JP7068820B2

JP7068820B2 - Methods and Compositions for Adoptive Cell Therapy

Info

Publication number: JP7068820B2
Application number: JP2017529321A
Authority: JP
Inventors: マークジェイ．ギルバート
Original assignee: ジュノーセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: AU2020281158A1; EP3227323A1; EP3766895A1; US20220280642A1; KR20170087514A; CN107206025A; AU2020281158B2; AU2015358400A1; CA2969456A1; MX2022005955A; AU2015358400B2; US20160158359A1; JP2022101625A; WO2016090190A1; US20240066122A1; EP3227323B1; US11266739B2; ES2819553T3; MX2017007138A; HK1244826A1

Description

関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって組み入れられる「Methods and Compositions for Adoptive Cell Therapy」という名称の2014年12月3日に出願された米国仮出願第62/087,224号に基づく優先権を主張する。 Cross-references to related applications This application is prioritized under US Provisional Application No. 62 / 087,224, filed December 3, 2014, entitled "Methods and Compositions for Adoptive Cell Therapy," the entire contents of which are incorporated by reference. Insist.

配列表の参照による組み入れ
本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願される。配列表は、65,266バイトのサイズの2015年12月3日に作成された735042001240SeqList.txtという名称のファイルとして提供された。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によってその全体が組み入れられる。 Incorporation by reference to sequence listings This application is filed with sequence listings in electronic format. The sequence listing was provided as a file named 735042001240SeqList.txt created on December 3, 2015, with a size of 65,266 bytes. The information in the electronic format of the sequence listing is incorporated by reference in its entirety.

分野
本開示は、例えば、複数の投与工程を介した、かつ/または先の投与を受けたことのある対象への投与による、遺伝子改変（組換え）受容体を発現する細胞の複数の用量の投与を含む、養子細胞療法に関する。一般に、いくつかの異なる投与工程に関して投与される細胞は、別の受容体を発現する。組換え受容体には、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）、および/またはトランスジェニックT細胞受容体（TCR）のようなその他のトランスジェニック受容体が含まれ得る。方法の特色は、例えば、疾患関連抗原を標的とする受容体を発現する投与された細胞への処置された対象の曝露の増加による、効力の改善のような、様々な利点を提供する。第1のまたは先の投与における細胞が発現するものとは別の受容体を発現する細胞の後の投与は、効力を改善することができる。例えば、それは、対象における特異的な抗受容体免疫応答に起因し得る細胞への曝露の低下のリスクを最小化することができ、かつ/または第1のもしくは先の受容体が標的とする抗原もしくはエピトープの抗原喪失および/もしくはダウンレギュレーションもしくは修飾のケースにおいて有効なターゲティングを可能にする。 The present disclosure relates to multiple doses of cells expressing a genetically modified (recombinant) receptor, eg, via multiple dosing steps and / or by administration to a subject who has received previous doses. Concerning adoptive cell therapy, including administration. In general, cells administered for several different dosing steps express different receptors. Recombinant receptors can include chimeric receptors, such as chimeric antigen receptors (CARs) and / or other transgenic receptors such as transgenic T cell receptors (TCRs). The features of the method provide various benefits, such as improved efficacy by increasing exposure of the treated subject to administered cells expressing receptors that target disease-related antigens. Subsequent administration of cells expressing a receptor other than that expressed by the cells in the first or previous administration can improve efficacy. For example, it can minimize the risk of reduced exposure to cells that may result from a specific anti-receptor immune response in a subject and / or an antigen targeted by the first or earlier receptor. Alternatively, it enables effective targeting in cases of antigen loss and / or downregulation or modification of the epitope.

背景
キメラ抗原受容体（CAR）のような組換え受容体を発現する改変細胞を使用した養子細胞療法のため、様々な方法が利用可能である。例えば、投与された細胞への対象の曝露を増加させることによって、例えば、そのような治療の効力を改善するため、改善された方法が必要とされている。例えば、投与された細胞の増大および/もしくは持続性を改善し、難治性もしくは再発性の対象を処置する能力を提供し、かつ/または毒性もしくはその他の望まれない事象のリスクを低下させる、そのような方法が必要とされている。そのような必要性を満たす方法、組成物、および製品が提供される。 Background Various methods are available for adoptive cell therapy using modified cells that express recombinant receptors such as chimeric antigen receptors (CARs). Improved methods are needed, for example, to improve the efficacy of such treatments by increasing the subject's exposure to administered cells, for example. For example, it improves the growth and / or persistence of administered cells, provides the ability to treat refractory or recurrent subjects, and / or reduces the risk of toxicity or other unwanted events. Such a method is needed. Methods, compositions, and products that meet such needs are provided.

概要
例えば、養子細胞療法のため、例えば、癌およびその他の疾患、状態、または障害の処置において、細胞を対象へ投与する方法、ならびにそのような方法において使用するための細胞、組成物、および製品が、提供される。細胞は、一般に、キメラ抗原受容体（CAR）、その他の抗原受容体、および/またはその他のキメラ受容体のような、1種または複数種の組換え受容体を発現する。いくつかの態様において、方法は、例えば、投与された細胞の増大および/または持続性を改善することによって、投与された細胞への対象の曝露を増加させ、難治性もしくは再発性の対象、および/または標的とされた抗原もしくはそのエピトープの喪失、ダウンレギュレーション、もしくは修飾を示す対象を処置する能力を提供する。いくつかの態様において、方法は、細胞療法の他の方法と比較して、毒性またはその他の望まれない事象のリスクを低下させる。 Overview How to administer cells to a subject, for example, for adoptive cell therapy, for example, in the treatment of cancer and other diseases, conditions, or disorders, and cells, compositions, and products for use in such methods. Is provided. Cells generally express one or more recombinant receptors, such as chimeric antigen receptors (CARs), other antigen receptors, and / or other chimeric receptors. In some embodiments, the method increases the subject's exposure to the administered cells, eg, by improving the growth and / or persistence of the administered cells, refractory or recurrent subjects, and. / Or provides the ability to treat a subject exhibiting loss, downregulation, or modification of the targeted antigen or epitope thereof. In some embodiments, the method reduces the risk of toxicity or other unwanted events as compared to other methods of cell therapy.

いくつかの態様において、第1の（または先の）受容体、例えば第1の（または先の）CARまたはTCRを発現する細胞の投与または用量を以前に受けたことのある対象へ、第2の（または後の）受容体、例えば第2の（または後の）キメラ抗原受容体（CAR）またはトランスジェニックTCRを発現する細胞を投与することによって実施される処置方法が、提供される。第2のまたは後の受容体は、一般に、第1のまたは先の受容体とは異なるものである。いくつかの態様において、方法は、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の前に、第1のまたは先の受容体を発現する細胞を投与する工程をさらに含む。例えば、いくつかの態様において、方法は、（a）第1のまたは先の受容体（例えば、第1のまたは先のCAR）を発現する細胞を対象へ投与する工程、および（b）第1のまたは先の受容体、例えば、CARを発現する細胞を対象へ投与する工程；および（b）第2のまたは後の受容体、例えば、CARを発現する細胞を対象へ投与する工程によって実施される。 In some embodiments, a second to a subject who has previously received administration or dose of cells expressing the first (or earlier) receptor, eg, the first (or earlier) CAR or TCR. Treatment methods performed by administering cells expressing a (or later) receptor, eg, a second (or later) chimeric antigen receptor (CAR) or transgenic TCR, are provided. The second or subsequent receptor is generally different from the first or earlier receptor. In some embodiments, the method further comprises administering the cells expressing the first or earlier receptor prior to the administration of the cells expressing the second or subsequent receptor. For example, in some embodiments, the method is (a) administering to a subject cells expressing a first or earlier receptor (eg, first or earlier CAR), and (b) first. Or earlier receptors, eg, cells expressing CAR; and (b) a second or subsequent receptor, eg, cells expressing CAR, are administered to the subject. To.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体、例えば、CARを発現する細胞は、第1のまたは先の受容体、例えば、CARを発現しない。いくつかの態様において、第1の（または先の）受容体および/または第2の（または後の）受容体は、CARまたはトランスジェニックTCRのような抗原受容体である。いくつかのそのような態様において、第1のまたは先の受容体、例えば、CARは、対象における疾患または状態または障害に関連した抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体、例えば、CARは、第1のまたは先の受容体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体、例えば、CAR、および第2のまたは後の受容体、例えば、CARは、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体が、前記抗原との結合について、第2のまたは後の受容体と競合するか、またはその逆である。いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体および第2のまたは後の受容体は、別のエピトープまたは抗原の部分に特異的に結合する。 In some embodiments, cells expressing the second or subsequent receptor, eg, CAR, do not express the first or earlier receptor, eg, CAR. In some embodiments, the first (or earlier) and / or second (or later) receptors are antigen receptors such as CAR or transgenic TCR. In some such embodiments, the first or earlier receptor, eg, CAR, specifically binds to an antigen associated with the disease or condition or disorder in the subject. In some embodiments, the second or subsequent receptor, eg, CAR, specifically binds to the antigen to which the first or earlier receptor specifically binds. In some embodiments, the first or earlier receptor, eg CAR, and the second or subsequent receptor, eg CAR, specifically bind to the same epitope of the antigen. In some embodiments, the first or earlier receptor competes with the second or later receptor for binding to said antigen, or vice versa. In some embodiments, the first or earlier receptor and the second or subsequent receptor specifically bind to a portion of another epitope or antigen.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体は、対象における疾患または状態または障害に関連した別の抗原に特異的に結合する。例えば、いくつかの態様において、第1の受容体が認識するかまたは結合する抗原は、CD19であり、第2のまたは後の受容体が特異的に結合するかまたは認識する抗原は、CD22またはCD20のような、CD19とは異なる、B細胞に特異的なもしくはB細胞に関連した抗原（またはB細胞疾患、例えば、B細胞悪性腫瘍に関連したもしくは特異的な抗原）である。 In some embodiments, the second or subsequent receptor specifically binds to another antigen associated with the disease or condition or disorder in the subject. For example, in some embodiments, the antigen recognized or bound by the first receptor is CD19 and the antigen specifically bound or recognized by the second or later receptor is CD22 or Different from CD19, such as CD20, B cell-specific or B cell-related antigens (or B cell disease, eg, B cell malignant tumor-related or specific antigens).

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体、例えば、CARは、第1のまたは先の受容体、例えば、CARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない。いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞は、第1のまたは先の受容体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する受容体を含まない。 In some embodiments, the second or subsequent receptor, eg CAR, does not specifically bind to the first or earlier receptor, eg, the antigen to which CAR specifically binds. In some embodiments, the cell expressing the second or subsequent receptor does not include a receptor that specifically binds to the antigen to which the first or earlier receptor specifically binds.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の時点で、その前に、かつ/またはその直前に、対象は、第1のまたは先の受容体に対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答を示す。いくつかの態様において、対象は、（b）における投与のような、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内に、第2のまたは後の受容体、例えば、CARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を示さない。 In some embodiments, at the time of administration of cells expressing the second or subsequent receptor, prior to and / or immediately before, the subject is specific for the first or earlier receptor. Shows a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is targeted. In some embodiments, the subject receives, within about 30 days, within about 60 days, or within about 90 days of administration of the cells expressing the second or subsequent receptor, such as the administration in (b). It does not show a detectable humoral or cell-mediated immune response to a second or subsequent receptor, such as CAR.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の時点で、その前に、かつ/またはその直前に、疾患もしくは状態が対象において持続しており；かつ/または疾患もしくは状態が対象において再発している。 In some embodiments, the disease or condition persists in the subject at the time of administration of the cells expressing the second or subsequent receptor, prior to and / or shortly before; and / or the disease. Or the condition has recurred in the subject.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の時点で、その前に、かつ/またはその直前に、対象は、第1のまたは先の受容体が特異的に結合する抗原のダウンレギュレーション、喪失、または修飾を示す。 In some embodiments, at the time of administration of cells expressing the second or subsequent receptor, prior to and / or immediately before, the subject is specifically directed to the first or earlier receptor. Shows downregulation, loss, or modification of the binding antigen.

いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体を発現する細胞の投与と第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与との間の時間は、少なくとも約28日間；少なくとも約35日間；少なくとも約42日間；少なくとも約49日間；または少なくとも約60日間である。いくつかの態様において、その時間は、少なくとも約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間、約21日間、約22日間、約23日間、約24日間、約25日間、約26日間、または約27日間、例えば、少なくとも14日間または少なくとも21日間である。 In some embodiments, the time between administration of cells expressing the first or earlier receptor and administration of cells expressing the second or subsequent receptor is at least about 28 days; at least about 35. Days; at least about 42 days; at least about 49 days; or at least about 60 days. In some embodiments, the time is at least about 14 days, about 15 days, about 16 days, about 17 days, about 18 days, about 19 days, about 20 days, about 21 days, about 22 days, about 23 days. , About 24 days, about 25 days, about 26 days, or about 27 days, eg, at least 14 days or at least 21 days.

いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体、例えば、CARは、第2のまたは後の受容体、例えば、CARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む。いくつかの態様において、少なくとも1種の免疫反応性エピトープには、少なくとも1種のB細胞エピトープもしくは体液性免疫系によって認識されるエピトープが含まれ；かつ/または少なくとも1種のT細胞エピトープもしくは細胞性応答によって認識されるエピトープ、例えば、細胞傷害性T細胞および/もしくはヘルパーT細胞によって認識されるものが含まれる。 In some embodiments, the first or earlier receptor, eg CAR, comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second or subsequent receptor, eg CAR. In some embodiments, the at least one immunoreactive epitope includes at least one B cell epitope or epitope recognized by the humoral immune system; and / or at least one T cell epitope or cell. It includes epitopes recognized by a sexual response, such as those recognized by cytotoxic T cells and / or helper T cells.

いくつかの態様において、対象は、（a）における投与の前に、第1のまたは先の受容体を発現する細胞の用量を受けたことがなく；かつ/または（b）における投与の前に、または方法の開始の前に、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の用量を受けたことがない In some embodiments, the subject has never received a dose of cells expressing the first or earlier receptor prior to administration in (a); and / or prior to administration in (b). , Or have never received a dose of cells expressing the second or subsequent receptor prior to the start of the method

いくつかの態様において、疾患または状態は腫瘍である。いくつかの態様において、それは、感染性疾患であるかまたはそれに関連している。いくつかの態様において、それは、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害であるかまたはそれに関連している。 In some embodiments, the disease or condition is a tumor. In some embodiments, it is or is associated with an infectious disease. In some embodiments, it is or is associated with an autoimmune disease or autoimmune disorder.

第2のまたは後の受容体、例えば、第2のまたは後のCARは、一般に、第1のまたは先の受容体、例えば、第1のまたは先のCARと比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の違いには、（a）における投与または第1のもしくは先の受容体、例えば、CARを発現する細胞の先の投与の後に、対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のまたは先の受容体、例えば、CARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いが含まれる。いくつかの態様において、そのような1つまたは複数の違いには、（a）における投与または先の投与の後に、対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のまたは先の受容体の各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いが含まれる。いくつかの態様において、そのような免疫応答は、方法に関連して検出される。 The second or subsequent receptor, eg, the second or subsequent CAR, is generally one of the amino acid sequences compared to the first or earlier receptor, eg, the first or earlier CAR. Or include multiple differences. In some embodiments, the difference in one or more is the immunity detectable in the subject after administration in (a) or prior administration of a first or earlier receptor, eg, cells expressing CAR. Includes at least one amino acid sequence difference compared to the first or previous receptor that gives rise to the response, eg, the region of CAR. In some embodiments, such one or more differences are in each of the first or previous receptors that give rise to a detectable immune response in the subject after the administration or previous administration in (a). Includes at least one amino acid sequence difference compared to the region. In some embodiments, such an immune response is detected in relation to the method.

いくつかの態様において、方法は、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の前に、または（b）における投与の前に、対象における受容体特異的な、例えば、CAR特異的な免疫応答の存在を検出する工程をさらに含む。いくつかの態様において、検出は、対象が特異的な抗体免疫応答または細胞性免疫応答のような特異的な免疫応答を示す、第1のまたは先の受容体、例えば、CARの少なくとも1個の領域の同定を含む。 In some embodiments, the method is receptor-specific, eg, CAR-specific, in a subject prior to administration of cells expressing a second or subsequent receptor, or prior to administration in (b). It further comprises the step of detecting the presence of an immune response. In some embodiments, the detection is at least one of the first or previous receptors, eg, CAR, where the subject exhibits a specific immune response, such as a specific antibody or cell-mediated immune response. Includes region identification.

いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体、例えば、CARは、対象における検出可能な免疫応答のような対象における免疫応答が特異的である第1のまたは先の受容体、例えば、CARの領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している。いくつかのそのような態様において、第1のまたは先の受容体のそのような領域は、2個の内在性配列またはドメインの間のジャンクションであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、それは、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個または複数個のCAR部分の中の領域であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、それは、scFv部分の中のフレームワーク領域（FR）、重鎖FR配列、重鎖CDR配列、軽鎖FR配列、および/もしくは軽鎖CDR配列であるかまたはそれを含む。 In some embodiments, the second or subsequent receptor, eg, CAR, is a first or earlier receptor, eg, for which an immune response in the subject is specific, such as a detectable immune response in the subject. Contains differences in one or more amino acid sequences compared to the CAR region. In some such embodiments, such a region of the first or earlier receptor is or comprises a junction between two endogenous sequences or domains. In some embodiments, it is selected from the group consisting of a scFv moiety, a linker moiety, an amino acid sequence that is not endogenous to the subject, a sequence derived from a species different from the subject, and / or a junction between two CAR domains. Is or contains an area within one or more CAR parts. In some embodiments, it is or comprises framework regions (FRs), heavy chain FR sequences, heavy chain CDR sequences, light chain FR sequences, and / or light chain CDR sequences within the scFv moiety.

いくつかの態様において、後のまたは第2の受容体、例えば、CARは、第1のまたは先の受容体、例えば、CARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む。いくつかの態様において、第1のまたは先の受容体、例えば、CARのそのような対応する領域は、例えば、第2の受容体を発現する細胞の投与の前にまたはその時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である。いくつかの態様において、それは、内在性配列であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、それは、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/もしくは宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域であるかまたはそれを含む。 In some embodiments, the later or second receptor, eg, CAR, comprises at least one region that has the same amino acid sequence as the corresponding region of CAR, eg, the first or earlier receptor. .. In some embodiments, the first or previous receptor, eg, such a corresponding region of CAR, is detectable, eg, before or at the time of administration of cells expressing the second receptor. Areas where the subject does not exhibit a humoral or cell-mediated immune response. In some embodiments, it is or comprises an endogenous sequence. In some embodiments, it consists of a group consisting of a co-stimulation domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. It is or contains an area within the selected CAR part.

いくつかの態様において、方法は、他の方法と比較して、細胞への対象の曝露の増加または増強をもたらす。いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与の後のCAR発現細胞の最大数、経時的なCAR発現細胞の曲線下面積（AUC）、および/または対象における検出可能なCAR発現細胞の持続時間は、第1のまたは先の受容体を発現する細胞の投与、例えば、（a）における投与、および後のまたは第2の受容体を発現する細胞の提供された方法における投与、例えば、（b）における投与と同じ時点でかつ/または同一の条件の下で実施される、第1のまたは先の受容体を発現する細胞の第2のまたは後の投与を含む代替投薬計画を使用した方法を介して達成されるものと比較して、より大きい。 In some embodiments, the method results in increased or enhanced exposure of the subject to cells as compared to other methods. In some embodiments, the maximum number of CAR-expressing cells after administration of cells expressing the second or subsequent receptor, the area under the curve (AUC) of CAR-expressing cells over time, and / or detection in the subject. Possible durations of CAR-expressing cells were provided for administration of cells expressing the first or earlier receptor, eg, administration in (a), and cells expressing the later or second receptor. Administration in the method, eg, includes a second or subsequent administration of cells expressing the first or earlier receptor, performed at the same time and / or under the same conditions as the administration in (b). Greater than what is achieved through methods using alternative dosing regimens.

いくつかの態様において、方法は、1マイクロリットル当たり少なくとも10個または少なくとも約10個の受容体発現（例えば、CAR発現）細胞、末梢血単核細胞（PBMC）の総数の少なくとも50％、少なくとも約1×10⁵個のCAR発現細胞、またはDNA 1マイクログラム当たり少なくとも1,000コピー、2,000コピー、3,000コピー、4,000コピー、もしくは5,000コピーのCARコードDNAの、対象の血液の中の受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞の最大濃度または最大数をもたらす。いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与、例えば、（b）における投与の開始の後、30日目、60日目、または90日目に、受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞が、対象の血液または血清の中で検出可能であり；かつ/または対象の血液は、少なくとも20％の受容体発現（例えば、CAR発現）細胞、1マイクロリットル当たり少なくとも10個の受容体発現（例えば、CAR発現）細胞、または少なくとも1×10⁴個の受容体発現（例えば、CAR発現）細胞を含有している。 In some embodiments, the method comprises at least 10% or at least about 10 receptor-expressing (eg, CAR-expressing) cells per microliter, at least 50% of the total number of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), at least about. Receptor-expressing cells in the blood of interest, eg, 1 x 10 ⁵ CAR-expressing cells, or at least 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, or 5,000 copies of CAR-encoding DNA per microgram of DNA. , Brings the maximum concentration or number of CAR-expressing cells. In some embodiments, administration of cells expressing the second or subsequent receptor, eg, receptor expression on day 30, 60, or 90 after initiation of administration in (b). Cells, such as CAR-expressing cells, are detectable in subject blood or serum; and / or subject blood is at least 20% receptor-expressing (eg, CAR-expressing) cells, at least per microliter. It contains 10 receptor-expressing (eg, CAR-expressing) cells, or at least 1 × 10 ⁴ receptor-expressing (eg, CAR-expressing) cells.

いくつかの態様において、上記の態様のいずれかは、複数の後の投与を含んでいてもよい。例えば、いくつかの態様において、方法は、さらなる後の受容体を各々発現する細胞の複数の投与（例えば、第1のまたは先の受容体と何らかの方式で各々別のものである、第3、第4、第5、第6等の受容体を発現する細胞の投与）を含む反復的な様式で実施される。
[本発明1001]
（a）対象における疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合する第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を該対象へ投与する工程、および
（b）第1のCARとは異なる第2のCARを発現しかつ第1のCARを発現しない細胞を該対象へ投与する工程
を含む、処置方法。
[本発明1002]
第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現せずかつ第2のCARを発現する細胞を対象へ投与する工程を含む処置方法であって、
該対象が、第1のCARを発現する細胞の投与を以前に受けたことがあり；
第1のCARが、該対象における疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原または該対象における疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、方法。
[本発明1003]
第2のCARを発現する細胞を投与する前に、第1のCARを発現する細胞を対象へ投与する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第2のCARを発現する細胞の投与の時点でまたはその直前に、
対象が、第1のCARに対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を示しており；
疾患もしくは状態が、該対象において持続しており；かつ/または
疾患もしくは状態が、該対象において再発している、
本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
第1のCARを発現する細胞の投与と第2のCARを発現する細胞の投与との間の時間が、少なくとも約28日間、少なくとも約35日間、少なくとも約42日間、少なくとも約49日間、および/または少なくとも約60日間である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
第1のCARが、第2のCARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のB細胞エピトープを含み；かつ/または
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、
本発明1006の方法。
[本発明1008]
対象が、（a）における投与の前に、第1のCARを発現する細胞の用量を受けたことがなく；かつ/または
該対象が、（b）における投与の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、
本発明1001および1004～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
対象が、前記投与の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、本発明1002～1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
第2のCARが、第1のCARと同じ抗原に特異的に結合する、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
疾患または状態が腫瘍である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
疾患または状態がB細胞悪性腫瘍である、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する、本発明1010の方法。
[本発明1014]
第1のCARが、前記抗原との結合について第2のCARと競合する、本発明1010～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、本発明1010～1012および1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
第2のCARが、前記疾患もしくは状態に関連した、第1のCARが結合する抗原とは別の抗原に特異的に結合するか；または
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない、
本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
第1のCARが、CD19、CD22、またはCD20より選択される、B細胞悪性腫瘍に関連した抗原に特異的に結合し、かつ第2のCARが、第1のCARが結合する抗原とは異なる、CD19、CD22、またはCD20のうちの別の抗原に結合する、本発明1012～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
第1のCARがCD19に特異的に結合し、かつ第2のCARがCD22に特異的に結合する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
第2のCARを発現する細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1020]
対象が、第2のCARを発現する細胞の投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を示さない、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
第2のCARが、第1のCARと比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含み；かつ/または
該1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
本発明1021の方法。
[本発明1023]
第2のCARを発現する細胞の投与の前に、対象におけるCAR特異的な免疫応答の存在を検出する工程をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
検出が、対象が特異的な免疫応答を示す第1のCARの少なくとも1個の領域の同定を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
第2のCARが、免疫応答が特異的である第1のCARの前記領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している、本発明1024の方法。
[本発明1026]
第1のCARの領域が、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個もしくは複数個のCAR部分の中の領域を含み、かつ/または第1のCARの該領域が、2個のドメインの間のジャンクションの各側のアミノ酸を含むジャンクション領域である、本発明1022～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記領域がscFv部分の中のフレームワーク領域（FR）を含み、
該領域が重鎖FR配列を含み、
該領域が重鎖CDR配列を含み、
該領域が軽鎖FR配列を含み、かつ/または
該領域が軽鎖CDR配列を含む、
本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記領域がジャンクション領域を含み、ジャンクション領域が、第1のCARの第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の最大15個の連続アミノ酸、および/または該ジャンクションのすぐN末端側の最大15個の連続アミノ酸を含み、任意で、該ジャンクションをさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1029]
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメインもしくはその機能性部分に対して100％の同一性を有するドメインを含み、該天然もしくは内在性のヒトタンパク質が、任意で、処置される対象によって発現され；かつ/あるいは
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、任意で、共刺激シグナル伝達ドメインまたは活性化細胞質シグナル伝達ドメインである、
本発明1028の方法。
[本発明1030]
第1のドメインおよび第2のドメインが、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しないか、または単一の天然もしくは内在性のヒトタンパク質もしくはヒトポリペプチドに存在しない、本発明1029の方法。
[本発明1031]
第1のドメインおよび第2のドメインがそれぞれ、細胞外リガンド結合ドメインおよびヒンジドメイン、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかまたはそれらを含み、これらはそのようなドメインの機能性部分を含んでいてもよい、本発明1029または本発明1030の方法。
[本発明1032]
第1のドメインが膜貫通ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含み、かつ第2のドメインが共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含む、本発明1029～1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分であり、かつ共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインまたはその機能性部分である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
第2のCARが、
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび/もしくは第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；
第1のドメインと配列が同一であるドメインおよび第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；または
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび第2のドメインと配列が同一であるドメイン
を含み、
第2のCARに存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含む部分において、第1のCARの第1のドメインおよび第2のドメインの一方または両方と比較して、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含む、本発明1029～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
第1のCARが、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:5と少なくとも95％同一であるアミノ酸の配列を含むそのバリアントもしくは機能性部分を共に含む、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、かつジャンクション領域を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARと比較して修飾された配列を含み、修飾が、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42または15～40の配列を含む部分における少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、本発明1032～1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
第2のCARが、第1のCARと比較して20以下のアミノ酸配列の違いを含むか、または第2のCARが、第1のCARに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を含む、本発明1021～1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
1つまたは複数の配列の違いのうちの少なくとも1つを含有している第2のCARの領域が、
1000nM未満のIC50のヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性を有する第1のCARの対応する領域と比較して、より少ない8～15アミノ酸部分を含有しているか；または
参照キメラ受容体のジャンクション領域の対応する部分の配列を有するペプチド断片の同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低いHLA分子に対する結合親和性を有するか；または
第1のCARの対応する領域と比較して、ヒト白血球抗原（HLA）分子に対する、該領域の中の少なくとも1個のペプチド断片の結合親和性、もしくは該領域の中の8～15アミノ酸部分の配列を有する全てのペプチド断片の低下した平均結合親和性を有する、
本発明1021～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
対象への投与の後に対象において第1のCARの中の領域に対して生じる免疫応答と比較して、低下した検出可能な免疫応答が、第2のCARを発現する細胞の投与の後に、対象において少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む第2のCARの対応する領域に対して生じる、本発明1021～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
第1のCARが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分および4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARのそのようなドメインの一方または両方とは異なる膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1040]
第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む、本発明1001～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
第1のCARの対応する領域が、第2のCARを発現する細胞の投与の時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
第1のCARの対応する領域が、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/または宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域を含む、本発明1040または本発明1041の方法。
[本発明1043]
第2のCARを発現する細胞の投与の後のCAR発現細胞の最大数、経時的なCAR発現細胞の曲線下面積（AUC）、および/または対象における検出可能なCAR発現細胞の持続時間が、第1のCARを発現する細胞の投与を実施し、続いて第1のCARを発現する細胞の第2の投与を実施することを含む代替投薬計画を含む方法を介して達成されたものと比較して、より大きく、かつ該第2の投与が、第2のCARを発現する細胞の投与と同時に実施される、本発明1001～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記方法が、1マイクロリットル当たり少なくとも約10個もしくは少なくとも10個のCAR発現細胞、末梢血単核細胞（PBMC）の総数の少なくとも50％、少なくとも約1×10 ⁵ 個のCAR発現細胞、もしくはDNA 1マイクログラム当たり少なくとも1,000コピーもしくは少なくとも2,000コピーもしくは少なくとも3,000コピーもしくは少なくとも4,000コピーもしくは少なくとも5,000コピーのCARコードDNAの、対象の血液の中のCAR発現細胞の最大濃度もしくは最大数をもたらし；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、CAR発現細胞が、対象の血液もしくは血清の中で検出可能であり；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、対象の血液が、少なくとも20％のCAR発現細胞、1マイクロリットル当たり少なくとも10個のCAR発現細胞、もしくは少なくとも1×10 ⁴ 個のCAR発現細胞を含有している、
本発明1001～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
第1のCARを発現する細胞の用量および/または第2のCARを発現する細胞の用量が、独立に、対象における疾患または状態の負荷の低減のために十分な量の細胞を含む、本発明1001～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
第1のCARを発現する細胞の投与および/または第2のCARを発現する細胞の投与が、対象における疾患または状態の負荷の低減を達成し、それによって、疾患または状態を処置する、本発明1001～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
細胞がT細胞である、本発明1001～1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
T細胞が対象に対して自己である、本発明1001～1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置のための医薬の製造のための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を含む組成物の使用であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する該抗原、または該疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、使用。
[本発明1050]
第1のキメラ受容体（CAR）によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置において使用するための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を含む組成物であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する該抗原、または該疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、組成物。
[本発明1051]
前記使用が、第1のCARに対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を示す対象におけるものであり；
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現する細胞の投与の後に該対象において持続しており；かつ/または
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現する細胞の投与の後に該対象において再発している、
本発明1049の使用または本発明1050の組成物。
[本発明1052]
前記組成物が、第1のCARを発現する細胞の投与の少なくとも約28日後、少なくとも約35日後、少なくとも約42日後、少なくとも約49日後、および/または少なくとも約60日後に使用するためのものである、本発明1049～1051のいずれかの使用または組成物。
[本発明1053]
第1のCARが、第2のCARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む、本発明1049～1052のいずれかの使用または組成物。
[本発明1054]
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のB細胞エピトープを含み；かつ/または
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、
本発明1053の使用または組成物。
[本発明1055]
対象が、前記使用の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、本発明1049～1054のいずれかの使用または組成物。
[本発明1056]
第2のCARが、第1のCARと同じ抗原に特異的に結合する、本発明1049～1055のいずれかの使用または組成物。
[本発明1057]
疾患または状態が腫瘍である、本発明1049～1056のいずれかの使用または組成物。
[本発明1058]
疾患または状態がB細胞悪性腫瘍である、本発明1049～1057のいずれかの使用または組成物。
[本発明1059]
第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する、本発明1056～1058のいずれかの使用または組成物。
[本発明1060]
第1のCARが、前記抗原との結合について第2のCARと競合する、本発明1056～1059のいずれかの使用または組成物。
[本発明1061]
第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、本発明1056～1058および1060のいずれかの使用または組成物。
[本発明1062]
第2のCARが、前記疾患もしくは状態に関連した、第1のCARが結合する抗原とは別の抗原に特異的に結合するか；または
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない、
本発明1049～1055のいずれかの使用または組成物。
[本発明1063]
第1のCARが、CD19、CD22、またはCD20より選択される、B細胞悪性腫瘍に関連した抗原に特異的に結合し、かつ第2のCARが、第1のCARが結合する抗原とは異なる、CD19、CD22、またはCD20のうちの別の抗原に結合する、本発明1058～1062のいずれかの使用または組成物。
[本発明1064]
第1のCARがCD19に特異的に結合し、かつ第2のCARがCD22に特異的に結合する、本発明1063の使用または組成物。
[本発明1065]
第2のCARを発現する細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、本発明1049～1055のいずれかの使用または組成物。
[本発明1066]
第2のCARの使用が、対象への投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答をもたらさない、本発明1049～1065のいずれかの使用または組成物。
[本発明1067]
第2のCARが、第1のCARと比較してアミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む、本発明1049～1066のいずれかの使用または組成物。
[本発明1068]
1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含み；かつ/または
該1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
本発明1067の使用または組成物。
[本発明1069]
対象が、第1のCARに対するCAR特異的な免疫応答が該対象において検出されている対象である、本発明1049～1068のいずれかの使用または組成物。
[本発明1070]
検出が、対象が特異的な免疫応答を示す第1のCARの少なくとも1個の領域の同定を含む、本発明1069の使用または組成物。
[本発明1071]
第2のCARが、免疫応答が特異的である第1のCARの前記領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している、本発明1070の使用または組成物。
[本発明1072]
第1のCARの領域が、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個もしくは複数個のCAR部分の中の領域を含み、かつ/または第1のCARの該領域が、2個のドメインの間のジャンクションの各側のアミノ酸を含むジャンクション領域である、本発明1068～1071のいずれかの使用または組成物。
[本発明1073]
前記領域がscFv部分の中のフレームワーク領域（FR）を含み、
該領域が重鎖FR配列を含み、
該領域が重鎖CDR配列を含み、
該領域が軽鎖FR配列を含み、かつ/または
該領域が軽鎖CDR配列を含む、
本発明1072の使用または組成物。
[本発明1074]
前記領域がジャンクション領域を含み、ジャンクション領域が、第1のCARの第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の最大15個の連続アミノ酸、および/または該ジャンクションのすぐN末端側の最大15個の連続アミノ酸を含み、任意で、該ジャンクションをさらに含む、本発明1072の使用または組成物。
[本発明1075]
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメインもしくはその機能性部分に対して100％の同一性を有するドメインを含み、該天然または内在性のヒトタンパク質が、任意で、処置される対象によって発現され；かつ/あるいは
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、任意で、共刺激シグナル伝達ドメインもしくは活性化細胞質シグナル伝達ドメインである、
本発明1074の使用または組成物。
[本発明1076]
第1のドメインおよび第2のドメインが、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しないか、または単一の天然もしくは内在性のヒトタンパク質もしくはヒトポリペプチドに存在しない、本発明1074または本発明1075の使用または組成物。
[本発明1077]
第1のドメインおよび第2のドメインがそれぞれ、細胞外リガンド結合ドメインおよびヒンジドメイン、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかまたはそれらを含み、これらはそのようなドメインの機能性部分を含んでいてもよい、本発明1074～1076のいずれかの使用または組成物。
[本発明1078]
第1のドメインが、膜貫通ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含み、かつ第2のドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含む、本発明1074～1077のいずれかの使用または組成物。
[本発明1079]
膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分であり、かつ共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメインまたはその機能性部分である、本発明1078の使用または組成物。
[本発明1080]
第2のCARが、
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび/もしくは第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；
第1のドメインと配列が同一であるドメインおよび第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；または
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび第2のドメインと配列が同一であるドメイン
を含み、
第2のCARに存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含む部分において、第1のCARの第1のドメインおよび第2のドメインの一方または両方と比較して、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含む、
本発明1074～1079のいずれかの使用または組成物。
[本発明1081]
第1のCARが、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:5と少なくとも95％同一であるアミノ酸の配列を含むそのバリアントもしくは機能性部分を共に含む、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、かつジャンクション領域を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARと比較して修飾された配列を含み、修飾が、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42または15～40の配列を含む部分における少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
本発明1078～1080のいずれかの使用または組成物。
[本発明1082]
第2のCARが、第1のCARと比較して20以下のアミノ酸配列の違いを含むか、または第2のCARが、第1のCARに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を含む、本発明1067～1081のいずれかの使用または組成物。
[本発明1083]
1つまたは複数の配列の違いのうちの少なくとも1つを含有している第2のCARの領域が、
1000nM未満のIC50のヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性を有する第1のCARの対応する領域と比較して、より少ない8～15アミノ酸部分を含有しているか；または
参照キメラ受容体のジャンクション領域の対応する部分の配列を有するペプチド断片の同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低いHLA分子に対する結合親和性を有するか；または
第1のCARの対応する領域と比較して、ヒト白血球抗原（HLA）分子に対する、該領域の中の少なくとも1個のペプチド断片の結合親和性、もしくは該領域の中の8～15アミノ酸部分の配列を有する全てのペプチド断片の低下した平均結合親和性を有する、本発明1067～1082のいずれかの使用または組成物。
[本発明1084]
第2のCARの使用が、対象への投与の後に対象において第1のCARの領域に対して生じる免疫応答と比較して、対象において少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む第2のCARの対応する領域に対して生じる検出可能な免疫応答の低下をもたらす、本発明1067～1083のいずれかの使用または組成物。
[本発明1085]
第1のCARが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分および4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARのそのようなドメインの一方または両方とは異なる膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
本発明1049～1070のいずれかの使用または組成物。
[本発明1086]
第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む、本発明1049～1085のいずれかの使用または組成物。
[本発明1087]
第1のCARの対応する領域が、第2のCARを発現する細胞の投与の時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である、本発明1086の使用または組成物。
[本発明1088]
第1のCARの対応する領域が、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/または宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域を含む、本発明1086または本発明1087の使用または組成物。
In some embodiments, any of the above embodiments may comprise a plurality of subsequent doses. For example, in some embodiments, the method is a plurality of administrations of cells each expressing a further subsequent receptor (eg, different from the first or earlier receptor in some way, third, respectively. It is carried out in a repetitive manner including administration of cells expressing the 4th, 5th, 6th, etc. receptors).
[Invention 1001]
(A) A step of administering to a subject a cell expressing a first chimeric antigen receptor (CAR) that specifically binds to a disease or condition-related antigen in the subject, and.
(B) A step of administering to the subject cells expressing a second CAR different from the first CAR and not expressing the first CAR.
Treatment methods, including.
[Invention 1002]
A treatment method comprising the step of administering to a subject cells that do not express the first chimeric antigen receptor (CAR) and that express the second CAR.
The subject has previously received administration of cells expressing the first CAR;
The first CAR specifically binds to the disease or condition-related antigen in the subject; and
A method in which the second CAR specifically binds to an antigen to which the first CAR specifically binds or another antigen associated with the disease or condition in the subject.
[Invention 1003]
The method of the present invention 1002, wherein the cells expressing the first CAR are administered to the subject before the cells expressing the second CAR are administered.
[Invention 1004]
At or just before administration of cells expressing the second CAR
The subject exhibits a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is specific for the first CAR;
The disease or condition persists in the subject; and / or
The disease or condition has recurred in the subject,
Any method of the present invention 1001 to 1003.
[Invention 1005]
The time between administration of cells expressing the first CAR and administration of cells expressing the second CAR is at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and /. Or the method of any of 1001-1004 of the present invention, which is at least about 60 days.
[Invention 1006]
The method of any of 1001-1005 of the present invention, wherein the first CAR comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second CAR.
[Invention 1007]
At least one immunoreactive epitope contains at least one B cell epitope; and / or
At least one immunoreactive epitope contains at least one T cell epitope,
The method of the present invention 1006.
[Invention 1008]
The subject had never received a dose of cells expressing the first CAR prior to administration in (a); and / or
The subject has never received a dose of cells expressing a second CAR prior to administration in (b).
The method of the present invention 1001 and 1004 to 1007.
[Invention 1009]
The method of any of 1002-1007 of the present invention, wherein the subject has never received a dose of cells expressing a second CAR prior to said administration.
[Invention 1010]
The method of any of 1001 to 1009 of the present invention, wherein the second CAR specifically binds to the same antigen as the first CAR.
[Invention 1011]
The method of any of 1001-1010 of the present invention, wherein the disease or condition is a tumor.
[Invention 1012]
The method of any of 1001-1011 of the present invention, wherein the disease or condition is a B-cell malignant tumor.
[Invention 1013]
The method of the present invention 1010, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to the same epitope of the antigen.
[Invention 1014]
The method of any of 1010-1013 of the present invention, wherein the first CAR competes with the second CAR for binding to said antigen.
[Invention 1015]
The method of any of 1010-1012 and 1014 of the present invention, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to different epitopes of the antigen.
[Invention 1016]
Does the second CAR specifically bind to an antigen other than the antigen to which the first CAR binds, which is associated with the disease or condition;
The second CAR does not specifically bind to the antigen to which the first CAR specifically binds,
Any method of the present invention 1001 to 1015.
[Invention 1017]
The first CAR specifically binds to an antigen associated with a B cell malignancies selected from CD19, CD22, or CD20, and the second CAR is different from the antigen to which the first CAR binds. , CD19, CD22, or any of the methods 1012-1016 of the present invention, which bind to another antigen of CD20.
[Invention 1018]
The method of the present invention 1017, wherein the first CAR specifically binds to CD19 and the second CAR specifically binds to CD22.
[Invention 1019]
The method of any of 1001 to 1008 of the present invention, wherein the cell expressing the second CAR does not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds.
[Invention 1020]
Subjects show a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration of cells expressing the second CAR. No, any method of the present invention 1001-1019.
[Invention 1021]
The method of any of 1001-1020 of the present invention, wherein the second CAR comprises one or more differences in amino acid sequences as compared to the first CAR.
[Invention 1022]
Differences in one or more include at least one amino acid sequence difference compared to the region of the first CAR that gives rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR; And / or
The difference in one or more amino acid sequences compared to each region of the first CAR that gives rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. include,
The method of 1021 of the present invention.
[Invention 1023]
The method of any of 1001 to 1022 of the present invention, further comprising the step of detecting the presence of a CAR-specific immune response in a subject prior to administration of cells expressing a second CAR.
[Invention 1024]
The method of the invention 1023, wherein detection comprises identifying at least one region of a first CAR in which the subject exhibits a specific immune response.
[Invention 1025]
The method of 1024 of the present invention, wherein the second CAR contains a difference in one or more amino acid sequences as compared to said region of the first CAR in which the immune response is specific.
[Invention 1026]
The region of the first CAR is selected from the group consisting of the scFv part, the linker part, the amino acid sequence that is not endogenous to the subject, the sequence derived from a species different from the subject, and / or the junction between the two CAR domains. The present invention comprises a region within one or more CAR moieties and / or that region of the first CAR is a junction region containing amino acids on each side of the junction between the two domains. Any method from 1022 to 1025.
[Invention 1027]
The region contains the framework region (FR) within the scFv portion.
The region contains a heavy chain FR sequence
The region contains a heavy chain CDR sequence and contains
The region comprises a light chain FR sequence and / or
The region comprises a light chain CDR sequence,
The method of the present invention 1026.
[Invention 1028]
The region comprises a junction region, where the junction region is a maximum of 15 contiguous amino acids on the immediate C-terminal side of the junction that joins the first and second domains of the first CAR, and / or of the junction. The method of the invention 1026 comprising up to 15 contiguous amino acids immediately N-terminal and optionally further including the junction.
[Invention 1029]
A domain in which the first domain and / or the second domain have 100% identity to the domain of a natural or endogenous human protein, or the domain of a natural or endogenous human protein or its functional portion. Containing, said natural or endogenous human protein is optionally expressed by the subject being treated; and / or
The first domain and / or the second domain comprises an extracellular binding domain, a hinge domain, a transmembrane domain, or an intracellular signaling domain, and the intracellular signaling domain is optionally a costimulatory signaling domain or An activated cytoplasmic signaling domain,
The method of the present invention 1028.
[Invention 1030]
The method of the invention 1029, wherein the first and second domains are not present in the same molecule in vivo in a human subject, or in a single natural or endogenous human protein or polypeptide.
[Invention 1031]
The first domain and the second domain are the extracellular ligand binding domain and the hinge domain, the hinge domain and the transmembrane domain, the transmembrane domain and the intracellular co-stimulation signaling domain, and the intracellular co-stimulation signaling domain and The method of the invention 1029 or the invention 1030, which is an activated cytoplasmic signaling domain or comprises them, which may comprise a functional portion of such a domain.
[Invention 1032]
The invention 1029-1031, wherein the first domain is or comprises a transmembrane domain or a functional portion thereof, and the second domain is or comprises a co-stimulation signaling domain or a functional portion thereof. Either way.
[Invention 1033]
The method of the invention 1032, wherein the transmembrane domain is the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the co-stimulation signaling domain is the 4-1BB signaling domain or its functional portion.
[Invention 1034]
The second CAR is
Domains with at least 95% sequence identity to the first domain and / or domains with at least 95% sequence identity to the second domain;
Domains that are sequence-identical to the first domain and domains that have at least 95% sequence identity to the second domain; or
Domains that have at least 95% sequence identity to the first domain and domains that are sequence identical to the second domain
Including
At least one or both of the domains present in the second CAR are at least one compared to one or both of the first and second domains of the first CAR in the portion containing the modified junction region. The method of any of the present inventions 1029-1033, comprising differences in one or more amino acid sequences.
[Invention 1035]
The CD28 transmembrane domain, wherein the first CAR contains both a variant or functional portion containing the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5 or the sequence of amino acids that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 5. And 4-1BB include the co-stimulation domain and contains the junction region; and
The portion where the second CAR contains the modified sequence compared to the first CAR and the modification contains the sequence of residues 13-42 or 15-40 based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5. The method of any of 1032-1034 of the present invention comprising a difference in at least one amino acid sequence in.
[Invention 1036]
The second CAR contains 20 or less amino acid sequence differences compared to the first CAR, or the second CAR contains at least 95% amino acid sequence identity to the first CAR. The method of any of 1021 to 1035 of the present invention.
[Invention 1037]
The region of the second CAR that contains at least one of the differences in one or more sequences,
Does it contain less 8-15 amino acid moieties compared to the corresponding region of the first CAR, which has a binding affinity for IC50s <1000 nM for human leukocyte antigen (HLA) molecules;
Does the peptide fragment with the sequence of the corresponding portion of the junction region of the reference chimeric receptor have a binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule that is lower than the binding affinity for the HLA molecule;
The binding affinity of at least one peptide fragment in the region, or the 8-15 amino acid portion of the region, relative to the corresponding region of the first CAR to the human leukocyte antigen (HLA) molecule. Has a reduced average binding affinity for all peptide fragments having a sequence,
The method of any of 1021 to 1036 of the present invention.
[Invention 1038]
A reduced detectable immune response compared to the immune response that occurs in the subject to a region within the first CAR after administration to the subject, the subject after administration of cells expressing the second CAR The method of any of 1021-1037 of the present invention, which occurs for the corresponding region of a second CAR comprising a difference in at least one amino acid sequence in.
[Invention 1039]
The first CAR contains the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the 4-1BB co-stimulation signaling domain or its functional portion; and
The second CAR contains a transmembrane domain and a co-stimulation signaling domain that are different from one or both of such domains in the first CAR.
Any method of the present invention 1001 to 1020.
[Invention 1040]
The method of any of 1001-1039 of the present invention, wherein the second CAR comprises at least one region having the same amino acid sequence as the corresponding region of the first CAR.
[Invention 1041]
The method of the invention 1040, wherein the corresponding region of the first CAR is the region in which the subject does not exhibit a detectable humoral or cell-mediated immune response at the time of administration of the cells expressing the second CAR. ..
[Invention 1042]
The corresponding region of the first CAR consists of a costimulatory domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. The method of the invention 1040 or the invention 1041 comprising a region within a CAR portion selected from the group.
[Invention 1043]
The maximum number of CAR-expressing cells after administration of the cells expressing the second CAR, the area under the curve (AUC) of the CAR-expressing cells over time, and / or the duration of the detectable CAR-expressing cells in the subject. Compared to those achieved through methods involving alternative dosing regimens involving administration of cells expressing the first CAR followed by a second administration of cells expressing the first CAR. The method of any of 1001 to 1042 of the present invention, wherein the second administration is carried out at the same time as the administration of the cells expressing the second CAR.
[Invention 1044]
The method comprises at least about 10 or at least 10 CAR-expressing cells per microliter, at least 50% of the total number of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), at least about 1 × 10 ⁵ CAR-expressing cells, or DNA. It results in the maximum concentration or number of CAR-expressing cells in the blood of interest of at least 1,000 copies or at least 2,000 copies or at least 3,000 copies or at least 4,000 copies or at least 5,000 copies of CAR-encoding DNA per microgram; and / or
CAR-expressing cells are detectable in the blood or serum of the subject at 30, 60, or 90 days after the initiation of administration of the cells expressing the second CAR; and / or
On day 30, 60, or 90 days after the start of administration of cells expressing the second CAR, the blood of interest was at least 20% CAR-expressing cells, at least 10 cells per microliter. Contains CAR-expressing cells, or at least 1 × 10 ⁴ CAR-expressing cells,
Any method of the present invention 1001 to 1043.
[Invention 1045]
The invention comprises a dose of cells expressing the first CAR and / or a dose of cells expressing the second CAR independently comprising a sufficient amount of cells to reduce the burden of the disease or condition in the subject. Any method from 1001 to 1044.
[Invention 1046]
The present invention, in which administration of cells expressing the first CAR and / or administration of cells expressing the second CAR achieves a reduction in the burden of the disease or condition in the subject, thereby treating the disease or condition. Any method from 1001 to 1045.
[Invention 1047]
The method of any of 1001-1046 of the present invention, wherein the cells are T cells.
[Invention 1048]
The method of any of 1001-1047 of the present invention, wherein the T cells are self with respect to the subject.
[Invention 1049]
Expressing a Second Chimeric Antigen Receptor (CAR) for the manufacture of a pharmaceutical for the treatment of a disease or condition in a subject previously treated by cells expressing the first Chimeric Antigen Receptor (CAR). The use of a composition containing cells,
The first CAR specifically binds to the disease or condition-related antigen in the subject; and
Use, in which the second CAR specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds, or to another antigen associated with the disease or condition.
[Invention 1050]
A composition comprising cells expressing a second chimeric antigen receptor (CAR) for use in the treatment of a disease or condition in a subject previously treated with the first chimeric receptor (CAR).
The first CAR specifically binds to the disease or condition-related antigen in the subject; and
A composition in which the second CAR specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds, or to another antigen associated with the disease or condition.
[Invention 1051]
The use is for subjects exhibiting a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is specific for the first CAR;
The disease or condition persists in the subject after administration of cells expressing the first CAR; and / or
The disease or condition has recurred in the subject after administration of cells expressing the first CAR.
Use of Invention 1049 or Composition of Invention 1050.
[Invention 1052]
The composition is intended for use at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and / or at least about 60 days after administration of the cells expressing the first CAR. There is any use or composition of any of the present inventions 1049-1051.
[Invention 1053]
The use or composition of any of the inventions 1049-1052, wherein the first CAR comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second CAR.
[Invention 1054]
At least one immunoreactive epitope contains at least one B cell epitope; and / or
At least one immunoreactive epitope contains at least one T cell epitope,
Use or composition of the present invention 1053.
[Invention 1055]
The use or composition of any of the inventions 1049-1054, wherein the subject has never received a dose of cells expressing a second CAR prior to said use.
[Invention 1056]
The use or composition of any of 1049-1055 of the present invention, wherein the second CAR specifically binds to the same antigen as the first CAR.
[Invention 1057]
The use or composition of any of the present inventions 1049-1056, wherein the disease or condition is a tumor.
[Invention 1058]
The use or composition of any of the present inventions 1049-1057, wherein the disease or condition is a B-cell malignant tumor.
[Invention 1059]
The use or composition of any of the inventions 1056-1058, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to the same epitope of said antigen.
[Invention 1060]
The use or composition of any of the inventions 1056-1059, wherein the first CAR competes with the second CAR for binding to said antigen.
[Invention 1061]
The use or composition of any of the inventions 1056-1058 and 1060, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to different epitopes of said antigen.
[Invention 1062]
Does the second CAR specifically bind to an antigen other than the antigen to which the first CAR binds, which is associated with the disease or condition;
The second CAR does not specifically bind to the antigen to which the first CAR specifically binds,
Use or composition of any of 1049-1055 of the present invention.
[Invention 1063]
The first CAR specifically binds to an antigen associated with a B cell malignancies selected from CD19, CD22, or CD20, and the second CAR is different from the antigen to which the first CAR binds. , CD19, CD22, or the use or composition of any of the inventions 1058 to 1062 that binds to another antigen of CD20.
[Invention 1064]
The use or composition of the present invention 1063, wherein the first CAR specifically binds to CD19 and the second CAR specifically binds to CD22.
[Invention 1065]
The use or composition of any of 1049-1055 of the present invention, wherein the cell expressing the second CAR does not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds.
[Invention 1066]
Use of the second CAR does not result in a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration to the subject. , The use or composition of any of the present inventions 1049-1065.
[Invention 1067]
The use or composition of any of the inventions 1049-1066, wherein the second CAR comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first CAR.
[Invention 1068]
Differences in one or more include at least one amino acid sequence difference compared to the region of the first CAR that gives rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR; And / or
The difference in one or more amino acid sequences compared to each region of the first CAR that gives rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. include,
Use or composition of the present invention 1067.
[Invention 1069]
The use or composition of any of the inventions 1049-1068, wherein the subject is the subject for which a CAR-specific immune response to the first CAR has been detected.
[Invention 1070]
Use or composition of the invention 1069, wherein detection comprises identifying at least one region of a first CAR in which the subject exhibits a specific immune response.
[Invention 1071]
The use or composition of the invention 1070, wherein the second CAR contains a difference in one or more amino acid sequences as compared to said region of the first CAR in which the immune response is specific.
[Invention 1072]
The region of the first CAR is selected from the group consisting of the scFv part, the linker part, the amino acid sequence that is not endogenous to the subject, the sequence derived from a species different from the subject, and / or the junction between the two CAR domains. The present invention comprises a region within one or more CAR moieties and / or that region of the first CAR is a junction region containing amino acids on each side of the junction between the two domains. Use or composition of any of 1068-1071.
[Invention 1073]
The region contains the framework region (FR) within the scFv portion.
The region contains a heavy chain FR sequence
The region contains a heavy chain CDR sequence and contains
The region comprises a light chain FR sequence and / or
The region comprises a light chain CDR sequence,
Use or composition of the present invention 1072.
[Invention 1074]
The region comprises a junction region, where the junction region is a maximum of 15 contiguous amino acids on the immediate C-terminal side of the junction that joins the first and second domains of the first CAR, and / or of the junction. The use or composition of the present invention 1072 comprising up to 15 contiguous amino acids immediately N-terminal and optionally further comprising said junction.
[Invention 1075]
A domain in which the first domain and / or the second domain have 100% identity to the domain of a natural or endogenous human protein, or the domain of a natural or endogenous human protein or its functional portion. Including, the natural or endogenous human protein is optionally expressed by the subject being treated; and / or
The first domain and / or the second domain comprises an extracellular binding domain, a hinge domain, a transmembrane domain, or an intracellular signaling domain, and the intracellular signaling domain is optionally a costimulatory signaling domain or An activated cytoplasmic signaling domain,
Use or composition of the present invention 1074.
[Invention 1076]
The first domain and the second domain are not present in the same molecule in vivo in human subjects, or in a single natural or endogenous human protein or polypeptide, according to the invention 1074 or 1075. Use or composition.
[Invention 1077]
The first and second domains are the extracellular ligand binding domain and the hinge domain, the hinge domain and the transmembrane domain, the transmembrane domain and the intracellular costimulatory signaling domain, and the intracellular costimulatory signaling domain and The use or composition of any of the present inventions 1074-1076, which are or contain activated cytoplasmic signaling domains, which may comprise a functional portion of such a domain.
[Invention 1078]
The invention 1074, wherein the first domain is or comprises a transmembrane domain or a functional portion thereof, and the second domain is a co-stimulation signaling domain or a functional portion thereof. Use or composition of any of ~ 1077.
[Invention 1079]
The use or composition of the invention 1078, wherein the transmembrane domain is the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the co-stimulation signaling domain is the 4-1BB signaling domain or its functional portion.
[Invention 1080]
The second CAR is
Domains with at least 95% sequence identity to the first domain and / or domains with at least 95% sequence identity to the second domain;
Domains that are sequence-identical to the first domain and domains that have at least 95% sequence identity to the second domain; or
Domains that have at least 95% sequence identity to the first domain and domains that are sequence identical to the second domain
Including
At least one or both of the domains present in the second CAR are at least one compared to one or both of the first and second domains of the first CAR in the portion containing the qualified junction region. Containing differences in one or more amino acid sequences,
Use or composition of any of the present inventions 1074-1079.
[Invention 1081]
The CD28 transmembrane domain, wherein the first CAR contains both a variant or functional portion containing the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5 or the sequence of amino acids that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 5. And 4-1BB include the co-stimulation domain and contains the junction region; and
The portion where the second CAR contains the modified sequence compared to the first CAR and the modification contains the sequence of residues 13-42 or 15-40 based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5. Including at least one amino acid sequence difference in
Use or composition of any of the present invention 1078-1080.
[Invention 1082]
The second CAR contains 20 or less amino acid sequence differences compared to the first CAR, or the second CAR contains at least 95% amino acid sequence identity to the first CAR. Use or composition of any of the present inventions 1067-1081.
[Invention 1083]
The region of the second CAR that contains at least one of the differences in one or more sequences,
Does it contain less 8-15 amino acid moieties compared to the corresponding region of the first CAR, which has a binding affinity for IC50s <1000 nM for human leukocyte antigen (HLA) molecules;
Does the peptide fragment with the sequence of the corresponding portion of the junction region of the reference chimeric receptor have a binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule that is lower than the binding affinity for the HLA molecule;
The binding affinity of at least one peptide fragment in the region, or the 8-15 amino acid portion of the region, to the human leukocyte antigen (HLA) molecule as compared to the corresponding region of the first CAR. The use or composition of any of the present inventions 1067-1082, which has a reduced average binding affinity for all peptide fragments having a sequence.
[Invention 1084]
Correspondence of the second CAR involving the difference in at least one amino acid sequence in the subject compared to the immune response that occurs in the subject to the region of the first CAR after administration of the second CAR to the subject. The use or composition of any of the present inventions 1067-1083, which results in a detectable reduction in immune response to the region.
[Invention 1085]
The first CAR contains the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the 4-1BB co-stimulation signaling domain or its functional portion; and
The second CAR contains a transmembrane domain and a co-stimulation signaling domain that are different from one or both of such domains in the first CAR.
Use or composition of any of the present inventions 1049-1070.
[Invention 1086]
The use or composition of any of the inventions 1049-1085, wherein the second CAR comprises at least one region having the same amino acid sequence as the corresponding region of the first CAR.
[Invention 1087]
Use of the present invention 1086, wherein the corresponding region of the first CAR is the region in which the subject does not exhibit a detectable humoral or cell-mediated immune response at the time of administration of cells expressing the second CAR. Or the composition.
[Invention 1088]
The corresponding region of the first CAR consists of a co-stimulation domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. Use or composition of the invention 1086 or invention 1087 comprising a region within a CAR moiety selected from the group.

（図１）図1は、ヒト対象における抗CD19 CAR発現細胞の投与の後の、CAR発現細胞に特異的な細胞溶解免疫応答の存在を検出する、例示的なクロム放出アッセイからの結果を示す。CAR発現（「CD19-CAR」）および非CAR発現（「モック」）の存在下での、CAR発現細胞の注入前（左パネル）および注入後（右パネル）の対象に由来する末梢血単核細胞（PBMC）を含有している混合リンパ球培養物についての結果が示される。「E/T」=エフェクター細胞と標的細胞との比。
（図２）図2は、例示的なヒト対象におけるCARの特定の領域を表すいくつかのオーバーラップペプチドに対する免疫応答を確認する例示的なELISpot分析からの結果を示す。「ペプチド」と共に表記された数字は、CAR配列の長さに沿った様々なオーバーラップペプチドを表し、対応する領域がチャートの上に示される。
（図３）図3は、アミノ酸配列

（残基1～15は例示的なCD28膜貫通ドメインに相当し、残基16～30は例示的な4-1BB共刺激ドメインに相当する）を有する例示的なジャンクション領域の一連の8アミノ酸長～14アミノ酸長のオーバーラップペプチドを含む、キメラ受容体の例示的な領域のペプチドのHLA-A2:01との結合についての予測結合親和性のエピトープ親和性マップを示す。図は、CD28膜貫通ドメインと4-1BB共刺激ドメインとの間に挿入されたアスパラギン残基を含有しているアミノ酸配列

を有するバリアントジャンクション領域の一連の8アミノ酸長～14アミノ酸長のオーバーラップペプチドの予測結合親和性も示す。
（図４）図4Aおよび図4Bは、集団内の個々のHLA対立遺伝子の頻度によって重み付けされた50nm未満の予測IC50を有する配列の長さに沿った各位置を含むデータセットにおける配列の総数を示す、それぞれ、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの対立遺伝子についてのアルゴリズムに基づくT細胞エピトープ予測を示す。
（図５）図5は、一連のバリアントペプチドのHLAクラスIおよびHLAクラスIIの対立遺伝子についてのアルゴリズムに基づくT細胞エピトープ予測を示す。スコアは、実施例2に記載されるように決定され重み付けされた。三角および点線は、クラスI重み付きスコアを示す。丸および実線は、クラスII重み付きスコアを示す。
（図６）図6は、SEQ ID NO:5の例示的なCD28-4-1BB配列のアミノ酸配列を示す。CD28膜貫通ドメインに相当するアミノ酸は、最初および最後の位置を示す矢印を有する実線によって示され；例示的な4-1BB共刺激ドメインのアミノ酸は、最初および最後の位置を示す矢印を有する破線によって示され；例示的なジャンクション領域のアミノ酸は、最初および最後の位置を示す矢印を有する破線および点線ならびにイタリック体によって示される。ジャンクション部位にすぐ隣接する2個のアミノ酸は、ボックスによって示される。K28、R31、およびL34を含む、いくつかの態様において、修飾の標的とされる例示的なアミノ酸は、太字であり、下線付きである。4-1BBによって媒介されるTRAFの結合およびシグナル伝達に関与し得る酸性残基の領域は、二重下線によって示される。 FIG. 1 shows results from an exemplary chromium release assay that detects the presence of CAR-expressing cell-specific cytolytic immune responses after administration of anti-CD19 CAR-expressing cells in human subjects. .. Peripheral blood mononuclears derived from subjects before (left panel) and post-injection (right panel) CAR-expressing cells in the presence of CAR expression (“CD19-CAR”) and non-CAR expression (“mock”). Results are shown for mixed lymphocyte cultures containing cells (PBMC). "E / T" = ratio of effector cells to target cells.
FIG. 2 shows the results from an exemplary ELI Spot analysis confirming an immune response to several overlapping peptides representing specific regions of CAR in an exemplary human subject. The numbers labeled with "peptides" represent various overlapping peptides along the length of the CAR sequence, with corresponding regions shown above the chart.
(Fig. 3) Fig. 3 shows the amino acid sequence.

A series of 8 amino acid lengths of an exemplary junction region with (residues 1-15 correspond to an exemplary CD28 transmembrane domain and residues 16-30 correspond to an exemplary 4-1BB co-stimulation domain). An epitope affinity map of predictive binding affinities for binding of peptides in an exemplary region of the chimeric receptor, including overlapping peptides of ~ 14 amino acids in length, to HLA-A2: 01 is shown. The figure shows an amino acid sequence containing an asparagine residue inserted between the CD28 transmembrane domain and the 4-1BB co-stimulation domain.

It also shows the predicted binding affinity of a series of 8-amino acid-long to 14-amino acid-long overlapping peptides in the variant junction region with.
(Fig. 4) Fig. 4A and Fig. 4B show the total number of sequences in the data set containing each position along the length of the sequence having a predicted IC50 of less than 50 nm weighted by the frequency of individual HLA alleles in the population. Shown are T cell epitope predictions based on algorithms for HLA class I and HLA class II alleles, respectively.
FIG. 5 shows algorithmic T cell epitope predictions for HLA class I and HLA class II alleles of a series of variant peptides. Scores were determined and weighted as described in Example 2. Triangles and dotted lines indicate class I weighted scores. Circles and solid lines indicate Class II weighted scores.
FIG. 6 shows the amino acid sequence of an exemplary CD28-4-1BB sequence of SEQ ID NO: 5. The amino acids corresponding to the CD28 transmembrane domain are indicated by solid lines with arrows indicating the first and last positions; the amino acids in the exemplary 4-1BB co-stimulation domain are indicated by dashed lines with arrows indicating the first and last positions. Shown; the amino acids in the exemplary junction region are indicated by dashed and dotted lines with arrows indicating the first and last positions and the italic form. The two amino acids immediately adjacent to the junction site are indicated by a box. Exemplary amino acids targeted for modification in some embodiments, including K28, R31, and L34, are bold and underlined. Regions of acidic residues that may be involved in TRAF binding and signal transduction mediated by 4-1BB are indicated by double underlining.

詳細な説明
I.組換え受容体を発現する細胞による処置方法
例えば、腫瘍のような様々な疾患および状態の処置のための、細胞療法において使用するための方法、組成物、および製品が、提供される。方法は、疾患もしくは状態に関連した分子を認識しかつ/もしくはそれに特異的に結合し、かつ/または特定の治療効果を促進するよう設計された組換え分子、典型的には、組換え受容体を発現する改変細胞を、対象へ投与する工程を含む。そのような結合は、そのような分子を標的とする免疫応答のような応答をもたらすことができる。組換え受容体には、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）、および/またはトランスジェニックT細胞受容体（TCR）を含むトランスジェニック抗原受容体のようなその他のトランスジェニック受容体が含まれ得る。 Detailed explanation
I. Methods of Treatment with Cells Expressing Recombinant Receptors Methods, compositions, and products for use in cell therapy, eg, for the treatment of various diseases and conditions such as tumors, are provided. The method is a recombinant molecule, typically a recombinant receptor, designed to recognize and / or specifically bind to a molecule associated with a disease or condition and / or promote a particular therapeutic effect. Includes the step of administering to the subject the modified cells expressing the above. Such binding can result in a response such as an immune response targeting such a molecule. Recombinant receptors include chimeric receptors, such as chimeric antigen receptors (CARs) and / or other transgenic receptors such as transgenic T cell receptors (TCRs). Can be included.

具体的には、方法は、そのような細胞の複数の投与、または先の投与もしくは用量を受けたことのある対象への細胞の投与を含む。典型的には、第1のまたは先の投与（例えば、第1のまたは先の用量）において投与される細胞は、第2のまたは後の投与または用量において投与されるものとは異なるものである。典型的には、細胞は、少なくとも一部分、別の組換え分子、例えば、別の組換え受容体の発現のため、別のものである。いくつかの態様において、第2のまたは後の投与または用量の細胞は、第1の用量または投与のものが発現する受容体を発現しない。いくつかの態様において、そのような細胞は、第1の投与または用量のものとは異なる受容体を発現する。従って、いくつかの態様において、方法は、細胞の第2の（および/もしくは第3、第4、第5等の）用量を、第1の用量を受けたことのある対象へ投与する工程、ならびに/または第1および第2（および/もしくは第3、第4、第5等の）用量を対象へ投与する工程を含む。ここで、第2の用量において投与される細胞は、第1の用量において投与される細胞が発現する受容体とは異なる受容体を発現する。方法は反復的な様式で実施されてもよい。 Specifically, the method comprises multiple administrations of such cells, or administration of cells to a subject who has received a previous dose or dose. Typically, cells administered in a first or earlier dose (eg, first or earlier dose) are different from those administered in a second or subsequent dose or dose. .. Typically, the cell is at least partially different due to the expression of another recombinant molecule, eg, another recombinant receptor. In some embodiments, the cells of the second or subsequent dose or dose do not express the receptors expressed by those of the first dose or dose. In some embodiments, such cells express a receptor different from that of the first dose or dose. Thus, in some embodiments, the method is the step of administering a second (and / or third, fourth, fifth, etc.) dose of cells to a subject who has received the first dose. And / or include the step of administering the first and second (and / or third, fourth, fifth, etc.) doses to the subject. Here, the cells administered at the second dose express a receptor different from that expressed by the cells administered at the first dose. The method may be carried out in an iterative manner.

いくつかの局面において、提供される態様は、組換え受容体を発現する投与された細胞への対象の曝露の増加（例えば、経時的な細胞数または持続時間の増加）が、養子細胞療法における効力および治療転帰を改善し得るという本明細書中の観察に基づく。複数の臨床試験において、CD19を標的とする種々のCAR発現T細胞の、様々なCD19発現癌を有する対象への投与の後に実施された予備分析は、CAR発現細胞へのより大きくかつ/またはより長い曝露の程度と処置転帰との間の相関を明らかにした。 In some aspects, the provided embodiment is that increased exposure of the subject to administered cells expressing recombinant receptors (eg, increased cell number or duration over time) is in adoptive cell therapy. Based on the observations herein that efficacy and treatment outcomes can be improved. In multiple clinical trials, preliminary analysis performed after administration of various CAR-expressing T cells targeting CD19 to subjects with various CD19-expressing cancers was larger and / or more to CAR-expressing cells. We revealed a correlation between the degree of long-term exposure and treatment outcomes.

そのような転帰には、患者の生存および寛解が含まれ、重度のまたは有意な腫瘍負荷を有する個体における生存および寛解すら含まれていた。にも関わらず、早すぎる細胞の排除をもたらし得る、投与された細胞によって発現された組換え受容体に対する宿主免疫応答によって、曝露は制限され得る。そのような宿主の獲得免疫応答または自然免疫応答が発達した後は、同一の組換え受容体を発現する細胞の後の用量を投与することによって、曝露の増加または対象の再処置の提供を試みることは実現可能または有効ではない場合がある。受容体に対するそのような免疫応答が発達した後、同一の受容体または類似した免疫原性エピトープを含むものを発現する細胞のそのような第2のまたは後の用量の投与は、有効または実質的な程度に増大しかつ/または持続する機会を有する前に、細胞の迅速な排除をもたらし得る。これらの困難を解決する態様が提供される。 Such outcomes included survival and remission of patients, and even survival and remission in individuals with severe or significant tumor loading. Nevertheless, exposure can be limited by a host immune response to recombinant receptors expressed by administered cells, which can result in premature cell elimination. After the adaptive or innate immune response of such a host develops, attempts are made to increase exposure or provide retreatment of the subject by administering subsequent doses of cells expressing the same recombinant receptor. Things may or may not be feasible. After the development of such an immune response to a receptor, administration of such a second or subsequent dose of cells expressing the same receptor or one containing a similar immunogenic epitope is effective or substantial. It can result in rapid elimination of cells before they have the opportunity to grow and / or persist to some extent. Aspects for solving these difficulties are provided.

いくつかの態様において、第1のまたは先の用量が発現する第1のまたは先の受容体とは異なる、第2の（および/またはその他の後の）受容体（例えば、CAR）を発現する細胞の第2の（および/またはその他の後の）用量を提供することによって、提供される方法は、第1のまたは先の受容体に対する宿主免疫応答による曝露の低下の問題を解決する。具体的には、第2のまたは後の用量の細胞は、第1のまたは先の用量の細胞が発現するのと同じ受容体を発現しないため、第2のまたは後の用量の細胞に存在する分子に特異的な免疫応答を対象が開始するリスクは低下する。 In some embodiments, it expresses a second (and / or other later) receptor (eg, CAR) that is different from the first or earlier receptor that the first or earlier dose expresses. By providing a second (and / or other) dose of cells, the provided method solves the problem of reduced exposure due to the host immune response to the first or earlier receptor. Specifically, the second or later dose of cells is present in the second or later dose of cells because they do not express the same receptors that the first or earlier dose of cells express. The risk of a subject initiating a molecule-specific immune response is reduced.

いくつかの局面において、提供される態様は、免疫療法、例えば、養子細胞免疫療法の状況における抗原の喪失、変異、修飾、および/またはダウンレギュレーションの観察に基づく。例えば、抗CD19 CAR発現T細胞を含むCD19標的療法を投与された数人の対象において、CD19陰性疾患が観察されている。いくつかの態様において、提供される方法には、そのような抗原のダウンレギュレーションまたは喪失または修飾の状況における利点がある。例えば、第1のまたは先の受容体が標的とする抗原またはエピトープと比較して異なる抗原に特異的に結合する第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与は、対象がそのようなエピトープまたは抗原の喪失または修飾を経験しているかまたは示す場合に、疾患もしくは状態の処置の継続および/または効力の改善を可能にすることができる。異なる抗原は、いくつかの態様において、第1の抗原が特異的であるかまたは関連しているのと同じ疾患または状態に特異的であるかまたは関連しているもう一つの抗原である。いくつかの態様において、それは、例えば、治療的介入の途中または後に、対象において発現されたスプライスバリアントまたは変異バージョンのような、第1の抗原のバリアントである。従って、本明細書に提供されるいくつかの方法および組成物の利点には、第1の処置アプローチの有効性を低下させる抗原の喪失、ダウンレギュレーション、または修飾を経験している対象における継続的な有効な処置を提供する能力が含まれる。 In some aspects, the embodiments provided are based on observations of antigen loss, mutation, modification, and / or downregulation in the context of immunotherapy, eg, adoptive cell immunotherapy. For example, CD19-negative disease has been observed in several subjects who received CD19-targeted therapy containing anti-CD19 CAR-expressing T cells. In some embodiments, the provided method has advantages in the context of downregulation or loss or modification of such antigens. For example, administration of cells expressing a second or subsequent receptor that specifically binds to a different antigen compared to the antigen or epitope that the first or earlier receptor targets is such a subject. If the loss or modification of an epitope or antigen is experienced or indicated, it can be possible to continue treatment of the disease or condition and / or improve efficacy. The different antigen is, in some embodiments, another antigen that is specific to or associated with the same disease or condition to which the first antigen is specific or associated. In some embodiments, it is a variant of the first antigen, such as, for example, a splicing variant or mutant version expressed in a subject during or after a therapeutic intervention. Therefore, the advantages of some of the methods and compositions provided herein are continuous in subjects experiencing antigen loss, downregulation, or modification that reduces the effectiveness of the first treatment approach. Includes the ability to provide effective treatment.

いくつかの態様において、対象は、第1のまたは先の投与の後に、例えば、第2のまたは後の投与の時点でまたはその直前に、第1のまたは先の受容体に対する免疫応答を示すため、第1の受容体を発現する細胞のさらなる投与、または類似した免疫原性による方法は、無効であり得る。いくつかの態様において、対象は、第2の受容体を発現する細胞の投与の後に、第2の受容体に対する免疫応答もしくは特定の型もしくは程度の免疫応答を示さないか、または一定の期間内に、例えば、それらの細胞の投与の約60日以内に、そのような応答を示さない。免疫応答の型は、検出可能な免疫応答、体液性免疫応答、および/または細胞性免疫応答であり得る。いくつかの態様において、第1のまたは先の投与の後のそのような免疫応答の存在または欠如は、検出され、第1のまたは先の受容体と比較して、第2のまたは後の受容体にどのような差が存在するよう設計されるかを通知することができる。そのような検出は、対象が特異的な免疫応答を示す第1のまたはその他の先の受容体（例えば、CAR）の少なくとも1個の領域の同定を含み得る。そのような同定された領域を、第2のまたはその他の後の受容体において変動させることができ、例えば、その1個または複数個の領域において異なる受容体を、第2の投与において選択することができる。 In some embodiments, the subject exhibits an immune response to the first or earlier receptor after the first or earlier administration, eg, at or just before the second or subsequent administration. , Further administration of cells expressing the first receptor, or similar immunogenicity methods may be ineffective. In some embodiments, the subject does not exhibit or show a particular type or degree of immune response to the second receptor or within a period of time after administration of cells expressing the second receptor. In, for example, within about 60 days of administration of those cells, do not show such a response. The type of immune response can be a detectable immune response, a humoral immune response, and / or a cell-mediated immune response. In some embodiments, the presence or absence of such an immune response after the first or previous administration is detected and the second or subsequent receptor compared to the first or earlier receptor. It can inform you what differences are designed to exist in your body. Such detection may include identification of at least one region of a first or other earlier receptor (eg, CAR) in which the subject exhibits a specific immune response. Such identified regions can be varied in the second or other subsequent receptors, eg, different receptors in one or more of the regions are selected in the second dose. Can be done.

具体的には、第2の分子、例えば、第2の受容体（例えば、第2のCAR）は、一般に、第1の受容体（例えば、第1のCAR）と、例えば、アミノ酸配列および/または免疫学的エピトープにおいて、一定程度異なる。従って、第1のまたは先の受容体は、一般に、細胞が投与される対象の免疫系によって認識され得る、少なくとも1種のB細胞エピトープおよび/または少なくとも1種のT細胞エピトープのような、第2のまたは後の受容体に存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む。具体的な態様において、第2の（または後の）受容体、例えば、CARは、第1のまたは先の受容体と比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む。 Specifically, the second molecule, eg, the second acceptor (eg, the second CAR), is generally the first receptor (eg, the first CAR) and, for example, the amino acid sequence and /. Or in immunological epitopes, they differ to some extent. Thus, the first or earlier receptor is generally the first, such as at least one B cell epitope and / or at least one T cell epitope that can be recognized by the immune system of the subject to which the cell is administered. Contains at least one immunoreactive epitope that is not present at the second or later receptor. In a specific embodiment, the second (or later) receptor, eg, CAR, comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first or earlier receptor.

そのような違いには、第1のまたは先の投与の後に対象において検出可能な免疫応答が示される第1のまたは先の受容体の領域と比較した少なくとも1つの違い、例えば、第1のまたは先の受容体のそのような領域に対応する第2のまたは後の受容体の領域における違いが含まれ得る。違いを含む領域には、scFv部分のような抗原結合部分、例えば、scFvの中のフレームワーク領域（FR）、もしくは、例えば、VHのFR1、FR2、FR3のような可変領域部分、重鎖および/もしくは軽鎖の可変領域部分、リンカー部分、ヒンジ部分、2個のCARドメインの間のジャンクション、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、ならびに/または非内在性である、例えば、宿主の内在性分子に存在する配列と同一でない、CARの中のアミノ酸の配列、例えば、天然環境において単一のアミノ酸配列において互いに天然に関連していない2個のドメインの間のジャンクション領域、例えば、キメラ受容体もしくは抗体/抗体断片の中の2個の内在性配列の間のジャンクションが含まれ得る。 Such differences include at least one difference compared to the region of the first or previous receptor that exhibits a detectable immune response in the subject after the first or previous administration, eg, the first or Differences in the region of the second or subsequent receptor corresponding to such region of the earlier receptor may be included. Regions containing differences include antigen binding moieties such as scFv moieties, eg, framework regions (FRs) within scFv, or variable domain moieties such as FR1, FR2, FR3 of VH, heavy chains and / Or present in the variable region portion of the light chain, the linker portion, the hinge portion, the junction between the two CAR domains, the transfection marker or expression marker, and / or in the endogenous molecule of the host, eg, non-endogenous. A sequence of amino acids in a CAR that is not identical to the sequence, eg, a junction region between two domains that are not naturally related to each other in a single amino acid sequence in the natural environment, eg, a chimeric receptor or antibody / It may contain a junction between two endogenous sequences in an antibody fragment.

一般に、第2のまたはその他の後の受容体には、第1のまたはその他の先の受容体と比較して、1つまたは複数の違いが存在するが、受容体は、類似性を有する領域、例えば、アミノ酸配列同一性を有する領域も含んでいてよい。いくつかの態様において、同一性を有する領域は、対象が、第1のまたは先の投与の後に、免疫応答を示さないかまたは示す可能性が低いものである。そのような領域には、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、CDR、および/または形質導入マーカーもしくは発現マーカーの中の領域が含まれ得る。scFvおよび/または可変領域が異なる受容体の間で異なる場合、それぞれのscFvまたは可変領域は、同一の種（例えば、マウスもしくはヒト）に由来してもよいし、異なる種に由来してもよいし、かつ/またはそれらの組み合わせであってもよい。 In general, the second or other subsequent receptor has one or more differences compared to the first or other earlier receptor, but the receptor is a region of similarity. For example, a region having amino acid sequence identity may also be included. In some embodiments, regions of identity are those in which the subject does not show or is unlikely to show an immune response after the first or previous dose. Such regions may include regions within co-stimulation domains, ITAM-containing domains, transmembrane domains, CDRs, and / or transduction or expression markers. If the scFv and / or variable region is different between different receptors, each scFv or variable region may be derived from the same species (eg, mouse or human) or from different species. And / or a combination thereof.

いくつかの態様において、第1の用量または投与の細胞の中の組換え分子、例えば、組換え受容体と、第2の用量または投与との間に認められる違いは、唯一の違いまたは実質的にもしくは本質的に唯一の違いである。いくつかの態様において、受容体における違いおよび/またはその他の認められる違いの他には、先および後の投与において投与される細胞および/または細胞集団は、同一であるかまたは本質的にもしくは実質的に同一である。いくつかの態様において、ある投与における、検出可能な表面レベルの1種または複数種のマーカーを発現する細胞の比は、後の投与と比較して、同一であるかまたは類似している。いくつかの態様において、異なる用量または投与における細胞の集団および/または亜集団の百分率は、同一であるかまたは実質的にもしくは本質的に同一である。異なる用量は、T細胞、CD8+および/またはCD4+T細胞、特定の系統または活性化状態または経験のT細胞の同一の百分率、例えば、エフェクターT細胞、未感作T細胞、および/もしくはメモリーT細胞、および/もしくはT_CM細胞、T_EM細胞、T_SCM細胞のようなその亜集団の同一の相対百分率を含有していてよく、かつ/または細胞は、同一の対象、試料、組織、および/もしくは液体もしくはコンパートメントに由来してよい。いくつかの態様において、例えば、組換え受容体をコードするベクターによる形質導入によって、第1の用量の細胞を改変するために使用されるのと同じ細胞組成物のもう一つの部分が、第2の投与の細胞を改変するために使用される。いくつかの態様において、組成物は、第2の投与の前に、例えば、凍結保存によって保存される。 In some embodiments, the only difference or substantial difference observed between a recombinant molecule, eg, a recombinant receptor, in a cell at a first dose or dose and a second dose or dose. Or essentially the only difference. In some embodiments, apart from differences in receptors and / or other recognized differences, the cells and / or cell populations administered in the previous and subsequent doses are identical or essentially or substantial. Is the same. In some embodiments, the ratio of cells expressing one or more markers at the detectable surface level at one dose is the same or similar as compared to subsequent doses. In some embodiments, the percentages of cell populations and / or subpopulations at different doses or doses are the same or substantially or essentially the same. Different doses are the same percentage of T cells, CD8 + and / or CD4 + T cells, T cells of a particular lineage or activated state or experience, eg effector T cells, unsensitized T cells, and / or memory T cells. The cells and / or may contain the same relative percentage of their subpopulation such as T _CM cells, T _EM cells, T _SCM cells, and / or the cells are the same subject, sample, tissue, and /. Alternatively, it may be derived from a liquid or compartment. In some embodiments, another portion of the same cell composition used to modify cells at the first dose, eg, by transduction with a vector encoding a recombinant receptor, is the second. Used to modify cells for administration. In some embodiments, the composition is stored, for example, by cryopreservation prior to the second administration.

いくつかの態様において、用量は、特定の量でかつ/または特定のタイミングパラメータによって投与される。いくつかの態様において、第2（または第3、第4、第5等）の受容体を発現する細胞の第2のまたはその他の後の用量は、第1のまたはその他の先の用量における受容体に対する免疫応答が発達した後、発達する機会を有した後、かつ/または検出されるかもしくはその他の方法で存在することが確認された後の時点で、例えば、第1のもしくはその他の先の用量の、28日後もしくは約28日後もしくは35日後もしくは約35日後または少なくとも28日後もしくは約28日後もしくは35日後もしくは約35日後に与えられる。 In some embodiments, the dose is administered in a particular amount and / or by a particular timing parameter. In some embodiments, the second or other subsequent dose of cells expressing the second (or third, fourth, fifth, etc.) receptor is the acceptance at the first or other earlier dose. After the immune response to the body has developed, has the opportunity to develop, and / or has been detected or otherwise confirmed to be present, for example, first or other. The dose is given after 28 days or about 28 days or 35 days or after about 35 days or at least 28 days or after about 28 days or after 35 days or after about 35 days.

後の用量は、標的とされた疾患もしくは障害の再発時の再処置のため、かつ/またはその再発を防止するため、かつ/または第1もしくは先の用量の後の疾患もしくは状態もしくは関心対象の抗原を標的とする組換え受容体を発現する細胞への曝露の低下を解決するかもしくは防止するため、使用され得る。例えば、後の用量は、いくつかの態様において、そのような細胞の持続性もしくは増大または対象もしくはその臓器もしくは液体の中のそのような細胞の総数もしくは相対数の減退の検出後または検出時に投与される。従って、いくつかの態様において、これらのパラメータのうちの1個または複数個が、第1のまたはその他の先の用量と第2のまたはその他の後の用量との間の時間に測定されるか、検出されるか、または査定され、そのような査定の結果に基づき、後の用量を投与するタイミングまたは決定がなされる。例えば、受容体を発現する細胞の数または濃度が、所望のレベルより低くなるか、または最大のもしくはその他の測定された濃度もしくは数に対する一定の百分率より低く減退したことが決定された時点で、第2の用量が投与されてよい。 Subsequent doses are for retreatment of the targeted disease or disorder in the event of recurrence and / or to prevent its recurrence and / or for the disease or condition or subject of interest after the first or earlier dose. It can be used to resolve or prevent reduced exposure to cells expressing recombinant receptors that target the antigen. For example, later doses may, in some embodiments, be administered after or at the time of detection of the persistence or growth of such cells or the decline in the total number or relative number of such cells in the subject or its organ or fluid. Will be done. Thus, in some embodiments, is one or more of these parameters measured in the time between the first or other earlier dose and the second or other later dose? , Detected or assessed, and based on the results of such assessment, the timing or decision to administer a later dose is made. For example, when it is determined that the number or concentration of cells expressing the receptor is below the desired level, or declines below a certain percentage of the maximum or other measured concentration or number. A second dose may be administered.

組換え受容体、例えば、CAR、またはトランスジェニックTCRは、一般に、対象および/またはその細胞もしくは組織における疾患または状態によって発現され、それらに関連しており、かつ/またはそれらに特異的である1種または複数種の抗原に特異的に結合する。そのような疾患には、腫瘍、癌、その他の増殖性疾患、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、および/または感染性の病原体もしくは疾患が含まれ得る。いくつかの態様において、第1の（またはその他の先の）受容体および第2の（またはその他の後の）受容体は、別のものであるが、同一のそのような抗原に特異的に結合する。結合は、類似したまたは同一のエピトープに対するものであってよい。いくつかの態様において、一方の受容体の抗原との結合は、抗原との結合について、他方のものと競合する。結合は、いくつかの態様において、他の受容体のものと競合しない完全に異なるエピトープ、および/または完全に異なる抗原に対するものである。これに関して、方法は、いくつかの態様において、疾患もしくは状態もしくはその細胞による標的のダウンレギュレーションもしくは変異に起因するような、特定のエピトープもしくは抗原を標的とする処置に対して抵抗性になった疾患もしくは状態を有し、かつ/または抗原喪失を経験している対象を処置するのに有用であり得る。例えば、いくつかの態様において、第1の受容体が認識するかまたは結合する抗原は、CD19であり、第2のまたは後の受容体が特異的に結合するかまたは認識する抗原は、CD22またはCD20のような、CD19とは異なる、B細胞に特異的なもしくはB細胞に関連した抗原（またはB細胞疾患、例えば、B細胞悪性腫瘍に関連しているかもしくは特異的な抗原）である。 Recombinant receptors, such as CARs, or transgenic TCRs, are generally expressed, associated with, and / or specific to a disease or condition in a subject and / or their cells or tissues1 It specifically binds to a species or multiple antigens. Such diseases may include tumors, cancers, other proliferative diseases, autoimmune or autoimmune disorders, and / or infectious pathogens or diseases. In some embodiments, the first (or other earlier) receptor and the second (or other later) receptor are different but specific to the same such antigen. Join. Binding may be to similar or identical epitopes. In some embodiments, the binding of one receptor to the antigen competes with that of the other for binding to the antigen. Binding is, in some embodiments, to a completely different epitope and / or a completely different antigen that does not compete with that of the other receptor. In this regard, the method, in some embodiments, has become resistant to treatments targeting a particular epitope or antigen, such as due to a disease or condition or downregulation or mutation of the target by the cell thereof. Alternatively, it may be useful in treating a subject who has a condition and / or is experiencing antigen loss. For example, in some embodiments, the antigen recognized or bound by the first receptor is CD19 and the antigen specifically bound or recognized by the second or later receptor is CD22 or Different from CD19, such as CD20, B cell-specific or B cell-related antigens (or B cell disease, eg, B cell malignant tumor-related or specific antigens).

従って、類似しているが別のものである疾患に関連したエピトープまたは抗原を標的とする能力を提示することによって、方法は、いくつかの態様において、対象における改変細胞の全体的な持続性を増加させるのみならず、細胞および/または療法の形態が、最初の標的のダウンレギュレーションまたは変異の状況ですら機能することを可能にすることによっても、効力を改善する。いくつかの態様において、第2の受容体は、同一の抗原および同一の疾患における異なる抗原に結合し、かつ/または細胞は、各々異なる抗原もしくはエピトープに結合する複数の受容体を含有し、そのうちの1種または複数種は、第1の受容体が認識するものと別のものであってもよいしもしくは同一であってもよい。いくつかの態様において、第2のまたは後の受容体は、第1の受容体が認識する抗原のバリアント、例えば、異なるスプライスバリアントまたは修飾バージョンに結合する。 Thus, by presenting the ability to target similar but different disease-related epitopes or antigens, the method, in some embodiments, provides the overall persistence of the modified cell in the subject. Not only does it increase, but it also improves efficacy by allowing the form of cells and / or therapy to function even in the context of downregulation or mutation of the initial target. In some embodiments, the second receptor binds to the same antigen and different antigens in the same disease, and / or the cell contains multiple receptors that each bind to a different antigen or epitope. One or more of the above may be different from or identical to those recognized by the first receptor. In some embodiments, the second or subsequent receptor binds to a variant of the antigen recognized by the first receptor, eg, a different splice variant or modified version.

いくつかの態様において、異なる受容体は、同一の種に起源を有する配列を有する（抗原結合ドメイン、例えば、sFv、および/もしくはキメラ受容体のその他のドメイン、例えば、その他のCARドメインのような）ドメイン、ならびに/または異なる種に起源を有する配列を有するものを有する。例えば、いくつかの態様において、異なる受容体は、2種のマウス由来scFvドメイン、またはそれぞれFMC63およびSJ25C1に由来するもののようなマウスに由来するフレームワーク領域（FR）配列を含む2種のscFvドメインのような、同一の種に由来する2種の異なる結合ドメインを含有している。他の態様において、異なる受容体は、異なる種に由来する同一のまたは異なる抗原のための2種の異なる結合ドメインを含有している。例えば、第1の受容体は、FMC63またはSJ25C1のようなマウス配列に由来するscFvまたはその他の結合ドメインを有し、もう一つの受容体は、もう一つの種に完全にまたは部分的に由来するドメイン、例えば、ヒトのまたはヒト化された配列、例えば、同一の抗原、例えば、同一のもしくは類似しているもしくは別のエピトープ、または別の抗原に結合するものを有する。 In some embodiments, the different receptors have sequences originating from the same species (such as antigen binding domains, eg sFv, and / or other domains of chimeric receptors, eg, other CAR domains. ) Have a domain, and / or one with a sequence originating from a different species. For example, in some embodiments, the different receptors contain two mouse-derived scFv domains, or two mouse-derived framework region (FR) sequences, such as those derived from FMC63 and SJ25C1, respectively. It contains two different binding domains from the same species, such as. In other embodiments, the different receptor contains two different binding domains for the same or different antigens from different species. For example, the first receptor has a scFv or other binding domain derived from a mouse sequence such as FMC63 or SJ25C1 and the other receptor is fully or partially derived from another species. It has a domain, eg, a human or humanized sequence, eg, one that binds to the same antigen, eg, the same or similar or different epitope, or another antigen.

いくつかの態様において、受容体は、他方のパートナーが、疾患もしくは状態もしくはその細胞もしくは組織の状況において特異的に発現され、かつ/またはその発現が疾患もしくは状態に関連している、結合パートナー対の一方および/またはそのバリアントのような、抗原受容体以外の受容体である。いくつかの態様において、そのような受容体は、キメラ受容体である。いくつかの態様において、そのようなキメラ受容体は、そのような結合パートナーと特異的に相互作用する細胞外結合部分を含有し、かつ、例えば、いくつかのキメラ抗原受容体に存在するもののような、活性化ドメインおよび/または共刺激ドメインのような、免疫賦活性シグナルを強化することができる膜貫通ドメインおよび/または細胞内シグナル伝達ドメインを含有している。 In some embodiments, the receptor is a binding partner pair in which the other partner is specifically expressed in the condition of the disease or condition or its cells or tissues and / or its expression is associated with the disease or condition. Receptors other than antigen receptors, such as one and / or a variant thereof. In some embodiments, such a receptor is a chimeric receptor. In some embodiments, such chimeric receptors contain extracellular binding moieties that specifically interact with such binding partners, such as those present, for example, in some chimeric antigen receptors. It contains transmembrane domains and / or intracellular signaling domains that can enhance immunostimulatory signals, such as activation and / or costimulatory domains.

いくつかの態様において、提供される方法は、対象における疾患または障害の長期的または連続的な処置または管理のためのものであり、改変細胞の第1、第2、第3、および/または複数の付加的な後の投与を含む。ここで、用量のうちの一つまたは複数は、他の用量におけるものとは異なるものであるが、対象における同一の疾患または状態を標的とする組換え受容体、例えば、同一のまたは異なるエピトープにおいて、同一のまたは異なる、疾患に特異的なまたは疾患に関連した抗原を標的とする別の受容体を発現する細胞を含む。長期的なまたは慢性の処置または管理は、いくつかの態様において、免疫原性、ならびに/または細胞の曝露、存在、持続性、数、および/もしくは百分率の下落について対象をモニタリングし、第1のまたは先の受容体または細胞に関する効力の喪失またはそのリスクの特定の指標が検出された場合、検出された時に、次の後の投与（例えば、次の後の受容体）を導入する、反復過程である。いくつかの態様において、先の用量における細胞の持続性、増大、もしくは曝露の低下、対象におけるそれに特異的な免疫応答、再発、抵抗性、および/または標的抗原のダウンレギュレーションもしくは変化のような、効力の喪失のリスクの一つまたは複数の指標の検出時に、各々の後の投与が開始される。 In some embodiments, the methods provided are for long-term or continuous treatment or management of a disease or disorder in a subject, the first, second, third, and / or plurality of modified cells. Includes additional subsequent administration of. Here, one or more of the doses is different from those at other doses, but at recombinant receptors targeting the same disease or condition in the subject, eg, at the same or different epitopes. Includes cells expressing different receptors that target the same or different, disease-specific or disease-related antigens. Long-term or chronic treatment or management, in some embodiments, monitors the subject for immunogenicity and / or decline in cell exposure, presence, persistence, number, and / or percentage, first. Or a repetitive process that introduces the next subsequent dose (eg, the next subsequent receptor) when a specific indicator of loss of efficacy or its risk with respect to the previous receptor or cell is detected. Is. In some embodiments, such as cell persistence, increase, or reduction of exposure at previous doses, immune response, recurrence, resistance, and / or downregulation or alteration of the target antigen specific to it in the subject. Upon detection of one or more indicators of the risk of loss of efficacy, subsequent administration of each is initiated.

第2のキメラ受容体の投薬の例示的な方法
いくつかの態様において、方法は、第1のキメラ受容体に対する免疫応答を発達させており、かつ/または第1のキメラ受容体に対して免疫原性である可能性の高い対象への、第2のキメラ受容体の投与を含む。いくつかの態様において、第1のキメラ受容体は、免疫原性である第1および第2のドメインのジャンクション領域を含有している。いくつかの態様において、免疫原性領域は、1種または複数種の（T細胞エピトープとも呼ばれる）ペプチドエピトープを含む。いくつかのケースにおいて、2個のドメインのジャンクションにかかる、可能性のあるペプチドエピトープを含有しているジャンクション領域は、免疫原性であり得、ジャンクション領域を含有しているキメラ受容体の対象への投与時に免疫応答の生成をもたらし得る。いくつかの態様において、ジャンクション領域には、キメラ受容体の第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側にある約8～24アミノ酸（例えば、8～15アミノ酸もしくは8～13アミノ酸、例えば、約8アミノ酸、約9アミノ酸、約10アミノ酸、約11アミノ酸、約12アミノ酸、約13アミノ酸、約14アミノ酸、約15アミノ酸、もしくは、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、もしくはそれ以上）および/またはジャンクションのすぐN末端側にある約8～24アミノ酸（例えば、8～15アミノ酸もしくは8～13アミノ酸、例えば、約8アミノ酸、約9アミノ酸、約10アミノ酸、約11アミノ酸、約12アミノ酸、約13アミノ酸、約14アミノ酸、約15アミノ酸、もしくは、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、もしくはそれ以上）の連続配列の複数の個々のオーバーラップペプチド断片が含まれ得る。ペプチド断片は、各々、2個のドメインのジャンクションを含むかまたはそれにかかっていてよい。従って、いくつかのケースにおいて、ジャンクション領域は、HLA分子に対する結合親和性を示し、かつ/または免疫応答を誘導することができる複数の可能性のあるペプチドエピトープを含有していてよい。 Exemplary Methods of Dosing of the Second Chimeric Receptor In some embodiments, the method develops an immune response to the first chimeric receptor and / or is immune to the first chimeric receptor. Includes administration of a second chimeric receptor to subjects who are likely to be primary. In some embodiments, the first chimeric receptor contains a junction region of immunogenic first and second domains. In some embodiments, the immunogenic region comprises one or more peptide epitopes (also referred to as T cell epitopes). In some cases, a junction region containing a potential peptide epitope across a junction of two domains can be immunogenic and to the subject of a chimeric receptor containing the junction region. Can result in the generation of an immune response upon administration of. In some embodiments, the junction region contains approximately 8-24 amino acids (eg, 8-15 amino acids or 8) immediately on the C-terminal side of the junction that joins the first and second domains of the chimeric receptor. ~ 13 amino acids, for example, about 8 amino acids, about 9 amino acids, about 10 amino acids, about 11 amino acids, about 12 amino acids, about 13 amino acids, about 14 amino acids, about 15 amino acids, or 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 Amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, 15 amino acids, or more) and / or about 8 to 24 amino acids (eg, 8 to 15 amino acids or 8 to 13 amino acids, eg, about) just on the N-terminal side of the junction. 8 amino acids, about 9 amino acids, about 10 amino acids, about 11 amino acids, about 12 amino acids, about 13 amino acids, about 14 amino acids, about 15 amino acids, or 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids , 14 amino acids, 15 amino acids, or more) may contain multiple individual overlapping peptide fragments. Each peptide fragment may contain or span a junction of two domains. Thus, in some cases, the junction region may contain multiple potential peptide epitopes that exhibit binding affinity for HLA molecules and / or can induce an immune response.

いくつかの態様において、キメラ受容体のジャンクション領域のような免疫原性領域を同定することができる。いくつかの態様において、MHC分子に結合する能力または一定の条件の下で免疫応答を誘発する能力によって、免疫原性領域を同定することができる。いくつかの態様において、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、または15アミノ酸長のような、8アミノ酸長～20アミノ酸長のオーバーラップペプチドのような、キメラ受容体のオーバーラップペプチドを、下記のようなアルゴリズムまたはその他の計算法を使用して、MHC結合について査定することができる。いくつかの態様において、キメラ受容体（例えば、CAR）によって遺伝学的に改変された細胞を投与された対象のような、それが投与された対象において、免疫応答を査定することによって、免疫原性であるか否かを決定するため、キメラ受容体を査定することができる。免疫応答を査定する例示的な方法は、以下に記載される。 In some embodiments, immunogenic regions such as junction regions of chimeric receptors can be identified. In some embodiments, immunogenic regions can be identified by their ability to bind to MHC molecules or elicit an immune response under certain conditions. In some embodiments, overlapping peptides of 8 to 20 amino acids long, such as 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, or 15 amino acids. Overlapping peptides of such chimeric receptors can be assessed for MHC binding using algorithms such as the following or other computational methods. In some embodiments, an immunogen by assessing an immune response in a subject to which it has been administered, such as a subject to which cells genetically modified by a chimeric receptor (eg, CAR) have been administered. Chimeric receptors can be assessed to determine if they are sex. Exemplary methods for assessing immune response are described below.

いくつかの態様において、少なくとも1種のペプチドエピトープは、細胞機構によってプロセシングされたペプチドを含むポリペプチドのペプチド断片と、いくつかのケースにおいて、複合体を形成することができる多形のペプチド結合部位または結合溝を含有している分子である、クラスIまたはクラスIIのタンパク質のような、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合することができる。いくつかの態様において、ペプチドエピトープは、ヒトMHC分子であるMHC分子に結合することができる。いくつかの態様において、MHC分子は、ヒト白血球抗原（HLA）分子である。いくつかの態様において、少なくとも1種のペプチドエピトープは、HLAクラスI分子またはHLAクラスII分子のようなHLA分子に対する結合親和性（例えば、IC50）を示す。いくつかの態様において、参照キメラ受容体のジャンクション領域は、1000nM未満、500nM未満、または50nM未満の結合親和性を示すペプチドエピトープを含有している。 In some embodiments, the at least one peptide epitope is a polymorphic peptide binding site capable of forming a complex with a peptide fragment of a polypeptide, including a peptide processed by a cellular mechanism, in some cases. Alternatively, it can bind to major histocompatibility complex (MHC) molecules, such as class I or class II proteins, which are molecules containing binding grooves. In some embodiments, the peptide epitope can bind to an MHC molecule, which is a human MHC molecule. In some embodiments, the MHC molecule is a human leukocyte antigen (HLA) molecule. In some embodiments, the at least one peptide epitope exhibits a binding affinity for an HLA molecule such as an HLA class I molecule or an HLA class II molecule (eg, IC50). In some embodiments, the junction region of the reference chimeric receptor contains a peptide epitope that exhibits a binding affinity of less than 1000 nM, less than 500 nM, or less than 50 nM.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体のジャンクション領域の少なくとも1種または複数種のペプチドエピトープは、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの態様において、MHCクラスII分子に結合するペプチドは、8～20アミノ酸長、例えば、10～17アミノ酸長であってよい。いくつかの態様において、MHCクラスII分子に結合するペプチドは、20アミノ酸より長くてもよい。いくつかの態様において、ペプチドは、MHC IIペプチド結合溝に沿って拡張型（extended）コンフォメーションで存在する。いくつかの態様において、MHC IIペプチド結合溝は、両端が開放されている。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも一部分、ペプチド結合溝を裏打ちする保存された残基との主鎖原子接触によって適所に保持される。いくつかの態様において、MHCクラスII対立遺伝子は、ヒト対象のような対象に存在することが公知の任意のものであってよい。いくつかの態様において、MHC対立遺伝子は、DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8、およびDP1であってよいが、これらに限定されない。いくつかの態様において、MHCクラスII対立遺伝子は、表1Bに示された任意のものであってよい。いくつかの態様において、MHCクラスII対立遺伝子は、HLA-DRB1^*0101、HLA-DRB^*0301、HLA-DRB^*0701、HLA-DRB^*0401、HLA-DQB1^*0201である。 In some embodiments, the peptide epitope of at least one or more of the junction regions of the reference chimeric receptor is an MHC class II epitope. In some embodiments, the peptide that binds to the MHC class II molecule may be 8-20 amino acids long, eg 10-17 amino acids long. In some embodiments, the peptide that binds to MHC class II molecules may be longer than 20 amino acids. In some embodiments, the peptide is present in an extended conformation along the MHC II peptide bond groove. In some embodiments, the MHC II peptide bond groove is open at both ends. In some embodiments, the peptide is retained in place by main chain atomic contact with conserved residues that line the peptide bond groove, at least in part. In some embodiments, the MHC class II allele may be any known to be present in a subject, such as a human subject. In some embodiments, the MHC allele may be, but is not limited to, DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8, and DP1. In some embodiments, the MHC class II allele may be any of those shown in Table 1B. In some embodiments, the MHC class II alleles are HLA-DRB1 ^* 0101, HLA-DRB ^* 0301, HLA-DRB ^* 0701, HLA-DRB ^* 0401, HLA-DQB1 ^* 0201.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体のジャンクション領域の少なくとも1種のペプチドエピトープは、MHCクラスIエピトープである。いくつかの態様において、MHCクラスI分子に結合するペプチドは、7～15アミノ酸長であってよい。いくつかの態様において、MHCクラスI分子に結合するペプチドは、8～13アミノ酸長であってよい。いくつかの態様において、ペプチドの結合は、ペプチドの主鎖の原子と、全てのMHCクラスI分子のペプチド結合溝にある不変部位との間の接触によって、2個の末端において安定化される。いくつかの態様において、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に結合する溝の両端に不変部位が存在する。いくつかの態様において、ペプチド長の変動は、ねじれによってペプチド骨格に適応する。いくつかの態様において、ねじれは、可動性を可能にすることができるプロリン残基またはグリシン残基を含む。いくつかの態様において、MHCクラスI対立遺伝子は、ヒト対象のような対象に存在することが公知の任意のものであってよい。いくつかの態様において、MHCクラスI対立遺伝子は、HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45、またはHLA-Cw8対立遺伝子である。いくつかの態様において、MHCクラスI対立遺伝子は、最も高頻度のMHCクラスI対立遺伝子に含まれる、表1Aに示された任意のものであってよい（Solberg et al.,(2008)Hum Immunol.2008 Jul;69(7):443-6）。いくつかの態様において、HLAクラスI対立遺伝子は、HLA-A^*02:01、HLA-A^*03:01、HLA-A^*11:01、またはHLA-B^*08:01である。 In some embodiments, the peptide epitope of at least one of the junction regions of the reference chimeric receptor is an MHC class I epitope. In some embodiments, the peptide that binds to the MHC class I molecule may be 7-15 amino acids long. In some embodiments, the peptide that binds to the MHC class I molecule may be 8-13 amino acids long. In some embodiments, peptide binding is stabilized at the two ends by contact between the atoms of the peptide backbone and the invariant sites in the peptide bond groove of all MHC class I molecules. In some embodiments, there are invariant sites at both ends of the groove that binds to the amino and carboxy terminus of the peptide. In some embodiments, fluctuations in peptide length adapt to the peptide backbone by twisting. In some embodiments, the twist comprises a proline or glycine residue that can allow mobility. In some embodiments, the MHC class I allele may be any known to be present in a subject, such as a human subject. In some embodiments, the MHC class I allelic genes are HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA. -B45, or HLA-Cw8 allogeneic gene. In some embodiments, the MHC class I allele may be any of those shown in Table 1A, among the most frequent MHC class I alleles (Solberg et al., (2008) Hum Immunol. .2008 Jul; 69 (7): 443-6). In some embodiments, the HLA class I allele is HLA-A ^* 02:01, HLA-A ^* 03:01, HLA-A ^* 11:01, or HLA-B ^* 08:01.

いくつかの態様において、MHCクラスI対立遺伝子は、いくつかの集団において、集団のおよそ50％によって発現されている、HLA-A2対立遺伝子である。いくつかの態様において、HLA-A2対立遺伝子は、HLA-A^*0201、^*0202、^*0203、^*0206、または^*0207遺伝子産物であってよい。いくつかのケースにおいて、異なる集団の間には亜型の頻度の違いが存在し得る。例えば、いくつかの態様において、HLA-A2陽性コーカサス人集団の95％超が、HLA-A^*0201であるが、中国人集団においては、頻度が、およそ23％ HLA-A^*0201、45％ HLA-A^*0207、8％ HLA-A^*0206、および23％ HLA-A^*0203であることが報告されている。いくつかの態様において、MHC分子は、HLA-A^*0201である。 In some embodiments, the MHC class I allele is an HLA-A2 allele that is expressed by approximately 50% of the population in some populations. In some embodiments, the HLA-A2 allele may be the HLA-A ^* 0201, ^* 0202, ^* 0203, ^* 0206, or ^* 0207 gene product. In some cases, there may be differences in the frequency of subtypes between different populations. For example, in some embodiments, more than 95% of the HLA-A2-positive Caucasian population is HLA-A ^* 0201, whereas in the Chinese population, the frequency is approximately 23% HLA-A ^* 0201, 45%. It has been reported to be HLA-A ^* 0207, 8% HLA-A ^* 0206, and 23% HLA-A ^* 0203. In some embodiments, the MHC molecule is HLA-A ^* 0201.

いくつかの態様において、第2のキメラ受容体は、参照キメラ受容体の第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の8～24位のアミノ酸（例えば、8～15個または8～13個、例えば、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、または8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、またはそれ以上のアミノ酸）および/またはジャンクションのすぐN末端側の8～24位のアミノ酸（例えば、8～15個もしくは8～13個、例えば、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、または8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、またはそれ以上のアミノ酸）の1個または複数個のアミノ酸残基が、例えば、挿入、欠失、またはアミノ酸置換によって修飾されている、第1のキメラ受容体であり得る参照キメラ受容体のジャンクション領域と比較して修飾されたジャンクション領域を含有しているバリアントキメラ受容体である。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体のジャンクション領域と比較して、修飾されたジャンクション領域において、最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個のアミノ酸の違いまたは修飾を含有している。 In some embodiments, the second chimeric receptor is an amino acid at position 8-24 on the immediate C-terminal side of the junction that joins the first and second domains of the reference chimeric receptor (eg, 8- 15 or 8 to 13, for example, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, or 8, 9, 10 Amino acids at positions 8 to 24 (eg, 8 to 15 or 8 to 13) on the immediate N-terminal side of the, 11, 12, 13, 14, 15, or more amino acids and / or junctions. For example, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, or about 8, 9, 9, 10, 11, 12 A first chimeric receptor in which one or more amino acid residues (th, 13, 14, 15, or more amino acids) are modified, for example, by insertion, deletion, or amino acid substitution. A variant chimeric receptor containing a modified junction region as compared to the junction region of a reference chimeric receptor that may be a body. In some embodiments, the variant chimeric receptor has a maximum of 1, 2, 3, 4, 5, 6, in the modified junction region as compared to the junction region of the reference chimeric receptor. Contains 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15, 16, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acid differences or modifications are doing.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体の第1のドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するドメインを含有し、かつ/または参照キメラ受容体の第2のドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するドメインを含有している。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体の第1のドメインと配列が同一であるドメインを含有し、かつ参照キメラ受容体の第2のドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有するドメインを含有している。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体の第1のドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有するドメインを含有し、かつ参照キメラ受容体の第2のドメインと配列が同一であるドメインを含有している。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体に存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含有している部分において、参照キメラ受容体の第1のドメインおよび/または第2のドメインと比較して、修飾されている。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 relative to the first domain of the reference chimeric receptor. %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more contains domains with sequence identity and / or at least relative to the second domain of the reference chimeric receptor. 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequences Contains domains with identity. In some embodiments, the variant chimeric receptor contains a domain that is sequence identical to the first domain of the reference chimeric receptor and is at least 85%, 86% of the second domain of the reference chimeric receptor. %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher sequence identity Contains a domain. In some embodiments, the variant chimeric receptor is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 relative to the first domain of the reference chimeric receptor. Contains domains with a%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher sequence identity and is sequence identical to the second domain of the reference chimeric receptor. Contains a domain. In some embodiments, where at least one or both of the domains present on the variant chimeric receptor contains a modified junction region, the first domain and / or the second domain of the reference chimeric receptor. Compared to, it is modified.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体と比較して、最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個のアミノ酸の違いまたは修飾（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換）を含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, relative to the reference chimeric receptor. It has 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity. In some embodiments, the variant chimeric receptor is up to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 compared to the reference chimeric receptor. Differences or modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions of amino acids) of, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acids. ) Is contained.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体（例えば、参照CAR）の第1および/または第2のドメインは、天然内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のタンパク質のドメインもしくはその機能部分に対して100％の同一性を有するドメインである。いくつかの態様において、第1のドメインおよび第2のドメインは、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しない。いくつかの態様において、第1のドメインおよび第2のドメインは、単一の天然または内在性のヒトタンパク質またはヒトポリペプチドに存在しない。 In some embodiments, the first and / or second domain of a reference chimeric receptor (eg, reference CAR) is a domain of a naturally occurring human protein, or a domain of a naturally occurring or endogenous protein or a functional portion thereof. It is a domain that has 100% identity with respect to. In some embodiments, the first domain and the second domain are not present on the same molecule in vivo in human subjects. In some embodiments, the first and second domains are not present in a single native or endogenous human protein or polypeptide.

いくつかの態様において、第1および/または第2のドメインは、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、もしくは細胞内シグナル伝達ドメイン、もしくはそれらの機能性部分であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BB、もしくはICOSの共刺激シグナル伝達ドメインのような共刺激シグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体（TCR）成分であるかもしくはそれを含み、かつ/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有しているドメインのような活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかもしくはそれを含む。いくつかのケースにおいて、活性化細胞質ドメインは、CD3ζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインもしくはその機能性バリアントもしくはシグナル伝達部分であるかまたはそれを含む。 In some embodiments, the first and / or second domain is or comprises an extracellular binding domain, a hinge domain, a transmembrane domain, or an intracellular signaling domain, or a functional portion thereof. In some embodiments, the intracellular signaling domain is or comprises a co-stimulating signaling domain such as CD28, 4-1BB, or the co-stimulating signaling domain of ICOS. In some embodiments, the intracellular signaling domain is such as a domain that is or contains a T cell receptor (TCR) component and / or contains an immunoreceptor activated tyrosine motif (ITAM). It is or contains an activated cytoplasmic signaling domain. In some cases, the activated cytoplasmic domain is or comprises a cytoplasmic signaling domain of the CD3ζ chain or a functional variant or signaling portion thereof.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体はCARである。いくつかの態様において、CARのようなキメラ受容体は、N末端からC末端へ順に、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有している。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン（例えば、TCRのかつ/もしくはITAMを含有している成分、例えば、CD3ζシグナル伝達ドメイン）であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、CD28、4-1BB、もしくはICOSのシグナル伝達ドメイン）であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインもしくは活性化シグナル伝達ドメインの一方のみを含有しているか、またはいずれかの順に両方のドメインを含有している。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化シグナル伝達ドメインの両方を含有している。 In some embodiments, the reference chimeric receptor is CAR. In some embodiments, a chimeric receptor such as CAR contains an extracellular ligand binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, in order from N-terminus to C-terminus. In some embodiments, the intracellular signaling domain is or comprises an activation signaling domain (eg, a component of the TCR and / or containing ITAM, eg, the CD3ζ signaling domain). In some embodiments, the intracellular signaling domain is or comprises a costimulatory signaling domain (eg, CD28, 4-1BB, or ICOS signaling domain). In some embodiments, the intracellular signaling domain contains only one of the co-stimulating signaling domain or the activating signaling domain, or contains both domains in either order. In some embodiments, the intracellular signaling domain contains both a co-stimulating signaling domain and an activating signaling domain.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、N末端からC末端へ順に、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインの一部として各々単独でまたはいずれかの順に、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、CD28、4-1BB、もしくはICOS）および/または活性化シグナル伝達ドメイン（例えば、TCRのかつ/もしくはITAMを含有している成分、例えば、CD3ζシグナル伝達ドメイン）を任意で含んでいてよい細胞内シグナル伝達ドメインを含有していてもよく、バリアントキメラ受容体は、ジャンクションのいずれかの側（N末端側および/またはC末端側）にある8～24アミノ酸（例えば、8～15アミノ酸または8～13アミノ酸、例えば、約8アミノ酸、約9アミノ酸、約10アミノ酸、約11アミノ酸、約12アミノ酸、約13アミノ酸、約14アミノ酸、約15アミノ酸、または8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、またはそれ以上）の連続部分の中の1個または複数個のアミノ酸残基において修飾を含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptors, in order from the N-terminal to the C-terminal, co-operate alone or in order as part of the extracellular ligand binding domain, transmembrane domain, and intracellular signaling domain, respectively. Optionally, a stimulating signaling domain (eg, CD28, 4-1BB, or ICOS) and / or an activating signaling domain (eg, a component of TCR and / or containing ITAM, eg, CD3ζ signaling domain). It may contain an intracellular signaling domain that may be included, and the variant chimeric receptor is an 8-24 amino acid (eg, 8) located on either side of the junction (N-terminal and / or C-terminal). ~ 15 amino acids or 8 ~ 13 amino acids, such as about 8 amino acids, about 9 amino acids, about 10 amino acids, about 11 amino acids, about 12 amino acids, about 13 amino acids, about 14 amino acids, about 15 amino acids, or 8 amino acids, 9 amino acids, Contains modifications at one or more amino acid residues in the contiguous portion of 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, 15 amino acids, or more.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体の特色は、下記のサブセクションIIIに記載される任意のものであってよい。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体の特色は、バリアントキメラ受容体が、記載されたような修飾されたジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有していること以外は、下記のサブセクションIIIに記載される任意のものであってもよい。 In some embodiments, the characteristics of the reference chimeric receptor may be any of those described in Subsection III below. In some embodiments, the variant chimeric receptor is characterized by the variant chimeric receptor being modified (eg, inserted, deleted, or substituted) in one or more modified junction regions as described. Other than being contained, it may be any of those described in Subsection III below.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、記載されたような参照キメラ受容体のジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有している修飾されたジャンクション領域を含有しており、参照キメラ受容体は、ジャンクションにおいて連続配列へと接合された、細胞外リガンド結合ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第1のドメインと、ヒンジドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第2のドメインとを含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified to contain one or more modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions) in the junction region of the reference chimeric receptor as described. The reference chimeric receptor contains a junction region and the reference chimeric receptor is a hinge domain or a first domain that is or is part of or contains an extracellular ligand binding domain or a continuation sequence at the junction. It contains a second domain that is part of or contains it.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、記載されたような参照キメラ受容体のジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有している修飾されたジャンクション領域を含有しており、参照キメラ受容体は、ジャンクションにおいて連続配列へと接合された、ヒンジドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第1のドメインと、膜貫通ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第2のドメインとを含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified to contain one or more modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions) in the junction region of the reference chimeric receptor as described. The reference chimeric receptor contains a junction region, and the reference chimeric receptor is a first domain that is or is part of or contains a hinge domain or a part thereof, and a transmembrane domain or one thereof, which is joined to a continuous sequence at the junction. Contains a second domain that is or contains a moiety.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、記載されたような参照キメラ受容体のジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有している修飾されたジャンクション領域を含有しており、参照キメラ受容体は、ジャンクションにおいて連続配列へと接合された、膜貫通ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第1のドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第2のドメインとを含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified to contain one or more modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions) in the junction region of the reference chimeric receptor as described. The reference chimeric receptor contains a junction region, and the reference chimeric receptor is a co-stimulation signaling domain with a first domain that is or is part of or contains a transmembrane domain or a continuation sequence at the junction. Or it contains a second domain that is or is part of it.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、記載されたような参照キメラ受容体のジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有している修飾されたジャンクション領域を含有しており、参照キメラ受容体は、ジャンクションにおいて連続配列へと接合された、共刺激シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第1のドメインと、活性化細胞質シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第2のドメインとを含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified to contain one or more modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions) in the junction region of the reference chimeric receptor as described. Containing a junction region, the reference chimeric receptor is the activated cytoplasm with a first domain that is or is part of or contains a co-stimulation signaling domain or part thereof, which is conjugated to a continuous sequence at the junction. It contains a signal transduction domain or a second domain that is part of or contains it.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体の第1のドメインは、膜貫通ドメインまたはその一部であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインには、T細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD 154に由来する（即ち、それらの膜貫通領域を少なくとも含む）もの、および/またはそれらの構造的特性、例えば、膜貫通特性を有する実質的な部分を保持するもののような、それらの機能性バリアントを含有している膜貫通領域が含まれる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD4、CD28、もしくはCD8、例えば、CD8αに由来する膜貫通ドメイン、またはそれらの機能性バリアントである。いくつかの態様において、参照キメラ受容体の第2のドメインは、膜貫通ドメインに直接連結されているかもしくは接合されている共刺激シグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、およびICOSのシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。 In some embodiments, the first domain of the reference chimeric receptor is or comprises a transmembrane domain or a portion thereof. In some embodiments, the transmembrane domain contains the α, β, or ζ chains of the T cell receptor, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64. , CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154 (ie, including at least their transmembrane regions) and / or retain their structural properties, eg, substantial portions with transmembrane properties. Includes transmembrane regions containing those functional variants, such as those that do. In some embodiments, the transmembrane domain is a CD4, CD28, or CD8, eg, a transmembrane domain derived from CD8α, or a functional variant thereof. In some embodiments, the second domain of the reference chimeric receptor is or comprises a co-stimulation signaling domain that is directly linked or attached to a transmembrane domain. In some embodiments, the co-stimulation signaling domain is or comprises the signaling domain of CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, and ICOS.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、記載されたような参照キメラ受容体のジャンクション領域における1個または複数個の修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）を含有している修飾されたジャンクション領域を含有しており、参照キメラ受容体は、ジャンクションにおいて連続配列へと接合された、CD28膜貫通ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第1のドメインと、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるかまたはそれを含む第2のドメインとを含有している。いくつかの態様において、CD28膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:2、103、もしくは104に示されたアミノ酸の配列であるかもしくはそれを含むか、またはSEQ ID NO:2、103、もしくは104に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むそれらの機能性部分もしくはバリアントである。いくつかの態様において、4-1BBシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むそれらの機能性部分もしくはバリアントであるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、第1のドメインおよび第2のドメインは、共に、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:5に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むそれらの機能性部分もしくはバリアントを含むかまたは有する。いくつかの態様において、参照キメラ受容体の第1のドメインおよび第2のドメインは、共に、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列を有するかまたは含む。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified to contain one or more modifications (eg, insertions, deletions, or substitutions) in the junction region of the reference chimeric receptor as described. The reference chimeric receptor contains a junction region, and the reference chimeric receptor is co-stimulated with a first domain that is or is part of or contains a CD28 transmembrane domain, which is conjugated to a continuous sequence at the junction. It contains a stimulus signaling domain or a second domain that is part of or contains it. In some embodiments, the CD28 transmembrane domain is or contains the sequence of amino acids set forth in SEQ ID NO: 2, 103, or 104, or is assigned to SEQ ID NO: 2, 103, or 104. At least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more. These functional parts or variants, including the sequences showing the above sequence identity. In some embodiments, the 4-1BB signaling domain is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89 relative to the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 3. %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more of those functional moieties containing sequences exhibiting sequence identity or It is a variant or contains it. In some embodiments, the first and second domains are both at least 85%, 86%, 87% of the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 5. , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more. Contains or has those functional parts or variants. In some embodiments, the first and second domains of the reference chimeric receptor both have or contain the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、SEQ ID NO:137に対して100％より小さいが85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、または96％より大きい配列同一性を有し、かつ修飾を含む、修飾されたジャンクション領域を含む。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、SEQ ID NO:5に対して100％より小さいが85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、または96％より大きい配列同一性を有し、かつ修飾を含む、アミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、各々修飾を含む、SEQ ID NO:138～157のいずれかに示されたアミノ酸の配列、SEQ ID NO:138～157のいずれかに示されたアミノ酸の配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、もしくは96％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むそれらの機能性バリアント、またはそれらの機能性部分を有するかまたは含む。 In some embodiments, the variant chimeric receptor is less than 100% for SEQ ID NO: 137 but 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93. Includes a modified junction region that has greater than%, 94%, 95%, or 96% sequence identity and contains modifications. In some embodiments, the variant chimeric receptor is less than 100% for SEQ ID NO: 5, but 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93. Has or contains an amino acid sequence that has greater than%, 94%, 95%, or 96% sequence identity and contains modifications. In some embodiments, the variant chimeric receptor comprises the sequence of amino acids set forth in any of SEQ ID NO: 138-157, each comprising modification, the amino acid set forth in any of SEQ ID NO: 138-157. Of amino acids that exhibit at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, or 96% sequence identity to the sequence of Have or include those functional variants, including sequences, or their functional parts.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、CD28膜貫通ドメインのような膜貫通ドメインにおいて、疎水性アミノ酸残基における修飾もしくは疎水性アミノ酸残基の修飾、または疎水性部分の中の修飾を含有していない。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、CD28膜貫通ドメインのような膜貫通ドメインにおいて、疎水性アミノ酸残基における修飾もしくは疎水性アミノ酸残基の修飾、または疎水性部分の中の修飾を1個または複数個含有している。いくつかの態様において、1個または複数個の修飾は、疎水性アミノ酸のもう一つの異なる疎水性アミノ酸残基への置換であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、1個または複数個の修飾は、もう一つの疎水性アミノ酸残基への置換以外の、膜貫通ドメインにおける、疎水性アミノ酸残基における修飾もしくは疎水性アミノ酸残基の修飾、もしくは疎水性部分の中の修飾ではないかまたはそれを含まない。 In some embodiments, the variant chimeric receptor comprises a modification in a hydrophobic amino acid residue or a modification in a hydrophobic amino acid residue, or a modification within a hydrophobic moiety, in a transmembrane domain such as the CD28 transmembrane domain. Not done. In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified in a hydrophobic amino acid residue or in a hydrophobic amino acid residue, or in a hydrophobic moiety, in a transmembrane domain such as the CD28 transmembrane domain. Contains one or more. In some embodiments, the modification is or comprises the substitution of a hydrophobic amino acid with another different hydrophobic amino acid residue. In some embodiments, the modification of one or more is a modification of a hydrophobic amino acid residue or a modification of a hydrophobic amino acid residue in a transmembrane domain, other than substitution with another hydrophobic amino acid residue. Or it is not a modification in the hydrophobic part or does not include it.

いくつかのケースにおいて、膜貫通ドメインは、膜の脂質二重層と相互作用する1個または複数個のトリプトファン残基を含有している。いくつかのケースにおいて、1個または複数個のトリプトファン残基は、脂質水界面の近くに位置していてよい。いくつかのケースにおいて、1個または複数個のトリプトファン残基は、膜貫通ドメインを膜内にアンカリングするかまたはそのアンカリングを支援する。例えば、de Jesus and Allen,Biochim Biophys Acta.2013 Feb;1828(2):864-76を参照すること。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、CD28膜貫通ドメインのような膜貫通ドメインにおいてトリプトファン残基の一方または両方に修飾を含有していない。いくつかの態様において、キメラ受容体は、各々、参照キメラ受容体におけるトリプトファンに相当する、SEQ ID NO:5のナンバリングに基づく2位および/または26位に相当するアミノ酸位置に、修飾を含有していない。 In some cases, the transmembrane domain contains one or more tryptophan residues that interact with the lipid bilayer of the membrane. In some cases, one or more tryptophan residues may be located near the lipid water interface. In some cases, one or more tryptophan residues anchor or assist in anchoring the transmembrane domain intramembrane. See, for example, de Jesus and Allen, Biochim Biophys Acta. 2013 Feb; 1828 (2): 864-76. In some embodiments, the variant chimeric receptor does not contain a modification in one or both of the tryptophan residues in a transmembrane domain such as the CD28 transmembrane domain. In some embodiments, the chimeric receptor contains a modification at the amino acid position corresponding to the 2- and / or 26-position based on the SEQ ID NO: 5 numbering, which corresponds to tryptophan in the reference chimeric receptor, respectively. Not.

いくつかの態様において、参照キメラ受容体の膜貫通ドメインに相当するバリアントキメラ受容体のドメインは、実質的に疎水性のヒドロパシープロファイルを有し、かつ/または1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、もしくはそれ以上のヒドロパシー（GRAVY）値の全体平均を有する。 In some embodiments, the domain of the variant chimeric receptor, which corresponds to the transmembrane domain of the reference chimeric receptor, has a substantially hydrophobic hydropathic profile and / or 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0. , 2.1, 2.2, or higher overall average of hydropathy (GRAVY) values.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、4-1BBシグナル伝達に関与するかまたはそのために必要なアミノ酸残基における修飾またはそれらのアミノ酸残基の修飾のような、共刺激シグナル伝達ドメインのシグナル伝達に関与するかまたはそのために必要なアミノ酸残基における修飾またはそれらのアミノ酸残基の修飾を含有していない。一般に、共刺激シグナル伝達は、TRAF分子との相互作用を含む。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、TRAF分子と相互作用するか、またはTRAF分子との結合のための結合モチーフの一部であるアミノ酸残基における修飾またはそれらのアミノ酸残基の修飾を含有していない。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、モチーフ(P/S/A/T)X(Q/E)Eを含む参照キメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基における修飾またはそれらのアミノ酸残基の修飾を含有していない。いくつかの態様において、TRAF分子は、TRAF1、TRAF2、および/またはTRAF3である。いくつかの態様において、参照キメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインに相当するバリアントキメラ受容体のドメインは、TRAFの活性化または細胞局在を誘導することができ、かつ/またはTRAFによって媒介されるシグナル伝達を誘導することができる。いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、各々SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく49～52に相当する位置にアミノ酸TTQEを含有し、かつ/または残基60～63に相当する位置にアミノ酸PEEEを含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor signals in the costimulatory signaling domain, such as modifications at amino acid residues involved in or required for 4-1BB signaling or modifications of those amino acid residues. It does not contain modifications in amino acid residues that are involved in or necessary for transmission or modifications of those amino acid residues. In general, co-stimulation signaling involves interaction with TRAF molecules. In some embodiments, the variant chimeric receptor interacts with a TRAF molecule or modifies amino acid residues that are part of a binding motif for binding to a TRAF molecule or modifies those amino acid residues. Does not contain. In some embodiments, the variant chimeric receptor is modified at the amino acid residue of the co-stimulating signaling domain of the reference chimeric receptor, including the motif (P / S / A / T) X (Q / E) E, or theirs. Contains no modification of amino acid residues. In some embodiments, the TRAF molecule is TRAF1, TRAF2, and / or TRAF3. In some embodiments, the domain of the variant chimeric receptor, which corresponds to the co-stimulation signaling domain of the reference chimeric receptor, can induce TRAF activation or cell localization and / or is mediated by TRAF. It can induce signal transduction. In some embodiments, the variant chimeric receptor contains the amino acid TTQE at positions corresponding to 49-52 based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5, respectively, and / or corresponds to residues 60-63. It contains the amino acid PEEE at the position.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42またはアミノ酸残基15～40の部分の中に1個または複数個のアミノ酸修飾を含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor has one or more amino acid modifications within the portion of residues 13-42 or amino acid residues 15-40 based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5. Contains.

いくつかの態様において、修飾は、1個もしくは複数個のアミノ酸残基の挿入であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、1個または複数個の挿入は、ドメイン間のジャンクションに隣接しているアミノ酸残基の間になされる。いくつかの態様において、1個または複数個のアミノ酸挿入は、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づくアミノ酸残基27と28との間になされる。いくつかの態様において、1個または複数個の挿入は、最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、または15個のアミノ酸残基の挿入を含んでいてよい。いくつかの態様において、挿入は、1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸残基の挿入である。いくつかの態様において、挿入は、任意のアミノ酸残基になされる。いくつかの態様において、挿入は、アスパラギン（N）の挿入である。 In some embodiments, the modification is or comprises the insertion of one or more amino acid residues. In some embodiments, one or more insertions are made between amino acid residues flanking the junction between domains. In some embodiments, the insertion of one or more amino acids is made between amino acid residues 27 and 28 based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5. In some embodiments, one or more insertions are up to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9, 10, 11, 12 It may include insertions of 13, 14, 14 or 15 amino acid residues. In some embodiments, the insertion is the insertion of one, two, three, four, or five amino acid residues. In some embodiments, the insertion is made to any amino acid residue. In some embodiments, the insertion is the insertion of asparagine (N).

いくつかの態様において、修飾は、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基28、31、もしくは34に相当する残基における1個もしくは複数個のアミノ酸置換であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、任意の他のアミノ酸へのものであってよい。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、ロイシン（L）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、アラニン（A）、セリン（S）、またはヒスチジン（H）であるアミノ酸残基へのものである。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づくK28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、L34A、およびL34Sのうちの1個もしくは複数個であるかまたはそれらに相当する。 In some embodiments, the modification is or comprises one or more amino acid substitutions at the residue corresponding to residue 28, 31, or 34 based on the numbering set forth in SEQ ID NO: 5. .. In some embodiments, the amino acid substitution may be to any other amino acid. In some embodiments, the amino acid substitution is to an amino acid residue that is leucine (L), asparagine (N), glutamine (Q), alanine (A), serine (S), or histidine (H). .. In some embodiments, the amino acid substitution is one of K28A, K28H, K28L, K28Q, K28S, R31A, R31H, R31L, R31N, L34A, and L34S based on the numbering shown in SEQ ID NO: 5. Multiple or equivalent.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、参照キメラ受容体のジャンクション領域と比較して、2個以上、例えば、最大2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上のアミノ酸修飾を有する修飾されたジャンクション領域を含有している。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34Sの中から選択されるアミノ酸置換であるかまたはそれに相当する。 In some embodiments, the variant chimeric receptor has two or more, eg, up to 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8 compared to the junction region of the reference chimeric receptor. It contains modified junction regions with 1, 9, 10 or more amino acid modifications. In some embodiments, amino acid substitutions are K28Q / R31A, K28Q / R31N, K28Q / R31S, K28Q / L34A, K28Q / L34S, R31N / L34A, R31N / L34S, K28Q / R31N / L34A, K28Q / R31N / L34S. It is or corresponds to an amino acid substitution selected from among them.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、各々修飾を含む、SEQ ID NO:138～157のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する修飾されたジャンクション領域、SEQ ID NO:138～157のいずれかに示されたアミノ酸の配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、もしくは96％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むそれらの機能性バリアント、もしくはそれらの機能性部分を有するかまたは含む。 In some embodiments, the variant chimeric receptor has a modified junction region, SEQ ID NO: 138-157, having the sequence of amino acids set forth in any of SEQ ID NO: 138-157, each comprising modification. At least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, or 96% of any of the amino acid sequences shown. They have or contain functional variants thereof, including sequences of amino acids indicating sequence identity, or functional portions thereof.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、各々修飾を含む、SEQ ID NO:114～134のいずれかに示されたアミノ酸の配列、SEQ ID NO:114～134のいずれかに示されたアミノ酸の配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、もしくは96％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むそれらの機能性バリアント、もしくはそれらの機能性部分を有するかまたは含む。 In some embodiments, the variant chimeric receptor comprises the sequence of amino acids set forth in any of SEQ ID NO: 114-134, each comprising modification, the amino acid set forth in any of SEQ ID NO: 114-134. Of amino acids that exhibit at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, or 96% sequence identity to the sequence of Have or include those functional variants, including sequences, or their functional portions.

いくつかの態様において、バリアントキメラ受容体は、そのような領域のペプチド断片が、ヒト白血球抗原（HLA）に対してより低い結合親和性を示し、かつ/または領域が、例えば、対象への投与の後、低下した免疫原性を示すような、修飾されたジャンクション領域を含有している。 In some embodiments, the variant chimeric receptor shows that the peptide fragment of such a region has a lower binding affinity for human leukocyte antigen (HLA) and / or the region is administered, eg, to a subject. After that, it contains a modified junction region that exhibits reduced immunogenicity.

いくつかの態様において、修飾されたジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片は、参照キメラ受容体のジャンクション領域の相当する部分の配列を有するペプチド断片の、同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低い、HLA分子に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、参照キメラ受容体のジャンクション領域の相当する部分のペプチド断片は、1000nM未満、500nM未満、または50nM未満の結合親和性を有する。 In some embodiments, the peptide fragment having the sequence of the 8-15 amino acid portion of the modified junction region is the same human leukocyte antigen (HLA) of the peptide fragment having the sequence of the corresponding portion of the junction region of the reference chimeric receptor. ) Has a binding affinity for HLA molecules, which is lower than the binding affinity for molecules. In some embodiments, the peptide fragment of the corresponding portion of the junction region of the reference chimeric receptor has a binding affinity of less than 1000 nM, less than 500 nM, or less than 50 nM.

いくつかの態様において、修飾されたジャンクション領域の中の全ての8～15アミノ酸断片、または全ての8、9、10、11、12、13、14、もしくは15アミノ酸断片の、ヒトHLA分子に対する結合親和性の平均は、参照キメラ受容体のジャンクション領域の中の全ての8～15アミノ酸断片、または全ての8、9、10、11、12、13、14、もしくは15アミノ酸断片の結合親和性の平均より低い。いくつかの態様において、結合親和性または結合親和性の平均は、2倍超、5倍超、10倍超、25倍超、50倍超、または100倍超、低い。 In some embodiments, the binding of all 8-15 amino acid fragments, or all 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid fragments within a modified junction region to a human HLA molecule. The average affinity is the binding affinity of all 8-15 amino acid fragments within the junction region of the reference chimeric receptor, or all 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid fragments. Lower than average. In some embodiments, the binding affinity or the average binding affinity is greater than 2-fold, greater than 5-fold, greater than 10-fold, greater than 25-fold, greater than 50-fold, or greater than 100-fold, low.

いくつかの態様において、1000nM未満のヒト白血球抗原（HLA）に対する結合親和性を有する修飾されたジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数は、同一のHLAとの結合について同一の親和性を有する参照キメラ受容体のジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数と比較して、低下している。いくつかの態様において、500nM未満のヒト白血球抗原（HLA）に対する結合親和性を有する修飾されたジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数は、同一のHLAとの結合について同一の親和性を有する参照キメラ受容体のジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数と比較して、低下している。いくつかの態様において、50nM未満のヒト白血球抗原（HLA）に対する結合親和性を有する修飾されたジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数は、同一のHLAとの結合について同一の親和性を有する参照キメラ受容体のジャンクション領域の8～15アミノ酸部分の配列を有するペプチド断片の数と比較して、低下している。 In some embodiments, the number of peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties of a modified junction region with binding affinity for human leukocyte antigen (HLA) <1000 nM is the same for binding to the same HLA. It is reduced compared to the number of peptide fragments having the sequence of the 8-15 amino acid portion of the junction region of the reference chimeric receptor having an affinity for. In some embodiments, the number of peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties of a modified junction region with binding affinity for human leukocyte antigen (HLA) <500 nM is the same for binding to the same HLA. It is reduced compared to the number of peptide fragments having the sequence of the 8-15 amino acid portion of the junction region of the reference chimeric receptor having an affinity for. In some embodiments, the number of peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties of a modified junction region with binding affinity for human leukocyte antigen (HLA) <50 nM is the same for binding to the same HLA. It is reduced compared to the number of peptide fragments having the sequence of the 8-15 amino acid portion of the junction region of the reference chimeric receptor having an affinity for.

いくつかの態様において、結合親和性は、実験またはアルゴリズムによって決定され得る。いくつかの態様において、MHCに対するペプチドの結合親和性は、計算によって、例えば、定量的結合親和性モデルに基づくアルゴリズム（Lafuente and Reche(2009)Current Pharmaceutical Design,15:3209-3220）を使用することによって、決定され得る。いくつかの態様において、結合親和性は、インビトロアッセイにおいて決定され得る。 In some embodiments, the binding affinity can be determined experimentally or algorithmically. In some embodiments, the binding affinity of a peptide for MHC is calculated, for example, using an algorithm based on a quantitative binding affinity model (Lafuente and Reche (2009) Current Pharmaceutical Design, 15: 3209-3220). Can be determined by. In some embodiments, the binding affinity can be determined in an in vitro assay.

いくつかの態様において、MHC分子に対するペプチドの結合親和性の決定は、放射能または蛍光による競合結合アッセイを含む。例えば、Ettinger et al.,J.Immunol.160:2365(1998)を参照すること。いくつかの態様において、競合アッセイは、異なるペプチドの結合親和性の比較を与える。いくつかのMHC結合研究は、EBVによって形質転換された細胞株に由来する界面活性剤によって可溶化されたクラスI分子を利用している（例えば、Sette,A.,et al.,Mol Immunol,31(11):813-22(1994)を参照すること）。いくつかの態様において、競合アッセイは、天然に負荷されたMHCを含み、関心対象のMHC分子は、界面活性剤による溶解物の中の他のMHC分子から精製されてもよいし、または他のMHC分子との混合物として使用されてもよい。いくつかの態様において、当該MHC分子に対する高い親和性を有する放射標識ペプチドを同定することができる。いくつかの態様において、次いで、高親和性放射標識ペプチドと競合する能力によって、当該MHC分子に対する付加的な「試験」ペプチドの親和性を決定する。 In some embodiments, determining the binding affinity of a peptide for MHC molecules comprises a competitive binding assay by radioactivity or fluorescence. See, for example, Ettinger et al., J. Immunol. 160: 2365 (1998). In some embodiments, the competitive assay provides a comparison of the binding affinities of different peptides. Some MHC binding studies utilize Class I molecules solubilized by detergents from cell lines transformed with EBV (eg, Sette, A., et al., Mol Immunol, 31 (11): 813-22 (1994)). In some embodiments, the competitive assay comprises naturally loaded MHC, and the MHC molecule of interest may be purified from other MHC molecules in the detergent lysate, or other. It may be used as a mixture with MHC molecules. In some embodiments, radiolabeled peptides with high affinity for the MHC molecule can be identified. In some embodiments, the ability to compete with the high affinity radiolabeled peptide then determines the affinity of the additional "test" peptide for the MHC molecule.

いくつかの態様において、ペプチドの親和性の決定は、pH2～3で短期間インキュベートすることによって、適切なMHC対立遺伝子を発現する細胞からネイティブ結合ペプチドを「取り除く（stripped）」、例えば、「T2」細胞を使用した、再構成アッセイを含んでいてもよい。いくつかの態様において、同一のMHC対立遺伝子に対する推定MHC結合ペプチドの結合親和性を決定するため、取り除かれたMHCモノマーを、溶液中で、推定MHC結合ペプチド、β2ミクログロブリン、およびコンフォメーション依存性モノクローナル抗体と合わせることができる。いくつかの態様において、例えば、標識されたモノクローナルまたは蛍光標識された二次抗体のいずれかによって直接標識した後、試験結合ペプチドと共にインキュベートされた細胞と、試験結合ペプチドなしでインキュベートされた細胞との間の決定された蛍光強度の違いを、試験ペプチドの結合を決定するために使用することができる。 In some embodiments, the determination of peptide affinity is to "stripped" the natively bound peptide from cells expressing the appropriate MHC allele by short-term incubation at pH 2-3, eg, "T2". It may include a reconstitution assay using cells. In some embodiments, the removed MHC monomer is subjected to putative MHC-binding peptide, β2 microglobulin, and conformation dependence in solution to determine the binding affinity of the putative MHC-binding peptide for the same MHC allelic gene. Can be combined with monoclonal antibodies. In some embodiments, for example, cells directly labeled with either a labeled monoclonal or fluorescently labeled secondary antibody and then incubated with the test binding peptide and cells incubated without the test binding peptide. The determined difference in fluorescence intensity between can be used to determine the binding of the test peptide.

いくつかの態様において、MHC（例えば、HLA）分子に対する結合親和性は、参照ペプチドの結合の50％の阻害が観察される結合アッセイにおけるペプチドの濃度である、IC50によって表される。いくつかのケースにおいて、そのようなアッセイは、IC50値がK_D値に近似する条件（即ち、HLAタンパク質および標識されたペプチドの限界濃度）において実行され得る。いくつかの態様において、結合は、参照ペプチドに対して相対的に表され得る。 In some embodiments, the binding affinity for MHC (eg, HLA) molecules is represented by the IC50, which is the concentration of the peptide in the binding assay in which 50% inhibition of the binding of the reference peptide is observed. In some cases, such an assay can be performed under conditions where the _IC50 value is close to the KD value (ie, the critical concentration of HLA protein and labeled peptide). In some embodiments, the binding can be expressed relative to the reference peptide.

いくつかの態様において、結合親和性はインシリコの方法を使用して予測され得る。アルゴリズムまたはその他の計算の方法を使用してMHC結合についての結合親和性を予測するための例示的なインシリコの方法は、当技術分野において公知である（例えば、Marsh,et al.,The HLA Factsbook(Academic Press,2000)を参照すること）。いくつかの態様において、アルゴリズムは、関心対象のペプチドが所定のMHC分子に結合するか否かを予測するために使用され得る。例えば、Southwood,et al.,J.Immunol.160:3363(1998)；Honeyman,et al.,Nat.Biotechnol.16:966-969(1998)；Breisie,et al.,Bioinformatics 14:121-131(1998)、および「SYFPEITHI」アルゴリズム（Hans-Georg Rammensee,et al.,Immunogenetics(1999)50:213-219)、Zhang et al.,PLoS ONE 7(2):e30483.doi:10.1371/journal.pone.0030483,the Immune Epitope and Analysis Resource(IEDB)(Peters B,et al.PLoS Biology 3:379(2005)）、および「BIMAS」アルゴリズム（Parker,K.C .,M.A.Bednarek,and J.E.Coligan.J.Immunol.152:163(1994)）を参照すること。 In some embodiments, binding affinity can be predicted using in silico methods. Exemplary in silico methods for predicting binding affinity for MHC binding using algorithms or other computational methods are known in the art (eg, Marsh, et al., The HLA Factsbook). (See Academic Press, 2000). In some embodiments, the algorithm can be used to predict whether the peptide of interest binds to a given MHC molecule. For example, Southwood, et al., J.Immunol.160: 3363 (1998); Honeyman, et al., Nat.Biotechnol.16: 966-969 (1998); Breisie, et al., Bioinformatics 14: 121-131 (1998), and the "SYFPEITHI" algorithm (Hans-Georg Rammensee, et al., Immunogenetics (1999) 50: 213-219), Zhang et al., PLoS ONE 7 (2): e30483.doi: 10.1371 / journal. pone.0030483, the Immune Epitope and Analysis Resource (IEDB) (Peters B, et al.PLoS Biology 3: 379 (2005)), and the "BIMAS" algorithm (Parker, K.C., M.A. Bednarek, and J.E. Coligan.J. See Immunol. 152: 163 (1994)).

いくつかの態様において、IEDBから入手可能なものを含むアルゴリズム予測ツールは、ANN（Nielsen et al.(2003)Protein Sci.,12:1007-1017およびLundegaard et al.(2008)NAR,36:W509-512）、SMM（Peters and Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132）、およびcomblib（Sidney et al.(2008)Immuno Res.4:2）、またはコンセンサスツール（Kim,et al.(2012)Immune epitope database analysis resource,NARを参照すること。上記のいずれかからの予測を組み合わせる）を使用した1種または複数種の予測を使用する。 In some embodiments, algorithmic prediction tools, including those available from IEDB, include ANN (Nielsen et al. (2003) Protein Sci., 12: 1007-1017 and Lundegaard et al. (2008) NAR, 36: W509. -512), SMM (Peters and Sette (2005) BMC Bioinformatics, 6: 132), and comblib (Sidney et al. (2008) Immuno Res. 4: 2), or Consensus Tool (Kim, et al. (2012)) Use one or more predictions using the Immune epitope database analysis resource, NAR, which combines predictions from any of the above).

いくつかの態様において、抗原プロセシングの予測は、プロテアソーム切断についてのアルゴリズム（PaProC）を使用して達成され得る。Kuttler et al.,J.Mol.Biol.298(2000),417-429およびNussbaum et al.,Immunogenetics 53(2001),87-94を参照すること。 In some embodiments, prediction of antigen processing can be achieved using an algorithm for proteasome cleavage (PaProC). See Kuttler et al., J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429 and Nussbaum et al., Immunogenetics 53 (2001), 87-94.

いくつかの態様において、第2のキメラ受容体であり得るバリアントキメラ受容体は、第1のキメラ受容体であり得る参照キメラ受容体と比較して、検出可能な免疫応答の低下を示す。いくつかの態様において、免疫応答は体液性免疫応答である。いくつかの態様において、免疫応答は細胞性免疫応答である。いくつかの態様において、免疫応答は、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、またはそれ以上、低下する。いくつかの態様において、免疫応答はインビトロで査定される。いくつかの態様において、免疫応答は、キメラ受容体を発現する細胞の投与のような、キメラ受容体の対象への投与によって、インビボで査定される。いくつかの態様において、キメラ受容体に対する宿主免疫応答は、下記のように査定される。 In some embodiments, the variant chimeric receptor, which can be the second chimeric receptor, exhibits a detectable reduction in immune response as compared to the reference chimeric receptor, which can be the first chimeric receptor. In some embodiments, the immune response is a humoral immune response. In some embodiments, the immune response is a cell-mediated immune response. In some embodiments, the immune response is 1.5-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, 10-fold, 50-fold, 100-fold, or more. descend. In some embodiments, the immune response is assessed in vitro. In some embodiments, the immune response is assessed in vivo by administration of the chimeric receptor to a subject, such as administration of cells expressing the chimeric receptor. In some embodiments, the host immune response to the chimeric receptor is assessed as follows.

II.養子細胞療法における細胞の投与
提供される方法は、一般に、その成分が組換え分子、例えば、受容体によって特異的に認識されかつ/または処置される疾患または状態のような疾患または状態を有する対象へ、組換え分子、例えば、組換え受容体、例えば、CAR、その他のキメラ受容体、またはその他の抗原受容体、例えば、トランスジェニックTCRを発現する細胞の複数の用量を投与する工程を含む。投与は、一般に、疾患もしくは状態の一つまたは複数の症状の改善を達成し、かつ/または疾患もしくは状態もしくはその症状を処置するかもしくは防止する。 II. Administration of Cells in Adoptive Cell Therapy The methods provided generally include diseases or conditions such as those in which the component is specifically recognized and / or treated by a recombinant molecule, eg, a receptor. The step of administering to a subject having a recombinant molecule, eg, a recombinant receptor, eg, CAR, other chimeric receptor, or other antigen receptor, eg, a plurality of doses of cells expressing transgenic TCR. include. Administration generally achieves amelioration of one or more symptoms of the disease or condition and / or treats or prevents the disease or condition or its symptoms.

本明細書において使用されるように、「対象」とは、ヒトまたはその他の動物のような哺乳動物であり、典型的には、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、一回または複数回の投与または用量の前に、疾患または状態を標的とする治療剤によって処置されたことがある。いくつかの局面において、対象は、他の治療剤に対して難治性もしくは非応答性であるかまたは難治性もしくは非応答性になる。いくつかの態様において、対象は、難治性または非応答性になっていないが、例えば、対象が処置に対して難治性または抵抗性になるのを防止するため、予防的に、第2のまたは後の受容体を発現する細胞の投与が実施される。 As used herein, a "subject" is a mammal, such as a human or other animal, typically a human. In some embodiments, the subject has been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition prior to a single or multiple doses or doses. In some aspects, the subject becomes refractory or non-responsive or refractory or non-responsive to other therapeutic agents. In some embodiments, the subject is not refractory or non-responsive, but prophylactically, for example, to prevent the subject from becoming refractory or resistant to treatment, a second or second Administration of cells expressing the later receptors is performed.

いくつかの態様において、対象は、一回または複数回の投与の時点でまたはその直前に、持続性または再発性の疾患を有する。例えば、疾患は、化学療法、放射線、および/もしくは造血幹細胞移植（HSCT）、例えば、同種HSCTを含む、もう一つの治療的介入による処置の後に再発していてもよいし、またはそのような処置に対して難治性になっていてもよい。疾患または状態は、第2の投与の前にまたはその時点で、再発していてもよいし、または第1の投与もしくは用量の細胞に対して難治性になっていてもよい。いくつかの態様において、投与は、養子細胞療法以外の療法または養子細胞療法のようなもう一つの療法、例えば、別の受容体を発現する細胞の第1の投与に対して対象が抵抗性になっていたとしても、対象を有効に処置する。 In some embodiments, the subject has a persistent or recurrent disease at the time of one or more doses or shortly thereafter. For example, the disease may recur after treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), eg, allogeneic HSCT, or such treatment. It may be intractable to. The disease or condition may relapse before or at that time of the second dose, or may be refractory to the cells of the first dose or dose. In some embodiments, the administration is resistant to a therapy other than or adoptive cell therapy or another therapy such as adoptive cell therapy, eg, a first dose of cells expressing another receptor. Even if it does, treat the subject effectively.

いくつかの態様において、対象は、他の治療剤または細胞投与に対して応答性であり、治療剤または投与による処置は、疾患負荷を低減する。いくつかの局面において、対象は、最初は、治療剤または投与に対して応答性であるが、次第に、例えば、細胞治療の投与または第2の用量もしくは投与が実施される時点で、疾患または状態の再発を示す。いくつかの態様において、対象は再発していない。いくつかのそのような態様において、対象は、再発のリスクを有する、例えば、再発の高いリスクを有すると決定され、従って、例えば、再発の可能性を低下させるかまたは再発を防止するため、予防的に細胞が投与される。 In some embodiments, the subject is responsive to other therapeutic agents or cell administration, and treatment with the therapeutic agent or administration reduces the disease burden. In some aspects, the subject is initially responsive to a therapeutic agent or administration, but gradually, for example, at the time of administration of cell therapy or a second dose or administration, the disease or condition. Shows recurrence. In some embodiments, the subject has not relapsed. In some such embodiments, the subject is determined to have a risk of recurrence, eg, a high risk of recurrence, and thus, eg, preventive to reduce the likelihood of recurrence or prevent recurrence. The cells are administered.

いくつかの態様において、対象は、もう一つの治療剤による先の処置を受けたことがない。いくつかの態様において、対象は、第1の用量の投与の前に、受容体、例えば、CARを発現する細胞の用量を受けたことがなく、かつ/またはそのような細胞が発現するCARもしくはその他の受容体を発現するか、もしくは同一の分子もしくは抗原を標的とする組換え受容体を発現する細胞の用量を受けたことがない。いくつかの態様において、対象は、第1の用量の投与の前に、第1の用量の受容体を発現する細胞の用量を受けたことがない。他の態様において、第1および/または第2の投与の細胞の複数の用量が与えられる。 In some embodiments, the subject has never received prior treatment with another therapeutic agent. In some embodiments, the subject has never received a dose of a receptor, eg, a cell expressing CAR, prior to administration of the first dose, and / or CAR expressed by such cells or Have not received doses of cells that express other receptors or that express recombinant receptors that target the same molecule or antigen. In some embodiments, the subject has never received a dose of cells expressing the receptor of the first dose prior to administration of the first dose. In other embodiments, multiple doses of cells of the first and / or second dose are given.

疾患、状態、および障害の中には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、およびメラノーマを含み、局所および転移性の腫瘍を含む腫瘍、感染症、例えば、ウイルスまたは他の病原体、例えば、HIV、HCV、HBV、CMV、ＨＰＶによる感染、ならびに寄生生物疾患、ならびに自己免疫性疾患および炎症性疾患がある。一部の態様において、疾患または状態は、腫瘍、癌、悪性腫瘍、新生物、または他の増殖性の疾患もしくは障害である。このような疾患には、白血病、リンパ腫、例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、ALL、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性B細胞リンパ腫、B細胞悪性腫瘍、結腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、皮膚癌、メラノーマ、骨癌、および脳癌、卵巣癌、上皮癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、ホジキンリンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、ならびに/または中皮腫が含まれるが、これに限定されない。 Diseases, conditions, and disorders include solid tumors, hematological malignancies, and melanoma, including tumors including local and metastatic tumors, infectious diseases such as viruses or other pathogens such as HIV, HCV, There are HBV, CMV, HPV infections, as well as parasitic diseases, as well as autoimmune and inflammatory diseases. In some embodiments, the disease or condition is a tumor, cancer, malignant tumor, neoplasm, or other proliferative disease or disorder. Such diseases include leukemia, lymphoma, eg, chronic lymphocytic leukemia (CLL), ALL, non-hodgkin lymphoma, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, refractory follicular lymphoma, mantle cell lymphoma, painless B. Cell lymphoma, B-cell malignant tumor, colon cancer, lung cancer, liver cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, skin cancer, melanoma, bone cancer, and brain cancer, ovarian cancer, epithelial cancer, renal cell cancer, pancreatic adenocarcinoma, Includes, but is not limited to, Hodgkin's lymphoma, cervical cancer, colorectal cancer, glial blastoma, neuroblastoma, Ewing's sarcoma, medullary blastoma, osteosarcoma, synovial sarcoma, and / or mesotheloma. ..

一部の態様において、疾患または状態は腫瘍であり、第1の用量の投与前に、対象の腫瘍負荷が多いか、例えば、固形腫瘍が大きいか、または疾患に関連する、例えば腫瘍の細胞の数が多いか、もしくは容積が大きい。一部の局面において、対象の転移数が多い、および/または転移が広範囲に局在している。一部の局面において、対象の腫瘍負荷は少なく、対象に転移はほとんどない。一部の態様において、用量のサイズまたはタイミングは対象における初期疾患負荷によって決定される。例えば、一部の局面において対象には、第1の用量において比較的少ない数の細胞が投与され得るが、低疾患負荷の状況では、用量が多くてもよい。 In some embodiments, the disease or condition is a tumor, and prior to administration of the first dose, the subject's tumor load is high, eg, a solid tumor is large, or disease-related, eg, tumor cells. Large in number or large in volume. In some aspects, the subject has a large number of metastases and / or metastases are extensively localized. In some aspects, the subject's tumor load is low and the subject has little metastasis. In some embodiments, the size or timing of the dose is determined by the initial disease load in the subject. For example, in some aspects the subject may be dosed with a relatively small number of cells at the first dose, but in low disease load situations the dose may be higher.

一部の態様において、疾患または状態は、ウイルス感染、レトロウイルス感染、細菌感染、および原生動物感染、免疫不全症、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスなどがあるが、これに限定されない感染性の疾患または状態である。一部の態様において、疾患または状態は自己免疫性または炎症性の疾患または状態、例えば、関節炎、例えば、慢性関節リウマチ(RA)、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、乾癬、硬皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植に関連する疾患もしくは状態である。 In some embodiments, the disease or condition is viral, retroviral, bacterial, and protozoal, immunodeficiency, cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barvirus (EBV), adenovirus, BK poly. Infectious diseases or conditions, such as, but not limited to, omavirus. In some embodiments, the disease or condition is an autoimmune or inflammatory disease or condition, such as arthritis, such as chronic rheumatoid arthritis (RA), type I diabetes, systemic erythematosus (SLE), inflammatory bowel disease, etc. Diseases or conditions associated with psoriasis, cirrhosis, autoimmune thyroid disease, Graves' disease, Crohn's disease, multiple sclerosis, asthma, and / or transplantation.

一部の態様において、疾患または障害に関連する抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、FBP、胎児アセチコリンe(acethycholine e)受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ軽鎖、ルイス(Lewis)Y、L1-細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児抗原(CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、およびMAGEA3、CE7、Wilms' Tumor 1(WT-1)、サイクリン、例えば、サイクリンA1(CCNA1)、ならびに/またはビオチン化分子、ならびに/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体が発現する分子からなる群より選択される。 In some embodiments, the disease or disorder-related antigens are orphan tyrosine kinase receptors RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesothelin, CEA, and hepatitis B surface antigens, antifolic acid. Receptors, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, or 4, FBP, fetal acethycholine e receptor, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-α, IL-13R-α2, kdr, κ light chain, Lewis Y, L1-cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D ligand, NY -ESO-1, MART-1, gp100, Carcinoembryonic Antigen, ROR1, TAG72, VEGF-R2, Carcinoembryonic Antigen (CEA), Prostate Specific Antigen, PSMA, Her2 / neu, Estrogen Receptor, Progesterone Receptor, Efrin B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, and MAGEA3, CE7, Wilms' Tumor 1 (WT-1), cyclins such as cyclin A1 (CCNA1), and / or biotinylated molecules, and / Or selected from the group consisting of molecules expressing HIV, HCV, HBV, or other pathogens.

本明細書で使用する「処置」(およびその文法上の語尾変化、例えば、「処置する(treat)」または「処置する(treating)」)とは、疾患もしくは状態もしくは障害、あるいはこれらに関連する症状、副作用もしくは転帰、または表現型の完全または部分的な寛解または低減を指す。処置の望ましい治療効果には、疾患の発生または再発の阻止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の阻止、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解または軽減、および寛解または予後の改善が含まれるが、これに限定されない。この用語は、疾患の完治、またはあらゆる症状の完全な除去、または全ての症状もしくは転帰に及ぼす影響を必ずしも意味しない。 As used herein, "treatment" (and its grammatical flexion, eg, "treat" or "treating") is a disease or condition or disorder, or related thereto. Refers to a complete or partial remission or reduction of symptoms, side effects or outcomes, or phenotype. Desirable therapeutic effects of treatment include prevention of disease onset or recurrence, relief of symptoms, reduction of any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevention of metastasis, reduction of the rate of disease progression, remission of the disease state. Or alleviates, and includes, but is not limited to, remission or improvement in prognosis. The term does not necessarily mean the complete cure of the disease, or the complete elimination of any symptom, or its effect on all symptoms or outcomes.

本明細書で使用する「疾患の発症を遅らせる」とは、疾患(例えば、癌)の発症を延ばす、邪魔する、遅くする、減速する、安定化する、抑制する、および/または延期することを意味する。この遅れは、病歴および/または処置されている個体に応じて様々な長さの時間でよい。当業者に明らかなように、十分な、または大きな遅れは、実際には、個体が疾患を発症しない点では予防を含む。例えば、転移の発症などの末期癌を遅らせることができる。 As used herein, "delaying the onset of a disease" means prolonging, interfering with, slowing down, slowing down, stabilizing, suppressing, and / or delaying the onset of a disease (eg, cancer). means. This delay may be of varying lengths of time depending on the medical history and / or the individual being treated. As will be apparent to those of skill in the art, sufficient or significant delays include prophylaxis in that the individual does not actually develop the disease. For example, it can delay end-stage cancers such as the onset of metastases.

本明細書で使用する「予防する」は、疾患の素因がある可能性があるがまだ疾患と診断されていない対象における疾患の発生または再発に関する予防を提供することを含む。一部の態様において、提供される細胞および組成物は、疾患の発症を遅らせるのに、または疾患の進行を遅くするのに用いられる。 As used herein, "preventing" includes providing prevention for the development or recurrence of a disease in a subject who may have a predisposition to the disease but has not yet been diagnosed with the disease. In some embodiments, the cells and compositions provided are used to delay the onset of the disease or to slow the progression of the disease.

本明細書で使用する、機能または活性を「抑制する」ということは、関心対象の条件もしくはパラメータ以外は同じ条件と比較した時に、または別の条件と比較した時に機能または活性を低減することである。例えば、腫瘍成長を抑制する細胞は、前記細胞の非存在下での腫瘍成長の速度と比較して腫瘍成長の速度を低減する。 As used herein, "suppressing" a function or activity means reducing the function or activity when compared to the same conditions or other conditions except for the condition or parameter of interest. be. For example, cells that suppress tumor growth reduce the rate of tumor growth compared to the rate of tumor growth in the absence of said cells.

投与の文脈において、薬剤、例えば、薬学的製剤、細胞、または組成物の「有効量」とは、望ましい結果、例えば、治療結果または予防結果を成し遂げるのに、必要な投与量/量で、かつ期間にわたって、有効な量を指す。 In the context of administration, the "effective amount" of a drug, eg, a pharmaceutical formulation, cell, or composition, is the dose / amount required to achieve the desired outcome, eg, therapeutic or prophylactic outcome. Refers to an effective amount over a period of time.

薬剤、例えば、薬学的製剤または細胞の「治療的有効量」とは、望ましい治療結果、例えば、疾患、状態、もしくは障害を処置するための望ましい治療結果、および/または処置の薬物動態学的効果もしくは薬力学的効果を成し遂げるのに、必要な投与量で、かつ期間にわたって、有効な量を指す。治療的有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに投与される細胞集団などの要因に応じて変化する場合がある。一部の態様において、提供される方法は、有効量、例えば、治療的有効量の前記細胞および/または組成物を投与する工程を伴う。 A "therapeutically effective amount" of a drug, eg, a pharmaceutical formulation or cell, is the desired therapeutic outcome, eg, the desired therapeutic outcome for treating a disease, condition, or disorder, and / or the pharmacokinetic effect of the treatment. Alternatively, it refers to an amount that is necessary and effective over a period of time to achieve a pharmacodynamic effect. Therapeutically effective amounts may vary depending on factors such as the subject's disease state, age, gender, and body weight, as well as the cell population administered. In some embodiments, the provided method comprises the step of administering an effective amount, eg, a therapeutically effective amount of the cell and / or composition.

「予防的有効量」とは、望ましい予防結果を成し遂げるのに、必要な投与量で、かつ期間にわたって、有効な量を指す。典型的には、疾患の前に、または疾患の初期段階に対象において予防用量が用いられるので、予防的有効量は治療的有効量より少ないが、必ず治療的有効量より少ないとは限らない。少ない腫瘍負荷の状況では、予防的有効量は一部の局面では治療的有効量より多い。 "Prophylactically effective amount" refers to an amount that is necessary and effective over a period of time to achieve the desired preventive outcome. The prophylactically effective amount is less than the therapeutically effective amount, but not necessarily less than the therapeutically effective amount, because the prophylactic dose is typically used in the subject before or in the early stages of the disease. In low tumor load situations, the prophylactically effective amount is higher than the therapeutically effective amount in some aspects.

養子細胞療法のために細胞を投与するための方法は公知であり、提供される方法および組成物に関連して用いられる場合がある。例えば、養子T細胞療法方法は、例えば、Gruenbergらへの米国特許出願公開第2003/0170238号; Rosenbergへの米国特許第4,690,915号; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.を参照されたい。 Methods for administering cells for adoptive cell therapy are known and may be used in connection with the methods and compositions provided. For example, adoptive T cell therapy methods include, for example, US Patent Application Publication No. 2003/0170238 to Gruenberg et al .; US Patent No. 4,690,915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577- It is described in 85). For example, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): See e61338.

一部の態様において、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞療法を受けようとする対象から、またはこのような対象に由来する試料から細胞が単離される、および/または別の方法で調製される自家移入によって行われる。従って、一部の局面において、前記細胞は、対象、例えば、処置および細胞を必要とする患者に由来し、単離および処理された後に同じ対象に投与される。 In some embodiments, cell therapy, eg, adoptive cell therapy, eg, adoptive T cell therapy, isolates cells from a subject seeking cell therapy or from a sample derived from such a subject, and / Or done by self-implantation prepared by another method. Thus, in some aspects, the cells are derived from a subject, eg, a patient in need of treatment and cells, and are administered to the same subject after isolation and treatment.

一部の態様において、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞療法を受けようとする対象、または細胞療法を最終的に受ける対象、例えば、第1の対象以外の対象から細胞が単離される、および/または別の方法で調製される同種異系移入によって行われる。このような態様では、次いで、前記細胞は、同じ種の異なる対象、例えば、第2の対象に投与される。一部の態様において、第1の対象および第2の対象は遺伝的に同一であるか類似している。一部の態様において、第2の対象は第1の対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。 In some embodiments, cell therapy, eg, adopted cell therapy, eg, adopted T-cell therapy, is a subject other than the subject seeking or ultimately receiving cell therapy, eg, the first subject. Cells are isolated from the subject and / or performed by allogeneic transfer prepared otherwise. In such an embodiment, the cells are then administered to a different subject of the same species, eg, a second subject. In some embodiments, the first subject and the second subject are genetically identical or similar. In some embodiments, the second subject expresses the same HLA class or supertype as the first subject.

前記細胞は、任意の適切な手段によって、例えば、大量瞬時注入によって、注射、例えば、静脈内注射または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、眼房内(intracameral)注射、結膜下(subconjectval)注射、結膜下(subconjuntival)注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍(posterior juxtascleral)送達によって投与することができる。一部の態様において、前記細胞は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与によって、所望であれば、局所処置の場合、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸腔内投与、頭蓋内投与、または皮下投与が含まれる。一部の態様において、ある特定の用量が前記細胞の単回大量瞬時投与によって投与される。一部の態様において、ある特定の用量が、前記細胞の複数回大量瞬時投与によって、例えば、3日以下の期間にわたって送達されるか、または前記細胞の連続注入投与によって送達される。 The cells are injected by any suitable means, eg, by mass instantaneous injection, eg, intravenous or subcutaneous injection, intraocular injection, peri-ocular injection, subretinal injection, intravitreous injection, transdiaridal injection, Subdural injection, intrachondral injection, intracameral injection, subconjectval injection, subconjuntival injection, subtenon sac injection, postocular injection, periocular injection, or near posterior epithelium ( posterior juxtascleral) Can be administered by delivery. In some embodiments, the cells are administered by parenteral administration, intrapulmonary administration, and intranasal administration, and if desired, by intralesional administration, in the case of topical treatment. Parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrathoracic, intracranial, or subcutaneous administration. In some embodiments, a particular dose is administered by a single high-dose instantaneous dose of said cells. In some embodiments, a particular dose is delivered by multiple high doses of the cells, eg, over a period of 3 days or less, or by continuous infusion of the cells.

疾患の予防または処置のために、適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、細胞が治療目的または予防目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴、細胞に対応する応答、ならびに主治医の判断に左右されることがある。前記組成物および細胞は、一部の態様では、一度に、または一連の処置にわたって対象に適切に投与される。 For the prevention or treatment of the disease, the appropriate dose is the type of disease to be treated, the type of cell or recombinant receptor, the severity and course of the disease, whether the cells are administered for therapeutic or prophylactic purposes. Please, it may depend on previous therapy, patient history, cell-corresponding response, and the judgment of the attending physician. The compositions and cells are, in some embodiments, appropriately administered to the subject at once or over a series of treatments.

一部の態様において、前記細胞は、組み合わせ処置の一部として、例えば、別の治療介入、例えば、抗体または操作された細胞または受容体または他の薬剤、例えば、細胞傷害剤または治療剤と同時に、または任意の順番で連続して投与される。従って、前記細胞は、一部の態様では、1種類もしくは複数種のさらなる治療剤と一緒に、または別の治療介入と共に、同時に、または任意の順番で連続して同時投与される。ある状況では、前記細胞は、前記細胞集団が1種類もしくは複数種のさらなる治療剤の効果を強化するような十分に短い期間で別の療法と一緒に同時投与されるか、または逆もまた同じである。一部の態様において、前記細胞は、1種または複数種のさらなる治療剤の前に投与される。一部の態様において、前記細胞は、1種または複数種のさらなる治療剤の後に投与される。一部の態様において、1種または複数種のさらなる薬剤は、例えば持続性を強化するために、サイトカイン、例えばIL-2、または他のサイトカインを含む。 In some embodiments, the cells, as part of a combination treatment, eg, at the same time as another therapeutic intervention, eg, an antibody or engineered cell or receptor or other agent, eg, a cytotoxic agent or therapeutic agent. , Or consecutive doses in any order. Thus, in some embodiments, the cells are co-administered simultaneously or sequentially in any order, with one or more additional therapeutic agents, or with another therapeutic intervention. In some situations, the cells may be co-administered with another therapy for a short period of time such that the cell population enhances the efficacy of one or more additional therapeutic agents, or vice versa. Is. In some embodiments, the cells are administered prior to one or more additional therapeutic agents. In some embodiments, the cells are administered after one or more additional therapeutic agents. In some embodiments, the one or more additional agents comprises a cytokine, such as IL-2, or other cytokine, eg, to enhance persistence.

一部の態様において、前記方法は、例えば、用量の投与前に腫瘍負荷を低減するために、化学療法剤、例えば、コンディショニング化学療法剤を投与することを含む。 In some embodiments, the method comprises administering, for example, a chemotherapeutic agent, eg, a conditioning chemotherapeutic agent, to reduce the tumor load prior to administration of the dose.

前記細胞が対象(例えば、ヒト)に投与されたら、操作された細胞集団の生物学的活性は、一部の局面では、多数の公知の方法のどの方法でも測定される。評価するパラメータには、インビボでは、例えば、画像化による、またはエクスビボでは、例えば、ELISAもしくはフローサイトメトリーによる、操作された、もしくは天然のT細胞または他の免疫細胞と抗原との特異的結合が含まれる。ある特定の態様において、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、当技術分野において公知の任意の適切な方法、例えば、細胞傷害アッセイ、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載の細胞傷害アッセイを用いて測定することができる。ある特定の態様において、前記細胞の生物学的活性はまた、ある特定のサイトカイン、例えば、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNFの発現および/または分泌をアッセイすることでも測定することができる。一部の局面において、生物学的活性は、臨床転帰、例えば、腫瘍負荷(tumor burden)または腫瘍量(tumor load)の低減を評価することによって測定される。一部の局面において、毒性転帰、細胞の持続性および/もしくは増殖、ならびに/または宿主免疫応答の存在もしくは非存在が評価される。 Once the cells are administered to a subject (eg, a human), the biological activity of the engineered cell population is, in some aspects, measured by any of a number of known methods. The parameters to be evaluated include the specific binding of the antigen to an engineered or native T cell or other immune cell in vivo, eg, by imaging, or in Exvivo, eg, by ELISA or flow cytometry. included. In certain embodiments, the ability of the engineered cell to destroy the target cell is any suitable method known in the art, such as a cytotoxic assay, eg, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 ( 7): Can be measured using the cytotoxic assay described in 689-702 (2009) and Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25-40 (2004). In certain embodiments, the biological activity of the cells can also be measured by assaying the expression and / or secretion of certain cytokines such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNF. In some aspects, biological activity is measured by assessing clinical outcomes, such as a reduction in tumor burden or tumor load. In some aspects, toxicity outcomes, cell persistence and / or proliferation, and / or the presence or absence of a host immune response are assessed.

ある特定の態様では、操作された細胞は、治療効力または予防効力が向上するように任意の数のやり方で改変される。例えば、集団によって発現される操作されたCARまたはTCRは、リンカーを介して標的化部分と直接的または間接的に結合体化することができる。化合物、例えば、CARまたはTCRを標的化部分に結合体化する手法は当技術分野において公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995)および米国特許第5,087,616号を参照されたい。 In certain embodiments, the engineered cells are modified in any number of ways to improve therapeutic or prophylactic efficacy. For example, the engineered CAR or TCR expressed by the population can be directly or indirectly associated with the targeted moiety via a linker. Techniques for binding compounds, such as CAR or TCR, to targeted moieties are known in the art. See, for example, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) and US Pat. No. 5,087,616.

III.前記細胞が発現する組換え受容体
前記細胞は通常、組換え受容体を発現する。異なる用量の前記細胞によって発現された前記受容体は典型的に、少なくとも部分的に、互いとは異なっている。前記受容体は、抗原受容体、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)を含む機能的な非TCR抗原受容体、および他の抗原結合受容体、例えば、トランスジェニックT細胞受容体(TCR)を含み得る。前記受容体は、他のキメラ受容体、例えば、特定のリガンドに結合しかつ、CAR内に存在するようなものと類似した膜貫通ドメインおよび/または細胞内シグナル伝達ドメインを有する、受容体も含み得る。 III. Recombinant Receptors Expressed by the Cell The cell usually expresses a recombinant receptor. The receptors expressed by the cells at different doses are typically at least partially different from each other. The receptors include functional non-TCR antigen receptors, including, for example, chimeric antigen receptors (CARs), and other antigen-binding receptors, such as transgenic T cell receptors (TCRs). obtain. The receptors also include other chimeric receptors, eg, receptors that bind to a particular ligand and have a transmembrane domain and / or an intracellular signaling domain similar to those present in CAR. obtain.

CARを含む例示的な抗原受容体ならびにこのような受容体を操作するための方法およびこのような受容体を細胞に導入するための方法には、例えば、国際特許出願公開番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開第US2002131960号、US2013287748、US20130149337、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、ならびに欧州特許出願第EP2537416号に記載のもの、ならびに/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載のものが含まれる。一部の局面において、前記抗原受容体には、米国特許第7,446,190号に記載のCARおよび国際特許出願公開番号WO/2014055668A1に記載のCARが含まれる。CARの例には、上述の任意の刊行物、例えば、WO2014031687、US8,339,645、US7,446,179、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701、およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)に開示されるCARが含まれる。国際公開公報WO2014031687、米国特許第8,339,645号、同第7,446,179号、同第7,446,190号、および同第8,389,282号、ならびに米国特許出願公開US 2013/0149337も参照されたい。キメラ受容体の中にはキメラ抗原受容体(CAR)がある。キメラ受容体、例えば、CARは、一般的に、細胞外抗原結合ドメイン、例えば、抗体分子の一部、一般的に、抗体の可変重(V_H)鎖領域および/または可変軽(V_L)鎖領域、例えば、scFv抗体断片を含む。 Exemplary antigen receptors, including CAR, as well as methods for manipulating such receptors and methods for introducing such receptors into cells include, for example, International Patent Application Publication Nos. WO200014257, WO2013126726, WO2012. / 129514, WO2014031687, WO2013 / 166321, WO2013 / 071154, WO2013 / 123061, US Patent Application Publication No. US2002131960, US2013287748, US20130149337, US Patent No. 6,451,995, No. 7,446,190, No. 8,252,592, No. 8,339,645, No. 8,398,282, No. 7,446,179, No. 6,410,319, No. 7,070,995, No. 7,265,209, No. 7,354,762, No. 7,446,191, No. 8,324,353, and No. 8,479,118, and European patent application. As described in EP 2537416 and / or Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3 (4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338; Turtle et al. ., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24 (5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18 (2): 160-75. In some aspects, the antigen receptor includes the CAR described in US Pat. No. 7,446,190 and the CAR described in International Patent Application Publication No. WO / 2014055668A1. Examples of CAR include any of the publications mentioned above, such as WO2014031687, US8,339,645, US7,446,179, US2013 / 0149337, US Pat. No. 7,446,190, US Pat. No. 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews. Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701, and Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177). CAR is included. See also WO2014031687, US Patent Nos. 8,339,645, 7,446,179, 7,446,190, and 8,389,282, and US Patent Application Publication US 2013/0149337. Among the chimeric receptors are chimeric antigen receptors (CARs). Chimeric receptors, such as CAR, are generally extracellular antigen-binding domains, such as part of an antibody molecule, generally a variable weight ( _VH ) chain region and / or variable light ( _VL ) of an antibody. It contains a chain region, eg, a scFv antibody fragment.

一部の態様において、組換え受容体の結合ドメイン、例えば抗体、例えば抗体断片の一部は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、例えば、ヒンジ領域、例えば、IgG4ヒンジ領域、および/もしくはCH1/CLおよび/もしくはFc領域をさらに含む。一部の態様において、定常領域または一部はヒトIgG、例えば、IgG4またはIgG1の定常領域または一部である。一部の局面において、定常領域の一部は、抗原認識成分、例えば、scFvと、膜貫通ドメインとの間にあるスペーサー領域として役立つ。スペーサーは、スペーサーが存在しない場合と比較して抗原結合後の前記細胞の応答性を高める長さのスペーサーでよい。例示的なスペーサー、例えばヒンジ領域は、国際公開公報WO2014031687に記載のものを含む。一部の例では、スペーサーは長さが12アミノ酸もしくは約12アミノ酸であるか、または長さが12アミノ酸以下である。例示的なスペーサーには、少なくとも約10～229アミノ酸、約10～200アミノ酸、約10～175アミノ酸、約10～150アミノ酸、約10～125アミノ酸、約10～100アミノ酸、約10～75アミノ酸、約10～50アミノ酸、約10～40アミノ酸、約10～30アミノ酸、約10～20アミノ酸、または約10～15アミノ酸を有し、列挙された任意の範囲の端点間の任意の整数を含むスペーサーが含まれる。一部の態様において、スペーサー領域には、約12アミノ酸もしくはこれより少ないアミノ酸、約119アミノ酸もしくはこれより少ないアミノ酸、または約229アミノ酸もしくはこれより少ないアミノ酸がある。例示的なスペーサーには、IgG4ヒンジのみ、CH2およびCH3ドメインと連結したIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインと連結したIgG4ヒンジが含まれる。例示的なスペーサーには、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153、国際特許出願公開番号WO2014031687、米国特許第8,822,647号、または米国特許出願公開第US2014/0271635号に記載のスペーサーが含まれるが、これに限定されない。 In some embodiments, the binding domain of the recombinant receptor, eg, an antibody, eg, part of an antibody fragment, is at least a portion of an immunoglobulin constant region, eg, a hinge region, eg, an IgG4 hinge region, and / or CH1 /. Further includes CL and / or Fc regions. In some embodiments, the constant region or portion is a constant region or portion of human IgG, such as IgG4 or IgG1. In some aspects, a portion of the constant region serves as a spacer region between the antigen recognition component, eg, scFv, and the transmembrane domain. The spacer may be a spacer having a length that enhances the responsiveness of the cells after antigen binding as compared with the case where the spacer is absent. Exemplary spacers, such as hinge regions, include those described in WO2014031687. In some examples, the spacer is 12 amino acids or about 12 amino acids in length, or 12 amino acids or less in length. Exemplary spacers include at least about 10-229 amino acids, about 10-200 amino acids, about 10-175 amino acids, about 10-150 amino acids, about 10-125 amino acids, about 10-100 amino acids, about 10-75 amino acids, A spacer having about 10-50 amino acids, about 10-40 amino acids, about 10-30 amino acids, about 10-20 amino acids, or about 10-15 amino acids and containing any integer between the endpoints in any range listed. Is included. In some embodiments, the spacer region has about 12 or less amino acids, about 119 or less amino acids, or about 229 or less amino acids. Exemplary spacers include IgG4 hinges only, IgG4 hinges linked to CH2 and CH3 domains, or IgG4 hinges linked to CH3 domains. Exemplary spacers are described in Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, International Patent Application Publication No. WO2014031687, US Patent No. 8,822,647, or US Patent Application Publication No. US2014 / 0271635. Spacers are included, but not limited to.

一部の態様において、定常領域または一部は、ヒトIgG、例えば、IgG4またはIgG1の定常領域または一部である。一部の態様において、スペーサーは、配列

(SEQ ID NO:1に示した)を有し、SEQ ID NO:158に示した配列によってコードされる。一部の態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:107に示した配列を有する。一部の態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:108に示した配列を有する。一部の態様において、定常領域または一部はIgDの定常領域または一部である。一部の態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:109に示した配列を有する。一部の態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:1、107、108、または109のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。 In some embodiments, the constant region or portion is a constant region or portion of human IgG, such as IgG4 or IgG1. In some embodiments, the spacers are arranged.

Has (indicated by SEQ ID NO: 1) and is encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 158. In some embodiments, the spacer has the sequence shown in SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the spacer has the sequence shown in SEQ ID NO: 108. In some embodiments, the constant region or part is the constant region or part of IgD. In some embodiments, the spacer has the sequence shown in SEQ ID NO: 109. In some embodiments, the spacer is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 for any of SEQ ID NO: 1, 107, 108, or 109. It has an amino acid sequence that exhibits%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity.

この抗原認識ドメインは、一般的に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えば、抗原受容体複合体、例えば、TCR複合体を通じた活性化、および/または別の細胞表面受容体を介したシグナルを模倣するシグナル伝達成分に連結される。一部の態様において、シグナルは免疫賦活性および/または共刺激性であり得る。一部の態様において、これは抑制性、例えば免疫抑制性であり得る。従って、一部の態様において、抗原結合成分(例えば、抗体)は1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一部の態様において、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合される。一態様において、前記受容体、例えば、CARにおいて前記ドメインの1つと天然に結合している膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小にするために、このようなドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避けるように選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変される。 This antigen recognition domain is generally mediated by one or more intracellular signaling components, eg, activation through an antigen receptor complex, eg, a TCR complex, and / or another cell surface receptor. It is linked to a signal transduction component that mimics the signal. In some embodiments, the signal can be immunostimulatory and / or costimulatory. In some embodiments, it can be inhibitory, eg, immunosuppressive. Thus, in some embodiments, the antigen binding component (eg, an antibody) is linked to one or more transmembrane domains and intracellular signaling domains. In some embodiments, the transmembrane domain is fused to the extracellular domain. In one embodiment, the receptor, eg, a transmembrane domain that is naturally associated with one of the domains in CAR is used. In some cases, transmembrane domains should avoid binding such domains to transmembrane domains of the same or different surface membrane proteins in order to minimize interaction with other members of the receptor complex. Selected for or modified by amino acid substitution.

膜貫通ドメインは、一部の態様では、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然の場合、前記ドメインは、一部の局面では、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する膜貫通領域を含む(すなわち、少なくとも、その膜貫通領域を含む)、および/またはその機能的バリアントを含有する膜貫通領域、例えば、その構造特性、例えば、膜貫通特性のかなりの部分を保持している膜貫通領域を含む。一部の態様において、膜貫通ドメインは、CD4、CD28、もしくはCD8、例えば、CD8αに由来する膜貫通ドメイン、またはその機能的バリアントである。膜貫通ドメインは一部の態様では合成である。一部の局面において、合成膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む。一部の局面において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見られる。一部の態様において、連結は、リンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによるものである。 Transmembrane domains are, in some embodiments, derived from either natural or synthetic sources. If the source is natural, the domain is, in some aspects, derived from any membrane-binding or transmembrane protein. The transmembrane region is the α chain, β chain, or ζ chain of the T cell receptor, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, A transmembrane region comprising a transmembrane region derived from CD137, CD154 (ie, at least including its transmembrane region) and / or containing a functional variant thereof, eg, its structural properties, eg, transmembrane properties. Includes a transmembrane region that holds a significant portion. In some embodiments, the transmembrane domain is a CD4, CD28, or CD8, eg, a transmembrane domain derived from CD8α, or a functional variant thereof. The transmembrane domain is synthetic in some embodiments. In some aspects, the synthetic transmembrane domain primarily comprises hydrophobic residues such as leucine and valine. In some aspects, phenylalanine, tryptophan, and valine triplets are found at each end of the synthetic transmembrane domain. In some embodiments, the linkage is by a linker, spacer, and / or transmembrane domain.

細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然抗原受容体を介したシグナル、このような受容体と共刺激受容体の組み合わせを介したシグナル、および/または共刺激受容体だけを介したシグナルを模倣するか、またはこれに似せる細胞内シグナル伝達ドメインがある。一部の態様において、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、長さが2～10アミノ酸のリンカー、例えば、グリシンおよびセリン、例えば、グリシン-セリンダブレット(doublet)を含有するリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に存在し、連結を形成する。 Some intracellular signaling domains mimic signals mediated by native antigen receptors, signals mediated by combinations of such receptors and co-stimulatory receptors, and / or signals mediated only by co-stimulatory receptors. There are intracellular signaling domains that do or resemble this. In some embodiments, a linker containing a short oligopeptide or polypeptide linker, eg, a linker of length 2-10 amino acids, eg, glycine and serine, eg, a glycine-serine doublet, is the CAR membrane. It exists between the transmembrane domain and the cytoplasmic signaling domain and forms a link.

前記受容体、例えば、CARは、一般的には、少なくとも1種類の細胞内シグナル伝達成分を含む。一部の態様において、前記受容体は、TCR複合体の細胞内成分、例えば、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えば、CD3ζ鎖を含む。従って、一部の局面において、抗原結合部分は1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。一部の態様において、細胞シグナル伝達モジュールには、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD膜貫通ドメインが含まれる。一部の態様において、前記受容体、例えば、CARは、1種または複数種のさらなる分子、例えば、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16の一部をさらに含む。例えば、一部の局面において、CARまたは他のキメラ受容体には、CD3-ゼータ(CD3-ζ)またはFc受容体γと、CD8、CD4、CD25、またはCD16とのキメラ分子が含まれる。 The receptor, eg, CAR, generally comprises at least one intracellular signaling component. In some embodiments, the receptor comprises an intracellular component of the TCR complex, eg, a TCR CD3 chain that mediates T cell activation and cytotoxicity, eg, a CD3ζ chain. Thus, in some aspects, the antigen binding moiety is linked to one or more cell signaling modules. In some embodiments, the cellular signaling module includes a CD3 transmembrane domain, a CD3 intracellular signaling domain, and / or other CD transmembrane domains. In some embodiments, the receptor, eg, CAR, further comprises a portion of one or more additional molecules, eg, Fc receptors γ, CD8, CD4, CD25, or CD16. For example, in some aspects, CAR or other chimeric receptors include chimeric molecules of CD3-zeta (CD3-ζ) or Fc receptor γ with CD8, CD4, CD25, or CD16.

一部の態様において、CARまたは他のキメラ受容体が連結されると、前記受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞、例えば、CARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、ある状況では、CARは、T細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはTヘルパー活性、例えば、サイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。一部の態様において、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分は、例えば、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、インタクトな免疫賦活性鎖の代わりに用いられる。一部の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはT細胞受容体(TCR)の細胞質配列を含み、一部の局面では、天然の状況では、このような受容体と協調して、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するように働く補助受容体の細胞質配列も含む。 In some embodiments, when a CAR or other chimeric receptor is ligated, the cytoplasmic or intracellular signaling domain of said receptor is that of an immune cell, eg, a T cell engineered to express CAR. Activates at least one of the normal effector functions or responses. For example, in certain situations, CAR induces the function of T cells, eg, cytolytic or T-helper activity, eg, cytokines or other factors. In some embodiments, the disrupted portion of the intracellular signaling domain of an antigen receptor component or co-stimulating molecule is used, for example, in place of an intact immunostimulatory chain if it transmits an effector function signal. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises the cytoplasmic sequence of the T cell receptor (TCR), and in some aspects, in the natural context, in coordination with such receptors, antigen receptor binding. It also contains the cytoplasmic sequences of co-receptors that later act to initiate signal transduction.

天然TCRの状況では、完全活性化には、一般的に、TCRを介したシグナル伝達だけでなく共刺激シグナルも必要とされる。従って、一部の態様において、完全活性化を促進するには、二次シグナルまたは共刺激シグナルを発生させるための成分もCARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを発生させるための成分を含まない。一部の局面において、さらなるCARが同じ細胞において発現され、二次シグナルまたは共刺激シグナルを発生させるための成分を提供する。 In the context of natural TCR, complete activation generally requires co-stimulation signals as well as TCR-mediated signaling. Thus, in some embodiments, CAR also includes a component for generating a secondary or co-stimulating signal to promote complete activation. In another embodiment, CAR does not contain a component for generating a co-stimulation signal. In some aspects, additional CAR is expressed in the same cell, providing a component for generating secondary or co-stimulating signals.

T細胞活性化は、一部の局面では、2種類の細胞質シグナル伝達配列:TCRを介して抗原依存的一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列(一次細胞質シグナル伝達配列)、および抗原非依存的に二次シグナルまたは共刺激シグナルを供給するように働く細胞質シグナル伝達配列(二次細胞質シグナル伝達配列)によって媒介されると説明される。一部の局面において、CARは、このようなシグナル伝達成分の一方または両方を含む。 T-cell activation is, in some aspects, two types of cytoplasmic signaling sequences: cytoplasmic signaling sequences that initiate antigen-dependent primary activation via the TCR (primary cytoplasmic signaling sequences), and antigen-independent. Is described as being mediated by a cytoplasmic signaling sequence (secondary cytoplasmic signaling sequence) that acts to supply a secondary or costimulatory signal. In some aspects, CAR comprises one or both of such signaling components.

一部の局面において、CARは、天然の状況においてTCR複合体の一次活性化を促進するシグナル伝達分子またはドメインに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激するように働く一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有してもよい。ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例には、CD3ζ鎖、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来する一次細胞質シグナル伝達配列が含まれる。一部の態様において、CARにある細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部、または配列を含有する。 In some aspects, CAR comprises a primary cytoplasmic signaling sequence derived from a signaling molecule or domain that promotes primary activation of the TCR complex in its natural context. The primary cytoplasmic signaling sequence that acts to stimulate may contain an immunoreceptor-activating tyrosine motif or a signaling motif known as ITAM. Examples of primary cytoplasmic signaling sequences containing ITAM include primary cytoplasmic signaling sequences derived from the CD3ζ chain, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CDS, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d. In some embodiments, the cytoplasmic signaling molecule in CAR contains a cytoplasmic signaling domain, a portion thereof, or a sequence derived from CD3ζ.

一部の態様において、CARは、共刺激受容体、例えば、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、およびICOSのシグナル伝達ドメインおよび/または膜貫通部分を含む。一部の局面において、同じCARが活性化成分と共刺激成分を両方とも含む。 In some embodiments, CAR comprises costimulatory receptors such as CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, and ICOS signaling domains and / or transmembrane moieties. In some aspects, the same CAR contains both an activating component and a co-stimulating component.

一部の態様において、あるCARには活性化ドメインが含まれるのに対して、同一細胞上に存在する別の抗原を認識する別のCARによって共刺激成分が提供される。一部の態様において、CARは活性化CARまたは刺激CAR、共刺激CARを含み、両方とも同じ細胞上に発現される(WO2014/055668を参照されたい)。一部の局面において、前記細胞は、1種または複数種の刺激CARもしくは活性化CARおよび/または共刺激CARを含む。一部の態様において、前記細胞は、阻害CAR(iCAR、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013)を参照されたい)、例えば、疾患もしくは状態に関連するおよび/または疾患もしくは状態に特異的な抗原以外の抗原を認識するCARをさらに含み、ここで、疾患標的化CARを通じて送達された活性化シグナルは、例えば、オフターゲット効果を小さくするための阻害性CARとそのリガンドとの結合によって、減弱または阻害される。 In some embodiments, one CAR contains an activation domain, whereas another CAR that recognizes another antigen present on the same cell provides the co-stimulatory component. In some embodiments, CAR comprises activated CAR or stimulated CAR, co-stimulated CAR, both expressed on the same cell (see WO2014 / 055668). In some aspects, the cell comprises one or more stimulated or activated CARs and / or co-stimulated CARs. In some embodiments, the cells are associated with an inhibitory CAR (see iCAR, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (December, 2013)), eg, a disease or condition and / Or further comprising CARs that recognize antigens other than disease- or condition-specific antigens, where activation signals delivered through disease-targeted CARs are, for example, inhibitory CARs to reduce off-target effects. And its ligand binding to attenuate or inhibit it.

一部の態様において、組換え受容体、例えば、CARの細胞内シグナル伝達成分は、CD3ζ細胞内ドメインと共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3(例えば、CD3-ζ)細胞内ドメインと連結した、CD28膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。一部の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ細胞内ドメインと連結した、キメラCD28およびCD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激ドメインを含む。 In some embodiments, the intracellular signaling component of a recombinant receptor, eg, CAR, comprises a CD3ζ intracellular domain and a co-stimulating signaling region. In certain embodiments, the intracellular signaling domain comprises a CD28 transmembrane domain and a signaling domain linked to the intracellular domain of CD3 (eg, CD3-ζ). In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD28 and CD137 (4-1BB, TNFRSF9) costimulatory domain linked to the intracellular domain CD3ζ.

一部の態様において、CARは、細胞質部分に、1種または複数種の、例えば、2種類以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば、一次活性化ドメインを含む。例示的なCARには、CD3-ζ、CD28、および4-1BBの細胞内成分が含まれる。 In some embodiments, the CAR comprises one or more, eg, two or more co-stimulation and activation domains, eg, primary activation domains, in the cytoplasmic moiety. Exemplary CARs include the intracellular components of CD3-ζ, CD28, and 4-1BB.

一部の態様において、CARまたは他の抗原受容体は、受容体、例えば、切断型バージョンの細胞表面受容体、例えば、切断型EGFR(tEGFR)を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するために用いられ得るマーカー、例えば、細胞表面マーカーをさらに含む。一部の局面において、マーカーは、CD34、NGFR、または上皮増殖因子受容体の全てまたは一部(例えば、切断型)(例えば、tEGFR)を含む。一部の態様において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば、切断可能なリンカー配列、例えば、T2Aをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカー、任意で、リンカー配列は、公開された特許出願番号WO2014031687に開示されるような任意のものでよい。例えば、マーカーは、任意で、リンカー配列、例えば、T2A切断可能なリンカー配列に連結された切断型EGFR(tEGFR)でもよい。切断型EGFR(例えば、tEGFR)の例示的なポリペプチドは、SEQ ID NO:111に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:111と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。例示的なT2Aリンカー配列は、SEQ ID NO:110に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:110と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, CAR or other antigen receptors confirm cell transfection or manipulation to express the receptor, eg, a truncated version of the cell surface receptor, eg, truncated EGFR (tEGFR). Further include markers that can be used to, for example, cell surface markers. In some aspects, the marker comprises CD34, NGFR, or all or part of the epidermal growth factor receptor (eg, truncated) (eg, tEGFR). In some embodiments, the nucleic acid encoding the marker is functionally linked to a linker sequence, eg, a cleavable linker sequence, eg, a polynucleotide encoding T2A. For example, the marker, optionally, the linker sequence may be any as disclosed in published patent application number WO2014031687. For example, the marker may optionally be a linker sequence, eg, a truncated EGFR (tEGFR) linked to a T2A cleavable linker sequence. Exemplary polypeptides of truncated EGFR (eg, tEGFR) are the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111, or at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89% with SEQ ID NO: 111. Includes amino acid sequences showing 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity. An exemplary T2A linker sequence is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110, or at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% with SEQ ID NO: 110. , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more contains amino acid sequences exhibiting sequence identity.

一部の態様において、マーカーは、T細胞上に天然で見出されないか、もしくはT細胞の表面に天然で見出されない分子、例えば、細胞表面タンパク質、またはその一部である。 In some embodiments, the marker is a molecule that is not naturally found on T cells or is not naturally found on the surface of T cells, such as a cell surface protein, or a portion thereof.

一部の態様において、前記分子は、非自己分子、例えば、非自己タンパク質、すなわち、前記細胞が養子移入される宿主の免疫系が「自己」と認識しない分子である。 In some embodiments, the molecule is a non-self molecule, eg, a non-self protein, that is, a molecule that the immune system of the host into which the cell is adopted does not recognize as "self".

一部の態様において、マーカーは治療機能を果たさない、および/または遺伝子操作するための、例えば、首尾良く操作された細胞を選択するためのマーカーとして使用する以外の効果を生じない。他の態様において、マーカーは治療用分子でもよく、何らかの望ましい効果を別の方法で発揮する分子、例えば、細胞がインビボで遭遇するリガンド、例えば、養子移入時に前記細胞の応答を強める、および/または弱めるための、ならびにリガンドに遭遇するための共刺激分子または免疫チェックポイント分子でもよい。 In some embodiments, the marker has no therapeutic function and / or has no effect other than being used as a marker for genetic engineering, eg, for selecting successfully engineered cells. In other embodiments, the marker may be a therapeutic molecule, a molecule that otherwise exerts some desired effect, eg, a ligand that the cell encounters in vivo, eg, enhances the response of the cell upon adoption, and / or. It may be a costimulatory molecule or an immune checkpoint molecule for weakening as well as for encountering a ligand.

場合によっては、CARは、第一世代CAR、第二世代CAR、および/または第三世代CARと呼ばれる。一部の局面において、第一世代CARは、抗原が結合した時に、CD3鎖によって誘導されるシグナルしか生じないCARである。一部の局面において、第二世代CARは、このようなシグナルと共刺激シグナルを生じるCAR、例えば、CD28またはCD137などの共刺激受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARである。一部の局面において、第三世代CARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むCARである。 In some cases, CARs are referred to as first-generation CARs, second-generation CARs, and / or third-generation CARs. In some aspects, the first generation CAR is a CAR that produces only a signal induced by the CD3 chain when the antigen binds. In some aspects, the second generation CAR is a CAR that contains an intracellular signaling domain derived from a co-stimulatory receptor such as CD28 or CD137, which produces such a signal and a co-stimulatory signal. In some aspects, the third generation CAR is a CAR that contains multiple co-stimulatory domains of different co-stimulatory receptors.

一部の態様において、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、例えば抗体または抗原結合抗体断片、例えばscFvまたはFvを含有する細胞外部分を含む。一部の局面において、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含有する細胞外部分と、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の態様において、抗体または断片はscFvを含み、細胞内ドメインはITAMを含有する。一部の局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ(CD3ζ)鎖のζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。一部の態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。一部の局面において、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含有する。一部の態様において、キメラ抗原受容体はT細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは直接的または間接的に連結することができる。一部の態様において、細胞外ドメインおよび膜貫通は、スペーサー、例えば、本明細書に記載の任意のスペーサーによって連結される。一部の態様において、前記受容体は、膜貫通ドメインが得られた分子の細胞外部分、例えば、CD28細胞外部分を含有する。一部の態様において、キメラ抗原受容体は、例えば、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に、T細胞共刺激分子に由来する細胞内ドメインまたはその機能的バリアントを含有する。一部の局面において、T細胞共刺激分子はCD28または41BBである。 In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises an extracellular moiety containing an antigen binding domain, eg, an antibody or antigen binding antibody fragment, eg scFv or Fv. In some aspects, the chimeric antigen receptor comprises an extracellular moiety containing an antibody or fragment and an intracellular signaling domain. In some embodiments, the antibody or fragment comprises scFv and the intracellular domain contains ITAM. In some aspects, the intracellular signaling domain comprises the signaling domain of the ζ chain of the CD3-zeta (CD3ζ) chain. In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises a transmembrane domain that links the extracellular domain to the intracellular signaling domain. In some aspects, the transmembrane domain contains the transmembrane portion of CD28. In some embodiments, the chimeric antigen receptor contains the intracellular domain of a T cell co-stimulator. The extracellular domain and transmembrane domain can be directly or indirectly linked. In some embodiments, the extracellular domain and transmembrane are linked by a spacer, eg, any spacer described herein. In some embodiments, the receptor contains the extracellular portion of the molecule from which the transmembrane domain was obtained, eg, the extracellular portion of CD28. In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises, for example, an intracellular domain derived from a T cell co-stimulating molecule or a functional variant thereof, between a transmembrane domain and an intracellular signaling domain. In some aspects, the T cell co-stimulator is CD28 or 41BB.

例えば、一部の態様において、CARは、抗体、例えば、抗体断片と、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるか、またはそれを含有する膜貫通ドメインと、CD28のシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の態様において、CARは、抗体、例えば、抗体断片と、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるか、またはそれを含有する膜貫通ドメインと、4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。このような一部の態様において、前記受容体は、Ig分子、例えば、ヒトIg分子の一部、例えば、Igヒンジ、例えば、IgG4ヒンジを含有するスペーサー、例えば、ヒンジのみのスペーサーをさらに含む。 For example, in some embodiments, the CAR is an antibody, eg, an antibody fragment, and a transmembrane portion of CD28 or a functional variant thereof, or a transmembrane domain containing it, and a signaling portion of CD28 or a signal transduction portion thereof. It contains a functional variant and an intracellular signaling domain containing a signaling portion of CD3ζ or a functional variant thereof. In some embodiments, the CAR is an antibody, eg, an antibody fragment, a transmembrane portion of CD28 or a functional variant thereof, or a transmembrane domain containing it, and a signaling moiety of 4-1BB or its thereof. It contains a functional variant and an intracellular signaling domain containing a signaling portion of CD3ζ or a functional variant thereof. In some such embodiments, the receptor further comprises a spacer containing an Ig molecule, eg, a portion of a human Ig molecule, eg, an Ig hinge, eg, an IgG4 hinge, eg, a hinge-only spacer.

一部の態様において、組換え受容体、例えば、CARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28の膜貫通ドメイン(例えば、アクセッション番号P01747.1)またはそのバリアント、例えば、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインであるか、あるいはこれを含む。一部の態様において、組換え受容体の一部を含有する膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:104に示したアミノ酸配列、あるいはSEQ ID NO:104と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはこれより多い配列同一性、または少なくとも約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、もしくはこれより多い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, the transmembrane domain of a recombinant receptor, eg, CAR, is shown in the transmembrane domain of human CD28 (eg, accession number P01747.1) or a variant thereof, eg, SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence, or SEQ ID NO: 2 and at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, A transmembrane domain containing, or including, an amino acid sequence exhibiting 98%, 99%, or more sequence identity. In some embodiments, the transmembrane domain containing a portion of the recombinant receptor is at least 85%, 86%, 87%, 88 with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 104, or SEQ ID NO: 104. %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity, or at least about 85%, about 86%, about 87%, about 88%, about 89%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98% Includes amino acid sequences with about 99% or more sequence identity.

一部の態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。一部の局面において、T細胞共刺激分子はCD28または41BBである。 In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises the intracellular domain of a T cell costimulatory molecule. In some aspects, the T cell co-stimulator is CD28 or 41BB.

一部の態様において、組換え受容体、例えば、CARの細胞内シグナル伝達成分は、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントもしくは部分、例えば、天然CD28タンパク質の位置186-187においてLL→GG置換のあるドメインを含有する。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:112もしくは113に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:112もしくは113と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。一部の態様において、細胞内ドメインは、4-1BBの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、(アクセッション番号Q07011.1)またはその機能的バリアントもしくは部分、例えば、SEQ ID NO:3に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, the intracellular signaling component of a recombinant receptor, eg, CAR, is a subcellular co-stimulating signaling domain of human CD28 or a functional variant or portion thereof, eg, position 186-187 of a native CD28 protein. Contains a domain with the LL → GG substitution in. For example, the intracellular signaling domain is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 112 or 113, or SEQ ID NO: 112 or 113. It may contain an amino acid sequence exhibiting 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity. In some embodiments, the intracellular domain is shown in the intracellular costimulatory signaling domain of 4-1BB (eg, (Axon No. Q07011.1) or a functional variant or portion thereof, eg, SEQ ID NO: 3. Amino acid sequence, or SEQ ID NO: 3 and at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, or more amino acid sequences showing sequence identity.

一部の態様において、組換え受容体、例えば、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアント、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3の112 AA細胞質ドメイン(アクセッション番号: P20963.2)、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載のCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。例えば、一部の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:4、105、もしくは159に示したアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4、105、もしくは159と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の、もしくはこれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, the intracellular signaling domain of a recombinant receptor, eg, CAR, is the human CD3ζ stimulating signaling domain or a functional variant thereof, eg, the 112 AA cytoplasmic domain of isoform 3 of human CD3ζ. Number: P20963.2), or the CD3ζ signaling domain described in US Pat. No. 7,446,190 or US Pat. No. 8,911,993. For example, in some embodiments, the intracellular signaling domain is at least 85%, 86%, with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 105, or 159, or SEQ ID NO: 4, 105, or 159. Amino acids showing sequence identity of 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more. Contains an array.

一部の局面において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域しか含有せず、例えば、IgG4またはIgG1のヒンジ領域しか含有せず、例えば、SEQ ID NO:1に示した、ヒンジだけのスペーサーである。他の態様において、スペーサーは、任意で、CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインに連結された、Igヒンジ、例えば、IgG4由来ヒンジであるか、これを含有する。一部の態様において、スペーサーは、例えば、SEQ ID NO:108に示した、CH2ドメインおよびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。一部の態様において、スペーサーは、例えば、SEQ ID NO:107に示した、CH3ドメインだけに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。一部の態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列もしくは他の可動性リンカー、例えば、公知の可動性リンカーであるか、またはこれを含む。 In some aspects, the spacer contains only the hinge region of IgG, eg, only the hinge region of IgG4 or IgG1, eg, the hinge-only spacer shown in SEQ ID NO: 1. In other embodiments, the spacer is optionally an Ig hinge linked to the CH2 and / or CH3 domains, eg, an IgG4-derived hinge, or contains it. In some embodiments, the spacer is, for example, an Ig hinge linked to the CH2 and CH3 domains, eg, an IgG4 hinge, as shown in SEQ ID NO: 108. In some embodiments, the spacer is, for example, an Ig hinge linked only to the CH3 domain, eg, an IgG4 hinge, as shown in SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the spacer is or comprises a glycine-serine-rich sequence or other mobile linker, such as a known mobile linker.

例えば、一部の態様において、CARは、抗体、例えば、scFvを含む、抗体断片と、スペーサー、例えば、免疫グロブリン分子の一部、例えば、重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域を含有するスペーサー、例えば、Ig-ヒンジ含有スペーサーと、CD28由来膜貫通ドメインの全てまたは一部を含有する膜貫通ドメインと、CD28由来細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の態様において、CARは、抗体または断片、例えば、scFvと、スペーサー、例えば、任意のIg-ヒンジ含有スペーサーと、CD28由来膜貫通ドメインと、4-1BB由来細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ由来シグナル伝達ドメインを含む。 For example, in some embodiments, the CAR comprises an antibody, eg, scFv, with an antibody fragment and a spacer, eg, a portion of an immunoglobulin molecule, eg, the hinge region of a heavy chain molecule and / or one or more. Includes spacers containing constant regions, such as Ig-hinge-containing spacers, transmembrane domains containing all or part of the CD28-derived transmembrane domain, CD28-derived intracellular signaling domains, and CD3ζ signaling domains. In some embodiments, the CAR is an antibody or fragment, eg, scFv, and a spacer, eg, any Ig-hinge-containing spacer, a CD28-derived transmembrane domain, a 4-1BB-derived intracellular signaling domain, and CD3ζ. Includes origin signaling domain.

いくつかの態様において、そのようなCAR構築物をコードする核酸分子は、例えば、CARをコードする配列の下流に、T2Aリボソームスキップ要素をコードする配列および/またはtEGFR配列をさらに含む。いくつかの態様において、配列は、SEQ ID NO:110に示されたT2Aリボソームスキップ要素、またはSEQ ID NO:110に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。いくつかの態様において、抗原受容体（例えば、CAR）を発現するT細胞は、（例えば、同一の構築物から2種のタンパク質を発現させるため、T2Aリボソームスイッチによって分離されたCARおよびEGFRtをコードする構築物の導入によって）非免疫原性選択エピトープとしての短縮EGFR（EGFRt）を発現するよう生成されてもよい。次いで、それは、そのような細胞を検出するためのマーカーとして使用され得る（例えば、米国特許第8,802,374号を参照すること）。いくつかの態様において、配列は、SEQ ID NO:111に示されたtEGFR配列、またはSEQ ID NO:111に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding such a CAR construct further comprises, for example, a sequence encoding the T2A ribosome skip element and / or a tEGFR sequence downstream of the sequence encoding the CAR. In some embodiments, the sequence is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% relative to the T2A ribosome skip element shown in SEQ ID NO: 110, or SEQ ID NO: 110. , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more, encode sequences of amino acids that exhibit sequence identity. In some embodiments, T cells expressing an antigen receptor (eg, CAR) encode CAR and EGFRt isolated by a T2A ribosome switch (eg, to express two proteins from the same construct). It may be generated to express shortened EGFR (EGFRt) as a non-immunogenic selective epitope (by introduction of a construct). It can then be used as a marker for detecting such cells (see, eg, US Pat. No. 8,802,374). In some embodiments, the sequence is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 relative to the tEGFR sequence shown in SEQ ID NO: 111, or SEQ ID NO: 111. %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more encodes sequences of amino acids that exhibit sequence identity.

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。提供される受容体およびその他のポリペプチド、例えば、リンカーまたはペプチドを含むポリペプチドは、天然アミノ酸残基および/または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含んでいてよい。その用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、およびリン酸化も含まれる。いくつかの局面において、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ポリペプチドは、ネイティブまたは天然の配列と比べて修飾を含有していてもよい。これらの修飾は、例えば、部位特異的変異誘発を通した計画的なものであってもよいし、または、例えば、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはPCR増幅によるエラーを通した偶発的なものであってもよい。 The terms "polypeptide" and "protein" are used interchangeably to refer to polymers of amino acid residues and are not limited to the minimum length. The provided acceptor and other polypeptide, eg, a polypeptide comprising a linker or peptide, may comprise an amino acid residue comprising a naturally occurring amino acid residue and / or an unnatural amino acid residue. The term also includes post-expression modifications of the polypeptide, such as glycosylation, sialylation, acetylation, and phosphorylation. In some aspects, the polypeptide may contain modifications compared to native or native sequences, as long as the protein maintains the desired activity. These modifications may be deliberate, for example, through site-directed mutagenesis, or, for example, accidentally through mutations in the host producing the protein or errors due to PCR amplification. There may be.

様々な用量において対象へ投与される細胞が発現するCARのような組換え受容体は、一般に、処置されている疾患または状態またはその細胞において発現され、それに関連しており、かつ/またはそれに特異的な分子を認識するかもしくはそれに特異的に結合する。分子、例えば、抗原との特異的な結合によって、受容体は、一般に、ITAMによって伝達されるシグナルのような免疫賦活性シグナルを細胞へ送達し、それによって、疾患または状態を標的とする免疫応答を促進する。例えば、いくつかの態様において、第1の用量における細胞は、疾患もしくは状態の細胞もしくは組織によって発現されるかまたは疾患もしくは状態に関連した抗原に特異的に結合する受容体、例えば、CARを発現する。 Recombinant receptors such as CAR expressed by cells administered to a subject at various doses are generally expressed, associated with, and / or specific to the disease or condition being treated or the cells thereof. Recognizes or specifically binds to a specific molecule. By specific binding to a molecule, eg, an antigen, the receptor generally delivers an immunostimulatory signal, such as a signal transmitted by ITAM, to the cell, thereby an immune response targeting the disease or condition. To promote. For example, in some embodiments, the cells at the first dose express a receptor that is expressed by a disease or condition cell or tissue or that specifically binds to a disease or condition-related antigen, such as CAR. do.

いくつかの態様において、後の用量における細胞は、疾患もしくは状態の細胞もしくは組織によって発現されるかまたは疾患もしくは状態に関連した抗原に特異的に結合する受容体、例えば、CARを発現する。いくつかの局面において、第2の用量の細胞が発現する受容体は、第1の用量の受容体と同じ抗原に特異的に結合するか、または結合について第1の用量の受容体と競合する。他の態様において、第2の用量の細胞が発現する受容体は、第1の用量の受容体が結合するものとは異なる抗原に特異的に結合する。 In some embodiments, the cells at a later dose express a receptor that is expressed by a disease or condition cell or tissue or that specifically binds to a disease or condition-related antigen, such as CAR. In some aspects, the receptor expressed by the second dose of cells specifically binds to the same antigen as the first dose of receptor or competes with the first dose of receptor for binding. .. In another embodiment, the receptor expressed by the second dose of cells specifically binds to a different antigen than that to which the first dose of receptor binds.

従って、いくつかの態様において、第2の受容体（例えば、第2のCAR）は、例えば、アミノ酸配列および/または免疫学的エピトープが、第1の受容体（例えば、第1のCAR）と、ある程度異なる。例えば、いくつかの局面において、第1の用量において投与される細胞が発現する受容体、例えば、CARは、後の用量の細胞が発現しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含有している。いくつかの態様において、第2の用量の細胞が発現する受容体、例えば、CARは、第1の用量の細胞が発現する免疫反応性エピトープを含有していない。例示的な免疫反応性エピトープには、細胞が投与される対象の免疫系によって認識され得るB細胞エピトープおよびT細胞エピトープが含まれる。 Thus, in some embodiments, the second receptor (eg, second CAR) is such that the amino acid sequence and / or immunological epitope is, for example, the first receptor (eg, first CAR). , To some extent different. For example, in some aspects, a cell-expressed receptor, eg, CAR, which is administered at the first dose contains at least one immunoreactive epitope that is not expressed by later doses of cells. In some embodiments, the receptor expressed by the second dose of cells, eg CAR, does not contain the immunoreactive epitope expressed by the first dose of cells. Exemplary immunoreactive epitopes include B cell epitopes and T cell epitopes that can be recognized by the immune system of the subject to which the cells are administered.

従って、いくつかの態様において、後の用量のCARの1種または複数種の成分は、第1の用量のCARと異なる。いくつかの態様において、第2の（または後の）受容体、例えば、CARは、第1のまたは先の受容体と比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む。例えば、いくつかの局面において、後の用量の細胞が発現するCARは、第1の用量の細胞が発現するCARと比較して、別のscFv、別のシグナル伝達ドメイン、および/または別のジャンクションを含有している。いくつかの態様において、第1および/または第2の受容体の配列、または宿主に非内在性の、例えば、宿主に天然に存在する分子にそれ自体存在しないその他の分子。そのような非内在性配列の例示的なものは、CARのようなキメラ分子の中の非天然に会合または融合したドメインのジャンクションにかかる配列である。いくつかの態様において、後の用量の細胞が発現するCARは、第1の用量のものとは異なる共刺激ドメイン、刺激ドメイン、膜貫通ドメイン、および/またはその他のドメインを含有している。 Thus, in some embodiments, the components of one or more of the later doses of CAR differ from the first dose of CAR. In some embodiments, the second (or later) receptor, eg, CAR, comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first or earlier receptor. For example, in some aspects, CARs expressed by later doses of cells are different scFvs, different signaling domains, and / or different junctions compared to CARs expressed by first doses of cells. Contains. In some embodiments, sequences of first and / or second receptors, or other molecules that are non-endogenous to the host, eg, not present in themselves in the naturally occurring molecule of the host. An exemplary such non-endogenous sequence is a sequence across a junction of a non-naturally associated or fused domain in a chimeric molecule such as CAR. In some embodiments, the CAR expressed by later doses of cells contains a different co-stimulation domain, stimulation domain, transmembrane domain, and / or other domain than that of the first dose.

そのような違いには、第1のまたは先の投与の後に対象において検出可能な免疫応答が示される第1のまたは先の受容体の領域と比較した少なくとも1つの違い、例えば、第1のまたは先の受容体のそのような領域に相当する第2のまたは後の受容体の領域における違いが含まれ得る。違いを含む領域には、scFv部分のような抗原結合部分、例えば、scFvの中のフレームワーク領域、または重鎖および/もしくは軽鎖の可変領域部分のような可変領域部分、リンカー部分、ヒンジ部分、2個のCARドメインの間のジャンクション、ならびに/または形質導入マーカーもしくは発現マーカーが含まれ得る。 Such differences include at least one difference compared to the region of the first or previous receptor that exhibits a detectable immune response in the subject after the first or previous administration, eg, the first or Differences in the region of the second or subsequent receptor corresponding to such region of the earlier receptor may be included. Regions containing differences include antigen binding moieties such as scFv moieties, eg framework regions within scFv, or variable domain moieties such as heavy and / or light chain variable regions, linker moieties, hinge moieties. , Junctions between two CAR domains, and / or transduction or expression markers may be included.

いくつかの態様において、第1のまたはその他の先の受容体、および第2のまたはその他の後の受容体は、類似性を有する領域、例えば、アミノ酸配列同一性を有する領域を含んでいてよい。例えば、いくつかの態様において、後の用量の細胞が発現するCARは、第1の用量の細胞が発現するCARと同じscFv、同一のシグナル伝達ドメイン、および/または同一のジャンクションを含有している。いくつかの態様において、それは、第1の用量のものと同じ共刺激ドメイン、刺激ドメイン、膜貫通ドメイン、および/またはその他のドメインをさらに含有している。 In some embodiments, the first or other earlier receptor and the second or other subsequent receptor may comprise a region having similarity, eg, a region having amino acid sequence identity. .. For example, in some embodiments, a CAR expressed by a later dose of cell contains the same scFv, the same signaling domain, and / or the same junction as the CAR expressed by a first dose of cell. .. In some embodiments, it further comprises the same co-stimulation domain, stimulation domain, transmembrane domain, and / or other domain as that of the first dose.

いくつかの局面において、同一性を有する領域は、対象が、第1のまたは先の投与の後に免疫応答を示さないかまたは示す可能性が低いものである。そのような領域には、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、CDR、および/または形質導入マーカーもしくは発現マーカーの中の領域が含まれ得る。 In some aspects, areas of identity are those in which the subject does not show or is unlikely to show an immune response after the first or previous dose. Such regions may include regions within co-stimulation domains, ITAM-containing domains, transmembrane domains, CDRs, and / or transduction or expression markers.

いくつかの局面において、第2の受容体、例えば、第2のCARの抗原結合ドメイン、例えば、抗体または抗体断片および/またはそのドメイン、例えば、軽鎖および/または重鎖の可変領域、例えば、scFvは、第1の受容体、例えば、第1のCARのものとは異なる種に由来する。そのようなドメインまたは断片が由来し得る例示的な種には、ヒトおよびマウスのような非ヒト種が含まれる。例えば、いくつかの態様において、第1のまたは先のCARのscFvが、マウス抗体もしくはFMC63もしくはSJ25C1のscFvのようなマウス由来部分を有する抗体に由来し、かつ第2のまたは後のCARのscFvが、ヒト抗体もしくはヒト抗体断片に由来するか、またはその逆である。 In some aspects, the antigen binding domain of the second receptor, eg, the second CAR, eg, an antibody or antibody fragment and / or its domain, eg, a variable region of a light chain and / or a heavy chain, eg, scFv is derived from a species different from that of the first receptor, eg, the first CAR. Exemplary species from which such domains or fragments can be derived include non-human species such as humans and mice. For example, in some embodiments, the scFv of the first or earlier CAR is derived from a mouse antibody or an antibody having a mouse-derived moiety such as FMC63 or SJ25C1 scFv, and the scFv of the second or subsequent CAR. Is derived from a human antibody or a human antibody fragment, or vice versa.

いくつかの態様において、第1のCARの抗原結合ドメイン、例えば、抗体部分または断片、例えば、scFvと、第2のCARのものとは、同一の種に由来する。いくつかのそのような態様において、第1および第2の受容体のドメインは、同一の種に由来するが、配列の1つまたは複数の違いを含有している。いくつかの局面において、第1のCARのscFvが、マウス配列、例えば、FMC63に由来し、かつ第2のCARのscFvが、別のマウス配列、例えば、SJ25C1に由来するか、またはその逆である。 In some embodiments, the antigen binding domain of the first CAR, eg, an antibody moiety or fragment, eg, scFv, and that of the second CAR are derived from the same species. In some such embodiments, the domains of the first and second receptors are derived from the same species but contain one or more differences in sequence. In some aspects, the scFv of the first CAR is derived from the mouse sequence, eg FMC63, and the scFv of the second CAR is derived from another mouse sequence, eg SJ25C1, or vice versa. be.

いくつかの局面において、第2の用量の受容体、例えば、CARは、第1の用量の受容体、例えば、CARと同じ抗原結合ドメイン、例えば、抗体断片または部分、例えば、scFvを含有している。いくつかの態様において、そのような後のまたは第2の受容体は、第1のまたは先の用量のCARと比較して、1個または複数個の異なるジャンクション領域を含有している。 In some aspects, the second dose of the receptor, eg CAR, contains the same antigen binding domain as the first dose receptor, eg CAR, eg, an antibody fragment or moiety, eg scFv. There is. In some embodiments, such subsequent or second receptor contains one or more different junction regions as compared to the first or earlier dose of CAR.

いくつかのそのような態様において、第2のまたは後のCARを発現する細胞の投与は、第2のCARが、第1の用量の細胞と同じジャンクションを含有し、かつ/または第1の用量の受容体に存在する非内在性配列を含有している方法と比較して、第2のまたは後の用量の細胞の排除の低下をもたらす。 In some such embodiments, administration of cells expressing the second or subsequent CAR causes the second CAR to contain the same junctions as the first dose of cells and / or the first dose. A second or later dose results in reduced elimination of cells as compared to methods containing non-endogenous sequences present at the receptor of.

いくつかの局面において、第1および第2の受容体は、同一の抗原を標的とする。いくつかの態様において、第1および第2の受容体は、前記抗原の同じエピトープを標的とする。例えば、いくつかの態様において、第1および第2の受容体は、同一のまたはオーバーラップするエピトープを標的とし、かつ/または前記抗原との結合について相互に競合するが、それぞれマウスおよびヒトのような異なる種に由来する。他の態様において、第1および第2の受容体は、同一の抗原上の異なるエピトープを標的とする。 In some aspects, the first and second receptors target the same antigen. In some embodiments, the first and second receptors target the same epitope of the antigen. For example, in some embodiments, the first and second receptors target the same or overlapping epitopes and / or compete with each other for binding to said antigen, such as mouse and human, respectively. Derived from different species. In other embodiments, the first and second receptors target different epitopes on the same antigen.

いくつかの態様において、第2の分子、例えば、受容体、例えば、CARは、第1のものに含有されている1個または複数個の免疫原性部分を含まず；いくつかの態様において、第2の受容体は、第1の受容体の免疫原性部分（または指定されたアッセイによって免疫原性であると見なされた部分）を含有していない。いくつかのそのような態様において、第2の受容体、例えば、CARは、第1の受容体に含有されている免疫原性部分を含まず、かつ/または、例えば、特定の対象において免疫原性であると見なされ、かつ/または、例えば、処置された対象において特異的な免疫応答が検出される部分を含有しないよう、特異的に選択されかつ/または設計される。いくつかの局面において、第1の受容体、例えば、CARの免疫原性部分が、別の配列に交換される。 In some embodiments, the second molecule, eg, a receptor, eg, CAR, does not contain one or more immunogenic moieties contained in the first; in some embodiments, The second receptor does not contain the immunogenic portion of the first receptor (or the portion considered immunogenic by the specified assay). In some such embodiments, the second receptor, eg, CAR, does not contain the immunogenic moiety contained in the first receptor and / or, eg, in a particular subject. It is considered to be sex and / or is specifically selected and / or designed so that it does not contain, for example, a moiety in which a specific immune response is detected in the treated subject. In some aspects, the first receptor, eg, the immunogenic portion of CAR, is exchanged for another sequence.

いくつかの態様において、例えば、対象が、第1の受容体もしくは分子が標的とする抗原もしくはその他の結合パートナーを標的とする処置に対して抵抗性になった場合、および/または抗原もしくは結合パートナーが、対象もしくは疾患組織（例えば、腫瘍）においてダウンレギュレートされているかもしくは変異している場合、第2の用量の受容体（例えば、CAR）は、第1の用量の受容体が標的とするものと比較して別の抗原を標的とするよう設計されるかまたは選択される。いくつかのそのような局面において、第2の用量（即ち、第2の分子、例えば、第2の受容体を発現する細胞）の投与は、同一の細胞の後の用量、同一の受容体を発現する細胞、および/または同一の抗原を標的とする受容体を発現する細胞の投与より、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍負荷のより大きい低減を達成する。 In some embodiments, for example, if the subject becomes resistant to treatment targeting an antigen or other binding partner targeted by the first receptor or molecule, and / or the antigen or binding partner. However, if the subject or diseased tissue (eg, tumor) is down-regulated or mutated, the second dose of the receptor (eg, CAR) is targeted by the first dose of the receptor. Designed or selected to target another antigen in comparison to one. In some such aspects, administration of a second dose (ie, a cell expressing a second molecule, eg, a second receptor) is a subsequent dose of the same cell, the same receptor. Greater reduction of disease load, eg, tumor load, in a subject is achieved by administration of expressing cells and / or cells expressing a receptor that targets the same antigen.

これに関して、方法は、いくつかの態様において、疾患または状態またはその細胞によるダウンレギュレーションまたは変異に起因するような、特定のエピトープまたは抗原またはその他の疾患標的を標的とする処置に対して疾患または状態が抵抗性になった対象の処置において有用であり得る。従って、類似しているが別のものである疾患関連エピトープまたは疾患を標的とする能力を提示することによって、方法は、いくつかの態様において、例えば、対象におけるそのような改変細胞の増大または持続性の増加を介して、受容体またはその他の組換え分子を発現する細胞への対象の全体的な曝露を増加させることのみならず、最初の標的のダウンレギュレーションまたは変異の状況ですら細胞が機能することを可能にすることによっても、効力を改善する。 In this regard, the method, in some embodiments, is a disease or condition for a procedure that targets a particular epitope or antigen or other disease target, such as due to downregulation or mutation by the disease or condition or its cells. Can be useful in the treatment of subjects who have become resistant. Thus, by presenting the ability to target similar but different disease-related epitopes or diseases, the method in some embodiments, eg, augmentation or persistence of such modified cells in a subject. Through increased sex, cells function not only to increase the subject's overall exposure to cells expressing receptors or other recombinant molecules, but also to downregulation or mutational conditions of the initial target. It also improves efficacy by allowing you to do so.

IV.投与された細胞に対する宿主免疫応答
いくつかの態様において、養子細胞療法の効力は、投与された細胞および/または構築物に対する、対象における免疫応答の発達によって、制限され得る。しばしば免疫不全であるB細胞悪性腫瘍を有する何人かの対象においてすら、養子細胞療法において投与された細胞が発現する受容体の領域に特異的な免疫応答が検出され得ることが、本明細書において観察される。さらに、いくつかの状況において、細胞療法が標的とする疾患に特異的なまたは疾患に関連した抗原の喪失、ダウンレギュレーション、および/または修飾が、対象において起こり得、それは、その抗原またはエピトープを標的とする療法の効力を損なうことができる。例えば、抗CD19免疫療法によって処置された何人かの対象において、CD19陰性疾患が観察されている。いくつかの態様において、提供される方法は、一つまたは複数のそのような状況において、改善された効力を提供する。 IV. Host Immune Response to Administered Cells In some embodiments, the efficacy of adoptive cell therapy may be limited by the development of an immune response in the subject to administered cells and / or constructs. It is herein that even in some subjects with B-cell malignant tumors, which are often immunocompromised, immune responses specific to the region of the receptor expressed by the cells administered in adoptive cell therapy can be detected. Observed. In addition, in some situations, loss, downregulation, and / or modification of disease-specific or disease-related antigens targeted by cell therapy can occur in the subject, which targets the antigen or epitope. The effectiveness of the therapy can be impaired. For example, CD19-negative disease has been observed in some subjects treated with anti-CD19 immunotherapy. In some embodiments, the methods provided provide improved efficacy in one or more such situations.

提供される方法のいくつかの態様において、第2の受容体を発現する細胞の一つまたは複数の用量または投与、例えば、後の用量または投与は、第1の組換え受容体および/または細胞に対する免疫応答、例えば、適応免疫応答または特異的な免疫応答が、対象において、存在するか、検出可能であるか、または一定のレベルを超えて検出可能であるようになった時点で投与される。組換え分子に対する特異的な免疫応答の存在または程度は、細胞が発現する受容体、例えば、CARまたはトランスジェニックTCRの免疫原性特性および/または対象がそれに曝される時間に関係し得る。例えば、いくつかの態様において、受容体に対する免疫応答、例えば、特異的な体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答は、第1の受容体を発現する細胞への対象の最初の曝露の後、28日目、約28日目、35日目、約35日目、42日目、または約42日目に検出される。従って、いくつかの態様において、第1の用量の細胞が発現する受容体を発現しない、受容体を発現する細胞の後の用量は、第1のまたは先の用量の第1の組換え受容体または細胞に対する免疫応答、適応免疫応答もしくは特異的免疫応答、検出可能な免疫応答、および/またはメモリ応答が対象において発達した後に投与される。この点に関して、後の用量の細胞の対象において増大しかつ/または持続する能力は、後の用量の細胞が第1の用量と同じ受容体を発現する他の方法と比較して、改善される。いくつかの態様において、第2のまたは後の用量は、少なくとも28日目、約28日目、35日目、約35日目、42日目、もしくは約42日目の時点で、または、28日目、約28日目、35日目、約35日目、42日目、もしくは約42日目以降の時点で投与される。いくつかの態様において、それは、14日目もしくは約14日目もしくは21日目もしくは約21日目、または少なくとも14日目もしくは約14日目もしくは21日目もしくは約21日目に投与される。 In some embodiments of the provided method, one or more doses or doses of cells expressing the second receptor, eg, later doses or doses, are the first recombinant receptor and / or cells. An immune response to, eg, an adaptive or specific immune response, is administered when it becomes present, detectable, or detectable above a certain level in the subject. .. The presence or extent of a specific immune response to a recombinant molecule may be related to the immunogenicity properties of the cell-expressed receptor, eg, CAR or transgenic TCR, and / or the time the subject is exposed to it. For example, in some embodiments, an immune response to a receptor, eg, a specific humoral and / or cell-mediated immune response, is after the subject's initial exposure to cells expressing the first receptor. , 28th day, about 28th day, 35th day, about 35th day, 42nd day, or about 42nd day. Thus, in some embodiments, the dose after the receptor-expressing cell that does not express the receptor that the first dose of cells express is the first or earlier dose of the first recombinant receptor. Alternatively, it is administered after an immune response to cells, an adaptive or specific immune response, a detectable immune response, and / or a memory response has developed in the subject. In this regard, the ability of later doses of cells to increase and / or sustain in a subject is improved compared to other methods in which later doses of cells express the same receptors as the first dose. .. In some embodiments, the second or subsequent dose is at least at day 28, about 28, 35, about 35, 42, or about 42, or 28. It is administered at the time of the day, about 28th day, 35th day, about 35th day, 42nd day, or about 42nd day or later. In some embodiments, it is administered on day 14 or about 14 or 21 or about 21 or at least 14 or about 14 or 21 or about 21 days.

前記方法は、このような免疫応答またはその指標の存在もしくは非存在またはレベルを、例えば、第1の用量または第2の用量の投与後、および後の用量または次の後の用量の投与前に検出することを伴ってもよい。 The method comprises the presence or absence or level of such an immune response or indicator thereof, eg, after administration of a first or second dose, and prior to administration of a later dose or a subsequent subsequent dose. It may be accompanied by detection.

一部の態様において、後の用量をいつ投与するか、および/または後の用量を投与するかどうかの決断は、対象が、このような免疫応答またはその検出可能な読み取り値を、例えば、第1の用量の細胞、もしくは第1の用量の細胞によって発現される組換え受容体、例えば、CARに対して特異的である検出可能な特異的な宿主免疫応答もしくは適応宿主免疫応答を、示すかどうか、ならびに/またはこのような応答が、ある特定のレベルを上回って検出されたかどうかに左右される。一部の態様において、このような応答が検出された場合、対象には後の用量が投与される。 In some embodiments, the determination of when to administer the later dose and / or whether to administer the later dose allows the subject to obtain such an immune response or its detectable reading, eg, first. Does it exhibit a detectable specific host immune response or adaptive host immune response that is specific for a recombinant receptor, eg, CAR, expressed by a dose of 1 cell, or a 1st dose of cell? It depends on whether and / or whether such a response is detected above a certain level. In some embodiments, if such a response is detected, the subject is administered a later dose.

一般的に、対象が、第1の用量の細胞によって発現される受容体、例えば、CARに対する特異的な免疫応答もしくは適応免疫応答、例えば、体液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答を示すか、またはこのような応答もしくはその指標を、検出可能なレベルで、もしくは許容されるレベルを上回って示す時期に、後の用量は投与される。一部の局面において、後の用量が投与される時には、対象は、第1の用量の細胞によって発現される受容体、例えばCARに対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答を示す。 In general, a subject exhibits or exhibits a receptor expressed by a first dose of cells, eg, a specific immune response or adaptive immune response to CAR, eg, a humoral or cell-mediated immune response. Later doses are administered at a time when such a response or indicator thereof is indicated at a detectable level or above an acceptable level. In some aspects, when a later dose is administered, the subject exhibits a humoral or cell-mediated immune response to a receptor expressed by the cells of the first dose, such as CAR.

一部の態様において、宿主免疫応答は体液性免疫応答であるか、または体液性免疫応答を含む。体液性免疫応答は、対象の血清、他の体液、および/または臓器もしくは組織の中にある、前記細胞またはそれによって発現される受容体に特異的な抗体の存在によって示されてもよい。一部の態様において、特定のアイソタイプのこのような抗体、例えば、IgMまたはIgG、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、および/またはIgG4が存在する。一部の態様において、このような抗体はIgEを含む。 In some embodiments, the host immune response is or comprises a humoral immune response. A humoral immune response may be indicated by the presence of antibodies specific for the cells or receptors expressed by them in the serum, other body fluids, and / or organs or tissues of interest. In some embodiments, there are such antibodies of a particular isotype, such as IgM or IgG, such as IgG1, IgG2, IgG3, and / or IgG4. In some embodiments, such antibodies include IgE.

一部の態様において、免疫応答は細胞性成分であるか、または細胞性成分を含む。細胞性応答は、T細胞受容体を介して、組換え受容体の1つもしくは複数のエピトープまたは細胞を特異的に認識する細胞、例えば、T細胞、例えば、ヘルパー細胞または細胞傷害性T細胞の存在によって示されてもよい。 In some embodiments, the immune response is or comprises a cellular component. The cellular response is a cell that specifically recognizes one or more epitopes or cells of the recombinant receptor via the T cell receptor, such as T cells, such as helper cells or cytotoxic T cells. It may be indicated by presence.

一部の態様において、免疫応答は一次免疫応答である。一部の局面において、免疫応答は記憶応答である。 In some embodiments, the immune response is a primary immune response. In some aspects, the immune response is a memory response.

上述の任意の態様の一部において、検出可能な免疫応答とは、特定の抗原および細胞に対する特異的免疫応答を評価するための多数の公知の方法のうちのどの方法でも検出することができる量を指す。例えば、一部の態様において、特定のタイプの免疫応答は、前記細胞上に存在する抗原に特異的に結合する、および/または前記細胞上に存在する抗原を中和する抗体、例えば、組換え受容体、例えば、CARのエピトープに結合する抗体の存在を検出するために、対象に由来する血清に対して、ELISpot、ELISA、または細胞に基づく抗体検出方法を行うことによって、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。このような一部のアッセイでは、検出される抗体のアイソタイプが決定され、応答のタイプ、および/または応答が記憶応答かどうかを示し得る。 In some of the aforementioned embodiments, the detectable immune response is an amount that can be detected by any of a number of known methods for assessing a specific immune response against a particular antigen and cell. Point to. For example, in some embodiments, a particular type of immune response is an antibody that specifically binds to and / or neutralizes an antigen present on the cell, eg, recombinant. For example, flow cytometry by performing an ELI Spot, ELISA, or cell-based antibody detection method on serum derived from a subject to detect the presence of an antibody that binds to a receptor, eg, an epitope of CAR. Can be detected by. Some such assays determine the isotype of the antibody to be detected and may indicate the type of response and / or whether the response is a memory response.

一部の態様において、特定の免疫応答は、組換え受容体中のエピトープに特異的に結合し、これに応答して細胞傷害性を誘導するCD8⁺T細胞を検出するための細胞傷害性T-リンパ球(CTL)アッセイ、および/または組換え受容体を発現する細胞、例えば、放射線照射済み細胞をスティミュレーター(stimulator)細胞として用いる混合リンパ球反応によって検出することができる。 In some embodiments, a particular immune response specifically binds to an epitope in a recombinant receptor and responds to it by detecting ^cytotoxic T cells that induce cytotoxicity. -The lymphocyte (CTL) assay and / or cells expressing recombinant receptors, such as irradiated cells, can be detected by a mixed lymphocyte reaction using as a stimulator cell.

一部の局面において、検出可能な免疫応答は、対照試料、例えば、コーティングされていないウェル、または対照ペプチド、もしくは組換え受容体を発現しない細胞でコーティングされたウェルのレベル、および/または組換え受容体発現細胞を用いた処置前の対象に由来する処置前の血清もしくは血液試料に基づいて検出されたレベルを上回るか、または有意に上回る、このような方法によって検出された免疫応答である。 In some aspects, the detectable immune response is the level of the control sample, eg, uncoated wells, or control peptides, or cells coated with cells that do not express recombinant receptors, and / or recombination. Immune responses detected by such methods that exceed or significantly exceed the levels detected based on pretreatment serum or blood samples from pretreatment subjects with receptor-expressing cells.

一部の局面において、このような宿主免疫応答の存在もしくは非存在、および/またはその数量、程度、もしくは度合いは、例えば、第1の用量または後の用量の投与後に検出または測定される。 In some aspects, the presence or absence of such a host immune response and / or the quantity, extent, or degree thereof is detected or measured, for example, after administration of a first dose or a subsequent dose.

体液性免疫応答は、結合アッセイ、イムノアッセイを含み、かつ細胞に基づくアッセイを含む、特定の抗原または細胞に特異的な抗体を検出するための多数の周知のアッセイのうちのどのアッセイでも検出することができる。前記アッセイには、抗体の特定の機能、例えば、抗原に結合した時に特定のエフェクター機能を行う能力の存在または非存在を評価するように設計されたアッセイ、例えば、中和抗体アッセイが含まれ得る。一部の態様では、細胞に基づくアッセイを用いて、例えば、対象に由来する処置前および処置後の細胞を、組換え受容体発現細胞(および対照細胞)とインキュベートし、抗原特異的結合および/または他の転帰、例えば、中和転帰を、例えば、フローサイトメトリーまたは酵素アッセイで検出することによって、体液性免疫応答の転帰、例えば、抗原特異的抗体、例えば、中和抗体が検出される。一部の態様では、組換え受容体、例えば、CAR、および公知の技法を用いてマッピングされたエピトープ、例えば、前記受容体の一部に相当する個々のペプチドを用いたエピトープに特異的な抗体を検出および定量するために、ELISAおよび/またはELISpotアッセイが用いられる。例えば、Berger et al. Blood. 2006 March; 107(6): 2294-2302、Berger et al. J Virol. 2001 January 75(2): 799-808、Riddell et al. Nature Medicine. 1996 February 2(2): 216-223、Berger et al. Blood. 2005 February 105(4): 1640-1647、Jensen et al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 September; 16(9): 1245-1256を参照されたい。一部の態様において、検出された抗体のアイソタイプは、例えば、特定のアイソタイプ、例えば、ヒトアイソタイプに特異的な検出抗体を用いて評価される。 The humoral immune response should be detected by any of a number of well-known assays for detecting specific antigens or cell-specific antibodies, including binding assays, immunoassays, and cell-based assays. Can be done. The assay may include an assay designed to assess the presence or absence of a particular function of an antibody, eg, the ability to perform a particular effector function when bound to an antigen, eg, a neutralizing antibody assay. .. In some embodiments, cell-based assays are used, for example, to incubate subject-derived pre- and post-treatment cells with recombinant receptor-expressing cells (and control cells) for antigen-specific binding and /. Or other outcomes, eg, neutralization outcomes, are detected, eg, by flow cytometry or enzyme assay, to detect outcomes of humoral immune responses, eg, antigen-specific antibodies, eg, neutralizing antibodies. In some embodiments, an assay specific for a recombinant receptor, such as CAR, and an epitope using an epitope mapped using known techniques, such as an individual peptide corresponding to a portion of said receptor. The ELISA and / or ELISA Spot assay is used to detect and quantify. For example, Berger et al. Blood. 2006 March; 107 (6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. 2001 January 75 (2): 799-808, Riddell et al. Nature Medicine. 1996 February 2 (2) ): 216-223, Berger et al. Blood. 2005 February 105 (4): 1640-1647, Jensen et al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 September; 16 (9): 1245-1256. In some embodiments, the detected antibody isotype is evaluated using, for example, a particular isotype, eg, a detected antibody specific for a human isotype.

前記細胞および/または受容体に対する細胞免疫応答または細胞に基づく免疫応答は、多数の周知の技法のうちのどの技法でも検出および/または測定することができる。このような技法には、投与された組換え受容体、例えば、CAR、および/または細胞の中にあるエピトープに特異的に結合し、これに応答して細胞傷害性を誘導するCD8+T細胞を検出するための細胞傷害性T-リンパ球(CTL)アッセイが含まれ得る。一部の態様において、前記アッセイは、混合リンパ球反応、例えば、レスポンダー(responder)細胞として、血液または他の臓器もしくは組織に由来するPBMCまたは他の宿主由来細胞と、スティミュレーター細胞として組換え受容体を発現するように誘導された細胞、例えば、放射線照射済みCAR発現T細胞を使用する混合リンパ球反応である。スティミュレーター細胞は一般的に自己由来であり、対象に投与される同じ細胞でもよく、放射線照射されてもよい。関心対象のトランスジーンを発現しない形質導入されていない細胞が、対照試料中で、スティミュレーター細胞の代わりに負の対照として用いられてもよい。同様に、処置前の時点または他の対象からのレスポンダー細胞試料が対照試料中に用いられてもよい。一部の局面において、このようなアッセイでは、宿主細胞が1つまたは複数のエフェクター機能、例えば、抗原特異的細胞溶解を行う能力を、例えば、投与された細胞の表面または投与された細胞の中に存在する抗原を特異的に認識し、細胞傷害応答を誘導する、対象に存在する細胞傷害性T細胞を検出するクロム放出アッセイを用いて評価する。一部の態様において、前記細胞の投与前および投与後に対象から末梢血細胞、例えば、PBMCが得られ、それぞれが、組換え受容体を発現するように改変された、一般的に放射線照射済みの自己由来T細胞を用いたアッセイ、例えば、細胞溶解アッセイにおいて用いられる。特異的溶解は、受容体特異的な細胞性免疫応答が存在することを示す。エピトープマッピングは、前記組換え受容体の一部に相当するペプチドのパネルを用いて行われてもよい。例えば、Berger et al. Blood. 2006 March; 107(6): 2294-2302、Berger et al. J Virol. 2001 January 75(2): 799-808、Riddell et al. Nature Medicine. 1996 February 2(2): 216-223 (1996)、Berger et al. Blood. 2005 February 105(4): 1640-1647、Lamers, Blood 2011 117: 72-82を参照されたい。抗原特異的T細胞を数え上げるためにHLA四量体結合アッセイが用いられてもよい。一部の局面において、トランスジーン特異的CD4+T細胞を検出するために、リンパ球増殖アッセイ(LPA)および/または分泌型サイトカインを評価するアッセイ、例えば、ELISAおよび/または細胞内染色、ならびにフローサイトメトリーによる評価が用いられる。 Cellular or cell-based immune responses to the cells and / or receptors can be detected and / or measured by any of a number of well-known techniques. Such techniques include CD8 + T cells that specifically bind to administered recombinant receptors, such as CAR, and / or epitopes within the cell, in response to inducing cytotoxicity. A cytotoxic T-lymphocyte (CTL) assay for detection can be included. In some embodiments, the assay is recombinant as a stimulator cell with a mixed lymphocyte reaction, eg, PBMC or other host-derived cells derived from blood or other organs or tissues, as responder cells. Mixed lymphocyte reaction using cells induced to express the receptor, eg, irradiated CAR-expressing T cells. Stimulator cells are generally self-derived and may be the same cells administered to the subject or may be irradiated. Non-transduced cells that do not express the transgene of interest may be used as a negative control in place of the stimulator cells in the control sample. Similarly, responder cell samples from pretreatment time points or other subjects may be used in the control sample. In some aspects, in such an assay, the host cell has the ability to perform one or more effector functions, eg, antigen-specific cell lysis, eg, on the surface of the administered cell or within the administered cell. It is evaluated using a chromium release assay that detects cytotoxic T cells present in the subject, which specifically recognizes the antigen present in the cell and induces the cytotoxic response. In some embodiments, peripheral blood cells, eg, PBMCs, are obtained from the subject before and after administration of the cells, each modified to express recombinant receptors, generally irradiated self. It is used in assays using derived T cells, such as cytolytic assays. Specific lysis indicates the presence of a receptor-specific cell-mediated immune response. Epitope mapping may be performed using a panel of peptides corresponding to some of the recombinant receptors. For example, Berger et al. Blood. 2006 March; 107 (6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. 2001 January 75 (2): 799-808, Riddell et al. Nature Medicine. 1996 February 2 (2) ): 216-223 (1996), Berger et al. Blood. 2005 February 105 (4): 1640-1647, Lamers, Blood 2011 117: 72-82. The HLA tetramer binding assay may be used to count antigen-specific T cells. In some aspects, an assay to evaluate lymphocyte proliferation assay (LPA) and / or secretory cytokines to detect transgene-specific CD4 + T cells, such as ELISA and / or intracellular staining, and flow. Evaluation by cytometry is used.

いくつかの態様において、対象における細胞または受容体に対する特異的な免疫応答の存在または欠如は、例えば、本明細書に記載されたアッセイのいずれか、例えば、エピトープマッピングによって査定される。いくつかの局面において、例えば、第1の投与の後に対象において免疫応答が発達したかまたは発達した可能性が高い第1の受容体の中の免疫原性エピトープおよび/または領域が決定され、そのような免疫原性のエピトープもしくは領域を含有せず、かつ/またはそのような領域においてアミノ酸の違いを含有している第2の受容体が選択される。 In some embodiments, the presence or absence of a specific immune response to a cell or receptor in a subject is assessed, for example, by any of the assays described herein, eg, epitope mapping. In some aspects, for example, an immunogenic epitope and / or region within a first receptor in which an immune response has developed or is likely to have developed in a subject after the first administration has been determined. A second receptor is selected that does not contain such immunogenic epitopes or regions and / or contains amino acid differences in such regions.

いくつかの態様において、第1のまたは先の投与の後にそのような免疫応答の存在または欠如が検出され、第1のまたは先の受容体と比較して、どのような違いが、第2のまたは後の受容体に存在するよう設計されるかを通知する。そのような検出は、対象が特異的な免疫応答を示す、第1のまたはその他の先の受容体（例えば、CAR）の少なくとも1個の領域の同定を含み得る。 In some embodiments, the presence or absence of such an immune response is detected after the first or previous administration, and what is the difference compared to the first or earlier receptor is the second. Or inform if it is designed to be present at a later receptor. Such detection may include identification of at least one region of the first or other earlier receptor (eg, CAR) in which the subject exhibits a specific immune response.

従って、いくつかの態様において、第2の用量の細胞は、それらが発現する受容体に基づき選択される。いくつかの態様において、第2の用量は、対象が第1のもしくは先の用量の投与の後に免疫応答を発達させた特定の免疫反応性エピトープを含有しておらず、および/またはそのような免疫反応性エピトープもしくは免疫原性であると決定された任意のそのようなエピトープを含有していない受容体（例えば、CAR）を発現する細胞を含有している。いくつかの局面において、対象は、免疫原性であると決定された1個または複数個の領域において第1の用量の細胞が発現する受容体とは異なるものである受容体を発現する細胞の第2のまたは後の用量を投与され得る。従って、いくつかの態様において、第2の（またはその他の後の）用量において投与される受容体を発現する細胞の選択は、患者特異的である。 Thus, in some embodiments, the second dose of cells is selected based on the receptors they express. In some embodiments, the second dose does not contain a particular immunoreactive epitope in which the subject has developed an immune response after administration of the first or previous dose, and / or such. It contains cells expressing an immunoreactive epitope or a receptor (eg, CAR) that does not contain any such epitope determined to be immunogenic. In some aspects, the subject is a cell expressing a receptor that is different from the receptor expressed by the first dose of cells in one or more regions determined to be immunogenic. A second or later dose may be administered. Therefore, in some embodiments, the selection of cells expressing the receptor administered at the second (or other later) dose is patient-specific.

いくつかの態様において、第1の用量の細胞が発現する受容体とは異なるものである受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している第2の用量の投与は、第1の用量の受容体に対して特異的である検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発しない。いくつかの局面において、第2の用量は、第2の用量の細胞が発現する受容体に対して、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発しない。 In some embodiments, administration of a second dose containing a receptor that is different from the receptor expressed by the cells of the first dose, eg, cells expressing CAR, is the first dose. Does not elicit a detectable humoral or cell-mediated immune response that is specific for its receptor. In some aspects, the second dose does not elicit a detectable humoral or cell-mediated immune response to the receptors expressed by the cells of the second dose.

従って、いくつかの態様において、対象は、第2の受容体を発現する細胞の投与の後に、第2の受容体に対する検出可能な免疫応答、例えば、体液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答のような免疫応答を示さないか、または一定の期間内、例えば、それらの細胞の投与の約60日以内に、そのような応答を示さない。 Thus, in some embodiments, the subject will have a detectable immune response to the second receptor, such as a humoral or cell-mediated immune response, after administration of cells expressing the second receptor. No immune response or no such response within a period of time, eg, within about 60 days of administration of those cells.

いくつかの態様において、方法は、第2の用量の細胞が発現する受容体に対する抗体の誘導を防止するかまたはそのレベルを低下させる。例えば、後の用量の投与の後の、例えば、ELISAによって対象の血清において測定されるような、抗受容体抗体、例えば、抗CAR抗体の抗体力価は、第1の用量の細胞と同じ受容体を発現する細胞の後の用量が投与される方法と比較して、減少する。従って、いくつかの態様において、方法は、投与された細胞を除去するかまたはその増大を防止するであろう宿主免疫応答を防止するかまたは低下させることによって、投与された細胞への対象の曝露を増加させることによって、効力を改善する。 In some embodiments, the method prevents or reduces the level of antibody to a second dose of cell-expressed receptor. For example, the antibody titer of an anti-receptor antibody, eg, an anti-CAR antibody, after administration of a later dose, eg, as measured in the serum of interest by ELISA, is the same acceptance as the cells of the first dose. Subsequent doses of cells expressing the body are reduced compared to the method of administration. Thus, in some embodiments, the method exposes the subject to the administered cells by removing or reducing the host immune response that would prevent the cells to be administered. Improve efficacy by increasing.

V.投薬法
方法は、一般に、例えば、経時的な、細胞への対象の曝露の増加を提供することによって、養子細胞療法の効力を改善するため、設計される。方法は、いくつかの異なる用量の間の特定の時間枠で、第1の用量を投与した後、一般に、第2のおよび/または一つもしくは複数の付加的な後の用量を投与する工程を含む。 V. Dosing Methods Methods are generally designed to improve the efficacy of adoptive cell therapy by providing, for example, increased exposure of the subject to cells over time. The method involves administering the first dose in a specific time frame between several different doses, followed by generally administering a second and / or one or more additional subsequent doses. include.

養子細胞療法の状況において、所定の「用量」の投与には、単一の組成物および/または単一の中断されない投与としての、例えば、単一の注射または連続注入としての、所定の量または数の細胞の投与が包含され、これには、3日以内である指定された期間にわたり複数の個々の組成物または注入として提供される分割用量としての所定の量または数の細胞の投与も包含される。従って、いくつかの状況において、用量は、単一の時点で与えられるかまたは開始される、指定された数の細胞の単一のまたは連続的な投与である。しかしながら、いくつかの状況において、用量は、3日以内の期間での複数の注射または注入で、例えば、1日1回、3日間もしくは2日間の、または1日での複数の注入によって、投与される。 In the context of adoptive cell therapy, a given "dose" of administration may be a single composition and / or a given amount or as a single uninterrupted dose, eg, as a single injection or continuous infusion. Administration of a number of cells is included, which also includes administration of a predetermined amount or number of cells as a divided dose provided as multiple individual compositions or infusions over a specified period of time within 3 days. Will be done. Thus, in some situations, the dose is a single or continuous dose of a specified number of cells given or initiated at a single point in time. However, in some situations, the dose is administered by multiple injections or infusions over a period of up to 3 days, eg, once daily, 3 or 2 days, or by multiple infusions per day. Will be done.

従って、いくつかの局面において、細胞は単一の薬学的組成物で投与される。 Therefore, in some aspects, the cells are administered in a single pharmaceutical composition.

いくつかの態様において、細胞は、単一の用量の細胞を集合的に含有している複数の組成物で投与される。 In some embodiments, the cells are administered in a plurality of compositions that collectively contain a single dose of cells.

「分割用量」という用語は、2回以上の注入によって、例えば、2日以上にわたり投与されるよう分割された用量をさす。この型の投薬法は、本発明の方法に包含され、単一の用量であると見なされる。分割用量は、3日以内の期間にわたり注入される。 The term "divided dose" refers to a divided dose that is administered by two or more infusions, eg, over two days or more. This type of dosing is included in the method of the invention and is considered to be a single dose. Divided doses are infused over a period of up to 3 days.

従って、一つまたは複数の用量が、いくつかの局面において、分割用量として投与されてもよい。例えば、いくつかの態様において、用量は、2日にわたりまたは3日にわたり対象へ投与されてよい。分割投薬法の例示的な方法には、1日目に用量の25％を投与し、2日目に用量の残りの75％を投与することが含まれる。他の態様において、用量の33％が1日目に投与され、残りの67％が2日目に投与されてもよい。いくつかの局面において、用量の10％が1日目に投与され、用量の30％が2日目に投与され、用量の60％が3日目に投与される。いくつかの態様において、分割用量は3日を超えて拡張されない。 Thus, one or more doses may be administered as divided doses in some aspects. For example, in some embodiments, the dose may be administered to the subject over 2 or 3 days. An exemplary method of split dosing involves administering 25% of the dose on day 1 and the remaining 75% of the dose on day 2. In other embodiments, 33% of the dose may be administered on day 1 and the remaining 67% may be administered on day 2. In some aspects, 10% of the dose is administered on day 1, 30% of the dose is administered on day 2, and 60% of the dose is administered on day 3. In some embodiments, the divided dose is not extended beyond 3 days.

いくつかの態様において、複数の用量は、いくつかの局面において、第1の用量と第2の用量との間のタイミングに関するものと同じタイミングガイドラインを使用して、例えば、後の用量が、第1のまたは先の用量の投与の約28日後より遅い時点で与えられる、第1および複数の後の用量の投与によって、与えられる。 In some embodiments, the plurality of doses, in some aspects, use the same timing guidelines as those relating to the timing between the first dose and the second dose, eg, the later dose. It is given by administration of the first and multiple subsequent doses, given later than about 28 days after administration of the one or earlier dose.

本明細書において使用されるように、「第1の用量」とは、所定の用量のタイミングが、後のまたは第2の用量の投与の前であることを記載するために使用される。その用語は、対象が細胞療法の用量を過去に受けたことがないことを必ずしも暗示せず、対象が、同一の細胞、または同一のもしくは異なる組換え受容体を発現するか、もしくは同一のもしくは異なる抗原を標的とする細胞の用量を過去に受けたことがないことも必ずしも暗示しない。例えば、いくつかの態様において、第1の用量とは、本明細書において使用されるように、第2またはそれ以上の細胞の対象への注入を表す。 As used herein, the term "first dose" is used to describe that the timing of a given dose is later or before administration of the second dose. The term does not necessarily imply that the subject has never received a dose of cell therapy in the past, and the subject expresses the same cells, or the same or different recombinant receptors, or is the same or It does not necessarily imply that they have never received doses of cells targeting different antigens in the past. For example, in some embodiments, the first dose refers to the infusion of a second or higher cell into a subject, as used herein.

本明細書において使用されるように、「第2の用量」とは、所定の用量のタイミングが、先の、例えば、第1の用量の投与の後であることを記載するために使用される。その用語は、対象が細胞療法の一つの用量のみを過去に受けたことがあることを必ずしも暗示せず、対象が、同一の組換え受容体を発現するかまたは同一の抗原を標的とする細胞の用量のみを過去に受けたことがあることも必ずしも暗示しない。いくつかの態様において、複数の用量が、第1の用量と第2の用量との間に、かつ/または第1の用量の前に、または第2の用量の後に投与される。例えば、第1の用量の細胞（または第1の用量の受容体を発現する細胞）の複数の用量が投与された後、第2の用量の細胞または受容体の複数の用量が投与されてもよい。第1および第2という用語は、時間的に相互に異なる用量を記載するために使用されるに過ぎない。 As used herein, "second dose" is used to describe that the timing of a given dose is earlier, eg, after administration of the first dose. .. The term does not necessarily imply that the subject has received only one dose of cell therapy in the past, cells expressing the same recombinant receptor or targeting the same antigen. It does not necessarily imply that you have received only the dose of. In some embodiments, multiple doses are administered between the first dose and / or before the first dose or after the second dose. For example, even if multiple doses of the first dose of cells (or cells expressing the first dose of the receptor) are administered followed by multiple doses of the second dose of cells or receptors. good. The terms first and second are only used to describe doses that differ from each other in time.

第1の用量のような先の用量に対して、「後の用量」という用語は、先の、例えば、第1の用量の後に同一の対象へ投与される用量をさす。いくつかの局面において、後の用量は、第2、第3、第4等の用量である。用量を記載する時、「後の」という用語も、特定の数値（例えば、「第2の」）も、介在する用量が存在しないことを暗示しない。 The term "later dose" as opposed to a earlier dose, such as the first dose, refers to a dose administered to the same subject after the earlier, eg, first dose. In some aspects, the later doses are the second, third, fourth, etc. doses. When describing the dose, neither the term "after" nor a particular number (eg, "second") implies the absence of an intervening dose.

いくつかの態様において、第1の用量と同じ受容体、例えば、CARを発現する細胞の一つまたは複数の連続的な用量が、対象へ投与されてもよい。 In some embodiments, the same receptor as the first dose, eg, one or more successive doses of cells expressing CAR, may be administered to the subject.

第1の用量のような先の用量に対して、「連続的な用量」という用語は、間に対象へ投与される介在する用量なしに、先の、例えば、第1の用量の後に同一の対象へ投与される用量をさす。にも関わらず、その用語には、単一の分割用量に含まれる一連の注入または注射の中の第2、第3等の注射または注入は包含されない。従って、特記されない限り、1日、2日、または3日の期間内の第2の注入は、本明細書において使用されるような「連続的な」用量であるとは見なされない。同様に、分割用量における一連の複数の用量の中の第2、第3等も、「連続的な」用量の意味の状況における「介在する」用量であるとは見なされない。従って、特記されない限り、対象が、第1の用量の開始の後に、第2のまたは後の細胞の注射または注入を受けたとしても、第2のまたは後の注射または注入が、第1のまたは先の用量の開始の後、3日以内に起こる限り、第1のまたは先の用量の開始の、3日を超える一定期間後に投与される用量は、「連続的な」用量であると見なされる。 For earlier doses, such as the first dose, the term "continuous dose" is the same after the earlier, eg, first dose, without an intervening dose administered to the subject in between. Refers to the dose given to a subject. Nevertheless, the term does not include second, third, etc. injections or infusions within a series of injections or injections contained in a single divided dose. Therefore, unless otherwise noted, a second infusion within a one-day, two-day, or three-day period is not considered to be a "continuous" dose as used herein. Similarly, the second, third, etc. of a series of multiple doses in a divided dose are not considered to be "intervening" doses in the context of a "continuous" dose meaning. Thus, unless otherwise stated, even if a subject receives an injection or infusion of a second or subsequent cell after the start of the first dose, the second or subsequent injection or infusion is the first or infusion. A dose administered after a period of more than 3 days from the start of the first or previous dose, as long as it occurs within 3 days after the start of the previous dose, is considered to be a "continuous" dose. ..

従って、特記されない限り、3日までの期間にわたる同一の細胞の複数の投与は、単一の用量であると見なされ、最初の投与の3日以内の細胞の投与は、連続する用量とは見なされず、第2の用量が第1に「連続的」であるか否かを決定する目的のため、介在する用量であるとは見なされない。 Therefore, unless otherwise noted, multiple doses of the same cell over a period of up to 3 days are considered to be a single dose, and administration of cells within 3 days of the first dose is considered to be a continuous dose. Nonetheless, it is not considered an intervening dose for the purpose of determining whether the second dose is "continuous" in the first.

いくつかの態様において、複数の連続的な用量が与えられる。複数の連続的な用量は、例えば、第1の用量と第1の連続的な用量との間のタイミングについて指定されたのと同じタイミングガイドラインを使用して、例えば、連続的な用量が、各々、第1のまたは直前の用量の投与の、約14日を超え、約28日より少ない期間内に、例えば、約21日以内に与えられる、第1および複数の連続的な用量の投与によって、投与されてよい。いくつかの態様において、第1の用量に対して、連続的な用量は、各々、第1の用量において投与されたものと同じ細胞、および/または第1の用量におけるものが発現するのと同じ組換え受容体を含む。いくつかのそのような態様において、そのような連続的な用量の投与の後に、第2の用量、および、いくつかのケースにおいて、付加的な連続的な用量が投与されてもよい。 In some embodiments, multiple continuous doses are given. Multiple consecutive doses, for example, using the same timing guidelines specified for the timing between the first dose and the first continuous dose, eg, consecutive doses, respectively. By administration of the first and multiple consecutive doses, given within a period of more than about 14 days and less than about 28 days, eg, within about 21 days, of administration of the first or previous dose. May be administered. In some embodiments, relative to the first dose, the continuous dose is the same as that expressed at the same cells and / or at the first dose, respectively, as administered at the first dose. Contains recombinant receptors. In some such embodiments, the administration of such a continuous dose may be followed by a second dose, and in some cases, an additional continuous dose.

従って、いくつかの局面において、対象は、同一の受容体を発現する細胞の複数の用量を投与され得る。いくつかの態様において、第1の受容体を発現する細胞を含有している複数の連続的な用量は、別の受容体を発現する細胞の後の投与の前に、例えば、第2の用量の投与の前に、対象へ投与され得、いくつかの態様において、その後に、第2の用量の細胞の連続的な投与が行われてもよい。いくつかの局面において、第2（または第3、第4、第5等）の受容体を発現する細胞の複数の連続的な用量が、対象へ投与され得る。 Thus, in some aspects, a subject may be administered multiple doses of cells expressing the same receptor. In some embodiments, a plurality of successive doses containing cells expressing the first receptor, eg, a second dose, prior to subsequent administration of cells expressing another receptor. Can be administered to a subject prior to administration of, and in some embodiments, a second dose of cells may be subsequently administered continuously. In some aspects, multiple successive doses of cells expressing the second (or third, fourth, fifth, etc.) receptor can be administered to the subject.

いくつかの態様において、例えば、複合臨床試験の状況において、対象は、第1の臨床試験において調査される受容体を発現する細胞の第1の用量、および第2の臨床試験において調査される受容体を発現する細胞の第2の（またはその他の後の）用量を投与され得る。 In some embodiments, for example, in the context of a combined clinical trial, the subject is the first dose of cells expressing the receptor investigated in the first clinical trial, and the receptor investigated in the second clinical trial. A second (or later) dose of cells expressing the body can be administered.

いくつかの態様において、提供される方法は、対象における同一の疾患または状態を標的とする別の組換え受容体を各々発現している改変細胞の第1、第2、第3、および/または複数の付加的な後の投与を含む、対象における疾患または障害の長期的または継続的な処置または管理のためのものである。そのような長期的な処置または管理は、対象がモニタリングされ、効力の喪失またはそのリスクの具体的な指標が検出された場合、検出された時に、次の後の投与（例えば、次の後の受容体）が導入される、反復過程を含んでいてもよい。いくつかの態様において、後の投与は、各々、先の用量における細胞の持続性、増大、もしくは曝露の低下、対象におけるそれに特異的な免疫応答、再発、抵抗性、および/または標的抗原のダウンレギュレーションもしくは変化のような、効力の喪失のリスクの1個または複数個の指標の検出時に開始される。 In some embodiments, the methods provided are first, second, third, and / or modified cells expressing different recombinant receptors targeting the same disease or condition in the subject, respectively. For long-term or continuous treatment or management of a disease or disorder in a subject, including multiple additional subsequent doses. Such long-term treatment or management, if the subject is monitored and a specific indicator of loss of efficacy or its risk is detected, when detected, the next subsequent administration (eg, the next subsequent administration). It may include an iterative process into which the receptor) is introduced. In some embodiments, subsequent administrations each have a cell persistence, increase, or reduction in exposure at the previous dose, an immune response, recurrence, resistance, and / or reduction of the target antigen specific to it in the subject. It begins with the detection of one or more indicators of the risk of loss of efficacy, such as regulation or change.

いくつかの態様において、後の用量は、再発時の再処置のため、かつ/または標的とされた疾患もしくは障害の再発を防止するため、かつ/または第1の用量の後の組換え受容体を発現する細胞への曝露の低下を解決するかもしくは防止するため、例えば、そのような細胞の持続性もしくは増大またはそのような細胞の数の減衰の検出時に、投与される、従って、いくつかの態様において、これらのパラメータのうちの1個または複数個が、第1のまたはその他の先の用量と第2のまたはその他の後の用量との間の時間に測定されるか、検出されるか、または査定され、そのような査定の結果に基づき、後の用量を投与するタイミングまたは決定がなされる。例えば、受容体を発現する細胞の数または濃度が、所望のレベルより低いか、または最大のもしくはその他の測定された濃度または数に対する一定の百分率より低く減衰したことが決定された時点で、第2の用量が投与され得る。 In some embodiments, later doses are for retreatment on relapse and / or to prevent recurrence of the targeted disease or disorder and / or recombinant receptors after the first dose. Administered, for example, upon detection of persistence or increase in such cells or a decrease in the number of such cells, to resolve or prevent a decrease in exposure to cells expressing. In aspects of, one or more of these parameters are measured or detected in the time between the first or other earlier dose and the second or other later dose. Alternatively, it will be assessed and based on the results of such assessment, the timing or decision to administer later doses will be made. For example, when it is determined that the number or concentration of cells expressing the receptor is lower than the desired level, or is attenuated below a certain percentage of the maximum or other measured concentration or number. Two doses can be administered.

投与量またはサイズ
一部の態様において、第1の用量または後の用量は、対象体重1キログラムあたり約10⁵～約10⁶個のこのような細胞の範囲内の数の細胞、組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、もしくは末梢血単核球(PBMC)、および/または対象体重1キログラムあたり約10⁵個以下もしくは約10⁶個以下のこのような細胞の数のこのような細胞を含有する。例えば、一部の態様において、第1の用量または後の用量は、対象体重1キログラムあたり1x10⁵個もしくは約1x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、2x10⁵個もしくは約2x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、5x10⁵個もしくは約5x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、または1x10⁶個もしくは約1x10⁶個より少ないもしくはそれ以下のこのような細胞を含む。一部の態様において、第1の用量は、対象体重1キログラムあたり1x10⁵個もしくは約1x10⁵個、2x10⁵個もしくは約2x10⁵個、5x10⁵個もしくは約5x10⁵個、または1x10⁶個もしくは約1x10⁶個のこのような細胞、あるいは前述の値のいずれか2つの間の範囲内にある値を含む。特定の態様において、細胞の数および/または濃度は組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞の数を指す。他の態様において、細胞の数および/または濃度は、投与される全ての細胞、T細胞、または末梢血単核球(PBMC)の数または濃度を指す。 Dosage or Size In some embodiments, the first or subsequent dose is a number of cells, recombinant receptors, within the range of about ¹⁰⁵ to about ¹⁰⁶ such cells per kilogram of subject body weight. Such as the number of (eg, CAR) -expressing cells, T cells, or peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and / or such cells of about ¹⁰⁵ or less or about ¹⁰⁶ or less per kilogram of subject body weight. Contains various cells. For example, in some embodiments, the first or subsequent dose is 1x10 ^{5 or less than about 1x10 5 or less, 2x10 5 or less than about 2x10 5} ^or ^less ^per kilogram of subject body weight. , 5x10 ⁵ or less than about 5x10 ⁵ or less, or 1x10 ⁶ or less than about 1x10 ⁶ or less such cells. In some embodiments, the first dose is 1x10 ⁵ or about 1x10 ⁵ per kilogram of body weight, 2x10 ⁵ or about 2x10 ⁵ , 5x10 ⁵ or about 5x10 ⁵ , or 1x10 ⁶ or about. Includes 1x10 ⁶ such cells, or values that are in the range between any two of the above values. In certain embodiments, the number and / or concentration of cells refers to the number of recombinant receptor (eg, CAR) expressing cells. In other embodiments, the number and / or concentration of cells refers to the number or concentration of all cells, T cells, or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) administered.

一部の態様において、例えば、対象がヒトの場合、第1の用量または後の用量は、約1x10⁸個より少ない全組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、もしくは末梢血単核球(PBMC)、例えば、約1x10⁶～1x10⁸個の範囲のこのような細胞、例えば、2x10⁶個、5x10⁶個、1x10⁷個、5x10⁷個、もしくは1x10⁸個のこのような細胞、または前述の値のいずれか2つの間の範囲を含む。 In some embodiments, for example, when the subject is a human, the first or subsequent dose is less than about 1x10 ⁸ total recombinant receptor (eg, CAR) -expressing cells, T cells, or peripheral blood monocytogenes. Nuclear spheres (PBMCs), eg, such cells in the range of approximately 1x10 ⁶ to 1x10 ⁸ , eg, 2x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , or 1x10 ⁸ such cells. , Or a range between any two of the above values.

一部の態様において、第1の用量または後の用量は、対象1m²あたり約1x10⁸個より少ない全組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、もしくは末梢血単核球(PBMC)細胞、例えば、対象1m²あたり約1x10⁶～1x10⁸個の範囲のこのような細胞、例えば、対象1m²あたり2x10⁶個、5x10⁶個、1x10⁷個、5x10⁷個、もしくは1x10⁸個のこのような細胞、または前述の値のいずれか2つの間の範囲を含有する。 In some embodiments, the first or subsequent dose is less than about 1x10 ⁸ cells per 1 m ² of subject, total recombinant receptor (eg, CAR) -expressing cells, T cells, or peripheral blood mononuclear cells (PBMC). ) Cells, such as those in the range of approximately 1x10 ⁶ to 1x10 ⁸ per 1 m ² of subject, eg 2x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , or 1x10 ⁸ per 1 m ² of subject. Such cells of, or the range between any two of the above-mentioned values.

ある特定の態様において、第1の用量または後の用量における細胞、組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、または末梢血単核球(PBMC)の数は、対象体重1キログラムあたり約1x10⁶個より多いこのような細胞、例えば、体重1キログラムあたり2x10⁶個、3x10⁶個、5x10⁶個、1x10⁷個、5x10⁷個、1x10⁸個、1x10⁹個、もしくは1x10¹⁰個のこのような細胞、および/または、対象1m²あたり1x10⁸個、もしくは1x10⁹個、1x10¹⁰個のこのような細胞、もしくは合計、あるいは前述の値のいずれか2つの間の範囲である。 In certain embodiments, the number of cells, recombinant receptor (eg, CAR) -expressing cells, T cells, or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) at the first or subsequent dose is per kilogram of subject body weight. More than about 1x10 ⁶ such cells, such as 2x10 ⁶ cells, 3x10 ⁶ cells, 5x10 ⁶ cells, 1x10 ⁷ cells, 5x10 ⁷ cells, 1x10 ⁸ cells, 1x10 ⁹ cells, or 1x10 ¹⁰ cells per kilogram of body weight. Such cells and / or 1x10 ⁸ or 1x10 ⁹ or 1x10 ¹⁰ such cells per 1 m ² of subject, or the sum, or the range between any two of the above values.

一部の態様において、後の用量において投与される細胞の数は、本明細書中の任意の態様の第1の用量において投与される細胞の数と同じまたは同等である、例えば、対象体重1キログラムあたりのそのような細胞1x10⁵個もしくは約1x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、2x10⁵個もしくは約2x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、5x10⁵個もしくは約5x10⁵個より少ないもしくはそれ以下、または1x10⁶個もしくは約1x10⁶個より少ないもしくはそれ以下である。一部の態様において、後の用量は、対象体重1キログラムあたりのそのような細胞1x10⁵個もしくは約1x10⁵個、2x10⁵個もしくは約2x10⁵個、5x10⁵個もしくは約5x10⁵個、または1x10⁶個もしくは約1x10⁶個、あるいは前述の値のいずれか2つの間の範囲内にある値を含有する。一部の態様では、このような値は組換え受容体発現細胞の数を指し、他の態様では、投与されるT細胞またはPBMCまたは全細胞の数を指す。一部の局面において、後の用量量は第1の用量量より多い。例えば、一部の態様において、後の用量は、対象体重1キログラムあたり約1x10⁶個を超える細胞、組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、および/またはPBMC、例えば、対象体重1キログラムあたり約3x10⁶個、約5x10⁶個、約1x10⁷個、約1x10⁸個、または約1x10⁹個のこのような細胞を含有する。一部の態様において、後の用量の量またはサイズは、疾患負荷もしくはその指標、および/または疾患もしくは状態の1つもしくは複数の症状を低減するのに十分である。一部の態様において、第2の（または他の後の）用量は、対象の生存を改善するのに、例えば、少なくとも6ヶ月、または少なくとも1年、2年、3年、4年、もしくは5年にわたって対象の生存、無再発生存、または無事象生存を誘導するのに有効なサイズの用量である。一部の態様において、後の用量において投与される、細胞、組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、および/もしくはPBMCの数、ならびに/または対象体重あたりの投与される、このような細胞の数は、第1の用量において投与される数の少なくとも2倍、5倍、10倍、50倍、もしくは100倍であるか、またはこれより多い。一部の態様において、後の用量の後に、疾患負荷、腫瘍サイズ、腫瘍体積、腫瘍質量、および/または腫瘍量もしくは腫瘍容積は、第1の用量または第2の（または他の後の）用量の投与直前と比較して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、もしくはこれより多く、または少なくとも約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、もしくはこれより多く低減する。 In some embodiments, the number of cells administered at a later dose is equal to or equivalent to the number of cells administered at the first dose of any of the embodiments herein, eg, subject body weight 1. Less than or less than 1x10 ⁵ or about 1x10 5 such cells per kilogram, less than or less than 2x10 ⁵ or about 2x10 ⁵ , 5x10 ⁵ or less than about ^{5x10 5} ^or less, or 1x10 ⁶ or less than about 1x10 ⁶ or less. In some embodiments, later doses are 1x10 ⁵ or about 1x10 ⁵ such cells, 2x10 ⁵ or about 2x10 ⁵ , 5x10 ⁵ or about 5x10 ⁵ , or 1x10 per kilogram of subject body weight. Contains ⁶ or about 1x10 ⁶ or values that are in the range between any two of the above values. In some embodiments, such a value refers to the number of recombinant receptor-expressing cells, in other embodiments, it refers to the number of T cells or PBMCs or total cells administered. In some aspects, the later dose is higher than the first dose. For example, in some embodiments, later doses include more than about 1x10 ⁶ cells per kilogram of subject body weight, recombinant receptor (eg, CAR) expressing cells, T cells, and / or PBMCs, such as subject body weight. It contains about 3x10 ⁶ , about 5x10 ⁶ , about 1x10 ⁷ , about 1x10 ⁸ , or about 1x10 ⁹ such cells per kilogram. In some embodiments, the amount or size of the later dose is sufficient to reduce the disease burden or indicator thereof and / or one or more symptoms of the disease or condition. In some embodiments, a second (or later) dose is used to improve the survival of the subject, eg, at least 6 months, or at least 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, or 5 years. A dose of a size that is effective in inducing subject survival, recurrence-free survival, or event-free survival over the years. In some embodiments, the number of cells, recombinant receptor (eg, CAR) -expressing cells, T cells, and / or PBMCs administered at a later dose, and / or administered per subject body weight, this. The number of such cells is at least 2-fold, 5-fold, 10-fold, 50-fold, or 100-fold, or greater than the number administered at the first dose. In some embodiments, after a later dose, the disease load, tumor size, tumor volume, tumor mass, and / or tumor volume or tumor volume is the first dose or the second (or later) dose. At least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or more, or at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, compared to just before administration. Or it is reduced more than this.

他の態様において、後の用量において投与される細胞の数は、第1の用量において投与される細胞の数より少ない。 In another embodiment, the number of cells administered at a later dose is less than the number of cells administered at the first dose.

一部の態様において、第2の（または他の後の）用量の投与後に、追加の用量が投与されるように、第1の用量の後に複数の後の用量が投与される。一部の局面において、追加の後の用量(すなわち、第3、第4、第5など)において対象に投与される細胞の数は第1の用量、第2の用量、および/もしくは他の後の用量と同じまたは同等である。一部の態様において、追加の用量は先の用量より多い。 In some embodiments, a plurality of subsequent doses are administered after the first dose, just as an additional dose is administered after administration of the second (or other later) dose. In some aspects, the number of cells administered to the subject at additional doses (ie, third, fourth, fifth, etc.) is the first dose, the second dose, and / or after others. The dose is the same as or equivalent to. In some embodiments, the additional dose is higher than the previous dose.

一部の局面において、第1の用量および/または後の用量のサイズは、1つまたは複数の判断基準、例えば、前処置、例えば、化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍量、容積、サイズ、もしくは程度、転移の度合いもしくはタイプ、ステージ、ならびに/または対象が毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍溶解症候群、神経毒性を発症する可能性もしくは発生率、ならびに/または投与されている細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答に基づいて決定される。 In some aspects, the size of the first and / or subsequent doses may be one or more criteria, eg, the subject's response to pretreatment, eg, chemotherapy, the disease burden in the subject, eg, a tumor. Amount, volume, size or degree, degree or type of metastasis or type, stage, and / or subject may develop toxic outcomes such as CRS, macrophage activation syndrome, tumor lysis syndrome, neurotoxicity, and / Or determined based on the host immune response to the cells and / or recombinant receptors being administered.

一部の局面において、第1の用量および/または後の用量のサイズは、対象における疾患または状態の負荷によって決定される。例えば、一部の局面において、第1の用量において投与される細胞の数は、第1の用量の投与直前の対象に存在する腫瘍負荷に基づいて決定される。一部の態様において、第1の用量および/または後の用量のサイズは疾患負荷と逆相関がある。多疾患負荷の状況のような一部の局面では、少数の細胞、例えば、対象体重1キログラムあたり約1x10⁶個未満の細胞が対象に投与される。低疾患負荷の状況のような他の態様では、多数の細胞、例えば、対象体重1キログラムあたり約1x10⁶個を超える細胞が対象に投与される。 In some aspects, the size of the first dose and / or the later dose is determined by the load of the disease or condition in the subject. For example, in some aspects, the number of cells administered at the first dose is determined based on the tumor load present in the subject immediately prior to administration of the first dose. In some embodiments, the size of the first dose and / or the later dose is inversely correlated with the disease burden. In some aspects, such as multi-disease loading situations, a small number of cells, eg, less than about 1x10 ⁶ cells per kilogram of subject body weight, are administered to the subject. In other embodiments, such as low disease load situations, a large number of cells, eg, more than about 1x10 ⁶ cells per kilogram of subject body weight, are administered to the subject.

一部の局面において、後の用量において投与される細胞の数は、第1の用量の投与後の、対象に存在する腫瘍負荷に基づいて決定される。一部の態様において、例えば、第1の用量が疾患負荷の減少を有する場合、または特定の閾値量もしくはレベルよりかなり少なく、例えば、上回ると毒性転帰のリスクが高まる閾値量もしくはレベルより少なく低減もしくは減少した場合、後の用量量は多く、例えば、体重1キログラムあたり1x10⁶個を超える細胞(例えば、全細胞、受容体発現細胞、T細胞、もしくはPBMC)であり、および/または第1の用量量より多い。他の局面では、第1の用量が腫瘍負荷をわずかに低減したか、または第1の用量が腫瘍負荷の検出可能な低減につながらなかった場合、後の用量において投与される細胞の数は少なく、例えば、約1x10⁶個未満であり、第1の用量と同じであるか、または第1の用量より少ない。 In some aspects, the number of cells administered at a later dose will be determined based on the tumor load present in the subject after administration of the first dose. In some embodiments, for example, if the first dose has a reduction in disease burden, or is significantly less than a particular threshold amount or level, eg, is reduced below a threshold amount or level that increases the risk of toxicity outcome. If reduced, later doses are high, eg, more than 1x10 ⁶ cells per kilogram of body weight (eg, whole cells, receptor-expressing cells, T cells, or PBMC), and / or the first dose. More than the amount. In other aspects, if the first dose reduced the tumor load slightly, or if the first dose did not lead to a detectable reduction in the tumor load, then the number of cells administered at the later dose was low. , For example, about 1x10 less than ⁶ pieces, equal to or less than the first dose.

いくつかの態様において、第1の用量において投与される細胞の数は、免疫応答が発達する前に細胞を投与するため、細胞の大きい用量が単回投与されるもののような、他の方法において投与される細胞の数より少ない。従って、いくつかの態様において、方法は、より大きい用量の投与を含む他の方法と比較して、毒性または毒性事象を低下させる。 In some embodiments, the number of cells administered at the first dose is such that a large dose of cells is administered as a single dose because the cells are administered before the immune response develops. Less than the number of cells administered. Thus, in some embodiments, the method reduces toxicity or toxic events as compared to other methods involving administration of larger doses.

いくつかの態様において、第1の用量は、毒性または毒性事象、例えば、サイトカイン放出症候群（CRS）、重症CRS（sCRS）、マクロファージ活性化症候群、腫瘍溶解症候群、3日以上の少なくとも38℃もしくは少なくとも約38℃の発熱、少なくとも20mg/dLもしくは少なくとも約20mg/dLのCRPの血漿レベル、および/または神経毒性を引き起こさないかまたはその可能性を低下させる量の細胞を含む。いくつかの局面において、第1の用量において投与される細胞の数は、対象が、細胞の投与の後に毒性または毒性事象、例えば、CRS、sCRS、および/またはCRS関連事象を示す可能性に基づき決定される。例えば、いくつかの態様において、対象における毒性事象の発症の可能性は、腫瘍負荷に基づき予測される。いくつかの態様において、方法は、用量の投与の前に、毒性事象および/または疾患負荷を検出するかまたは査定する工程を含む。 In some embodiments, the first dose is a toxic or toxic event such as cytokine release syndrome (CRS), severe CRS (sCRS), macrophage activation syndrome, tumor lysis syndrome, at least 38 ° C or at least for 3 days or longer. It contains a fever of about 38 ° C., plasma levels of CRP of at least 20 mg / dL or at least about 20 mg / dL, and / or an amount of cells that does not cause or reduce the likelihood of neurotoxicity. In some aspects, the number of cells administered at the first dose is based on the possibility that the subject will exhibit toxic or toxic events, such as CRS, sCRS, and / or CRS-related events, after administration of the cells. It is determined. For example, in some embodiments, the likelihood of developing a toxic event in a subject is predicted based on tumor load. In some embodiments, the method comprises the step of detecting or assessing toxic events and / or disease burden prior to administration of the dose.

いくつかの態様において、第2の（またはその他の後の）用量は、第1の投与の後、サイトカイン放出症候群（CRS）、マクロファージ活性化症候群、または腫瘍溶解症候群、または神経毒性を発症する臨床的なリスクが、存在しないかまたは終わったかまたは鎮静した時点で、例えば、そのようなイベントが、一般に、特定の疾患または状態を有する対象の、例えば、60％、70％、80％、90％、または95％において鎮静し、かつ/または起こる可能性が低くなる、臨界期の後に投与される。 In some embodiments, the second (or other later) dose is clinical to develop cytokine release syndrome (CRS), macrophage activation syndrome, or tumor lysis syndrome, or neurotoxicity after the first dose. When there is no, end, or sedation of the risk, for example, such an event is generally 60%, 70%, 80%, 90% of subjects with a particular disease or condition. , Or at 95% sedation and / or less likely to occur, administered after a critical period.

用量のタイミング
いくつかの局面において、第2のまたは後の用量のタイミングは、第1の用量の開始から、後の用量の開始まで測定される。他の態様において、例えば、用量が、1日を超えて、例えば、2日または3日にわたり投与される、本明細書に記載された分割投薬法の状況においては、後の用量のタイミングは、第1の用量の完了から、または第1の用量の投与の中央日から、測定される。 Dose Timing In some aspects, the timing of the second or subsequent dose is measured from the start of the first dose to the start of the later dose. In other embodiments, in the context of the divided dosage regimen described herein, where the dose is administered, eg, over one day, eg, two or three days, the timing of later doses. Measured from the completion of the first dose or from the middle day of administration of the first dose.

いくつかの態様において、第1の用量の細胞が発現するものとは異なる受容体、例えば、CARを発現する細胞の後の用量が投与されるか否かは、第1の用量の細胞またはそれが発現する組換え受容体に対する対象における免疫応答または検出可能な免疫応答の存在または程度に基づき決定される。いくつかの局面において、第1の用量の細胞と異なる受容体を発現する細胞を含有している後の用量は、検出可能な宿主適応免疫応答、または一定のレベル、ステージ、もしくは程度に確立もしくは到達した免疫応答を有する対象へ投与されるであろう。 In some embodiments, whether or not a later dose of a receptor different from that expressed by the first dose of cells, eg, cells expressing CAR, is administered is the first dose of cells or it. Is determined based on the presence or extent of an immune response or detectable immune response in the subject to the recombinant receptor on which it is expressed. In some aspects, the dose after containing cells expressing receptors different from the first dose of cells establishes or establishes a detectable host adaptive immune response, or a certain level, stage, or degree. It will be administered to subjects with an reached immune response.

いくつかの態様において、第2の（またはその他の後の）用量は、第1の受容体（例えば、CAR）を発現する細胞の第2の投与が、宿主免疫系によって排除される可能性が高いかまたは排除されると予測される時点で、投与される。免疫応答の発達の可能性は、本明細書に記載されるように、第1の用量の投与の後に、対象における受容体に特異的な免疫応答を測定することによって決定され得る。 In some embodiments, the second (or other later) dose may eliminate the second dose of cells expressing the first receptor (eg, CAR) by the host immune system. Administer at a time when it is high or expected to be eliminated. The potential for the development of an immune response can be determined by measuring the receptor-specific immune response in the subject after administration of the first dose, as described herein.

例えば、いくつかの態様において、対象は、第1の用量の後に対象において免疫応答が検出可能であるか否かを決定するため、第1の（またはその他の先の）用量の後、第2の（またはその他の後の）用量の前に試験され得る。いくつかのそのような態様において、第1の用量に対する免疫応答の検出は、第2の用量を投与する必要を誘発し得る。 For example, in some embodiments, the subject is after the first (or other earlier) dose to determine if an immune response is detectable in the subject after the first dose. Can be tested before (or after) doses. In some such embodiments, detection of an immune response to a first dose may elicit the need to administer a second dose.

いくつかの局面において、第1のまたは先の用量の後、対象において、本明細書に記載されるように、減衰が存在するか、または所望の曝露より低いか、例えば、細胞の一定の数または濃度より少ないかを決定するため、本明細書に記載されるように、対象に由来する試料を試験することができる。いくつかのそのような局面において、細胞への対象の曝露の減衰の検出は、第2の用量を投与する必要を誘発し得る。 In some aspects, after the first or previous dose, in the subject, as described herein, attenuation is present or lower than the desired exposure, eg, a certain number of cells. Alternatively, a sample derived from the subject can be tested as described herein to determine if it is less than the concentration. In some such aspects, detection of attenuation of the subject's exposure to cells may elicit the need to administer a second dose.

いくつかの態様において、後の用量は、第1のまたは先の用量に応答して起こった疾患負荷の低減の後、対象における疾患または状態が再発していない時点で投与される。いくつかの態様において、疾患負荷の低減は、対象もしくはその液体もしくは臓器もしくは組織における疾患細胞の負荷もしくは数、腫瘍の重量もしくは体積、または転移の程度もしくは範囲のような1種または複数種の因子の低下によって示される。そのような因子は、初期の処置または投与に応答して起こった因子の低下の後、因子がその後に増加した場合に、再発したと見なされる。 In some embodiments, the later dose is administered at a time when the disease or condition in the subject has not recurred after the reduction of the disease burden that occurred in response to the first or earlier dose. In some embodiments, reduction of disease load is due to one or more factors such as the load or number of diseased cells in the subject or its fluid or organ or tissue, the weight or volume of the tumor, or the degree or extent of metastasis. Indicated by a decrease in. Such factors are considered to have recurred if the factors are subsequently increased after a decrease in the factors that occurred in response to initial treatment or administration.

いくつかの態様において、第2の用量は、疾患が再発した時点で投与される。いくつかの態様において、再発は、1種もしくは複数種の因子、または、一般に、疾患負荷に関する。いくつかの局面において、後の用量は、対象、疾患負荷、またはその因子が、第1のまたは先の投与の後に測定されたまたは到達された最低点と比較して再発しているが、第1の用量の直前と比較してまだ低い時点で投与される。いくつかの態様において、対象は、疾患負荷またはそれを示す因子が変化していない時点で、例えば、疾患負荷の増加が防止されている時に、後の用量を投与される。 In some embodiments, the second dose is administered at the time of disease recurrence. In some embodiments, recurrence relates to one or more factors, or generally disease burden. In some aspects, later doses are relapsed, although the subject, disease dose, or factor thereof has recurred compared to the lowest point measured or reached after the first or previous dose. It is administered at a lower point than immediately before the dose of 1. In some embodiments, the subject is administered a later dose at a time when the disease load or factors indicating it have not changed, eg, when an increase in disease load has been prevented.

いくつかの態様において、後の用量は、宿主適応免疫応答が検出された時、確立された時、または一定のレベル、程度、もしくはステージに到達した時に投与される。いくつかの局面において、後の用量は、対象における記憶免疫応答の発達の後に投与される。 In some embodiments, later doses are administered when a host adaptive immune response is detected, established, or reaches a certain level, degree, or stage. In some aspects, later doses are administered after the development of a memory immune response in the subject.

いくつかの局面において、第1の用量の投与と後の用量の投与との間の時間は、約28～約35日であるか、約29～約35日であるか、または約35日より長い。いくつかの態様において、第2の用量の投与は、第1の用量の投与の約28日後より後の時点でなされる。いくつかの局面において、第1の用量と後の用量との間の時間は、約28日である。 In some aspects, the time between administration of the first dose and administration of the subsequent dose is about 28-about 35 days, about 29-about 35 days, or more than about 35 days. long. In some embodiments, administration of the second dose is made at a time point greater than or equal to approximately 28 days after administration of the first dose. In some aspects, the time between the first dose and the later dose is about 28 days.

いくつかの態様において、付加的な用量、例えば、後の用量は、第2の用量の投与の後に投与される。いくつかの局面において、付加的な用量は、先の用量の投与の少なくとも約28日後に投与される。いくつかの態様において、先の用量の約28日後より前に、用量は投与されない。 In some embodiments, an additional dose, eg, a later dose, is administered after administration of the second dose. In some aspects, the additional dose is administered at least about 28 days after administration of the previous dose. In some embodiments, the dose is not administered prior to about 28 days after the previous dose.

いくつかの局面において、本発明の方法は、他の方法が第1の用量の受容体を発現する細胞を含有している第2の用量を投与し得る時間範囲を越えた時点で、例えば、第1の用量の細胞に対する免疫応答が検出された後に、受容体を発現する細胞を投与することを可能にするという点で有利である。 In some aspects, the method of the invention is described, for example, at a time beyond the time range in which the second dose may be administered, other methods containing cells expressing the first dose of the receptor. It is advantageous in that it allows the cells expressing the receptor to be administered after the immune response to the first dose of cells has been detected.

いくつかの態様において、方法は、例えば、第1の受容体に対する免疫応答によって、第1の受容体を発現する細胞の第2の投与が除去されるであろう時点であり得る、例えば、第1の用量の後の毒性事象が除去された後に、第2の投与を行うことを可能にすることによって、他の方法と比較して毒性または毒性事象を低下させる。 In some embodiments, the method may be, for example, at a time when an immune response to the first receptor will eliminate the second dose of cells expressing the first receptor, eg, first. By allowing a second dose to be administered after the toxic event after one dose has been eliminated, the toxicity or toxic event is reduced compared to other methods.

いくつかの局面において、方法は、再発が起こった時点で、例えば、対象が最初は処置に応答したが、再発を発症した時、例えば、第1の受容体に対する免疫応答によって第1の受容体を発現する細胞の第2の投与が除去されるであろう時点で、第2の用量の投与を可能にする。 In some aspects, the method is such that at the time of recurrence, for example, the subject initially responded to treatment, but when recurrence develops, eg, by an immune response to the first receptor, the first receptor. Allows administration of a second dose at a time when the second dose of cells expressing the disease will be eliminated.

いくつかの態様において、例えば、第1の用量の細胞が発現する受容体を発現する一つまたは複数の連続的な用量が対象へ投与される場合、連続的な用量は、約14日、約15日、約21日、約27日、または約28日、分離されていてよい。いくつかの局面において、連続的な用量は、先の用量の21日後に投与される。いくつかの態様において、連続的な用量は、先の用量の投与の14～28日後に投与される。 In some embodiments, for example, if a first dose of a cell-expressing receptor expresses one or more successive doses to a subject, the continuous dose is about 14 days, about. It may be separated for 15, about 21, about 27 days, or about 28 days. In some aspects, the continuous dose is administered 21 days after the previous dose. In some embodiments, the continuous dose is administered 14-28 days after administration of the previous dose.

任意の態様において、前記方法は、場合によっては、第1の用量または先の用量および後の用量の投与を含み、他の場合では、以前に第1の用量または先の用量が与えられたことがある対象への後の用量の投与を含むが、第1の用量または先の用量それ自体の投与を含まない。従って、前記方法は、場合によっては、強化処置を投与すること、例えば、後の強化用量を、ある用量の組換え受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞が以前に与えられたことがある対象に投与することによって強化処置を投与することを伴う。 In any embodiment, the method may include administration of a first dose or an earlier dose and a later dose, in other cases previously given the first dose or the earlier dose. Includes administration of later doses to a subject, but does not include administration of the first dose or the earlier dose itself. Thus, the method may optionally administer a strengthening treatment, eg, a later strengthening dose, to a subject who has previously been given a dose of recombinant receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells. Accompanied by administration of intensifying treatment by administration to.

一部の態様において、後の用量の後に、疾患負荷、腫瘍サイズ、腫瘍体積、腫瘍質量、および/または腫瘍量もしくは腫瘍容積は、第1の用量もしくは先の用量の投与直前または第2の用量もしくは後の用量の投与直前と比較して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、もしくはこれより多く、または少なくとも約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、もしくはこれより多く低減する。 In some embodiments, after the later dose, the disease load, tumor size, tumor volume, tumor mass, and / or tumor volume or tumor volume is the first dose or just before or after administration of the previous dose or the second dose. Or at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or more, or at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, compared to just before administration of a later dose. Reduce by about 90% or more.

VI.細胞曝露および持続性
一部の態様において、提供される方法は、投与された細胞への対象の曝露を増大させる(例えば、細胞数を増やすか、もしくはある期間にわたる持続期間を延ばす)、ならびに/または養子細胞療法における効力および治療転帰を改善する。一部の局面において、前記方法は、組換え受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞への曝露の程度を大きく、および/または長期間にすることで、他の方法と比較して処置転帰が改善される点で有利である。このような転帰には、重度の腫瘍負荷を有する個体であっても、患者が生存および寛解することが含まれることがある。 VI. Cell Exposure and Persistence In some embodiments, the methods provided increase the subject's exposure to administered cells (eg, increase cell number or extend duration over a period of time). And / or improve efficacy and treatment outcome in adoptive cell therapy. In some aspects, the method has a higher and / or longer duration of exposure to recombinant receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells, with a treatment outcome compared to other methods. It is advantageous in that it is improved. Such outcomes may include survival and remission of the patient, even in individuals with severe tumor loading.

一部の態様において、第1の用量の後および/または後の用量の後に、対象における組換え受容体発現細胞(例えば、CAR発現細胞)の存在および/または量が検出される。一部の局面において、対象の血液もしくは血清または臓器もしくは組織(例えば、疾患部位)における組換え受容体発現細胞(例えば、CAR発現細胞)の量を評価するために定量PCR(qPCR)が用いられる。一部の局面において、持続性は、DNA 1マイクログラムあたりの、受容体、例えば、CARをコードするDNAもしくはプラスミドのコピーとして、あるいは試料、例えば、血液もしくは血清1マイクロリットルあたりの受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞の数として、または試料1マイクロリットルあたりの末梢血単核球(PBMC)もしくは白血球もしくはT細胞の総数あたりの受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞の数として定量される。 In some embodiments, the presence and / or amount of recombinant receptor-expressing cells (eg, CAR-expressing cells) in the subject is detected after and / or after the first dose. In some aspects, quantitative PCR (qPCR) is used to assess the amount of recombinant receptor-expressing cells (eg, CAR-expressing cells) in a subject's blood or serum or organ or tissue (eg, disease site). .. In some aspects, persistence is receptor-expressing cells per microgram of DNA, as a copy of the receptor, eg, the DNA or plasmid encoding CAR, or per sample, eg, blood or serum. Quantified, for example, as the number of CAR-expressing cells, or as the number of receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells, per microliter of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or leukocytes or T cells per microliter of sample. ..

一部の態様において、前記細胞は、第2の（または他の後の）用量を投与して4日後、14日後、15日後、27日後、もしくは28日後、または少なくとも4日後、14日後、15日後、27日後、もしくは28日後に対象において検出される。一部の局面において、前記細胞は、第2の（または他の後の）用量を投与して2週間後、4週間後、もしくは6週間後または少なくとも2週間後、4週間後、もしくは6週間後、あるいは3ヶ月後、6ヶ月後、または12ヶ月後、18ヶ月後、または24ヶ月後、または30ヶ月後、または36ヶ月後、あるいは1年後、2年後、3年後、4年後、5年後、またはこれより後で検出される。 In some embodiments, the cells are 4 days, 14 days, 15 days, 27 days, or 28 days, or at least 4 days, 14 days, 15 after administration of the second (or other later) dose. Detected in the subject after days, 27 days, or 28 days. In some aspects, the cells are administered a second (or later) dose 2 weeks, 4 weeks, or 6 weeks or at least 2 weeks, 4 weeks, or 6 weeks after administration. After, or after, 3 months, 6 months, or 12 months, 18 months, 24 months, 30 months, 36 months, or 1 year, 2 years, 3 years, 4 years Detected after, 5 years, or later.

一部の態様において、後の用量の投与後の、前記方法による対象における受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞の持続性は、後の用量の後の、代替の方法によって、例えば、単回用量の投与を伴う前記方法によって、または、第1の（または他の先の）用量の細胞と同じ受容体、例えばCARを発現する細胞の後の用量の投与を伴う方法によって成し遂げられるものと比較して、大きい。 In some embodiments, the persistence of receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells, in a subject according to the method after administration of a later dose, eg, by alternative methods after later doses, eg, once. Compared to those achieved by the method with administration of a dose, or by a method involving administration of a later dose of the same receptor, eg, CAR-expressing cells, as the cells of the first (or other earlier) dose. And it's big.

一部の態様において、第2の用量の投与後の対象における組換え受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞の持続性および/または増殖および/または存在は、代替投薬計画を用いる方法、例えば、単一用量の受容体発現細胞の投与を伴う方法、または第1の用量の細胞が発現するのと同じ受容体を発現する第2の用量もしくは複数の用量の細胞を伴う方法により得られたものと比較して、大きい。 In some embodiments, the persistence and / or proliferation and / or presence of recombinant receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells, in a subject after administration of a second dose is a method using an alternative dosing regimen, eg, Obtained by a method involving administration of a single dose of receptor-expressing cells, or a method involving a second dose or multiple doses of cells expressing the same receptor that the first dose of cells express. Large compared to.

曝露、例えば、増殖および/または持続性を示す細胞の数は、対象が曝露される前記細胞の最大数、ある特定の数もしくはパーセントを上回る検出可能な細胞の持続期間、ある期間にわたる細胞の数の曲線下面積、ならびに/またはその組み合わせおよびその指標で述べられてもよい。このような転帰は、公知の方法、例えば、特定の試料、例えば、血液もしくは血清における核酸もしくはDNAの全量と比較して、組換え受容体をコードする核酸のコピー数を検出するqPCR、および/または受容体発現細胞を、一般的に、その受容体に特異的な抗体を用いて検出するフローサイトメトリーアッセイを用いて評価されてもよい。細胞に基づくアッセイも、機能細胞、例えば、疾患もしくは状態の細胞、または受容体によって認識される抗原を発現する細胞に結合することができる、および/あるいはこれを中和ことができる、および/あるいはこれに対する応答、例えば、細胞傷害応答を誘導することができる細胞の数またはパーセントを検出するのに用いられてもよい。 The number of cells exhibiting exposure, eg, proliferation and / or persistence, is the maximum number of said cells to which the subject is exposed, the duration of detectable cells above a certain number or percentage, and the number of cells over a period of time. The area under the curve of, and / or a combination thereof and its index may be described. Such outcomes are known methods such as qPCR to detect the number of copies of nucleic acid encoding a recombinant receptor compared to the total amount of nucleic acid or DNA in a particular sample, eg blood or serum, and /. Alternatively, receptor-expressing cells may generally be evaluated using a flow cytometry assay that detects the receptor-specific antibody. Cell-based assays can also bind to and / or neutralize functional cells, such as cells of disease or condition, or cells expressing antigens recognized by the receptor, and / or. It may be used to detect the number or percentage of cells capable of inducing a response to this, eg, a cytotoxic response.

一部の局面において、前記細胞に対する対象の曝露の増加は、前記細胞の増殖の増加を含む。一部の態様において、受容体(例えば、CAR)発現細胞は、第1の用量の投与後および/または後の用量の投与後に増殖する。一部の局面において、前記方法は、他の方法、例えば、単一用量の細胞の投与または、第1の用量と同じ受容体を発現する細胞の、1つまたは複数の後の用量の投与を伴う方法と比較して多い、前記細胞の増殖をもたらす。 In some aspects, increased exposure of a subject to said cells includes increased proliferation of said cells. In some embodiments, receptor (eg, CAR) -expressing cells proliferate after administration of the first dose and / or after administration of the subsequent dose. In some aspects, the method comprises administration of another method, eg, a single dose of cells, or one or more subsequent doses of cells expressing the same receptor as the first dose. It results in more cell proliferation compared to the accompanying method.

一部の局面において、前記方法は、例えば、フローサイトメトリーによって測定された時に、投与された細胞の多量のインビボ増殖をもたらす。一部の局面において、前記細胞の高いピーク割合が検出される。例えば、一部の態様において、第1の投与後または後の投与後のピークまたは最大レベルにおいて、対象の血液もしくは疾患部位、またはその白血球画分、例えば、PBMC画分もしくはT細胞画分における、前記細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％は、前記組換え受容体、例えば、CARを発現する。 In some aspects, the method results in a large in vivo proliferation of administered cells, for example when measured by flow cytometry. In some aspects, high peak percentages of said cells are detected. For example, in some embodiments, at peak or maximum levels after the first or subsequent administration, in the blood or disease site of interest, or its leukocyte fraction, eg, the PBMC fraction or the T cell fraction. At least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or at least about 90% of the cells. Expresses the recombinant receptor, eg CAR.

一部の態様において、前記方法は、対象の血液もしくは血清もしくは他の体液または臓器もしくは組織において、DNA 1マイクログラムあたり少なくとも100、500、1000、1500、2000、5000、10,000、もしくは15,000コピーの最大濃度の、前記受容体、例えば、CARをコードする核酸、または末梢血単核球(PBMC)の総数、単核細胞の総数、T細胞の総数、もしくはマイクロリットルの総数あたり少なくとも0.1個、0.2個、0.3個、0.4個、0.5個、0.6個、0.7個、0.8個、もしくは0.9個の受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞をもたらす。一部の態様において、前記受容体発現細胞は、対象の血液中に、総PBMCの少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、または60％として検出される、および/あるいは第1の投与または後の投与の後少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、24週間、36週間、48週間、または52週間にわたって、あるいはこのような投与の後1年、2年、3年、4年、もしくは5年、またはこれより長く、このようなレベルで検出される。 In some embodiments, the method comprises a maximum of at least 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000, or 15,000 copies per microgram of DNA in a subject's blood or serum or other body fluid or organ or tissue. At least 0.1, 0.2 per concentration of said receptor, eg, the nucleic acid encoding CAR, or the total number of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the total number of mononuclear cells, the total number of T cells, or the total number of microliters. , 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, or 0.9 receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells. In some embodiments, the receptor-expressing cells are detected in the blood of a subject as at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, or 60% of total PBMC, and / or the first. At least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks, 11 weeks, 12 weeks, 24 weeks, 36 after one or subsequent doses It is detected at such levels over a week, 48 weeks, or 52 weeks, or 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, or 5 years, or longer after such administration.

一部の局面において、前記方法は、例えば、対象の血清中にある、DNA 1マイクログラムあたりの前記組換え受容体、例えば、CARをコードする核酸のコピーの少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍、または少なくとも20倍の増加をもたらす。 In some aspects, the method comprises at least twice, at least four times, at least a copy of the recombinant receptor, eg, a nucleic acid encoding CAR, per microgram of DNA in the serum of interest. It results in a 10-fold, or at least 20-fold increase.

一部の態様において、前記受容体発現細胞は、第1の用量を投与して、または第2の（または後の）用量を投与して少なくとも、20日後、21日後、22日後、23日後、24日後、25日後、26日後、27日後、28日後、29日後、30日後、31日後、32日後、33日後、34日後、35日後、36日後、37日後、38日後、39日後、40日後、41日後、42日後、43日後、44日後、45日後、46日後、47日後、48日後、49日後、50日後、51日後、52日後、53日後、54日後、55日後、56日後、57日後、58日後、59日後、もしくは60日後、またはこれより後に、あるいは、第1の用量または後の用量を投与して少なくとも、2週間後、3週間後、4週間後、5週間後、6週間後、7週間後、8週間後、9週間後、10週間後、11週間後、12週間後、13週間後、14週間後、15週間後、16週間後、17週間後、18週間後、19週間後、20週間後、21週間後、22週間後、23週間後、もしくは24週間後、またはこれより後に、あるいは約2週間後、約3週間後、約4週間後、約5週間後、約6週間後、約7週間後、約8週間後、約9週間後、約10週間後、約11週間後、約12週間後、約13週間後、約14週間後、約15週間後、約16週間後、約17週間後、約18週間後、約19週間後、約20週間後、約21週間後、約22週間後、約23週間後、もしくは約24週間後、またはこれより後に、例えば、特定の方法、例えば、qPCRまたはフローサイトメトリーに基づく検出方法によって、対象の血液中または血清中で検出することができる。 In some embodiments, the receptor-expressing cells are administered at least 20 days, 21 days, 22 days, 23 days after the first dose or the second (or later) dose. 24 days later, 25 days later, 26 days later, 27 days later, 28 days later, 29 days later, 30 days later, 31 days later, 32 days later, 33 days later, 34 days later, 35 days later, 36 days later, 37 days later, 38 days later, 39 days later, 40 days later , 41 days, 42 days, 43 days, 44 days, 45 days, 46 days, 47 days, 48 days, 49 days, 50 days, 51 days, 52 days, 53 days, 54 days, 55 days, 56 days, 57 At least 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 days after, 58 days, 59 days, 60 days, or later, or the first dose or the dose after. Weeks, 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks, 11 weeks, 12 weeks, 13 weeks, 14 weeks, 15 weeks, 16 weeks, 17 weeks, 18 weeks , 19 weeks, 20 weeks, 21 weeks, 22 weeks, 23 weeks, or 24 weeks, or later, or about 2 weeks, about 3 weeks, about 4 weeks, about 5 weeks After about 6 weeks, about 7 weeks, about 8 weeks, about 9 weeks, about 10 weeks, about 11 weeks, about 12 weeks, about 13 weeks, about 14 weeks, about 15 weeks After, about 16 weeks, about 17 weeks, about 18 weeks, about 19 weeks, about 20 weeks, about 21 weeks, about 22 weeks, about 23 weeks, or about 24 weeks, or this Later, it can be detected in the blood or serum of the subject, for example by a specific method, eg, a detection method based on qPCR or flow cytometry.

一部の局面において、対象もしくは流体、組織、またはその区画において、例えば、血液中、例えば、末梢血中に、またはその疾患部位において、少なくとも約1x10²個、少なくとも約1x10³個、少なくとも約1x10⁴個、少なくとも約1x10⁵個、もしくは少なくとも約1x10⁶個、もしくは少なくとも約5x10⁶個、もしくは少なくとも約1x10⁷個、もしくは少なくとも約5x10⁷個、もしくは少なくとも約1x10⁸個の組換え受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞、および/あるいは1マイクロリットルあたり少なくとも10個、25個、50個、100個、200個、300個、400個、もしくは500、または1000個の受容体発現細胞、例えば、1マイクロリットルあたり少なくとも10個が検出可能であるか、または存在する。一部の態様において、このような数または濃度の細胞は、第1の用量の投与後または後の用量の投与後少なくとも約20日間、少なくとも約40日間、もしくは少なくとも約60日間、または少なくとも約3ヶ月間、約4ヶ月間、約5ヶ月間、約6ヶ月間、約7ヶ月間、約8ヶ月間、約9ヶ月間、約10ヶ月間、約11ヶ月間、もしくは約12ヶ月間、または少なくとも2年もしくは3年にわたって対象において検出可能である。このような細胞数は、フローサイトメトリーに基づく方法または定量PCRに基づく方法と、公知の方法を用いた総細胞数への外挿によって検出されてもよい。例えば、Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al. Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828を参照されたい。 In some aspects, at least about 1x10 ² , at least about 1x10 ³ , at least about 1x10, in a subject or fluid, tissue, or section thereof, eg, in blood, eg, in peripheral blood, or at the site of the disease. ⁴ , at least about 1x10 ⁵ , or at least about 1x10 ⁶ , or at least about 5x10 ⁶ , or at least about 1x10 ⁷ , or at least about 5x10 ⁷ , or at least about 1x10 ⁸ recombinant receptor-expressing cells For example, CAR-expressing cells and / or at least 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, or 500, or 1000 receptor-expressing cells per microliter, eg. At least 10 per microliter are detectable or present. In some embodiments, cells of such number or concentration are at least about 20 days, at least about 40 days, or at least about 60 days, or at least about 3 after administration of the first dose or after administration of the first dose. Months, about 4 months, about 5 months, about 6 months, about 7 months, about 8 months, about 9 months, about 10 months, about 11 months, or about 12 months, or It is detectable in the subject for at least 2 or 3 years. Such cell numbers may be detected by flow cytometry-based or quantitative PCR-based methods and extrapolation to total cell numbers using known methods. For example, Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177), Park et al, Molecular Therapy 15 (4): 825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121 (5): 1822-1826 ( 2011), Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1 (9): 1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117: 72-82, Jensen et al . Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16 (9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118 (18): 4817-4828.

一部の局面において、前記細胞を投与して、例えば、第1の用量または後の用量を投与して約1週間後、約2週間後、約3週間後、約4週間後、約5週間後、もしくは少なくとも約6週間後、または少なくとも約2ヶ月後、約3ヶ月後、約4ヶ月後、約5ヶ月後、約6ヶ月後、約7ヶ月後、約8ヶ月後、約9ヶ月後、約10ヶ月後、約11ヶ月後、もしくは約12ヶ月後、または少なくとも2年後もしくは3年後に、免疫組織化学、PCR、および/またはフローサイトメトリーによって測定された時の、100個の細胞あたりの、例えば、末梢血もしくは骨髄または他の区画にある100個の細胞あたりの、前記組換え受容体をコードする核酸のコピー数、例えば、ベクターコピー数は、少なくとも0.01、少なくとも0.1、少なくとも1、または少なくとも10である。一部の態様において、第1の用量または後の用量の受容体発現細胞、例えば、CAR発現細胞を投与して約1週間後、約2週間後、約3週間後、または少なくとも約4週間後、あるいはこのような投与の少なくとも2ヶ月後、3ヶ月後、4ヶ月後、5ヶ月後、6ヶ月後、7ヶ月後、8ヶ月後、9ヶ月後、10ヶ月後、11ヶ月後、もしくは12ヶ月後、または少なくとも2年後もしくは3年後の時期に、ゲノムDNA 1マイクログラムあたりの前記受容体、例えば、CARを発現するベクターのコピー数は少なくとも100、少なくとも1000、少なくとも5000、または少なくとも10,000、または少なくとも15,000、または少なくとも20,000である。 In some aspects, the cells are administered, eg, about 1 week, about 2 weeks, about 3 weeks, about 4 weeks, about 5 weeks after the administration of the first dose or the later dose. After, or at least about 6 weeks, or at least about 2 months, about 3 months, about 4 months, about 5 months, about 6 months, about 7 months, about 8 months, about 9 months 100 cells, as measured by immunohistochemistry, PCR, and / or flow cytometry, after about 10 months, about 11 months, or about 12 months, or at least 2 or 3 years. Per, eg, per 100 cells in peripheral blood or bone marrow or other compartment, the number of copies of the nucleic acid encoding the recombinant receptor, eg, vector copies, is at least 0.01, at least 0.1, at least 1. , Or at least 10. In some embodiments, about 1 week, about 2 weeks, about 3 weeks, or at least about 4 weeks after administration of the first or later dose of receptor-expressing cells, eg, CAR-expressing cells. Or at least 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, or 12 after such administration. At least 100, at least 1000, at least 5000, or at least 10,000 copies of the receptor, eg, a vector expressing CAR, per microgram of genomic DNA at months, or at least 2 or 3 years later. , Or at least 15,000, or at least 20,000.

一部の局面において、前記細胞によって発現される受容体、例えば、CARは、前記細胞を投与して、例えば、第1の用量または第2の用量もしくは後の用量の投与を開始して、少なくとも約3ヶ月後、少なくとも約6ヶ月後、少なくとも約12ヶ月後、少なくとも約1年後、少なくとも約2年後、少なくとも約3年後、または3年を超えた時期に、対象、その血液、および/またはその疾患部位において定量PCR(qPCR)またはフローサイトメトリーによって検出することができる。 In some aspects, a receptor expressed by said cell, eg CAR, administers said cell and initiates administration of, for example, a first dose or a second dose or a later dose, at least. Subjects, their blood, and at least about 3 months, at least about 6 months, at least about 12 months, at least about 1 year, at least about 2 years, at least about 3 years, or over 3 years. / Or can be detected by quantitative PCR (qPCR) or flow cytometry at the disease site.

一部の態様において、第1の用量の投与後、ある期間にわたる、対象の流体、組織、または臓器、例えば、血液における受容体(例えば、CAR)発現細胞の濃度の曲線下面積(AUC)は、単一用量の細胞または同じ受容体を発現する複数用量の細胞が対象に投与される代替投薬計画により得られたものと比較して、大きい。 In some embodiments, the area under the curve (AUC) of the concentration of receptor (eg, CAR) -expressing cells in a fluid, tissue, or organ of interest, such as blood, over a period of time after administration of the first dose. Larger than that obtained by an alternative dosing regimen in which a single dose of cells or multiple doses of cells expressing the same receptor are administered to the subject.

一部の局面において、後の用量の投与後、ある期間にわたる、対象の流体、組織、または臓器、例えば、血液における受容体(例えば、CAR)発現細胞の濃度の曲線下面積(AUC)は、単一用量の細胞または同じ受容体を発現する複数用量の細胞が対象に投与される代替投薬計画により得られたものと比較して、大きい。 In some aspects, the area under the curve (AUC) of the concentration of receptor (eg, CAR) -expressing cells in a fluid, tissue, or organ of interest, eg, blood, over a period of time after administration of a later dose. Larger compared to those obtained by alternative dosing regimens in which a single dose of cells or multiple doses of cells expressing the same receptor are administered to the subject.

VII.疾患負荷
前記用量の投与は、一般的には、対象における疾患または状態の増殖または負荷を低減または阻止する。例えば、疾患または状態が腫瘍である場合、前記方法は、一般的には、腫瘍サイズ、容積、もしくは転移を低減する、および/または予後もしくは生存または腫瘍負荷に関連する他の症状を改善する。一部の態様において、第2の用量または後の用量の投与の時間は、第1の用量または先の用量の後のトランスジーン特異的免疫応答の発生および/または再発に関連して決められる。 VII. Disease Load Administration of the dose generally reduces or prevents the growth or load of the disease or condition in the subject. For example, if the disease or condition is a tumor, the method generally reduces tumor size, volume, or metastasis and / or improves other symptoms associated with prognosis or survival or tumor loading. In some embodiments, the time of administration of the second or subsequent dose is determined in relation to the development and / or recurrence of a transgene-specific immune response after the first or earlier dose.

疾患負荷は、対象における、または対象の臓器、組織、もしくは体液における、例えば、腫瘍の臓器もしくは組織または別の位置、例えば、転移を示す位置における疾患の細胞の総数を包含してもよい。例えば、腫瘍細胞は、ある特定の血液腫瘍の状況では血液中または骨髄中で検出および/または定量されてもよい。疾患負荷は、一部の態様では、腫瘍の質量、および/または転移の数もしくは程度を含んでもよい。
一部の態様において、2つ以上の用量の投与は、疾患負荷を低減させる。 The disease load may include the total number of diseased cells in the subject or in the organ, tissue, or body fluid of the subject, eg, the organ or tissue of the tumor or another location, eg, a location exhibiting metastasis. For example, tumor cells may be detected and / or quantified in blood or bone marrow in certain hematological malignancies. The disease burden may, in some embodiments, include the mass of the tumor and / or the number or extent of metastases.
In some embodiments, administration of two or more doses reduces the disease burden.

一部の局面において、複数の用量の投与は疾患負荷の増加を阻止する場合があり、これは、疾患負荷が変化しないことで証明される場合がある。 In some aspects, administration of multiple doses may prevent an increase in disease load, which may be demonstrated by the fact that the disease load does not change.

一部の局面において、第1の用量の投与後に疾患または状態は持続する、および/または第1の用量の投与は対象における疾患もしくは状態を根絶するのに十分でない。 In some aspects, the disease or condition persists after administration of the first dose, and / or administration of the first dose is not sufficient to eradicate the disease or condition in the subject.

一部の局面において、第2の用量の投与は、第1の用量の直前または第2の用量の直前の疾患負荷と比較して疾患負荷を低減する。一部の局面において、例えば、再発の状況では、第2の用量の投与は、第1の用量の投与後の疾患負荷のピークレベルと比較して疾患負荷の低減をもたらす。 In some aspects, administration of the second dose reduces the disease burden as compared to the disease load immediately prior to the first dose or immediately prior to the second dose. In some aspects, for example, in the context of recurrence, administration of the second dose results in a reduction in disease load compared to the peak level of disease load after administration of the first dose.

一部の態様において、前記方法は、代替投薬計画、例えば、対象に単一用量の細胞または同じ受容体、例えばCARを発現する複数用量の細胞が与えられる代替の投与計画を用いる方法を用いて観察される低減と比較して大きな程度までおよび/または長い期間にわたって、疾患または状態の負荷、例えば、腫瘍細胞の数、腫瘍のサイズ、患者生存または無事象生存の持続期間を低減する。一部の態様において、第2の用量の後に、疾患負荷は、同じ受容体、例えばCARを発現する第2の用量の細胞を投与することによって生じる低減と比較して大きな度合いで、または長い期間にわたって、低減する。 In some embodiments, the method uses an alternative dosing regimen, eg, an alternative dosing regimen in which the subject is given a single dose of cells or the same receptor, eg, multiple doses of cells expressing CAR. Reduces the burden of disease or condition, such as the number of tumor cells, tumor size, patient survival or duration of event-free survival, to a large extent and / or over a long period of time compared to the observed reduction. In some embodiments, after the second dose, the disease burden is to a greater extent or for a longer period of time compared to the reduction caused by administering the same receptor, eg, a second dose of cells expressing CAR. Reduce over.

一部の態様において、対象における疾患または状態の負荷は検出、評価、または測定される。疾患負荷は、一部の局面では、対象における、または対象の臓器、組織、もしくは体液、例えば、血液もしくは血清における疾患細胞または疾患関連細胞、例えば、腫瘍細胞の総数を検出することによって検出されてもよい。一部の態様において、疾患負荷、例えば、腫瘍負荷は、固形腫瘍の質量および/または転移の数もしくは程度を測定することによって評価される。一部の局面において、対象の生存、ある特定の期間内での生存、生存の度合い、無事象生存もしくは無症状生存(symptom-free survival)または無再発生存の存在もしくは持続期間が評価される。一部の態様において、疾患または状態の任意の症状が評価される。一部の態様において、疾患または状態の負荷の判断基準が指定される。 In some embodiments, the load of the disease or condition in the subject is detected, evaluated, or measured. Disease burden is, in some aspects, detected by detecting the total number of diseased or disease-related cells, eg, tumor cells, in the subject or in the subject's organ, tissue, or body fluid, eg, blood or serum. May be good. In some embodiments, disease loading, eg, tumor loading, is assessed by measuring the mass of solid tumors and / or the number or extent of metastases. In some aspects, the subject's survival, survival within a particular time period, degree of survival, presence or duration of asymptomatic or symptom-free survival or recurrence-free survival is assessed. In some embodiments, any symptom of the disease or condition is assessed. In some embodiments, criteria for load of disease or condition are specified.

一部の局面において、第1の用量の投与前に、第1の用量の投与後であるが第2の用量の投与前に、および/または第2の用量もしくは後の用量の投与後に、疾患負荷が測定または検出される。後の複数の用量の状況では、疾患負荷は、一部の態様では、任意の後の用量の前もしくは後に、または後の用量の投与の間の期間において測定されてもよい。 In some aspects, the disease before administration of the first dose, after administration of the first dose but before administration of the second dose, and / or after administration of the second or subsequent dose. The load is measured or detected. In later multiple dose situations, disease load may, in some embodiments, be measured before or after any subsequent dose, or in the period between administrations of subsequent doses.

一部の局面において、複数の用量の投与は、疾患負荷、例えば、腫瘍負荷の低減、例えば、第2の用量の投与直前と比較した負荷における、あるいは第1の用量の直前と比較した全体における、10パーセント、20パーセント、30パーセント、40パーセント、50パーセント、60パーセント、70パーセント、90パーセント、もしくは100パーセント、または約10パーセント、約20パーセント、約30パーセント、約40パーセント、約50パーセント、約60パーセント、約70パーセント、約90パーセント、もしくは約100パーセントの減少をもたらす。一部の態様において、第2の用量の後に、疾患負荷、腫瘍サイズ、腫瘍体積、腫瘍質量、および/または腫瘍量もしくは腫瘍容積は、第1の用量または後の用量の投与直前と比較して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、もしくはそれより多く、または少なくとも約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、もしくはそれより多く、低減する。 In some aspects, administration of multiple doses is in a reduction in disease loading, eg, tumor loading, eg, in a load compared to immediately prior to administration of the second dose, or overall compared to immediately preceding the first dose. , 10 percent, 20 percent, 30 percent, 40 percent, 50 percent, 60 percent, 70 percent, 90 percent, or 100 percent, or about 10 percent, about 20 percent, about 30 percent, about 40 percent, about 50 percent, It results in a reduction of about 60 percent, about 70 percent, about 90 percent, or about 100 percent. In some embodiments, after the second dose, the disease load, tumor size, tumor volume, tumor mass, and / or tumor volume or tumor volume is compared to immediately prior to administration of the first or subsequent dose. Reduce by at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or more, or at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or more. ..

一部の態様において、前記方法による疾患負荷の低減は、例えば、第1の用量または任意の後の用量の投与、例えば、開始から1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後に、または3ヶ月を超えた後に評価された時の、形態学的な完全寛解の誘導を含む。一部の局面において、例えば、マルチパラメトリックフローサイトメトリー(multiparametric flow cytometry)によって評価された時の、微小残存病変アッセイは陰性であるか、または微小残存病変のレベルは約0.3％未満、約0.2％未満、約0.1％未満、もしくは約0.05％未満である。 In some embodiments, the reduction of the disease burden by the method is, for example, administration of a first dose or any subsequent dose, eg, 1 month, 2 months, 3 months, or 3 months after the start. Includes induction of morphological complete remission when assessed after crossing. In some aspects, for example, when assessed by multiparametric flow cytometry, the minimal residual disease assay is negative, or the level of minimal residual disease is less than about 0.3%, about 0.2%. Less than, less than about 0.1%, or less than about 0.05%.

一部の態様において、対象の無事象生存率または全生存率は、前記方法によって、他の方法と比較して改善される。例えば、一部の態様において、第1の用量の6ヶ月後の、前記方法で処置した対象の無事象生存率または確率は、約40％超、約50％超、約60％超、約70％超、約80％超、約90％超、または約95％超である。一部の局面において、全生存率は、約40％超、約50％超、約60％超、約70％超、約80％超、約90％超、または約95％超である。一部の態様において、前記方法で処置した対象は、無事象生存、無再発生存、または少なくとも6ヶ月、または少なくとも1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、もしくは10年までの生存を示す。一部の態様において、例えば、6ヶ月を超える、もしくは約6ヶ月を超える、または少なくとも1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、もしくは10年の腫瘍増殖停止時間(time to progression)など腫瘍増殖停止時間が改善される。 In some embodiments, the subject's event-free survival rate or overall survival rate is improved by the method as compared to other methods. For example, in some embodiments, 6 months after the first dose, the event-free survival rate or probability of subjects treated with the method is greater than about 40%, greater than about 50%, greater than about 60%, about 70. More than%, more than about 80%, more than about 90%, or more than about 95%. In some aspects, overall survival is greater than about 40%, greater than about 50%, greater than about 60%, greater than about 70%, greater than about 80%, greater than about 90%, or greater than about 95%. In some embodiments, subjects treated in the manner described above are event-free, relapse-free, or at least 6 months, or at least 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, 5 years, 6 years, 7 years, Shows survival up to 8, 9, or 10 years. In some embodiments, for example, more than 6 months, or more than about 6 months, or at least 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, 5 years, 6 years, 7 years, 8 years, 9 years, or Tumor growth arrest time is improved, such as 10-year tumor growth arrest time (time to progression).

一部の態様において、前記方法による処置後に再発確率は他の方法と比較して低下する。例えば、一部の態様において、第1の用量の6ヶ月後の再発確率は、約80％未満、約70％未満、約60％未満、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、または約10％未満である。 In some embodiments, the probability of recurrence is reduced after treatment with the method as compared to other methods. For example, in some embodiments, the probability of recurrence after 6 months of the first dose is less than about 80%, less than about 70%, less than about 60%, less than about 50%, less than about 40%, less than about 30%. , Less than about 20%, or less than about 10%.

VIII.毒性および毒性転帰
いくつかの態様において、方法は、例えば、単一の用量としての細胞の投与、第1の用量と同じ受容体を発現する細胞の後の用量の投与、および/または方法によって指定された第1の用量と後の用量との間の時間より早い時点での後の用量の投与と比較して、毒性またはその事象もしくは症状を低下させるかまたは防止する。 VIII. Toxicity and Toxicity Outcomes In some embodiments, the method is, for example, administration of cells as a single dose, administration of a subsequent dose of cells expressing the same receptor as the first dose, and / or method. Reduces or prevents toxicity or its events or symptoms as compared to administration of later doses earlier than the time between the first and subsequent doses specified by.

キメラ抗原受容体を発現するT細胞による処置のような養子T細胞療法の投与は、サイトカイン放出症候群および神経毒性のような毒性の効果または事象を誘導する場合がある。いくつかの例において、そのような効果または事象は、観察された毒性の基礎となり得る、循環血中サイトカインの高いレベルと平行する。 Administration of adoptive T cell therapy, such as treatment with T cells expressing chimeric antigen receptors, may induce toxic effects or events such as cytokine release syndrome and neurotoxicity. In some examples, such effects or events parallel high levels of circulating cytokines that can be the basis of the observed toxicity.

いくつかの局面において、本発明の方法は、例えば、同一の受容体を発現する細胞の複数回のより小さな用量が宿主免疫応答によって排除され得る場合に、例えば大きな用量が単回投与される他の方法よりも小さな第1の用量の投与を可能にすることによって、他の方法と比較して毒性または毒性事象を低下させることができる。 In some aspects, the methods of the invention include, for example, when multiple smaller doses of cells expressing the same receptor can be eliminated by a host immune response, eg, a larger dose is administered as a single dose. By allowing administration of a first dose smaller than that of the method, toxicity or toxic events can be reduced compared to other methods.

いくつかの態様において、本発明は、第1の用量の投与の28日後より後、例えば、再び投与された場合に、第1の受容体を発現する細胞が排除されるであろう、第1の受容体に対する免疫応答が発達した時点で、後の用量の投与を可能にすることによって、他の方法と比較して毒性または毒性事象を低下させることができる。従って、いくつかの局面において、方法は、対象がCRSを発症するリスクを有する時点で、複数の用量を投与する方法と比較して、毒性を低下させる。 In some embodiments, the invention will eliminate cells expressing the first receptor more than 28 days after administration of the first dose, eg, when re-administered. Once the immune response to the receptor has developed, toxic or toxic events can be reduced compared to other methods by allowing later doses to be administered. Therefore, in some aspects, the method reduces toxicity compared to methods that administer multiple doses at a time when the subject is at risk of developing CRS.

一部の局面において、毒性転帰はサイトカイン放出症候群(CRS)もしくは重度のCRS(sCRS)であるか、サイトカイン放出症候群(CRS)もしくは重度のCRS(sCRS)に関連するか、またはサイトカイン放出症候群(CRS)もしくは重度のCRS(sCRS)を示す。CRS、例えば、sCRSは、場合によっては、養子T細胞療法後に、および他の生物製品が対象に投与された後に起こることがある。Davila et al., Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368, 1509-1518 (2013);およびKochenderfer et al., Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78を参照されたい。 In some aspects, the toxicity outcome is whether it is cytokine release syndrome (CRS) or severe CRS (sCRS), is associated with cytokine release syndrome (CRS) or severe CRS (sCRS), or is cytokine release syndrome (CRS). ) Or severe CRS (sCRS). CRS, eg, sCRS, can optionally occur after adoptive T cell therapy and after other biological products have been administered to the subject. Davila et al., Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368, 1509- See 1518 (2013); and Kochenderfer et al., Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78.

CRSは、抗炎症性療法、例えば、抗IL-6療法、例えば、抗IL-6抗体、例えば、トシリズマブ、または抗生物質を用いて治療されることがある。一部の態様において、第1の投与の後に、対象はこのような療法で処置され、このような処置の後に、CRS関連症状が低減したか、もしくは低下している最中であるか、許容されるレベルを下回って低下した場合および時にだけ、後の用量が投与される。 CRS may be treated with anti-inflammatory therapy, eg, anti-IL-6 therapy, eg, anti-IL-6 antibody, eg tocilizumab, or antibiotics. In some embodiments, the subject is treated with such therapy after the first dose, and after such treatment, CRS-related symptoms have been reduced or are in the process of being reduced or tolerated. Subsequent doses are administered only when and occasionally below the levels to be given.

CRSの転帰、徴候、および症状は公知であり、本明細書に記載のものを含む。一部の態様において、特定の投与計画もしくは投与が、ある特定のCRS関連転帰、徴候、もしくは症状をもたらす場合、または特定の投与計画もしくは投与が、ある特定のCRS関連転帰、徴候、もしくは症状をもたらさない場合、特定の転帰、徴候、および症状、ならびに/またはその数量もしくは程度が指定されることがある。 Outcomes, signs, and symptoms of CRS are known and include those described herein. In some embodiments, a particular dosing regimen or administration results in a particular CRS-related outcome, sign, or symptom, or a particular dosing regimen or administration produces a particular CRS-related outcome, sign, or symptom. If not, specific outcomes, signs, and symptoms, and / or their quantity or extent may be specified.

様々な転帰を測定または検出するための方法を特定することができる。 Methods for measuring or detecting various outcomes can be identified.

一部の局面において、第1の用量の投与前に、第1の用量の投与後で後の用量の投与前に、または後の用量の投与後に、CRS関連転帰が対象において評価される。一部の態様において、毒性転帰、例えば、CRS関連転帰のレベル、例えば、CRSの指標の血清レベルがELISAによって測定される。一部の局面において、毒性転帰は神経毒性であるか、または神経毒性に関連する。 In some aspects, CRS-related outcomes are assessed in the subject before administration of the first dose, after administration of the first dose, before administration of the later dose, or after administration of the later dose. In some embodiments, the toxicity outcome, eg, the level of a CRS-related outcome, eg, the serum level of an indicator of CRS, is measured by ELISA. In some aspects, the toxic outcome is neurotoxic or is associated with neurotoxicity.

一部の局面において、前記方法は、他の方法と比較して神経毒性に関連する症状を低減する。例えば、本方法に従って処置された対象は、他の方法によって処置された対象と比較して、神経毒性の症状、例えば、四肢の脱力またはしびれ、記憶、視力、および/または知性の喪失、制御不能な強迫行動および/または強制行動、妄想、頭痛、運動制御の喪失を含む認知問題および行動問題、認知衰退、ならびに自律神経系機能不全、ならびに性機能不全を低減している可能性がある。 In some aspects, the method reduces neurotoxicity-related symptoms as compared to other methods. For example, subjects treated according to this method have neurotoxic symptoms, such as weakness or numbness in the extremities, memory, vision, and / or loss of intelligence, out of control, compared to subjects treated by other methods. It may reduce cognitive and behavioral problems, including compulsive and / or forced behavior, delusions, headaches, loss of motor control, cognitive decline, and autonomic nervous system dysfunction, as well as sexual dysfunction.

一部の態様において、前記方法は、神経系および/または脳に対する損傷、例えば、ニューロン死を含む、神経毒性に関連する転帰を低減する。一部の局面において、前記方法は、神経毒性に関連する因子、例えば、βアミロイド(Aβ)、グルタミン酸、および酸素ラジカルのレベルを低減する。 In some embodiments, the method reduces neurotoxicity-related outcomes, including damage to the nervous system and / or brain, such as neuronal death. In some aspects, the method reduces the levels of factors related to neurotoxicity, such as β-amyloid (Aβ), glutamic acid, and oxygen radicals.

一部の態様において、本方法による複数の用量が投与された対象では、単一用量の投与、第1の用量と同じ受容体、例えばCARを発現する細胞の後の用量の投与、ならびに/または前記方法によって特定された第1の用量と後の用量との間の時点より早い時点での後の用量の投与と比較して、神経毒性に関連する症状、転帰、または因子を低減した。 In some embodiments, in subjects to which multiple doses according to the method have been administered, single dose administration, administration of the same receptor as the first dose, eg, subsequent doses of cells expressing CAR, and / or The symptoms, outcomes, or factors associated with neurotoxicity were reduced compared to administration of the later dose earlier than the time between the first dose and the later dose identified by the method.

IX.細胞
前記細胞は通常、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であり、典型的にはヒト細胞、例えば、ヒト対象に由来しかつ例えば組換え受容体を発現するように操作された、ヒト細胞である。一部の態様において、前記細胞は血液、骨髄、リンパ、またはリンパ系臓器に由来し、免疫系の細胞、例えば、自然免疫または適応免疫の細胞、例えば、リンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞を含む骨髄系細胞またはリンパ系細胞である。他の例示的な細胞には、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞(iPSC)を含む多分化能性幹細胞および多能性幹細胞が含まれる。前記細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接単離された、および/または対象から単離され、凍結された細胞である。一部の態様において、前記細胞には、T細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞、およびその部分母集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖、再循環、局在化、および/もしくは持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに/または分化の程度によって規定されるT細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセットが含まれる。処置しようとする対象に関して、前記細胞は同種異系および/または自己由来でもよい。前記方法の中には既製の方法が含まれる。一部の局面において、例えば、既製の技術の場合、前記細胞は多能性および/または多分化能性であり、例えば、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞(iPSC)である。一部の態様において、前記方法は、対象から細胞を単離する工程、細胞を調製、処理、培養、および/または操作する工程、ならびに凍結保存前または凍結保存後に細胞を同じ対象に再導入する工程を含む。 IX. Cell The cell is usually a eukaryotic cell, eg, a mammalian cell, typically a human cell, eg, a human derived from a human subject and engineered to express, for example, a recombinant receptor. It is a cell. In some embodiments, the cells are derived from blood, bone marrow, lymph, or lymphoid organs and are cells of the immune system, such as cells of spontaneous or adaptive immunity, such as lymphocytes, typically T cells and / Or myeloid or lymphoid cells, including NK cells. Other exemplary cells include stem cells, such as pluripotent stem cells including induced pluripotent stem cells (iPSCs) and pluripotent stem cells. The cells are typically primary cells, eg, cells directly isolated from a subject and / or isolated from a subject and frozen. In some embodiments, the cells include one or more subsets of T cells or other cell types, such as whole T cell populations, CD4 + cells, CD8 + cells, and partial populations thereof, such as function, activity. Metabolism, maturity, differentiation potential, proliferation, recirculation, localization, and / or sustainability, antigen specificity, type of antigen receptor, presence in a particular organ or compartment, marker or cytokine secretion profile, and /. Or it includes one or more subsets of T cells or other cell types defined by the degree of differentiation. For the subject to be treated, the cells may be allogeneic and / or self-derived. The methods include ready-made methods. In some aspects, for example, in the case of off-the-shelf techniques, the cells are pluripotent and / or pluripotent, eg stem cells, eg induced pluripotent stem cells (iPSCs). In some embodiments, the method involves isolating cells from a subject, preparing, treating, culturing, and / or manipulating the cells, and reintroducing the cells into the same subject before or after cryopreservation. Including the process.

T細胞ならびに/またはCD4+T細胞および/もしくはCD8+T細胞のサブタイプおよび部分母集団の中には、ナイーブT(T_N)細胞、エフェクターT細胞(T_EFF)、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーT(T_SCM)、セントラルメモリー(central memory)T(T_CM)、エフェクターメモリーT(T_EM)、または高度に分化したエフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアント(mucosa-associated invariant)T(MAIT)細胞、天然および適応性の調節性T(Treg)細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞ヘルパーT細胞、α/βT細胞、ならびにδ/γT細胞がある。 Some subtypes and subpopulations of T cells and / or CD4 + T cells and / or CD8 + T cells include naive T ( _TN ) cells, effector T cells (T _EFF ), memory T cells and their subs. Types such as stem cell memory T (T _SCM ), central memory T (T _CM ), effector memory T (T _EM ), or highly differentiated effector memory T cells, tumor infiltrating lymphocytes (TIL), Immature T cells, mature T cells, helper T cells, cytotoxic T cells, mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, natural and adaptive regulatory T (Treg) cells, helper T cells For example, there are TH1 cells, TH2 cells, TH3 cells, TH17 cells, TH9 cells, TH22 cells, follicular helper T cells, α / βT cells, and δ / γT cells.

一部の態様において、前記細胞はナチュラルキラー(NK)細胞である。一部の態様において、前記細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および/または好塩基球である。 In some embodiments, the cell is a natural killer (NK) cell. In some embodiments, the cells are monospheres or granulocytes, such as myeloid cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells, mast cells, eosinophils, and / or basophils.

一部の態様において、前記細胞は、遺伝子操作を介して導入された1種または複数種の核酸を含み、それによって、このような核酸の組換え産物または遺伝子操作された産物を発現する。一部の態様において、前記核酸は異種である、すなわち、細胞または細胞から得られた試料に通常は存在せず、例えば、別の生物または細胞から得られたもの、例えば、操作されている細胞、および/またはこのような細胞が得られた生物に普通は見られないものである。一部の態様において、前記核酸は非天然であり、例えば、複数の異なる細胞タイプに由来する様々なドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含む核酸を含む、天然に見られない核酸である。 In some embodiments, the cell comprises one or more nucleic acids introduced via genetic manipulation, thereby expressing recombinant or genetically engineered products of such nucleic acids. In some embodiments, the nucleic acid is heterologous, i.e., it is not normally present in a cell or a sample obtained from a cell, eg, one obtained from another organism or cell, eg, a cell being manipulated. , And / or such cells are not normally found in the organism from which they were obtained. In some embodiments, the nucleic acid is unnatural and is a non-naturally occurring nucleic acid, including, for example, a nucleic acid comprising a chimeric combination of nucleic acids encoding different domains from different cell types.

遺伝子操作のためのベクターおよび方法
遺伝子操作された組換え受容体発現細胞を生成するための方法、組成物、およびキットも提供される。遺伝子操作は、一般的に、例えば、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換によって、組換え成分または操作された成分をコードする核酸を細胞に導入することを伴う。 Vectors and Methods for Genetic Engineering Methods, compositions, and kits for generating genetically engineered recombinant receptor-expressing cells are also provided. Genetic manipulation generally involves introducing into cells a nucleic acid encoding a recombinant or engineered component, eg, by retroviral transduction, transfection, or transformation.

一部の態様において、遺伝子移入は、最初に、細胞を刺激し、例えば、細胞を、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるような増殖、生存、および/または活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせ、その後に、活性化された細胞に形質導入し、臨床用途に十分な数まで培養で増殖させることによって成し遂げられる。 In some embodiments, gene transfer first stimulates the cell and, for example, responds to the cell, such as proliferation, survival, and / or activation as measured by expression of, for example, a cytokine or activation marker. It is accomplished by stimulating and then transducing the activated cells and growing them in culture to a sufficient number for clinical use.

ある状況では、刺激因子(例えば、リンホカインまたはサイトカイン)の過剰発現が対象に対して毒性をもつ場合がある。従って、ある状況では、操作された細胞は、例えば、養子免疫治療において投与された時に、インビボで細胞を負の選択に対して感受性にする遺伝子セグメントを含む。例えば、一部の局面において、前記細胞は、細胞が投与された対象のインビボ状態が変化した結果として排除可能になるように操作される。負の選択が可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因してもよい。負の選択が可能な遺伝子には、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-I TK)遺伝子(Wigler et al., Cell II :223, 1977);細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ(phosphribosyltransferase)(HPRT)遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ、(Mullen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))が含まれる。 In some situations, overexpression of stimulators (eg, lymphokines or cytokines) may be toxic to the subject. Thus, in certain situations, the engineered cells contain, for example, a gene segment that makes the cells vulnerable to negative selection in vivo when administered in adoptive immunotherapy. For example, in some aspects, the cells are engineered so that they can be eliminated as a result of changes in the in vivo state of the subject to which the cells are administered. The phenotype that allows negative selection may be due to the insertion of a gene that imparts susceptibility to the administered agent, eg, the compound. Negatively selectable genes include the simple herpesvirus type I thymidine kinase (HSV-I TK) gene (Wigler et al., Cell II: 223, 1977); Includes the phosphribosyltransferase (HPRT) gene, the cellular adenine phosphoribosyltransferase (APRT) gene, the bacterial thytocin deaminase, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

一部の局面において、前記細胞は、サイトカインまたは他の因子の発現を促進するようにさらに操作される。遺伝子操作された成分、例えば、抗原受容体、例えば、CARを導入するための様々な方法は周知であり、提供される方法および組成物と共に使用することができる。例示的な方法には、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションを介した方法を含む、受容体をコードする核酸を移入するための方法が含まれる。 In some aspects, the cells are further engineered to promote the expression of cytokines or other factors. Various methods for introducing genetically engineered components, such as antigen receptors, such as CAR, are well known and can be used with the provided methods and compositions. Exemplary methods include methods for the transfer of receptor-encoding nucleic acids, including methods via viruses such as retroviruses or lentiviruses, transductions, transposons, and electroporation.

一部の態様において、組換え核酸は、組換え感染性ウイルス粒子、例えば、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターを用いて細胞に移入される。一部の態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えば、γ-レトロウイルスベクターを用いてT細胞に移入される(例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November; 29(11): 550-557を参照されたい)。 In some embodiments, the recombinant nucleic acid is transferred into cells using a vector derived from recombinant infectious virus particles, such as Simian virus 40 (SV40), adenovirus, adeno-associated virus (AAV). In some embodiments, the recombinant nucleic acid is transferred to T cells using a recombinant lentiviral or retroviral vector, eg, a γ-retroviral vector (eg, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014). Apr 3. doi: 10.1038 / gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al. , Trends Biotechnol. 2011 November; 29 (11): 550-557).

一部の態様において、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、骨髄増殖性肉腫ウイルス(myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV)、マウス胚性幹細胞ウイルス(MESV)、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するレトロウイルスベクターには末端反復配列(LTR)がある。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。一部の態様において、レトロウイルスには、任意の鳥類細胞供給源または哺乳動物細胞供給源に由来するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスは典型的に両種指向性である。両種指向性とは、レトロウイルスが、ヒトを含む、いくつかの種の宿主細胞に感染できることを意味する。一態様において、発現させようとする遺伝子はレトロウイルスgag配列、pol配列、および/またはenv配列に取って代わる。多数の例示的なレトロウイルス系が述べられている(例えば、米国特許第5,219,740号;同第6,207,453号;同第5,219,740号; Miller and Rosman(1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109)。 In some embodiments, retrovirus vectors such as Moloney mouse leukemia virus (MoMLV), myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), mouse embryonic stem cell virus (MESV), mouse stem cell virus (MSCV), Retroviral vectors derived from splenic focus-forming virus (SFFV), or adeno-associated virus (AAV) have terminal repeat sequences (LTRs). Most retroviral vectors are derived from mouse retroviruses. In some embodiments, the retrovirus includes a retrovirus derived from any avian cell source or mammalian cell source. Retroviruses are typically bidirectional. Bilateral orientation means that retroviruses can infect host cells of several species, including humans. In one embodiment, the gene to be expressed replaces the retrovirus gag sequence, pol sequence, and / or env sequence. Numerous exemplary retroviral systems have been described (eg, US Pat. No. 5,219,740; No. 6,207,453; No. 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, AD. (1990). ) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109).

レンチウイルス形質導入法は公知である。例示的な方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114;およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。 Lentivirus transduction methods are known. An exemplary method is, for example, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009). Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.

一部の態様において、組換え核酸はエレクトロポレーションを介してT細胞に移入される(例えば、Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298およびVan Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437)を参照されたい)。一部の態様において、組換え核酸は転位を介してT細胞に移入される(例えば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照されたい)。免疫細胞において遺伝物質を導入および発現する他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載)、プロトプラスト融合、カチオン性リポソームを介したトランスフェクション;タングステン粒子によって促進されるマイクロパーティクルボンバードメント(microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))が含まれる。 In some embodiments, the recombinant nucleic acid is transferred to T cells via electroporation (eg, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene. See Therapy 7 (16): 1431-1437)). In some embodiments, the recombinant nucleic acid is translocated into T cells (eg, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec). See Ther Nucl Acids 2, e74 and Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Other methods for introducing and expressing genetic material in immune cells include calcium phosphate transfection (see, eg, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), protoplast fusion, and cationic liposomes. Transfection; microparticle bombardment promoted by tungsten particles (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); and strontium phosphate DNA co-precipitation (Brash et al., Mol. Cell Biol. , 7: 2031-2034 (1987)) is included.

組換え産物をコードする核酸を移入するための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載のものである。 Other approaches and vectors for transferring nucleic acids encoding recombinant products are described, for example, in International Patent Application Publication No. WO2014055668 and US Pat. No. 7,446,190.

さらなる核酸、例えば、導入用の遺伝子の中には、Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991);およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)に記載のように、療法の効力を改善するための、例えば、移入された細胞の生存および/または機能を促進することによって療法の効力を改善するための遺伝子;細胞を選択および/または評価するための、例えば、インビボ生存または局在化を評価するための遺伝子マーカーを提供するための遺伝子;安全性を改善する、例えば、細胞をインビボで負の選択に対して感受性にすることによって安全性を改善する遺伝子がある。ドミナントポジティブ選択マーカーと負の選択マーカーとの融合から得られた二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用について説明している、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公報も参照されたい。例えば、Riddell et al., 米国特許第6,040,177号の縦列14～17を参照されたい。 Additional nucleic acids, such as genes for introduction, include Lupton S. D. et al., Mol. And Cell Biol., 11: 6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992). ) To improve the efficacy of the therapy, eg, genes to improve the efficacy of the therapy by promoting the survival and / or function of the transferred cells; cell selection and / or evaluation. Genes to provide, for example, genetic markers for assessing in vivo survival or localization; to improve safety, eg, to be safe by sensitizing cells to negative selection in vivo. There are genes that improve sex. The publications of PCT / US91 / 08442 and PCT / US94 / 05601 by Lupton et al. Also describe the use of bifunctional selectable fusion genes obtained from fusion of dominant positive and negative selectable markers. Please refer. See, for example, columns 14-17 of Riddell et al., US Pat. No. 6,040,177.

操作のための細胞の調製
一部の態様において、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養工程および/または調製工程を含む。トランスジェニック受容体、例えば、CARをコードする核酸を導入するための細胞は、試料、例えば、生物学的試料、例えば、対象から得られた、または対象に由来する生物学的試料から単離されてもよい。一部の態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有する対象、または細胞療法を必要とするか、もしくは細胞療法が投与される対象である。対象は、一部の態様では、特定の治療介入、例えば、細胞が単離、処理、および/または操作される養子細胞療法を必要とするヒトである。 Preparation of Cells for Manipulation In some embodiments, preparation of the manipulated cells comprises one or more culture steps and / or preparation steps. Cells for introducing a transgenic receptor, eg, a nucleic acid encoding CAR, are isolated from a sample, eg, a biological sample, eg, a biological sample obtained from or derived from a subject. You may. In some embodiments, the subject from which the cells are isolated is the subject having the disease or condition, or the subject requiring or receiving cell therapy. The subject is, in some embodiments, a human who requires a particular therapeutic intervention, eg, adoptive cell therapy in which cells are isolated, processed, and / or manipulated.

従って、前記細胞は、一部の態様では、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。前記試料には、対象から直接採取した組織、液体、および他の試料、ならびに1つまたは複数の処理工程、例えば、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターを用いた形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションに起因する試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料でもよく、処理された試料でもよい。生物学的試料には、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器試料が、これらから得られた処理済み試料を含めて含まれるが、これに限定されない。 Thus, in some embodiments, the cell is a primary cell, eg, a primary human cell. The samples include tissues, liquids, and other samples taken directly from the subject, as well as one or more treatment steps, such as separation, centrifugation, genetic manipulation (eg, transduction using a viral vector), washing. , And / or samples resulting from incubation. The biological sample may be a sample obtained directly from a biological source or a processed sample. Biological samples include body fluids such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including treated samples obtained from them. Not limited to.

一部の局面において、前記細胞が得られる、または単離される試料は血液もしくは血液由来試料であるか、アフェレーシスもしくは白血球搬出法による生成物であるか、またはこれから得られる。例示的な試料には、全血、末梢血単核球（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検材料、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、消化管に関連するリンパ系組織、粘膜に関連するリンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、***、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、もしくは他の臓器、および/またはこれらに由来する細胞が含まれる。試料には、細胞療法、例えば、養子細胞療法の状況では、自己供給源および同種異系供給源に由来する試料が含まれる。 In some aspects, the sample from which the cells are obtained or isolated is blood or a blood-derived sample, or is a product of apheresis or leukocyte export, or is obtained from it. Exemplary samples include whole blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), leukocytes, bone marrow, thoracic gland, tissue biopsy material, tumors, leukemia, lymphoma, lymph nodes, lymphoid tissues associated with the gastrointestinal tract, and mucous membranes. Related lymphatic tissue, spleen, other lymphatic tissue, liver, lung, stomach, intestine, colon, kidney, pancreas, breast, bone, prostate, cervix, testis, ovary, tonsils, or other organs, And / or cells derived from these are included. Samples include samples derived from self-sources and allogeneic sources in the context of cell therapy, eg, adoptive cell therapy.

いくつかの局面において、第2の用量の細胞は、第1の用量の細胞と同じアフェレーシス生成物に由来する。いくつかの態様において、複数の用量、例えば、第1、第2、第3等の用量の細胞は、同一のアフェレーシス生成物に由来する。 In some aspects, the second dose of cells is derived from the same apheresis product as the first dose of cells. In some embodiments, cells at multiple doses, eg, first, second, third, etc., are derived from the same apheresis product.

他の態様において、第2の（またはその他の後の）用量の細胞は、第1の（またはその他の先の）用量の細胞が由来するものとは異なるアフェレーシス生成物に由来する。 In other embodiments, the second (or other later) dose of cells is derived from a different apheresis product than that of the first (or other earlier) dose of cells.

一部の態様において、前記細胞は細胞株、例えば、T細胞株に由来する。前記細胞は、一部の態様では、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタから得られる。 In some embodiments, the cell is derived from a cell line, eg, a T cell line. The cells are, in some embodiments, obtained from heterologous sources, such as mice, rats, non-human primates, and pigs.

一部の態様において、前記細胞の単離には、1つまたは複数の調製工程および/または親和性に基づかない細胞分離工程が含まれる。一部の例では、例えば、望ましくない成分を除去するために、望ましい成分を濃縮するために、細胞を溶解するか、または特定の試薬に対して感受性のある細胞を除去するために、1種または複数種の試薬の存在下で細胞が洗浄、遠心分離、および/またはインキュベートされる。一部の例では、細胞は、密度、粘着性、サイズ、特定の成分に対する感受性および/または耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。 In some embodiments, isolation of the cells comprises one or more preparation steps and / or cell separation steps that are not based on affinity. In some examples, one species, for example, to remove unwanted components, to concentrate desired components, to lyse cells, or to remove cells that are sensitive to a particular reagent. Alternatively, cells are washed, centrifuged, and / or incubated in the presence of multiple reagents. In some examples, cells are separated based on one or more properties such as density, stickiness, size, sensitivity and / or resistance to specific components.

一部の例では、対象の循環血に由来する細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球搬出法によって得られる。試料は、一部の局面では、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、および/または血小板を含有し、一部の局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。 In some examples, cells derived from the circulating blood of interest are obtained, for example, by apheresis or leukocyte export. The sample contains lymphocytes, erythrocytes, and / or platelets, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, and other nucleated leukocytes in some aspects, and erythrocytes and platelets in some aspects. Contains cells other than.

一部の態様において、例えば、血漿画分を除去するために、および後の処理工程のために前記細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために、対象から収集した血球は洗浄される。一部の態様において、前記細胞はリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。一部の態様において、洗浄溶液には、カルシウムおよび/もしくはマグネシウムならびに/または多くの、もしくは全ての二価カチオンが無い。一部の局面において、洗浄工程は半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Cobe 2991 cell processor, Baxter）によって製造業者の説明書に従って成し遂げられる。一部の局面において、洗浄工程はタンジェント流（tangential flow）濾過（TFF）によって製造業者の説明書に従って成し遂げられる。一部の態様において、洗浄後に、前記細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まないPBSで再懸濁される。ある特定の態様において、血球試料の成分は除去され、前記細胞は培養培地に直接、再懸濁される。 In some embodiments, blood cells collected from the subject are washed, eg, to remove the plasma fraction and to place the cells in a suitable buffer or medium for subsequent processing steps. In some embodiments, the cells are washed with phosphate buffered saline (PBS). In some embodiments, the wash solution is free of calcium and / or magnesium and / or many or all divalent cations. In some aspects, the cleaning process is accomplished by a semi-automatic "flow-through" centrifuge (eg, Cobe 2991 cell processor, Baxter) according to the manufacturer's instructions. In some aspects, the cleaning process is accomplished by tangential flow filtration (TFF) according to the manufacturer's instructions. In some embodiments, after washing, the cells are resuspended in PBS without various biocompatible buffers such as Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ . In certain embodiments, the components of the blood cell sample are removed and the cells are resuspended directly in the culture medium.

一部の態様において、前記方法には、密度に基づく細胞分離方法、例えば、赤血球溶解による末梢血からの白血球の調製、およびPercoll勾配またはFicoll勾配による遠心分離が含まれる。 In some embodiments, the method includes a density-based cell separation method, eg, preparation of leukocytes from peripheral blood by erythrocyte lysis, and centrifugation by a Percoll or Ficoll gradient.

一部の態様において、単離方法には、細胞における、1種または複数種の特定の分子、例えば、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸の発現または存在に基づく様々な細胞タイプの分離が含まれる。一部の態様において、このようなマーカーに基づいて分離するための任意の公知の方法を使用することができる。一部の態様において、分離は親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、単離は、一部の局面では、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとインキュベートし、その後に、一般的に洗浄工程を行い、抗体または結合パートナーに結合している細胞を、抗体または結合パートナーに結合していない細胞から分離することによって、1種または複数種のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞発現または発現レベルに基づいて細胞および細胞集団を分離することを含む。 In some embodiments, the isolation method comprises a variety of cells based on the expression or presence of one or more specific molecules, eg, surface markers, eg, surface proteins, intracellular markers, or nucleic acids in the cell. Includes type separation. In some embodiments, any known method for separating based on such markers can be used. In some embodiments, the separation is an affinity or immune affinity based separation. For example, isolation, in some aspects, is, for example, incubated with an antibody or binding partner that specifically binds to such a marker, followed by a general washing step to bind to the antibody or binding partner. By separating cells that are present from cells that are not bound to an antibody or binding partner, cells and cell populations are determined based on the cell expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers. Including separating.

このような分離工程は、さらに使用するために、試薬に結合した細胞が保持される正の選択に基づいてもよく、および/または抗体または結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づいてもよい。一部の例では、さらに使用するために両画分とも保持される。一部の局面において、不均質な集団の中にある細胞タイプを特異的に特定する抗体が利用できない場合、望ましい集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最も良く行われるように、負の選択が特に有用な場合がある。 Such separation steps may be based on positive selection in which cells bound to the reagent are retained for further use and / or negative in which cells not bound to an antibody or binding partner are retained. It may be based on your choice. In some examples, both fractions are retained for further use. In some aspects, if antibodies that specifically identify the cell type within the heterogeneous population are not available, isolation is best performed based on markers expressed by cells outside the desired population. Negative choices can be particularly useful.

分離によって、特定のマーカーを発現する特定の細胞集団または細胞が100％濃縮または除去される必要はない。例えば、特定のタイプの細胞、例えば、マーカーを発現する細胞の正の選択または濃縮とは、このような細胞の数またはパーセントが増加することを指すが、このマーカーを発現しない細胞が完全に無くなる必要はない。同様に、特定のタイプの細胞、例えば、マーカーを発現する細胞の負の選択、除去、または枯渇とは、このような細胞の数またはパーセントが減少することを指すが、このような細胞が全て完全に取り除かれる必要はない。 Separation does not require 100% enrichment or elimination of a particular cell population or cell expressing a particular marker. For example, positive selection or enrichment of a particular type of cell, eg, a cell that expresses a marker, refers to an increase in the number or percentage of such cells, but complete elimination of cells that do not express this marker. No need. Similarly, negative selection, elimination, or depletion of a particular type of cell, eg, a cell expressing a marker, refers to a reduction in the number or percentage of such cells, but all such cells. It does not have to be completely removed.

一部の例では、複数回の分離工程が行われ、この場合、ある工程に由来する正に選択された画分または負に選択された画分は別の分離工程、例えば、後の正の選択または負の選択に供される。一部の例では、1回の分離工程で、例えば、それぞれが負の選択のために標的化されたマーカーに特異的な複数種の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、同時に、複数種のマーカーを発現する細胞を枯渇することができる。同様に、様々な細胞タイプの表面に発現している複数種の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞タイプを同時に正に選択することができる。 In some examples, multiple separation steps are performed, in which case a positively selected fraction or a negatively selected fraction derived from one step is another separation step, eg, a later positive fraction. Subject to choice or negative choice. In some examples, multiple at the same time in a single separation step, eg, by incubating cells with multiple antibodies or binding partners, each specific for a marker targeted for negative selection. Cells expressing seed markers can be depleted. Similarly, by incubating cells with multiple antibodies or binding partners expressed on the surface of different cell types, multiple cell types can be positively selected at the same time.

例えば、一部の局面において、特定のT細胞部分母集団、例えば、1種類もしくは複数種の表面マーカーが陽性の細胞または高レベルの1種類もしくは複数種の表面マーカーを発現する細胞、例えば、CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、および/またはCD45RO⁺T細胞が正の選択法または負の選択法によって単離される。 For example, in some aspects, a particular T cell partial population, eg, cells positive for one or more surface markers or cells expressing high levels of one or more surface markers, eg, CD28. ⁺ , CD62L ⁺ , CCR7 ⁺ , CD27 ⁺ , CD127 ⁺ , CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , CD45RA ⁺ , and / or CD45RO ⁺ T cells are isolated by positive or negative selection.

例えば、CD3⁺、CD28⁺T細胞は、CD3/CD28結合磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を用いて正に選択することができる。 For example, CD3 ⁺ , CD28 ⁺ T cells can be positively selected using CD3 / CD28 binding magnetic beads (eg, DYNABEADS® M-450 CD3 / CD28 T Cell Expander).

一部の態様において、単離は、特定の細胞集団を正の選択によって濃縮することによって、または特定の細胞集団を負の選択によって枯渇させることによって行われる。一部の態様において、正の選択または負の選択は、それぞれ、正に選択された細胞または負に選択された細胞の表面に発現している1種類もしくは複数種の表面マーカー（マーカー⁺）または比較的高いレベルで発現している1種類もしくは複数種の表面マーカー（マーカー^high）に特異的に結合する1種または複数種の抗体または他の結合剤と細胞をインキュベートすることによって成し遂げられる。 In some embodiments, isolation is performed by enriching a particular cell population by positive selection or by depleting a particular cell population by negative selection. In some embodiments, the positive or negative selection is one or more surface markers (markers ⁺ ) or multiple types expressed on the surface of positively selected cells or negatively selected cells, respectively. It is accomplished by incubating cells with one or more antibodies or other binders that specifically bind to one or more surface markers (marker ^high ) that are expressed at relatively high levels.

一部の態様において、T細胞は、非T細胞、例えば、B細胞、単球、または他の白血球の表面に発現しているマーカー、例えば、CD14の負の選択によってPBMC試料から分離される。一部の局面において、CD4⁺ヘルパーおよびCD8⁺細胞傷害性T細胞を分離するために、CD4⁺選択工程またはCD8⁺選択工程が用いられる。このようなCD4⁺集団およびCD8⁺集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリー、および/またはエフェクターT細胞部分母集団の表面において発現しているか、または比較的多量に発現しているマーカーを対象にした正の選択または負の選択によって部分母集団にさらに選別することができる。 In some embodiments, T cells are separated from PBMC samples by negative selection of markers expressed on the surface of non-T cells, such as B cells, monocytes, or other leukocytes, such as CD14. In some aspects, a CD4 ⁺ selection step or a CD8 ⁺ selection step is used to separate CD4 ⁺ helpers and CD8 ⁺ cytotoxic T cells. Such CD4 ⁺ and CD8 ⁺ populations are targeted at markers that are expressed or relatively abundantly on the surface of one or more naive, memory, and / or effector T cell subpopulations. It can be further sorted into a subpopulation by the positive or negative selections made to.

一部の態様において、さらに、CD8⁺細胞は、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞について、例えば、それぞれの部分母集団に関連する表面抗原に基づいた正の選択または負の選択によって濃縮または枯渇される。一部の態様において、効力を高めるために、例えば、長期生存、増殖、および/または投与後の生着を改善するために、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮が行われる。一部の局面において、この効力は、このような部分母集団において特にロバストである。Terakura et al.（2012） Blood.1:72-82; Wang et al.（2012） J Immunother. 35（9）:689-701を参照されたい。一部の態様において、T_CMが濃縮されたCD8⁺T細胞およびCD4⁺T細胞を組み合わせると効力がさらに高まる。 In some embodiments, CD8 ⁺ cells are further positively selected or negatively selected for naive, central memory, effector memory, and / or central memory stem cells, eg, based on surface antigens associated with their respective partial populations. Concentrated or depleted by choice. In some embodiments, central memory T (T _CM ) cell enrichment is performed to enhance efficacy, eg, to improve long-term survival, proliferation, and / or engraftment after administration. In some aspects, this effect is particularly robust in such subpopulations. See Terakura et al. (2012) Blood. 1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. In some embodiments, the combination of _TCM -enriched CD8 ⁺ T cells and CD4 ⁺ T cells further enhances efficacy.

態様において、メモリーT細胞は、CD8⁺末梢血リンパ球のCD62L⁺サブセットおよびCD62L^-サブセットの両方に存在する。PBMCは、例えば、抗CD8抗体および抗CD62L抗体を用いて、CD62L^-CD8⁺画分および/またはCD62L⁺CD8⁺画分について濃縮または枯渇することができる。 In embodiments, memory T cells are present in both CD8 ⁺ CD62L ⁺ subsets of peripheral blood lymphocytes and CD62L ^- suplicates. PBMCs can be concentrated or depleted for the CD62L ^- CD8 ⁺ fraction and / or the CD62L ⁺ CD8 ⁺ fraction using, for example, anti-CD8 and anti-CD62L antibodies.

一部の態様において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の正の、または多量の表面発現に基づいている。一部の局面において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するか、または多量に発現する細胞を対象にした負の選択に基づいている。一部の局面において、T_CM細胞が濃縮されたCD8⁺集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇と、CD62Lを発現する細胞を対象にした正の選択または濃縮によって行われる。一局面において、セントラルメモリーT（T_CM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞の負の画分から開始して行われ、この画分は、CD14およびCD45RAの発現に基づく負の選択と、CD62Lに基づく正の選択に供される。このような選択は一部の局面では同時に行われ、他の局面では連続して、どちらの順序でも行われる。一部の局面において、CD4に基づく分離から正の画分および負の画分が両方とも保持され、この方法の後の工程において、任意で、1つまたは複数のさらなる正の選択工程または負の選択工程の後に用いられるように、CD8⁺細胞集団または部分母集団の調製において用いられた同じCD4発現に基づく選択工程が、CD4⁺細胞集団または部分母集団を作製するのにも用いられる。 In some embodiments, central memory T (T _CM ) cell enrichment is based on positive or high surface expression of CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, and / or CD127. In some aspects, enrichment of Central Memory T (T _CM ) cells is based on negative selection for cells that express CD45RA and / or Granzyme B or that express them in large amounts. In some aspects, isolation of CD8 ⁺ populations enriched with TCM cells is performed by depletion of cells expressing CD4, CD14, CD45RA and positive selection or enrichment of cells expressing _CD62L . Will be. In one aspect, enrichment of Central Memory T (T _CM ) cells begins with a negative fraction of cells selected based on CD4 expression, which fractions are negative based on the expression of CD14 and CD45RA. It is offered for selection and positive selection based on CD62L. Such selections are made simultaneously in some aspects and consecutively in both aspects, in either order. In some aspects, both positive and negative fractions are retained from the CD4 based separation, and in subsequent steps of this method, optionally, one or more additional positive selection steps or negatives. The same CD4 expression-based selection step used in the preparation of the CD8 ⁺ cell population or partial population, as used after the selection step, is also used to generate the CD4 ⁺ cell population or partial population.

特定の例では、PBMC試料または他の白血球試料はCD4⁺細胞の選択に供される。この場合、負の画分および正の画分が両方とも保持される。次いで、負の画分は、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく負の選択と、セントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカー、例えば、CD62LまたはCCR7に基づく正の選択に供される。この場合、正の選択および負の選択はどちらの順序でも行われる。 In certain cases, PBMC samples or other leukocyte samples are subjected to CD4 ⁺ cell selection. In this case, both the negative and positive fractions are retained. Negative fractions are then subjected to negative selection based on the expression of CD14 and CD45RA or CD19 and positive selection based on markers characteristic of central memory T cells, such as CD62L or CCR7. In this case, the positive and negative selections are made in either order.

CD4⁺Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによってナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞に選別される。CD4⁺リンパ球は標準的な方法によって得ることができる。一部の態様において、ナイーブCD4⁺Tリンパ球は、CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T細胞である。一部の態様において、セントラルメモリーCD4⁺細胞はCD62L⁺およびCD45RO⁺である。一部の態様において、エフェクターCD4⁺細胞はCD62L^-およびCD45RO^-である。 CD4 ⁺ T helper cells are sorted into naive cells, central memory cells, and effector cells by identifying cell populations with cell surface antigens. CD4 ⁺ lymphocytes can be obtained by standard methods. In some embodiments, the naive CD4 ⁺ T lymphocytes are ^CD45RO- , CD45RA ⁺ , CD62L ⁺ , CD4 ⁺ T cells. In some embodiments, the central memory CD4 ⁺ cells are CD62L ⁺ and CD45RO ⁺ . In some embodiments, the effector CD4 ⁺ cells are CD62L ^- and ^CD45RO- .

一例では、負の選択によってCD4⁺細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。一部の態様において、正の選択および/または負の選択のために細胞の分離を可能にするために、抗体または結合パートナーは固体支持体またはマトリックス、例えば、磁気ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。例えば、一部の態様において、前記細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気（affinitymagnetic））分離法を用いて分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol.2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher（著作権）Humana Press Inc., Totowa, NJにおいて概説される）。 In one example, to concentrate CD4 ⁺ cells by negative selection, monoclonal antibody cocktails typically include antibodies against CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, and CD8. In some embodiments, the antibody or binding partner is bound to a solid support or matrix, such as magnetic beads or paramagnetic beads, to allow cell separation for positive and / or negative selection. Ru. For example, in some embodiments, the cells and cell populations are separated or isolated using immunomagnetic (or affinity magnetic) separation methods (Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol.2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: SA Brooks and U. Schumacher (copyright) outlined in Humana Press Inc., Totowa, NJ).

一部の局面において、分離しようとする細胞の試料または組成物は、小さな、磁化可能な、または磁気に反応する材料、例えば、磁気に反応する粒子または微粒子、例えば、常磁性ビーズ（例えば、DynalbeadsまたはMACSビーズ）とインキュベートされる。磁気に反応する材料、例えば、粒子は、一般的に、分離することが望ましい細胞または細胞集団、例えば、負に選択する、または正に選択することが望ましい細胞または細胞集団の表面に存在する分子、例えば、表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば、抗体に直接的または間接的に取り付けられる。 In some aspects, the cell sample or composition to be separated is a small, magnetizable, or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (eg, Dynalbeads). Or incubate with MACS beads). Magnetically responsive materials, such as particles, are generally molecules present on the surface of cells or cell populations that should be separated, such as cells or cell populations that should be negatively or positively selected. For example, it is attached directly or indirectly to a binding partner that specifically binds to a surface marker, such as an antibody.

一部の態様において、磁性粒子または磁気ビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合される、磁気に反応する材料を含む。磁気分離方法において用いられる多くの周知の磁気に反応する材料がある。適切な磁性粒子には、参照により本明細書に組み入れられる、Molday,米国特許第4,452,773号、および欧州特許明細書EP452342Bに記載の磁性粒子が含まれる。コロイドサイズの粒子、例えば、Owen 米国特許第4,795,698号およびLiberti et al.,米国特許第5,200,084号に記載のコロイドサイズの粒子が他の例である。 In some embodiments, the magnetic particles or beads include a magnetically responsive material that is attached to a specific binding member such as an antibody or other binding partner. There are many well-known magnetically responsive materials used in magnetic separation methods. Suitable magnetic particles include those described in Molday, US Pat. No. 4,452,773, and European Patent Specification EP452342B, which are incorporated herein by reference. Colloid-sized particles, such as those described in Owen US Pat. No. 4,795,698 and Liberti et al., US Pat. No. 5,200,084, are other examples.

インキュベーションは、一般的に、磁性粒子または磁気ビーズに取り付けられている、抗体または結合パートナーまたはこのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば、二次抗体もしくは他の試薬が、もし細胞表面分子が試料中の細胞の表面に存在すれば細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。 Incubation is generally performed by an antibody or binding partner or a molecule that specifically binds to such an antibody or binding partner, eg, a secondary antibody or other reagent, attached to a magnetic particle or magnetic bead. If the cell surface molecule is present on the surface of the cell in the sample, it is carried out under the condition of specifically binding to the cell surface molecule.

一部の局面において、試料は磁場の中に置かれ、磁気に反応する粒子または磁化可能な粒子が取り付けられている細胞は磁石に引き付けられるか、非標識細胞から分離される。正の選択の場合、磁石に引き付けられた細胞が保持される。負の選択の場合、引き付けられなかった細胞（非標識細胞）が保持される。一部の局面において、同じ選択工程の間に正の選択と負の選択の組み合わせが行われ、正の画分および負の画分が保持され、さらに処理されるか、またはさらなる分離工程を受ける。 In some aspects, the sample is placed in a magnetic field and cells to which magnetically responsive or magnetizable particles are attached are either attracted to the magnet or separated from unlabeled cells. For positive selection, cells attracted to the magnet are retained. For negative selections, unattracted cells (unlabeled cells) are retained. In some aspects, a combination of positive and negative selections is made during the same selection process, the positive and negative fractions are retained and further processed or undergo further separation steps. ..

ある特定の態様において、磁気に反応する粒子は一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、もしくはストレプトアビジンでコーティングされる。ある特定の態様において、磁性粒子は、1種または複数種のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に取り付けられる。ある特定の態様において、前記細胞はビーズではなく、一次抗体または結合パートナーで標識され、次いで、細胞タイプ特異的な二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁性粒子が添加される。ある特定の態様において、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子が、ビオチン化した一次抗体または二次抗体と一緒に用いられる。 In certain embodiments, the magnetically reactive particles are coated with a primary antibody or other binding partner, a secondary antibody, a lectin, an enzyme, or streptavidin. In certain embodiments, the magnetic particles are attached to the cell via a coating of a primary antibody specific for one or more markers. In certain embodiments, the cells are labeled with a primary antibody or binding partner rather than beads, followed by magnetic particles coated with a cell type-specific secondary antibody or other binding partner (eg, streptavidin). Is added. In certain embodiments, streptavidin-coated magnetic particles are used in conjunction with biotinylated primary or secondary antibodies.

一部の態様において、後でインキュベート、培養、および/または操作される細胞に、磁気に反応する粒子を取り付けたままにしておく。一部の局面において、患者に投与するために、前記粒子を細胞に取り付けたままにしておく。一部の態様において、磁化可能な粒子または磁気に反応する粒子は細胞から取り除かれる。磁化可能な粒子を細胞から取り除くための方法は公知であり、例えば、競合する非標識競合抗体、磁化可能な粒子、または切断可能なリンカーと結合体化した抗体などの使用を含む。一部の態様において、磁化可能な粒子は生分解性である。 In some embodiments, the cells to be incubated, cultured, and / or manipulated later are left with magnetically responsive particles attached. In some aspects, the particles are left attached to the cells for administration to the patient. In some embodiments, magnetizable or magnetically responsive particles are removed from the cell. Methods for removing magnetizable particles from cells are known and include, for example, the use of competing unlabeled competing antibodies, magnetizable particles, or antibodies conjugated to a cleavable linker. In some embodiments, the magnetizable particles are biodegradable.

一部の態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）を介した選択である。磁気活性化細胞選別（MACS）システムは、磁化粒子が取り付けられている細胞を高純度で選択することができる。ある特定の態様において、MACSは、外部磁場が印加された後に、非標的種および標的種が連続して溶出されるモードで動作する。すなわち、取り付けられなかった種が溶出される間に、磁化粒子に取り付けられた細胞は所定の位置に保たれる。次いで、この第1の溶出工程が完了した後に、磁場に閉じ込められ、溶出しないようにされていた種は、このような種が溶出および回収が可能なように何らかのやり方で遊離される。ある特定の態様において、非標的細胞は標識され、不均質な集団細胞から枯渇される。 In some embodiments, affinity-based selection is via magnetically activated cell selection (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). The Magnetically Activated Cell Sorting (MACS) system can select cells to which magnetized particles are attached with high purity. In certain embodiments, the MACS operates in a mode in which non-target and target species are continuously eluted after an external magnetic field is applied. That is, the cells attached to the magnetized particles are kept in place while the unattached seeds are eluted. Then, after the first elution step is completed, the seeds that have been trapped in the magnetic field and prevented from elution are somehow released so that such species can be eluted and recovered. In certain embodiments, non-target cells are labeled and depleted from heterogeneous population cells.

ある特定の態様において、単離または分離は、前記方法の単離工程、細胞調製工程、分離工程、処理工程、インキュベーション工程、培養工程、および/または製剤化工程の1つまたは複数を行うシステム、装置、または器具を用いて行われる。一部の局面において、前記システムは、例えば、誤り、使用者の操作、および/または汚染を最小限にするために、これらの各工程を閉じた、または無菌の環境において行うのに用いられる。一例では、システムは、国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載のシステムである。 In certain embodiments, isolation or isolation is a system in which one or more of the isolation step, cell preparation step, separation step, treatment step, incubation step, culture step, and / or formulation step of the method is performed. It is done using a device or an instrument. In some aspects, the system is used, for example, to perform each of these steps in a closed or sterile environment to minimize errors, user manipulation, and / or contamination. In one example, the system is the system described in International Patent Application Publication No. WO2009 / 072003 or US20110003380A1.

一部の態様において、システムまたは器具は、統合システム型もしくは自立型システムにおいて、および/または自動的に、もしくはプログラム可能なやり方で、単離工程、処理工程、操作工程、および製剤化工程の1つまたは複数、例えば、全てを行う。一部の局面において、システムまたは器具は、使用者が、処理工程、単離工程、操作工程、および製剤化工程の様々な局面をプログラムする、制御する、その転帰を評価する、および/または調整するのを可能にする、システムまたは器具と通信するコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを備える。 In some embodiments, the system or instrument is one of the isolation, processing, operating, and formulation steps in an integrated system or self-sustaining system and / or in an automatic or programmable manner. Do one or more, for example all. In some aspects, the system or instrument allows the user to program, control, evaluate its outcome, and / or adjust various aspects of the treatment, isolation, operation, and formulation steps. Equipped with a computer and / or computer program that communicates with the system or equipment that allows it to.

一部の局面において、例えば、閉じた無菌のシステムにおいて細胞を臨床規模レベルで自動分離するために、分離工程および/または他の工程はCliniMACSシステム（Miltenyi Biotic）を用いて行われる。構成要素には、内蔵型マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、および様々なピンチ弁が含まれる場合がある。内蔵型コンピュータは一部の局面では機器の全構成要素を制御し、反復手順を統一された順序で行うようにシステムを命令する。磁気分離ユニットは、一部の局面では、可動性の永久磁石および選択カラム用のホルダを備える。蠕動ポンプはチューブセット全体にわたる流速を制御し、ピンチ弁と一緒に、緩衝液がシステムを制御されて流れ、細胞が絶え間なく懸濁されるのを確かなものにする。 In some aspects, for example, in order to automatically separate cells at the clinical scale level in a closed sterile system, the separation step and / or other steps are performed using the CliniMACS system (Miltenyi Biotic). Components may include a built-in microcomputer, a magnetic separation unit, a peristaltic pump, and various pinch valves. The built-in computer controls all the components of the device in some aspects and commands the system to perform the iterative procedure in a unified order. The magnetic separation unit, in some aspects, comprises a movable permanent magnet and a holder for the selective column. The peristaltic pump controls the flow velocity throughout the tube set and, along with the pinch valve, ensures that the buffer flows through the system in a controlled manner and the cells are constantly suspended.

CliniMACSシステムは、一部の局面では、滅菌した非発熱性の溶液に溶解して供給される、抗体に結合した磁化可能な粒子を使用する。一部の態様において、細胞は磁性粒子で標識された後に、余分な粒子を除去するために洗浄される。次いで、細胞調製バッグがチューブセットに接続され、そして次にチューブセットは緩衝液含有バックおよび細胞収集バッグに接続される。チューブセットは、プレカラムおよび分離カラムを含む予め組み立てられた滅菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムが開始した後に、システムは分離カラムに細胞試料を自動的にアプライする。標識された細胞はカラム内に保持されるのに対して、標識されなかった細胞は一連の洗浄工程によって除去される。一部の態様において、本明細書に記載の方法と共に使用するための細胞集団は標識されず、カラム内に保持されない。一部の態様において、本明細書に記載の方法と共に使用するための細胞集団は標識され、カラム内に保持される。一部の態様において、磁場が取り除かれた後に、本明細書に記載の方法と共に使用するための細胞集団はカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。 The CliniMACS system, in some aspects, uses antibody-bound magnetizable particles that are supplied dissolved in a sterile, non-thermal solution. In some embodiments, the cells are labeled with magnetic particles and then washed to remove excess particles. The cell preparation bag is then connected to the tube set, and then the tube set is connected to the buffer containing bag and cell collection bag. The tube set consists of pre-assembled sterile tubes containing a pre-column and a separation column and is disposable only. After the separation program starts, the system automatically applies the cell sample to the separation column. Labeled cells are retained in the column, whereas unlabeled cells are removed by a series of washing steps. In some embodiments, the cell population for use with the methods described herein is unlabeled and is not retained in the column. In some embodiments, the cell population for use with the methods described herein is labeled and retained in a column. In some embodiments, after the magnetic field has been removed, the cell population for use with the methods described herein is eluted from the column and collected in a cell collection bag.

ある特定の態様において、分離工程および/または他の工程はCliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を用いて行われる。CliniMACS Prodigyシステムには、一部の局面では、細胞を自動洗浄し、遠心分離によって分画する細胞処理ユニット（cell processing unity）が付いている。CliniMACS Prodigyシステムはまた、内蔵カメラと、供給源の細胞産物の巨視的な層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを決定する画像認識ソフトウェアも備えている場合がある。例えば、末梢血は赤血球、白血球、および血漿の層に自動的に分離される。CliniMACS Prodigyシステムはまた、細胞培養プロトコール、例えば、細胞分化および増殖、抗原添加、ならびに長期細胞培養を行う内臓型細胞発育チャンバーも備えている場合がある。インプットポートを用いると、培地を無菌的に取り出し、補充することができる。細胞は、内臓型顕微鏡を用いてモニタリングすることができる。例えば、Klebanoff et al.（2012） J Immunother. 35（9）: 651-660, Terakuraet al.（2012） Blood.1:72-82、およびWang et al.（2012） J Immunother. 35（9）:689-701を参照されたい。 In certain embodiments, the separation step and / or other steps are performed using the CliniMACS Prodigy system (Miltenyi Biotec). The CliniMACS Prodigy system, in some aspects, is equipped with a cell processing unity that automatically cleans and fractionates cells by centrifugation. The CliniMACS Prodigy system may also have a built-in camera and image recognition software that determines the optimal cell fractionation endpoint by identifying the macroscopic layer of the source cell product. For example, peripheral blood is automatically separated into layers of red blood cells, white blood cells, and plasma. The CliniMACS Prodigy system may also include a visceral cell development chamber for cell culture protocols, such as cell differentiation and proliferation, antigen addition, and long-term cell culture. The input port can be used to aseptically remove and replenish the medium. Cells can be monitored using a visceral microscope. For example, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1: 72-82, and Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9). See: 689-701.

一部の態様において、本明細書に記載の細胞集団はフローサイトメトリーを介して収集および濃縮（または枯渇）される。フローサイトメトリーでは、複数種の細胞表面マーカーについて染色された細胞は流体の流れに入って運ばれる。一部の態様において、本明細書に記載の細胞集団は、分取スケール（preparative scale）（FACS）選別を介して収集および濃縮（または枯渇）される。ある特定の態様において、本明細書に記載の細胞集団は、FACSに基づく検出系と組み合わせて微小電気機械システム（MEMS）チップを用いることによって収集および濃縮（または枯渇）される（例えば、WO2010/033140, Cho et al.（2010） Lab Chip 10, 1567-1573;および Godin et al.（2008） J Biophoton. 1（5）:355-376を参照されたい）。どちらの場合でも、細胞は複数種のマーカーで標識することができ、それによって、詳細に明らかにされたT細胞サブセットを高純度で単離することが可能になる。 In some embodiments, the cell populations described herein are collected and enriched (or depleted) via flow cytometry. In flow cytometry, cells stained for multiple cell surface markers are carried into a fluid flow. In some embodiments, the cell populations described herein are collected and enriched (or depleted) via preparative scale (FACS) sorting. In certain embodiments, the cell populations described herein are collected and enriched (or depleted) by using a microelectromechanical system (MEMS) chip in combination with a FACS-based detection system (eg WO2010 /. See 033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; and Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5): 355-376). In either case, the cells can be labeled with multiple markers, which allows the isolated T cell subsets revealed in detail to be isolated with high purity.

一部の態様において、正の選択および/または負の選択のために分離を容易にするために、抗体または結合パートナーは1種または複数種の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は蛍光標識抗体との結合に基づいてもよい。一部の例では、1種または複数種の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、流体の流れの中で、例えば、分取スケール（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを備える蛍光標識細胞分取（FACS）によって、例えば、フローサイトメトリー検出系と組み合わせて行われる。このような方法を用いると、複数種のマーカーに基づいて正の選択および負の選択を同時に行うことができる。 In some embodiments, the antibody or binding partner is labeled with one or more detectable markers to facilitate separation for positive and / or negative selection. For example, the separation may be based on binding to a fluorescently labeled antibody. In some examples, cell separation based on the binding of an antibody or other binding partner specific for one or more cell surface markers is performed in a flow of fluid, eg, flow cytometry (FACS) and / Or by fluorescently labeled cell fractionation (FACS) with a microelectromechanical system (MEMS) chip, eg, in combination with a flow cytometry detection system. Using such a method, positive selection and negative selection can be performed simultaneously based on a plurality of types of markers.

一部の態様において、調製方法は、単離、インキュベーション、および/または操作の前または後に細胞を凍結、例えば、凍結保存するための工程を含む。一部の態様において、凍結工程およびその後の解凍工程によって、細胞集団の中にある顆粒球が取り除かれ、単球がある程度まで取り除かれる。一部の態様において、例えば、血漿および血小板を取り除く洗浄工程の後に、前記細胞は凍結溶液に懸濁される。様々な任意の公知の凍結溶液およびパラメータを一部の局面で使用することができる。一例は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結培地を使用することを伴う。次いで、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるように、これを培地で1:1に希釈する。次いで、細胞は通常、1分につき1°の速度で-80℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相の中で保管される。 In some embodiments, the preparation method comprises the steps of freezing, eg, cryopreserving, the cells before or after isolation, incubation, and / or manipulation. In some embodiments, the freezing and subsequent thawing steps remove granulocytes within the cell population and to some extent monocytes. In some embodiments, the cells are suspended in a frozen solution, for example, after a washing step to remove plasma and platelets. A variety of any known cryosolutions and parameters can be used in some aspects. One example involves the use of PBS containing 20% DMSO and 8% human serum albumin (HSA), or other suitable cell freezing medium. It is then diluted 1: 1 in medium so that the final concentrations of DMSO and HSA are 10% and 4%, respectively. The cells are then frozen to -80 ° C at a rate of 1 ° per minute and stored in the gas phase of a liquid nitrogen storage tank.

一部の態様において、提供される方法は、発育工程、インキュベーション工程、培養工程、および/または遺伝子操作工程を含む。例えば、一部の態様において、枯渇された細胞集団および培養開始組成物をインキュベートおよび/または操作するための方法が提供される。 In some embodiments, the provided method comprises a growth step, an incubation step, a culture step, and / or a genetic manipulation step. For example, in some embodiments, methods for incubating and / or manipulating depleted cell populations and culture initiation compositions are provided.

従って、一部の態様において、前記細胞集団は培養開始組成物中でインキュベートされる。インキュベーションおよび/または操作は、培養容器、例えば、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、弁、バイアル、培養皿、バック、または細胞を培養もしくは発育するための他の容器の中で行われてもよい。 Thus, in some embodiments, the cell population is incubated in the culture initiation composition. Incubation and / or manipulation is performed in a culture vessel, eg, a unit, chamber, well, column, tube, tube set, valve, vial, culture dish, bag, or other vessel for culturing or developing cells. You may be broken.

一部の態様において、前記細胞は遺伝子操作の前に、または遺伝子操作に関連してインキュベートおよび/または培養される。インキュベーション工程は、培養、発育、刺激、活性化、および/または増殖を含んでもよい。一部の態様において、前記組成物または細胞は刺激条件または刺激薬剤の存在下でインキュベートされる。このような条件は、遺伝子操作のために、例えば、組換え抗原受容体を導入するために、集団内の細胞の増殖（proliferation）、増殖（expansion）、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、ならびに/または細胞を初回刺激（prime）するように設計された条件を含む。 In some embodiments, the cells are incubated and / or cultured prior to or in connection with genetic engineering. The incubation step may include culturing, development, stimulation, activation, and / or proliferation. In some embodiments, the composition or cell is incubated in the presence of stimulating conditions or stimulants. Such conditions induce proliferation, expansion, activation, and / or survival of cells in the population for genetic manipulation, eg, to introduce recombinant antigen receptors. As such, it includes conditions designed to mimic antigen exposure and / or to prime cells.

条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された他の任意の薬剤のうち1つまたは複数を含んでもよい。 Conditions include specific media, temperature, oxygen content, carbon dioxide content, time, drugs such as nutrients, amino acids, antibiotics, ions, and / or stimulators such as cytokines, chemokines, antigens, binding partners, etc. It may contain fusion proteins, recombinant soluble receptors, and one or more of any other agent designed to activate cells.

一部の態様において、刺激条件または刺激薬剤には、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1種または複数種の薬剤、例えば、リガンドが含まれる。一部の局面において、この薬剤は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードをオンにするか、または開始する。このような薬剤には、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合した、抗体、例えば、TCR成分および/もしくは共刺激受容体に特異的な抗体、例えば、抗CD3、抗CD28、ならびに/または1種類もしくは複数種のサイトカインが含まれ得る。任意で、増殖方法は、抗CD3および/または抗CD28の抗体を（例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）培養培地に添加する工程をさらに含んでもよい。一部の態様において、刺激薬剤には、IL-2および/またはIL-15、例えば、少なくとも約10単位/mLの濃度のIL-2が含まれる。 In some embodiments, the stimulatory condition or stimulant comprises one or more agents capable of activating the intracellular signaling domain of the TCR complex, eg, a ligand. In some aspects, the agent turns on or initiates the TCR / CD3 intracellular signaling cascade in T cells. Such agents include antibodies, eg, antibodies specific for TCR components and / or costimulatory receptors, eg, anti-CD3, anti-CD28, and / or 1 bound to a solid support such as beads. It may contain one or more cytokines. Optionally, the growth method may further comprise the step of adding anti-CD3 and / or anti-CD28 antibodies (eg, at a concentration of at least about 0.5 ng / ml) to the culture medium. In some embodiments, the stimulant comprises IL-2 and / or IL-15, eg, IL-2 at a concentration of at least about 10 units / mL.

一部の局面において、インキュベーションは、Riddellらへの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.（2012） J Immunother. 35（9）: 651-660、Terakuraet al.（2012） Blood.1:72-82、および/またはWang et al.（2012） J Immunother. 35（9）:689-701に記載の技法などの技法に従って行われる。 In some aspects, the incubation was described in US Pat. No. 6,040,177 to Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1: 72- 82, and / or according to techniques such as those described in Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

一部の態様において、T細胞は、（例えば、結果として生じた細胞集団が、増殖させようとする初期集団内でTリンパ球1個につき少なくとも約5個、10個、20個、もしくは40個またはそれより多いPBMCフィーダー細胞を含有するように）フィーダー細胞、例えば、非***末梢血単核球（PBMC）を培養開始組成物に添加し、培養物を（例えば、T細胞の数を増やすのに十分な時間にわたって）インキュベートすることによって増殖される。一部の局面において、非***フィーダー細胞はγ線を照射したPBMCフィーダー細胞を含んでもよい。一部の態様において、細胞***を阻止するために、PBMCに約3000～3600ラドの範囲のγ線が照射される。一部の局面において、フィーダー細胞が培養培地に添加された後に、T細胞の集団が添加される。 In some embodiments, T cells are (eg, at least about 5, 10, 20, or 40 T cells per T lymphocyte in the initial population in which the resulting cell population seeks to proliferate. Feeder cells (eg, non-dividing peripheral blood mononuclear cells (PBMC)) are added to the culture initiation composition and the culture (eg, increasing the number of T cells) is added so that it contains more PBMC feeder cells. Proliferate by incubating (for sufficient time). In some aspects, the non-dividing feeder cells may include PBMC feeder cells irradiated with gamma rays. In some embodiments, PBMCs are irradiated with gamma rays in the range of about 3000-3600 rads to prevent cell division. In some aspects, a population of T cells is added after the feeder cells have been added to the culture medium.

一部の態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の増殖に適した温度、例えば、少なくとも約25℃、一般的には少なくとも約30度、および一般的には37℃または約37℃を含む。任意で、インキュベーションは、フィーダー細胞として非***性のEBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）を添加する工程をさらに含んでもよい。LCLに、約6000～10,000ラドの範囲のγ線を照射することができる。LCLフィーダー細胞は、一部の局面では、LCLフィーダー細胞と初回Tリンパ球との比が少なくとも約10:1などの任意の適切な量で提供される。 In some embodiments, stimulation conditions include temperatures suitable for human T lymphocyte proliferation, such as at least about 25 ° C, generally at least about 30 ° C, and generally 37 ° C or about 37 ° C. .. Optionally, the incubation may further include the addition of non-dividing EBV transformed lymphoblast-like cells (LCL) as feeder cells. The LCL can be irradiated with gamma rays in the range of about 6000 to 10,000 rads. LCL feeder cells are provided in some aspects in any suitable amount, such as a ratio of LCL feeder cells to initial T lymphocytes of at least about 10: 1.

態様において、抗原特異的T細胞、例えば、抗原特異的CD4+および/またはCD8+T細胞は、ナイーブまたは抗原特異的なTリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的T細胞株またはクローンは、感染対象からT細胞を単離し、前記細胞をインビトロで同じ抗原で刺激することによって作製することができる。 In embodiments, antigen-specific T cells, such as antigen-specific CD4 + and / or CD8 + T cells, are obtained by stimulating naive or antigen-specific T lymphocytes with an antigen. For example, an antigen-specific T cell line or clone for a cytomegalovirus antigen can be made by isolating T cells from an infected subject and stimulating the cells with the same antigen in vitro.

X.組成物および製剤
細胞を含む組成物も、薬学的組成物および製剤、例えば、ある特定の用量で投与するための、またはある特定の用量を分けて投与するための数の細胞を含む単位剤形組成物を含めて提供される。薬学的組成物および製剤は、一般的に、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。一部の態様において、前記組成物は、少なくとも1種類のさらなる治療剤を含む。 X. Compositions and Formulas Compositions comprising cells are also pharmaceutical compositions and formulations, eg, units comprising a number of cells to be administered at a particular dose or in divided doses. Provided including the dosage form composition. Pharmaceutical compositions and formulations generally include one or more of any pharmaceutically acceptable carriers or excipients. In some embodiments, the composition comprises at least one additional therapeutic agent.

「薬学的製剤」という用語とは、「薬学的製剤」に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形をとり、製剤が投与される対象に対して容認できないほどの毒性がある、さらなる成分を含有しない調製物を指す。 The term "pharmaceutical formulation" is in the form of effective biological activity of the active ingredient contained in the "pharmaceutical formulation" and is unacceptably toxic to the subject to whom the formulation is administered. Refers to a preparation that does not contain any additional ingredients.

「薬学的に許容される担体」とは、対象に無毒な、活性成分以外の、薬学的製剤中にある成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これに限定されない。 "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to an ingredient in a pharmaceutical formulation other than the active ingredient that is non-toxic to the subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.

一部の局面において、担体の選択は、一つには、特定の細胞および/または投与方法によって決定される。従って、様々な適切な製剤がある。例えば、薬学的組成物は防腐剤を含有してもよい。適切な防腐剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが含まれ得る。一部の局面において、2種類以上の防腐剤の混合物が用いられる。防腐剤またはその混合物は典型的には全組成物の重量に対して約0.0001％～約2％の量で存在する。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これに限定されない。 In some aspects, the choice of carrier is determined, in part, by the particular cell and / or method of administration. Therefore, there are various suitable formulations. For example, pharmaceutical compositions may contain preservatives. Suitable preservatives may include, for example, methylparaben, propylparaben, sodium benzoate, and benzalkonium chloride. In some aspects, a mixture of two or more preservatives is used. Preservatives or mixtures thereof are typically present in an amount of about 0.0001% to about 2% by weight of the total composition. Carriers are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Pharmaceutically acceptable carriers are generally non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used and buffers such as phosphates, citric acids, and other organic acids; ascorbic acid and methionine. Antioxidants including; preservatives (eg octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl alcohol or benzyl alcohol; alkyl parabens, eg methyl paraben or propyl paraben; catechol; resorcinol Cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein, eg serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymer, eg, polyvinylpyrrolidone; amino acid , For example, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other amino acids including glucose, mannose, or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, Trehalose, or sorbitol; includes, but is limited to, salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and / or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). Not done.

一部の局面では、緩衝剤が前記組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩が含まれる。一部の局面において、2種類以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は典型的には全組成物の重量に対して約0.001～約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)において、さらに詳細に説明されている。 In some aspects, a buffer is included in the composition. Suitable buffers include, for example, citric acid, sodium citrate, phosphoric acid, potassium phosphate, and various other acids and salts. In some aspects, a mixture of two or more buffers is used. The buffer or mixture thereof is typically present in an amount of about 0.001 to about 4% by weight based on the weight of the total composition. Methods for preparing administrable pharmaceutical compositions are known. Illustrative methods are described in more detail, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams &Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

前記製剤は水溶液を含んでもよい。前記製剤または組成物はまた、前記細胞で処置されている特定の適応症、疾患、または状態に有用な複数種の活性成分、好ましくは、前記細胞を補う活性を有する活性成分も含有してよく、この場合、それぞれの活性は互いに悪影響を及ぼさない。このような活性成分は、所期の目的に有効な量で組み合わせられて適切に存在する。従って、一部の態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンをさらに含む。 The pharmaceutical product may contain an aqueous solution. The formulation or composition may also contain a plurality of active ingredients useful for a particular indication, disease, or condition being treated with the cells, preferably active ingredients having activity to supplement the cells. , In this case, the respective activities do not adversely affect each other. Such active ingredients are appropriately present in combination in an amount effective for the intended purpose. Thus, in some embodiments, the pharmaceutical composition comprises other pharmaceutically active agents or drugs such as chemotherapeutic agents such as asparaginase, busulfan, carboplatin, cisplatin, daunorubicin, doxorubicin, fluorouracil, gemcitabine, hydroxy. It further comprises urea, methotrexate, paclitaxel, rituximab, vinblastine, and / or vincristine.

薬学的組成物は、一部の態様では、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療的有効量または予防的有効量の細胞を含む。治療効力または予防効力は、一部の態様では、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。望ましい投与量は細胞の単回大量瞬時投与によって送達されてもよく、細胞の複数回大量瞬時投与によって送達されてもよく、細胞の連続注入投与によって送達されてもよい。 In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises an amount effective to treat or prevent a disease or condition, eg, a therapeutically effective amount or a prophylactically effective amount of cells. Therapeutic or prophylactic efficacy is, in some embodiments, monitored by regular assessment of the subject being treated. The desired dose may be delivered by a single high-dose instantaneous dose of cells, by multiple high-dose bursts of cells, or by continuous infusion of cells.

前記の細胞および組成物は、標準的な投与技法、製剤、および/または装置を用いて投与され得る。前記細胞の投与は自家投与でもよく、または異種投与でもよい。例えば、ある対象から免疫応答性細胞または前駆細胞を入手し、同じ対象または異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血に由来する免疫応答性細胞またはその子孫(例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで得られる)を、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与することができる。治療用組成物(例えば、遺伝子組換えされた免疫応答性細胞を含有する薬学的組成物)が投与される時に、一般的に、注射用単位剤形(溶液、懸濁液、エマルジョン)の形で製剤化される。 The cells and compositions may be administered using standard administration techniques, formulations, and / or devices. The administration of the cells may be self-administration or heterologous administration. For example, immunoreactive cells or progenitor cells can be obtained from a subject and administered to the same subject or subjects of different compatibility. Immune-responsive cells derived from peripheral blood or their progeny (eg, obtained in vivo, exvivo, or in vitro) via local injection, including catheterization, systemic injection, local injection, intravenous injection, or parenteral administration. Can be administered. When a therapeutic composition (eg, a pharmaceutical composition containing recombinant immune-responsive cells) is administered, it is generally in the form of an injectable unit dosage form (solution, suspension, emulsion). It is formulated with.

製剤には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、頬投与、舌下投与、または坐剤投与のための製剤が含まれる。一部の態様において、前記細胞集団は非経口投与される。本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、腟投与、および腹腔内投与を含む。一部の態様において、前記細胞は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射による末梢全身送達を用いて対象に投与される。 Formulations include formulations for oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, pulmonary, transdermal, intramuscular, intranasal, buccal, sublingual, or suppository administrations. Is done. In some embodiments, the cell population is administered parenterally. As used herein, the term "parenteral" includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal, and intraperitoneal administration. In some embodiments, the cells are administered to a subject using peripheral systemic delivery by intravenous, intraperitoneal, or subcutaneous injection.

組成物は、一部の態様では、滅菌した液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液として提供されるか、または粘性のある組成物として提供され、これらは、一部の局面では、選択されたpHまで緩衝化されてもよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性のある組成物、および固体組成物より調製しやすい。さらに、液体組成物の方が、投与するのに、特に、注射によって投与するのに若干便利である。他方で、粘性のある組成物は、特定の組織との長い接触期間をもたらすように適切な粘性の範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性のある組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(polyoi)(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒でもよい担体を含んでもよい。 The compositions are, in some embodiments, provided as sterile liquid preparations, such as isotonic aqueous solutions, suspensions, emulsions, dispersions, or as viscous compositions, which are provided. In some aspects, it may be buffered to a selected pH. Liquid preparations are usually easier to prepare than gels, other viscous compositions, and solid compositions. In addition, the liquid composition is somewhat more convenient to administer, especially by injection. On the other hand, viscous compositions can be formulated within the appropriate viscous range to provide a long contact period with a particular tissue. A liquid or viscous composition is a solvent comprising, for example, water, saline, phosphate buffered saline, a polyol (polyoi) (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol) and a suitable mixture thereof. Alternatively, it may contain a carrier which may be a dispersion medium.

滅菌注射液は、細胞を溶媒の中に取り入れて、例えば、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合して調製することができる。前記組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化または粘性を高める添加物、防腐剤、着香剤、および/または染料を含有することができる。一部の局面では、適切な調製物を調製するために標準的な教科書が調べられる場合がある。 Sterile injections can be prepared by incorporating cells into a solvent and mixing them with, for example, suitable carriers, diluents, or excipients such as sterile water, saline, glucose, dextrose and the like. .. The composition may be an adjunct, eg, a wetting agent, a dispersant, or an emulsifier (eg, methylcellulose), a pH buffer, a gelling or viscous additive, a preservative, depending on the desired dosing route and preparation. It can contain flavoring agents and / or dyes. In some aspects, standard textbooks may be looked up to prepare the appropriate preparation.

抗菌性防腐剤、抗酸化物質、キレート剤、および緩衝液を含む、前記組成物の安定性および無菌性を向上させる様々な添加物を添加することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸によって防止することができる。注射用薬学的剤形の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって引き起こすことができる。 Various additives can be added that improve the stability and sterility of the composition, including antibacterial preservatives, antioxidants, chelating agents, and buffers. The action of microorganisms can be prevented by various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanols, phenols and sorbic acids. Long-term absorption of the pharmaceutical dosage form for injection can be triggered by the use of agents that delay absorption, such as aluminum monostearate and gelatin.

インビボ投与のために使用しようとする製剤は一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜で濾過することによって、容易に成し遂げられ得る。 The formulations to be used for in vivo administration are generally sterile. Asepticity can be easily achieved, for example, by filtering with a sterile filter membrane.

XI.製造品
養子細胞療法のために、提供される方法に従って対象に前記細胞を投与するための、ならびに前記細胞および組成物を保管および投与するための製造品、例えば、キットおよび装置製造品も提供される。 XI. Manufactured products For adoptive cell therapy, manufactured products for administering the cells to a subject according to the methods provided, and for storing and administering the cells and compositions, such as kits and equipment manufacturing products. Provided.

製造品は、1つまたは複数の容器、典型的には、複数の容器と、包装材料と、前記容器および/もしくはパッケージの表面にあるか、または前記容器および/もしくはパッケージに付けられたラベルまたは添付文書を備え、一般的には、ラベルまたは添付文書は前記細胞を対象に投与するための説明書を含む。 The product is one or more containers, typically multiple containers, packaging materials, and labels or labels on or attached to the containers and / or packages. A package insert is provided, and generally, the label or package insert contains instructions for administering the cells to the subject.

前記容器は、一般的に、投与される前記細胞、例えば、その1つまたは複数の単位用量を収容する。製造品は典型的には複数の容器を備え、それぞれの容器には1単位用量の前記細胞が入っている。単位用量は、第1の用量において対象に投与される前記細胞の量または数でもよく、第1の用量または後の（複数の）用量において投与される前記細胞の数の2倍(以上)でもよい。単位用量は、投与方法に関連して対象に投与される、前記細胞の最も少ない用量または可能性のある最も少ない用量でもよい。一部の態様において、単位用量は、最小数の細胞であるか、あるいは特定の疾患もしくは状態を有する任意の対象または本明細書における方法に従う任意の対象に単一用量で投与される最小数の細胞である。例えば一部の局面では、例えば提供される方法に従って、場合によっては複数の単位用量が第1の用量としてある特定の対象に投与され、1または複数の単位用量が1つまたは複数の後の用量においてある特定の対象に投与されるように、単位用量は、体重が比較的軽くかつ/または疾患負荷が比較的多い患者に投与される最小限の数の細胞を含んでもよい。一部の態様において、単位用量の細胞の数は、第1の用量において、特定の対象、例えば、前記細胞が得られた対象に投与することが望ましい細胞の数、または組換え受容体発現細胞もしくはCAR発現細胞の数である。一部の態様において、前記細胞は、本明細書において提供される方法によって処置しようとする対象、または本明細書において提供される方法を必要とする対象から得られたものである。 The container generally contains the cells to be administered, eg, one or more unit doses thereof. The product typically comprises multiple containers, each containing a unit dose of the cells. The unit dose may be the amount or number of said cells administered to the subject at the first dose, or twice (or more) the number of said cells administered at the first dose or later (s) doses. good. The unit dose may be the lowest dose of said cells or the lowest possible dose given to the subject in relation to the method of administration. In some embodiments, the unit dose is the minimum number of cells or the minimum number administered in a single dose to any subject with a particular disease or condition or any subject according to the method herein. It is a cell. For example, in some aspects, for example, according to the method provided, multiple unit doses may be administered to a particular subject as the first dose, and one or more unit doses may be one or more subsequent doses. The unit dose may include a minimal number of cells administered to a patient who is relatively light in body weight and / or has a relatively high disease burden, as administered to a particular subject. In some embodiments, the number of cells at a unit dose is the number of cells that should be administered to a particular subject, eg, the subject from which the cells were obtained, or recombinant receptor-expressing cells at the first dose. Or the number of CAR-expressing cells. In some embodiments, the cells are obtained from a subject to be treated by the methods provided herein, or from a subject in need of the methods provided herein.

一部の態様において、1つまたは複数の単位用量は、同じ受容体、例えばCARを発現する細胞を含有する。一部の局面において、1つまたは複数の単位用量は、1つまたは複数の残りの単位用量とは異なる受容体、例えばCARを発現する細胞を含有する。 In some embodiments, one or more unit doses contain cells expressing the same receptor, eg CAR. In some aspects, the one or more unit doses contain a receptor that is different from the one or more remaining unit doses, eg, cells expressing CAR.

一部の態様において、前記容器はそれぞれ個々に、例えば、同じ数または実質的に同じ数の細胞を含む、第1のまたは第2のまたは第3のおよびその他の受容体を発現する単位用量の前記細胞を含む。従って、一部の態様において、前記容器はそれぞれ、同じ数もしくはほぼ同じ数もしくは実質的に同じ数の細胞、または同じ数もしくはほぼ同じ数もしくは実質的に同じ数の組換え受容体発現細胞を含む。一部の態様において、単位用量は、処置しようとする対象および/または前記細胞が得られた対象1kgあたり、約1x10⁸個未満、約5x10⁷個未満、約1x10⁶個未満、または約5x10⁵個未満の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。一部の態様において、それぞれの単位用量は、2x10⁶個、5x10⁶個、1x10⁷個、5x10⁷個、もしくは1x10⁸個、または約2x10⁶個、約5x10⁶個、約1x10⁷個、約5x10⁷個、もしくは約1x10⁸個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含有する。 In some embodiments, each of the containers is a unit dose expressing a first or second or third and other receptor, each containing, for example, the same number or substantially the same number of cells. Contains the cells. Thus, in some embodiments, the vessel comprises the same number or substantially the same number or substantially the same number of cells, or the same number or approximately the same number or substantially the same number of recombinant receptor expressing cells, respectively. .. In some embodiments, the unit dose is about 1x10 < ⁸ , about 5x10 < ⁷ , about 1x10 < ⁶ , or about 5x10 ⁵ per kg of subject to be treated and / or the subject from which the cells were obtained. Includes less than a few manipulated cells, whole cells, T cells, or PBMCs. In some embodiments, the respective unit doses are 2x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , or 1x10 ⁸ , or about 2x10 ⁶ , about 5x10 ⁶ , about 1x10 ⁷ , about Contains 5x10 ⁷ or approximately 1x10 ⁸ engineered cells, whole cells, T cells, or PBMCs.

適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、および可撓性のあるバッグ、例えば、注入バッグが含まれる。特定の態様において、前記容器は、バッグ、例えば、可撓性のあるバッグ、例えば、対象に細胞を注入するのに適した可撓性のあるバッグ、例えば、可撓性のあるプラスチックバッグもしくはPVCバッグ、および/またはIV溶液バッグである。前記バッグは、一部の態様では、前記細胞および組成物の無菌溶液および無菌送達を提供するように密閉することができる、および/または滅菌することができる。一部の態様において、前記容器、例えば、バッグの容量は、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、もしくは1000ml、または約10ml、約20ml、約30ml、約40ml、約50ml、約60ml、約70ml、約80ml、約90ml、約100ml、約200ml、約300ml、約400ml、約500ml、もしくは約1000ml容量、または少なくとも10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、もしくは1000ml、または少なくとも約10ml、約20ml、約30ml、約40ml、約50ml、約60ml、約70ml、約80ml、約90ml、約100ml、約200ml、約300ml、約400ml、約500ml、もしくは約1000ml容量、例えば、10mLもしくは約10mLから100mLもしくは約100mL、または10mLもしくは約10mLから500mLもしくは約500mL容量である。一部の態様において、前記容器、例えば、バッグは、安定な、ならびに/あるいは様々な温度の1つまたは複数において、例えば、低温、例えば、-20℃未満もしくは約-20℃未満、-80℃未満もしくは約-80℃未満、-120℃未満もしくは約-120℃未満、-135℃未満もしくは約-135℃未満、または-20℃もしくは約-20℃、-80℃もしくは約-80℃、-120℃もしくは約-120℃、-135℃もしくは約-135℃、ならびに/あるいは凍結保存に適した温度、ならびに/あるいは他の温度、例えば、前記細胞を解凍するのに適した温度、および体温、例えば、37℃または約37℃、例えば、処置の直前に、例えば、対象の場所または処置の場所、例えば、ベッドサイドで解凍が可能な温度で、細胞を安定して保管および/もしくは維持する材料である、ならびに/あるいはこのような材料から作られる。 Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and flexible bags, such as injection bags. In certain embodiments, the container is a bag, eg, a flexible bag, eg, a flexible bag suitable for injecting cells into a subject, eg, a flexible plastic bag or PVC. Bags and / or IV solution bags. In some embodiments, the bag can be sealed and / or sterilized to provide a sterile solution and sterile delivery of the cells and compositions. In some embodiments, the volume of the container, eg, a bag, is 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, or 1000 ml, or about 10 ml. , About 20 ml, about 30 ml, about 40 ml, about 50 ml, about 60 ml, about 70 ml, about 80 ml, about 90 ml, about 100 ml, about 200 ml, about 300 ml, about 400 ml, about 500 ml, or about 1000 ml capacity, or at least 10 ml, 20 ml , 30ml, 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml, 90ml, 100ml, 200ml, 300ml, 400ml, 500ml, or 1000ml, or at least about 10ml, about 20ml, about 30ml, about 40ml, about 50ml, about 60ml, about 70ml , About 80 ml, about 90 ml, about 100 ml, about 200 ml, about 300 ml, about 400 ml, about 500 ml, or about 1000 ml volume, for example, 10 mL or about 10 mL to 100 mL or about 100 mL, or 10 mL or about 10 mL to 500 mL or about 500 mL volume Is. In some embodiments, the container, eg, a bag, is stable and / or at one or more of various temperatures, eg, low temperature, eg, less than -20 ° C or less than about -20 ° C, -80 ° C. Less than or less than -80 ° C, less than -120 ° C or less than -120 ° C, less than -135 ° C or less than about -135 ° C, or -20 ° C or about -20 ° C, -80 ° C or about -80 ° C,- 120 ° C or about -120 ° C, -135 ° C or about -135 ° C, and / or a temperature suitable for cryopreservation, and / or other temperatures, such as a temperature suitable for thawing the cells, and body temperature. A material that stably stores and / or maintains cells, for example, at 37 ° C. or about 37 ° C., eg, immediately prior to treatment, eg, at a subject site or treatment site, eg, at a temperature at which it can be thawed at the bedside. And / or made from such materials.

前記容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。一部の態様において、前記容器は、例えば、チューブを接続するための、または1つもしくは複数のチューブにカニューレ挿入するための、例えば、静脈内注入もしくは他の注入のためにカニューレ挿入するための、ならびに/あるいは他の容器、例えば、細胞培養バッグおよび/もしくは保管バッグまたは他の容器に移入する目的で、ならびにこれから移入する目的で接続するための1つまたは複数のポート、例えば、無菌のアクセスポートを有する。例示的な容器には、注射用に針で穴を開けることができる栓が付いたものを含む、注入バッグ、静脈内溶液バッグ、バイアルが含まれる。 The container may be made of various materials such as glass or plastic. In some embodiments, the container is for, for example, for connecting tubes, or for cannulating into one or more tubes, for example, for intravenous or other infusion. And / or one or more ports for connecting to and / or to other containers, such as cell culture bags and / or storage bags or other containers, and for future transfer purposes, such as sterile access. Has a port. Exemplary containers include infusion bags, intravenous solution bags, vials, including those with stoppers that can be pierced with a needle for injection.

さらに、製造品は、1つもしくは複数の識別情報および/または使用のための説明書が付いた添付文書またはラベルを備えてもよい。一部の態様において、情報または説明書は、特定の状態もしくは疾患を処置するために、その内容を使用することができるか、もしくは使用しなければならならいこと、および/またはそのために説明書を提供することを示す。ラベルまたは添付文書は、疾患または状態を処置するために製造品の中身が用いられることを示してもよい。一部の態様において、ラベルまたは添付文書は、例えば、提供される方法の任意の態様に従って、第1の用量および1つまたは複数の後の用量の前記細胞を投与することを伴う方法を介して、対象、例えば、前記細胞が得られた対象を処置するための説明書を提供する。一部の態様において、説明書は、第1の用量において1単位用量、例えば、製造品の中にある1個の個別容器の内容物を投与し、それに続いて、特定の時点で、もしくは特定の時間枠内で、および/あるいは対象において1つもしくは複数の因子もしくは転帰の存在もしくは非存在または量もしくは程度が検出された後に、1つまたは複数の後の用量を投与することを規定している。 In addition, the manufactured product may include a package insert or label with one or more identification information and / or instructions for use. In some embodiments, the information or instructions may or must use their content to treat a particular condition or disease, and / or the instructions for that purpose. Indicates that it will be provided. Labels or package inserts may indicate that the contents of the product are used to treat the disease or condition. In some embodiments, the label or package insert is, for example, via a method involving administration of a first dose and one or more subsequent doses of the cells according to any aspect of the provided method. , E.g., provide instructions for treating the subject from which the cells were obtained. In some embodiments, the instructions administer a unit dose at the first dose, eg, the contents of one individual container within the product, followed by a specific time point or specific. Within the time frame and / or after the presence or absence or amount or extent of one or more factors or outcomes are detected in the subject, it is specified that one or more subsequent doses should be administered. There is.

いくつかの態様において、説明書は、第1の投与および後の投与を実施することによる、複数の単位用量の対象への投与を説明する。いくつかの態様において、第1の投与は、第1の受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している単位用量のうちの一つの対象への送達を含み、後の投与は、第1の投与と同じ受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している単位用量のうちの一つまたは複数の対象への投与を含む。 In some embodiments, the instructions describe administration of a plurality of unit doses to a subject by performing a first dose and a subsequent dose. In some embodiments, the first administration comprises delivery to a subject of a unit dose containing a first receptor, eg, cells expressing CAR, a subsequent administration is a second. The administration of 1 comprises administration to one or more subjects of a unit dose containing the same receptor, eg, cells expressing CAR.

いくつかの局面において、第1の投与は、第1の受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している単位用量のうちの一つの対象への送達を含み、後の投与は、別の受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している単位用量のうちの一つまたは複数の対象への投与を含む。いくつかの態様において、患者が、第1の投与と同じ受容体を発現する細胞を含有している第2の投与を受けるか、または第1の投与の細胞が発現するものとは異なる受容体、例えば、CARを発現する細胞を含有している第2の投与を受けるかは、本明細書に記載された方法のパラメータのいずれかに基づき決定され得る。例えば、いくつかの局面において、例えば、患者が第1の受容体に対する免疫応答を発達させた場合には、第1の受容体とは異なる受容体を発現する細胞を含有している単位用量が投与され得る。 In some aspects, the first dose comprises delivery to a subject of one of the unit doses containing the first receptor, eg, cells expressing CAR, the subsequent doses are separate. Receptors such as, for example, administration to one or more subjects of a unit dose containing cells expressing CAR. In some embodiments, the patient receives a second dose containing cells expressing the same receptors as the first dose, or a receptor different from that expressed by the cells of the first dose. For example, whether to receive a second dose containing cells expressing CAR can be determined based on any of the parameters of the methods described herein. For example, in some aspects, for example, if a patient develops an immune response to a first receptor, a unit dose containing cells expressing a receptor different from that of the first receptor may be used. Can be administered.

いくつかの態様において、説明書は、第1の投与、例えば、第1の投与または先の投与の開始の少なくとも約28日後または少なくとも約35日後の時点で、第2の（またはその他の後の）投与が実施されることを説明する。いくつかの態様において、説明書は、第1の（またはその他の先の）用量の細胞が発現する受容体、例えば、CARに対して特異的である検出可能な適応宿主免疫応答を対象が示すことが決定された後の時点で、後の用量が投与されることを説明する。 In some embodiments, the instructions describe the second (or after) at least about 28 days or at least about 35 days after the start of the first dose, eg, the first dose or the previous dose. ) Explain that the administration is carried out. In some embodiments, the instructions indicate a detectable adaptive host immune response that is specific for a first (or other earlier) dose of the cell-expressed receptor, eg, CAR. Explain that later doses will be administered at a time point after it has been determined.

一部の態様において、ラベルまたは添付文書またはパッケージは、前記細胞が得られた、および/または前記細胞が投与される対象の具体的な身元を示す識別子を備える。自家移入の場合、前記細胞が得られた対象の身元は、前記細胞が投与される対象の身元と同じである。従って、識別情報は、前記細胞が特定の患者、例えば、前記細胞が最初に得られた患者に投与されることを指定することがある。このような情報は、バーコードまたは他のコード化した識別子の形で包装材料および/またはラベルの中に存在してもよく、対象の名前および/または他の識別特性を示してもよい。 In some embodiments, the label or package insert or package comprises an identifier indicating the specific identity of the subject from which the cell was obtained and / or to which the cell is administered. In the case of autologous transfer, the identity of the subject from which the cells were obtained is the same as the identity of the subject to which the cells are administered. Thus, the identification information may specify that the cell is administered to a particular patient, eg, the patient in which the cell was first obtained. Such information may be present in the packaging material and / or label in the form of a barcode or other coded identifier, and may indicate the name and / or other distinguishing properties of the subject.

製造品は、一部の態様では、前記細胞を含む組成物、例えば、その個々の単位剤形を収容する、1つまたは複数の、典型的には複数の容器を備え、1つまたは複数のさらなる容器と、その中に収容される、さらなる薬剤、例えば、細胞傷害剤またはそうでない場合は治療剤、例えば、前記細胞と一緒に、組み合わせて投与される、例えば、同時に、または任意の順番で連続して投与される、さらなる薬剤を含む組成物をさらに備える。代わりに、または加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液を収容する別の容器または同じ容器をさらに備えてもよい。製造品は、緩衝液、希釈剤、フィルター、チューブ、針、および/または注射器などの他の材料をさらに備えてもよい。 The product comprises, in some embodiments, one or more, typically multiple, containers, one or more, containing the composition comprising said cells, eg, individual unit dosage forms thereof. Additional containers and additional agents contained therein, eg, cytotoxic agents or otherwise therapeutic agents, eg, administered in combination with said cells, eg, simultaneously or in any order. Further comprises a composition comprising additional agents to be administered sequentially. Alternatively, or in addition, the product may further comprise another container or the same container containing the pharmaceutically acceptable buffer. The product may further include other materials such as buffers, diluents, filters, tubes, needles, and / or syringes.

「添付文書」という用語は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、および/またはこのような治療製品の使用に関する警告を収めている、市販の治療製品パッケージに慣例に従って入れられている説明書を指すために用いられる。 The term "package insert" is used in commercial treatment product packages that contain information about indications, dosages, dosages, administrations, combinations, contraindications, and / or warnings about the use of such treatment products. Used to refer to instructions that are put in according to convention.

特に定義のない限り、本明細書において用いられる専門用語、注釈、ならびに他の技術用語および科学用語または専門語は全て、クレームされた対象が属する当業者に一般的に理解するものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、理解しやすいように、および/または容易に参照できるように、一般的に理解されている意味を有する用語が本明細書において定義される。本明細書における、このような定義の記載が、必ず、当技術分野において一般的に理解されているものと、かなり大きく異なると解釈することはしてはならない。 Unless otherwise defined, all technical terms, notes, and other technical and scientific or technical terms used herein have the same meanings commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the alleged subject belongs. Intended to have. In some cases, terms with commonly understood meanings are defined herein for ease of understanding and / or for easy reference. The description of such a definition herein shall not necessarily be construed as significantly different from what is generally understood in the art.

本明細書で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきり示されていない限り複数の指示物を含む。例えば、「1つの(a)」または「1つの(an)」は「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味する。本明細書に記載の局面およびバリエーションは、「からなる」および/または「から本質的になる」局面およびバリエーションを含むことが理解される。 As used herein, the singular forms "one (a)", "one (an)", and "the" include multiple referents unless expressly indicated by context. For example, "one (a)" or "one (an)" means "at least one" or "one or more". It is understood that the aspects and variations described herein include "consisting" and / or "essentially" aspects and variations.

本開示全体を通じて、クレームされた対象の様々な局面が範囲の形で示される。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためであり、クレームされた対象の範囲に対する融通の利かない限定として解釈してはならないと理解されるはずである。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲(sub-range)ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、値の範囲が示された場合、その範囲の上限と下限との間の、間にあるそれぞれの値と、その述べられた範囲内にある他の任意の述べられた値または間にある値が、クレームされた対象に包含されると理解される。これらのさらに小さな範囲の上限および下限は、独立して、その小さな範囲に含まれてもよく、その述べられた範囲内にある、明確に除外されるあらゆる限界を条件としてクレームされた対象にも包含される。述べられた範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、クレームされた対象に含まれる。このことは範囲の幅に関係なく適用される。 Throughout this disclosure, various aspects of the alleged subject matter are presented in the form of scope. It should be understood that the description in the form of scope is for convenience and brevity only and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the claimed subject matter. Therefore, the description of the range should be regarded as specifically disclosing all possible sub-ranges as well as the individual numbers within that range. For example, if a range of values is indicated, it is between each value between the upper and lower bounds of the range and any other stated value or between within that stated range. It is understood that the value is included in the claimed object. The upper and lower limits of these smaller ranges may be independently contained within that smaller range, even for objects claimed subject to any clearly excluded limits within that stated range. Be included. If the stated scope includes one or both of the limits, then the scope excluding either or both of those included limits is also included in the claimed subject matter. This applies regardless of the width of the range.

本明細書で使用する「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に分かる、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」のついた値またはパラメータについての言及は、その値またはパラメータそのものに向けられた態様を含む(およびその態様について説明している)。例えば、「約X」についての説明は「X」の説明を含む。 As used herein, the term "about" refers to the usual error range of each value that is readily apparent to those skilled in the art. References herein to a value or parameter with "about" include (and describe) aspects directed to that value or parameter itself. For example, the description of "about X" includes the description of "X".

本明細書で使用する組成物とは、細胞を含む、2種類以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはその任意の組み合わせでもよい。 As used herein, composition refers to any mixture of two or more products, substances, or compounds, including cells. The composition may be a solution, suspension, liquid, powder, paste, aqueous, non-aqueous, or any combination thereof.

本明細書で使用する、細胞または細胞集団が特定のマーカーについて「陽性」であるという記載は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーが細胞の表面に、または細胞の中に検出可能に存在することを指す。表面マーカーを指している場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、この抗体を検出することによって検出される時に表面発現が存在することを指す。ここで、染色は、フローサイトメトリーによって、他の点では同一の条件下で、アイソタイプが一致する対照を用いた同じ手順を行って検出される染色をかなり上回るレベルで、および/またはマーカーが陽性であることが分かっている細胞のレベルと実質的に類似するレベルで、および/またはマーカーが陰性であることが分かっている細胞のレベルよりかなり高いレベルで検出することができる。 As used herein, the statement that a cell or cell population is "positive" for a particular marker is that the particular marker, typically a surface marker, is detectable on the surface of or within the cell. Refers to doing. When referring to a surface marker, the term refers to the presence of surface expression when detected by flow cytometry, eg, by staining with an antibody that specifically binds to the marker and detecting this antibody. .. Here, the staining is at a level significantly higher than that detected by flow cytometry, otherwise under the same conditions, using the same procedure with isotype-matched controls, and / or the marker is positive. It can be detected at a level substantially similar to the level of cells known to be and / or at a level significantly higher than the level of cells known to be negative for the marker.

本明細書で使用する、細胞または細胞集団が特定のマーカーについて「陰性」であるという記載は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーが細胞の表面に、または細胞の中に実質的に検出可能に存在することが無いことを指す。表面マーカーを指している場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、この抗体を検出することによって検出される時に表面発現が存在しないことを指す。ここで、染色は、フローサイトメトリーによって、他の点では同一の条件下で、アイソタイプが一致する対照を用いた同じ手順を行って検出される染色をかなり上回るレベルで、および/またはマーカーが陽性であることが分かっている細胞のレベルよりかなり低いレベルで、および/またはマーカーが陰性であることが分かっている細胞のレベルと比較して実質的に類似するレベルで検出されない。 As used herein, the statement that a cell or cell population is "negative" for a particular marker is substantially detected on the surface of or within the cell of a particular marker, typically a surface marker. It means that it never exists as possible. When referring to a surface marker, the term refers to the absence of surface expression when detected by flow cytometry, eg, by staining with an antibody that specifically binds to the marker and detecting this antibody. .. Here, the staining is at a level significantly higher than that detected by flow cytometry, otherwise under the same conditions, using the same procedure with isotype-matched controls, and / or the marker is positive. It is not detected at levels well below the levels of cells known to be and / or at substantially similar levels compared to the levels of cells known to be negative for the marker.

本明細書で使用する「ベクター」という用語とは、連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造であるベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を起こすことができる。このようなベクターは本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。 As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of augmenting another linked nucleic acid. The term includes vectors that are self-replicating nucleic acid structures, as well as vectors that have been integrated into the genome of the host cell into which they have been introduced. Certain vectors are capable of causing expression of functionally linked nucleic acids. Such vectors are referred to herein as "expression vectors".

本願において言及された、特許文書、科学文献、およびデータベースを含む刊行物は全て、それぞれ個々の刊行物が個々に参照により組み入れられるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。本明細書において示された定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開された出願、および他の刊行物に示された定義と相違するか、または他の点で一致しない場合、参照により本明細書に組み入れられる定義ではなく、本明細書において示された定義が優先される。 All publications, including patent documents, scientific literature, and databases referred to herein, are by reference in their entirety for all purposes, to the same extent that each individual publication is individually incorporated by reference. Be incorporated. If the definitions presented herein differ from or otherwise inconsistent with the definitions set forth in patents, applications, published applications, and other publications incorporated herein by reference. , The definitions presented herein supersede, rather than the definitions incorporated herein by reference.

本明細書において用いられるセクションの見出しは、系統立ててまとめることだけを目的とし、説明された対象を限定すると解釈してはならない。 The section headings used herein are for the purpose of systematically summarizing and should not be construed as limiting the subject matter described.

XII.例示的な態様
提供される態様には、以下が含まれる。
１．（a）対象における疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合する第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を該対象へ投与する工程、および
（b）第1のCARとは異なる第2のCARを発現しかつ第1のCARを発現しない細胞を該対象へ投与する工程
を含む、処置方法。
２．第2のCARを発現する細胞の投与の時点でまたはその直前に、
対象が、第1のCARに対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を示しており；
疾患もしくは状態が、該対象において持続しており；かつ/または
疾患もしくは状態が、該対象において再発している、
態様1の方法。
３．第1のCARを発現する細胞の投与と第2のCARを発現する細胞の投与との間の時間が、少なくとも約28日間、少なくとも約35日間、少なくとも約42日間、少なくとも約49日間、および/または少なくとも約60日間である、態様1または態様2の方法。
４．第1のCARが、第2のCARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む、態様1～3のいずれかの方法。
５．少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のB細胞エピトープを含み；かつ/または
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、
態様4の方法。
６．対象が、（a）における投与の前に、第1のCARを発現する細胞の用量を受けたことがなく；かつ/または
該対象が、（b）における投与の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、
態様1～5のいずれかの方法。
７．第2のCARが、第1のCARと同じ抗原に特異的に結合する、態様1～6のいずれかの方法。
８．疾患または状態が腫瘍である、態様1～7のいずれかの方法。
９．疾患または状態がB細胞悪性腫瘍である、態様1～8のいずれかの方法。
１０．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する、態様9の方法。
１１．第1のCARが、前記抗原との結合について第2のCARと競合する、態様7～10のいずれかの方法。
１２．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、態様7～9および11のいずれかの方法。
１３．第2のCARが、前記疾患もしくは状態に関連した、第1のCARが結合する抗原とは別の抗原に特異的に結合するか；または
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない、
態様1～12のいずれかの方法。
１４．第1のCARが、CD19、CD22、またはCD20より選択される、B細胞悪性腫瘍に関連した抗原に特異的に結合し、かつ第2のCARが、第1のCARが結合する抗原とは異なる、CD19、CD22、またはCD20のうちの別の抗原に結合する、態様9～13のいずれかの方法。
１５．第1のCARがCD19に特異的に結合し、かつ第2のCARがCD22に特異的に結合する、態様14の方法。
１６．第2のCARを発現する細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、態様1～6のいずれかの方法。
１７．対象が、第2のCARを発現する細胞の投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を示さない、態様1～16のいずれかの方法。
１８．第2のCARが、第1のCARと比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む、態様1～17のいずれかの方法。
１９．1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含み；かつ/または
該1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
態様18の方法。
２０．第2のCARを発現する細胞の投与の前に、対象におけるCAR特異的な免疫応答の存在を検出する工程をさらに含む、態様1～19のいずれかの方法。
２１．検出が、対象が特異的な免疫応答を示す第1のCARの少なくとも1個の領域の同定を含む、態様20の方法。
２２．第2のCARが、免疫応答が特異的である第1のCARの前記領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している、態様21の方法。
２３．第1のCARの領域が、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個もしくは複数個のCAR部分の中の領域を含み、かつ/または第1のCARの該領域が、2個のドメインの間のジャンクションの各側のアミノ酸を含むジャンクション領域である、態様19～22のいずれかの方法。
２４．領域がscFv部分の中のフレームワーク領域（FR）を含み、
該領域が重鎖FR配列を含み、
該領域が重鎖CDR配列を含み、
該領域が軽鎖FR配列を含み、かつ/または
該領域が軽鎖CDR配列を含む、
態様23の方法。
２５．領域がジャンクション領域を含み、ジャンクション領域が、第1のCARの第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の最大15個の連続アミノ酸、および/または該ジャンクションのすぐN末端側の最大15個の連続アミノ酸を含み、任意で、該ジャンクションをさらに含む、態様24の方法。
２６．第1のドメインおよび/または第2のドメインが、天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメインもしくはその機能性部分に対して100％の同一性を有するドメインを含み、該天然もしくは内在性のヒトタンパク質が、任意で、処置される対象によって発現され；かつ/あるいは
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、任意で、共刺激シグナル伝達ドメインまたは活性化細胞質シグナル伝達ドメインである、
態様25の方法。
２７．第1のドメインおよび第2のドメインが、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しないか、または単一の天然もしくは内在性のヒトタンパク質もしくはヒトポリペプチドに存在しない、態様26の方法。
２８．第1のドメインおよび第2のドメインがそれぞれ、細胞外リガンド結合ドメインおよびヒンジドメイン、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかまたはそれらを含み、これらはそのようなドメインの機能性部分を含んでいてもよい、態様26または態様27の方法。
２９．第1のドメインが膜貫通ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含み、かつ第2のドメインが共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含む、態様26～28のいずれかの方法。
３０．膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分であり、かつ共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインまたはその機能性部分である、態様29の方法。
３１．第2のCARが、
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび/もしくは第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；
第1のドメインと配列が同一であるドメインおよび第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；または
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび第2のドメインと配列が同一であるドメイン
を含み、
第2のCARに存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含む部分において、第1のCARの第1のドメインおよび第2のドメインの一方または両方と比較して、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含む、態様26～30のいずれかの方法。
３２．第1のCARが、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:5と少なくとも95％同一であるアミノ酸の配列を含むそのバリアントもしくは機能性部分を共に含む、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、かつジャンクション領域を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARと比較して修飾された配列を含み、修飾が、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42または15～40の配列を含む部分における少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、態様29～31のいずれかの方法。
３３．第2のCARが、第1のCARと比較して20以下のアミノ酸配列の違いを含むか、または第2のCARが、第1のCARに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を含む、態様18～32のいずれかの方法。
３４．1つまたは複数の配列の違いのうちの少なくとも1つを含有している第2のCARの領域が、
1000nM未満のIC50のヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性を有する第1のCARの対応する領域と比較して、より少ない8～15アミノ酸部分を含有しているか；または
参照キメラ受容体のジャンクション領域の対応する部分の配列を有するペプチド断片の同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低いHLA分子に対する結合親和性を有するか；または
第1のCARの対応する領域と比較して、ヒト白血球抗原（HLA）分子に対する、該領域の中の少なくとも1個のペプチド断片の結合親和性、もしくは該領域の中の8～15アミノ酸部分の配列を有する全てのペプチド断片の低下した平均結合親和性を有する、
態様18～33のいずれかの方法。
３５．対象への投与の後に対象において第1のCARの中の領域に対して生じる免疫応答と比較して、低下した検出可能な免疫応答が、第2のCARを発現する細胞の投与の後に、対象において少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む第2のCARの対応する領域に対して生じる、態様18～34のいずれかの方法。
３６．第1のCARが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分および4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARのそのようなドメインの一方または両方とは異なる膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
態様1～17のいずれかの方法。
３７．第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む、態様1～36のいずれかの方法。
３８．第1のCARの対応する領域が、第2のCARを発現する細胞の投与の時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である、態様37の方法。
３９．第1のCARの対応する領域が、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/または宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域を含む、態様37または態様38の方法。
４０．第2のCARを発現する細胞の投与の後のCAR発現細胞の最大数、経時的なCAR発現細胞の曲線下面積（AUC）、および/または対象における検出可能なCAR発現細胞の持続時間が、第1のCARを発現する細胞の投与を実施し、続いて第1のCARを発現する細胞の第2の投与を実施することを含む代替投薬計画を含む方法を介して達成されたものと比較して、より大きく、かつ該第2の投与が、第2のCARを発現する細胞の投与と同時に実施される、態様1～39のいずれかの方法。
４１．前記方法が、1マイクロリットル当たり少なくとも約10個もしくは少なくとも10個のCAR発現細胞、末梢血単核細胞（PBMC）の総数の少なくとも50％、少なくとも約1×10⁵個のCAR発現細胞、もしくはDNA 1マイクログラム当たり少なくとも1,000コピーもしくは少なくとも2,000コピーもしくは少なくとも3,000コピーもしくは少なくとも4,000コピーもしくは少なくとも5,000コピーのCARコードDNAの、対象の血液の中のCAR発現細胞の最大濃度もしくは最大数をもたらし；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、CAR発現細胞が、対象の血液もしくは血清の中で検出可能であり；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、対象の血液が、少なくとも20％のCAR発現細胞、1マイクロリットル当たり少なくとも10個のCAR発現細胞、もしくは少なくとも1×10⁴個のCAR発現細胞を含有している、
態様1～40のいずれかの方法。
４２．第1のCARを発現する細胞の用量および/または第2のCARを発現する細胞の用量が、独立に、対象における疾患または状態の負荷の低減のために十分な量の細胞を含む、態様1～41のいずれかの方法。
４３．第1のCARを発現する細胞の投与および/または第2のCARを発現する細胞の投与が、対象における疾患または状態の負荷の低減を達成し、それによって、疾患または状態を処置する、態様1～42のいずれかの方法。
４４．細胞がT細胞である、態様1～43のいずれかの方法。
４５．T細胞が対象に対して自己である、態様1～44のいずれかの方法。
４６．第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現せずかつ第2のCARを発現する細胞を対象へ投与する工程を含む処置方法であって、
該対象が、第1のCARを発現する細胞の投与を以前に受けたことがあり；
第1のCARが、該対象における疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原または該対象における疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、方法。
４７．第2のCARを発現する細胞を投与する前に、第1のCARを発現する細胞を対象へ投与する、態様46の方法。４８．第2のCARを発現する細胞の投与の時点でまたはその直前に、
対象が、第1のCARに対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を示しており；
疾患もしくは状態が、該対象において持続しており；かつ/または
疾患もしくは状態が、該対象において再発している、
態様46～47のいずれかの方法。
４９．第1のCARを発現する細胞の投与と第2のCARを発現する細胞の投与との間の時間が、少なくとも約28日間、少なくとも約35日間、少なくとも約42日間、少なくとも約49日間、および/または少なくとも約60日間である、態様46～48のいずれかの方法。
５０．第1のCARが、第2のCARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む、態様46～49のいずれかの方法。
５１．少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のB細胞エピトープを含み；かつ/または
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、
態様50の方法。
５２．対象が、前記投与の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、態様46～51のいずれかの方法。５３．第2のCARが、第1のCARと同じ抗原に特異的に結合する、態様46～52のいずれかの方法。
５４．疾患または状態が腫瘍である、態様46～53のいずれかの方法。
５５．疾患または状態がB細胞悪性腫瘍である、態様46～54のいずれかの方法。
５６．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する、態様53の方法。
５７．第1のCARが、前記抗原との結合について第2のCARと競合する、態様53～56のいずれかの方法。
５８．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、態様53～55および57のいずれかの方法。
５９．第2のCARが、前記疾患もしくは状態に関連した、第1のCARが結合する抗原とは別の抗原に特異的に結合するか；または
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない、
態様46～58のいずれかの方法。
６０．第1のCARが、CD19、CD22、またはCD20より選択される、B細胞悪性腫瘍に関連した抗原に特異的に結合し、かつ第2のCARが、第1のCARが結合する抗原とは異なる、CD19、CD22、またはCD20のうちの別の抗原に結合する、態様55～59のいずれかの方法。
６１．第1のCARがCD19に特異的に結合し、かつ第2のCARがCD22に特異的に結合する、態様60の方法。
６２．第2のCARを発現する細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、態様46～52のいずれかの方法。
６３．対象が、第2のCARを発現する細胞の投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を示さない、態様46～62のいずれかの方法。
６４．第2のCARが、第1のCARと比較して、アミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む、態様46～63のいずれかの方法。
６５．1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含み；かつ/または
該1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
態様64の方法。
６６．第2のCARを発現する細胞の投与の前に、対象におけるCAR特異的な免疫応答の存在を検出する工程をさらに含む、態様46～65のいずれかの方法。
６７．検出が、対象が特異的な免疫応答を示す第1のCARの少なくとも1個の領域の同定を含む、態様66の方法。
６８．第2のCARが、免疫応答が特異的である第1のCARの前記領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している、態様67の方法。
６９．第1のCARの領域が、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個もしくは複数個のCAR部分の中の領域を含み、かつ/または第1のCARの該領域が、2個のドメインの間のジャンクションの各側のアミノ酸を含むジャンクション領域である、態様65～68のいずれかの方法。
７０．領域がscFv部分の中のフレームワーク領域（FR）を含み、
該領域が重鎖FR配列を含み、
該領域が重鎖CDR配列を含み、
該領域が軽鎖FR配列を含み、かつ/または
該領域が軽鎖CDR配列を含む、
態様69の方法。
７１．領域がジャンクション領域を含み、ジャンクション領域が、第1のCARの第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の最大15個の連続アミノ酸、および/または該ジャンクションのすぐN末端側の最大15個の連続アミノ酸を含み、任意で、該ジャンクションをさらに含む、態様69の方法。
７２．第1のドメインおよび/または第2のドメインが、天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメインもしくはその機能性部分に対して100％の同一性を有するドメインを含み、該天然もしくは内在性のヒトタンパク質が、任意で、処置される対象によって発現され；かつ/あるいは
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、任意で、共刺激シグナル伝達ドメインまたは活性化細胞質シグナル伝達ドメインである、
態様71の方法。
７３．第1のドメインおよび第2のドメインが、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しないか、または単一の天然もしくは内在性のヒトタンパク質もしくはヒトポリペプチドに存在しない、態様72の方法。
７４．第1のドメインおよび第2のドメインがそれぞれ、細胞外リガンド結合ドメインおよびヒンジドメイン、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかまたはそれらを含み、これらはそのようなドメインの機能性部分を含んでいてもよい、態様72または態様73の方法。
７５．第1のドメインが膜貫通ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含み、かつ第2のドメインが共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含む、態様72～74のいずれかの方法。
７６．膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分であり、かつ共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BBシグナル伝達ドメインまたはその機能性部分である、態様75の方法。
７７．第2のCARが、
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび/もしくは第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；
第1のドメインと配列が同一であるドメインおよび第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；または
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび第2のドメインと配列が同一であるドメイン
を含み、
第2のCARに存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含む部分において、第1のCARの第1のドメインおよび第2のドメインの一方または両方と比較して、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含む、態様72～76のいずれかの方法。
７８．第1のCARが、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:5と少なくとも95％同一であるアミノ酸の配列を含むそのバリアントもしくは機能性部分を共に含む、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、かつジャンクション領域を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARと比較して修飾された配列を含み、修飾が、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42または15～40の配列を含む部分における少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、態様75～77のいずれかの方法。
７９．第2のCARが、第1のCARと比較して20以下のアミノ酸配列の違いを含むか、または第2のCARが、第1のCARに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を含む、態様64～78のいずれかの方法。
８０．1つまたは複数の配列の違いのうちの少なくとも1つを含有している第2のCARの領域が、
1000nM未満のIC50のヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性を有する第1のCARの対応する領域と比較して、より少ない8～15アミノ酸部分を含有しているか；または
参照キメラ受容体のジャンクション領域の対応する部分の配列を有するペプチド断片の同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低いHLA分子に対する結合親和性を有するか；または
第1のCARの対応する領域と比較して、ヒト白血球抗原（HLA）分子に対する、該領域の中の少なくとも1個のペプチド断片の結合親和性、もしくは該領域の中の8～15アミノ酸部分の配列を有する全てのペプチド断片の低下した平均結合親和性を有する、
態様64～79のいずれかの方法。
８１．対象への投与の後に対象において第1のCARの中の領域に対して生じる免疫応答と比較して、低下した検出可能な免疫応答が、第2のCARを発現する細胞の投与の後に、対象において少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む第2のCARの対応する領域に対して生じる、態様64～80のいずれかの方法。
８２．第1のCARが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分および4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARのそのようなドメインの一方または両方とは異なる膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
態様46～63のいずれかの方法。
８３．第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む、態様46～82のいずれかの方法。
８４．第1のCARの対応する領域が、第2のCARを発現する細胞の投与の時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である、態様83の方法。
８５．第1のCARの対応する領域が、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/または宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域を含む、態様83または態様84の方法。
８６．第2のCARを発現する細胞の投与の後のCAR発現細胞の最大数、経時的なCAR発現細胞の曲線下面積（AUC）、および/または対象における検出可能なCAR発現細胞の持続時間が、第1のCARを発現する細胞の投与を実施し、続いて第1のCARを発現する細胞の第2の投与を実施することを含む代替投薬計画を含む方法を介して達成されたものと比較して、より大きく、かつ該第2の投与が、第2のCARを発現する細胞の投与と同時に実施される、態様46～85のいずれかの方法。
８７．前記方法が、1マイクロリットル当たり少なくとも約10個もしくは少なくとも10個のCAR発現細胞、末梢血単核細胞（PBMC）の総数の少なくとも50％、少なくとも約1×10⁵個のCAR発現細胞、もしくはDNA 1マイクログラム当たり少なくとも1,000コピーもしくは少なくとも2,000コピーもしくは少なくとも3,000コピーもしくは少なくとも4,000コピーもしくは少なくとも5,000コピーのCARコードDNAの、対象の血液の中のCAR発現細胞の最大濃度もしくは最大数をもたらし；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、CAR発現細胞が、対象の血液もしくは血清の中で検出可能であり；かつ/または
第2のCARを発現する細胞の投与の開始の後、30日目、60日目、もしくは90日目に、対象の血液が、少なくとも20％のCAR発現細胞、1マイクロリットル当たり少なくとも10個のCAR発現細胞、もしくは少なくとも1×10⁴個のCAR発現細胞を含有している、
態様46～86のいずれかの方法。
８８．第1のCARを発現する細胞の用量および/または第2のCARを発現する細胞の用量が、独立に、対象における疾患または状態の負荷の低減のために十分な量の細胞を含む、態様46～87のいずれかの方法。
８９．第1のCARを発現する細胞の投与および/または第2のCARを発現する細胞の投与が、対象における疾患または状態の負荷の低減を達成し、それによって、疾患または状態を処置する、態様46～88のいずれかの方法。
９０．細胞がT細胞である、態様46～89のいずれかの方法。
９１．T細胞が対象に対して自己である、態様46～90のいずれかの方法。
９２．第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置のための医薬の製造のための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を含む組成物の使用であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する該抗原、または該疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、使用。
９３．第1のキメラ受容体（CAR）によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置において使用するための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を含む組成物であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した抗原に特異的に結合し；かつ
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する該抗原、または該疾患もしくは状態に関連した別の抗原に特異的に結合する、組成物。
９４．前記使用が、第1のCARに対して特異的である検出可能な体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を示す対象におけるものであり；
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現する細胞の投与の後に該対象において持続しており；かつ/または
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現する細胞の投与の後に該対象において再発している、
態様92の使用または態様93の組成物。
９５．前記組成物が、第1のCARを発現する細胞の投与の少なくとも約28日後、少なくとも約35日後、少なくとも約42日後、少なくとも約49日後、および/または少なくとも約60日後に使用するためのものである、態様92～94のいずれかの使用または組成物。
９６．第1のCARが、第2のCARに存在しない少なくとも1種の免疫反応性エピトープを含む、態様92～95のいずれかの使用または組成物。
９７．少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のB細胞エピトープを含み；かつ/または
少なくとも1種の免疫反応性エピトープが少なくとも1種のT細胞エピトープを含む、
態様96の使用または組成物。
９８．対象が、前記使用の前に、第2のCARを発現する細胞の用量を受けたことがない、態様92～97のいずれかの使用または組成物。
９９．第2のCARが、第1のCARと同じ抗原に特異的に結合する、態様92～98のいずれかの使用または組成物。
１００．疾患または状態が腫瘍である、態様92～99のいずれかの使用または組成物。
１０１．疾患または状態がB細胞悪性腫瘍である、態様92～100のいずれかの使用または組成物。
１０２．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の同じエピトープに特異的に結合する、態様56～101のいずれかの使用または組成物。
１０３．第1のCARが、前記抗原との結合について第2のCARと競合する、態様99～102のいずれかの使用または組成物。
１０４．第1のCARおよび第2のCARが、前記抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、態様99～101および103のいずれかの使用または組成物。
１０５．第2のCARが、前記疾患もしくは状態に関連した、第1のCARが結合する抗原とは別の抗原に特異的に結合するか；または
第2のCARが、第1のCARが特異的に結合する抗原に特異的に結合しない、
態様92～98のいずれかの使用または組成物。
１０６．第1のCARが、CD19、CD22、またはCD20より選択される、B細胞悪性腫瘍に関連した抗原に特異的に結合し、かつ第2のCARが、第1のCARが結合する抗原とは異なる、CD19、CD22、またはCD20のうちの別の抗原に結合する、態様101～105のいずれかの使用または組成物。
１０７．第1のCARがCD19に特異的に結合し、かつ第2のCARがCD22に特異的に結合する、態様106の使用または組成物。
１０８．第2のCARを発現する細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、態様92～98のいずれかの使用または組成物。
１０９．第2のCARの使用が、対象への投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答をもたらさない、態様92～108のいずれかの使用または組成物。
１１０．第2のCARが、第1のCARと比較してアミノ酸配列の1つまたは複数の違いを含む、態様92～109のいずれかの使用または組成物。
１１１．1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含み；かつ/または
該1つもしくは複数の違いが、第1のCARを発現する細胞の投与の後に対象において検出可能な免疫応答を生じさせる第1のCARの各領域と比較した、少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
態様110の使用または組成物。
１１２．対象が、第1のCARに対するCAR特異的な免疫応答が該対象において検出されている対象である、態様92～11のいずれかの使用または組成物。
１１３．検出が、対象が特異的な免疫応答を示す第1のCARの少なくとも1個の領域の同定を含む、態様112の使用または組成物。
１１４．第2のCARが、免疫応答が特異的である第1のCARの前記領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含有している、態様113の使用または組成物。
１１５．第1のCARの領域が、scFv部分、リンカー部分、対象にとって内在性でないアミノ酸配列、対象とは異なる種に由来する配列、および/もしくは2個のCARドメインの間のジャンクションからなる群より選択される1個もしくは複数個のCAR部分の中の領域を含み、かつ/または第1のCARの該領域が、2個のドメインの間のジャンクションの各側のアミノ酸を含むジャンクション領域である、態様111～114のいずれかの使用または組成物。
１１６．領域がscFv部分の中のフレームワーク領域（FR）を含み、
該領域が重鎖FR配列を含み、
該領域が重鎖CDR配列を含み、
該領域が軽鎖FR配列を含み、かつ/または
該領域が軽鎖CDR配列を含む、
態様115の使用または組成物。
１１７．領域がジャンクション領域を含み、ジャンクション領域が、第1のCARの第1のドメインと第2のドメインとを接合するジャンクションのすぐC末端側の最大15個の連続アミノ酸、および/または該ジャンクションのすぐN末端側の最大15個の連続アミノ酸を含み、任意で、該ジャンクションをさらに含む、態様115の使用または組成物。
１１８．第1のドメインおよび/または第2のドメインが、天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメイン、または天然もしくは内在性のヒトタンパク質のドメインもしくはその機能性部分に対して100％の同一性を有するドメインを含み、該天然または内在性のヒトタンパク質が、任意で、処置される対象によって発現され；かつ/あるいは
第1のドメインおよび/または第2のドメインが、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、任意で、共刺激シグナル伝達ドメインもしくは活性化細胞質シグナル伝達ドメインである、
態様117の使用または組成物。
１１９．第1のドメインおよび第2のドメインが、ヒト対象においてインビボで同一分子に存在しないか、または単一の天然もしくは内在性のヒトタンパク質もしくはヒトポリペプチドに存在しない、態様117または態様118の使用または組成物。
１２０．第1のドメインおよび第2のドメインがそれぞれ、細胞外リガンド結合ドメインおよびヒンジドメイン、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび活性化細胞質シグナル伝達ドメインであるかまたはそれらを含み、これらはそのようなドメインの機能性部分を含んでいてもよい、態様117～119のいずれかの使用または組成物。
１２１．第1のドメインが、膜貫通ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含み、かつ第2のドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分であるかまたはそれを含む、態様117～120のいずれかの使用または組成物。
１２２．膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分であり、かつ共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBシグナル伝達ドメインまたはその機能性部分である、態様121の使用または組成物。
１２３．第2のCARが、
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび/もしくは第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；
第1のドメインと配列が同一であるドメインおよび第2のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメイン；または
第1のドメインに対して少なくとも95％の配列同一性を有するドメインおよび第2のドメインと配列が同一であるドメイン
を含み、
第2のCARに存在するドメインの少なくとも一方または両方が、修飾されたジャンクション領域を含む部分において、第1のCARの第1のドメインおよび第2のドメインの一方または両方と比較して、少なくとも1つまたは複数のアミノ酸配列の違いを含む、
態様117～122のいずれかの使用または組成物。
１２４．第1のCARが、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:5と少なくとも95％同一であるアミノ酸の配列を含むそのバリアントもしくは機能性部分を共に含む、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、かつジャンクション領域を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARと比較して修飾された配列を含み、修飾が、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく残基13～42または15～40の配列を含む部分における少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む、
態様121～132のいずれかの使用または組成物。
１２５．第2のCARが、第1のCARと比較して20以下のアミノ酸配列の違いを含むか、または第2のCARが、第1のCARに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を含む、態様110～124のいずれかの使用または組成物。
１２６．1つまたは複数の配列の違いのうちの少なくとも1つを含有している第2のCARの領域が、
1000nM未満のIC50のヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性を有する第1のCARの対応する領域と比較して、より少ない8～15アミノ酸部分を含有しているか；または
参照キメラ受容体のジャンクション領域の対応する部分の配列を有するペプチド断片の同じヒト白血球抗原（HLA）分子に対する結合親和性より低いHLA分子に対する結合親和性を有するか；または
第1のCARの対応する領域と比較して、ヒト白血球抗原（HLA）分子に対する、該領域の中の少なくとも1個のペプチド断片の結合親和性、もしくは該領域の中の8～15アミノ酸部分の配列を有する全てのペプチド断片の低下した平均結合親和性を有する、態様110～125のいずれかの使用または組成物。
１２７．第2のCARの使用が、対象への投与の後に対象において第1のCARの領域に対して生じる免疫応答と比較して、対象において少なくとも1つのアミノ酸配列の違いを含む第2のCARの対応する領域に対して生じる検出可能な免疫応答の低下をもたらす、態様110～126のいずれかの使用または組成物。
１２８．第1のCARが、CD28膜貫通ドメインまたはその機能性部分および4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性部分を含み；かつ
第2のCARが、第1のCARのそのようなドメインの一方または両方とは異なる膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
態様92～113のいずれかの使用または組成物。
１２９．第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含む、態様92～128のいずれかの使用または組成物。
１３０．第1のCARの対応する領域が、第2のCARを発現する細胞の投与の時点で、検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答を対象が示さない領域である、態様129の使用または組成物。
１３１．第1のCARの対応する領域が、共刺激ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、形質導入マーカーもしくは発現マーカー、宿主にとって内在性の配列、および/または宿主と同じ種に由来する抗体ドメインからなる群より選択されるCAR部分の中の領域を含む、態様129または態様130の使用または組成物。 XII. Illustrative Aspects The provided embodiments include:
1. 1. (A) Administration of cells expressing a first chimeric antigen receptor (CAR) that specifically binds to a disease or condition-related antigen in the subject, and (b) What is the first CAR? A treatment method comprising the step of administering to the subject cells expressing a different second CAR but not expressing the first CAR.
2. 2. At or just before administration of cells expressing the second CAR
The subject exhibits a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is specific for the first CAR;
The disease or condition is persistent in the subject; and / or the disease or condition is recurrent in the subject.
The method of aspect 1.
3. 3. The time between administration of cells expressing the first CAR and administration of cells expressing the second CAR is at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and /. Or the method of embodiment 1 or 2, which is at least about 60 days.
4. The method of any of aspects 1-3, wherein the first CAR comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second CAR.
5. At least one immunoreactive epitope contains at least one B cell epitope; and / or at least one immunoreactive epitope contains at least one T cell epitope.
The method of aspect 4.
6. The subject has never received a dose of cells expressing the first CAR prior to administration in (a); and / or the subject received a second CAR prior to administration in (b). Never received a dose of expressing cells,
Any method of aspects 1-5.
7. The method of any of aspects 1-6, wherein the second CAR specifically binds to the same antigen as the first CAR.
8. The method of any of aspects 1-7, wherein the disease or condition is a tumor.
9. The method of any of aspects 1-8, wherein the disease or condition is a B-cell malignant tumor.
10. The method of embodiment 9, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to the same epitope of the antigen.
11. The method of any of aspects 7-10, wherein the first CAR competes with the second CAR for binding to said antigen.
12. The method of any of aspects 7-9 and 11, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to different epitopes of the antigen.
13. Does the second CAR specifically bind to an antigen other than the antigen to which the first CAR binds, which is related to the disease or condition; or the second CAR specifically binds to the first CAR? Does not specifically bind to the binding antigen,
The method of any of aspects 1-12.
14. The first CAR specifically binds to an antigen associated with a B cell malignancies selected from CD19, CD22, or CD20, and the second CAR is different from the antigen to which the first CAR binds. , CD19, CD22, or the method of any of aspects 9-13, which binds to another antigen of CD20.
15. The method of embodiment 14, wherein the first CAR specifically binds to CD19 and the second CAR specifically binds to CD22.
16. The method of any of aspects 1-6, wherein the cells expressing the second CAR do not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds.
17. Subjects show a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration of cells expressing the second CAR. No, any method of aspects 1-16.
18. The method of any of aspects 1-17, wherein the second CAR comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first CAR.
19. Differences in at least one amino acid sequence compared to the region of the first CAR where one or more differences give rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Containing; and / or at least one difference thereof compared to each region of the first CAR that produces a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Including differences in amino acid sequences,
The method of aspect 18.
20. The method of any of aspects 1-19, further comprising the step of detecting the presence of a CAR-specific immune response in a subject prior to administration of cells expressing a second CAR.
21. A method of embodiment 20, wherein detection comprises identifying at least one region of a first CAR in which the subject exhibits a specific immune response.
22. The method of embodiment 21, wherein the second CAR contains a difference in one or more amino acid sequences as compared to said region of the first CAR in which the immune response is specific.
23. The region of the first CAR is selected from the group consisting of the scFv part, the linker part, the amino acid sequence that is not endogenous to the subject, the sequence derived from a species different from the subject, and / or the junction between the two CAR domains. 19 in an embodiment 19 that comprises a region within one or more CAR moieties and / or that region of the first CAR is a junction region containing amino acids on each side of the junction between the two domains. One of the methods from to 22.
24. The region contains the framework area (FR) inside the scFv part and contains
The region contains a heavy chain FR sequence
The region contains a heavy chain CDR sequence and contains
The region comprises a light chain FR sequence and / or the region comprises a light chain CDR sequence.
The method of aspect 23.
25. The region contains the junction region, where the junction region joins the first and second domains of the first CAR, up to 15 contiguous amino acids immediately at the C-terminus of the junction, and / or immediately at the junction. The method of embodiment 24, comprising up to 15 contiguous amino acids on the N-terminal side and optionally further including the junction.
26. A domain in which the first domain and / or the second domain have 100% identity to the domain of a natural or endogenous human protein, or the domain of a natural or endogenous human protein or a functional portion thereof. Including, the natural or endogenous human protein is optionally expressed by the subject to be treated; and / or the first and / or second domains are extracellular binding domains, hinge domains, transmembrane domains. , Or including an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is optionally a costimulatory signaling domain or an activated cytoplasmic signaling domain.
Aspect 25 method.
27. The method of embodiment 26, wherein the first and second domains are not present in the same molecule in vivo in a human subject, or in a single natural or endogenous human protein or polypeptide.
28. The first domain and the second domain are the extracellular ligand binding domain and the hinge domain, the hinge domain and the transmembrane domain, the transmembrane domain and the intracellular co-stimulation signaling domain, and the intracellular co-stimulation signaling domain and The method of embodiment 26 or 27, which is or comprises an activated cytoplasmic signaling domain, which may comprise a functional portion of such a domain.
29. Aspects 26-28, wherein the first domain is or comprises a transmembrane domain or a functional portion thereof, and the second domain is or comprises a co-stimulation signaling domain or a functional portion thereof. Either way.
30. The method of embodiment 29, wherein the transmembrane domain is the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the co-stimulation signaling domain is the 4-1BB signaling domain or its functional portion.
31. The second CAR is
Domains with at least 95% sequence identity to the first domain and / or domains with at least 95% sequence identity to the second domain;
Domains that are sequence-identical to the first domain and domains that have at least 95% sequence identity to the second domain; or domains that have at least 95% sequence identity to the first domain and the first. Includes domains with the same sequence as 2 domains,
At least one or both of the domains present in the second CAR are at least one compared to one or both of the first and second domains of the first CAR in the portion containing the qualified junction region. The method of any of aspects 26-30, comprising differences in one or more amino acid sequences.
32. The CD28 transmembrane domain, wherein the first CAR contains both a variant or functional portion containing the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5 or the sequence of amino acids that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 5. And 4-1BB Containing the co-stimulation domain and containing the junction region; and the second CAR contained a modified sequence compared to the first CAR, the modification being shown in SEQ ID NO: 5. The method of any of aspects 29-31 comprising a difference in at least one amino acid sequence in the portion comprising the sequence of residues 13-42 or 15-40 based on numbering.
33. The second CAR contains 20 or less amino acid sequence differences compared to the first CAR, or the second CAR contains at least 95% amino acid sequence identity to the first CAR. The method of any of aspects 18-32.
34.1 Regions of the second CAR containing at least one of the differences in one or more sequences,
Contains less 8-15 amino acid moieties compared to the corresponding region of the first CAR, which has a binding affinity for IC50 less than 1000 nM for human leukocyte antigen (HLA) molecules; or of reference chimeric receptors Does the peptide fragment with the sequence of the corresponding portion of the junction region have a lower binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule than the binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule; or compared to the corresponding region of the first CAR? , Binding affinity of at least one peptide fragment in the region to human leukocyte antigen (HLA) molecule, or reduced average binding of all peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties in the region. Have an affinity,
The method of any of aspects 18-33.
35. A reduced detectable immune response compared to the immune response that occurs in the subject to a region within the first CAR after administration to the subject, the subject after administration of cells expressing the second CAR The method of any of aspects 18-34, which occurs for the corresponding region of the second CAR comprising a difference in at least one amino acid sequence in.
36. The first CAR comprises the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the 4-1BB co-stimulation signaling domain or its functional portion; and the second CAR is one of such domains of the first CAR. Or both contain different transmembrane domains and co-stimulation signaling domains,
The method of any of aspects 1-17.
37. The method of any of aspects 1-36, wherein the second CAR comprises at least one region having the same amino acid sequence as the corresponding region of the first CAR.
38. The method of embodiment 37, wherein the corresponding region of the first CAR is a region in which the subject does not exhibit a detectable humoral or cell-mediated immune response at the time of administration of the cells expressing the second CAR.
39. The corresponding region of the first CAR consists of a co-stimulation domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. A method of aspect 37 or aspect 38 comprising a region within a CAR portion selected from the group.
40. The maximum number of CAR-expressing cells after administration of cells expressing a second CAR, the area under the curve (AUC) of CAR-expressing cells over time, and / or the duration of detectable CAR-expressing cells in the subject. Compared to those achieved through methods involving alternative dosing regimens involving administration of cells expressing the first CAR followed by a second administration of cells expressing the first CAR. The method of any of aspects 1-39, wherein the second administration is performed at the same time as the administration of the cells expressing the second CAR.
41. The method comprises at least about 10 or at least 10 CAR-expressing cells per microliter, at least 50% of the total number of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), at least about 1 × 10 ⁵ CAR-expressing cells, or DNA. It results in the maximum concentration or number of CAR-expressing cells in the blood of interest of at least 1,000 copies or at least 2,000 copies or at least 3,000 copies or at least 4,000 copies or at least 5,000 copies of CAR coding DNA per microgram; and / or CAR-expressing cells are detectable in the blood or serum of the subject at 30, 60, or 90 days after the initiation of administration of the cells expressing the second CAR; and / or On day 30, 60, or 90 days after the start of administration of cells expressing the second CAR, the blood of interest was at least 20% CAR-expressing cells, at least 10 cells per microliter. Contains CAR-expressing cells, or at least 1 × 10 ⁴ CAR-expressing cells,
The method of any of aspects 1-40.
42. Aspect 1 in which the dose of cells expressing the first CAR and / or the dose of cells expressing the second CAR independently comprises a sufficient amount of cells to reduce the burden of the disease or condition in the subject. One of the methods from ~ 41.
43. Administration of cells expressing the first CAR and / or administration of cells expressing the second CAR achieves a reduction in the burden of the disease or condition in the subject, thereby treating the disease or condition, embodiment 1. One of the methods up to 42.
44. The method of any of aspects 1-43, wherein the cell is a T cell.
45. The method of any of aspects 1-44, wherein the T cells are self relative to the subject.
46. A treatment method comprising the step of administering to a subject cells that do not express the first chimeric antigen receptor (CAR) and that express the second CAR.
The subject has previously received administration of cells expressing the first CAR;
The first CAR specifically binds to an antigen associated with the disease or condition in the subject; and the second CAR is associated with the antigen or disease or condition associated with the subject to which the first CAR specifically binds. A method of specifically binding to another antigen.
47. The method of embodiment 46, wherein the cells expressing the first CAR are administered to the subject prior to administering the cells expressing the second CAR. 48. At or just before administration of cells expressing the second CAR
The subject exhibits a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is specific for the first CAR;
The disease or condition is persistent in the subject; and / or the disease or condition is recurrent in the subject.
The method of any of aspects 46-47.
49. The time between administration of cells expressing the first CAR and administration of cells expressing the second CAR is at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and /. Or the method of any of aspects 46-48, which is at least about 60 days.
50. The method of any of aspects 46-49, wherein the first CAR comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second CAR.
51. At least one immunoreactive epitope contains at least one B cell epitope; and / or at least one immunoreactive epitope contains at least one T cell epitope.
Aspect 50 method.
52. The method of any of aspects 46-51, wherein the subject has never received a dose of cells expressing a second CAR prior to said administration. 53. The method of any of aspects 46-52, wherein the second CAR specifically binds to the same antigen as the first CAR.
54. The method of any of aspects 46-53, wherein the disease or condition is a tumor.
55. The method of any of aspects 46-54, wherein the disease or condition is a B-cell malignant tumor.
56. The method of embodiment 53, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to the same epitope of the antigen.
57. The method of any of aspects 53-56, wherein the first CAR competes with the second CAR for binding to said antigen.
58. The method of any of aspects 53-55 and 57, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to different epitopes of the antigen.
59. Does the second CAR specifically bind to an antigen other than the antigen to which the first CAR binds, which is related to the disease or condition; or the second CAR specifically binds to the first CAR? Does not specifically bind to the binding antigen,
The method of any of aspects 46-58.
60. The first CAR specifically binds to an antigen associated with a B cell malignancies selected from CD19, CD22, or CD20, and the second CAR is different from the antigen to which the first CAR binds. , CD19, CD22, or the method of any of embodiments 55-59, which binds to another antigen of CD20.
61. The method of embodiment 60, wherein the first CAR specifically binds to CD19 and the second CAR specifically binds to CD22.
62. The method of any of aspects 46-52, wherein the cells expressing the second CAR do not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds.
63. Subjects show a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration of cells expressing the second CAR. No, any method of aspects 46-62.
64. The method of any of aspects 46-63, wherein the second CAR comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first CAR.
65.1 Differences in at least one amino acid sequence compared to the region of the first CAR where one or more differences give rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Containing; and / or at least one difference thereof compared to each region of the first CAR that produces a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Including differences in amino acid sequences,
Aspect 64 method.
66. The method of any of aspects 46-65, further comprising the step of detecting the presence of a CAR-specific immune response in a subject prior to administration of cells expressing a second CAR.
67. A method of embodiment 66, wherein detection comprises identifying at least one region of a first CAR in which the subject exhibits a specific immune response.
68. The method of embodiment 67, wherein the second CAR contains a difference in one or more amino acid sequences as compared to said region of the first CAR in which the immune response is specific.
69. The region of the first CAR is selected from the group consisting of the scFv part, the linker part, the amino acid sequence that is not endogenous to the subject, the sequence derived from a species different from the subject, and / or the junction between the two CAR domains. Aspect 65, comprising a region within one or more CAR moieties and / or a region of the first CAR comprising amino acids on each side of the junction between the two domains. Any method from ~ 68.
70. The region contains the framework area (FR) inside the scFv part and contains
The region contains a heavy chain FR sequence
The region contains a heavy chain CDR sequence and contains
The region comprises a light chain FR sequence and / or the region comprises a light chain CDR sequence.
The method of aspect 69.
71. The region contains the junction region, where the junction region joins the first and second domains of the first CAR, up to 15 contiguous amino acids immediately at the C-terminus of the junction, and / or immediately at the junction. The method of embodiment 69, comprising up to 15 contiguous amino acids on the N-terminal side and optionally further including the junction.
72. A domain in which the first domain and / or the second domain have 100% identity to the domain of a natural or endogenous human protein, or the domain of a natural or endogenous human protein or a functional portion thereof. Including, the natural or endogenous human protein is optionally expressed by the subject to be treated; and / or the first and / or second domains are extracellular binding domains, hinge domains, transmembrane domains. , Or including an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is optionally a costimulatory signaling domain or an activated cytoplasmic signaling domain.
The method of aspect 71.
73. The method of embodiment 72, wherein the first and second domains are not present in the same molecule in vivo in a human subject, or in a single natural or endogenous human protein or polypeptide.
74. The first domain and the second domain are the extracellular ligand binding domain and the hinge domain, the hinge domain and the transmembrane domain, the transmembrane domain and the intracellular co-stimulation signaling domain, and the intracellular co-stimulation signaling domain and The method of embodiment 72 or 73, which is an activated cytoplasmic signaling domain or comprises them, which may comprise a functional portion of such a domain.
75. Aspects 72-74, wherein the first domain is or comprises a transmembrane domain or a functional portion thereof, and the second domain is or comprises a co-stimulation signaling domain or a functional portion thereof. Either way.
76. The method of embodiment 75, wherein the transmembrane domain is the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the co-stimulation signaling domain is the 4-1BB signaling domain or its functional portion.
77. The second CAR is
Domains with at least 95% sequence identity to the first domain and / or domains with at least 95% sequence identity to the second domain;
Domains that are sequence-identical to the first domain and domains that have at least 95% sequence identity to the second domain; or domains that have at least 95% sequence identity to the first domain and the first. Includes domains with the same sequence as 2 domains,
At least one or both of the domains present in the second CAR are at least one compared to one or both of the first and second domains of the first CAR in the portion containing the qualified junction region. The method of any of aspects 72-76, comprising differences in one or more amino acid sequences.
78. The CD28 transmembrane domain, wherein the first CAR contains both a variant or functional portion containing the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5 or the sequence of amino acids that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 5. And 4-1BB Containing the co-stimulation domain and containing the junction region; and the second CAR contained a modified sequence compared to the first CAR, the modification being shown in SEQ ID NO: 5. The method of any of aspects 75-77 comprising a difference in at least one amino acid sequence in the portion comprising the sequence of residues 13-42 or 15-40 based on numbering.
79. The second CAR contains 20 or less amino acid sequence differences compared to the first CAR, or the second CAR contains at least 95% amino acid sequence identity to the first CAR. The method of any of aspects 64-78.
80.1 Regions of the second CAR containing at least one of the differences in one or more sequences,
Contains less 8-15 amino acid moieties compared to the corresponding region of the first CAR, which has a binding affinity for IC50 less than 1000 nM for human leukocyte antigen (HLA) molecules; or of reference chimeric receptors Does the peptide fragment with the sequence of the corresponding portion of the junction region have a lower binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule than the binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule; or compared to the corresponding region of the first CAR? , Binding affinity of at least one peptide fragment in the region to human leukocyte antigen (HLA) molecule, or reduced average binding of all peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties in the region. Have an affinity,
The method of any of aspects 64-79.
81. A reduced detectable immune response compared to the immune response that occurs in the subject to a region within the first CAR after administration to the subject, the subject after administration of cells expressing the second CAR The method of any of aspects 64-80, which occurs for the corresponding region of the second CAR comprising a difference in at least one amino acid sequence in.
82. The first CAR comprises the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the 4-1BB co-stimulation signaling domain or its functional portion; and the second CAR is one of such domains of the first CAR. Or both contain different transmembrane domains and co-stimulation signaling domains,
The method of any of aspects 46-63.
83. The method of any of aspects 46-82, wherein the second CAR comprises at least one region having the same amino acid sequence as the corresponding region of the first CAR.
84. The method of embodiment 83, wherein the corresponding region of the first CAR is a region in which the subject does not exhibit a detectable humoral or cell-mediated immune response at the time of administration of the cells expressing the second CAR.
85. The corresponding region of the first CAR consists of a co-stimulation domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. A method of aspect 83 or aspect 84 comprising a region within a CAR portion selected from the group.
86. The maximum number of CAR-expressing cells after administration of cells expressing a second CAR, the area under the curve (AUC) of CAR-expressing cells over time, and / or the duration of detectable CAR-expressing cells in the subject. Compared to those achieved through methods involving alternative dosing regimens involving administration of cells expressing the first CAR followed by a second administration of cells expressing the first CAR. The method of any of aspects 46-85, wherein the second administration is performed at the same time as the administration of the cells expressing the second CAR.
87. The method comprises at least about 10 or at least 10 CAR-expressing cells per microliter, at least 50% of the total number of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), at least about 1 × 10 ⁵ CAR-expressing cells, or DNA. It results in the maximum concentration or number of CAR-expressing cells in the blood of interest of at least 1,000 copies or at least 2,000 copies or at least 3,000 copies or at least 4,000 copies or at least 5,000 copies of CAR coding DNA per microgram; and / or CAR-expressing cells are detectable in the blood or serum of the subject at 30, 60, or 90 days after the initiation of administration of the cells expressing the second CAR; and / or On day 30, 60, or 90 days after the start of administration of cells expressing the second CAR, the blood of interest was at least 20% CAR-expressing cells, at least 10 cells per microliter. Contains CAR-expressing cells, or at least 1 × 10 ⁴ CAR-expressing cells,
The method of any of aspects 46-86.
88. Aspect 46, wherein the dose of cells expressing the first CAR and / or the dose of cells expressing the second CAR independently comprises a sufficient amount of cells to reduce the burden of the disease or condition in the subject. Any method of ~ 87.
89. Aspect 46, wherein administration of cells expressing a first CAR and / or administration of cells expressing a second CAR achieves a reduction in the burden of the disease or condition in the subject, thereby treating the disease or condition. Any method of ~ 88.
90. The method of any of aspects 46-89, wherein the cells are T cells.
91. The method of any of aspects 46-90, wherein the T cells are self relative to the subject.
92. Expressing a Second Chimeric Antigen Receptor (CAR) for the manufacture of a pharmaceutical for the treatment of a disease or condition in a subject previously treated by cells expressing the first Chimeric Antigen Receptor (CAR). The use of a composition containing cells,
The first CAR specifically binds to the antigen associated with the disease or condition in the subject; and the second CAR specifically binds to the antigen, or disease or condition to which the first CAR specifically binds. Use, which specifically binds to another associated antigen.
93. A composition comprising cells expressing a second chimeric antigen receptor (CAR) for use in the treatment of a disease or condition in a subject previously treated with the first chimeric receptor (CAR).
The first CAR specifically binds to the antigen associated with the disease or condition in the subject; and the second CAR specifically binds to the antigen, or disease or condition to which the first CAR specifically binds. A composition that specifically binds to another associated antigen.
94. The use is for subjects exhibiting a detectable humoral and / or cell-mediated immune response that is specific for the first CAR;
The disease or condition persists in the subject after administration of cells expressing the first CAR; and / or the disease or condition is present in the subject after administration of cells expressing the first CAR. It's recurring,
Use of Aspect 92 or composition of Aspect 93.
95. The composition is intended for use at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and / or at least about 60 days after administration of the cells expressing the first CAR. The use or composition of any of aspects 92-94.
96. The use or composition of any of aspects 92-95, wherein the first CAR comprises at least one immunoreactive epitope that is not present in the second CAR.
97. At least one immunoreactive epitope contains at least one B cell epitope; and / or at least one immunoreactive epitope contains at least one T cell epitope.
Use or composition of embodiment 96.
98. The use or composition of any of aspects 92-97, wherein the subject has never received a dose of cells expressing a second CAR prior to said use.
99. The use or composition of any of aspects 92-98, wherein the second CAR specifically binds to the same antigen as the first CAR.
100. The use or composition of any of aspects 92-99, wherein the disease or condition is a tumor.
101. The use or composition of any of aspects 92-100, wherein the disease or condition is a B-cell malignant tumor.
102. The use or composition of any of aspects 56-101, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to the same epitope of said antigen.
103. The use or composition of any of aspects 99-102, wherein the first CAR competes with the second CAR for binding to said antigen.
104. The use or composition of any of aspects 99-101 and 103, wherein the first CAR and the second CAR specifically bind to different epitopes of said antigen.
105. Does the second CAR specifically bind to an antigen other than the antigen to which the first CAR binds, which is related to the disease or condition; or the second CAR specifically binds to the first CAR? Does not specifically bind to the binding antigen,
Use or composition of any of aspects 92-98.
106. The first CAR specifically binds to an antigen associated with a B cell malignancies selected from CD19, CD22, or CD20, and the second CAR is different from the antigen to which the first CAR binds. , CD19, CD22, or the use or composition of any of aspects 101-105 that binds to another antigen of CD20.
107. The use or composition of embodiment 106, wherein the first CAR specifically binds to CD19 and the second CAR specifically binds to CD22.
108. The use or composition of any of aspects 92-98, wherein the cell expressing the second CAR does not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds.
109. Use of the second CAR does not result in a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration to the subject. , The use or composition of any of aspects 92-108.
110. The use or composition of any of aspects 92-109, wherein the second CAR comprises one or more differences in the amino acid sequence as compared to the first CAR.
111.1 Differences in at least one amino acid sequence compared to the region of the first CAR where one or more differences give rise to a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Containing; and / or at least one difference thereof compared to each region of the first CAR that produces a detectable immune response in the subject after administration of cells expressing the first CAR. Including differences in amino acid sequences,
Use or composition of embodiment 110.
112. The use or composition of any of aspects 92-11, wherein the subject is a subject in which a CAR-specific immune response to the first CAR has been detected.
113. Use or composition of embodiment 112, wherein detection comprises identifying at least one region of a first CAR in which the subject exhibits a specific immune response.
114. The use or composition of embodiment 113, wherein the second CAR contains a difference in one or more amino acid sequences as compared to said region of the first CAR in which the immune response is specific.
115. The region of the first CAR is selected from the group consisting of the scFv part, the linker part, the amino acid sequence that is not endogenous to the subject, the sequence derived from a species different from the subject, and / or the junction between the two CAR domains. Aspect 111, comprising a region within one or more CAR moieties and / or a region of the first CAR comprising amino acids on each side of the junction between the two domains. Use or composition of any of ~ 114.
116. The region contains the framework area (FR) inside the scFv part and contains
The region contains a heavy chain FR sequence
The region contains a heavy chain CDR sequence and contains
The region comprises a light chain FR sequence and / or the region comprises a light chain CDR sequence.
Use or composition of embodiment 115.
117. The region contains the junction region, where the junction region joins the first and second domains of the first CAR, up to 15 contiguous amino acids immediately at the C-terminus of the junction, and / or immediately at the junction. The use or composition of embodiment 115, comprising up to 15 contiguous amino acids on the N-terminal side and optionally further comprising the junction.
118. A domain in which the first domain and / or the second domain have 100% identity to the domain of a natural or endogenous human protein, or the domain of a natural or endogenous human protein or a functional portion thereof. Including, the natural or endogenous human protein is optionally expressed by the subject to be treated; and / or the first and / or second domains are extracellular binding domains, hinge domains, transmembrane domains. , Or including an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is optionally a costimulatory signaling domain or an activated cytoplasmic signaling domain.
Use or composition of embodiment 117.
119. Use or use of embodiment 117 or 118, wherein the first and second domains are not present in the same molecule in vivo in a human subject, or in a single natural or endogenous human protein or polypeptide. Composition.
120. The first domain and the second domain are the extracellular ligand binding domain and the hinge domain, the hinge domain and the transmembrane domain, the transmembrane domain and the intracellular co-stimulation signal transduction domain, and the intracellular co-stimulation signal transduction domain and the intracellular co-stimulation signal transduction domain, respectively. The use or composition of any of aspects 117-119, which is or comprises an activated cytoplasmic signaling domain, which may comprise a functional portion of such a domain.
121. Aspects 117-where the first domain is or comprises a transmembrane domain or a functional portion thereof and the second domain is or comprises a co-stimulation signaling domain or a functional portion thereof. Use or composition of any of 120.
122. The use or composition of embodiment 121, wherein the transmembrane domain is the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the co-stimulation signaling domain is the 4-1BB signaling domain or its functional portion.
123. The second CAR is
Domains with at least 95% sequence identity to the first domain and / or domains with at least 95% sequence identity to the second domain;
Domains that are sequence-identical to the first domain and domains that have at least 95% sequence identity to the second domain; or domains that have at least 95% sequence identity to the first domain and the first. Includes domains with the same sequence as 2 domains,
At least one or both of the domains present in the second CAR are at least one compared to one or both of the first and second domains of the first CAR in the portion containing the qualified junction region. Containing differences in one or more amino acid sequences,
Use or composition of any of aspects 117-122.
124. The CD28 transmembrane domain, wherein the first CAR contains both a variant or functional portion containing the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5 or the sequence of amino acids that is at least 95% identical to SEQ ID NO: 5. And 4-1BB Containing the co-stimulation domain and containing the junction region; and the second CAR contained a modified sequence compared to the first CAR, the modification being shown in SEQ ID NO: 5. Containing differences in at least one amino acid sequence in the portion containing the sequence of residues 13-42 or 15-40 based on numbering,
Use or composition of any of aspects 121-132.
125. The second CAR contains 20 or less amino acid sequence differences compared to the first CAR, or the second CAR contains at least 95% amino acid sequence identity to the first CAR. Use or composition of any of aspects 110-124.
126. The region of the second CAR that contains at least one of the differences in one or more sequences,
Contains less 8-15 amino acid moieties compared to the corresponding region of the first CAR, which has a binding affinity for IC50 less than 1000 nM for human leukocyte antigen (HLA) molecules; or of reference chimeric receptors Does the peptide fragment with the sequence of the corresponding portion of the junction region have a lower binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule than the binding affinity for the same human leukocyte antigen (HLA) molecule; or compared to the corresponding region of the first CAR? , Binding affinity of at least one peptide fragment in the region to human leukocyte antigen (HLA) molecule, or reduced average binding of all peptide fragments having a sequence of 8-15 amino acid moieties in the region. The use or composition of any of aspects 110-125 having an affinity.
127. Correspondence of the second CAR involving the difference in at least one amino acid sequence in the subject compared to the immune response that occurs in the subject to the region of the first CAR after administration of the second CAR to the subject. The use or composition of any of aspects 110-126, which results in a detectable reduction in immune response to the region.
128. The first CAR comprises the CD28 transmembrane domain or its functional portion and the 4-1BB co-stimulation signaling domain or its functional portion; and the second CAR is one of such domains of the first CAR. Or both contain different transmembrane domains and co-stimulation signaling domains,
Use or composition of any of aspects 92-113.
129. The use or composition of any of aspects 92-128, wherein the second CAR comprises at least one region having the same amino acid sequence as the corresponding region of the first CAR.
130. Use or use of embodiment 129, wherein the corresponding region of the first CAR is the region where the subject does not exhibit a detectable humoral or cell-mediated immune response at the time of administration of the cells expressing the second CAR. Composition.
131. The corresponding region of the first CAR consists of a co-stimulation domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, a transduction or expression marker, a sequence endogenous to the host, and / or an antibody domain derived from the same species as the host. Use or composition of aspect 129 or aspect 130 comprising a region within a CAR portion selected from the group.

以下の実施例は例示のためだけに含まれ、本発明の範囲を限定することを目的としない。 The following examples are included for illustration purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

実施例1：トランスジーン生成物に特異的な宿主免疫応答の分析
CD19特異的CARを発現する自己T細胞によって処置されたB細胞悪性腫瘍を有する4人の対象から、処置前および処置後の末梢血単核細胞（PBMC）試料を入手した。CARは、マウス抗体に由来する抗CD19 scFv、ヒンジドメイン、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、T2Aドメイン、および短縮EGFR（EGFRt）部分を含んでいた。 Example 1: Analysis of a host immune response specific for a transgene product
Pre- and post-treatment peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples were obtained from 4 subjects with B-cell malignancies treated with autologous T cells expressing CD19-specific CAR. CAR contained anti-CD19 scFv, hinge domain, CD28 transmembrane domain, 4-1BB intracellular signaling domain, CD3ζ intracellular signaling domain, T2A domain, and shortened EGFR (EGFRt) moieties derived from mouse antibodies. ..

対象から入手された注入前および注入後（42日目）のPBMCを、本質的に、Berger et al.Blood.2006 March;107(6):2294-2302、Berger et al.J Virol.2001 January 75(2):799-808、Riddell et al.Nature Medicine.1996 February 2(2):216-223、Berger et al.Blood.2005 February 105(4):1640-1647によって記載されたようにして、特異的な抗CAR免疫応答の存在または欠如を検出するために査定した。簡単に説明すると、投与された細胞が発現するCARによって形質導入された自己のγ照射済み細胞（1:1または2:1の応答細胞対刺激細胞比の刺激細胞）によって、インビトロでPBMC（応答細胞）を刺激した。次いで、様々なエフェクター標的比（E/T）で、自己の⁵¹Cr標識CAR形質導入T細胞（「CD19 CAR」）および非形質導入（「モック」）T細胞（標的）に対する細胞傷害について、クロム放出アッセイにおいて培養物を査定した。コインキュベーションの後、クロムの放出を定量化し、各試料における最大の達成可能な溶解に対する百分率を決定した。 Pre- and post-injection (day 42) PBMCs obtained from subjects, essentially Berger et al. Blood. 2006 March; 107 (6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. 2001 January. As described by 75 (2): 799-808, Riddell et al.Nature Medicine.1996 February 2 (2): 216-223, Berger et al.Blood.2005 February 105 (4): 1640-1647. Assessed to detect the presence or absence of a specific anti-CAR immune response. Briefly, PBMCs (responses) in vitro by self-γ-irradiated cells (1: 1 or 2: 1 response cell-to-stimulation cell ratio stimulator cells) transduced by CAR expressed by the administered cells. The cells) were stimulated. Chromium was then charged for cytotoxicity to autologous ⁵¹ Cr-labeled CAR transduced T cells (“CD19 CAR”) and non-transduced (“mock”) T cells (targets) at various effector target ratios (E / T). Cultures were assessed in the release assay. After coincubation, chromium release was quantified and the percentage of maximum achievable lysis in each sample was determined.

1人の例示的な患者に由来する試料についての結果が、図1に示され、注入前および注入後42日目のPBMCの細胞溶解活性が示される。注入前のPBMC由来培養物においては、CAR形質導入標的細胞に特異的な細胞溶解活性は検出されなかったが、査定された4人の対象のうちの2人において、注入後のPBMC試料に由来する培養物において、CAR特異的な溶解活性が検出された。これらの結果は、CAR発現T細胞の一回の注入の後に、CAR特異的な免疫応答が発達し得ることを示している。 Results for a sample from one exemplary patient are shown in Figure 1 showing the cytolytic activity of PBMC before and 42 days after infusion. No cytolytic activity specific to CAR transduction target cells was detected in pre-injection PBMC-derived cultures, but derived from post-injection PBMC samples in 2 of the 4 assessed subjects. CAR-specific lytic activity was detected in the culture. These results indicate that a CAR-specific immune response can develop after a single infusion of CAR-expressing T cells.

特異的な免疫応答によって認識されるCARの領域を査定するため、エピトープマッピングを実施した。投与された細胞が発現するCARのおよそ500アミノ酸の配列の全長のオーバーラップする部分（11アミノ酸オーバーラップ）を表す配列を有する複数の15アミノ酸長ペプチドの個々のプールの存在下で、注入前および注入後のPBMC試料を刺激した。CD8およびCD4の表面発現ならびにサイトカインの細胞内発現を検出するため、抗体によって細胞を染色した。各々10種のペプチドを含有し、集合的に125種の個々のオーバーラップペプチドを含む、23個のプールを、査定した。各ペプチドは、プールのうちの少なくとも2個において表される。 Epitope mapping was performed to assess the region of CAR recognized by a specific immune response. Pre-injection and in the presence of individual pools of multiple 15-amino acid long peptides having sequences representing the full-length overlap (11 amino acid overlap) of the approximately 500 amino acid sequence of CAR expressed by the administered cells. The PBMC sample after injection was stimulated. Cells were stained with antibodies to detect surface expression of CD8 and CD4 as well as intracellular expression of cytokines. Twenty-three pools, each containing 10 peptides and collectively containing 125 individual overlapping peptides, were assessed. Each peptide is represented in at least two of the pools.

この設計は、このアッセイにおいてヒットとして検出された複数個のプールに存在するペプチドが、免疫原性である可能性のあるペプチドヒットと見なされる、個々のペプチドに特異的な応答を査定するための分析グリッドの生成を可能にした。CAR特異的な免疫応答が検出された2人の患者について、それぞれ、6個および3個のペプチドヒットが同定された。 This design is for assessing individual peptide-specific responses in which peptides present in multiple pools detected as hits in this assay are considered peptide hits that may be immunogenic. Enabled to generate an analysis grid. Six and three peptide hits were identified for the two patients in which a CAR-specific immune response was detected, respectively.

これらの個々のヒットの各々について特異的な免疫応答の存在または欠如を査定するため、抗サイトカイン捕捉抗体を使用して、個々のELISpotアッセイを実施した（Berger et al.(2006)；Berger et al.(2001)；Riddell et al.(1996)；およびBerger et al.(2005)（前記）を参照すること）。1人の患者についての例示的なアッセイの結果が、図2に示される。CARのscFvのV_H部分の中の配列を有する（1人の患者については、FR1領域、CDR1領域、およびFR2領域の中、他方についてはFR3の中の領域を含む）ペプチドに対する特異的な免疫応答が、査定された両方の患者において検出された。第1の患者については、CARの膜貫通ドメインと共刺激ドメインとの間のジャンクションを各々含有している2種のオーバーラップ15アミノ酸長ペプチド（図2中、「融合部位」と表示される）に対しても、特異的な免疫応答が検出された。これらの2種のオーバーラップ15アミノ酸長ペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列

を有していた。マウスscFv、CD28膜貫通ドメインおよび共刺激ドメイン、ならびにCD3ζドメインを有する異なるCARの投与の後の、類似した方法を使用した、もう一つの研究においても、1人の対象について、抗CD19 scFvのV_H部分を含有しているプールに対して免疫応答が検出され、もう1人の対象について、ジャンクション部分を含有しているプールに対して検出された。 Individual ELI Spot assays were performed using anti-cytokine capture antibodies to assess the presence or absence of a specific immune response for each of these individual hits (Berger et al. (2006); Berger et al. (2001); Riddell et al. (1996); and Berger et al. (2005) (see above)). The results of an exemplary assay for one patient are shown in Figure 2. Specific immunity to peptides having sequences within the _VH portion of the scFv of CAR (including regions in the FR1, CDR1 and FR2 regions for one patient and in FR3 for the other) Responses were detected in both assessed patients. For the first patient, two overlapping 15 amino acid length peptides each containing a junction between the transmembrane domain and the costimulatory domain of CAR (indicated as "fusion site" in Figure 2). Also, a specific immune response was detected. Each of these two overlapping 15 amino acid length peptides has an amino acid sequence.

Had. In another study using similar methods after administration of different CARs with mouse scFv, CD28 transmembrane domain and co-stimulation domain, and CD3ζ domain, the V of anti-CD19 scFv was also used in one subject. An immune response was detected in the pool containing the _H moiety and in another subject against the pool containing the junction moiety.

このアッセイによって、他の領域の中のペプチドに対しては、患者における特異的な免疫応答は検出されなかった。例えば、このアッセイにおいて、scFvの他のCDRもしくはフレームワーク領域の中の配列を有するペプチド、共刺激ドメインもしくは膜貫通ドメインの領域の中にあるがその2つの間のジャンクションにかからないペプチド、またはCARのEGFRt領域もしくはCD3ζ領域の中のペプチドに対しては、特異的な応答は検出されなかった。内在性配列に対する特異的な免疫応答は検出されなかった。 No specific immune response in the patient was detected for peptides in other regions by this assay. For example, in this assay, a peptide having a sequence in another CDR or framework region of scFv, a peptide in the region of the co-stimulation domain or transmembrane domain but not in the junction between the two, or CAR. No specific response was detected for peptides in the EGFRt region or CD3ζ region. No specific immune response to the endogenous sequence was detected.

実施例2：CARのジャンクション領域に由来するペプチドのHLAクラスIおよびHLAクラスIIとの結合についてのインシリコ分析
例示的なCAR配列の部分の中の一連のオーバーラップペプチド配列の各々について、MHC結合親和性および可能性のある免疫原性に関係のあるその他の特性を予測するためのインシリコ分析のため、Immune Epitope Database and analysis resource（IEDB）から入手可能なT細胞エピトープ予測ツールを使用した。部分には、免疫グロブリン由来ヒンジドメインを有するスペーサー、ヒトCD28膜貫通ドメイン、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、およびヒトCD3ζシグナル伝達ドメインが含まれた。査定された部分において、ヒンジドメインはヒトIgG4ヒンジドメインであり、CD28膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:2に示された配列を含み、4-1BB共刺激ドメインは、SEQ ID NO:3に示された配列を含有していた。従って、この部分は、スペーサー領域と膜貫通ドメインとの間のジャンクション、膜貫通ドメインと共刺激ドメインとの間のジャンクション、および共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間のジャンクション（図3Aおよび3Bを参照すること）という、ヒト配列に由来する異なるドメインの間の3つのジャンクションを含有していた（それらのジャンクションは、ヒト対象への投与時のCARに対する可能性のある免疫原性の部位を表していた可能性がある）。 Example 2: Insilico analysis of the binding of peptides derived from the junction region of CAR to HLA class I and HLA class II MHC binding affinity for each of the set of overlapping peptide sequences within an exemplary portion of the CAR sequence. A T cell epitope prediction tool available from the Immunoe Epitope Database and analysis resource (IEDB) was used for incilico analysis to predict sex and other properties related to potential immunogenicity. The moieties included a spacer with an immunoglobulin-derived hinge domain, a human CD28 transmembrane domain, a human 4-1BB co-stimulation domain, and a human CD3ζ signaling domain. In the assessed portion, the hinge domain is the human IgG4 hinge domain, the CD28 transmembrane domain contains the sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the 4-1BB co-stimulation domain is shown in SEQ ID NO: 3. It contained the sequence that was created. Thus, this portion is the junction between the spacer region and the transmembrane domain, the junction between the transmembrane domain and the co-stimulation domain, and the junction between the co-stimulation domain and the intracellular signaling domain (Fig. 3A and). It contained three junctions between different domains derived from the human sequence (see 3B) (these junctions are potential immunogenic sites for CAR when administered to human subjects). May have represented).

T細胞へ提示される可能性を高める特定の特性を有し得る配列の部分を同定するため、27種の個々のHLAクラスI対立遺伝子および56種の個々のHLAクラスII対立遺伝子との結合の親和性を、それぞれ、（9アミノ酸長結合コアを含有している）8～14アミノ酸長および15アミノ酸長の部分の長さに沿ったオーバーラップペプチドについて予測した。集合的には世界中の集団の99％超に存在するHLA対立遺伝子を表すこれらの対立遺伝子、および米国集団におけるそれらのおよその頻度が、表1Aおよび1Bにリストされる。 For binding to 27 individual HLA class I alleles and 56 individual HLA class II alleles to identify parts of the sequence that may have specific properties that increase the likelihood of being presented to T cells. Affinities were predicted for overlapping peptides along the length of the 8-14 amino acid long and 15 amino acid long moieties (containing a 9 amino acid long binding core), respectively. Collectively, these alleles, which represent HLA alleles present in more than 99% of the population worldwide, and their approximate frequency in the US population are listed in Tables 1A and 1B.

（表１Ａ）HLAクラスI

(Table 1A) HLA class I

（表１Ｂ）HLAクラスII

(Table 1B) HLA class II

ANNを使用したデータセットにおいて、各8～14アミノ酸ペプチドについてHLAクラスI分子との結合についてのIC50値を予測するため、IEDBから入手可能なアルゴリズムに基づくT細胞エピトープ予測ツールを使用し（Nielsen et al.(2003)Protein Sci.,12:1007-1017およびLundegaard et al.(2008)NAR,36:W509-512）、いくつかのケースにおいては、SMM（Peters and Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132）およびcomblib（Sidney et al.(2008)Immuno Res.4:2）またはコンセンサスツール（Kim,et al.(2012)Immune epitope database analysis resource、NARを参照すること（上記のいずれかからの予測の組み合わせ））を使用した1種または複数種の付加的な予測を使用した。データセット中の各15アミノ酸ペプチドについて、HLAクラスIIとの結合についてのIC50値を、NetMHCIIpan法（Karosiene et al.(2013)Immunogenetics 65(10):711；Nielsen et al.(2008)PLoS Comput Biol.4(7)e1000107）を使用して予測した。CARアミノ酸配列の部分の中の各々の個々の位置について、その位置を含み、50nm未満の予測IC50でクラスIまたはクラスIIの対立遺伝子のいずれかと結合すると予測されたデータセット中の配列の総数を決定した。図4A（HLAクラスI）および4B（HLAクラスII）は、それぞれ、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子についての結果を示し、集団内の個々のHLA対立遺伝子の頻度によって重み付けされた、決定されたた総数に基づく、配列の長さに沿ったポジショナルカバレッジ（positional coverage）を示している。査定された領域全体の曲線下面積（AUC）は、およそ、HLAクラスI結合について1321、HLAクラスII結合について2943であった。膜貫通-共刺激ドメイン領域についてのAUCは、およそ、HLAクラスI結合について931、HLAクラスII結合について2212であった。 In a dataset using ANN, we used an algorithm-based T cell epitope prediction tool available from IEDB to predict IC50 values for binding to HLA class I molecules for each 8-14 amino acid peptide (Nielsen et. al. (2003) Protein Sci., 12: 1007-1017 and Lundegaard et al. (2008) NAR, 36: W509-512), in some cases SMM (Peters and Sette (2005) BMC Bioinformatics, 6) : 132) and comblib (Sidney et al. (2008) Immuno Res. 4: 2) or consensus tool (Kim, et al. (2012) Immuno epitope database analysis resource, NAR (from any of the above). A combination of predictions)) was used for one or more additional predictions. For each 15 amino acid peptide in the dataset, the IC50 value for binding to HLA class II was determined by the NetMHCIIpan method (Karosiene et al. (2013) Immunogenetics 65 (10): 711; Nielsen et al. (2008) PLoS Comput Biol. Predicted using .4 (7) e1000107). For each individual position within the portion of the CAR amino acid sequence, the total number of sequences in the dataset containing that position and predicted to bind to either a Class I or Class II allele with a predicted IC50 of less than 50 nm. Were determined. Figures 4A (HLA Class I) and 4B (HLA Class II) show results for class I and class II alleles, respectively, and were weighted and determined by the frequency of individual HLA alleles in the population. It shows the positional coverage along the length of the sequence based on the total number. The area under the curve (AUC) for the entire assessed region was approximately 1321 for HLA class I bindings and 2943 for HLA class II bindings. The AUC for the transmembrane-costimulation domain region was approximately 931 for HLA class I binding and 2212 for HLA class II binding.

図4Aおよび4Bに示されるように、配列のいくつかの部分が、MHC複合体に強く結合し、従って、T細胞による可能性のある認識のためのエピトープとして提示される可能性がより高い断片を含有していることが、この方法によって予測された。HLA対立遺伝子に対する結合親和性は、単独では、必ずしも免疫原性を予測しない。この例示的なCARの個々のドメイン（例えば、膜貫通、共刺激）はヒト由来であるため、（通常は互いに関連していない複数の領域にかかり、かつ/またはそのような領域の間のジャンクションを含むエピトープとは対照的に）ヒト対象への投与時に、これらの個々の領域のいずれかの中の単独のエピトープに対して免疫原性応答が発達する可能性は低かった。例えば、MHC分子に強く結合し、MHC分子の状況において提示されると予測されたペプチドについても、ペプチドが完全に内在性タンパク質に由来する場合、それは「自己」と認識され、従って、生産的な免疫応答を誘導し得ない。例えば、実施例1に記載された結果において、完全に単一の膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインの中にあるいくつかの領域は、HLA結合親和性予測において高スコアであったが、類似したCAR配列のこれらのドメインのいずれかの中の単独のペプチド配列に対して、免疫応答は検出されなかった。従って、様々な「ホットスポット」が予測HLA結合親和性に関して観察されたが、その後の査定および改変は、より高い予測IC50値を有するのみならず、2種の異なるタンパク質に由来する異なるドメインの間のジャンクションにかかる、可能性のあるエピトープを含む区域に焦点を当てた。 As shown in Figures 4A and 4B, some parts of the sequence bind strongly to the MHC complex and are therefore more likely to be presented as epitopes for possible recognition by T cells. Was predicted by this method. Binding affinity for HLA alleles alone does not necessarily predict immunogenicity. Since the individual domains of this exemplary CAR (eg, transmembrane, co-stimulation) are of human origin, they span multiple regions (usually not related to each other and / or junctions between such regions). When administered to a human subject (as opposed to an epitope containing), it was unlikely that an immunogenic response would develop for a single epitope within any of these individual regions. For example, a peptide that binds strongly to an MHC molecule and is predicted to be presented in the context of an MHC molecule is also recognized as "self" if the peptide is entirely derived from an endogenous protein and is therefore productive. Cannot induce an immune response. For example, in the results described in Example 1, some regions within a completely single transmembrane domain or cytoplasmic domain had high scores in HLA binding affinity prediction, but similar CAR sequences. No immune response was detected for a single peptide sequence in any of these domains. Thus, although various "hot spots" were observed for predicted HLA binding affinity, subsequent assessments and modifications not only have higher predicted IC50 values, but also between different domains derived from two different proteins. Focused on the area containing the potential epitopes at the junction of.

具体的には、例示的なCARのCD28膜貫通ドメインと4-1BBシグナル伝達ドメインとのジャンクションにかかる、1種または複数種の可能性のあるペプチドエピトープを含むジャンクション領域を、さらに査定した。例示的なヒトCD28膜貫通ドメイン（SEQ ID NO:2）および例示的なヒト4-1BB共刺激ドメイン（SEQ ID NO:3）を含むSEQ ID NO:5に示された配列に関して、査定されたジャンクション領域は、以下のようなCD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインにかかるジャンクションの両側の13アミノ酸を含有していた：

（26アミノ酸ジャンクション領域は太字で示され、ドメインの間のジャンクションのすぐC'側およびN'側の2個のアミノ酸は下線で示される）。査定された26アミノ酸ジャンクション領域は、SEQ ID NO:137に示され、SEQ ID NO:5に示されたアミノ酸の配列のアミノ酸残基15～40に相当する。 Specifically, the junction region containing one or more possible peptide epitopes involved in the junction of the exemplary CAR CD28 transmembrane domain with the 4-1BB signaling domain was further assessed. Assessed for the sequences shown in SEQ ID NO: 5, including an exemplary human CD28 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2) and an exemplary human 4-1BB co-stimulation domain (SEQ ID NO: 3). The junction region contained 13 amino acids on both sides of the junction across the CD28 transmembrane domain and the 4-1BB co-stimulation domain, including:

(The 26 amino acid junction region is shown in bold, and the two amino acids immediately C'and N'side the junction between domains are underlined). The assessed 26 amino acid junction region corresponds to amino acid residues 15-40 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 137 and in the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 5.

クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子に高いIC50値で結合すると予測され、従って、この領域を含有しているCARに対する免疫原性を誘導する可能性を低下させる可能性が高いペプチド断片をもたらす、SEQ ID NO:137に示された26アミノ酸ジャンクション領域の中の1個または複数個のアミノ酸修飾（変異）を同定するため、インシリコモデリングを実施した。具体的には、（SEQ ID NO:5のナンバリングに基づく28位、31位、および34位に相当するアミノ酸位置における1個または複数個の変異に相当する）SEQ ID NO:137のナンバリングに基づく14位、17位、および20位に相当するアミノ酸位置における1個または複数個の変異を含有しているジャンクション領域のバリアントペプチド断片について予測を行った。この例示的な研究においては、エピトープ全体の全ての可能な単一アミノ酸置換を予測IC50値に対する影響について調査する、全ての高親和性エピトープのインシリコ変異誘発および結合予測の後、これらの残基がさらなる分析のために選択された。より大きいIC50予測（結合の減少）をもたらす残基を同定し、前記の残基を、置換に感受性があるものとして同定した。 SEQ which is predicted to bind to class I and class II alleles at high IC50 values and thus results in a peptide fragment that is likely to reduce the likelihood of inducing immunogenicity to CAR containing this region. Insilico modeling was performed to identify one or more amino acid modifications (mutations) in the 26 amino acid junction region indicated by ID NO: 137. Specifically, it is based on the numbering of SEQ ID NO: 137 (corresponding to one or more mutations at amino acid positions corresponding to positions 28, 31, and 34 based on the numbering of SEQ ID NO: 5). Predictions were made for variant peptide fragments in the junction region containing one or more mutations at amino acid positions corresponding to positions 14, 17, and 20. In this exemplary study, all possible single amino acid substitutions across the epitope are predicted. After in silico mutagenesis and binding prediction of all high affinity epitopes, these residues are investigated for their effect on IC50 values. Selected for further analysis. Residues that resulted in a greater IC50 prediction (decreased binding) were identified and the aforementioned residues were identified as sensitive to substitution.

査定された位置における1個または複数個のアミノ酸置換を各々含有している一連の異なるバリアントジャンクション領域を、例示的なCAR配列の中の非変異ジャンクション領域と比較して査定した。膜貫通領域または共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかの構造または機能に対して破壊的である可能性の低い、同定された位置におけるアミノ酸置換の例示的なサブセットを選択した。エピトープはオーバーラップしているため、一度に複数種のエピトープに影響することができる可能性のある置換も選択した。具体的には、個々のバリアントジャンクション領域は、以下の修飾（アミノ酸置換）を含有していた：SEQ ID NO:5のナンバリングに基づく、K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R32A、R31H、R31L、R31N、L34A、L34S、K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S。 A series of different variant junction regions, each containing one or more amino acid substitutions at the assessed positions, were assessed in comparison to the non-mutant junction region in the exemplary CAR sequence. An exemplary subset of amino acid substitutions at identified positions was selected that are unlikely to be disruptive to the structure or function of either the transmembrane domain or the co-stimulation signaling domain. Since the epitopes overlap, we also selected substitutions that may affect multiple epitopes at once. Specifically, the individual variant junction regions contained the following modifications (amino acid substitutions): K28A, K28H, K28L, K28Q, K28S, R32A, R31H, R31L based on the SEQ ID NO: 5 numbering. , R31N, L34A, L34S, K28Q / R31A, K28Q / R31N, K28Q / R31S, K28Q / L34A, K28Q / L34S, R31N / L34A, R31N / L34S, K28Q / R31N / L34A, K28Q / R31N / L34S.

IEDBから入手可能なT細胞エピトープ予測ツールを使用して、非バリアントジャンクション領域およびバリアントジャンクション領域について、重み付き免疫原性スコアを、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子について入手した。それぞれの（バリアントまたは非バリアント）26アミノ酸ジャンクション領域の中の（個々に27種のHLAクラスI対立遺伝子の各々のための）一連の8アミノ酸長～14アミノ酸長オーバーラップペプチドおよび（個々に56種のHLAクラスII対立遺伝子の各々のための）一連の15アミノ酸長オーバーラップペプチドの各々について、予測IC50値を使用してスコアを導出し、個々のHLAクラスIおよびクラスIIの対立遺伝子の集団内の相対頻度に基づき重み付けした。より高い相対スコアは、より高度の予測される結合を示す。 Weighted immunogenicity scores for non-variant junction regions and variant junction regions were obtained for class I and class II alleles using the T cell epitope prediction tool available from IEDB. A series of 8-amino acid-long to 14-amino acid-long overlapping peptides (for each of the 27 HLA Class I alleles individually) within each (variant or non-variant) 26-amino acid junction region and 56 individually. Scores are derived using predicted IC50 values for each of the 15 amino acid length overlap peptides (for each of the HLA class II alleles) within the individual HLA class I and class II allele populations. Weighted based on the relative frequency of. Higher relative scores indicate a higher degree of predicted binding.

結果は図5に示される。結果は、領域の中のアミノ酸を修飾することによって、CARジャンクション領域の中の全体的な予測HLAクラスI免疫原性スコアを減少させることが可能であることを証明している。結果は、HLAクラスII結合についての予測免疫原性スコアの実質的な増加をもたらすことなく、予測されたHLAクラスI結合親和性を低下させ（従って、予測免疫原性スコアを低下させ）ることが可能であることも確認する。従って、一般に、結果は、CARのCD28膜貫通ドメインと4-1BB共刺激ドメインとの間のジャンクションにかかる領域の中にアミノ酸修飾を作成し、この領域を有するが、この領域に修飾または修飾の組み合わせを含有している受容体と同じキメラ受容体のヒト対象への投与時の免疫原性の可能性の低下に一致するであろうヒトHLA結合についての予測親和性の全体的な低下を達成し得ることを示した。 The results are shown in Figure 5. The results demonstrate that it is possible to reduce the overall predicted HLA class I immunogenicity score within the CAR junction region by modifying the amino acids within the region. The result is to reduce the predicted HLA class I binding affinity (and thus the predicted immunogenicity score) without resulting in a substantial increase in the predicted immunogenicity score for HLA class II binding. Also confirm that is possible. Thus, in general, the result is to create an amino acid modification within the region of the junction between the CD28 transmembrane domain of CAR and the 4-1BB co-stimulation domain, and to have this region, but to modify or modify this region. Achieved an overall reduction in predictive affinity for human HLA binding that would be consistent with a reduction in the likelihood of immunogenicity upon administration of the same chimeric receptor to a human subject as the receptor containing the combination. Shown that it can be done.

実施例3：CARのジャンクション領域に由来するペプチドのHLAクラスIとの結合についてのインシリコ分析とインビトロ結合との比較
CD28と4-1BBとのジャンクションにかかる26アミノ酸ジャンクション領域の部分の中の例示的なオーバーラップ9アミノ酸ペプチド配列について、いくつかのHLAクラスI対立遺伝子（A^*02:01、A^*03:01、A^*11:01、およびB^*08:01）に対する実際の結合親和性を、インビトロで査定した。具体的には、CD28膜貫通ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインのドメイン間のジャンクション（下線で示された2個のアミノ酸を接合している結合）にかかる部分を含有している（SEQ ID NO:7に示される）配列VAFIIFWVKRGRKKLLに由来する一連のオーバーラップ9アミノ酸ペプチドを査定した。さらに、実施例2に記載されるような、この領域における変異を各々含有している、この部分の多数の異なるバリアントの各々の一連のオーバーラップ9アミノ酸ペプチドも、査定した。 Example 3: Comparison of in silico analysis and in vitro binding for binding of peptides derived from the junction region of CAR to HLA class I
Several HLA Class I alleles (A ^* 02: 01, A ^* 03: 01) for an exemplary overlapping 9 amino acid peptide sequence within the portion of the 26 amino acid junction region at the junction of CD28 and 4-1BB. , A ^* 11:01, and B ^* 08:01) were assessed in vitro. Specifically, it contains a junction (SEQ ID NO) between the domains of the CD28 transmembrane domain and the 4-1BB co-stimulation domain (the binding that joins the two amino acids underlined). A series of overlapping 9 amino acid peptides derived from the sequence VAFIIFW VK RGR KKLL (shown in: 7) was assessed. In addition, a series of overlapping 9 amino acid peptides for each of the many different variants of this moiety, each containing a mutation in this region, as described in Example 2, were also assessed.

様々な9アミノ酸長オーバーラップペプチドを合成し、それらの純度をMALDI-TOF質量分析によって試験した。次いで、各ペプチドが3成分MHCペプチド複合体を安定化することができる程度を測定するハイスループット結合アッセイであるREVEAL Epitope Discovery System（ProImmune,Oxford,United Kingdom）を使用して、結合特性を査定するため、合成ペプチドを組換えMHC分子と共にインキュベートした。各ペプチドを、HLAクラスI対立遺伝子の各々に関してこの能力について別々に試験し、陽性対照（関連対立遺伝子についての既知のT細胞エピトープ）について観察された程度に対してノーマライズした。結果は、100％に設定された陽性対照ペプチドに対して結合がノーマライズされたスコアとして報告される。この分析においては、50を越えるスコアを、一般に、強いまたは高親和性の結合を表すと見なした。 Various 9 amino acid length overlap peptides were synthesized and their purity was tested by MALDI-TOF mass spectrometry. Binding properties are then assessed using the REVEAL Epitope Discovery System (ProImmune, Oxford, United Kingdom), a high-throughput binding assay that measures the extent to which each peptide can stabilize a three-component MHC peptide complex. Therefore, synthetic peptides were incubated with recombinant MHC molecules. Each peptide was tested separately for this ability for each of the HLA class I alleles and normalized to the extent observed for positive controls (known T cell epitopes for related alleles). Results are reported as a score with normalized binding to a positive control peptide set to 100%. In this analysis, scores above 50 were generally considered to represent strong or high affinity binding.

実施例2に記載されたようなインシリコ予測法を使用して同一のペプチド:MHC複合体の結合について入手された予測結合（IC50）値と、結果を比較した。予測された最大IC50値が約50,000であったため、IC50値を対数変換し、LOG(50000)から差し引き、LOG(50000)で割って、ノーマライズされたインシリコスコアを得た（(Log(50000) - logIC50)/log(50000)）。この分析においては、2.0より大きいインシリコ結合予測スコアを、一般に、予測された強いまたは高親和性の結合を表すと見なした。 Results were compared to the predicted binding (IC50) values obtained for binding of the same peptide: MHC complex using in silico prediction methods as described in Example 2. Since the predicted maximum IC50 value was about 50,000, the IC50 value was logarithmically converted, subtracted from LOG (50000), and divided by LOG (50000) to obtain a normalized in silico score ((Log (50000)-). logIC50) / log (50000)). In this analysis, in silico binding prediction scores greater than 2.0 were generally considered to represent predicted strong or high affinity binding.

結果は、表2A（HLA-A^*02:01およびHLA-A^*03:01）ならびに表2B（HLA-A^*11:01およびHLA-B^*08:01）に示される。一般に、インシリコ結合予測は、実際のインビトロ結合結果を予測する。いくつかのケースにおいて、比較的高い結合がインシリコで予測されるが、インビトロアッセイにおいては観察されない。 The results are shown in Table 2A (HLA-A ^* 02:01 and HLA-A ^* 03:01) and Table 2B (HLA-A ^* 11:01 and HLA-B ^* 08:01). In silico binding predictions generally predict actual in vitro binding results. In some cases, relatively high binding is predicted in silico, but not observed in in vitro assays.

結果は、インビトロアッセイにおいて測定される親和性を一般に予測する、予測結合親和性と一致していた。さらに、結果は、ジャンクション領域の中の修飾によるHLAに対する結合親和性の成功した低下を証明し、同一の残基を含有しているオーバーラップエピトープのうちのもう1種に対する結合親和性を増加させることなく（または低下させつつ）、可能性のあるオーバーラップエピトープのうちの1種の予測または実際の結合親和性またはスコアの低下をもたらすよう、配列を修飾することが可能であることを証明した。いくつかの態様において、そのような変異または修飾は、特に有利であり得る。結果の非限定的な例として、SEQ ID NO:5に示されたナンバリングに基づく修飾K29L、R31H、L34S、および/またはL34Aは、一般に、もう1種のHLA対立遺伝子に対するより高い結合親和性をもたらすことなく、かつ/またはもう1種のペプチドに対するより高い結合親和性をもたらすことなく、少なくとも1種のHLA対立遺伝子および/または査定された領域の中の少なくとも1種のペプチドについて予測または実際の結合親和性またはスコアの低下をもたらした。 The results were consistent with the predictive binding affinity, which generally predicts the affinity measured in the in vitro assay. In addition, the results demonstrate a successful reduction in binding affinity for HLA by modification within the junction region and increase binding affinity for another of the overlapping epitopes containing the same residue. It has been demonstrated that the sequence can be modified without (or while reducing) to result in a predicted or actual binding affinity or reduction in score for one of the possible overlapping epitopes. .. In some embodiments, such mutations or modifications may be particularly advantageous. As a non-limiting example of the results, the numbering-based modifications K29L, R31H, L34S, and / or L34A shown in SEQ ID NO: 5 generally have higher binding affinity for another HLA allele. Predicted or actual for at least one HLA allele and / or at least one peptide in the assessed region without resulting and / or resulting in higher binding affinity for another peptide. It resulted in a decrease in binding affinity or score.

（表２Ａ）バリアントペプチドのインシリコおよびインビトロのMHC結合

(Table 2A) In silico and in vitro MHC binding of variant peptides

（表２Ｂ）バリアントペプチドのインシリコおよびインビトロのMHC結合

(Table 2B) In silico and in vitro MHC binding of variant peptides

実施例4：CARのジャンクション領域に由来するペプチドのHLA-A2:01との結合についての分析
免疫原性応答を誘導することができる可能性のあるCAR由来ペプチドを同定するため、CARのCD28膜貫通ドメインと4-1BB共刺激ドメインとの間のジャンクションを含有している非バリアント（参照）配列の中の一連のオーバーラップペプチドをインシリコで査定した。結合についての親和性を予測するためのインシリコ分析を使用して、一般的なヒトMHCクラスI分子（HLA-A2:01）のペプチド溝に対する結合親和性を予測するため、アルゴリズムを使用した。図3に示されるように、CARの査定された部分は、下線によって示されたドメインのジャンクションにかかる残基と共に(SEQ ID NO:2に示された）CD28膜貫通ドメインの一部および(SEQ ID NO:3に示された）4-1BB共刺激ドメインの一部を含有している(SEQ ID NO:6に示された）配列

を有していた。予測されたHLA-A2:01結合親和性を、SEQ ID NO:6に示された配列の8～14アミノ酸の一連の140種のオーバーラップペプチドについてインシリコで査定した。ペプチドのうちの35種は、膜貫通ドメイン部分に由来する配列のみを含有しており；ペプチドのうちの35種は、共刺激ドメイン部分に由来する配列のみを含有しており、ペプチドのうちの70種は、ドメイン間のジャンクションを架橋するアミノ酸残基を含有しているジャンクションまたは融合領域の配列を有していた。この査定のため、0nM～50nMの解離定数でHLA-A2:01に結合すると予測されたペプチド断片を、高い親和性で結合すると予測されるものと見なした。51nM～1000nMの解離定数で結合すると予測されたペプチド断片を、低い親和性で結合すると予測されるものと見なした。1000nM～5000nMの予測親和性で結合すると予測されたペプチド断片を、極めて低い親和性で結合すると予測されるものと見なした。結果は図3に提示される。 Example 4: Analysis of binding of peptides derived from the junction region of CAR to HLA-A2: 01 To identify CAR-derived peptides that may be able to induce an immunogenic response, the CD28 membrane of CAR A series of overlapping peptides in a non-variant (reference) sequence containing a junction between the transmembrane domain and the 4-1BB co-stimulation domain was assessed in silico. An algorithm was used to predict the binding affinity for the peptide groove of a common human MHC class I molecule (HLA-A2: 01) using in silico analysis to predict binding affinity. As shown in Figure 3, the assessed portion of the CAR is part of the CD28 transmembrane domain (indicated by SEQ ID NO: 2) and part of the CD28 transmembrane domain (indicated by SEQ ID NO: 2), along with residues at the junction of the domain indicated by the underline. Sequence containing part of the 4-1BB co-stimulation domain (shown in ID NO: 3) (shown in SEQ ID NO: 6)

Had. The predicted HLA-A2: 01 binding affinity was assessed in silico for a series of 140 overlapping peptides of 8-14 amino acids in the sequence shown in SEQ ID NO: 6. Thirty-five of the peptides contain only sequences derived from the transmembrane domain portion; 35 of the peptides contain only sequences derived from the co-stimulating domain portion and of the peptides. Seventy species had sequences of junctions or fusion regions containing amino acid residues that bridge the junctions between domains. For this assessment, peptide fragments predicted to bind to HLA-A 2:01 with a dissociation constant of 0 nM to 50 nM were considered to bind with high affinity. Peptide fragments predicted to bind with a dissociation constant of 51 nM to 1000 nM were considered to bind with low affinity. Peptide fragments predicted to bind with a predicted affinity of 1000 nM to 5000 nM were considered to bind with very low affinity. The results are presented in Figure 3.

図3に示されるように、ドメイン間のジャンクションにかかるオーバーラップ領域を含む配列を各々含有している、この領域の参照配列に由来するペプチドのうちの2種が、HLA-A2:01に対する低い結合親和性を示すと予測された。具体的には、配列

を有する14アミノ酸長ペプチドが、294nMの解離定数で結合すると予測され、

の配列を有する13アミノ酸長ペプチドが、618nMの解離定数で結合すると予測された。これらのペプチドは、各々、SEQ ID NO:1に示され、実施例1において同定された15アミノ酸長ペプチドの部分を含んでいた。この配列の中のより短い8アミノ酸長～12アミノ酸長ペプチドは、HLA-A2:01との結合を示すと予測されなかった。アミノ酸配列

を含有しているもう一つの13アミノ酸長ペプチドは、およそ3000nMの予測解離定数を有する極めて低い結合親和性を有すると予測された。2個のドメインの間のジャンクションを架橋する残りの断片は、いずれも、このアッセイによって、HLA-A2:01に対する結合親和性を示すと予測されなかった（全てが、5000nMよりはるかに大きく、ほとんどのケースにおいて、14,000nmより高いかまたは20,000nM以上の予測解離定数を有していた）。HLA-A2:01と結合すると予測されたペプチドの各々において、2個のジャンクションにかかる残基（VK）は、いずれも、それ自体、アンカー残基であると予測されず；むしろ、そのようなペプチドは、隣接しない位置にこれらの残基を含有していた。 As shown in FIG. 3, two of the peptides derived from the reference sequence of this region, each containing a sequence containing overlapping regions that span junctions between domains, are low relative to HLA-A2: 01. It was predicted to show binding affinity. Specifically, an array

A 14 amino acid long peptide with is predicted to bind with a dissociation constant of 294 nM,

A 13 amino acid long peptide with the sequence of was predicted to bind with a dissociation constant of 618 nM. Each of these peptides was indicated by SEQ ID NO: 1 and contained a portion of the 15 amino acid long peptide identified in Example 1. Shorter 8-amino acid-long to 12-amino acid-long peptides in this sequence were not predicted to exhibit binding to HLA-A2: 01. Amino acid sequence

Another 13 amino acid long peptide containing is predicted to have a very low binding affinity with a predicted dissociation constant of approximately 3000 nM. None of the remaining fragments bridging the junction between the two domains were predicted to show binding affinity for HLA-A2: 01 by this assay (all much larger than 5000 nM and most). In this case, it had a predicted dissociation constant higher than 14,000 nm or greater than 20,000 nM). In each of the peptides predicted to bind to HLA-A2: 01, neither of the residues (VKs) across the two junctions is predicted to be an anchor residue in itself; rather, such. The peptide contained these residues at non-adjacent positions.

膜貫通ドメインに由来する配列のみを含有しているペプチドのうちのおよそ15種は、5000nM未満のHLA-A2:01に対する解離定数を有すると予測された。共刺激ドメインに由来する配列のみを含有している2種のペプチドは、5000nM未満のHLA-A2:01結合についての解離定数を有すると予測された。査定された配列の共刺激ドメインおよび膜貫通ドメインは、一般にヒト対象に対して免疫原性である可能性がより低い、内在性ヒト配列に由来する。例えば、実施例1に記載された研究において、CARのこれらのドメインのいずれかの中のペプチド配列に特異的な免疫応答は検出されなかった。従って、ジャンクション領域にかかる配列を含有しているペプチドのバリアントを査定した。 Approximately 15 of the peptides containing only sequences from the transmembrane domain were predicted to have a dissociation constant for HLA-A 2:01 <5000 nM. The two peptides containing only sequences from the co-stimulation domain were predicted to have a dissociation constant for HLA-A2: 01 binding below 5000 nM. The co-stimulatory and transmembrane domains of the assessed sequences are derived from endogenous human sequences, which are generally less likely to be immunogenic to human subjects. For example, in the study described in Example 1, no immune response specific to the peptide sequence in any of these domains of CAR was detected. Therefore, a variant of the peptide containing the sequence over the junction region was assessed.

HLA-A2:01に対する低下した結合親和性および/またはこのHLA対立遺伝子を有するヒト対象における低下した免疫原性を有すると予測されるバリアントペプチドを生成するため、SEQ ID NO:6に示された配列と比較して、ジャンクション領域に変異を含有しているバリアント配列を、インシリコで生成した。（非アンカー位置に）ジャンクションにかかる「VK」残基を含有しているペプチドは、HLA-A2:01に対する高い結合親和性を示すと予測されたため、CD28膜貫通ドメインと4-1BB共刺激ドメインとの間のジャンクションに2個のアスパラギン残基を挿入した。バリアントは、（SEQ ID NO:13に示された）配列

（アスパラギン残基の挿入によって生成されたジャンクションに隣接する配列は、下線で示される）を含有していた。SEQ ID NO:13の例示的なバリアント配列を、同一の予測法によって査定した。このバリアント配列について予測結合親和性を査定するため、SEQ ID NO:13に示された配列の8～14アミノ酸の一連の154種のオーバーラップする断片を、前記のようなインシリコ分析によって査定した。35種のペプチドは膜貫通部分の配列のみを有し、35種のペプチドは共刺激ドメイン部分の配列のみを有し、84種のペプチドは挿入されたアスパラギン残基の一方または両方を含むドメインを架橋するアミノ酸を含有しているジャンクション領域配列を含有していた。 Presented in SEQ ID NO: 6 to produce a variant peptide that is predicted to have reduced binding affinity for HLA-A2: 01 and / or reduced immunogenicity in human subjects with this HLA allele. Variant sequences containing mutations in the junction region compared to the sequences were generated at incilico. Peptides containing "VK" residues at junctions (at non-anchor positions) were predicted to exhibit high binding affinity for HLA-A2: 01, so the CD28 transmembrane domain and 4-1BB co-stimulation domain. Two asparagine residues were inserted in the junction between and. The variant is the sequence (shown in SEQ ID NO: 13)

(The sequence adjacent to the junction generated by the insertion of the asparagine residue is underlined). An exemplary variant sequence of SEQ ID NO: 13 was assessed by the same prediction method. To assess the predictive binding affinity for this variant sequence, a series of 154 overlapping fragments of 8-14 amino acids of the sequence shown in SEQ ID NO: 13 were assessed by in silico analysis as described above. Thirty-five peptides have only the transmembrane sequence, 35 peptides have only the costimulatory domain moiety sequence, and 84 peptides have domains containing one or both of the inserted asparagine residues. It contained a junction region sequence containing amino acids to be crosslinked.

結果は図3に示される。示されるように、全体として、ジャンクションを含有しているバリアント領域の中のオーバーラップペプチドのHLA-A2:01結合親和性は、集合的に、非バリアント配列と比較して、実質的に低下していた。具体的には、免疫原性であると以前に予測されたジャンクション領域の部分におけるペプチドのHLA-A2:01との結合についての予測解離定数は、実質的に低下していた。例えば、それぞれSEQ ID NO:10および11に示される同定されたペプチドと比較して、改変された隣接残基を含むペプチドバリアント

は、HLA-A2:01との検出可能な結合親和性を示さないと予測された。2種の14アミノ酸ペプチド

は、1000nM～5000nMの範囲内の極めて低い結合親和性を示すこのHLAとの結合についての解離定数を示すと予測された。修飾されたジャンクション領域配列を含有している他の全てのペプチドは、5000nMより大きく、大部分のケースにおいて、14,000nMより高いかまたは20,000nM以上の解離定数を示すと予測され、従って、この査定によってHLA-A2:01に対する結合親和性を示すと予測されなかった。さらに、ジャンクション領域配列の修飾は、共刺激ドメインまたは膜貫通ドメインの領域の中に、HLA-A2:01に対するより高い結合親和性を有すると予測される新しいペプチドを作出しなかった。 The results are shown in Figure 3. As shown, overall, the HLA-A2: 01 binding affinity of the overlapping peptides in the junction-containing variant region is collectively substantially reduced compared to the non-variant sequence. Was there. Specifically, the predicted dissociation constant for the peptide's binding to HLA-A2: 01 at a portion of the junction region previously predicted to be immunogenic was substantially reduced. For example, peptide variants containing modified flanking residues compared to the identified peptides shown in SEQ IDs NO: 10 and 11, respectively.

Was predicted to show no detectable binding affinity for HLA-A2: 01. Two 14-amino acid peptides

Was predicted to show a dissociation constant for binding to this HLA, which has a very low binding affinity in the range of 1000 nM to 5000 nM. All other peptides containing a modified junction region sequence are expected to exhibit dissociation constants greater than 5000 nM and, in most cases, greater than 14,000 nM or greater than 20,000 nM, and thus this assessment. Was not predicted to show binding affinity for HLA-A2: 01. In addition, modification of the junction region sequence did not create a new peptide in the region of the co-stimulation domain or transmembrane domain that was predicted to have a higher binding affinity for HLA-A2: 01.

実施例5：抗CD19 CARによって以前に処置された対象への抗CD22 CAR発現細胞の投与
再発性/難治性CD22⁺B細胞急性リンパ芽球性白血病（ALL）を有する6人の対象へ、抗CD22キメラ抗原受容体（CAR）を発現する自己T細胞を投与した。CARは、ヒト抗CD22 scFv抗体、CD8α膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。 Example 5: Administration of anti-CD22 CAR-expressing cells to subjects previously treated with anti-CD19 CAR Anti-CD22 ⁺ B-cell anti-CD22 to 6 subjects with acute lymphoblastic leukemia (ALL) Autologous T cells expressing the CD22 chimeric antigen receptor (CAR) were administered. CAR contained a human anti-CD22 scFv antibody, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB intracellular signaling domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

全ての対象が、少なくとも1種の先の同種造血幹細胞移植を以前に受けたことがあり、かつ様々なCD19に対するCAR-T細胞治療のうちの1種による処置を受けたことがあった。対象のうちの5人は、CD19が検出されない（「CD19陰性」）ALLを再発しており、それ以外の1人の対象は、先のCD19 CAR療法に対する非応答者であった。 All subjects had previously received at least one previous allogeneic hematopoietic stem cell transplant and had been treated with one of the CAR-T cell therapies for various CD19s. Five of the subjects had relapsed ALL with no CD19 detected (“CD19 negative”), and one other subject was a non-responder to previous CD19 CAR therapy.

表3は、処置された患者の特徴を要約する。 Table 3 summarizes the characteristics of the treated patients.

（表３）患者の特徴

HCT：造血細胞移植 (Table 3) Patient characteristics

HCT: Hematopoietic cell transplantation

細胞の投与の前に、患者は、末梢血単核細胞（PBMC）を採集するための自己白血球アフェレーシスを受けた。CD3発現についてのイムノアフィニティに基づく濃縮によって、採集されたPBMCからT細胞を単離し、抗CD3/CD28ビーズの存在下で培養した後、抗CD22 CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入した。細胞を7～10日間培養した。対象は、-4日目、-3日目、および-2日目に、25mg/m²フルダラビンによる導入化学療法を受け、-2日目に900mg/m²シクロホスファミドを受けた（0日目に細胞注入）。各患者は、静脈注射によって、レシピエントの体重1kg当たり3×10⁵個の形質導入T細胞の最初のCAR T細胞用量を受けた。登録された2番目の対象が、用量規制毒性（DLT）の基準を満たすグレード3の下痢を発症したため、全部で6人の対象を処置するため、最初の用量レベルで用量拡大を行った。その後、この用量でDLTは見られなかった。2人の対象が、グレード1のサイトカイン放出症候群（CRS）を発症し、1人の対象が、グレード2のCRSを発症し、2人の対象において、CRSは存在しなかった。 Prior to administration of the cells, the patient underwent autologous leukocyte apheresis to collect peripheral blood mononuclear cells (PBMC). T cells were isolated from collected PBMCs by immunoaffinity-based enrichment for CD3 expression, cultured in the presence of anti-CD3 / CD28 beads, and then transduced with a lentiviral vector encoding anti-CD22 CAR. The cells were cultured for 7-10 days. Subjects received induction chemotherapy with 25 mg / m ² fludarabine on days -4, -3, and -2, and 900 mg / m ² cyclophosphamide on day -2 (0). Cell injection on the day). Each patient received an initial CAR T cell dose of 3 × 10 ⁵ transduced T cells per kg body weight of the recipient by intravenous injection. The second enrolled subject developed grade 3 diarrhea that met the criteria for dose-controlled toxicity (DLT), so dose expansion was performed at the first dose level to treat a total of 6 subjects. After that, no DLT was seen at this dose. Two subjects developed Grade 1 Cytokine Release Syndrome (CRS), one subject developed Grade 2 CRS, and two subjects had no CRS.

末梢血、骨髄、または脳脊髄液におけるCAR-T細胞の数を、CD22-Fcと共に細胞をインキュベートすることによって、処置後のいくつかの時点で決定した。増大が観察された患者については、約7日目から、末梢血、骨髄、および脳脊髄液において、CAR-T細胞増大の証拠が見られた。最大またはピークのCAR-T細胞増大は、一般に、注入後、約12日目～約15日目に観察された。表7は、処置された対象についての各試料における全T細胞に対する百分率としての、この査定期間に観察された抗CD22 CAR-T細胞の最大またはピークに対する百分率を示す。注入後28日目（+/-4日）に臨床的な応答を評価した。 The number of CAR-T cells in peripheral blood, bone marrow, or cerebrospinal fluid was determined at several time points after treatment by incubating the cells with CD22-Fc. For patients with observed growth, evidence of CAR-T cell growth was seen in peripheral blood, bone marrow, and cerebrospinal fluid from about day 7. Maximum or peak CAR-T cell proliferation was generally observed approximately 12 to approximately 15 days after injection. Table 7 shows the percentages of anti-CD22 CAR-T cells observed during this review period as a percentage of total T cells in each sample for treated subjects. A clinical response was assessed 28 days (+/- 4 days) after infusion.

表4に示されるように、結果は、CAR-T細胞増大の程度と一般に相関している応答と一致していた。CAR-T細胞の増大を示さないかまたは低い増大を示した3人の対象は、疾患進行の証拠も示した。2人の他の対象は安定（stable disease）を有し、1人はMRDを伴わない完全寛解を有することが観察された。この対象において、フローサイトメトリーによるCAR持続は、注入後47日目まで検出され、注入後3ヶ月間、寛解が維持された。結果は、抗CD19 CAR療法を以前に受けたことがあり（例えば、エピトープ/抗原喪失のため、非応答性になった）対象における、安全で、実現可能で、臨床的に活性な抗CD22 CAR T細胞療法を証明している。 As shown in Table 4, the results were consistent with responses that were generally correlated with the degree of CAR-T cell proliferation. Three subjects who showed no or low growth of CAR-T cells also showed evidence of disease progression. Two other subjects were observed to have stable disease and one had complete remission without MRD. In this subject, flow cytometric CAR persistence was detected up to 47 days post-injection and remission was maintained for 3 months post-injection. The results are safe, feasible, and clinically active anti-CD22 CAR in subjects who have previously received anti-CD19 CAR therapy (eg, become unresponsive due to epitope / antigen loss). Proving T cell therapy.

（表４）処置応答

PB：末梢血；CSF：脳脊髄液；CRS：サイトカイン放出症候群；PD：進行（progressive disease）：MRD：微小残存病変；CR：完全寛解；SD：安定。 (Table 4) Treatment response

PB: Peripheral blood; CSF: Cerebrospinal fluid; CRS: Cytokine release syndrome; PD: Progressive disease: MRD: Minimal error; CR: Complete remission; SD: Stable.

本発明は、本発明の個々の局面の例示に過ぎないものとして意図される本明細書に開示された態様によって、その範囲を制限されず、機能的に等価である任意のものが、本発明の範囲に含まれる。本明細書に記載されたものに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する様々な修飾が、上記の説明および教示から、当業者に明白になり、同様に、本発明の範囲に含まれることが意図される。そのような修飾またはその他の態様は、本発明の真の範囲および本旨を逸脱することなく実施され得る。 The present invention is not limited in scope and is functionally equivalent by any of the aspects disclosed herein intended to be merely exemplary of the individual aspects of the invention. Is included in the range of. In addition to those described herein, various modifications to the models and methods of the invention will be apparent to those of skill in the art from the above description and teaching and are also within the scope of the invention. Intended. Such modifications or other embodiments may be carried out without departing from the true scope and spirit of the invention.

（表５）配列

(Table 5) Array

Claims

第1のキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置のための医薬の製造のための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞を含む組成物の使用であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した第1の抗原に特異的に結合し、ここで、該第1の抗原が、CD19であり；
第2のCARが、CD22である該疾患もしくは状態に関連した第2の抗原に特異的に結合し；
第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含み；
該疾患もしくは状態が、白血病またはリンパ腫であり；かつ
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現するT細胞の投与の後に該対象において再発している、使用。 Expressing a second chimeric antigen receptor (CAR) for the production of drugs for the treatment of diseases or conditions in subjects previously treated by T cells expressing the first chimeric antigen receptor (CAR) Use of a composition containing T cells to
The first CAR specifically binds to the first antigen associated with the disease or condition in the subject, where the first antigen is CD19;
The second CAR specifically binds to the second antigen associated with the disease or condition, which is CD22;
The second CAR contains at least one region whose amino acid sequence is identical to the corresponding region of the first CAR;
The disease or condition is leukemia or lymphoma; and the disease or condition has recurred in the subject after administration of T cells expressing the first CAR, use.

第1のキメラ抗原受容体（CAR）によって以前に処置された対象における疾患または状態の処置において使用するための、第2のキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞を含む組成物であって、
第1のCARが、該対象における該疾患または状態に関連した第1の抗原に特異的に結合し、ここで、該第1の抗原が、CD19であり；
第2のCARが、CD22である該疾患もしくは状態に関連した第2の抗原に特異的に結合し；
第2のCARが、第1のCARの対応する領域とアミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域を含み；
該疾患もしくは状態が、白血病またはリンパ腫であり；かつ
該疾患もしくは状態が、第1のCARを発現するT細胞の投与の後に該対象において再発している、組成物。 A composition comprising T cells expressing a second chimeric antigen receptor (CAR) for use in the treatment of a disease or condition in a subject previously treated with the first chimeric antigen receptor (CAR). hand,
The first CAR specifically binds to the first antigen associated with the disease or condition in the subject, where the first antigen is CD19;
The second CAR specifically binds to the second antigen associated with the disease or condition, which is CD22;
The second CAR contains at least one region whose amino acid sequence is identical to the corresponding region of the first CAR;
A composition in which the disease or condition is leukemia or lymphoma; and the disease or condition has recurred in the subject after administration of T cells expressing the first CAR.

前記医薬が、第1のCARを発現するT細胞の投与の少なくとも約28日後、少なくとも約35日後、少なくとも約42日後、少なくとも約49日後、および/または少なくとも約60日後に使用するためのものである、請求項1記載の使用。 The pharmaceutical is intended for use at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and / or at least about 60 days after administration of T cells expressing the first CAR. Yes, the use of claim 1 .

前記疾患または状態がリンパ腫である、請求項1または3記載の使用。 The use according to claim 1 or 3 , wherein the disease or condition is lymphoma.

前記疾患または状態が白血病である、請求項1または3記載の使用。 Use according to claim 1 or 3 , wherein the disease or condition is leukemia.

前記白血病がB細胞急性リンパ芽球性白血病（ALL）である、請求項5記載の使用。 The use according to claim 5, wherein the leukemia is B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL).

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1および3～6のいずれか一項記載の使用。 Claims 1 and 3-6 , wherein at least one region having the same amino acid sequence is selected from the group consisting of an intracellular co-stimulation signaling domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, and a combination thereof. Use of any one of the items described.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、CD3ゼータシグナル伝達ドメインであるITAM含有ドメインである、請求項7記載の使用。 The use according to claim 7, wherein at least one region having the same amino acid sequence is an ITAM-containing domain which is a CD3 zeta signaling domain.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、CD28シグナル伝達ドメインまたは4-1BBシグナル伝達ドメインである共刺激シグナル伝達ドメインであるITAM含有ドメインである、請求項7記載の使用。 The use according to claim 7, wherein at least one region having the same amino acid sequence is an ITAM-containing domain which is a co-stimulation signaling domain which is a CD28 signaling domain or a 4-1BB signaling domain.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、4-1BBシグナル伝達ドメインである、請求項9記載の使用。 The use according to claim 9, wherein at least one region having the same amino acid sequence is a 4-1BB signaling domain.

対象が、前記医薬による処置の前に、第2のCARを発現するT細胞の用量を受けたことがない、請求項1および3～10のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3-10, wherein the subject has never received a dose of T cells expressing a second CAR prior to treatment with said pharmaceutical .

前記対象が、第1のCARが標的とする抗原の抗原喪失および/またはダウンレギュレーションまたは修飾を示す、請求項1および3～11のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3-11, wherein the subject exhibits antigen loss and / or downregulation or modification of the antigen targeted by the first CAR.

第2のCARを発現するT細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、請求項1および3～12のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3 to 12 , wherein the T cell expressing the second CAR does not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds. ..

前記医薬の処置における使用が、対象への投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答をもたらさない、請求項1および3～13のいずれか一項記載の使用。 Use in the treatment of said pharmaceuticals does not result in a detectable humoral or cell-mediated immune response to the second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration to the subject. , The use of any one of claims 1 and 3-13.

前記対象が、第1のCARに対するCAR特異的な免疫応答が該対象において検出されている対象である、請求項1および3～14のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3-14, wherein the subject is a subject in which a CAR-specific immune response to the first CAR has been detected.

前記T細胞が対象に対して自己である、請求項1および3～15のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3 to 15 , wherein the T cell is self to the subject.

前記組成物が、対象における疾患または状態の負荷の低減のために十分な量の第2のCARを発現する細胞を含む、請求項1および3～16のいずれか一項記載の使用。 The use according to any one of claims 1 and 3-16, wherein the composition comprises cells expressing a second CAR in an amount sufficient to reduce the burden of the disease or condition in the subject.

前記組成物が、対象への約1×10⁶個～約1×10⁸個のCAR発現T細胞の投与のために製剤化されている、請求項1および3～17のいずれか一項記載の使用。 The one of claims 1 and 3 to 17 , wherein the composition is formulated for administration of about 1 × 10 ⁶ to about 1 × 10 ⁸ CAR-expressing T cells to a subject. Use of.

前記組成物が、第1のCARを発現するT細胞の投与の少なくとも約28日後、少なくとも約35日後、少なくとも約42日後、少なくとも約49日後、および/または少なくとも約60日後に使用するためのものである、請求項2記載の組成物。 The composition is intended for use at least about 28 days, at least about 35 days, at least about 42 days, at least about 49 days, and / or at least about 60 days after administration of T cells expressing the first CAR. The composition according to claim 2 .

前記疾患または状態がリンパ腫である、請求項2または19記載の組成物。 The composition according to claim 2 or 19 , wherein the disease or condition is lymphoma.

前記疾患または状態が白血病である、請求項2または19記載の組成物。 The composition according to claim 2 or 19 , wherein the disease or condition is leukemia.

前記白血病がB細胞急性リンパ芽球性白血病（ALL）である、請求項21記載の組成物。 21. The composition of claim 21 , wherein the leukemia is B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL).

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ITAM含有ドメイン、膜貫通ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項2および19～22のいずれか一項記載の組成物。 Claims 2 and 19-22, wherein at least one region having the same amino acid sequence is selected from the group consisting of an intracellular co-stimulation signaling domain, an ITAM-containing domain, a transmembrane domain, and a combination thereof. The composition according to any one.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、CD3ゼータシグナル伝達ドメインであるITAM含有ドメインである、請求項23記載の組成物。 23. The composition of claim 23 , wherein at least one region having the same amino acid sequence is an ITAM-containing domain that is a CD3 zeta signaling domain.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、CD28シグナル伝達ドメインまたは4-1BBシグナル伝達ドメインである共刺激シグナル伝達ドメインであるITAM含有ドメインである、請求項23記載の組成物。 23. The composition of claim 23 , wherein at least one region having the same amino acid sequence is an ITAM-containing domain, which is a co-stimulation signaling domain that is a CD28 signaling domain or a 4-1BB signaling domain.

前記アミノ酸配列が同一である少なくとも1個の領域が、4-1BBシグナル伝達ドメインである、請求項25記載の組成物。 25. The composition of claim 25 , wherein at least one region having the same amino acid sequence is the 4-1BB signaling domain.

対象が、前記組成物の処置における使用の前に、第2のCARを発現するT細胞の用量を受けたことがない、請求項2および19～26のいずれか一項記載の組成物。 The composition of any one of claims 2 and 19-26, wherein the subject has never received a dose of T cells expressing a second CAR prior to use in the treatment of said composition .

前記対象が、第1のCARが標的とする抗原の抗原喪失および/またはダウンレギュレーションまたは修飾を示す、請求項2および19～27のいずれか一項記載の組成物。 The composition according to any one of claims 2 and 19-27, wherein the subject exhibits antigen loss and / or downregulation or modification of the antigen targeted by the first CAR.

第2のCARを発現するT細胞が、第1のCARが特異的に結合する前記抗原に特異的に結合する受容体を含まない、請求項2および19～28のいずれか一項記載の組成物。 The composition according to any one of claims 2 and 19 to 28 , wherein the T cell expressing the second CAR does not contain a receptor that specifically binds to the antigen to which the first CAR specifically binds. Things .

前記組成物の処置における使用が、対象への投与の約30日以内、約60日以内、または約90日以内の、第2のCARに対する検出可能な体液性免疫応答または細胞性免疫応答をもたらさない、請求項2および19～29のいずれか一項記載の組成物。 Use in the treatment of the composition results in a detectable humoral or cell-mediated immune response to a second CAR within about 30 days, about 60 days, or about 90 days of administration to the subject. No, the composition according to any one of claims 2 and 19-29.

前記対象が、第1のCARに対するCAR特異的な免疫応答が該対象において検出されている対象である、請求項2および19～30のいずれか一項記載の組成物。 The composition according to any one of claims 2 and 19-30, wherein the subject is a subject in which a CAR-specific immune response to the first CAR has been detected.

前記T細胞が対象に対して自己である、請求項2および19～31のいずれか一項記載の組成物。 The composition according to any one of claims 2 and 19 to 31 , wherein the T cells are self with respect to the subject.

前記組成物が、対象における疾患または状態の負荷の低減のために十分な量の第2のCARを発現する細胞を含む、請求項2および19～32のいずれか一項記載の組成物。 The composition of any one of claims 2 and 19-32, wherein said composition comprises cells expressing a second CAR in an amount sufficient to reduce the burden of the disease or condition in the subject.

前記組成物が、対象への約1×10⁶個～約1×10⁸個のCAR発現T細胞の投与のために製剤化されている、請求項2および19～33のいずれか一項記載の組成物。 13. One of claims 2 and 19-33, wherein the composition is formulated for administration of about 1 × 10 ⁶ to about 1 × 10 ⁸ CAR-expressing T cells to a subject. Composition .