JP7071430B2 - 糖質コンジュゲートrna剤およびその調製方法 - Google Patents
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Description
Xのそれぞれが、ヒドロキシ保護基または水素であり;
Yのそれぞれが、アミン保護基(例えば、アセチル)であり;
nが0~20(例えば、0~15または4~15、好ましくは7)であり;
q、rおよびsのそれぞれが、独立して、1~7であり;
Lが連結基であり;
R1がiRNA剤である)で表されるものなどの糖質がコンジュゲートされたiRNA剤を調製するのに有用である。一実施形態において、Xの全てが同じであり、Yの全てが同じであり、qの全てが同じであり、rの全てが同じであり、sの全てが同じである。一実施形態において、Xのそれぞれが水素である。他の実施形態において、Yのそれぞれがアセチルである。一実施形態において、Xのそれぞれが水素であり、Yのそれぞれがアセチルである。
(i)金属不純物(パラジウム、白金、およびルテニウムなど)、
(ii)以下の2つの尿素副生成物のそれぞれ
(i)式(VI)の化合物を、金属アルコキシド塩基(例えば、NaOMe)などの塩基と反応させるステップと;
(ii)ステップ(i)の生成物(例えば、NaBH4で)を還元するステップと;
(iii)ステップ(ii)の生成物を、酸(例えば、HCl)と反応させるステップと
を含み得る。この方法は、単一のポットで、高収率(例えば、>80%)で行われ得る。
Aが、C6~C14アルキレンリンカー(例えば、-(CH2)10-などのC8~C12アルキレンリンカー)であり;
各Rが、独立して、酸保護基(例えば、置換または非置換アルキル(例えば、t-ブチル)または置換または非置換アリール)であり;
Rxが、置換または非置換アルキル(例えば、メチル)または置換または非置換アリールなどの酸保護基である。好ましくは、Rxが、全てのR基と異なる)
の化合物を調製するための方法に関する。
X、Y、n、q、r、およびsが、式(A)に関して上に定義されるとおりであり;
Prtがヒドロキシル保護基である)の化合物を調製するための方法に関する。
X、Y、n、q、r、およびsが、上に定義されるとおりであり;
Prtがヒドロキシル保護基であり;
(1)塩基の存在下で、式II:
(2)式(IV)の化合物中のZを脱保護した後、ヒドロキシルプロリン(V):
(3)ステップ(2)の生成物を、無水コハク酸と連結するステップ;および
(4)ステップ(3)の生成物を固体担体に連結して、式(I)の化合物を得るステップ
のうちの1つ以上を含む。この方法がステップ(4)を含まない場合、形成される中間体は、その後、式(I)または(A)の化合物に転化される。式(I)の化合物は、式(A)のものなどの糖質がコンジュゲートされたiRNA剤を調製するのに有用である。
「連結基」という用語は、iRNA剤をGalNAc3部分に連結するための任意の好適な基を指す。連結基の例が、国際公開第2009/082607号パンフレットおよび米国特許出願公開第2012/0136042号明細書に提供され、これらは両方とも、参照により本明細書に援用される。
以下のスキーム1~8のいずれかに示されるように、AcおよびBzは、本明細書に記載されるように、任意のヒドロキシ保護基で置換され得る。Bocは、本明細書に記載されるように、任意のアミノ保護基で置換され得る。
あるいは、化合物1を、ナトリウムメトキシドなどのアルコキシドと反応させ、還元剤(例えば、水素化ホウ素ナトリウム)を加え、次に、塩酸を加えることによって、化合物1が、1ステッププロセスで化合物4Aに転化され得る。この1ステッププロセスの全収率は84%である。
実施例1-化合物2の合成
ステップ(i)[1]:DCM(3L)中のトランスヒドロキシプロリンメチルエステル・HCL3(100g、552.3mmol)およびBoc2O(132.5g、607.57mmol)の懸濁液に、Et3Nを、1時間にわたって約0~5℃で滴下して加え、一晩、ゆっくりと室温にした。水(50mL)を加え、有機溶媒を濃縮した後、溶媒を濃縮したところ、粗材料(約115g)が得られ、それを精製せずに次のステップに使用した。1H NMR(CDCl3):1.42、1.46(s,9H)、1.75~1.77(m,2H)、2.07~2.11(m,1H)、2.26~2.34(m,1H)、3.44~3.67(m,3H)、3.74(s,3H)、4.4(t,J=8.0Hz、1H)、4.48~4.51(m,1H)。
ステップ(ii)[1]:氷浴上で、オーバーヘッド撹拌機を備えた五つ口の15Lのガラス反応器中で反応を行った。アセトニトリル(8L)中の4(450g、2.94モル)の撹拌溶液に、Et3N(1L、7.2モル)およびトリフルオロ酢酸エチル(1000g、7.04モル)を加え、室温で一晩撹拌した。白色の固体(Et3N.HCl)を焼結式漏斗でろ過し、酢酸エチル(4L)で洗浄した。有機溶液を濃縮した後、トルエン(2L×2)と同時蒸発させ、22Lのロータリーエバポレータ中で、減圧下で一晩乾燥させたところ、粗生成物がゴム状の塊(約600g)として得られた。
ステップ(i)[1]:市販の化合物6(1081g、2.139mol)、ドデカン酸モノメチルエステル(653g、2.673モル)およびHOBt(433.5g、3.209mol)を、アルゴン下で、オーバーヘッド撹拌機を備えた12Lの三つ口丸底フラスコ中で、DCM(6L)とDMF(1L)との混合物に溶解させた。反応混合物を氷水浴中で冷却し、約10℃の温度を維持した。EDAC.HCl(531g、2.673mol)を何回かに分けてゆっくりと加えた後、30分間の期間にわたってDIEA(1.12L、6.42mol)を加えた。反応混合物を、アルゴン下で2日間撹拌し続けた。KMnO4染色を用いて2日後にTLCを確認し、ロータリーエバポレータフラスコに移し、揮発物を減圧下で除去した。ジクロロメタンの大部分を除去した後、フラスコをフードに移し、撹拌しながら15Lの水を加え、混合物を一晩沈降させ続けた。上層をデカントし、粘性の底層を、4LのEtOAcに溶解させ、水(2×4L)、10%のクエン酸水溶液(2×3.5L)、2×4LのNaHCO3水溶液、続いて、飽和塩水(2.5L)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。粗生成物を高真空下で一晩乾燥させ、他の精製を伴わずに次の反応に使用した(1641g、定量的)。LC-MS、C38H69NO12についての計算値、分子量:731.48;実測値732.3(M+H)。1H NMR(400MHz、DMSO)δ 6.85(s,1H)、3.53(dd,J=12.9、6.9Hz、16H)、3.30(s,1H)、2.49(dd,J=3.5、1.7Hz、2H)、2.37(t,J=6.1Hz、7H)、2.26(t,J=7.4Hz、2H)、2.02(t,J=7.3Hz、2H)、1.56~1.44(m,3H)、1.44~1.34(m,32H)、1.21(s,13H)。
ステップ(ii)[1]:DCM/DMF(1.5L/0.5L)中の7(89.5g、158.7)、NBocプロパンジアミン(103.6g、595mmol)、EDC(113.7g、595mmol)、HOBt(96.4g、630mmol)の撹拌溶液に、DIEA(207.4mL、1190mmol)を、10分間にわたって滴下して加え、室温で14時間撹拌した。100mLの水を加え、DCMを減圧下で蒸発させた。さらに1Lの水を加えた後、水層を注意深くデカントし、この手順を2回繰り返した。得られた粘性油をDCM(500mL)に溶解させた後、水(500mL)、10%のクエン酸(500mL)、飽和NaHCO3(250mL)、塩水(200mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、対応する生成物(157g)が無色の粘性油として得られた。LCMS:計算値:1031.67(M+)、実測値:1066.4(M++Cl-)
ステップ(iii)[1]:DCM/DMF(250mL/250mL)中の酸8(28g、27.514mmol)トランスヒドロキシルプロリノール4(6.3g、41.27mmol)およびHOBt(16.84g、110.06mmol)の撹拌溶液に、DIEA(17.75g、137.57mmol)を、室温で5分間にわたって滴下して加え、30分間撹拌した。上記の溶液に、HBTU(13.05、34.39mmol)を、10分間にわたって何回かに分けて加え、3時間撹拌した。100mLの水を加えた後、DCMを蒸発させ、次に、500mLの水を加え、1時間静置しておいた。濁った溶液をデカントし、粘着性の固体を水(100mL×3)ですすいだ。ゴム状の材料をDCM(500mL)中の20%のMeOHに溶解させ、濃縮した後、トルエン(100ml×2)と同時蒸発させたところ、対応する生成物(31g)が、黄色がかった泡状の固体として得られた。LCMS:計算値:1116.73(M+)、実測値:1117.7(M++1)、1139.6(M++Na)。
(A)上記のNBoc化合物(0.475g、0.425mmol)を10mLの95%のHCOOHに溶解させ、3時間撹拌した。有機溶媒を濃縮したところ、対応する生成物が定量的収率で得られた。化合物9についてのLCMS:計算値:816.57(M+)、実測値:817.4(M++1)、839.3(M++Na)
(B)上記のNBoc化合物(0.475g、0.425mmol)をDCM中の10mLの20%のTFAに溶解させ、3時間撹拌した。有機溶媒を濃縮したところ、対応する生成物が定量的収率で得られた。化合物9についてLCMS:計算値:816.57(M+)、実測値:817.4(M++1)、839.3(M++Na)
ステップ(iv):DCM(200mL)中の25(10g、15.79)、EDC(3.79g、19.84mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(2.27g、19.73mmol)の撹拌溶液に、DIEA(5.09g、39.46mmol)を、5分間にわたって滴下して加え、室温で14時間撹拌した。50mLの水を加えた後、DCM(2×100mL)で抽出し、水、10%のクエン酸(100mL)、飽和NaHCO3(250mL)、塩水(200mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、対応する生成物(12g)が、黄色がかった固体として得られ、それを精製せずに次のステップに使用した。
ステップ(i)[1]:無水ピリジン(7.2L)を、Ar雰囲気下で、40Lの反応器中で、無水酢酸(5.3L)中のガラクトサミン.HCl20(1.63kg、7.55mol)の撹拌および(氷浴上で)冷却された懸濁液に加えた。DMAP(79g)、およびトリエチルアミン(1.05L、7.55mol)を連続して加え、混合物を氷浴上で一晩撹拌し、その間、20の溶解、続いて、過アセチル化(peracetylated)糖およびトリエチルアミン塩酸塩の結晶化が、最初の2時間の間に30℃までの発熱効果を伴って起こった。混合物を焼結式ガラスフィルタに通してろ過し、残渣を、トルエン(約4L×2)、続いて水(約3L×2)で洗浄した。結晶性残渣をガラスフィルタ上で一晩乾燥させ、乾燥皿に移し、ホットプレート上で、70℃で2日間にわたって空気中で乾燥させたところ、2.53kg(86%)の純粋な化合物過アセチル化化合物が得られた。
アルゴンをゆっくりと流しながら、20Lの回転蒸発フラスコ中で反応を行った。乾燥メタノール(4L)中のバレロラクトン22(98%の純度(TCI)、1.0kg、10mol)およびトリエチルアミン(140mL、1mol)の溶液を室温で1時間撹拌し、その間、わずかな発熱効果(28℃まで)が観察された。混合物を真空中で濃縮し(25℃の加熱浴)、乾燥トルエン(4L)で希釈し、減圧下で蒸発させ、残渣を、4ミリバール/25℃のロータリーエバポレータで乾燥させた後、高真空(0.4~0.6トル、室温)下で一晩撹拌したところ、23が1%未満のトルエンを含有する無色の液体、1.39kg(100%)として得られた。
ステップ(iii)[1]:Ar雰囲気下で、冷却ジャケットを備えた20Lの反応器中で反応を行った。TMSOTf(250mL、1.38mol)を、無水DCE(6.5L)中の粗製の21(2.14kg、≦6.49mol)およびヒドロキシエステル23(0.94L、7.14mol)の撹拌および冷却された(12℃)溶液に加えた。直後の発熱効果(23℃まで)が観察され、冷却器をオフにし、混合物を室温で3時間撹拌し、NaHCO3(168g、2.0mol)と、水(3L)と、いくらかの氷との激しく撹拌された混合物を含む22Lの開放されたフラスコに移した。有機相を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、油状の残渣を、12ミリバール/30℃のロータリーエバポレータで乾燥させたところ、3.09kgの粗生成物が得られ、それをさらに精製せずに次のステップに使用した。
ステップ(iv)[1]:化合物24(1.06kg、3.15mol、約95%の純度)およびDMAP(384g、3.15mol)を、Ar雰囲気下で、無水ピリジン(9.0L)に溶解させた。安息香酸無水物(2.49kg、11.02mol)を加え、混合物を一晩撹拌し、水(200mL)を加え、さらに0.5時間撹拌し続けた。ピリジンを蒸発させ、残渣を、35℃を超える浴温度(結晶化が起こった)で10ミリバールのロータリーエバポレータで乾燥させた。固体が完全に溶解するまで、残渣をロータリーエバポレータフラスコ中で水(2L)とEtOAc(4L)とに分液し、抽出容器に移し、さらなるEtOAc(8L)および水(5L)で希釈した。有機層を分離し、水(10L)、飽和NaHCO3(5L×2)、および再度、水(5L×2)で連続して洗浄した。有機層を分離し、溶媒を、粘性の塊になるまで真空中で蒸発させ、油状の残渣をエタノール(3.8L)に再溶解させ、溶媒を再度蒸発させ、残渣を、20ミリバール/35℃のロータリーエバポレータで乾燥させた。残渣を35℃でエタノール(10.6L)に再溶解させ、加熱/冷却ジャケットを備えた20Lのろ過反応器に移した。水(6.0L)を何度かに分けて加え、混合物を22℃に冷まし、生成物のシードを加えた。一晩撹拌した後、バルク結晶化が起こり;混合物を0℃に冷却し、さらに5時間撹拌し、ろ過した。一晩空気を通すことによって沈殿物を予備乾燥させ、乾燥皿に移し、ホットプレート上で、65℃で2日間にわたって(一定の質量になるまで)空気中で乾燥させたところ、1.70kg(84%)のベンゾイル化生成物(約97%の純度)が得られた。
ステップ(v)[1]:化合物24(12.70g、38mmol)を、メタノール(50mL)および水(5mL)中のNaOH(1.88g、47mmol)の溶液に溶解させ、混合物を一晩撹拌し、酢酸(0.51mL、9mmol)で中和し、無水エタノール(200mL)で希釈し、蒸発させて乾燥させた。0.4トルで一晩乾燥させた後、15.38gの白色の発泡体が得られ、それを150mLの無水ピリジン、続いて、無水酢酸(30mL、152mmol)で研和した。混合物を30℃で一晩撹拌し、0℃に冷却し、水(14mL)を加えた。冷却浴を除去し、混合物を室温で1時間撹拌し、溶媒の大部分を真空中で除去し、残渣を、飽和塩水(150mL)と酢酸エチル(100mL)とに分液し、有機層を分離し、20%のリン酸と20%の塩水との混合物(1:1、250mL)、飽和塩水で3回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させた。残渣を、n-ブタノール(3回)、続いて、ACN(3回)と同時蒸発させたところ、14.46g(83%)の25が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ 1.54(S,4H)、1.71(S,3H)、2.22(t,2H)、3.54(m,1H)、3.81(m,1H)、4.39(m,2H)、4.48(m,2H)、4.74(d,1H)、5.37(dd,1H)、5.76(d,1H)、7.40(t,2H)、7.50(t,2H)、7.58(m,3H)、7.65(t,1H)、7.73(m,3H)、7.92(t,4H)、8.11(d,2H)、12.11(s,1H)。13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ 21.0、22.6、28.3、33.2、49.7、62.0、67.9、68.4、70.0、71.8、100.8、128.5、128.6、128.9、129.0、129.1、133.4、133.6、164.8、165.1、169.3、174.3。LC-MS:634(M+1)+。
ステップ(vii)[1]:化合物7(1090g、1.936mol)およびHOBt(1170g、8.667mol)を、アルゴン下で、オーバーヘッド撹拌機を備えた22Lのフラスコに取り込んだ。4LのDCMおよび2LのDMFを、撹拌しながら加え、混合物を氷水混合物中で約10℃に冷却した。2LのDCM中のモノbocプロピルアミン21(1265g、7.260mol)の溶液を、撹拌しながら上記の溶液に加えた。ゆっくりと全ての試薬を溶液に入れた。4LのDCM中のEDAC.HCl(1439g、7.260mol)のスラリーを、約10℃の温度を維持しながら、反応混合物にゆっくりと加えた。DIEA(2.40L、13.55mol)を、1.5時間の期間にわたってゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌し続けた。TLCを確認し、反応混合物をロータリーエバポレータ漏斗に移し、揮発物を減圧下で除去した。フラスコをフードに移し、10Lの水を、撹拌しながら残渣に加え、混合物を一晩沈降させた。2つの層を一晩分離し、上層をデカントした。底層を8LのEtOAcに溶解させ、分液漏斗に移し、水(2×4L)、NaHCO3水溶液(2.5L)および10%のクエン酸水溶液(2×3.5L)および水(1×4L)および飽和塩水(2.5L)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、トルエンおよびジクロロメタンと同時蒸発させ、高真空下で乾燥させた(収量2026g、定量的)。LC-MS C50H93N7O15についての計算値、分子量:1031.67;実測値1032.6(M+H)。1H NMR(400MHz、DMSO)δ 7.79(t,J=5.6Hz、1H)、6.94(s,1H)、6.72(t,J=5.3Hz、1H)、3.61~3.45(m,5H)、3.01(dd,J=12.8、6.6Hz、2H)、2.89(dd,J=12.7、6.5Hz、2H)、2.26(t,J=6.3Hz、3H)、2.03(t,J=7.3Hz、1H)、1.55~1.38(m,3H)、1.36(d,J=10.7Hz、8H)、1.21(s,3H)。
アセテートのためのステップ(viii)[1]:DCM(500mL)中のGalNAc酸25-Ac(50.65g、113.27mmol)、HBTU(52g、136mmol)およびHOBt(19g、135mmol)の溶液に、DIEA(52ml、10当量)を加え、混合物を15℃で10分間撹拌した。この混合物に、DMF(100mL)中のアミン29(32g、29.80mmol)の溶液を加え、混合物を4時間撹拌した。TLCを確認し、溶媒を除去した。残渣に水を加え、EtOAcで抽出した。有機層を、水(2×200mL)、重炭酸塩水溶液(1×200mL)および塩水(200mL)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶離剤としてEtOAc/MeOH混合物を用いた短いシリカゲルカラムによって、粗生成物を精製したところ、化合物がオフホワイトの固体26a(収量、42.3g、70%)として得られた。MALDI-MS C92H150N10O39についての計算値 分子量:2019.01;実測値2042.10(M+Na)。
方法A:DCM(200mL)中のGalNAc酸25-Bz(35.86g、56.63mmol)、HBTU(28g、73.61mmol)およびHOBt(11.48g、84.90mmol)の溶液に、DIEA(26ml、10当量)を加え、混合物を15℃で10分間撹拌した。この混合物に、DMF(50mL)中のアミン29(15.70g、14.90mmol)の溶液を加え、混合物を4時間撹拌した。TLCを確認し、溶媒を除去した。残渣に水を加え、EtOAcで抽出した。有機層を、水(2×100mL)、重炭酸塩水溶液(1×100mL)および塩水(150mL)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶離剤としてEtOAc/MeOH混合物を用いた短いシリカゲルカラムによって、粗生成物を精製したところ、化合物がオフホワイトの固体26b(収量、25.20g、67%)として得られた。MALDI-MS C137H168N10O39についての計算値、分子量:2577.15;実測値3000.10(M+Na)。1H NMR(400MHz、DMSO)δ 8.04~7.80(m,1H)、7.79~7.33(m,2H)、6.96(s,1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.55~4.19(m,1H)、4.01(q,J=7.1Hz、1H)、3.86~3.73(m,1H)、3.64~3.45(m,1H)、3.31(s,1H)、3.02(d,J=5.0Hz、1H)、2.36~2.15(m,1H)、2.13~1.99(m,1H)、1.69(s,1H)、1.61~1.35(m,1H)、1.31~1.02(m,1H)。
ステップ(i):無水DCM(50mL)中の三本鎖酸30(5.00g、2.5mmol)、ヒドロキシプロリノール誘導体5(1.17g、2.8mmol)、HBTU(1.14g、3.0mmol)、HOBt(1.01g、7.5mmol)の撹拌された混合物に、DIEA(1.3mL、7.5mmol)を加えた。混合物を一晩撹拌し、水(60mL)でクエンチし、有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させたところ、9.21gの残渣が得られた。それを、酢酸エチル(80mL)とDCM(30mL)との混合物に溶解させ、酢酸エチル中の2%のTEAで非活性化されたシリカゲル(20g)を含むろ過カラムに充填した。ろ過カラムを、90mLのそれぞれ:酢酸エチル-TEA(2%)(×6)、酢酸エチル-メタノール(10:1、×1)、および(3:1、×3)で溶出した。生成物を含有する画分を収集し、真空中で蒸発させ、残渣を、ACNと(2回)同時蒸発させた。生成物を0.4トルで一晩乾燥させたところ、4.77g(80%)の31(Ac)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-D6):δ 1.21~1.15(m,12H)、1.49~1.46(m,22H)、1.76(s,9H)、1.88(s,9H)、1.98(s,12H)、2.01(m,9H)、2.09(s,9H)、2.21(t,2H)、2.27(t,6H)、2.9(m,1H)、3.02(m,14H)、3.52(m,12H)、3.70(m,10H)、3.88(q,3H)、4.0(s,9H)、4.1(m,1H)、4.48(d,3H)、4.7~4.5(m,1H)、4.98(d,3H)、5.21(d,3H)、6.84(m,4H)、7.02(s,1H)、7.17(m,5H)、7.28(m,4H)、7.79(m,3H)、7.88(m,6H)。MALDI-MS:2429(M+Na)+。
ポリスチレンアミノベースの担体の例:ステップ(ii)[i]からのスクシネート(32.50g、12.46mmol)を、アセトニトリル(1000mL)に取り込み、それに、HBTU(11.80g、31.16mmol)およびDIEA(10mL、4当量)を加え、反応混合物を5分間混合した。アミノ末端ポリスチレン担体(160g)を加え、混合物を室温で24時間振とうした。それをろ過し、DCM、10%のMeOH/DCM、DCMおよびジエチルエーテルで連続して洗浄した。それを真空下で乾燥させ、充填量を確認した。乾燥された固体担体を、25%のAc2O/Pyを用いて3時間キャッピングし、洗浄し、乾燥させたところ、所要の固体担体(186g、67μmol/gの充填量)が得られた。
ステップ(ii)[2]:
上述されるのと同じプロトコルにしたがって、異なるヒドロキシル末端ポリマー担体を充填し、結果を以下に示す。
上述されるのと同じプロトコルにしたがって、異なるヒドロキシル末端ポリマー担体を充填し、結果を以下に示す。
ガス入口、温度計、還流冷却器および還流冷却器上に設置されたガス出口を備え、バブラーに連結された5Lのフラスコ中で反応を行った。MeOH(166mL、0.725mol)中のNaOMeの25重量%の溶液を、Ar雰囲気下で、無水MeOH(1.3L)中の1(131.6g、0.725mol)の冷却(0℃)および撹拌された溶液に加えた後、約1.5時間にわたってNaBH4(90.8g、2.39mol)を何回かに分けて加えた。最初の1/3の分量のボロヒドリドの添加の際に著しい発熱効果が観察され、反応温度を20~25℃未満に維持するように添加の速度を調整した。氷水冷却浴を水道水冷却浴と交換し、水素発生が停止するまで(ガスバブラー監視)、温度を20~25℃未満に維持しながら混合物を一晩撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し;ジオキサン(3.2mol、800mL)中のHClの4Mの溶液を加え(30℃までの発熱)、冷却浴を除去し、混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を微多孔性ガラスフィルタに通してろ過し、バルク結晶化が起こるまでろ液を減圧(80ミリバール、30℃)下で蒸発させた(約2Lの溶媒が除去された)。乾燥MeCN(1.5L)を加え、混合物をロータリーエバポレータ(20℃、2時間)で研和し、ろ過し、結晶性残渣をMeCNで1回洗浄し、窒素をゆっくりと流しながら、一晩乾燥させたところ、93.0g(84%)の純粋な4Aが得られた。さらなる分量の11.0g(9%)の4Aが、母液からゆっくりと沈殿し、これは、NH4Clおよび他の少量の不純物で汚染されていた。1H NMR(D2O):1.94~2.01(m,1H)、2.14~2.19(m,1H)、3.30~3.48(m,2H)、3.71~3.76(m,1H)、3.93~4.08(m,2H)、4.67~4.75(m,1H)。
上記の手順をより大きい規模で最適化するために、1から4Aへの転化を、3モルの規模で行い、この手順を以下に示す。
(tert-ブチル-3,3’-(2-アミノ-2-((3-tert-ブトキシ-3-オキソプロポキシ)メチル)プロパン-1,3-ジイル)ビス(オキシ)ジプロパノエート)
無水メタノール(6.5L)中のトリ-GalNAc(Bz)-メチルエステル26B(1.51kg、0.585mol)の溶液に、Ar雰囲気下で、メタノール(135mL、0.585mol)中のNaOMeの25重量%の溶液を加えた。混合物を周囲温度で2時間撹拌し、トリエチルアミン塩酸塩(96.3g、0.70mol)で中和し、減圧下で蒸発させ、残渣を、分液漏斗中で、1%のNaCl水溶液(7.0L)とEtOAc(3.0L)とに分液して、安息香酸メチル(副生成物)を有機層中に抽出した(脱ベンゾイル化された(de-benzoylated)生成物26B-1は水への溶解性が高い)。EtOAc層を分離し、水層をさらなる3.0Lの酢酸エチルで洗浄した。ピリジン(2.0L)を水性抽出物に加え、酢酸エチルの全ての痕跡が除去されるまで(約2時間)、混合物を40ミリバール/35℃のロータリーエバポレータで蒸発させた。
前のステップからの水抽出物を含有するロータリーエバポレータフラスコに、オーバーヘッド撹拌機を装着し、NaOH(70.0g、1.75mol)を加え、混合物を周囲温度で一晩撹拌し、トリエチルアミン塩酸塩(241g、1.75mol)で中和し、6.0Lのピリジンで希釈し、粘性の油状の残渣が得られるまで、溶媒を、20Lのロータリーエバポレータで、13ミリバール/35℃で蒸発させた。残渣をピリジン(6.0L)に再溶解させ、沈殿した塩化ナトリウムをろ過して取り除き、ピリジン(3×500mL)で洗浄し、組み合わされたろ液を、粘性の油状の残渣が得られるまで20ミリバール/45℃で蒸発させた。
ステップ2からの残渣を、Ar雰囲気下で、無水ピリジン(6.0L)に再溶解させ、溶液を、約1.5時間にわたって無水ピリジン(5.6L)と無水酢酸(2.8L)との激しく撹拌された混合物にゆっくりと加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌し、氷水浴中で約4℃に冷却し、1.5Lの氷冷水を加えた。40℃までの発熱効果が観察され;混合物を周囲温度に冷まし(約0.5時間)、ロータリーエバポレータに移して、揮発物を除去した。油状の残渣を、一定重量(約1.82Kg)になるまで、2ミリバール/45℃で、真空下で乾燥させた。残渣を、酢酸エチル(5.0L)とイソプロパノール(1.0L)との撹拌された混合物に溶解させ、25%の塩化ナトリウム水溶液(6.0L)を加えた。トリエチルアミン(1.025L)をゆっくりと加えることによって、水相のpHを7に調整した。中和には、固体塩化ナトリウムの沈殿および中間層の分離が伴い、それを0.5Lのイソプロパノールの添加によって、有機相に戻した。液体を、移送ポンプを用いて、固体NaClから分液漏斗へとデカントした。有機層を分離し、25%のNaCl(6.0L×2)、飽和NaCl(3.0L)で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、泡状の残渣を、無水アセトニトリル(6.0L×2)と同時蒸発させ、2ミリバール/40℃で24時間乾燥させたところ、1.11kg(95%)の27Aが得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ 8.00(d,J=9.3Hz、3H)、7.96~7.80(m,15H)、7.80~7.43(m,30H)、7.37(t,J=7.8Hz、6H)、6.98(s,1H)、5.76(d,J=3.2Hz、3H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、3H)、4.74(d,J=8.5Hz、3H)、4.55~4.40(m,6H)、4.40~4.20(m,6H)、4.01(q,J=7.1Hz、3H)、3.89~3.73(m,3H)、3.66~3.42(m,18H)、3.34(s,2H)、3.03(s,12H)、2.35~2.17(m,8H)、2.13~2.00(m,8H)、1.70(s,9H)、1.61~1.33(m,21H)、1.16(dd,J=12.4、5.2Hz、15H)。
1)対応するトシル酸塩25Bへのトリス(Bocアミン)メチルエステル24Aのp-トルエンスルホン酸(PTSAまたはトシル酸)脱保護
無水DMF(100mL)中のBzGalNAc C5酸-ナトリウム塩13A(21.5g、32.8mmol)およびHOBt-一水和物(5.51g、36mmol)の冷却(10℃)および撹拌された溶液に、EDC塩酸塩(7.1g、36mmol)、続いて、DIEA(10.0mL、73mmol)を加え、EDC塩酸塩の完全な溶解が得られるまで(約15分間)、混合物を10℃で撹拌した。同時に、25B(13.95g、9.1mmol)を含有する前のステップからの固体を、無水DMF(70mL)に溶解させ、溶液を、カニューレを介して、上記の混合物に移した。混合物を一晩で室温に温め、0℃に冷却し、水(600mL)で希釈した。有機成分を0℃で一晩沈降させた後、水層を粘性の有機残渣からデカントし、これをEtOAc(200mL)に取り込み、5%のNaCl(200mL)と、20%のリン酸(20mL)と、5%の塩水(×2)と、飽和塩水との混合物で連続して洗浄し;有機層を、300mLの総体積になるまでEtOAcで希釈し、無水Na2SO4上で乾燥させた。この溶液を、EtOAc中に予め湿式充填された100gのシリカゲルの短いろ過カラムに直接充填した。カラムを、EtOAc(300mL×2)、続いて、3;1のEtOAc-メタノール(300mL×3)で溶出し、所望の生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、0.4トルで一晩乾燥させたところ、20.14g(86%)の26Aが得られた。HPLCプロファイル(87%)は、対照のバッチ(88%)と同等であった。
Claims (1)
- 式(A)
Xのそれぞれが、水素またはヒドロキシ保護基であり;
Yのそれぞれが、アミン保護基であり;
nが0~20であり;
q、rおよびsのそれぞれが、独立して、1~7であり;
Lが連結基であり;
R1がiRNA剤である)
の化合物を調製するための方法であって;
前記方法が、
(i)塩基の存在下で、式(II)
Zが酸保護基である)
の化合物を得るステップ;および
(ii)式(IV)の化合物のZを脱保護した後、式(V)
を含み、
- 式(II)の化合物が、式(X)
Halがハロゲンであり、
AがC 6 ~C 14 アルキレンリンカーであり、
R x が酸保護基である)
の化合物を用いて得られ、
- 式(V)のヒドロキシルプロリンが、以下のステップ:
[a]式(VI)の化合物を式(VII)の化合物に転化するステップ:
(1)式(VI)の前記化合物を塩基と反応させるステップと;
(2)ステップ(1)の前記生成物を還元するステップと;
(3)ステップ(2)の前記生成物を酸と反応させるステップと
を含み、前記(1)~(3)が単一のポットで重金属の不在下で行われる、ステップと;
[b]式(VII)の化合物の窒素原子を保護するステップと
を介して得られる、
方法。
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