JP7065517B2 - Ｐｔｆ１ａ陽性細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本願はPTF1A陽性細胞を製造する方法に関する。

多能性幹細胞から膵臓細胞への分化は、多能性幹細胞→内胚葉細胞→原腸細胞→膵前駆細胞→膵臓細胞の順に誘導される。ヒト及びマウスにおいて、膵前駆細胞にはPDX1の発現が認められることが知られている。一方でPDX1は、膵前駆細胞だけでなく、他の臓器へ分化する細胞にも認められる。

マウス発生学において、膵原基にPdx1が発現したあと引き続きPtf1aを発現した細胞は、最終的にほぼすべて膵臓細胞に分化することが確認されており、Ptf1aのノックアウトマウスでは膵臓低形成が認められる（非特許文献１）。Ptf1a低発現マウスは膵臓低形成と耐糖能異常が認められる（非特許文献２）。ヒトにおいてもPTF1A遺伝子の突然変異（非特許文献３）あるいはそのエンハンサーの突然変異（非特許文献４）による膵臓低形成が報告されている。

これらの知見より、PTF1A遺伝子はマウスのみならずヒトにおいても膵発生の運命決定遺伝子であり、PTF1A遺伝子の発現が膵臓細胞への分化に重要であることが推測される。

多能性幹細胞から膵臓細胞を誘導する方法としては、多能性幹細胞をアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法などが例示される（特許文献１、非特許文献５から９）。この他にも、多能性幹細胞へPDX1を導入して培養する方法（特許文献２および３）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（特許文献４、非特許文献１０）が知られている。これら多能性幹細胞から膵臓細胞を誘導する方法において、膵前駆細胞のPDX1発現が重視されてきたが、PTF1Aの発現に焦点をあてて評価したものは少なく、その発現制御は不明な点が多い。

特開２００９－２２５６６１号公報 米国特許７５３４６０８号公報 特開２００６－０７５０２２号公報 ＷＯ２０１１／０８１２２２号公報 ＷＯ２０１５／０２０１１３号公報

Kawaguchi Y et al., Nat Genet 32: 128-134, 2002 Fukuda A et al., Diabetes 57: 2421-2431, 2008 Gabrielle SS et al., Nat Genet 36: 1301-1305, 2004 Michael NW et al., Nat Genet 46: 61-66, 2014 E.Kroon et al., Nature Biotechnology(2008) Vol.26, No.4 : 443-452 K.A.D'Amour et al., Nature Biotechnology(2006) Vol.24, No.11: 1392-1401 W.Jiang, Cell Research(2007) 17: 333-344 J.H.Shim et al., Diabetologia (2007) 50: 1228-1238 R.Maehra et al., PNAS(2009),vol.106, No.37: 15768-15773 Kunisada Y et al., Stem Cell Res. (2012) vol.8, No.2: 274-284.

上記先行技術文献はいずれも引用により本願の一部を構成する。

本願はPTF1A陽性細胞をインビトロで製造する方法を提供することを目的とする。特に多能性幹細胞、例えばiPS細胞からPDX1陽性細胞を経てPTF1A陽性細胞を誘導する方法を提供する。

本願は、
PDX1陽性細胞を提供する工程、および
PDX1陽性細胞を（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ステロイドおよび（ｃ）ニコチンアミドからなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程を含む、PTF1A陽性細胞の製造方法を提供する。

好適な態様としては、（a）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（b）ステロイドおよび（c）ニコチンアミドからなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する前に、PDX1陽性細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程を含む方法が提供される。

本願において、PDX1陽性細胞は、多能性幹細胞から誘導された細胞であってよい。多能性幹細胞からPDX1陽性細胞を得る方法は種々報告されており、公知のいずれの方法を用いてもよい。

本願発明の方法により、低分子物質を用いて効率的にPDX1陽性細胞におけるPTF1Aの発現を誘導することが可能となった。本願発明の方法により、多能性幹細胞から効率的にPTF1A発現細胞を製造することができる。

本願実施例の概略図である。 本願方法により誘導された細胞におけるPTF1Aの発現量の経時変化を示す。 本願方法により誘導された細胞における、インスリン遺伝子およびアミラーゼ遺伝子の発現を示す。

本願発明は、PDX1陽性細胞を（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ステロイドおよび（ｃ）ニコチンアミドからなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程を含むPTF1A陽性細胞の製造方法を提供する。

本願発明において用いられる培地は、基礎培地に適宜物質を添加して作成される。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Improved MEM（Invitrogen）、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、StemPro34（Invitrogen）およびこれらの混合培地、例えばDMEM/F12培地（DMEMとHam's F12の１：１混合培地）などが包含される。基礎培地としては、血清含有培地であっても、無血清培地でもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、1-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。

本願において用いられるPDX1陽性細胞としては、多能性幹細胞から誘導された細胞培養物が好適に用いられる。PDX1遺伝子陽性細胞の培養物としては、立体構造を有する細胞塊状態で培養されているものを用いるのが好ましい。

本願の方法の一態様において、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）からなる群から選択される1以上を含有する培地においてPDX1陽性細胞を培養する工程は、好ましくはPDX1陽性細胞を予め下記に述べる第１工程および第２工程にて培養した後の第３工程として行う。

［PDX1陽性細胞からPTF1A陽性細胞誘導の第１工程］
PDX1陽性細胞からPTF1A陽性細胞誘導の第１工程ではPDX1陽性細胞を成長因子、レチノイン酸受容体（RAR）アゴニスト、ヘッジホッグ経路阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤およびＡＬＫ５受容体阻害剤を含む培地にて培養する。各成分の培地中の濃度は適宜定めれば良い。

PDX1陽性細胞からPTF1A細胞誘導の第１工程において、好ましくはヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を培地に添加する。
ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤としては例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例えばHDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)）等の核酸性発現阻害剤、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)が例示される。

HDAC阻害剤としては酪酸ナトリウムが好適に用いられる。HDAC阻害剤として酪酸ナトリウムを用いる場合、培地中の濃度は通常50μＭ～1000μＭ、好ましくは200μＭ～800μＭ、例えば約500μＭである。第１工程においては１日～３日、好ましくは１日培養する。

［PDX1陽性細胞からPTF1A陽性細胞誘導の第２工程］
第２工程以降において、培養は浮遊培養で、低接着プレートを用いて行うのが好ましい。第２工程において、培地は基礎培地に成長因子、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、ヘッジホッグ経路阻害剤、ROCK阻害剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤およびＡＬＫ５受容体阻害剤を含有するものが好適に用いられる。各成分の培地中の濃度は適宜定めれば良い。第２工程においては、第１工程で得た細胞を新たなプレートに満たした第２工程用培地中へ移してから１日～３日、好ましくは１日培養する。

［PDX1陽性細胞からPTF1A陽性細胞誘導の第３工程］
PDX1陽性細胞を（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ステロイドおよび（ｃ）ニコチンアミドからなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する。

培地は、上述した基礎培地へ（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される少なくとも一種、（ｂ）ステロイドおよび（ｃ）ニコチンアミドからなる群から選択される１以上の物質を添加することによって作成される。好ましい基礎培地は、Ｂ－２７サプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２である。

アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤、およびｃＡＭＰ類縁体からなる群より選択される物質の例としては、アデニル酸シクラーゼ活性を有する化合物、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性を有する化合物、およびアデニル酸シクラーゼ活性とｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性とを併せ持つ化合物等が挙げられる。より具体的には、ホルスコリン、ジブチルｃＡＭＰ、ＰＡＣＡＰ２７(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide 27)、ＩＢＭＸ（３－イソブチル－１－メチルキサンチン）等が挙げられる。好ましくは、ホルスコリンである。ホルスコリンの培地中の濃度は通常0.1から50μＭ、好ましくは2から50μＭであり、例えば約10μMである。

ステロイドとしては、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン等が挙げられる。なかでもデキサメサゾンが好適に用いられる。ステロイドとしてデキサメサゾンを使用する場合の培地中の濃度は、通常0.1から50μＭ、好ましくは2から50μＭ、例えば約10μＭである。

ニコチンアミドの培地中の濃度は、0.01から20ｍＭ、好ましくは0.1から5ｍＭであり、例えば約１ｍＭである。

本願の方法において、成分（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）はそれぞれを単独で添加しても、任意の２種類を組み合わせて添加しても、（ａ）（ｂ）（ｃ）を全て添加してもよい。好ましくは、ホルスコリン、デキサメサゾンおよびニコチンアミドのいずれか１種、２種または３種全てを含む培地が挙げられる。

本願の方法において、培地はさらに成長因子、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、ヘッジホッグ経路阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤およびＡＬＫ５受容体阻害剤を含有するものであってもよい。各成分の培地中の濃度は適宜定めれば良い。

成長因子としては好ましくはＫＧＦが用いられる。ＫＧＦは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、ＦＧＦ－７と呼ばれることもある。ＥＧＦは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。

レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストは天然に存在するレチノイドであっても、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物やレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってもよい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス－レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９－シス－レチノイン酸（９－シスＲＡ）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号，米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Ａｍ８０、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ５５６４９が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としてはホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要９：５５－６１，２００９年）。ＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、ＡＭ５８０(4-[[5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル2-ナフタレニル]カルボキシアミド]安息香酸)、ＴＴＮＰＢ(4-[[E]-2-[5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル2-ナフタレニル]-1-プロペニル]安息香酸)、AC55649(4’-オクチル-[1,1’－ビフェニル]-4-カルボン酸)であり、さらに好ましくはレチノイン酸である。

ヘッジホッグ経路阻害剤は、ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、およびデザート・ヘッジホッグのいずれかが膜受容体であるPatchedに結合して起こるシグナル、例えば、Smoothenedの活性を阻害する化合物を意味し、ヘッジホッグが受容体に結合して起こるシグナルを阻害すれば、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、ジェルビン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl-dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、SANT-2、SANT-3、SANT-4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225が挙げられる。好ましくは、シクロパミンである。

プロテインキナーゼＣ活性化剤としては、Alpha APP Modulator、例えば(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-2,4-ペンタジエノイルアミノ)ベンゾラクタムが例示される。

ＡＬＫ５受容体阻害剤としては、ALK5阻害剤II（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）が例示される。
第３工程において培養は浮遊培養で、低接着プレートを用いて行うのが好ましい。培養期間は特に限定的ではなく、第３工程開始時にそれまでの工程で得た細胞を新たなプレートに満たした上記培地中に移してから４日～１４日、例えば８日以上、好ましくは約１２日間培養する。

培養条件は特に限定的ではないが、一つの態様においては３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２の条件下で培養すればよい。

本願の方法により、細胞におけるPTF1Aの発現が増加する。また、本願の方法にて培養された細胞は、インスリンおよびアミラーゼの両方を発現する。

本願の方法の一態様において、PDX1陽性細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞から誘導されたものである。多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、***幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、例えばヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞である。更に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。

多能性幹細胞は、公知の方法を用いて製造したものを用いても、市販の多能性幹細胞や、研究あるいは移植医療のためにその由来する個体の情報と共に保存された多能性幹細胞を用いてもよい。頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するひとをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中であり（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）、例えばかかるｉＰＳ細胞バンクから取得された多能性幹細胞を用いてもよい。

本願の方法において用いられる多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養しても、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。単一細胞の状態に分離して培養する場合の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。

多能性幹細胞からPDX1陽性細胞を誘導するには、まず、多能性幹細胞から内胚葉細胞を誘導し、内胚葉細胞から原腸細胞を誘導する。原腸細胞からさらに、PDX1陽性細胞を誘導する。

多能性幹細胞から内胚葉細胞を経て原腸細胞を得るには、従来から公知の方法を用いれば良い。一つの態様として、多能性幹細胞をアクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤、GSK3阻害剤、ROCK阻害剤およびP13キナーゼを含有する培地中で１～４日、好ましくは２日間培養し、次いでアクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤のみを含有する培地中１～４日、好ましくは２日間培養し、さらにGSK3阻害剤および成長因子を含有する培地中にて３～８日、好ましくは４日間培養する。かかる操作により原腸細胞を得ることができる。

アクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤とは、ＡＬＫ－４および／又はＡＬＫ－７に対し活性化作用を有する物質であり、例えば、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが挙げられる。好ましくは、アクチビンである。アクチビンには、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢが知られているが、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンも使用することができる。アクチビンとしては特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。工程１に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。

GSK3阻害剤とは、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK－3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3－(2,4－ジクロロフェニル)－4－(1－メチル－1H－インドール－3－イル)－1H－ピロール－2,5－ジオン）、SB415286（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。GSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。

次いで原腸細胞からPDX1陽性細胞を誘導する。
原腸細胞からPDX1陽性細胞を誘導するには、原腸細胞をまず成長因子、例えばＫＧＦおよびＥＧＦ、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、ヘッジホッグ経路阻害剤、およびROCK阻害剤を含有する培地にて培養する。培地としては、公知の基礎培地から適宜選択して用いれば良いが、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＢ２７サプリメントを配合した培地が好適に用いられる。培地中への各添加物の含有量は適宜定めれば良い。

ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本願発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。

原腸細胞からPDX1陽性細胞への誘導に当たり、立体構造を有する細胞塊としてのPDX1陽性細胞を得るために、細胞は三次元支持体となる物質、例えばマトリゲルの存在下で培養してもよい。

原腸細胞からPDX1陽性細胞誘導の工程は、培地を適宜新しいものに交換しながら４～１４日、例えば約８日行う。本工程により、PDX1陽性細胞が誘導される。本願の一態様においては、本工程で得られた細胞を、PDX1陽性細胞として用いる。

本願発明を実施例にて更に詳細に説明する。実施例の概略を図1に示した。
ヒトiPS細胞 201B7株（Cell 131:861-872, 2007）を使用した。
未分化状態の維持には37℃、5%CO₂のもとに、フィーダー細胞としてマイトマイシン処理をしたマウス繊維芽細胞株SNLを、培地として霊長類ES細胞用培地（リプロセル）を用いた。同培地へは4ng/mL human recombinant bFGF（WAKO）、0.5% Penicillin-Streptomycin（GIBCO）を添加した。培地交換は継代の翌々日から毎日行い、６～７日ごとに継代をおこなった。

まず未分化iPS細胞を24穴プレートで内胚葉細胞へと分化させた。
未分化なiPS細胞のディッシュからフィーダー細胞を除去し、Accutase（Innovative Cell Technologies）で単一細胞になるまで解離させた。24穴プレートは前日から室温でマトリゲルコートしたものを用いた。各種分化誘導因子を含むRPMI培地（GIBCO）に分散させたiPS細胞を24穴プレートに1穴あたり2×10⁴個の密度で播種し、37℃、5%CO₂で2日間培養した。分化誘導因子として、アクチビンA（100ng/mL）とGSK3阻害剤CHIR99021（3μM）、Y-27632（10μM）、ワルトマニン（100nM）、2%B27サプリメント（GIBCO）を使用した。2日間の培養ののち、培地をアクチビンA（100ng/mL）、2%B27サプリメントを含むRPMI培地に交換して1日間培養した。さらに同様の培地に交換して1日間培養した。

次に原腸細胞への分化誘導をおこなった。分化誘導因子として、KGF（50ng/mL）、CHIR99021（2μM）を含み、2%B27サプリメントを含むRPMI培地を1日ごとに交換し、計4日間培養した。

原腸細胞をPDX1陽性細胞へ誘導した。
ここまで誘導した細胞をAccutaseで単一細胞にまで解離し、前日からマトリゲルコートしておいた6穴プレートに各種分化誘導因子および2.5%マトリゲルを含および2%B27サプリメントを含むDMEM/F12培地（GIBCO）に懸濁して播種した。

分化誘導因子として、KGF（50ng/mL）、EGF（100ng/mL）、レチノイン酸（2μM）、シクロパミン（250nM）、Y-27632（10μM）を添加した。37℃、5%O₂、5%CO₂で8日間培養した。以後の培養はすべて同様のガス・温度設定でおこなった。培地交換は同様のものを4日目に1度おこなった。8日間の培養が終わったサンプルを「D0」と表記する。得られた細胞塊を免疫染色および定量RT-PCRにて確認したところ、PDX1を発現していることが確認されたが、PTF1A発現は確認されなかった。

＜PDX1陽性細胞からPTF1A発現誘導の第１工程＞
続いてPTF1A発現を誘導するために、マトリゲルを含まずに各種分化誘導因子を含むDMEM/F12培地で1日間培養した。分化誘導因子として、酪酸ナトリウム（500uM）、KGF（50ng/mL）、レチノイン酸（100nM）、シクロパミン（250nM）、PKC活性剤Alpha-APP Modulator（250nM）、ALK5受容体阻害剤（1μM）、2%B27サプリメントを用いた。陰性コントロール群では酪酸ナトリウムを添加しなかった。

＜PDX1陽性細胞からPTF1A発現誘導の第２工程＞
細胞をセルスクレイパーで接着細胞を剥がし、低接着6穴プレートに浮遊させた。培地は、KGF（50ng/mL）、レチノイン酸（100nM）、シクロパミン（250nM）、Alpha-APP Modulator（250nM）、ALK5受容体阻害剤（1μM）、2%B27サプリメントに加え、Y-27632（10μM）を添加したDMEM/F12培地とし、この条件で1日間培養し細胞塊を形成させた。（第２工程）

＜PDX1陽性細胞からPTF1A発現誘導の第３工程＞
次に得られた細胞塊をKGF（50ng/mL）、レチノイン酸（100nM）、シクロパミン（250nM）、Alpha-APP Modulator（250nM）、ALK5受容体阻害剤（1μM）、2%B27サプリメントに、新たな分化誘導因子として、ホルスコリン（10μM）、デキサメサゾン（10μM）、ニコチンアミド（1mM）を加えた培地へ培地交換した（添加群）。培養は以後12日間継続し、4日毎に同様の培地に交換した。6日目、10日目、14日目にサンプリングを行った。それぞれ「D6」「D10」「D14」と表記する。浮遊培養の前に酪酸ナトリウムを添加しなかった陰性コントロール群では引き続きホルスコリン、デキサメサゾン、ニコチンアミドを添加せず、これを最終的な陰性コントロール（非添加群）とした。
添加群と非添加群のPTF1Aの発現量を、B2M遺伝子をインターナルコントロール、ヒト膵組織検体を陽性コントロールとして用いて、定量RT-PCRでPTF1Aの発現を評価した。結果を図２に示す。

また、14日目の細胞について定量RT-PCRでインスリンおよびアミラーゼの発現を確認した。結果を図３に示す。

Claims (7)

1. ヒト多能性幹細胞から誘導されたＰＤＸ１陽性細胞を提供する工程、
   得られたＰＤＸ１陽性細胞を、酪酸ナトリウム、ＫＧＦ、レチノイン酸受容体アゴニスト、シクロパミン、プロテインキナーゼ活性化剤および及びＡＬＫ５受容体阻害剤を含む培地で１～３日間培養する第１工程、
   工程１で得られた細胞をＫＧＦ、レチノイン酸受容体アゴニスト、シクロパミン、プロテインキナーゼ活性化剤および及びＡＬＫ５受容体阻害剤を含む培地で１～３日培養する第２工程、および
   工程２で得られた細胞を、ホルスコリン、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ＫＧＦ、レチノイン酸受容体アゴニスト、シクロパミン、プロテインキナーゼ活性化剤およびＡＬＫ５受容体阻害剤を含む培地で４～１４日間培養を行う第３工程
   を含む、ＰＴＦ１Ａ陽性細胞の製造方法。
2. 第２工程及び第３工程の培養を、低接着プレートを用いて浮遊培養とする、請求項１記載の方法。
3. 第３工程において８日間以上培養を行う、請求項１または２記載の方法。
4. 第１工程において１日間培養を行う、請求項１～３いずれかに記載の方法。
5. ＰＴＦ１Ａ陽性細胞が、インスリンおよびアミラーゼを発現する、請求項１～４いずれかに記載の方法。
6. 多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１～５いずれかに記載の方法。
7. 請求項１～６いずれかに記載の方法を含む、インスリン発現細胞およびアミラーゼ発現細胞の製造方法。

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