞に一過的にトランスフェクトし、全細胞パッチクランピングに付した。トランスフェクション混合物に暴露されたが、ｄｓｃＧＦＰ蛍光の欠如した細胞を第２のセットの対照として使用した。典型的な電圧ステッププロトコルは、両方の対照群で無視し得る外向き電流を誘起したが、ＥＫＣトランスファープラスミドがトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ－２ａ細胞は、数ナノアンプの大きさのピークを有する大きい電圧依存電流を示した（図５Ｂｉ、ｉｉ）。最大脱分極電圧ステップ（＋２０ｍＶ）における電流密度は、ＥＫＣトランスフェクト細胞では対照よりも有意に大きく、ごく小さい内因性電圧依存電流を示した（図５Ｂｉｉ）。非トランスフェクト細胞と、対照プラスミドがトランスフェクトされた細胞との間の電流密度に有意差はなかった（図５Ｂｉｉ）。本発明者らの分子最適化がＫｖ１．１チャネル活性化の電圧依存性に影響を及ぼすかを決定するために、各ＥＫＣトランスフェクト細胞に対して規格化コンダクタンス－電圧プロットを個別ボルツマン関数で当てはめた。平均調整Ｒ^２が０．９９５±０．０００７であることから、すべての細胞にわたり良好な当てはめが実証された。－２８．２±０．４ｍＶの平均Ｖ_０．５は、ＣＭＶ駆動野生型ＫＣＮＡ１がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られた値（－３２．８±０．９ｍＶ）に類似していた（Tomlinson et al., 2013）。すべてのＳＫＣトランスフェクト細胞でそれ自体のボルツマン関数で当てはめた電圧に対する平均規格化コンダクタンスのプロットは、図５Ｂｉｉｉに提供される。全体として、最適化ＥＫＣトランスファープラスミドは、ロバストなＫｖ１．１電流の形成を支援することがこれらのデータから示唆される。

ＥＫＣトランスファープラスミドを非インテグレーティングレンチウイルスベクターにパッケージした（Yanez-Munoz et al., 2006）。ラット視覚皮質に注入した場合、このレンチベクターは、ｄｓｃＧＦＰレポーターの強い局在化された発現を駆動した（図５Ｃ）。逐次的脳スライスのイメージングでは、約０．０７５ｍｍ３の推定トランスダクション体積が得られた（図６）。免疫組織化学では、ｄｓｃＧＦＰ発現とグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色との間に目に見えるオーバーラップは示されなかった（ＧＦＡＰと共に共局在化されたｄｓｃＧＦＰ＋細胞数０／５１２、ｎ＝３動物、図５Ｄｉ）。これとは対照的に、ｄｓｃＧＦＰ＋細胞は、すべて神経系マーカーＮｅｕＮと共に共局在化された（７１４／７１４、ｎ＝３動物、図５Ｄｉ）。ＥＫＣレンチベクターからのトランスジーン発現は、ニューロンに制限されることがこれらのデータから示唆される。ｄｓｃＧＦＰ発現と、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対する酵素マーカーであるグルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）による染色との間に最小限のオーバーラップが存在した（ＧＡＤ６７と共に共局在化されたｄｓｃＧＦＰ＋細胞数３／６０３、ｎ＝３動物、図３Ｄｉｉｉ）。このことから、ＥＫＣトランスジーン発現は、興奮性ニューロンに主に制限されることが示唆される。

ＥＫＣ遺伝子療法は、ランダム化盲検化前臨床試験で発作頻度を低減する
ＥＫＣレンチベクターの有効性を試験するために、本発明者らは、臨床試験条件を模倣するランダム化盲検化前臨床試験を設計し、低減された発作頻度を主アウトカム尺度として選択した。わずかに低減された効力を有する新たなバッチのＴｅＮＴは、より少ない全発作を惹起し、動物福祉を改善した。ＴｅＮＴ注入の１１日後、２６匹のスプラーグドーリーラットを２群にランダムに分割し、あらかじめ植え込まれたカニューレを介してＥＫＣレンチベクター又はｄｓｃＧＦＰのみの対照ベクターのいずれかを注入した。ＥＣｏＧ記録をさらに４週間継続した。発作活動が最高になる時期を捕らえるために、タイムラインをパイロット試験のものから１１日後に治療するように変更した（ＴｅＮＴ後２～４週間）。ロバストなてんかんを発生できない動物の交絡した影響を最小限に抑えるために、治療前の週に５回未満の発作を経験した場合には対象を除外した。この基準を非盲検化前に適用して、８匹の動物（６匹のＥＫＣ、２匹の対照）の除外を行った。ウイルス注入前の週に遭遇した発作回数に関して治療群間に有意差はなかった（マンホイットニーＵ検定、ｐ＝０．１８５）。ＥＫＣ治療は、経時的発作頻度のロバストな減少を生じることが主アウトカム尺度の分析から示唆された（週０～３の一般化対数線形混合モデル、治療×週相互作用効果：Ｆ（１，６７）＝２９．７０４、ｐ＜０．００１、図７Ｃ）。パイロット試験のときと同じように、効果は、記録の継続期間にわたり続き、絶対効果サイズは、対照群で発作が寛解したときにのみ減少した。この場合にも、治療効果は、迅速に出現し、２群の累積１日発作頻度のプロットは、治療２日後に発散し始める（図７Ｄ）。

考察
ＥＫＣ遺伝子療法は、安全性及び診療への移行を改善するように適合化された形態で焦点新皮質発作に有効な新たな治療を提示する。

本発明者らは、Ｋｖ１．１の過剰発現がＥＰＣの運動皮質ＴｅＮＴモデルでてんかん様放電の頻度を低減可能であることをすでに示した（Wykes et al., 2012）。しかしながら、Ｋｖ１．１過剰発現が離散長期持続性発作を抑制するのに十分であるかは不明であった。本発明者らは、Ｋｖ１．１過剰発現が発作頻度を低減するのに実際に十分であることをここで２つの独立した実験で示す。発作回数に対する効果は、明らかであるが、発作は、開始後、治療動物及び対照動物の両方で類似のエレクトログラフィー的特徴を有する類似のパターンで進行する。

後頭皮質へのＴｅＮＴの注入は、運動皮質へのＴｅＮＴの注入（＜１ｓ）よりも顕著に長く（５０～１５０ｓ）持続する発作を誘発した（Wykes et al., 2012）。この差は、ヒト患者において後頭葉発作及びＥＰＣで見られるものに相当し、後頭皮質及び運動皮質における異なる接続性の帰趨であり得る。皮質構造がＴｅＮＴ傷害により誘発されるてんかん様活動のタイプにどのような影響を与えるか決定するためにさらなる研究が必要であろう。

レンチウイルス遺伝子療法アプローチは、ＣＮＳ障害においてより一般的になってきており、長期試験でさえも良好な安全性及び耐容性を示してきた（Palfi et al., 2014）。てんかんの場合、さらなる安全上の問題は、介在ニューロンにおけるカリウムチャネル過剰発現の可能性であり、これにより局所興奮性の減衰ではなく増悪によって発作活動を悪化させる可能性がある。このリスクを軽減するために、本発明者らは、ラットのＧＡＢＡ作動性細胞においてごくわずかな発現をもたらすヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーターを利用した。齧歯動物皮質の興奮性錐体ニューロンの少数は、ＧＡＢＡ及びグルタメートに関して陽性に染色されるため、特異性の本発明者らの推定は、わずかに保守的である可能性もあり（Hill et al., 2000；Lavdas et al., 1996）、したがって錐体の形態及び生理機能にもかかわらずＧＡＤ６７を発現する可能性もある。

神経系興奮性をレギュレートするＫｖ１．１をはじめとするカリウムチャネルの役割は、広範なニューロンにわたり保存されるため、カリウムチャネル過剰発現は、神経系過興奮性により特徴付けられる他の疾患の治療で治療の見込みを保持し得る。現在、慢性疼痛に対する新たな治療の必要性が臨床的に満たされないまま存在し、後根神経節ニューロンの興奮性の低減を目的としたさまざまな遺伝子療法アプローチは、前臨床有効性がすでに実証されている（Snowball and Schorge, 2015）。パーキンソン病などの他の障害は、特定のグループのニューロンの過剰活動に関連付けられ得ると共に（Lobb、2014）、適当な細胞型特異的プロモーターが同定可能でる場合に治療の候補になり得る。

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配列アネックス
模範的操作されたヒトＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）

（式中、ｎは、Ｔ又はＣである）
位置４００にバリン（下線付き）を含む編集されたヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号２）

模範的ヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号３）

ヌクレオチド位置１９９８にアデニン（下線付き）を含む野生型ＫＣＮＡ１コード配列のヌクレオチド配列（配列番号４）

位置４００にイソロイシン（下線付き）を含む野生型ヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号５）

レポーターが欠如している模範的操作されたＫＣＮＡ１遺伝子ウイルスベクターのヌクレオチド配列（細菌プラスミド部分を含まない）（配列番号９）

（式中、ｎは、Ｔ又はＣである）
位置４００にバリン（下線付き）及び位置３７９にバリン（太字）の置換を含む編集されたヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号１４）

Claims

操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む発現ベクターであって、
前記操作されたＫＣＮＡ１遺伝子が、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルであって、ヒト細胞において当該編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの発現を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に結合された編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードし、
前記操作されたＫＣＮＡ１遺伝子が、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
発現ベクター。
前記プロモーターが、細胞型特異的プロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
前記細胞型特異的プロモーターが、ニューロンに特異的である、請求項２に記載の発現ベクター。
前記細胞型特異的プロモーターが、錐体ニューロンに特異的である、請求項２又は３に記載の発現ベクター。
前記細胞型特異的プロモーターが、ヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーターを含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
前記ヒトＣＡＭＫ２Ａプロモーターが、
配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、請求項５に記載の発現ベクター。
ウイルスベクターである、請求項１～６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項７に記載の発現ベクター。
前記レンチウイルスベクターが、配列番号９のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の発現ベクター。
ウイルス粒子を作製するインビトロ方法であって、
請求項８又は９に記載のレンチウイルスベクターで哺乳動物細胞をトランスデュースし、前記細胞内で粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質を発現させることと、
前記トランスデュースされた細胞が培養培地中に放出されるレンチウイルス粒子を生成するように、前記細胞を前記培地中で培養することと、
を含む方法。
粒子形成に必要な前記ウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする１つ以上のウイルスパッケージング発現ベクター及びウイルスエンベロープ発現ベクターで前記哺乳動物細胞をトランスデュースすることを含む、請求項１０に記載のインビトロ方法。
前記パッケージングタンパク質が、非機能性インテグラーゼ酵素を含み、それにより、前記レンチウイルスベクターが、そのウイルスゲノムを前記細胞のゲノム内に取り込むことができない、請求項１０又は１１に記載のインビトロ方法。
前記培養培地から前記ウイルス粒子を分離することと、任意選択的に、前記ウイルス粒子を濃縮することとをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のインビトロ方法。
ヒト細胞内で発現を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に結合された操作されたＫＣＮＡ１遺伝子をコードする一本鎖ＲＮＡ分子を含むウイルス粒子であって、
前記操作された遺伝子が、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードし、
前記操作されたＫＣＮＡ１遺伝子が、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
ウイルス粒子。
請求項８又は９に記載の発現ベクターと、細胞内で発現されたとき、粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする１つ以上のウイルスパッケージング発現ベクター及びウイルスエンベロープ発現ベクターとを含むキット。
前記ウイルスパッケージング発現ベクターが、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである、請求項１５に記載のキット。
神経学的障害の治療に使用するための、請求項１４に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。
前記神経学的障害が、神経系過興奮性を伴う、請求項１７に記載の医薬組成物。
前記神経学的障害が、発作障害である、請求項１７に記載の医薬組成物。
前記発作障害が、てんかんである、請求項１９に記載の医薬組成物。
前記てんかんが、新皮質てんかんである、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記神経学的障害が、パーキンソン病である、請求項１７に記載の医薬組成物。
前記神経学的障害が、慢性疼痛である、請求項１７に記載の医薬組成物。
神経学的障害の治療のための医薬の製造における、請求項１４に記載のウイルス粒子の使用。
前記神経学的障害が、神経系過興奮性を伴う、請求項２４に記載のウイルス粒子の使用。
前記神経学的障害が、発作障害である、請求項２４に記載のウイルス粒子の使用。
前記発作障害が、てんかんである、請求項２６に記載のウイルス粒子の使用。
前記てんかんが、新皮質てんかんである、請求項２７に記載のウイルス粒子の使用。
前記神経学的障害が、パーキンソン病である、請求項２４に記載のウイルス粒子の使用。
前記神経学的障害が、慢性疼痛である、請求項２４に記載のウイルス粒子の使用。
請求項１～９のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む細胞。
哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の細胞。
ヒト細胞である、請求項３２に記載の細胞。
ヒト胎児腎細胞である、請求項３３に記載の細胞。
編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする操作されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む核酸であって、
前記操作されたＫＣＮＡ１遺伝子が、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
核酸。