JP7043080B2

JP7043080B2 - がんに対する有効性判定キット及びがんに対する有効性判定方法

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Publication number: JP7043080B2
Application number: JP2018564453A
Authority: JP
Inventors: 和広森下; 朝永市川; 新吾中畑
Original assignee: University of Miyazaki
Current assignee: University of Miyazaki
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-01-09
Also published as: EP3574917A1; EP3574917A4; WO2018139181A1; JPWO2018139181A1

Description

本発明は、がんに対する有効性判定キット及びがんに対する有効性判定方法に関する。

タンパク質アルギニンＮ－メチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）は、タンパク質内のアルギニン残基のメチル化修飾に関連するタンパク質アルギニンメチル基転移酵素である。アルギニンメチル化された生体分子は、核内では転写を調節し、ＤＮＡの修復に関与する。また、アルギニンメチル化された生体分子は、細胞質では情報伝達系等の細胞機能を調節している。アルギニンメチル化された生体分子は、種々のがんに深く関与している。このため、ＰＲＭＴ５の阻害は、がん治療の標的のひとつとされている。例えば、特許文献１には、ＰＲＭＴ５阻害剤が白血病等の複数のがん種に有効であることが開示されている。

特表２０１６－５１４７００号公報国際公開第２０１０／１１６８９９号

ＳｈｉｎｇｏＮａｋａｈａｔａ、外２１名、「ＬｏｓｓｏｆＮＤＲＧ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｃｔｉｖａｔｅｓＰＩ３Ｋ－ＡＫＴｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｖｉａＰＴＥＮｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎＡＴＬＬａｎｄｏｔｈｅｒｃａｎｃｅｒｓ」、２０１４年、５：３３９３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４３９３

一方で、ＰＲＭＴ５をコードするＰＲＭＴ５遺伝子は、がん種によってはがん抑制遺伝子として働くことも報告されている。ＰＲＭＴ５がどのような種類のがんでがん細胞の維持増殖に関与し、ＰＲＭＴ５阻害剤の効果が得られるかについては、その詳細は明らかにされていない。既知のＰＲＭＴ５阻害剤の中には、正常な細胞とがん細胞との区別なく機能阻害を起こすものがあり、がん細胞に対する選択性の向上が求められていた。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、がんに対するＰＲＭＴ５阻害剤の有効性を精度よく判定することができるがんに対する有効性判定キット及びがんに対する有効性判定方法を提供することを目的とする。

本発明者は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡｄｕｌｔＴ－ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ－ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＡＴＬＬ）、肝臓がん及び肺がん等の多種類のがんにおいて遺伝子Ｎ－ＭｙｃＤｏｗｎｓｔｒｅａｍ－ＲｅｇｕｌａｔｅｄＧｅｎｅ２（ＮＤＲＧ２）が、がん抑制遺伝子であることを非特許文献１及び特許文献２で報告した。

ＮＤＲＧ２がコードするＮＤＲＧ２タンパク質は、ＰＰ２Ａフォスファターゼと複合体を形成し、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄｔｅｎｓｉｎｈｏｍｏｌｏｇｕｅｄｅｌｅｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０（ＰＴＥＮ）を含む情報伝達に重要な基幹タンパク質群を脱リン酸化し活性を変化させる。さらに、本発明者は、ＮＤＲＧ２タンパク質によってリン酸化修飾が変動する結合タンパク質としてＰＲＭＴ５を同定し、鋭意研究を重ねることで本発明を完成させた。

本発明の第１の観点に係るがんに対する有効性判定キットは、
タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤のがんに対する有効性判定キットであって、
がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を定量するための試薬を備え、
前記がん細胞は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、骨肉腫又は子宮がん由来の細胞である。

本発明の第２の観点に係るがんに対する有効性判定方法は、
タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤のがんに対する有効性判定方法であって、
がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を測定する測定ステップと、
前記測定ステップにおいて測定された発現量を、対応する正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量と比較する比較ステップと、
前記比較ステップにおいて、前記がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が前記正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量よりも低い場合に、タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤が前記がん細胞に有効であると判定する判定ステップと、
を含み、
前記がん細胞は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、骨肉腫又は子宮がん由来の細胞である。

本発明によれば、がんに対するＰＲＭＴ５阻害剤の有効性を精度よく判定することができる。

細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４、ＨＵＴ１０２、ＫＯＢ、Ｕ２ＯＳ及びＨｅＬａにおけるＮＤＲＧ２の発現を示す図である。（Ａ）はＨＵＴ１０２に係る細胞の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ｂ）はＫＯＢに係る細胞の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ａ）はＨＵＴ１０２に係る細胞におけるアポトーシスのマーカーであるＣｌｅａｖｅｄ（ＣＬ．）－ｃａｓｐａｓｅ３の発現を示す図である。（Ｂ）はＫＯＢに係る細胞におけるＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３の発現を示す図である。（Ａ）はＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３を染色したＨＵＴ１０２に係る細胞の画像を示す図である。図中のバーの長さは１００μｍに相当する。（Ｂ）は培養したＨＵＴ１０２に係る細胞におけるＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３が陽性細胞の比率を示す図である。（Ａ）はＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３を染色したＫＯＢに係る細胞株の画像を示す図である。図中のバーの長さは１００μｍに相当する。（Ｂ）は培養したＫＯＢに係る細胞におけるＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３が陽性細胞の比率を示す図である。ＨＵＴ１０２に係る細胞を皮下移植したマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。ＨＵＴ１０２に係る細胞を皮下移植したマウスにおける腫瘍重量を示す図である。ＨＵＴ１０２に係る細胞の皮下移植後３１日目に採取した腫瘍の画像を示す図である。図８に示す腫瘍の免疫組織化学染色の結果を示す図である。図中のバーの長さは２００μｍに相当する。（Ａ）はＰＲＭＴ５阻害剤ＡｄＯＸ存在下でのＨＵＴ１０２の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ｂ）はＡｄＯＸ存在下でのＫＯＢの細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ａ）はＡｄＯＸ存在下でのＪｕｒｋａｔの細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ｂ）はＡｄＯＸ存在下でのＭＯＬＴ４の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ａ）はＵ２ＯＳに係る細胞の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ｂ）はＨｅＬａに係る細胞の細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ａ）はＡｄＯＸ存在下でのＵ２ＯＳの細胞増殖能の経時変化を示す図である。（Ｂ）はＡｄＯＸ存在下でのＨｅＬａの細胞増殖能の経時変化を示す図である。

本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。

（実施の形態１）
まず、実施の形態１に係る抗がん剤について説明する。本実施の形態に係る抗がん剤は、ＰＲＭＴ５阻害剤を含む。ＰＲＭＴ５阻害剤は、ＰＲＭＴ５を直接的又は間接的に阻害するものであれば特に限定されない。ＰＲＭＴ５阻害剤は、例えば、ＰＲＭＴ５に結合してＰＲＭＴ５の活性を抑制する化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡアプタマー及びＲＮＡアプタマー等である。ＰＲＭＴ５阻害剤は、ＰＲＭＴ５遺伝子の発現抑制を介して、ＰＲＭＴ５を阻害してもよい。この場合、ＰＲＭＴ５阻害剤は、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸等である。

好ましくは、ＰＲＭＴ５阻害剤は化合物である。ＰＲＭＴ５阻害剤として好ましい化合物は、ＡｄＯＸ（アデノシン－２’，３’－ジアルデヒド）、ＥＰＺ０１５６６６、ＡＭＩ－１、５’－メチルチオアデノシン及びＳ－アデノシルホモシステイン等である。

上記抗がん剤は、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が対応する正常な細胞よりも低下しているがんに使用される。ＮＤＲＧ２の発現の測定には、当技術分野において公知の標準的な方法を用いることができる。例えば、ＮＤＲＧ２の発現量は、ＮＤＲＧ２が転写されたｍＲＮＡの量又はＮＤＲＧ２タンパク質の量を指標として測定できる。ｍＲＮＡの量及びＮＤＲＧ２タンパク質の量は、それぞれ公知であるＮＤＲＧ２の塩基配列及びＮＤＲＧ２タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、標準的な方法を用いて測定できる。

がん細胞内のＮＤＲＧ２の転写産物であるｍＲＮＡの量を測定する場合、該ｍＲＮＡの定量は、該ｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いるＰＣＲの後に電気泳動を行ってもよいし、蛍光標識されたプローブを用いてリアルタイムＰＣＲ法で行ってもよい。

がん細胞内のＮＤＲＧ２タンパク質の量を測定する場合、例えば、該タンパク質の量は、該タンパク質に結合する抗体を用いることによって測定することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。当該タンパク質の定量は、当該抗体を用いる免疫組織化学染色によって行ってもよいし、がん細胞から得られるタンパク質抽出物を電気泳動した後に抗体を用いて定量するイムノブロット法等を用いてもよい。

「対応する正常な細胞」とは、がん化した細胞に対してがん化していない細胞を意味する。比較対照となる正常な細胞は、被検体の正常な細胞であってもよいし、被検体とは異なる個体の正常な細胞であってもよい。なお、複数の個体の正常な細胞についてＮＤＲＧ２の発現量を測定し、発現量の平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な細胞における発現量のデータから、平均値±標準偏差等の適正値を比較対照としてもよい。

好ましくは、上記抗がん剤は、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が対応する正常な細胞よりも有意に低下しているがんに使用される。ここで「有意に低下している」とは、統計学上の有意な差をもって低下していることを意味する。統計学上の差を評価するには、例えば、がん細胞の平均発現量と正常な細胞の平均発現量の差を、ｔ検定等で検定すればよい。

例えば、対応する正常な細胞は、がんがＡＴＬＬの場合、Ｔ細胞及びリンパ節のがん化していない細胞等である。がんが骨肉腫の場合、対応する正常な細胞は、腫瘍発生部位に対応する部位のがん化していない細胞等である。がんが子宮頸がんの場合、対応する正常な細胞は、子宮頸部のがん化していない細胞等である。

より具体的には、上記がん細胞のＮＤＲＧ２の発現量は、対応する正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量に対する相対値で０～９０％、０～８０％、０～７０％、０～６０％、０～５０％、０～４０％、０～３０％、０～２０％、０～１０％、０～５％、０～３％、０～２％又は０～１％である。

がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が対応する正常な細胞よりも低下しているがんとしては、好ましくは、ＡＴＬＬ、膵臓がん、皮膚がん、悪性リンパ腫、前立腺がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、食道がん、胆管がん、前立腺がん、褐色細胞腫、陰茎がん、骨肉腫及び精巣がんが挙げられる。なお、ＮＤＲＧ２の発現量が低下しているがん細胞は、上記非特許文献１及び特許文献２に示されている。

本実施の形態に係る抗がん剤は、ＰＲＭＴ５阻害剤を有効成分として含むように既知の方法で製造される。当該抗がん剤は、有効成分として０．１～９９重量％、１～５０重量％、好ましくは１～２０重量％のＰＲＭＴ５阻害剤を含む。

本実施の形態に係る抗がん剤の剤形は、注射剤及び経口剤が好ましい。その他、当該抗がん剤の剤形は、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤及び口腔内吸収剤等であってもよい。当該抗がん剤は、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等として当該抗がん剤に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物を用いることもできる。

賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶セルロース及び軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク及びコロイドシリカ等である。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン等である。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム及びカルボキシメチルスターチナトリウム等である。

溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール及びマクロゴール等である。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤は、界面活性剤及び親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等である。

等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン及びＤ－マンニトール等である。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコール等である。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸及びソルビン酸等である。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩及びアスコルビン酸等である。

本実施の形態に係る抗がん剤の投与量は、患者の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該抗がん剤は、ＰＲＭＴ５阻害剤が治療上有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なＰＲＭＴ５阻害剤の量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。当該抗がん剤の投与量は、典型的には、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。当該抗がん剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与されてもよい。なお、必要に応じて、当該抗がん剤は、上記の範囲外の量で使用されてもよい。

本実施の形態に係る抗がん剤の投与方法は、特に限定されないが、注射、経鼻、経皮、経肺及び経口等で投与される。投与方法としては、静脈内投与、動脈内投与又は経口投与が特に好ましい。

本実施の形態に係る抗がん剤は、下記実施例４に示すように、ＮＤＲＧ２の発現量が低下しているがん細胞の細胞増殖抑制を示す一方で、ＮＤＲＧ２の発現量が低下していないがん細胞の細胞増殖にはほとんど影響しない。がん化していない正常な細胞は、ＮＤＲＧ２の発現量が低下していないため、がん細胞に対して高い選択性が得られる。当該抗がん剤は、がん細胞特異的に細胞増殖を抑制するため、副作用のリスクを軽減できる。

また、上記抗がん剤は、好適には、ＡＴＬＬ、骨肉腫及び子宮頸がんからなる群から選択されるがんに使用される。下記実施例２～４に示すように、ＡＴＬＬ、骨肉腫及び子宮頸がんのがん細胞に対して、より確実に抗がん作用を得ることができる。

（実施の形態２）
次に、実施の形態２に係る抗がん剤のスクリーニング方法について説明する。本実施の形態に係る抗がん剤のスクリーニング方法は、ＰＲＭＴ５阻害剤を、対応する正常な細胞よりもＮＤＲＧ２の発現量が低下したがん細胞に接触させる接触ステップを含む。

ＮＤＲＧ２の発現量が低下したがん細胞は、例えば、患者の腫瘍組織から採取された細胞又は該細胞から樹立されたがん化した細胞株である。ＮＤＲＧ２の発現量の低下は、上述の方法で評価することができる。ＰＲＭＴ５阻害剤をがん細胞に接触させるには、例えば、当該がん細胞の培地にＰＲＭＴ５阻害剤を添加すればよい。

接触ステップの後、がん細胞の挙動を評価することで、抗がん剤として有望なＰＲＭＴ５阻害剤を選択することができる。がん細胞の挙動の評価では、ＰＲＭＴ５阻害剤の非存在下で培養したがん細胞と、ＰＲＭＴ５阻害剤を接触させたがん細胞とを比較してもよい。がん細胞の挙動とは、例えば、細胞増殖、細胞死、アポトーシス及び細胞周期の変化等である。

好ましくは、接触ステップで、コントロールとしてＰＲＭＴ５阻害剤を添加しない培地でがん細胞を培養し、ＰＲＭＴ５阻害剤存在下で培養したがん細胞とコントロールのがん細胞との間で、所定時間経過後の細胞数を比較すればよい。ＰＲＭＴ５阻害剤存在下で培養したがん細胞の細胞数が、コントロールよりも有意に少ない場合、該ＰＲＭＴ５阻害剤を抗がん剤として選択すればよい。

アポトーシスを評価する場合、例えば、がん細胞におけるＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３等のアポトーシスのマーカーの発現を、ウエスタンブロット法又は免疫染色等で評価すればよい。コントロールよりもアポトーシスのマーカーが有意に多く発現させたＰＲＭＴ５阻害剤を、抗がん剤として選択すればよい。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る抗がん剤のスクリーニング方法によれば、高い選択性でより確実に特定のがんに薬効を示すＰＲＭＴ５阻害剤を選択することができる。

（実施の形態３）
続いて、実施の形態３に係るがんに対する有効性判定キットについて説明する。該有効性判定キットは、ＰＲＭＴ５阻害剤のがんに対する有効性判定キットであって、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を定量するための試薬を備える。

がん細胞は、例えば、生検において患者の腫瘍組織から採取したがん細胞である。がん細胞は、そのまま用いてもよいし、培養することで増殖させたがん細胞を用いてもよい。がん細胞として、固定して切片化された組織に含まれるがん細胞を用いてもよい。

上記試薬は、例えば、上述のＮＤＲＧ２タンパク質に対する抗体及びＮＤＲＧ２の転写産物であるｍＲＮＡに特異的なプライマーである。当該有効性判定キットは、必要に応じて、免疫組織化学染色用のその他の試薬又は蛍光標識されたプローブ等を備えてもよい。

本実施の形態に係るがんに対する有効性判定キットによれば、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を定量することができるため、がんに対するＰＲＭＴ５阻害剤の有効性を精度よく判定することができる。

また、ＰＲＭＴ５阻害剤は、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が低下しているがんに有効であるため、当該有効性判定キットを用いて患者のがん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を定量し、対応する正常な細胞等とＮＤＲＧ２の発現量を比較することができる。これにより、該患者を投与対象とするか否かを判定できるため、臨床上有用である。

別の実施の形態では、ＰＲＭＴ５阻害剤のがんに対する有効性判定方法が提供される。該有効性判定方法は、測定ステップと、比較ステップと、判定ステップと、を含む。測定ステップでは、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を測定する。比較ステップでは、測定ステップにおいて測定された発現量を、対応する正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量と比較する。判定ステップでは、比較ステップにおいて、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量よりも低い場合に、ＰＲＭＴ５阻害剤ががん細胞に有効であると判定する。

また、別の実施の形態では、上述の測定ステップ、比較ステップ及び判定ステップに加え、がん細胞を有するがん患者にＰＲＭＴ５阻害剤を投与する投与ステップをさらに含むがんの治療方法が提供される。

また、別の実施の形態では、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が対応する正常な細胞よりも低下しているがんの患者に、ＰＲＭＴ５阻害剤を投与する投与ステップを含む、がんの治療又は予防方法が提供される。また、他の実施の形態では、ＰＲＭＴ５阻害剤は、がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が対応する正常な細胞よりも低下しているがんの治療又は予防に使用される。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（細胞株）
下記実施例では、細胞株として、ＨＴＬＶ－１非感染Ｔ細胞リンパ性急性白血病Ｔ－ＡＬＬ（Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４）、ＨＴＬＶ－１感染細胞株（ＨＵＴ１０２）、ＡＴＬＬ細胞株（ＫＯＢ）、骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ）及び子宮がん細胞株（ＨｅＬａ）を用いた。ＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）添加若しくは無添加のｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を１０％添加したＲＰＭ１１６４０又はＤＭＥＭ培養液で３７℃、５％二酸化炭素下で上記細胞株を培養した。

（抗体）
下記実施例におけるウエスタンブロット法及び免疫染色では、一次抗体として、ヤギ抗ＰＲＭＴ５（Ｃ－２０）ポリクローナル抗体（ｓｃ－２２１３２）、ヤギ抗ＮＤＲＧ２（Ｅ－２０）ポリクローナル抗体（ｓｃ－ｓｃ－１９４６８）（以上、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、マウス抗β－ａｃｔｉｎ（ＡＣ－７４）モノクローナル抗体（Ａ５３１６）（ＳＩＧＭＡＡＬＤＲＩＣＨ社製）、ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ３（８Ｇ１０）モノクローナル抗体（＃９６６５）、ウサギ抗ＣＬ．－Ｃａｓｐａｓｅ３（Ａｓｐ１７５）ポリクローナル抗体（＃９６６１）（以上、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製）を使用した。二次抗体としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｐ０４４９）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐ０２６０）及びＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐ０３９９）（以上、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を使用した。

（実施例１：細胞株におけるＮＤＲＧ２の発現量の検討）
上述のＪｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４、ＨＵＴ１０２、ＫＯＢ、Ｕ２ＯＳ及びＨｅＬａにおけるＮＤＲＧ２の発現量として、ＮＤＲＧ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法で確認した。ウエスタンブロット法では、培養した細胞を回収後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭリン酸緩衝液、１２０ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。次に、１％ＮＰ－４０緩衝液（１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ－４０、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を加えて細胞を溶解させた。遠心後、１０～２０ｇの細胞溶解液にＳＤＳサンプル緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、５％β－メルカプトエタノール）を加えて、９５℃で５分間煮沸した。得られた試料を、８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、ミニプロテアン３セル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により定電圧１００Ｖで１時間電気泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により定電圧１００Ｖを２時間でＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、ＰＶＤＦ膜に対して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は５％スキンミルク添加リン酸緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）により、定温で１時間ブロッキング反応を行った。ブロッキング後、ＣａｎＧｅｔｓｉｇｎａｌ（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（東洋紡社製）又は５％スキンミルクで１０００倍希釈した一次抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。

ＰＢＳＴでＰＶＤＦ膜を３回洗浄した後、ＣａｎＧｅｔｓｉｇｎａｌ（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（東洋紡社製）又は５％スキンミルクで２０００倍希釈した二次抗体を用いて、ＰＶＤＦ膜において室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでＰＶＤＦ膜を３回洗浄した後、ＬｕｍｉｌｉｇｈｔＰＬＵＳＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＫｉｔ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社製）にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーＬＡＳ－３０００（富士フィルム社製）で画像を解析した。

（結果）
図１に示すように、ＨＴＬＶ－１に非感染の細胞株Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４では、ＮＤＲＧ２タンパク質の発現が認められた。一方、ＨＵＴ１０２、ＫＯＢ、Ｕ２ＯＳ及びＨｅＬａでは、ＮＤＲＧ２タンパク質がほとんど発現していなかった。なお、Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４におけるＮＤＲＧ２のｍＲＮＡの発現量は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と同程度であることが上記非特許文献１において示されている。

（実施例２：ＰＲＭＴ５遺伝子の発現低下によるアポトーシス誘導）
細胞株におけるＰＲＭＴ５遺伝子の発現を低下させるために、ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＲＮＡｉｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ＰＲＭＴ５発現低下ベクターとしてｓｈ－ＰＲＭＴ５－３及びｓｈ－ＰＲＭＴ５－４を作製した。ｓｈ－ＰＲＭＴ５－３のセンス鎖の塩基配列及びアンチセンス鎖の塩基配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。ｓｈ－ＰＲＭＴ５－４のセンス鎖の塩基配列及びアンチセンス鎖の塩基配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。コントロールｓｈＲＮＡベクターとして、標的遺伝子の塩基配列を含まないＭｏｃｋ又はルシフェラーゼを標的としたｓｈｌｕｃを作製した。

上記ベクターを用いてＰＲＭＴ５発現低下細胞株を作製した。上記ベクター１０μｇ及びｐＶＳＶ－Ｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）２０μｇを、リン酸カルシウム法により２９３ＧＰ細胞株に導入し、レトロウイルスを作製した。得られたレトロウイルスをＨＵＴ１０２及びＫＯＢ細胞それぞれ１×１０^６細胞に感染させ、Ｍｏｃｋ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株を樹立した。

樹立した各細胞株について、９６ウェルプレートで細胞数２×１０^３個を培養し、所定の時間にｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を添加した。４５０ｎｍ又は４９０ｎｍの吸光度に基づいて細胞数を定量し、細胞増殖能を評価した。

実施例１と同様のウエスタンブロット法及び培養した細胞の免疫染色でアポトーシスを評価した。培養した細胞の免疫染色では、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．１％ＮＰ－４０により透過処理を行った。２％ＢＳＡ溶液を用いて常温で１時間ブロッキングし、２％ＢＳＡで希釈した一次抗体を用いて４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温にて２％ＢＳＡで希釈した二次抗体を１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）でＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３を染色した。

（結果）
図２（Ａ）は、ＨＵＴ１０２を親株（ｐａｒｅｎｔａｌ）として、親株から樹立したＭｏｃｋ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株の細胞増殖能の経時変化を示す。ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株では、ＰＲＭＴ５遺伝子の発現低下により有意に細胞増殖能が低下した。図２（Ｂ）は、ＫＯＢを親株として、親株から樹立したＭｏｃｋ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株の細胞増殖能の経時変化を示す。ＨＵＴ１０２と同様に、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株では、ＰＲＭＴ５遺伝子の発現低下により有意に細胞増殖能が低下した。

図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、それぞれＨＵＴ１０２及びＫＯＢのウエスタンブロット法の結果を示す。ＨＵＴ１０２及びＫＯＢの双方において、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株では、アポトーシスの指標であるＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３の発現が顕著に亢進していた。

図４（Ａ）は、ＨＵＴ１０２の免疫染色の結果を示す。免疫染色においてもＨＵＴ１０２のｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株でＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３の亢進した発現が確認された。図４（Ｂ）は、培養した細胞に対してＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３が免疫染色において陽性だった細胞の比率を示す。ＨＵＴ１０２のｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株におけるＣＬ－ｃａｓｐａｓｅ３の有意な発現亢進が定量的に示された。

図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、ＫＯＢに関して、それぞれ免疫染色で撮像された画像及びＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３が陽性であった細胞の比率を示す。ＨＵＴ１０２と同様に、ＫＯＢに関してもｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株において、ＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３の亢進した発現が確認された。

以上の結果より、ＮＤＲＧ２の発現が低下したＡＴＬＬに係る細胞株の細胞増殖及び抗アポトーシスに、ＰＲＭＴ５が関与していることが示された。

（実施例３：免疫不全マウスへの皮下移植実験）
ＨＵＴ１０２の親株、Ｍｏｃｋ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株を回収し、それぞれ１×１０^７個の細胞をＰＢＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社製）に懸濁し、２６Ｇのシリンジを用いて免疫不全ＳＣＩＤマウス（ＣＬＥＡＪａｐａｎ社製）の背部皮下に移植した。移植後７日から腫瘍の直径及び短径を電動ノギスで随時測定し、計算式（直径×（短径）^２／２）で腫瘍体積を算出した。

皮下移植後３１日目に安楽死させ剖検を行い、腫瘍を摘出した。腫瘍重量を測定後、腫瘍を４％パラホルムアルデヒドで固定した。エタノールで固定した腫瘍から段階的に脱水し、キシレンによる透徹を行い、腫瘍をパラフィンに包埋した。パラフィンブロックを薄切し、スライドガラスに固定した。作製した切片はキシレンを用いてパラフィンを取り除き、段階的なエタノールで親水化した。免疫組織化学染色のために、切片についてクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中でのマイクロウェーブ処理により抗原を賦活化した後、メタノール溶液０．３％Ｈ_２Ｏ_２に３０分間浸することで内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。続いて、切片に対して、２％ＢＳＡ溶液を用いて常温で１時間ブロッキングし、２％ＢＳＡで希釈した一次抗体を用いて４℃で一晩反応させた。次に、ＰＢＳで切片を３回洗浄し、２％ＢＳＡで希釈した二次抗体と室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳで切片を３回洗浄し、ＤＡＢ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）でＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３を染色した。

（結果）
図６は、腫瘍体積の経時変化を示す。ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株で移植後１７日目以降、有意に腫瘍形成能が低下した。図７及び図８に示すように、３１日目の腫瘍重量及び大きさはｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株で顕著に減少していた。図９は、腫瘍免疫組織化学染色の結果を示す。ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株の腫瘍では、ＣＬ．－ｃａｓｐａｓｅ３が増加していた。

以上の結果より、がん細胞のＮＤＲＧ２の発現が低下したＡＴＬＬに対して、ＰＲＭＴ５の阻害が有効であることが示された。

（実施例４：ＰＲＭＴ阻害剤による細胞増殖抑制実験）
ＨＵＴ１０２及びＫＯＢに加え、Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４を培養した。培養開始時に、ＰＲＭＴ５阻害剤であるＡｄＯＸ（Ｓｉｇｍａ社製）を培地にそれぞれ付加した。上記実施例２と同様に、細胞増殖能を評価した。

また、固形がんの細胞株についてもＰＲＭＴ５遺伝子の発現低下の影響を実施例２と同様に評価した。Ｕ２ＯＳ及びＨｅＬａの親株、ｓｈｌｕｃ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株の細胞増殖能とＰＲＭＴ阻害剤の細胞増殖能に対する影響とを評価した。

（結果）
図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）は、それぞれＨＵＴ１０２及びＫＯＢの細胞増殖能の経時変化を示す。ＡｄＯＸは、ＨＵＴ１０２及びＫＯＢのいずれでも濃度依存的に細胞増殖抑制を示した。一方、図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）は、それぞれＪｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４の細胞増殖能の経時変化を示す。ＮＤＲＧ２の発現が低下していないＪｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４では、ＡｄＯＸによる細胞増殖抑制が認められなかった。

図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）は、それぞれＵ２ＯＳ及びＨｅＬａを親株として、親株から樹立したｓｈｌｕｃ細胞株、ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株の細胞増殖能の経時変化を示す。ｓｈＰＲＭＴ５－３細胞株及びｓｈＰＲＭＴ５－４細胞株では、ＰＲＭＴ５遺伝子の発現低下により有意に細胞増殖能が低下した。図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、それぞれＡｄＯＸ存在下でのＵ２ＯＳ及びＨｅＬａの細胞増殖能の経時変化を示す。ＡｄＯＸは、Ｕ２ＯＳ及びＨｅＬａのいずれでも濃度依存的に細胞増殖を抑制した。

以上の結果より、ＡＴＬＬのみならず、ＮＤＲＧ２の発現が低下した固形がんに対しても、ＰＲＭＴ５の阻害が有効であることが示された。ＮＤＲＧ２の発現が低下していないがん細胞では、がん細胞の増殖がＰＲＭＴ５の阻害によって抑制されなかったことから、ＮＤＲＧ２の発現が低下していない正常細胞及びがん細胞では、ＰＲＭＴ５阻害による細胞増殖抑制がほとんどみられないと考えられる。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１７年１月２７日に出願された、日本国特許出願２０１７－１２６５４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１７－１２６５４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明は、がん、特にはＡＴＬＬ等のＮＤＲＧ２の発現量が低下したがんの治療又は予防に好適である。

Claims

タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤のがんに対する有効性判定キットであって、
がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を定量するための試薬を備え、
前記がん細胞は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、骨肉腫又は子宮がん由来の細胞である、
がんに対する有効性判定キット。
タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤のがんに対する有効性判定方法であって、
がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量を測定する測定ステップと、
前記測定ステップにおいて測定された発現量を、対応する正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量と比較する比較ステップと、
前記比較ステップにおいて、前記がん細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量が前記正常な細胞におけるＮＤＲＧ２の発現量よりも低い場合に、タンパク質アルギニンメチル基転移酵素５阻害剤が前記がん細胞に有効であると判定する判定ステップと、
を含み、
前記がん細胞は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、骨肉腫又は子宮がん由来の細胞である、
がんに対する有効性判定方法。