JP7056675B2 - モノクローナル抗体の検出結果を向上する方法 - Google Patents
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Description
1.以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含むサンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上方法であって、ステップ(b)の選択的プロテアーゼ消化を、カオトロピック試薬及び還元剤の存在下、pH8~9の条件下で実施する、上記方法。
2.カオトロピック試薬がグアニジン塩酸塩、ウレア、チオウレア、エチレングリコール、及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される、上記1記載の方法。
3.カオトロピック試薬が0.5~3 Mの範囲の濃度のウレア又はチオウレアである、上記2記載の方法。
4.還元剤が、チジオトレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)又はその塩酸塩、トリブチルホスフィンからなる群より選択される、上記1~3のいずれか記載の方法。
5.還元剤が0.1~0.5 mMの範囲の濃度のTCEPである、上記4記載の方法。
6.以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上のための、カオトロピック試薬及び還元剤の使用。
7.カオトロピック試薬がグアニジン塩酸塩、ウレア、チオウレア、エチレングリコール、及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される、上記6記載の使用。
8.カオトロピック試薬が0.5~3 Mの範囲の濃度のウレア又はチオウレアである、上記7記載の使用。
9.還元剤が、チジオトレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)又はその塩酸塩、トリブチルホスフィンからなる群より選択される、上記6~8のいずれか記載の使用。
10.還元剤が0.1~0.5 mMの範囲の濃度のTCEPである、上記9記載の使用。
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含むサンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上方法であって、ステップ(b)の選択的プロテアーゼ消化を、カオトロピック試薬及び還元剤の存在下、pH8~9の条件下で実施する、上記方法を提供する。
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上のための、カオトロピック試薬及び還元剤の使用を提供する。
本発明の方法のステップ(a)は、サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップに相当する。
本発明の方法のステップ(b)は、上記ステップ(a)で得られたモノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップに相当する。
上記の通り、還元剤としてTCEPを選択すると、ステップ(b)の終了時に微量に残存する還元剤によって後の操作に支障が出る可能性が低く、またペプチドの安定性を向上させることも期待されるため、好適である。
本発明の方法のステップ(c)は、選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップに相当する。
<ステップ(a)>
1.モノクローナル抗体が含まれる生物学的サンプル5-10μLを約10-20倍量のPBS+0.1% n-オクチルチオグリコシド (OTG)に希釈する。
2.多孔質体懸濁液 (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, 50% slurry)を25μL加える。
3.5分程度穏やかにボルテックス攪拌する。
4.ウルトラフリーlow-protein binding Durapore PFDF (0.22μm)に全量回収する。
5.上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
6.PBS+0.1% OTGを300μL加え、上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
7.ステップ6を繰り返す。
8.界面活性剤を除くため、PBSを300μL加え、上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
9.ステップ8を繰り返す。
10.反応溶液(25mM Tris-HCl、pH8)を75-100μL加える。この溶液には10 fmol/μLのP14R合成ペプチドを添加しておく。
11.化学修飾トリプシンを固相したナノ粒子(0.5 mg/ml FGbeads懸濁液)を5-10μL加える。
12.飽和蒸気圧下50℃にて、穏やかに攪拌しながら4-6時間反応を行う。
13.反応液に10%ギ酸を10μL加えることで反応を停止する。
14.遠心ろ過(10,000g x 1分間)し、溶液を回収する。
15.磁気スタンドに立て、約1-2分間静置し、余剰樹脂を除去する。
16.LCMS分析に供する。
測定対象としてアダリムマブを用い、サンプル中のアダリムマブをnSMOL法で検出するためのプロトコールの改良を検討した。
図1に、アダリムマブの重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す(配列番号1及び2)。アダリムマブの検出のためにnSMOL法で検出可能な複数のペプチド候補が選定されたが、ヒト血漿中に存在し得る他の抗体由来のペプチドと同じ配列となるペプチドを除外する等の選定により、アダリムマブのFab領域に存在するシグネチャーペプチドとして下線で示す配列APYTFGQGTK(配列番号3)を有するペプチドを選択した。
得られた懸濁液をフィルターカップ(ミリポア社ウルトラフリーMC-GV)に移し、遠心分離(10,000 g x 1 分間)して上清を除去した。
反応停止溶液(10% ギ酸)を5μL加え、遠心ろ過をして、磁気分離によって溶液を回収した。
測定は、上記の配列番号3のペプチドについて実施した。測定条件は以下に示す通りである。
溶媒A:0.1%ギ酸含有水溶液
溶媒B:0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液
流速:0.4 ml/分又は1 ml/分
平衡化濃度:%B=1.0
カラム:Shimpack GISS C18, 2 mm x 50 mm(島津製作所)
カラム温度:50℃
1.50 分 ポンプ中溶媒B濃度 1%
4.70 分 ポンプ中溶媒B濃度 42%
4.71 分 ポンプ中流速 0.4 ml/分
4.72 分 ポンプ中溶媒B濃度 95%
4.73 分 ポンプ中流速 1 ml/分
5.65 分 ポンプ中溶媒B濃度 95%
5.66 分 ポンプ中溶媒B濃度 1%
6.05 分 ポンプ中流速 1 ml/分
6.06 分 ポンプ中流速 0.4 ml/分
ネブライザーガス 3 L/分
ヒーティングガス 10 L/分
ドライイングガス 10 L/分
インターフェイス温度 300℃
脱溶媒温度 240℃
ヒートブロック温度 400℃
使用ガス アルゴン
使用分圧 270 kPa
還元剤として2 mM TCEP(シグマアルドリッチ社製)を用い、カオトロピック試薬として1M ウレア(シグマアルドリッチ社製)が共存した場合の効果を確認した。1M ウレアの存在下、及び不存在下、pH8、pH8.5及びpH9の条件で、実施例1と同様のnSMOL法を行った。その結果、図3に示すように、実施例1と同様に、カオトロピック試薬の存在下及び不存在下のいずれにおいてもpHが高い程高いシグナル強度が得られ、またカオトロピック試薬が共存した場合により収率が上がることが確認された。
カオトロピック試薬は高濃度では変性作用もあるため、濃度の最適化の検討が必要と考えられた。
カオトロピック試薬として1M ウレアを用い、還元剤の濃度を変えて効果を検討した。具体的には、0.5~3 mMのTCEPを共存させて、pH8.5で実施例1と同様のnSMOL法を行った。その結果、図4に示すように、還元剤濃度が低い程、反応収率および内部標準比率が高いことが判明した。
従って、より低濃度の還元剤の使用を検討する必要があると考えられた。
カオトロピック試薬として2M ウレアを用い、TCEPの不存在下、及び実施例3よりも低濃度である0.1~0.3 mMのTCEPの存在下で、pH8.5で実施例1と同様のnSMOL法を行った。
その結果、図5に示すように、還元剤の不存在下ではピーク強度は低く、0.1~0.3 mMの濃度では高いピーク強度が得られた。従って、2M ウレアを用いてpH8.5で反応させた場合、アダリムマブの検出においては0.1~0.2 mMのTCEPが存在することが最適であることが示された。
カオトロピック試薬として2M ウレアを用い、実施例4より更に低濃度の0.01~0.2 mMのTCEPの存在下で実施例1と同様のnSMOL法を行った(pH8.5)。
その結果、図6に示すように、アダリムマブの検出においては0.05~0.2 mMの濃度、特に0.1~0.2 mMのTCEPの使用が最適であることが確認された。
還元剤として0.5 mM TCEPを用い、ウレアの不存在下、1 M又は2 Mウレアの存在下で実施例1と同様のnSMOL法を行った(pH8.5)。
その結果、図7に示すように、本発明で使用する低濃度還元剤の使用条件においては、カオトロピック試薬として2M ウレアが最適であることが確認された。一般的なタンパク質変性作用は約7 Mのウレアで生じるため、本濃度は変性作用やカオトロピック作用ではなく、例えば遊離ペプチドの安定化、遊離効率等に寄与するものではないかと考えられた。
低濃度還元剤の使用条件において、アダリムマブのnSMOL法による検出におけるカオトロピック試薬濃度依存性を検討した。具体的には、カオトロピック試薬として0~3M ウレアを用い、還元剤として0.01~0.2 mMのTCEPを用いて実施例1と同様のnSMOL法を行った(pH8.5)。
その結果、図8に示すように、3M ウレアを使用した場合、還元剤濃度依存的に収率が下がることが確認された。一方、添加ISTDは、遊離ペプチドに対し余剰に上昇していることがわかった。これらの結果から、カオトロピック試薬として2M ウレア、還元剤として0.1~0.2 mM TCEPが最適であると考えられた。
上記の実施例に示す結果、及び他に検討した様々な結果から、nSMOL法によるアダリムマブの検出のために、カオトロピック試薬として2M ウレア、還元剤として0.2mM TCEPを使用し、pH8.5の条件で反応させた場合と、カオトロピック試薬及び還元剤の不存在下、pH 8の条件で反応させた場合とで、他の条件は同じとして検出されたピーク強度を比較した。
その結果、図9に示すように、本発明の方法(Urea/TCEP)において、従来の方法(対照)よりも約30倍も高い値が得られ、顕著な向上効果がもたらされた。
上記の実施例8で感度向上効果が確認された条件(2M ウレア、0.2mM TCEP、pH8.5)を用いて2~250μg/mLの濃度範囲のアダリムマブを含有するサンプルをnSMOL法によって分析した。
種々の抗体を用いて、アダリムマブと同様の検討を行った。トラスツズマブ(中外製薬株式会社)、セツキシマブ(ブリストル・マイヤーズスクイブ社)、リツキシマブ(全薬工業株式会社)、ニボルマブ(小野薬品工業株式会社)のそれぞれについて、アミノ酸配列情報等に基づいて表3に示すシグネチャーペプチドを選択し、0.1mM、0.2mM、0.5mM TCEPの存在下で検出結果を比較した(2M ウレア、pH8.5)。
実施例10で検討した0.2mMのTCEP濃度を用い、トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ニボルマブについて、カオトロピック試薬及び還元剤の不存在下、pH 8の条件(対照)と、2M ウレア、0.2mM TCEP、pH8.5の条件とでnSMOL法をそれぞれ行った場合のシグネチャーペプチドのピーク強度を比較した。
上記の実施例11で顕著な感度向上効果が得られた2M ウレア、0.2mM TCEP、pH8.5の条件を用いて、2~250μg/mLの濃度範囲のトラスツズマブを含有するサンプルをnSMOL法によって分析した。測定は、配列番号4のペプチドをシグネチャーペプチドとして行った。
Claims (6)
- 以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含むサンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上方法であって、ステップ(b)の選択的プロテアーゼ消化を、カオトロピック試薬及び還元剤の存在下、pH8~9の条件下で実施するものであり、プロテアーゼがトリプシンであり、かつカオトロピック試薬が0.5~3 Mの範囲の濃度のウレア又はチオウレアである、上記方法。 - 還元剤が、チジオトレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)又はその塩酸塩、トリブチルホスフィンからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 還元剤が0.1~0.5 mMの範囲の濃度のTCEPである、請求項2記載の方法。
- 以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法における検出感度の向上のための、カオトロピック試薬及び還元剤の使用であって、プロテアーゼがトリプシンであり、かつカオトロピック試薬が0.5~3 Mの範囲の濃度のウレア又はチオウレアである、上記使用。 - 還元剤が、チジオトレイトール(DTT)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)又はその塩酸塩、トリブチルホスフィンからなる群より選択される、請求項4記載の使用。
- 還元剤が0.1~0.5 mMの範囲の濃度のTCEPである、請求項5記載の使用。
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