JP7050276B2 - アブラナ科植物の免疫活性化方法及び免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、アブラナ科植物の免疫活性化方法及び免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法に関する。

近年、農業関連分野において、コンパニオンプランツを用いた栽培方法が注目されている。コンパニオンプランツとは、栽培作物と共生し、栽培作物に対して有益な効果を発揮する植物のことをいう。コンパニオンプランツによる効果としては、害虫の忌避効果、植物の生長の促進効果等が挙げられる。

例えば、特許文献１では、コンパニオンプランツを用いて、害虫による食害や病気の感染を防ぐ無農薬土耕栽培法が開示されている。また、特許文献１では、害虫による被害に対し有益な効果を発揮する植物の組み合わせが開示されている。

しかしながら、コンパニオンプランツについては、その作用機序も含め、まだ科学的に解明されている例が少ない。植物の組み合わせによる効果は様々であり、反対に生育が悪くなる等の悪影響を及ぼし合う組み合わせもある。

特開２００６－５５００８号公報

ところで、コンパニオンプランツとして利用されている植物の１つに、シソ科ハッカ属のミントがある。ミントは、アロマ植物の中でも多くの変種が存在し、ミントの種類によって香気成分の組成も様々である。

本発明者らは、ミントの香気成分に着目し、その香気成分の受容植物としてアブラナ科植物を混栽等することにより、その香気成分によるアブラナ科植物への影響について検証を重ねた。

本発明は上記の検証から得た知見に基づいて完成されたものであり、ペパーミントの香気成分を利用したアブラナ科植物の免疫活性化方法、及び免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ アブラナ科植物の生育過程でペパーミントの香気成分を曝露させて、ＴＩ（トリプシンインヒビター）遺伝子及びＩＣＳ１（イソコリスミ酸シンターゼ１）遺伝子の発現量を上昇させる、アブラナ科植物の免疫活性化方法。

＜２＞ アブラナ科植物とペパーミントとを混栽することによりペパーミントの香気成分をアブラナ科植物に曝露させる、＜１＞に記載の免疫活性化方法。

＜３＞ アブラナ科植物がコマツナである、＜１＞又は＜２＞に記載の免疫活性化方法。

＜４＞ アブラナ科植物の生育過程でペパーミントの香気成分を曝露させて、ＴＩ（トリプシンインヒビター）遺伝子及びＩＣＳ１（イソコリスミ酸シンターゼ１）遺伝子の発現量を上昇させる、免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法。

本発明によれば、ペパーミントの香気成分を利用したアブラナ科植物の免疫活性化方法、及び免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法を提供できる。

１２種のミントの香気成分を曝露させたコマツナのＴＩ（トリプシンインヒビター）遺伝子及びＩＣＳ１（イソコリスミ酸シンターゼ１）遺伝子の発現量を示す図である。 ペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナの、ペパーミント除去後の栽培時におけるＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量の経時変化を示す図である。 複数の地点からペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナのＴＩ遺伝子（同図（Ａ））及びＩＣＳ１遺伝子（同図（Ｂ））の発現量を示す図である。 ペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナのＳＯＴ５－α（グルコシノレート合成酵素）遺伝子の発現量を示す図である。 ペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナに載せて飼育したハスモンヨトウ幼虫（害虫）の体重増加率を示す図である。 温室内でペパーミントとコマツナとを混栽した場合の害虫によるコマツナの被食害率を示す図である。 温室内でペパーミント又はキャンディーミントの香気成分を曝露させたコマツナの害虫による被食害率を示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜アブラナ科植物の免疫活性化方法＞
本実施形態に係るアブラナ科植物の免疫活性化方法は、アブラナ科植物にペパーミントの香気成分を曝露させることを含む。

ペパーミントを含むミント種は、コンパニオンプランツとして利用されており、多くの変種が存在し、その香気成分の組成も様々である。本発明者らは、このミント種の多様な香気成分組成に着目して、アブラナ科植物に対する作用について調査した。その結果、ペパーミントの香気成分を曝露させたアブラナ科植物のみに、アブラナ科植物の防御遺伝子の発現の有意な上昇が確認された。

本実施形態に係る免疫活性化方法を用いてアブラナ科植物の免疫を活性化することにより、害虫による食害、病害等を低減することができる。具体的には、例えば、アブラナ科植物に含まれる害虫忌避成分等の産生が促進されて、害虫による摂食が抑制される。この効果を利用して、アブラナ科植物の栽培に用いる農薬の使用量を抑制することも可能である。

また、本実施形態に係る免疫活性化方法を用いてアブラナ科植物の免疫を活性化することにより、アブラナ科植物のグルコシノレートの産生を促進することができる。グルコシノレートは、アブラナ科植物に含まれている辛味成分であり、害虫や病害に対する自衛に寄与することが多い。

アブラナ科植物は、特に限定されないが、例えば、コマツナ、キャベツ、ダイコン、ハクサイ、ブロッコリー、ワサビ等が挙げられる。

アブラナ科植物にペパーミントの香気成分を曝露させる方法については、特に限定されず、ペパーミントから香気成分が放出され、アブラナ科植物が香気成分を受容できる方法であればよい。

具体的には、例えば、ペパーミントの近傍にアブラナ科植物を混栽してもよい。また、ペパーミントの香気成分を受容できる範囲であれば、定植せずに、ペパーミントとアブラナ科植物とを異なる鉢等に植えて栽培してもよい。ペパーミントとアブラナ科植物との距離としては、特に限定されないが、例えば、２ｍ以内であることが好ましく、可能な限り近傍であることがより好ましい。

また、香気成分を放出できる状態であれば、根を抜いたペパーミントをアブラナ科植物の近傍に添えてもよく、さらに、アブラナ科植物がペパーミントの香気成分を受容できる状態であれば、アブラナ科植物の根を抜いてもよい。

ペパーミントの香気成分をアブラナ科植物に曝露させる期間については、特に限定されず、例えば、３日間以上が好ましく、常時混栽することがより好ましい。曝露させた後は、アブラナ科植物の防御遺伝子の発現が上昇した状態が数日間持続する。これにより、植物内の昆虫忌避成分の量が増加するため、ペパーミントを撤去しても、免疫活性化の効果が持続する。

免疫活性化の評価方法としては、特に限定されず、例えば、アブラナ科植物に含まれるＴＩ遺伝子、ＩＣＳ１遺伝子等の発現を解析することにより確認する方法が挙げられる。

グルコシノレートの生産の促進を確認する方法としては、特に限定されず、例えば、グルコシノレート合成酵素遺伝子であるＳＯＴ５－α遺伝子の発現を解析する方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、グルコシノレートを定量する方法等が挙げられる。

＜免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法＞
本実施形態に係る免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法は、アブラナ科植物にペパーミントの香気成分を曝露させる工程を含む。

本実施形態に係る生産方法は、上述したアブラナ科植物の免疫活性化方法と同様の方法であってもよい。

本実施形態に係る生産方法によれば、アブラナ科植物の免疫が活性化されるため、生育過程において、害虫による食害を低減することができる。また、生産されたアブラナ科植物は、免疫活性化効果の１つとして辛味成分でもあるグルコシノレートの生産が促進されるため、その風味の変化が期待できる。

次に、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

以下の予備実験及び実施例では、アブラナ科植物として、播種後１４日間、直径７．５ｃｍのポットで生育したコマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ． ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ）を使用した。
また、ペパーミントを含むミント種については、１個体ずつ直径１０．５ｃｍのポットに植え、丈が４０ｃｍになるまで生育したものを使用した。
上記植物の生育は、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で行った。

＜予備実験：有用ミント種の同定＞
予備実験として、コマツナの免疫を活性化することができる香気成分を放出するミント種を同定するために、１２種のミントの香気成分をコマツナに曝露させて、コマツナの防御遺伝子であるＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現を解析した。

まず、ミント１個体が植えられたポットから周囲５ｃｍの距離に、コマツナ１個体が植えられたポットを５個ずつ配置して、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、３日間生育した。ミントとしては、ペパーミント、アップルミント、オレンジミント、クールミント、キャンディーミント、グレープフルーツミント、ペニーロイヤルミント、スペアミント、オーデコロンミント、パイナップルミント、レモンミント、及びイングリッシュミントの１２種を使用した。
コントロールとしては、ミントを配置せずに同条件で生育した。

次に、以下の手順により、防御遺伝子の発現を解析した。
３日間生育した上記コマツナ約１００ｍｇを液体窒素下で粉砕して、セパゾールＲＮＡ（ナカライテスク株式会社）５００μＬを加えて、５分間静置した後、１．５ｍＬチューブに移し、クロロホルム（和光純薬工業株式会社）を１００μＬ加えて、転倒混和して３分間静置した。次いで、微量冷却遠心機（日立工機株式会社のＣＦ１５ＲＸ ＩＩ）を用いて、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離を行い、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、等量のイソプロパノール（和光純薬工業株式会社）を加えて、転倒混和して１０分間静置した。そして、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、沈殿に７０％エタノールを１ｍＬ加えて、ボルテックスミキサーにより撹拌して、１２０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離を行い、沈殿を室温で乾燥させて、１００μＬの蒸留水でＲＮＡを溶解させた。

８３．３ｎｇ／μＬの上記ＲＮＡ溶液６μＬにｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒを添加した４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を加えて、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、氷上で５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（東洋紡株式会社）を２μＬ加え、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間反応させた。その後、逆転写産物に蒸留水を４０μＬ加えて後述するリアルタイムＰＣＲに用いた。

上記逆転写産物５μＬ、蒸留水３μＬ、各プライマー２μＬ（５μＭ）、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社）１０μＬを混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲのプログラムとしては、９５℃で６０秒間プレヒートした後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒のステップを４５サイクル、融解ステップは、０．１℃／ｓｅｃの速度で６５℃から９５℃まで温度を上昇させるプログラムを用いた。上記プライマーの塩基配列は、表１に示す。

予備実験の遺伝子発現解析の結果を図１に示す。図１の縦軸は、コントロールの遺伝子発現量を１とした場合の相対的な遺伝子発現量である。図１に示すとおり、コマツナでは、ペパーミントの香気成分を曝露させた場合のみ、コントロールと比べＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量が有意に上昇した。この結果から、コマツナの免疫を活性化させる香気成分を放出するミントとして、ペパーミントが選定された。

＜実施例１：ペパーミントの香気成分によるコマツナの防御遺伝子の発現量の経時変化の確認＞
実施例１では、ペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナの、ペパーミント除去後のＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量の経時変化を確認した。
まず、ペパーミント１個体が植えられたポットから周囲５ｃｍの距離に、コマツナ１個体が植えられたポットを５個配置して、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、７日間生育した。その後、ペパーミントを撤去して、上記の条件下で１６日間生育した。

次に、予備実験と同様の防御遺伝子発現の解析方法を用いて、ペパーミントを撤去後、２日目、４日目、８日目、１２日目、１６日目のコマツナのＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量を解析した。コントロールとしては、ペパーミントを配置せずに同条件で生育したコマツナを用いた。

実施例１の遺伝子発現解析の結果を図２に示す。図２の縦軸は、コントロールの遺伝子発現量を１とした場合の相対的な遺伝子発現量であり、横軸はペパーミント撤去後に経過した日数である。図２に示すとおり、ＴＩ遺伝子の発現が上昇した状態は８日間持続し、ＩＣＳ１遺伝子の発現が上昇した状態は４日間持続した。この結果から、ペパーミントの香気成分によりコマツナの免疫が活性化した状態が、数日間持続することが分かった。

＜実施例２：コマツナの免疫活性化に有効なペパーミントとの距離の確認＞
実施例２では、コマツナの免疫活性化を実現するために有効なコマツナとペパーミントとの距離を確認した。
まず、ペパーミント１個体が植えられたポットからの距離５ｃｍ、５０ｃｍ、及び１００ｃｍに、コマツナ１個体が植えられたポットを５個ずつ合計１５個配置し、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、７日間生育した。

次に、予備実験と同様の防御遺伝子発現の解析方法を用いて、７日間生育後のコマツナのＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量を解析した。コントロールとしては、ペパーミントを配置せずに同条件で生育したコマツナを用いた。

実施例２の遺伝子発現解析の結果を図３に示す。図３の縦軸は、コントロールの遺伝子発現量を１とした場合の相対的な発現量である。図３に示すとおり、ペパーミントが植えられたポットから５ｃｍの距離に配置したコマツナのみ、コントロールと比べＴＩ遺伝子及びＩＣＳ１遺伝子の発現量が有意に上昇した。この結果から、本実施例の条件下では、コマツナの免疫活性化に有効なペパーミントとの距離は、５０ｃｍ以内にあることが分かった。

＜実施例３：ペパーミントの香気成分によるグルコシノレートの産生促進効果の確認＞
実施例３では、ペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナのグルコシノレート合成酵素の遺伝子発現解析を行い、グルコシノレートの産生促進効果を確認した。
まず、ペパーミント１個体が植えられたポットから周囲５ｃｍの距離に、コマツナ１個体が植えられたポットを５個配置して、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、７日間生育した。

次いで、予備実験と同様の遺伝子発現の解析方法を用いて、７日間生育後のコマツナに含まれるグルコシノレート合成酵素であるＳＯＴ５－αの遺伝子の発現量を解析した。但し、プライマーは、表２に示す塩基配列のものを使用した。コントロールとしては、ペパーミントを配置せずに同条件で生育したコマツナを用いた。

実施例３の遺伝子発現解析の結果を図４に示す。図４の縦軸は、コントロールの遺伝子発現量を１とした場合の相対的な遺伝子発現量である。図４に示すとおり、ＳＯＴ５－α遺伝子の発現量は、コントロールに比べ、約１５倍上昇した。この結果から、ペパーミントの香気成分をコマツナに曝露させることにより、コマツナに含まれるグルコシノレートの産生が促進されることが分かった。

＜実施例４：室内での害虫による食害の確認＞
実施例４では、ペパーミントの香気成分をコマツナに曝露させた場合の、害虫による食害に対する効果について確認した。

ペパーミント１個体が植えられたポットから周囲５ｃｍの距離に、コマツナ１個体が植えられたポットを５個配置して、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、７日間生育した。次いで、ペパーミントを撤去し、コマツナ１個体につき害虫１匹をコマツナの葉に載せ、上記と同じ条件下で、４日間飼育し、害虫の体重増加率を測定した。コントロールとして、ペパーミントを配置せず同条件で生育したコマツナの葉に載せた害虫の体重増加率を用いた。

害虫としては、孵化後７日程度のハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ）（住化テクノサービス株式会社）の三齢幼虫を用いた。孵化後は、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間、暗期８時間の条件下で、人工飼料を与え飼育・継代した。

実施例４の害虫の体重増加率の結果を図５に示す。図５の縦軸は、コントロールの体重増加率を１とした場合の相対的な体重増加率である。図５に示すとおり、コントロールに比べ体重増加率が約３０％減少している。この結果から、コマツナは害虫抵抗性を獲得していることが確認された。

＜実施例５：野外での害虫によるコマツナの被食害率の確認１＞
実施例５では、ペパーミントをコマツナの近傍に配置して混栽した場合の、害虫による食害に対する効果を確認した。
２０１６年４月に東京都葛飾区の野外に設置された温室にて、ペパーミント４個体の周囲０．５ｍ、１ｍ、及び２ｍの距離にコマツナを５個体ずつ合計１５個体配置した。またコントロールとしては、ペパーミントの近傍で生育していないコマツナを、温室内の１３ｍ離れた場所に配置して、１６日間栽培した。試験中は、定期的に水遣りを行い、植物が乾燥しないようにした。

１６日後に、害虫により食害された葉の面積を確認し、損失した葉の面積から食害率を算出した。

実施例５の害虫によるコマツナの被食害率の結果を図６に示す。図６の縦軸は、元々の葉の面積１００％に対して、食害のため損失した葉の面積の割合である。図６に示すとおり、全ての距離において、ペパーミントの近傍で生育していないコントロールのコマツナに比べ、害虫によるコマツナの被食害率が有意に低下した。ペパーミントの周囲０．５ｍの距離に配置したコマツナに関しては、コントロールに比べ被食害率が約半分に低下した。

＜実施例６：野外での害虫によるコマツナの被食害率の確認２＞
実施例６では、ペパーミント１個体が植えられたポットから周囲５ｃｍの距離に、コマツナ１個体が植えられたポットを５個配置して、２４±１℃、蛍光灯下で明期１６時間（光度：８０μＥｍ^－２ｓ^－１）、暗期８時間の条件下で、７日間生育した。その後、コマツナのみを東京都葛飾区の野外に設置された温室内にランダムに定植して、１６日間栽培した。また、上記と同じ条件で、ペパーミントの代わりにキャンディーミントの周囲でコマツナを生育した後、上記と同じ条件で、コマツナを１６日間栽培した。
コントロールとして、ペパーミント又はキャンディーミントの香気成分を曝露させず、上記と同じ条件で生育したコマツナを用いた。試験中は、定期的に水遣りを行い、植物が乾燥しないようにした。上記の温室内での栽培は、２０１７年６月に実施された。

１６日後に、害虫により食害された葉の面積を確認し、損失した葉の面積から食害率を算出した。

実施例６の害虫によるコマツナの被食害率の結果を図７に示す。図７の縦軸は、元々の葉の面積１００％に対して、食害のため損失した葉の面積の割合である。図７に示すとおり、予めペパーミントの香気成分を曝露させたコマツナでは、害虫によるコマツナの被食害率は、コントロールに比べ半分以下に低下した。一方、予めキャンディーミントの香気成分を曝露させたコマツナでは、ペパーミントの場合と異なり、コントロールとの被食害率の有意な低下は確認できなかった。この結果から、ペパーミントの香気成分を曝露させたことにより、コマツナは害虫抵抗性を獲得したことが分かった。また、同じハッカ属であっても、キャンディーミントではコマツナに対する免疫活性化効果は確認できず、ミントの種類によって、免疫活性化作用が異なることが分かった。

Claims (4)

1. アブラナ科植物の生育過程でペパーミントの香気成分を曝露させて、ＴＩ（トリプシンインヒビター）遺伝子及びＩＣＳ１（イソコリスミ酸シンターゼ１）遺伝子の発現量を上昇させる、アブラナ科植物の免疫活性化方法。
2. アブラナ科植物とペパーミントとを混栽することによりペパーミントの香気成分をアブラナ科植物に曝露させる、請求項１に記載の免疫活性化方法。
3. アブラナ科植物がコマツナである、請求項１又は２に記載の免疫活性化方法。
4. アブラナ科植物の生育過程でペパーミントの香気成分を曝露させて、ＴＩ（トリプシンインヒビター）遺伝子及びＩＣＳ１（イソコリスミ酸シンターゼ１）遺伝子の発現量を上昇させる、免疫が活性化されたアブラナ科植物の生産方法。

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