JP7058401B2 - 多量子ドットに基づく生体分子高感度検出方法 - Google Patents
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Description
<コア粒子>
ストーバー(Stober(oはウムラウト))法によって120nmの直径を有するシリカ粒子(10mg/ml)を調製した。
量子ドットに対する結合部位を提供する材料として10μlの1%(体積/体積)3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTS)を前記コア粒子に添加した。混合物を25℃で12時間撹拌して前記コア粒子の表面にチオール基を導入した。
量子ドット埋め込み層の表面に追加の量子ドットに対する結合部位を有する前記構造体をエタノールで3回洗浄した。シラノール反応物質としての50μlのオルト珪酸テトラエチル及び塩基としての25%水酸化アンモニウムを68rpmで20時間撹拌し、エタノールで3回洗浄して、シリカシェル及び該シリカシェル中に存在する多量子ドットから構成されるシリカ/量子ドット複合シェルを形成した。
50μlのメルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPTES)及び50μlの塩基としての25%水酸化アンモニウム(NH4OH(水溶液))を<量子ドット埋め込み層>の欄に記載したように連続的に添加するのではなく同時に添加すること以外は実施例1と同様にして多量子ドット含有ナノ粒子を調製した。その結果、多量子ドットを含有するシリカの単独シェルが形成された。
実施例1で調製された多量子ドット含有ナノ粒子及び比較例1で調製された多量子ドット含有ナノ粒子の量子収率と輝度を測定した。結果は図3にまとめて示す。図3は水溶性リガンドとしてのCOOHで修飾された量子ドットを含有するナノ粒子(QD-COOH)、比較例1で調製された多量子ドット含有ナノ粒子(シングルシリカQD。sQDで示す。)、及び実施例1で調製された多量子ドット含有ナノ粒子(QD2。mQDで示す。)の量子収率と輝度を比較している。前記QD-COOH(対照)のQY、前記シリカ被覆QDのQY、及び前記多層量子ドット含有ナノ粒子(QD2)のQYを図3のAに示す。前記シングルQD及び前記多層量子ドット含有ナノ粒子の蛍光強度を図3のBに示す。365nmのUVランプを用いて、前記シングルQD及び前記多層量子ドット含有ナノ粒子を観察した(図3のC)。
この実施例では、種々のサイズの多層多量子ドットを含有するナノ粒子が(多重)標識部位として機能し得るかどうかの可能性を調べた。
前記多層多量子ドット含有ナノ粒子の生物学的検出キットへの適用について図5を参照して説明する。図5は、本発明の多層多量子ドット含有ナノ粒子の生物材料検出キットへの適用と関連領域の部分拡大図を模式的に示す。
実施例1で調製された前記多層多量子ドット含有ナノ粒子1mgを(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTS溶液、5%体積/体積、1mL)に添加し、室温で1時間撹拌した。次に、当該混合物をエタノールで3回洗浄し、そこに75mgの無水コハク酸、500μlの2-メチル-2-ピロリドン(NMP)溶液、及び3.50μlのN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を添加した。得られた混合物を2時間撹拌した。
10pmolの抗体を100μgの前記表面修飾済み多層量子ドット含有ナノ粒子に添加し、室温で2時間振盪した。次に、その反応産物をPBS(pH7.2)で4回洗浄し、前記抗体結合多層量子ドット含有ナノ粒子にウシ血清アルブミン(BSA)溶液(5%重量/重量、1mL)を添加し、続いて室温で1時間振盪した。
図7に示すように、実施例1と同様にして調製した多層量子ドットナノ粒子及び抗体結合磁性ビーズを用いて抗原に対するサンドウィッチアッセイを実施した。
<ポリスチレンシード>
シード重合により単分散マクロ多孔性ポリスチレン-ジビニルベンゼンビーズを調製した。具体的には、分散重合法を用いて単分散ポリスチレンシード(4μm)を調製した。分散媒体は立体安定剤として1gのポリビニルピロリドン-40(PVP-40)を含有するエタノール/2-メトキシエタノール(3:2、体積/体積)(90mL)であった。
オーバーヘッドスターラーと還流濃縮器を取り付けたガラス製反応容器中で、0.25%(重量/重量)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有するフタル酸ジブチル(DBP、0.7mL)乳化水性媒体(100mL)の中に前記ポリスチレンシード(4μm、700mg)を分散させた。得られた分散媒体を室温、400rpmで20時間撹拌し、スチレン(4.6mL)及びジビニルベンゼン(DVB、2.3mL)中のBP(240mg)からなるDBP混合物中で前記ポリスチレンシードを膨潤させ、ホモジナイザーを使用することにより0.25%(重量/重量)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する100mLの水性媒体の中に前記ポリスチレンシードを1分間浸漬した。対応する乳化モノマー溶液を前記フタル酸ジブチル(DBP)膨潤ポリスチレンシード分散媒体に撹拌しながら添加した。
連続的に400rpmで撹拌しながら室温でモノマー膨潤を20時間実施した。膨潤処理の後に蒸留水(10mL)中の10%(重量/体積)ポリビニルアルコール(PVA)の水溶液を前記分散媒体に添加し、前記媒体を窒素流で30分間パージした。連続的に200rpmで撹拌しながらシード重合を70℃で20時間実施して単分散PS-DVBビーズを得た。
得られたマクロ多孔性PS-DVBビーズ(1g)を氷浴中の5mLの酢酸に添加した。次に、硫酸(50mL)を室温でゆっくりと前記ビーズに添加し、温度を90℃まで上げ、前記樹脂混合物を30分間~2時間撹拌した。この分散体を氷冷水(400mL)中に注いで反応を停止させ、そしてスルホン化PS-DVBビーズを遠心分離により収集した。遠心分離を繰り返すことにより脱イオン水で前記ビーズを徹底的に洗浄した。次に、このスルホン化ビーズをエタノールで3回洗浄し、真空下で乾燥した(1.1g)。
機械的撹拌(200rpm)及び窒素によるパージを行いながら前記スルホン化マクロ多孔性PS-DVBビーズ(500mg)を室温の脱イオン水(10mL)中に分散し、そして窒素でパージした。新たに調製した、脱イオン水(10mL)中のFeCl3・6H2O(618mg、2.26mmol)とFeCl2・4H2O(257mg、1.28mmol)との混合物を前記分散体に添加して吸着させた。
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン溶液(1%(体積/体積)、100mL)を100mgの前記磁化ビーズに添加し、室温で10分間振盪した。次に、水酸化アンモニウム(28%、2mL)を前記ビーズ分散体に添加し、室温で20分間振盪した。この分散体にTEOS(2mL)を添加し、室温で12時間激しく振盪した。生じたシリカ被覆磁性ビーズを磁石により収集し、そしてエタノールで5回洗浄した。
実施例1の<前記多層多量子ドット含有ナノ粒子の表面修飾>の欄に記載されている方法を繰り返した。
図7に示されているように抗体(10μM)を100μgの前記表面修飾済み磁性ビーズに添加し、室温で2時間振盪した。次に、当該混合物をPBS(pH7.2)で4回洗浄した。BSA溶液(5%(重量/重量)、1mL)を前記抗体結合磁性ビーズに添加し、室温で1時間振盪し、PBS(pH7.2)で4回洗浄し、そしてPBS(pH7.2)中に分散させた。
PBS(pH7.2)中に分散した抗原を100μgの前記抗体結合磁性ビーズに添加し、室温で1時間振盪した。次に、図7の右側に示されているように磁石を用いて当該混合物をPBS(pH7.2)で4回洗浄し、そして100μgの前記抗体結合多層量子ドット含有ナノ粒子を当該混合物に添加した。当該混合物を室温で1時間振盪し、1時間にわたってPBS(pH7.2)で4回洗浄し、そして300μlのPBS(pH7.2)中に分散させてバイオプラットフォームを構築した。
本開示に係る態様には以下の態様も含まれる。
<1> それぞれのナノ粒子が、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子の表面に結合した複数の量子ドットを含み、かつ、前記コア粒子の表面全体を取り囲む量子ドット埋め込み層、及び、前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェルを含む、量子ドットでドープされたナノ粒子。
<2> 前記量子ドット埋め込み層を構成する前記量子ドットが前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成するシリカ材料と架橋結合しており、前記架橋により前記量子ドットが前記シリカ材料にランダムに結合した構造が形成されている、<1>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<3> 前記量子ドットに対する結合部位を提供する材料によって前記架橋結合が形成されており、前記量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料はその両末端に官能基を有し、前記材料の一方の末端に存在する官能基は前記量子ドットの表面に結合しており、かつ、前記材料の他方の末端に存在する官能基は前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成する前記コア粒子又はシリカ粒子に結合している、<2>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<4> 前記量子ドット埋め込み層は疎水性有機化合物で被覆された前記量子ドットを前記コア粒子の外表面上に複数回ドープすることにより形成されており、ドープされた前記量子ドットは前記コア粒子の周囲に順々に層を形成している、<1>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<5> 前記シリカ/量子ドット複合シェルは前記量子ドット埋め込み層の外表面に形成される複数の層から構成され、前記量子ドット埋め込み層を連続的に取り囲む、<1>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<6> 前記シリカ/量子ドット複合シェルを取り囲むシリカベースのシェルをさらに含む、<1>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<7> 前記量子ドットがタイプIの量子ドットである、<1>に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
<8> (a)量子ドットに対する結合部位を提供する材料でポリマー又は無機のコア粒子の表面を修飾すること、(b)ステップ(a)の反応産物に疎水性有機化合物で被覆された量子ドットを供与し、反応を進行させて、前記コア粒子の外表面を取り囲む前記量子ドットを含む量子ドット埋め込み層を形成すること、(c)量子ドットに対する結合部位を提供する材料でステップ(b)の反応産物の表面を修飾すること、(d)ステップ(c)の反応産物に塩基を供与し、反応を進行させて、前記量子ドット埋め込み層の表面上に量子ドットに対する追加の結合部位を形成すること、及び、(e)ステップ(d)の反応産物にシラノール反応物質及び塩基を供与し、反応を進行させ、生じた反応産物を精製して複数の層の前記量子ドットが前記コア粒子を取り囲んでいる構造を有しているシリカ/量子ドット複合シェルを形成すること、を含む、量子ドットでドープされたナノ粒子の作製方法。
<9> ステップ(e)の前に、ある特定の回数だけ、ステップ(c)及びステップ(d)が繰り返される、<8>に記載の方法。
<10> ステップ(a)において、量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料を前記コア粒子と反応させて量子ドットに対する表面結合部位が形成されているコアを調製する、<8>に記載の方法。
<11> ステップ(b)の反応産物に疎水性有機溶媒を供与し、反応を進行させて、未結合の量子ドットをコア表面上の前記量子ドットに対する前記結合部位に結合させる、<8>に記載の方法。
<12> ステップ(c)において、量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料をステップ(b)の反応産物に供与し、反応を進行させて、前記材料の一方の末端に存在する官能基が前記量子ドット埋め込み層を構成する前記量子ドットの表面に結合し、かつ、前記材料の他方の末端に存在する官能基が前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成するシリカ材料と結合する部位として提供されるようにする、<8>に記載の方法。
<13> 前記量子ドットと、前記コア粒子と、結合部位を提供する前記材料との体積比が、1:0.000001~60:0.000001~890である、<8>に記載の方法。
<14> 前記コア粒子と、前記量子ドット埋め込み層と、前記シリカ/量子ドット複合シェルとの幅厚比が、1:0.1~9:1~10である、<8>に記載の方法。
<15> 量子ドットでドープされたナノ粒子が固定化されている感応膜表面を含む生物学的検出キット、ここで、量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の各々は、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子にドープされた量子ドットを含む量子ドット埋め込み層、及び前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェルを含む。
<16> 量子ドットでドープされたナノ粒子、及び、量子ドットでドープされた前記ナノ粒子とサンドウィッチアッセイ構造体を形成する磁性ビーズ、を含み、前記磁性ビーズが磁性材料を含有する高分子量重合体からなる、バイオプラットフォーム。
<17> 量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の各々が、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子の表面に結合した複数の量子ドットを含み、かつ、前記コア粒子の表面全体を取り囲む量子ドット埋め込み層、及び、前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェル、を含む、<16>に記載のバイオプラットフォーム。
<18> 前記量子ドット埋め込み層内の前記量子ドットが前記コア粒子の表面を取り囲み、取り囲んでいる前記量子ドットの複数の層が互いに積層されている、<17>に記載のバイオプラットフォーム。
<19> 量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の前記コア粒子と、前記量子ドット埋め込み層と、前記シリカ/量子ドット複合シェルとの幅厚比が1:0.1~9:1~10である、<18>に記載のバイオプラットフォーム。
<20> <16>から<19>のいずれか1つに記載のバイオプラットフォームに生物学的試料を注入して反応を進行させること、及び前記反応の間に放出される蛍光の強度を測定すること、を含む生物学的検出方法、ここで、量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の各々は、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子の表面に結合した複数の量子ドットを含み、かつ、前記コア粒子の表面全体を取り囲む量子ドット埋め込み層、及び、前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェル、を含み、前記量子ドット埋め込み層内の前記量子ドットは前記コア粒子の表面を取り囲み、取り囲んでいる前記量子ドットの複数の層は互いに積層されている。
<21> 量子ドットでドープされたナノ粒子が固定化されている感応膜表面を含む生物学的検出キットに生物学的試料を注入して反応を進行させること、及び、前記反応の間に放出される蛍光の強度を測定すること、を含む生物学的検出方法、ここで、量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の各々は、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子にドープされた量子ドットを含む量子ドット埋め込み層、及び、前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェル、を含む。
<22> 量子ドットでドープされた前記ナノ粒子は様々なサイズの量子ドットを用い、それにより、前記ナノ粒子の各々が有するシェル表面を生物学的試料の(多重)標識部位として機能させることができる、<21>に記載の生物学的検出方法。
<23> 前記蛍光強度が光学的方法により測定されるか、又は前記蛍光強度から変換された電気的信号が測定される、<21>に記載の生物学的検出方法。
<24> 量子ドットでドープされたナノ粒子及び量子ドットでドープされた前記ナノ粒子とサンドウィッチアッセイ構造体を形成する磁性ビーズを含むバイオプラットフォームに生物学的試料を注入して反応を進行させること、及び、前記反応の間に放出される蛍光の強度を測定すること、を含む生物学的検出方法、ここで、量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の各々は、ポリマー又は無機のコア粒子、前記コア粒子にドープされた量子ドットを含む量子ドット埋め込み層、及び前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェルを含む。
<25> 前記バイオプラットフォームを構成する量子ドットでドープされた前記ナノ粒子が様々なサイズの量子ドットを用い、それにより、前記ナノ粒子の各々が有するシェル表面を生物学的試料の(多重)標識部位として機能させることができる、<24>に記載の生物学的検出方法。
<26> 前記蛍光強度が光学的方法により測定されるか、又は前記蛍光強度から変換された電気的信号が測定される、<24>に記載の生物学的検出方法。
Claims (17)
- それぞれのナノ粒子が、
ポリマー又は無機のコア粒子、
前記コア粒子の表面に結合した複数の量子ドットを含み、かつ、前記コア粒子の表面全体を取り囲む量子ドット埋め込み層、及び
前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェル
を含み、
前記シリカ/量子ドット複合シェルにおいて、前記量子ドットがシリカ中に無作為に埋め込まれている、
量子ドットでドープされたナノ粒子。 - 前記量子ドット埋め込み層を構成する前記量子ドットが前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成するシリカ材料と架橋結合しており、前記架橋により前記量子ドットが前記シリカ材料にランダムに結合した構造が形成されている、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記量子ドットに対する結合部位を提供する材料によって前記架橋結合が形成されており、前記量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料はその両末端に官能基を有し、前記材料の一方の末端に存在する官能基は前記量子ドットの表面に結合しており、かつ、前記材料の他方の末端に存在する官能基は前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成するシリカ粒子に結合している、請求項2に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記量子ドット埋め込み層を構成する前記量子ドットが、両末端に官能基を有する材料によって共有結合的にコア粒子と結合しており、前記材料の一方の末端の官能基が前記量子ドットに結合した原子を含んでおり、前記材料の他方の末端の官能基が前記コア粒子と結合している、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記量子ドット埋め込み層は疎水性有機化合物で被覆された前記量子ドットを前記コア粒子の外表面上に複数回ドープすることにより形成されており、ドープされた前記量子ドットは前記コア粒子の周囲に順々に層を形成している、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記シリカ/量子ドット複合シェルは前記量子ドット埋め込み層の外表面に形成される複数の層から構成される、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記シリカ/量子ドット複合シェルを取り囲むシリカベースのシェルをさらに含む、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- 前記量子ドットがタイプIの量子ドットである、請求項1に記載の量子ドットでドープされたナノ粒子。
- (a)量子ドットに対する結合部位を提供する材料でポリマー又は無機のコア粒子の表面を修飾すること、
(b)ステップ(a)の反応産物に疎水性有機化合物で被覆された量子ドットを供与し、反応を進行させて、前記コア粒子の外表面を取り囲む前記量子ドットを含む量子ドット埋め込み層を形成すること、
(c)量子ドットに対する結合部位を提供する材料でステップ(b)の反応産物の表面を修飾すること、
(d)ステップ(c)の反応産物に塩基を供与し、反応を進行させて、前記量子ドット埋め込み層の表面上に量子ドットに対する追加の結合部位を形成すること、及び
(e)ステップ(d)の反応産物にシラノール反応物質及び塩基を供与し、反応を進行させ、生じた反応産物を精製して複数の層の前記量子ドットが前記コア粒子を取り囲んでいる構造を有しているシリカ/量子ドット複合シェルを形成すること、
を含み、
前記シリカ/量子ドット複合シェルにおいて、前記量子ドットがシリカ中に無作為に埋め込まれている、
量子ドットでドープされたナノ粒子の作製方法。 - ステップ(a)において、量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料を前記コア粒子と反応させて量子ドットに対する表面結合部位が形成されているコアを調製する、請求項9に記載の方法。
- ステップ(b)の反応産物に疎水性有機溶媒を供与し、反応を進行させて、未結合の量子ドットをコア表面上の前記量子ドットに対する前記結合部位に結合させる、請求項9に記載の方法。
- ステップ(c)において、量子ドットに対する結合部位を提供する前記材料をステップ(b)の反応産物に供与し、反応を進行させて、前記材料の一方の末端に存在する官能基が前記量子ドット埋め込み層を構成する前記量子ドットの表面に結合し、かつ、前記材料の他方の末端に存在する官能基が前記シリカ/量子ドット複合シェルを構成するシリカ材料と結合する部位として提供されるようにする、請求項9に記載の方法。
- 前記量子ドットと、前記コア粒子と、結合部位を提供する前記材料との体積比が、1:0.000001~60:0.000001~890である、請求項9に記載の方法。
- 前記コア粒子と、前記量子ドット埋め込み層と、前記シリカ/量子ドット複合シェルとの幅厚比が、1:0.1~9:1~10である、請求項9に記載の方法。
- 量子ドットでドープされたナノ粒子、及び
磁性ビーズ
を含み、
前記量子ドットでドープされたナノ粒子の各々が、
ポリマー又は無機のコア粒子、
前記コア粒子の表面に結合した複数の量子ドットを含み、かつ、前記コア粒子の表面全体を取り囲む量子ドット埋め込み層、及び
前記量子ドット埋め込み層を取り囲むシリカ/量子ドット複合シェル
を含み、
前記シリカ/量子ドット複合シェルにおいて、前記量子ドットがシリカ中に無作為に埋め込まれており、
前記磁性ビーズが磁性材料を含有する高分子量重合体からなる、
バイオプラットフォーム。 - 前記量子ドット埋め込み層内の前記量子ドットが前記コア粒子の表面を取り囲み、取り囲んでいる前記量子ドットの複数の層が互いに積層されている、請求項15に記載のバイオプラットフォーム。
- 量子ドットでドープされた前記ナノ粒子の前記コア粒子と、前記量子ドット埋め込み層と、前記シリカ/量子ドット複合シェルとの幅厚比が1:0.1~9:1~10である、請求項16に記載のバイオプラットフォーム。
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