JP7051175B1 - 評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[項目1]
1種以上の腸内細菌を含む便検体と、
試験対象素材と、
前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、
培養後の培養液に含まれる代謝物を解析する解析ステップとを含むことを特徴とする、試験対象素材の評価方法。
[項目2]
前記代謝基質物質は、前記腸内細菌により代謝され、健康状態に悪影響を及ぼすことを特徴とする、項目1に記載の評価方法。
[項目3]
前記代謝基質物質は、少なくとも胆汁酸を含む、項目1に記載の評価方法。
[項目4]
前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒスチジン、フェニルアラニンから選ばれる少なくとも1つを含む、項目1に記載の評価方法。
[項目5]
前記代謝基質物質は、コリン、カルニチンから選ばれる少なくとも1つと、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸から選ばれる少なくとも1つを少なくとも含む、項目2に記載の評価方法。
[項目6]
前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、及びタウロコール酸を含む、項目3に記載の評価方法。
[項目7]
腸内細菌叢の類似度の指標に基づいて、複数の前記便検体の組合せを選択する便検体選択ステップをさらに備える、項目1~6のいずれかに記載の評価方法。
[項目8]
前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプの前記便検体が含まれるように前記ヒト便検体の組合わせを選択する、項目7に記載の評価方法。
[項目9]
前記便検体選択ステップは、全てのペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも0.3以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、項目7に記載の評価方法。
[項目10]
前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプに属する便検体のペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも0.4以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、項目7に記載の評価方法。
[項目11]
前記培地には、炭素源材料が添加されていないことを特徴とする、項目1~10のいずれかに記載の評価方法。
[項目12]
腸内細菌の培養が可能な培地と、前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質とを含むことを特徴とする、試験対象素材の作用を評価するための評価用培地。
まず、培養時間を最適化する目的で、以下の実験を行った。
A.試験対象素材の調整
ドラフト内で所定の試験対象素材を90mg量り取った。実施例1において、試験対象素材としてグルコースを用いた。なお、ネガティブコントロールとしてグルコースを添加しないものを作成した。嫌気チャンバー内で、量り取った試験対象素材をpH4.5のPureWater 1mLで溶かした。あらかじめ嫌気チャンバー内で気相を置換しておいたチューブに、0.22μmのフィルターを通して移した。
YCFA培地の組成は以下のとおりである。(per liter)
trypticase (2.5 g), peptone (2.5 g), yeast extract(5 g), K2HPO4 (0.9 g), KH2PO4 (0.9 g), NaCl (1.8 g), NH4SO4 (1.8 g), CaCl2 2H2O (0.24 g), MgSO4 7H2O (0.375 g), potassiumacetate (1 g), sodium propionate (0.5 g), sodium n-butyrate (0.3g), valeric acid (0.1 g), isobutyrate (0.1 g), isovaleric acid (0.1g), 2-methyl butyrate (0.1 g), NH4Fe(III)-citrate (0.01 g), MnCl2(0.006 g), CoCl2 (0.002 g), NiCl2 (0.0004 g), (NH4)6(Mo7O24) 4H2O(0.0004 g), CuSO4 (0.00015 g), AlK(SO4)2 (0.0003 g), Na2B4O7(0.0003 g), ZnSO4 (0.002 g), Na2SeO3 (0.0003 g), pyridoxalphosphate (0.002 g), p-amino benzoate (0.0005 g), biotin (0.0002g), phenylpropionate (0.002 g), l-arginine (0.002 g), Panvitan(0.1 g), cysteine hydrochloride(1 g), resazurin (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) (0.005 g), and vitamin K(0.001g).
嫌気チャンバー内で、あらかじめ気相を置換しておいたエッペンドルフチューブに便を12mg量り取った。Bで調整したYCFA培地を500μL入れ、ホモジナイズし、さらにYCFA培地を加えて便ジュースを作成した。便ジュースにおける便濃度は0.1% (w/v)となった。なお、実施例1では、異なる6人の健康な男女より採取した便(001、101、005、104、106、107)を使用した。
Aで調整した試験対象素材10μLを96wellプレートの各wellに添加した。
Cで調整した便ジュースを290μLずつwellに添加した。
試験対象素材の終濃度は0.3% (w/v)となった。
嫌気チャンバー内の37℃インキュベーターで培養した。
本実施例においては、代謝基質物質を添加し、その濃度範囲を検討する目的で、以下の実験を行った。本実施例においては、試験対象素材(グルコース)を添加しない点(すべて無添加)と、培地に代謝基質物質を添加し、代謝基質物質混合液入り培地を用いる点以外は、上記実施例1と同様に培養液を準備し、16時間培養を行った。また、便検体としては、上記実施例1で用いた便検体のうち、104、106、107の便検体を用いた。
代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸(Glycocholic acid; GCA)、タウロコール酸(Taurocholic acid; TCA)を用いた。各代謝基質物質について、300mMの水溶液を作成した。コリンとして塩化コリン(ナカライ)、カルニチンとしてL-Carnitine(東京化成工業)、グリココール酸としてSodium Glycocholate Hydrate(東京化成工業)、タウロコール酸としてTaurocholic acid sodium salt hydrate(SIGMA)を使用した。作成した300mMのコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸をそれぞれ14μLずつエッペンドルフチューブに取り、1,344μLのPureWaterを入れ、3mMの代謝基質物質混合液 1.4 mLを作製した。
あらかじめチューブ内の空間を嫌気チャンバー内の気相に置換しておいた30mLチューブに、11.6mLのYCFA培地を分注し、3mMの代謝基質物質混合液を400μLずつ培地に添加した。各代謝基質物質の代謝基質物質混合液入り培地における終濃度はそれぞれ100μMとなった。
次に、YCFA培地以外の培地の有用性について確認するために以下の実験を行った。
試験対象素材(グルコース)を添加しない点(すべて無添加)と、培地の組成を以下のとおり変更した以外は、上記実施例1と同様に培養液を準備し、16時間培養を行った。なお、実施例2と同様に、代謝基質物質混合液入り培地を用い、各代謝基質物質の終濃度はそれぞれ100μMとした。また、便検体としては、上記実施例1で用いた便検体と同じ6者(001、101、102、104、106、107)の便を用いた。
サンプル名「non」:YCFA培地100%
サンプル名「0.3GAM」:YCFA培地99.7%+GAM培地0.3%
サンプル名「3GAM」:YCFA培地97%+GAM培地3%
サンプル名「10GAM」:YCFA培地90%+GAM培地10%
サンプル名「30GAM」:YCFA培地70%+GAM培地30%
サンプル名「GAM」:GAM培地100%
なお、YCFA培地は、実施例1と同様の組成である。GAM培地の組成は以下のとおりである。59.0g(1L分)中:ペプトン10.0g、ダイズペプトン3.0g、プロテオーゼペプトン10.0g、消化血清末13.5g、酵母エキス5.0g、肉エキス2.2g、肝臓エキス1.2g、ブドウ糖3.0g、リン酸二水素カリウム2.5g、塩化ナトリウム3.0g、溶性デンプン5.0g、L-システイン塩酸塩0.3g、チオグリコール酸ナトリウム0.3g
次に、便検体の保存条件を検証するために以下の実験を行った。
試験対象素材(ファイバリクサ:Fib)を添加した点と、使用する便検体の状態を以下のとおりとした以外は、上記実施例3(YCFA培地100%)と同様に培養液を準備し、16時間培養を行った。また、ネガティブコントロールとして、試験対象素材を添加しない無添加(Non)サンプルを作成した。また、便検体としては、上記実施例1で用いた便検体のうち、3者(104、106、107)の便を用いた。
・0h-RT:便を採便後すぐに試験に使用
・7d-frozen:便を冷凍庫(-80℃)で7日間静置してから使用
・7d-RT:便を常温で7日間静置してから使用
実施例5では、試験対象素材として4種類の食物繊維を用いて、複数の試験対象素材を並列に比較可能か否か評価を行った。試験対象素材として食物繊維を用いる点と、使用する便検体の状態を以下のとおりとした以外は、上記実施例3(YCFA培地100%)と同様に培養液を準備し、16時間培養を行った。
・チコリ由来イヌリン:Chi(直鎖イヌリン)
・アガベ由来イヌリン:Aga(分岐鎖イヌリン)
・合成イヌリン:Syn(合成イヌリン)
・難消化性デキストリン:dex
実施例5における細菌系統組成を明らかにするため、未培養便および培養後の便-試験化合物混合液に対する16S rRNA遺伝子配列を用いたメタゲノム解析を行った。メタゲノム解析はMurakamiら(2015)の方法に従った。まず便および便-試験化合物混合液の遠心ペレットから抽出したDNAを鋳型として、16S rRNA遺伝子のV1-V2領域のDNA断片をPCRにて増幅し、続いてPCR産物の配列をIllumina MiSeqを用いたペアエンド法により解析した。これらの塩基配列をbowtie2により16S rRNA遺伝子のデータベースに対してマッピングした。16S rRNA遺伝子のデータベースには、silva(https://www.arb-silva.de)が提供するSILVA SSU Refを99%の閾値でクラスタリングして得られたOTUを用いた(以下、SILVAデータベースと記載)。上記マッピングにより、各塩基配列はSILVAデータベース内で最も類似しているOTUに帰属され、各OTUに帰属した(マップされた)塩基配列数を数えることで、腸内細菌叢の細菌系統組成を定量化した。
試験対象素材添加による腸内細菌叢由来の代謝反応への影響を評価するため、便-試験化合物混合液の上清に含まれる代謝物質のうち、有機酸・短鎖脂肪酸、胆汁酸について定量評価を実施した。まず、培養液を遠心分離して得られた上清をフィルターユニット付きチューブでろ過し、有機酸・短鎖脂肪酸測定用と胆汁酸測定用に分けた。有機酸・短鎖脂肪酸測定用の試料溶液は有機溶媒を用いた液液抽出ののち誘導体化処理を施し、溶出時間補正用の内部標準物質を添加した。胆汁酸測定用の試料溶液は有機溶媒を用いた液液抽出ののち、内部標準物質を添加した。代謝物質はLC-TOF/MSを用いて測定し、検出されたピークのカラム保持時間、質量電荷比(m/z)、ピーク面積を取得した。これらの情報を標準試料の測定結果と照合することで各ピークが対応する代謝物質を同定した。これらのピークは、検体ごとに内部標準物質との面積比が一定になるように補正し、サンプル間で相対定量が可能な値(相対面積比、relative area)に変換した。代謝物質のうち有機酸・短鎖脂肪酸分析では14化合物、胆汁酸分析では14化合物を濃度既知の標準試料を用いて作成した検量線と比較することにより、絶対定量を行った。
実施例6においては、試験対象素材としてフラクトオリゴ糖(FOS)を使用した。なお、ポジティブコントロールとしてグルコース(Glu)、比較対象として何も溶解していない酸素除去済み超純水を添加した無添加サンプルを解析した。また、便検体として、001、101、102、104、107、110を使用した。これらの便検体の全てのペアのWeighted UniFrac distanceのうち、最小の値は0.3であった。また、これらの便検体のうち、異なるエンテロタイプに属する便検体間のWeighted UniFrac distanceの最小値は、0.422であった。試験対象素材として上記を用いた以外は、実施例3(YCFA培地100%)と同様にして、培養を行った。培養後、ピペッティングし、培養液をスクリューチューブに抜き取った。培養液を遠心分離し、上清をエッペンドルフチューブに移し入れた。ペレットが残ったチューブには、0.1mmジルコニア/シリカビーズを入れた。
実施例7においては、試験対象素材としてフラクトオリゴ糖(FOS)を使用し、比較対象として何も溶解していない酸素除去済み超純水を添加した無添加サンプルを解析した。また、便検体として101、102、104、107、110、115を使用した。代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸を用い、代謝基質物質の終濃度がそれぞれ100μMの組(old4)、代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸を用い、培養液における代謝基質物質の終濃度がそれぞれ10μMの組(4mix)、代謝基質物質としてコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸を用い、培養液における代謝基質物質の終濃度がそれぞれ10μMの組(5mix)、及び代謝基質物質を添加しない組(non)を用意した。その他の条件は実施例3(YCFA培地100%)と同様にして16時間培養した。
Claims (10)
- 1種以上の腸内細菌を含む便検体と、
試験対象素材と、
前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、
培養後の培養液に含まれる代謝物を解析する解析ステップと、
腸内細菌叢の類似度の指標に基づいて、複数の前記便検体の組合せを選択する便検体選択ステップを備えることを特徴とする、試験対象素材の評価方法。 - 前記代謝基質物質は、前記腸内細菌により代謝され、健康状態に悪影響を及ぼすことを特徴とする、請求項1に記載の評価方法。
- 前記代謝基質物質は、少なくとも胆汁酸を含む、請求項1に記載の評価方法。
- 前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒスチジン、フェニルアラニンから選ばれる少なくとも1つを含む、請求項1に記載の評価方法。
- 前記代謝基質物質は、コリン、カルニチンから選ばれる少なくとも1つと、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸から選ばれる少なくとも1つを少なくとも含む、請求項4に記載の評価方法。
- 前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、及びタウロコール酸を含む、請求項4に記載の評価方法。
- 前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプの前記便検体が含まれるようにヒト便検体の組合わせを選択する、請求項1~6のいずれか一項に記載の評価方法。
- 前記便検体選択ステップは、全てのペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも0.3以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、請求項1~6のいずれか一項に記載の評価方法。
- 前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプに属する便検体のペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも0.4以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、請求項1~6のいずれか一項に記載の評価方法。
- 前記培地には、炭素源材料が添加されていないことを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載の評価方法。
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