JP7065433B2 - 電極及びその製造方法、並びに積層体 - Google Patents

Description

本発明は、電極及びその製造方法、並びに積層体に関する。特に、本発明は、細胞の内包が可能な電極及びその製造方法、並びに前記電極の製造に利用可能な積層体に関する。

脊髄損傷や脳梗塞に代表される回復の困難な中枢神経系の損傷に対する治療方法として、生体組織を移植する再生治療への期待が高まっている。中枢神経系の機能を適切に回復させるためには神経細胞を素子とする複雑なネットワークの再建が必須であり、欠落した素子を補填するための神経細胞、および神経細胞の活動を支持するグリア細胞が、移植組織を構成する主要な細胞である。移植ソースとなる細胞においては、幹細胞の樹立・分化技術の著しい発展により、ヒト由来の神経系細胞を多様かつ選択的に作製することが可能になっている。さらに、生体内と同様の細胞活性の獲得、および細胞の配置や配分比率の制御を目的として、培養細胞を三次元的に組み立てる技術が盛んに研究されており、移植組織の細胞組成や構造をデザインする技術が確立されつつある。

一方、移植後の組織の状態をモニタリングする技術は十分に開発されておらず、とりわけ移植組織とホスト組織（移植先の生体（ホスト）が内生的に有する組織）との間で適切な神経ネットワークが再建されているかはほとんど明らかになっていない。移植組織とホスト組織を構成する神経細胞間の結合形成を検証した例として、光遺伝学的手法により光応答性を付加した細胞をモデル動物に移植する技術は存在するものの（非特許文献１）、ネットワークの機能を担う神経細胞ごとの電気活動を十分な時空間分解能で取得することは難しい。また、非特許文献１の技術は、遺伝子操作を含むため、ヒトのホスト組織に適用することは困難である。

より時空間的な情報を精密に取得するためには、細胞に接触させた電極から電気刺激印可および電気活動計測を行う電気生理的な手法が適する。電気生理的な手法は、イメージングによる観察手法と比べると時間分解能が高く、さらに電極を多点化することで空間情報を把握することも可能であり、ネットワークの機能を評価する目的に適している。そのため、脳や脊髄への電極の埋植に向けて、従来の金属電極と比べて生体適合性の高い電極・基板素材を用いた種々の計測デバイスの開発が精力的に進められている。近年では、イメージングと併せた評価に向けた素材として、生体適合性と導電性に加えて光透過性の高いグラフェンにより構成された電極が注目されている（非特許文献２）。非特許文献２には、芳香環を多く有する高分子材料であるポリパラキシレン（パリレン）にグラフェンを転写して作製された電極素子が開示されている。非特許文献２では、前記のような電極素子を生体内に埋め込むことで、生体組織の電気信号を計測することが報告されている。

J. P. Weick et al., Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 20189-20194 D. W. Park, et al., Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Comm. 2014, 5, 5258-1-22.

非特許文献２に記載の技術では、生体組織の移植と両立する場合、組織移植の後に電極を埋植するために生体への侵襲性が高いことに加えて、移植組織とホスト組織とをそれぞれ狙って選択的に電極を組織に接着させることが技術的に不可能であるという課題がある。特に、移植組織を構成する神経細胞が遊走性を有する場合、移植組織と電極との接触を維持することが困難であり、移植組織とホスト組織との結合形成の過程を経時的に評価することができない。

上記事情に鑑み、本発明は、細胞を内包化させることができ、生体内に埋植することが可能な電極、及びその製造方法、並びに当該電極の製造に用いる積層体を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、内部空間を有する電極であって、前記電極は導電性材料を含む層（導電層）を有する膜を含み、前記内部空間は、前記膜が湾曲することにより形成されている、電極である。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記内部空間に細胞が存在していることを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記膜は、前記内部空間と前記電極の外部空間とを連通する孔を有することを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記電極の形状が筒状であることを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記筒状の形状は、前記筒の片端又は両端が、閉鎖されていることを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記膜は、高分子化合物を含む層（高分子化合物層）をさらに有することを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記高分子化合物層及び前記導電層が、光透過性を有する材料で構成されることを特徴とする。
本発明の一態様は、上記の電極であって、前記導電性材料が、導電性炭素材料であることを特徴とする。

本発明の一態様は、電極の製造方法であって、（ａ）高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、導電性材料を含む層（導電層）と、を有する膜を形成する工程と、（ｂ）前記膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記膜に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる工程と、を有することを特徴とする、電極の製造方法である。
本発明の一態様は、上記の電極の製造方法であって、さらに、前記工程（ａ）の後かつ前記工程（ｂ）の前に、（ｃ）前記膜の表面に、細胞を存在させる工程を有することを特徴とする。

本発明の一態様は、基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された導電性材料を含む層（導電層）と、前記導電層上に積層された高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、を有する積層体である。

本発明により、細胞を内包化させることができ、生体内に埋植することが可能な電極、及びその製造方法、並びに当該電極の製造に用いる積層体が提供される。

本発明の一態様に係る電極の一例を示す斜視図である。（ａ）は、筒状の電極（筒状電極）の内部空間に細胞が内包化された状態を示す斜視図である。（ｂ）は、細胞を内包する筒状電極（細胞内包化筒状電極）が、複数個アセンブリされた構造体を示す。細胞内包化電極間で、神経突起２１を介した三次元的な神経ネットワークが形成されている例である。（ｃ）は、細胞内包化筒状電極をヒト脳組織に移植した例を示す概略図である。 本発明の一態様に係る電極の製造方法の一例を説明する概略図である。図２は、細胞内包化筒状電極の製造方法の一例を説明するものである。 グラフェン層（導電層）上にパリレン層（高分子化合物層）が積層された積層構造を有する膜（グラフェン－パリレン電極膜）の位相差顕微鏡像である。膜は、縦６００μｍ×横３００μｍの長方形パターンに加工されている。（ａ）は孔なし、（ｂ）は直径８μｍの孔が５０μｍ間隔で形成されたもの、（ｃ）は直径８μｍの孔が２５μｍ間隔で形成されたもの、（ｄ）は直径１５μｍの孔が５０μｍ間隔で形成されたものである。 グラフェン－パリレン電極膜の自己組織的な湾曲に伴う初代培養神経細胞の内包化過程を示す位相差顕微鏡像である。ＥＤＴＡ添加後から０秒後（ｔ＝０ｓ）、４秒後（ｔ＝４ｓ）、８秒後（ｔ＝８ｓ）、１２秒後（ｔ＝１２ｓ）、１６秒後（ｔ＝１６ｓ）、２０秒後（ｔ＝２０ｓ）の位相差顕微鏡像を示す。 グラフェン－パリレン電極膜により形成される筒状電極に細胞が内包化された細胞内包化筒状電極をタイムラプス撮影した位相差顕微鏡像である。（ａ）は孔を有さない電極であり、（ｂ）は直径８μｍの孔を有する電極である。図中の矢尻は、代表的な神経突起を示す。 筒状電極の自己組立て前後の電気的特性の変化を示す図である。（１）～（４）は、本発明の一態様である電極の作製プロセスを示す。（５）は、（１）～（４）のプロセスにより作製された電極について、自己組立て前（乾燥状態、水中）、及び自己組立て後（ＥＤＴＡ溶液添加後、純水に置換後）のＩ－Ｖ曲線を測定した結果を示す。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

＜電極＞
本発明の一態様に係る電極は、内部空間を有する電極であって、前記電極は、導電性材料を含む層（導電層）を有する膜を含み、前記内部空間は、前記膜が湾曲することにより形成されている、電極である。
以下に、本発明の好ましい一態様を示す図面を挙げ、本態様に係る電極について説明する。

図１（ａ）は、本発明の一態様にかかる電極の一例を示す斜視図である。電極１００は、導電性材料を含む層（導電層１０）を有する膜１０１（以下、「電極膜１０１」という。）により構成されている、電極膜１０１は、三次元湾曲形状を有し、電極膜１０１が湾曲することにより、電極１００の内部空間が形成されている。図１（ａ）の例では、電極１００の内部空間内には細胞２が存在しており、電極１００は、細胞が内包化された電極（以下、「細胞内包化電極」という場合がある。）となっている。

≪電極≫
電極１００は、導電層１０を有する電極膜１０１から構成されている。電極膜１０１は、三次元湾曲形状を有しており、それにより電極１００には内部空間が形成されている。図１（ａ）の例では、電極膜１０１は、導電層１０に加えて、高分子化合物層１１を含む。図１（ａ）に示すように、電極膜１０１は、導電層１０に、高分子化合物層１１が積層された構造となっている。すなわち、導電層１０が外側に、高分子化合物層１１が内側に配置されている。
図１（ａ）に示す電極１００では、電極膜１０１において、導電層１０と高分子化合物層１１とが、隣接して配置されている。本態様にかかる電極において、導電層１０と高分子化合物層１１とは、必ずしも隣接している必要はないが、少なくとも三次元湾曲形状を形成する部分では、導電層１０と高分子化合物層１１とが隣接していることが好ましい。導電層１０と高分子化合物層１１とは、３次元湾曲形を形成する部分において密着していることがより好ましい。

図１（ａ）に示す電極膜１０１は、導電層１０及び高分子化合物層１１をそれぞれ１層ずつ有しているが、本態様にかかる電極膜は、図１（ａ）の例に限定されない。例えば、図１（ｃ）に示す電極膜２０１のように、２つの導電層１０ａ及び導電層１０ｂの間に高分子化合物層１１が配置される構成であってもよい。

電極１００は、三次元湾曲形状を有している。ここで、電極が「三次元湾曲形状を有する」とは、電極の構造の少なくとも一部が、三次元的に湾曲した形状となっていることをいう。例えば、図１（ａ）の例では、電極１００は、構造全体が、筒状に湾曲した形状（筒状形状）となっている。筒状形状は、電極１００が有し得る三次元湾曲形状の好ましい例である。しかしながら、電極１００が有し得る三次元湾曲形状は、図１（ａ）の例に限定されず、例えば、構造の一部のみが三次元的に湾曲した形状をとるものでもあってもよい。また、例えば、生体組織様構造など様々な三次元湾曲形状とすることができる。電極１００は、導電層１０及び高分子化合物層１１の厚さ及び形状を変化させることで、様々な三次元湾曲形状を有するものを設計することができる。三次元湾曲形状の例としては、例えば、球状、回転楕円体等が挙げられるが、これらに限定されない。また、筒状形状は、円形状の横断面を有するものに限定されず、楕円形状、多角形状（三角形状、四角形状、五角形状、六角形状など）等の横断面を有するものであってもよい。電極１００が有する内部空間の形状は、前記三次元湾曲形状に応じて変化し、例えば、円柱状、球状、回転楕円形状、多角柱形状、多角錐形状、円錐形状等が例示される。

電極１００の大きさは、特に限定されず、電極１００の用途に応じて適宜設定することができる。例えば、電極１００に細胞２を内包化する場合であって、細胞２の短軸方向の長さが１０μｍである場合、電極１００の横断面の内径は１０μｍよりも大きいことが好ましく、２０μｍ以上であることがより好ましい。電極１００の横断面の内径としては、例えば、２０～２００μｍ、２０～１００μｍ、又は２０～７０μｍ等が例示される。
電極１００の長さ方向の大きさは、特に限定されず、電極１００の用途に応じて適宜設定することができる。例えば、電極１００に細胞２を内包化する場合、細胞２を内包可能な大きさであればよく、細胞２の長軸方向の長さ以上であることが好ましい。電極１００の長さ方向の大きさとしては、例えば、２０～１００００μｍ、２０～２０００μｍ、又は２００～２０００μｍ等が例示される。
電極１００の大きさは、電極１００の用途に応じて適宜設計することができる。電極１００の内部空間に細胞２を存在させる場合には、細胞２の大きさ及び細胞数に応じて、適宜、電極１００の形状及びサイズを設計することができる。また、内部空間に細胞２を存在させた電極１００を移植用組織として用いる場合には、当該移植用組織の目的に応じて、適宜、電極１００の形状及びサイズを設計することができる。

電極１００の形状が筒状である場合、当該筒の片端又は両端は閉鎖されていてもよい。筒の片端又は両端を閉鎖する方法は、特に限定されず、例えば、適切な材料を用いて筒の開口端に栓をして閉鎖してもよい。電極１００の内部空間に細胞２を入れ、電極１００の片端又は両端を閉鎖することにより、電極１００の内部空間から外部空間への細胞２の移動を抑制することができる。

（導電層）
導電層１０は、導電性材料を含む層である。導電層１０に用いられる導電性材料は、導電性を有するものであれば特に限定されないが、薄膜形状に加工が可能なナノマテリアル（少なくとも一次元が１００ｎｍ以下の材料）であることが好ましい。また、溶液中に浸漬された際に大きな体積変化を誘導しない材料が好ましく、光透過性及び生体適合性の高い材料であることがより好ましい。さらに、導電性材料は、高分子化合物層１１に含まれる高分子化合物と、π－π相互作用をする物質であることが好ましい。そのような物質を選択することにより、導電層１０と高分子化合物層１１との密着性を高めることができる。
導電性材料としては、例えば、グラフェンやカーボンナノチューブなどの導電性炭素材料や二硫化モリブデンなどの平面状物質等が挙げられる。その中でも、導電性材料は、導電性炭素材料を含むことが好ましく、グラフェンを含むことがより好ましい。導電層１０に含まれる導電性材料は、１種であってもよく、２種以上であってもよいが、１種であることが好ましい。好ましい態様において、導電層１０は、グラフェンから構成されてもよく、カーボンナノチューブをシート状に加工したバッキーペーパーから構成されてもよい。

導電層１０は、単層又は複数層の導電性材料から構成されていてもよい。導電層１０が複数層の導電性材料から構成される場合、導電性材料の層数は、特に限定されないが、例えば、２～３０層、２～２０層、２～１０層又は２～５層等が例示される。導電層１０は、１～３０層の導電性炭素材料から構成されることが好ましく、電極膜１０１の透明性を保つためには、導電層１０は、１～４層の導電性炭素材料から構成されることがより好ましい。導電層１０は、１～３０層のグラフェンから構成されることがさらに好ましく、電極膜１０１の透明性を保つためには、導電層１０は、１～４層のグラフェンから構成されることが特に好ましい。導電層１０がグラフェンから構成される場合、多結晶グラフェンであっても単結晶グラフェンであってもよいが、湾曲形状の方向制御の観点から、単結晶グラフェンが好ましい。

中でも、導電性材料としては、グラフェンが好ましい。グラフェンは、生体適合性が高いため、電極１００を生体内に埋植した場合に、埋植後の炎症を引き起こしにくい。また、透明性が高いため、イメージングを併せた評価も可能となる。グラフェンの光透過率は９７．７％であり、金、銀、銅などの導電性金属材料と比較して、高い光透過性を有する。

導電層１０の厚みは、０．３～１０ｎｍであることが好ましい。導電層１０が複数層の導電性材料から構成される場合、それら複数層を合計した厚みが、導電層１０の厚みとなる。導電層１０の厚みを前記範囲内とし、高分子化合物層１１の厚みを後述する所定の範囲内とすることにより、電極膜１０１に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させることができる。安定な三次元湾曲形状形成の観点から、導電層１０の厚みは、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～５ｎｍであることがより好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがさらに好ましい。前記範囲内で、高分子化合物層１１の厚みに対する導電層１０の厚みの比率を制御することにより、任意の三次元湾曲形状を有する電極１００を得ることができる。例えば、高分子化合物層１１の厚みに対する導電層１０の厚みを増すことにより、三次元湾曲形状の曲率半径を小さくすることができる。

電極膜が、図１（ｃ）に示す電極膜２０１のように、２つの導電層１０ａ，１０ｂの間に高分子化合物層１１が配置された構成を有する場合、外側の導電層１０ａの厚みは、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがより好ましい。内側の導電層１０ｂの厚みは、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがより好ましい。
外側の導電層１０ａと内側の導電層１０ｂとの厚みの比率（導電層１０ａの厚み／導電層１０ｂの厚み）は、１～１０の範囲であることが好ましく、２～４の範囲であることがより好ましい。

（高分子化合物層）
電極膜１０１は、前記導電層１０に加えて、高分子化合物層１１を有することが好ましい。高分子化合物層１１は、芳香環を有する高分子化合物を含む層であることが好ましい。高分子化合物層１１に用いられる高分子化合物は、分子内に芳香環を多く有し、導電層１０に含まれる導電性材料とπ－π相互作用をするものが好ましい。そのような高分子化合物を用いることにより、高分子化合物層１１の導電層１０に対する密着性が高くなる。また、高分子化合物層１１は、光透過性が高く、生体適合性の高い材料で構成されることが好ましく、細胞毒性のない高分子化合物を用いることがより好ましい。そのような高分子化合物としては、例えば、ポリパラキシレン又はその誘導体等が挙げられる。ポリパラキシレンの誘導体としては、例えば、ハロゲン化パラキシレン（クロロパラキシレン、フルオロパラキシレンなど）のポリマー等が挙げられる。

中でも、高分子化合物としては、ポリパラキシレンが好ましい。ポリパラキシレンは、生体適合性が高いため、電極１００を生体内に埋植した場合に、埋植後の炎症を引き起こしにくい。また、透明性が高いため、イメージングを併せた評価も可能となる。また、ポリパラキシレンの薄膜は、柔軟かつ堅牢であるため、ナノメートルレベルの薄膜であっても、電極１００の三次元湾曲構造を維持することができる。
加えて、ポリパラキシレンは、絶縁性が高いため、図１（ｃ）に示すように、２つの導電層１０ａ，１０ｂの間に高分子化合物層１１を配置する構成とした場合に、導電層１０ａ及び導電層１０ｂにおける導通を防ぐことができる。そのため、図１（ｃ）において、電極２００に内包された細胞２及びホスト組織３の電気活動をそれぞれ選択的に計測することができるとともに、細胞２及びホスト組織３にそれぞれ選択的に電気刺激を与えることができる。
ポリパラキシレンは、グラフェンとの密着性が高いため、導電層１０の導電性材料としてグラフェンを用いた場合に特に好適に用いることができる。導電層１０にグラフェンを用い、高分子化合物層１１にポリパラキシレンを用いることにより、剥離や断裂が生じにくくなり、導通性を失うことなく所望の三次元湾曲形状を形成することができる。

高分子化合物層１１に含まれる高分子化合物は、１種であってもよく、２種以上であってもよいが、１種であることが好ましい。

高分子化合物層１１の厚みは、１０～９００ｎｍであることが好ましい。高分子化合物層１１が複数層の薄膜から構成される場合、それら複数層の薄膜を合計した厚みが、高分子化合物層１１の厚みとなる。高分子化合物層１１の厚みを前記範囲内とし、導電層１０の厚みを上述の所定の範囲内とすることにより、電極膜１０１に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させることができる。安定な三次元湾曲形状形成の観点から、高分子化合物層１１の厚みは、４０～４００ｎｍであることが好ましく、５０～２５０ｎｍであるであることがより好ましい。前記範囲内で、導電層１０の厚さに対する高分子化合物層１１の厚さの比率を制御することにより、任意の三次元湾曲形状を有する電極１００を得ることができる。例えば、導電層１０の厚みに対する高分子化合物層１１の厚みを増すことにより、三次元湾曲形状の曲率半径を大きくすることができる。

導電層１０と高分子化合物層１１との厚みの比率（導電層１０の厚み／高分子化合物層１１の厚み）は、１／３０００～１／１の範囲であれば特に限定されないが、１／１２００～１／４であることがより好ましい。導電層１０と高分子化合物層１１との厚みの比率を前記範囲内とすることにより、安定した三次元湾曲形状を形成することができる。

電極膜が、図１（ｃ）に示す電極膜２０１のように、２つの導電層１０ａ，１０ｂの間に高分子化合物層１１が配置された構成を有する場合、高分子化合物層１１の厚みは、４０～４００ｎｍであることが好ましく、５０～２５０ｎｍであることがより好ましい。
外側の導電層１０ａと高分子化合物層１１との厚みの比率（導電層１０ａの厚み／高分子化合物層１１の厚み）は、１／３０００～１／１の範囲であることが好ましく、１／１２００～１／４の範囲であることがより好ましい。内側の導電層１０ｂと高分子化合物層１１との厚みの比率（導電層１０ｂの厚み／高分子化合物層１１の厚み）は、１／３０００～１／１の範囲であることが好ましく、１／１２００～１／４の範囲であることがより好ましい。

（孔）
電極膜１０１は、電極１００の内部空間と電極１００の外部空間とを連通する孔１２を有していてもよい。電極膜１０１が孔１２を有する場合、孔１２は、電極膜１０１を貫通する孔である。電極膜１０１が孔１２を有することにより、電極１００の内部空間と外部空間との間の物質交換が可能となる。また、電極１００の内部空間に細胞２が内包されている場合、細胞２は、孔１２を介して、外部空間にアクセスすることができる。電極１００の内部空間に存在する細胞が電極の外部空間にアクセスするとは、前記細胞が、該孔を介して、電極の外部空間（外部環境）に作用すること又は外部空間（外部環境）の影響を受けることを意味する。細胞２が電極１００の外部空間にアクセスすることの具体例としては、例えば、細胞２が、該孔１２を介して、電極１００の外部空間から物質を取り込むこと、外部空間に物質を排出すること、外部空間の物質と接触すること、外部空間の細胞と相互作用すること、神経突起等の細胞の一部を外部空間まで伸長させること等が挙げられる。

図１（ａ）に示す電極１００は、導電層１０及び高分子化合物層１１を貫通する孔１２を有している。電極１００に内包される細胞２は、細胞体２０及び神経突起２１を備え、神経突起２１が孔１２を通過して電極１００の外部に伸長している。

孔１２の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。孔１２の横断面形状としては、例えば、円形状、楕円形状、多角形状（三角形、四角形、六角形など）等が挙げられるがこれらに限定されない。孔１２としては、形成の容易性等から、円形状又は楕円形状が好ましい。
孔１２の内径は特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。孔１２の内径は、孔１２を通過させたい物体よりも大きいことが好ましく、孔１２を通過させたくない物体よりも小さいことが好ましい。例えば、電極膜１０１が細胞２を内包する場合、孔１２の内径は、細胞２の短軸方向の長さよりも小さいことが好ましい。例えば、細胞２の細胞体２０の短軸方向の長さが約１０μｍである場合、孔１２の内径は１０μｍ未満とすることが好ましい。また、直径０．１～２μｍの神経突起２１が孔１２を通過するようにする場合、孔１２の内径は１μｍ以上とすることが好ましく、３μｍ以上とすることがより好ましい。孔１２の内径としては、例えば、１～１５μｍ、１～１０μｍ、又は３～８μｍ等が挙げられる。
孔１２は、電極膜１０１の厚み方向の形状又は大きさを変化させてもよい。例えば、孔１２は円錐形状としてもよい。例えば、電極１００の内部空間から外部空間に向かって孔１２の形状をテーパー形状とすれば、電極１００の外部空間への神経突起２１の伸長を誘導することができる。
例えば、孔１２が、電極１００の内側から外側方向に窄んだ穴（内側方向の内径＞外側方向の内径）である場合には、内側から外側へと神経突起２１が伸長しやすくなる。また、孔１２の大きさを調整することで、孔１２を通過する神経突起２１の本数の割合を制御することができる。電極１００の内外へ伸長する神経突起２１の本数のバランスを介して、電極１００の内外の神経組織間を伝わる興奮伝播の割合を調整することができる。

孔１２の配置は、電極１００が三次元湾曲形状を維持することができる限り特に限定されない。孔１２の配置は、格子状であってもよく、千鳥状であってもよい。孔１２の間隔としては、電極１００の三次元湾曲形状を好適に維持する観点から、例えば、隣接する孔１２どうしの中心間距離が２５～５００μｍ程度となる間隔が挙げられる。なお、電極１００の三次元湾曲形状が維持される限り、電極１００がメッシュ状になるように孔１２を形成してもよい。

電極１００が細胞２を内包する場合、電極１００が孔１２を有することにより、細胞２は、孔１２を介して、神経突起２１等を外部環境に伸長できる。また、電極１００に内包された細胞は、孔１２を介して、電極１００の外部環境に一酸化窒素やカリウムなどの物質を排出することができ、あるいは酸素や糖分などの物質を外部環境から取り入れることが可能となる。そのため、電極１００に内包された状態で、細胞２を長期間培養することができる。

≪細胞≫
電極１００は、その内部空間に、細胞２が存在していることが好ましい。すなわち、電極１００は細胞内包化電極であることが好ましい。細胞内包化電極は、生体への移植組織として用いることができ、かつ生体内で移植組織及びホスト組織の電気活動をモニタリングすることができる。

図１（ａ）に記載の電極１００は、細胞２を内包している。図１（ａ）の例では、細胞２は、細胞体２０及び神経突起２１を有する神経細胞である。神経突起２１は、神経細胞の樹状突起及び軸索のいずれであってもよい。図１（ａ）の例では、細胞２は神経細胞であるが、細胞２は神経細胞に限定されず、他の種類の細胞であってもよい。
細胞２は、動物細胞であってもよく、植物細胞であってもよいが、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、哺乳類細胞が好ましい。哺乳類細胞としては、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類の細胞が挙げられる。ヒト以外の哺乳類の細胞としては、霊長類細胞（チンパンジー、ゴリラ、サルなど）、家畜動物の細胞（ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなど）、げっ歯類の細胞（マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、ペット類の細胞（イヌ、ネコ、ウサギなど）が挙げられる。
細胞２の細胞種は特に限定されず、生体内のいかなる細胞であってもよいが、例えば、神経細胞、グリア細胞、心筋細胞、線維芽細胞、血管上皮細胞等が例示される。本実施形態の電極１００に細胞を内包化し、移植用の神経組織とする場合、細胞２の好ましい例としては、神経細胞及びグリア細胞が挙げられる。細胞２は、１種類の細胞であってよく、複数種類の細胞の混合物であってもよい。細胞の混合物としては、例えば、神経細胞及びグリア細胞の混合物が好ましく例示される。

電極１００の三次元湾曲形状の内部空間に内包される細胞２の数は、特に限定されず、電極１００の三次元湾曲形状の内部空間の大きさに応じた任意の数であってよい。細胞２は、電極１００に内包されたまま培養可能であり、電極１００の内部空間内で増殖し得る。そのため、最初に内包される細胞２の数に関わらず、培養を続けることにより、電極１００の内部空間を適正な数の細胞２で満たすことができる。

細胞２は、電極１００の内部空間に存在している。「細胞が電極の内部空間に存在している」とは、電極膜によって形成される三次元湾曲形状の内部空間に、細胞の少なくとも一部が存在していることを意味し、細胞全体が前記内部空間に存在している必要はない。例えば、図１（ａ）に示すように、細胞体２０が電極１００の内部空間に存在し、神経突起２１が電極１００の外部環境に伸長している状態も、「細胞が電極の内部空間に存在している」状態に包含される。

（その他の構成）
電極１００は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記導電層１０、及び高分子化合物層１１に加えて、その他の構成を有していてもよい。その他の構成としては、例えば、タンパク質層、金属層等が挙げられる。

・タンパク質層
電極１００は、タンパク質層を備えていてもよい。タンパク質層とは、タンパク質を主成分として含む層である。タンパク質層は、電極１００において、例えば、最内層及び最外層のいずれか又は両方に配置されてもよい。
タンパク質層を構成するタンパク質としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどの細胞外マトリクスが挙げられるがこれらに限定されず、電極１００の用途、細胞２の種類、移植先のホスト組織に応じて、適宜選択すればよい。タンパク質層を設けることにより、電極１００に任意の機能を付与することができる。例えば、タンパク質として、前記のような細胞外マトリクスを用いた場合、細胞２又はホスト組織の細胞と電極１００との接着性を向上させることができる。

・金属層
電極１００は、金属層を備えていてもよい。金属層は、金属元素を含む層である。電極１００の電気的な特性を評価する際、特にプローブを用いて端点に導通を取る場合に、導電層１０としてグラフェン単層膜等を用いると導電層１０に直接プローブの先端を密着させることが難しい。電極１００が金属層を有することで、プローブによる剥離に耐え得る機械的強度を電極１００に付与することができ、電極の形状を保存することができる。金属層に含まれる金属元素は、金属電極として通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、イリジウムなどの貴金属等が挙げられる。金属層の厚みは、特に限定されないが、例えば、１０ｎｍ～１００μｍであることが好ましい。電極１００が金属層を含む場合、金属層は、三次元湾曲形状を有しない部分に配置されることが好ましい。

電極１００において、三次元湾曲形状を有する部分の電極膜１０１全体の厚み（導電層１０、高分子化合物層１１を合わせた合計の厚み）は、後述する製造工程における屈曲を妨げないようにするために、１０～５００ｎｍ程度であることが好ましい。
電極１００の好ましい具体例としては、導電層１０がグラフェンから構成され、高分子化合物層１１がポリパラキシレン又はその誘導体から構成されており、かつ導電層１０と高分子化合物層１１とが隣接しているものが挙げられる。グラフェンとポリパレキシレン又はその誘導体とは、特に密着性が高いため、前記のような構成とすることで、三次元湾曲形状部分においても、剥離や横滑り、断線等の発生を抑制することができる。また、電極１００の好ましい具体例としては、その内部空間に細胞２が存在しているものが挙げられ、中でも、細胞２は、神経細胞、グリア細胞又は神経細胞及びグリア細胞の混合物であることが好ましい。さらに、電極膜１０１が孔１２を有していることが好ましい。

≪使用例≫
図１（ｂ）は、複数の筒状の電極１００ａ～１００ｃがアセンブリされた構造体を示す。電極１００ａ～１００ｃの内部空間には、それぞれ、神経細胞である細胞２ａ～２ｃが存在している。複数の電極１００ａ～１００ｃをアセンブリすることで、電極１００ａ～１００ｃにそれぞれ内包される細胞２ａ～２ｃの間で三次元的なネットワークを形成させることができる。図１（ｂ）では、電極１００ａ～１００ｃの孔１２ａ～１２ｃから、神経突起２１ａ～２１ｃが伸長して相互に連結し、三次元的な神経ネットワークが形成されている。

図１（ｃ）は、細胞内包化電極をヒト脳組織に移植した例を示す概略図である。図１（ｃ）に示す細胞内包化電極２００は、２つの導電層１０ａ，１０ｂとその間に挟まれた高分子化合物層１１とからなる電極膜２０１に、細胞２が内包された構成となっている（図１（ｃ）右図参照）。ヒト脳組織（ホスト組織３）に移植された細胞内包化電極２００に内包される細胞２は、電極膜２０１に形成された孔１２を介して、神経突起２１をホスト組織３に伸長している。ホスト組織３内の神経細胞３０もまた、孔１２を介して、細胞内包化電極２００の内部空間に神経突起３２を伸長している。そして、神経突起２１，３２を介して、細胞２とホスト組織３の神経細胞３０との間でシナプス結合が形成されている。ホスト組織３の電気活動は、外側の導電層１０ａにより計測することができ、細胞内包化電極２００に内包される細胞２の電気活動は内側の導電層１０ｂにより計測することができる。導電層１０ａ及び導電層１０ｂでそれぞれ計測された電気信号を、増幅してＡ／Ｄ変換し、外部記録装置で計測データを記録するようにしてもよい。

本実施態様にかかる電極では、移植組織を構成する細胞を電極に内包させることで、当該細胞内包化電極を生体内に移植した場合に、移植組織の電気活動の計測及び移植組織への電気刺激の両方が可能となる。さらに、電極膜を２つの導電層で高分子化合物層を挟んだ構成とすることで、移植組織及びホスト組織のそれぞれに電極を接触させることができ、移植組織及びホスト組織の電気活動の計測、及び移植組織及びホスト組織の電気刺激をそれぞれ選択的に行うことが可能となる。

本実施態様にかかる電極では、移植細胞を電極の内部空間に内包させることで、細胞の遊走による細胞－電極間接触の消失を抑制することができる。そのため、移植細胞の活動を長期間に亘って安定的に計測することができる。これにより、移植組織がホスト組織に結合して組織を回復する過程を長期間に亘ってモニタリングし、評価することが可能となる。
さらに、移植組織と電極とを別々に埋植する必要がないため、埋植の手術が１度で済み、結果として侵襲性が低減される。また、光遺伝学的手法等の遺伝子操作を伴うイメージング技術と異なり、遺伝子操作の必要がないため、ヒトに対しても適用可能である。

本実施態様にかかる電極では、電極の内部空間に存在する液体中での物質拡散が低減される。神経細胞の電気活動により生じる細胞外の電位変化を電極により計測する場合、物質が拡散しにくい環境下ではイオン電流の漏出が防がれるため振幅の大きな信号を得ることができる。加えて、本実施態様にかかる電極では、電極の内部空間に細胞を内包させた状態でホスト組織に移植することができるため、電極と細胞の接触状態が良好である。そのため、本実施態様の電極では、典型的な挿入型の電極を用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比の高い信号を得ることができる。

本実施態様にかかる電極は、三次元的な組織を組み立てる足場としても使用することができる。機能的な移植組織を構築するためには、多種類の神経系細胞により構成される三次元組織を組み立てるための足場が必要である。本実施態様の電極は、マイクロマニュピレータにより操作が可能であるため、複数の細胞内包化電極をアセンブリする（組み立てる）ことで、多様なデザインの移植組織を構築することができる。特に、本実施態様にかかる細胞内包化電極として、孔を有するものを用いることにより、複数の細胞内包化電極を組み合わせて任意の構造の神経ネットワークを持つ三次元的な移植組織を形成することができる。

本実施態様にかかる細胞内包化電極が孔を有するものである場合、電極に内包された細胞は、前記孔を介して、外部環境にアクセスすることができる。例えば、孔を介して、神経突起の伸長、グリア細胞の遊走、及び電極の内部環境と外部環境との物質交換が可能となるとともに、電極の壁面により神経細胞の遊走を阻むことができる。そのため、例えば、内包細胞が神経細胞である場合、神経細胞を電極の内部空間に留めたまま、孔を介して、神経突起を外部環境に伸長させることができる。また、外部環境中の神経細胞も、孔を介して、電極の内部空間に神経突起を伸長させることができる。これにより、電極の内外の組織におけるシナプス形成を実現できる。また、電極に内包される細胞の壊死等を抑制することができる。

また、電極膜に存在する孔の大きさを制御することにより、細胞内包化電極に内包された細胞の遊走、神経突起伸長、電極の内外での物質交換（物質の放出・取り込み）といった条件を制御することができる。そのため、本実施態様の電極は、移植組織としての応用だけではなく、移植の効果を評価するための実験系としての応用も可能である。細胞移植による生体への効果は、移植細胞が放出するサイトカイン、及び移植細胞とホスト組織の細胞との接触を介する相互作用に大きく分けられるが、それぞれの影響の大きさはほとんど分かっていない。 本実施態様の細胞内包化電極において孔の大きさを種々変化させることによりは、移植細胞が生体に与える影響を評価するための実験系としての適用が可能である。

本実施態様の電極において、導電層をグラフェンで構成し、高分子化合物層をポリパラキシレンで構成した場合、グラフェン及びポリパラキシレンは生体適合性の高い材料であるため、生体内に埋植しても炎症反応を起こしにくい。従来の金属電極では、生体内に埋植した場合、炎症反応により電極周囲に形成されるグリア瘢痕が電極と細胞との接触を阻み、電極による計測シグナルを消失させることが問題となっていた。本実施態様の電極では、特にグラフェン及びポリパラキシレンを用いることにより、生体内に埋植した後の炎症反応を抑制することができ、電極と細胞との接触が維持される。そのため、生体内に埋植後も、長期的に、移植細胞の電気活動を計測することができる。

＜電極の製造方法＞
本発明の一態様にかかる電極の製造方法は、（ａ）高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、導電性材料を含む層（導電層）と、を有する膜を形成する工程と、（ｂ）前記膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記膜に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる工程と、を有する。本実施態様の伝教の製造方法は、さらに、前記工程（ａ）の後かつ前記工程（ｂ）の前に、（ｃ）前記膜の表面に、細胞を存在させる工程を有することが好ましい。以下に、本発明の好ましい一態様を示す図面を挙げ、本発明の電極の製造方法について説明する。

図２は、本発明の一態様に係る電極の製造方法の概略を示す図である。
まず、導電層１０と高分子化合物層１１とを含む膜３０２（以下、「電極膜３０２」という）を形成する（図２（ａ）～（ｇ）：工程（ａ））。図２（ａ）～（ｇ）の例では、基板１４上に犠牲層１３を形成し、犠牲層１３上に導電層１０および高分子化合物層１１を積層して電極膜３０２を形成している。
次いで、電極膜３０２の表面に、細胞２を存在させる（図２（ｈ）：工程（ｃ））。
次いで、電極膜３０２の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、電極膜３０２に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる（図２（ｉ）～（ｊ）：工程（ｂ））。図２（ｉ）～（ｊ）の例では、導電層１０と高分子化合物層１１とが互いに密着、接合することにより、電極膜３０２の厚み方向に応力分布が形成されており、犠牲層１３を分解して電極膜３０２を基板１４から遊離させることで、電極膜３０２の面内方向に歪みの勾配が形成される（図２（ｉ））。この歪みの勾配を駆動力として、導電層１０及び高分子化合物層１１が互いに密着したまま屈曲し（図２（ｉ））、三次元湾曲形状が自己組織的に組み立てられる（図２（ｊ））。屈曲時に、電極膜３０２は、表面に存在する細胞２を内包しながら三次元湾曲形状を形成するため、三次元湾曲形状の内部空間に細胞２が内包された電極３００を得ることができる。
以下、本実施態様に係る電極の製造方法の各工程について説明する。

［工程（ａ）］
工程（ａ）は、高分子化合物層と、導電層と、を有する膜（積層体）を形成する工程である。

高分子化合物層と導電層とを有する膜を形成する方法は、特に限定されないが、例えば、基板及び犠牲層を利用する方法が挙げられる。図２（ａ）～（ｇ）の例では、基板１４上に犠牲層１３を形成し（図２（ａ）～（ｂ））、次いで犠牲層１３上に導電層１０を形成し（図２（ｃ））、次いで導電層１０上に高分子化合物層１１を形成することにより（図２（ｄ））、電極膜３０２を形成している。基板１４及び犠牲層１３上に電極膜３０２を形成することで、二次元平面構造を維持した状態で電極膜３０２を形成することができる。

（基板）
基板１４は、電極膜３０２の形成の便宜のために用いられるものであり、材質は特に限定されない。基板１４の材料としては、表面の平坦性が高いものが好ましい。また、本実施態様の方法で製造される電極を基板上に保持したまま細胞を内包させて蛍光顕微鏡等による観察を行う場合には、蛍光顕微鏡による細胞の蛍光強度観察を妨げないものや、光学特性として波長の吸収帯が導電層１０に重複しないものが好ましい。
基板１４の材料としては、例えば、シリコン、ソーダガラス、石英、酸化マグネシウム、及びサファイア等が挙げられる。
基板１４の厚みは、特に限定されないが、５０～２００μｍ程度が好ましい。
基板１４の具体例としては、例えば、１００μｍ程度の厚みを有するガラス基板等が挙げられる。

（犠牲層）
犠牲層１３は、上記導電層１０及び高分子化合物層１１からなる電極膜３０２を、基板１４から遊離するための一時的な接着層としての役割を有する。犠牲層１３を構成する材料は、化学物質、温度変化、及び光照射などの外部からの刺激に応答して溶解する性質を有する材料であれば、特に限定されない。犠牲層１３としては、例えば、物理ゲルの１種であるアルギン酸カルシウムゲルなどが利用可能である。アルギン酸カルシウムゲルは、クエン酸ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、又はアルギナーゼと呼ばれる酵素などを添加することで、アルギン酸カルシウムゲルがゲルからゾルへ転移して溶解する。犠牲層１３が外部刺激に応答して溶解する性質を有することで、後述する工程（ｃ）において、犠牲層１３を溶解することにより基板１４から電極膜３０２を遊離させ、電極膜３０２に自己組織的に三次元湾曲形状を形成させることができる。前記クエン酸ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤は、細胞などの生体試料に対して毒性を示さないため、犠牲層１３の溶解作業の直前に目的の細胞を懸濁することで細胞の内包化が可能となる。

その他にも、犠牲層１３としては、外部刺激に応答して溶解する性質を有する材料であれば、合成高分子や生体高分子などの種類に限定されず利用が可能である。例えば、エッチング液により溶解可能な金属薄膜、温度変化によりゲル－ゾル転移を誘導できるポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、及び紫外線照射によりゲル－ゾル転移を誘導できるフォトレジスト類などが好適に挙げられる。

犠牲層１３の厚みは、特に制限されない。犠牲層１３の厚みは、例えば、速やかに溶解させる観点から、２０～１０００ｎｍとすることができる。
基板１４上に犠牲層１３を形成する方法は、特に限定されず、犠牲層１３の材料に応じて、薄膜形成に一般的に用いられる方法を適宜選択することができる。犠牲層１３の形成方法としては、例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法等が挙げられる。

（導電層、高分子化合物層）
導電層１０及び高分子化合物層１１は、上記「＜電極＞」の項で記載したものと同様である。
図２（ｃ）及び（ｄ）の例では、犠牲層１３上に、導電層１０を形成し、前記導電層１０上に、高分子化合物層１１を形成しているが、形成順序は逆であってもよい。すなわち、犠牲層１３上に、高分子化合物層１１を形成し、前記高分子化合物層１１上に導電層１０を形成してもよい。
ここで形成される導電層１０の厚みは０．３～１０ｎｍであることが好ましく、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがより好ましい。高分子化合物層１１の厚みは１０～９００ｎｍであることが好ましく、４０～４００ｎｍであることが好ましく、５０～２５０ｎｍであることがより好ましい。導電層１０及び高分子化合物層１１の厚みを前記範囲内とすることにより、電極膜３０２の厚み方向に歪みの勾配を発生させることができる。前記範囲内で導電層１０の厚みを大きくすれば、後述の工程（ｃ）で形成される三次元湾曲形状の曲率半径を小さくすることができる。一方。前記範囲内で高分子化合物層１１の厚みを大きくすれば、後述の工程（ｃ）で形成される三次元湾曲形状の曲率半径を大きくすることができる。

導電層１０の形成方法は特に限定されず、水面を用いた転写法、化学気層成長法（ＣＶＤ）、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、熱蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。例えば、導電層１０がグラフェンから構成される場合、銅箔などの金属膜の表面にＣＶＤを用いてグラフェン単層膜を形成し、前記金属膜を溶解して水面上で洗浄を繰り返したのち、前記グラフェン単層膜を犠牲層１３又は高分子化合物層１１の表面に転写することにより、導電層１０を形成することができる。さらに、前記操作を繰り返すことで、複数層のグラフェンからなる導電層１０を形成することができる。

高分子化合物層１１の形成方法は特に限定されず、ＣＶＤ、スピンコーティングやインクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。例えば、高分子化合物層１１がポリパラキシレン又はその誘導体から構成される場合、パラキシレン又はその誘導体のダイマをＣＶＤにより成長していくことで、高分子化合物層１１を形成することができる。

電極が、図１（ｃ）に示す細胞内包化電極２００のように、２つの導電層１０ａ，１０ｂの間に高分子化合物層１１が挟まれた構成を有する場合、犠牲層１３上に導電層１０ａを形成し、次いで前記導電層１０ａ上に高分子化合物層１１を形成した後、前記高分子化合物層１１上に導電層１０ｂを形成すればよい。この場合、導電層１０ａの厚みは０．３～１０ｎｍとすることができ、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがより好ましい。高分子化合物層１１の厚みは１０～９００ｎｍとすることができ、４０～４００ｎｍであることが好ましく、５０～２５０ｎｍであることがより好ましい。導電層１０ｂの厚みは０．３～１０ｎｍとすることができ、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがより好ましい。

（その他の構成）
本工程において形成する電極膜３０２は、前記導電層１０及び前記高分子化合物層１１に加えて、その他の構成を含んでいてもよい。その他の構成は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。電極膜３０２は、その他の構成として、例えば、導電層１０及び高分子化合物層１１以外のその他の層を含んでいてもよい。その他の層は、当該層を構成する材料に応じて、適宜、厚み及び形成方法等を選択可能である。その他の層としては、例えば、タンパク質層、及び金属層等が挙げられる。

電極膜３０２がタンパク質層を含む場合、前記タンパク質層は、電極膜３０２の最上層に形成することが好ましい。すなわち、図２の例では、高分子化合物層１１上にタンパク質層を形成することが好ましい。タンパク質層を構成するタンパク質としては、上記「＜電極＞」の項で挙げたものと同様のものが挙げられる。
タンパク質層を形成する方法は特に限定されないが、例えば、タンパク質溶解液又はタンパク質懸濁液に、電極膜３０２を浸漬する方法等が挙げられる。

電極膜３０２が金属層を含む場合、金属層の厚みは、例えば、１０ｎｍ～１００μｍとすることができる。金属層は、導電層１０に隣接して設けることができ、犠牲層１３上に導電層１０を形成した後、前記導電層１０上に金属層を形成してもよい。あるいは、犠牲層１３上に高分子化合物層１１を形成した後、前記高分子化合物層１１上に金属層を形成し、次いで前記金属層上に導電層１０を形成してもよい。この場合、後述の工程（ｂ）において三次元湾曲形状を形成させる部分には、金属層を形成しないことが好ましい。
金属層の形成方法は特に限定されず、蒸着法、スパッタ法、直接塗布（例えば、銀ペーストの直接塗布）などの方法が利用可能である。

［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記膜に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる工程である。

膜の厚み方向の歪みの勾配は、それぞれ所定の厚みを有する導電層１０と高分子化合物層１１とを密着、接合することにより得ることができる。図２の例では、犠牲層１３上に、導電層１０及び高分子化合物層１１を形成することで、電極膜３０２の厚み方向に歪みの勾配が発生する。ここで、犠牲層１３を溶解することにより（図２（ｉ））、前記歪みの勾配を駆動力として、電極膜３０２に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させることができる（図２（ｊ））。

犠牲層１３の溶解は、犠牲層１３の材料に応じて、適宜行うことができる。例えば、犠牲層１３がアルギン酸カルシウムゲルで構成される場合には、クエン酸ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、又はアルギナーゼと呼ばれる酵素などを添加することで、犠牲層１３を溶解することができる。また、犠牲層１３が、エッチング液により溶解可能な金属薄膜であればエッチング液により溶解することができ、温度変化によりゲル－ゾル転移を誘導できるポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）であれば温度変化により溶解することができ、紫外線照射によりゲル－ゾル転移を誘導できるフォトレジスト類であれば紫外線照射により溶解することができる。

［工程（ｃ）］
本実施態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）の後かつ前記工程（ｂ）の前に、（ｃ）前記積層体の表面に、細胞を存在させる工程を有していることが好ましい。

図２（ｈ）は、電極膜３０２の表面に、細胞２を存在させた状態を示す概略図である。細胞２は、電極膜３０２の表面の垂直位置上のいずれかの位置に存在していればよく、電極膜３０２の表面上に浮遊していてもよく、電極膜３０２の表面に接着していてもよい。前記工程（ｂ）により自己組織的に組み立てられる電極３００の内部空間に細胞２を内包させるために、電極膜３０２の表面から細胞２までの距離は、電極膜３０２の短軸方向の長さの１／２よりも小さいことが好ましい。細胞２は、上記「＜電極＞」の項で記載したものと同様である。
電極膜３０２の表面に細胞２を存在させる方法は特に限定されず、任意の方法と用いることができる。電極膜３０２の表面に細胞２を存在させる方法としては、例えば、細胞２の培養液又は懸濁液を電極膜３０２の表面に滴下する方法、電極膜３０２を細胞２の培養液又は懸濁液に浸漬する方法等が挙げられる。
電極膜３０２の表面に存在させる細胞２の数は、前記細胞２の培養液又は懸濁液中の細胞２の濃度により制御することができる。

上記のようにして、電極３００を製造することができる。

一実施形態において、本実施態様に係る製造方法は、基板上に、犠牲層を形成する工程と、前記犠牲層上に、導電層及び高分子化合物層１１を含む膜（積層体）を形成する工程と、前記膜（積層体）の表面に細胞２を存在させる工程と、前記犠牲層を溶解して、前記膜（積層体）の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記膜（積層体）に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる工程を含むものであってもよい。前記の膜（積層体）を形成する工程は、犠牲層上に、高分子化合物層を形成し、前記高分子化合物層上に導電層を形成する工程であってもよく；犠牲層上に、導電層を形成し、前記導電層上に高分子化合物層を形成する工程であってもよく；犠牲層上に、第１の導電層を形成し、前記導電層上に高分子化合物層を形成し、前記高分子化合物層上に第２の導電層を形成する工程であってもよい。

［他の工程］
本実施態様に係る製造方法は、上記工程（ａ）～（ｃ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は特に限定されないが、他の工程としては、例えば、電極膜３０２をパターニングする工程（パターニング工程）、細胞を培養する工程（培養工程）等が挙げられる。

（パターニング工程）
本実施態様の方法は、パターニング工程を含むことが好ましい。パターニング工程は、前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に行うことが好ましい。電極膜３０２をパターニングする方法は特に限定されず、公知のパターニング方法を用いることができる。パターニング方法としては、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、及びドライエッチング法等の微細加工技術を適用することが可能である。

図２（ｅ）～（ｆ）は、電極膜３０２のパターニング工程の一例を説明する図であり、レジスト層１５を用いて電極膜３０２のパターニングを行っている。図２（ｅ）では、電極膜３０２上にレジスト層１５を形成した状態を示している。レジスト層１５の形成方法は特に限定されず、スピンコート法等の公知の方法を用いることができる。レジスト層１５を、任意の形状のフォトマスクを通して露光し、現像液を用いて現像することにより、任意の形状のレジストパターンを得ることができる。前記レジストパターンを物理マスクとして、電極膜３０２及び犠牲層１３をエッチングすることにより、任意の形状にパターニングされた電極膜３０２を得ることができる（図２（ｆ））。前記のパターニングにおいて、犠牲層１３は、電極膜３０２とともにパターニングしてもよいし、パターニングしなくてもよいが、パターニングの容易性及び犠牲層１３の分解性等の観点から、電極膜３０２とともにパターニングすることが好ましい。

微細な構造のパターニングを行う場合には、電極膜３０２が二次元平面形状を有していることが好ましいが、基板１４及び犠牲層１３上に電極膜３０２を形成することにより、電極膜３０２は二次元平面形状を維持することができる。

パターニングにより形成するパターン形状は特に限定されないが、パターニングにより電極膜３０２に孔を形成することが好ましい。したがって、電極膜３０２をパターニングする工程は、電極膜３０２に孔を形成する工程であってもよい。孔の形状、大きさ及び配置は、上記「＜電極＞」の項で例示したものと同様のものが例示される。

また、パターニングにより、電極膜３０２を任意の二次元形状及び大きさとしてもよい。したがって、電極膜３０２をパターニングする工程は、電極膜３０２を任意の二次元形状及び大きさにパターニングする工程であってもよい。例えば、筒状の電極３００を得る場合には、電極膜３０２は長方形状にパターニングすることが好ましい。前記長方形の大きさは、内包する細胞の大きさ、及び電極３００の使用目的等に応じて適宜選択すればよく、例えば、縦４００～４０００μｍ、横２０～４００μｍ等とすることができる。

電極膜３０２のパターニングにおいて、孔の形成と二次元形状の形成とを行う場合、孔の形成と二次元形状の形成は同時に行ってもよく、複数回のパターニングで別々に行ってもよい。

（培養工程）
本実施態様の方法は、培養工程を含んでいてもよい。培養工程は、工程（ｃ）の後かつ工程（ｂ）の前に行ってもよく、工程（ｂ）の後に行ってもよい。細胞が接着性を有する細胞である場合、工程（ｃ）の後かつ工程（ｂ）の前に培養工程を行うことで、電極膜３０２に細胞を接着させることができる。そのため、工程（ｂ）において、電極膜３０２に三次元湾曲形状を形成させる際に、三次元湾曲形状の内部空間に細胞を確実に内包させることができる。
また、工程（ｂ）の後に培養工程を行うことで、電極３００の三次元湾曲形状に沿って細胞を増殖させることができる。
培養条件は、細胞の種類に応じて、当該細胞の培養に一般的に用いられる条件を用いることができる。

本実施態様の方法では、三次元湾曲形状の形成とともに当該三次元湾曲形状の内部空間に細胞を内包させるため、任意の三次元形状を有する電極の内部空間に細胞を内包させることができる。従来の金属電極では、微細な三次元生体組織の形状に沿って金属層を含む多層薄膜を張り付けることは困難であり、薄膜の部分的な剥離により電極の性能が著しく低下してしまうという問題があった。しかしながら、本実施態様の方法では、それぞれ所定の厚みを有する導電層及び高分子化合物層を含む積層体に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させると同時に、内部空間に細胞を内包させるため、任意の三次元生体組織の形状を有する電極を形成することができる。特に、導電層及び高分子化合物層に互いに密着性の高い材料を用いることで、三次元形状への構造変化に伴う剥離や横滑り、及び断線等を抑制することができる。また、電極膜の形状を任意の形状及び大きさに設計することで、任意の三次元形状及び大きさを有する電極を得ることができる。
また、基板及び犠牲層上に電極膜を形成することで、電極膜を平面状態に維持することができ、任意のタイミングで電極膜を基板から剥離させ、三次元湾曲形状の形成を開始させることができる。

＜積層体＞
本発明の一態様にかかる積層体は、基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された導電性材料を含む層（導電層）と、前記導電層上に積層された高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、を含む。

本実施態様にかかる積層体の具体例としては、図２（ｇ）に例示される積層体３０３が挙げられる。
基板１４、犠牲層１３、導電層１０、及び高分子化合物層１１は、上記「＜電極の製造方法＞」の項で説明したものと同様である。本実施態様の積層体３０３は、導電層１０及び高分子化合物層１１を貫通する孔を有していることが好ましい。孔としては、上記「＜電極＞」の項で例示したものと同様のものが例示される。

本実施態様にかかる積層体は、前記実施態様にかかる電極の製造に用いることができる。

以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］電極膜の作製例
図２（ａ）～（ｇ）のプロセスに従い、積層体３０３を作製した。
基板１４として、ガラス基板を用いた。ガラス基板上で、アルギン酸ナトリウム溶液をスピンコーティングし、その後１００ｍＭの塩化カルシウム溶液の中に浸漬することでアルギン酸カルシウムゲルの犠牲層を形成した。犠牲層の厚みはアルギン酸ナトリウム溶液の濃度とスピンコーティングの速度を変化させることで制御可能である。本実施例では、２ｗｔ％のアルギン酸ナトリウム溶液を３０００ｒｐｍでスピンコーティングすることで４０ｎｍのゲル層を形成した。

次に、犠牲層１３の表面に、導電層１０を転写した。本実施例では、導電層１０として、銅箔の表面にＣＶＤを用いて作製された単層のグラフェンを用いた。銅箔は塩化第二鉄溶液により溶解され、水面上で洗浄を繰り返した後、グラフェン単層（導電層１０）を犠牲層１３の表面に転写した。本作業を繰り返すことで、複数層のグラフェンを犠牲層１３の表面に積層することも可能となる。
次に、パラキシレンダイマーをＣＶＤにより成長していくことで、導電層１０上にポリパラキシレン（パリレン）からなる高分子化合物層１１を形成した。高分子化合物層１１の厚みは、ＣＶＤ成長の原料となるパラキシレンダイマーの重量により制御可能である。本実施例では、５０ｍｇのパラキシレンダイマーを、ＣＶＤ法を用いて導電層１０上に成長させることで、５０ｎｍの高分子化合物層１１を形成した。

次に、高分子化合物層１１上に、フォトレジストをスピンコーティングし、レジスト層１５を形成した。任意の形状のフォトマスクを通してレジスト層１５に紫外光を照射し、任意の形状の物理マスクをパターニングした。その後、酸素プラズマにより、高分子化合物層１１、導電層１０及び犠牲層１３をエッチングした。エッチングは、基板１４上に成膜した犠牲層１３に届くまで行った。最後に、アセトンによりレジスト層１５を除去して高分子化合物層１１を上面として露出させて、電極膜３０２を得た。

図３に、パターニング後の電極膜の位相差顕微鏡像を示す。図３（ａ）～３（ｄ）に示す二次元電極は、縦６００μｍ、横３００μｍの長方形状にパターニングしたものである。（ａ）は孔なし、（ｂ）は直径８μｍの孔が５０μｍ間隔で形成されたもの、（ｃ）は直径８μｍの孔が２５μｍ間隔で形成されたもの、（ｄ）は直径１５μｍの孔が５０μｍ間隔で形成されたものである。なお、前記の孔の間隔は、隣接する孔どうしの中心間距離を意味する。

［実施例２］電極の作製
図２（ｈ）～（ｊ）のプロセスに従い、電極を作製した。
ラットの海馬組織から単離した初代培養神経細胞の細胞培養液を電極膜３０２上に播種し、電極膜３０２の表面上に神経細胞を存在させた。
基板１４、犠牲層１３および電極膜３０２からなる積層体３０３に、キレート剤であるＥＤＴＡ溶液を添加することで、犠牲層１３を溶解した。ＥＤＴＡ溶液の添加後、軸方向への電極膜３０２の屈曲が誘導されることが観察された。これにより長軸方向の長さを維持した状態の筒状の電極が得られた。ＥＤＴＡ溶液を添加してから筒状の電極が完成するまでの時間は、添加するＥＤＴＡ溶液の最終濃度と基板を浸漬している溶液の種類により制御が可能である。
図４は、電極膜３０２の湾曲に伴う初代培養神経細胞の内包化過程を示す位相差顕微鏡像である。ＥＤＴＡ添加後から０秒後（ｔ＝０ｓ）、４秒後（ｔ＝４ｓ）、８秒後（ｔ＝８ｓ）、１２秒後（ｔ＝１２ｓ）、１６秒後（ｔ＝１６ｓ）、２０秒後（ｔ＝２０ｓ）の位相差顕微鏡像を示す。電極膜の湾曲に伴って、培養液中に浮遊した細胞が、電極膜により形成される三次元湾曲形状の内部空間内に内包される過程を観察することができた。導電層１０及び高分子化合物層１１からなる電極膜３０２が自己組織的に湾曲可能であること、及び湾曲の過程で細胞が内包化されることを確認することができた。

［実施例３］細胞内包化電極における神経突起の誘導
上記のように作製した細胞内包化電極を培養皿上で培養し、電極に内包された細胞が、外部環境に神経突起を伸長できるか否かを確認した。
図５は、細胞内包化電極に内包化された細胞をタイムラプス撮影した位相差顕微鏡像である。（ａ）は電極表面に孔を有さない電極であり、（ｂ）は電極表面に直径８μｍの孔を有する電極である。
孔の有無にかかわらず、培養後５日間の観察期間中、電極に内包化された細胞が維持された。孔のない電極においては、培養日数の経過により筒状の電極の筒端部から神経突起の伸長する様子が観察されたが、筒壁面から神経突起の伸長する様子は観察されなかった（図５（ａ））。一方、直径８μｍの孔を形成した電極では、孔から神経突起が伸長し、培養皿上の広範囲に神経突起が伸展する様子が観察された。
また本実施例では、電極の両端が開口している場合を示している。一方、電極の片端あるいは両端が閉じられているもよい。電極の片端が閉じられている場合は、細胞の電極内外へ移動を開口端に限定することが可能になる。電極の両端が閉じられているときは、細胞の電極内外の移動を抑制することが可能になる。

［実施例４］自己組立て前後の電気的特性の変化
図６（１）～（４）に示すプロセスに従って、三次元湾曲形状を有する電極を作製した。
基板１４上に、犠牲層１３を形成し、その表面に導電層１０を転写した（図６（１））。基板１４、犠牲層１３及び導電層１０は、実施例１と同様のものを用いた。次に、その導電層１０の両末端に金電極（金属層１６）を蒸着した（図６（２））。その後、パリレン層（高分子化合物層１１）を蒸着し、その表面をパターニングした（図６（３））。そして、ＥＤＴＡ溶液の添加により凹型に構造変化した電極４００を得た（図６（４））。

上記に示す、自己組立て前後の電極４００のＩ－Ｖ曲線を図６（５）に示す。
図６（１）に示す結果から、構造変化に伴う抵抗の変化は観察されたものの、三次元湾曲形状を形成しても断線することなく、安定した導電性が保持されていることが確認できた。

本発明によれば、細胞を内包化させることができ、生体内に埋植することが可能な電極、及びその製造方法、並びに当該電極の製造に用いる積層体が提供される。前記電極は、細胞を内包化させることにより移植組織として使用することができる。生体内に移植された細胞内包化電極では、移植組織と電極との接触が固定化されるため、生体内で移植組織の活動を長期間に亘って計測することが可能である。

２…細胞、ホスト組織…３、１０，１０ａ，１０ｂ…導電層１０…高分子化合物層１１…孔、１３…犠牲層、１４…基板、１５…レジスト層、１６…金属層、２０…細胞体、２１…神経突起、３０…ホスト組織の神経細胞、３１…ホスト組織の神経細胞の細胞体、３２…ホスト組織の神経細胞の神経突起、１００，２００，３００…電極、１０１，２０１，３０２…電極膜、３０３…積層体

Claims (9)

1. 内部空間を有する電極であって、
   前記電極は、導電性材料を含む層（導電層）を有する膜を含み、
   前記内部空間は、前記膜が湾曲することにより形成されており、
   前記内部空間に細胞が存在していることを特徴とする、
   電極。
2. 前記膜は、前記内部空間と前記電極の外部空間とを連通する孔を有することを特徴とする、
   請求項１に記載の電極。
3. 前記電極の形状が筒状であることを特徴とする、
   請求項１又は２に記載の電極。
4. 前記筒状の形状は、前記筒の片端又は両端が、閉鎖されていることを特徴とする、
   請求項３に記載の電極。
5. 前記膜は、高分子化合物を含む層（高分子化合物層）をさらに有することを特徴とする、
   請求項１～４のいずれか一項に記載の電極。
6. 前記高分子化合物層及び前記導電層が、光透過性を有する材料で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の電極。
7. 前記導電性材料が、導電性炭素材料であることを特徴とする、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の電極。
8. 電極の製造方法であって、
   （ａ）高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、導電性材料を含む層（導電層）と、を有する膜を形成する工程と、
   （ｂ）前記膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記膜に、自己組織的に三次元湾曲形状を形成させる工程と、を有し、
   前記工程（ａ）の後かつ前記工程（ｂ）の前に、
   （ｃ）前記膜の表面に、細胞を存在させる工程を有することを特徴とする、
   電極の製造方法。
9. 基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された導電性材料を含む層（導電層）と、前記導電層上に積層された高分子化合物を含む層（高分子化合物層）と、を含み、前記高分子化合物層の表面に細胞が存在している、積層体。

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