JP7041616B2 - リポカチオン性デンドリマーおよびその使用 - Google Patents

リポカチオン性デンドリマーおよびその使用 Download PDF

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Description

本出願は、2015年9月14日付で出願された米国仮出願第62/218,412号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1. 発明の分野
本発明は全体として、デンドリマーの分野に関する。特に、本発明は、核酸を含むデンドリマーナノ粒子組成物に関する。より詳細には、本発明は、核酸の送達のためのデンドリマーナノ粒子組成物に関する。より詳細には、本発明は、薬物および他の賦形剤の送達のためのデンドリマーナノ粒子組成物に関する。
2. 関連技術の説明
RNAiもしくは他の核酸剤の発見およびそれらの治療可能性の認識以来、有効な送達担体のための継続的な探索が行われている(Whitehead et al., 2009; Kanasty et al., 2013; Akinc et al., 2008; Davis et al., 2010; Love et al., 2010; Siegwart et al., 2011; Jayaraman et al., 2012)。健常な肝臓への低分子RNAの送達効力に関して進歩が遂げられたが、腫瘍に対する高い効力と低い正常細胞肝毒性の臨床的に必要とされる組み合わせは、現存する送達媒体によって現在満たされていない。残念ながら、肝細胞がん(HCC)処置のための低分子薬物の全5つの第III相ヒト臨床試験は、消耗性の末期肝機能障害が薬物毒性を増幅させるため、過去4年内に部分的に失敗した(Roberts, L.R., 2008; Scudellari, M., 2014)。マイクロRNA (miRNA)は、細胞分化、増殖、および生存に関与する複数の経路を同時に標的とすることにより腫瘍抑制因子として機能することができるため有望な代替戦略となるが、これらの治療剤は担体が有効であることを要する(Ventura and Jacks, 2009; Kasinski and Slack, 2011; Ling et al., 2013; Cheng et al., 2015)。薬物担体の効力と毒性とのバランスは、特に担体自身の毒性が低分子RNA療法の治療有効性を弱めうる肝臓がんとの関連で、有用な基準である。
この低い毒性と高い効力のバランスを達成するために、送達担体の構造多様性および分子サイズを拡大することによる化学構造の影響は、治療的に有効なバランスを達成するのに有用である。デンドリマーは、中心コアから放射状に発する複数の完全に分枝した単量体から構成される単分散巨大分子である。デンドリマーはそれゆえ、低分子と同じ高度の分子均一性および多分散重合体としての化学的調整のための広い理論的空間を有する(Bosman et al., 1999; Frechet and Tomalia, 2002; Gillies and Frechet, 2002; Grayson and Frechet, 2001)。これらの固有の特徴は、さまざまな生物医学的用途のための特異的性質(Murat and Grest, 1996; Percec et al., 2010; Duncan and Izzo, 2005)をデンドリマーが有することを可能にする(Stiriba et al., 2002; Lee et al., 2005; Wu et al., 2015)。遺伝子送達において、大部分の研究では、さらなる化学修飾のために限られた数の市販のデンドリマーを用いてきた。(Kang et al., 2005; Taratula et al., 2009; Khan et al., 2014)。デンドリマー用途の拡大はそれゆえ、サイズ、化学的性質、形態、および最終的には、デンドリマーの物理的特性を化学合成によって容易に調整する能力に依る。かくして、核酸および他の薬物の担体として作用できる新しいデンドリマーの開発は臨床的に有用である。
発明の概要
いくつかの局面において、本開示は下記式のデンドリマー:
コア-(繰り返し単位)n-末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは、下記式を有し:
Figure 0007041616000001
式中、
X1はアミノもしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、ヘテロシクロアルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、もしくはその置換型であり;
R1はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
aは1、2、3、4、5、もしくは6であり; あるいは
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000002
式中、
X2はN(R5)yであり;
R5は水素、アルキル(C≦18)、もしくは置換アルキル(C≦18)であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R2はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3であり; あるいは
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000003
式中、
X3は-NR6-であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、もしくは置換アルキル(C≦8)、-O-、もしくはアルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、アレーンジイル(C≦8)、ヘテロアレーンジイル(C≦8)、ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R3およびR4は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH2CH2N)e(Rc)Rdの基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; または
コアはアルキルアミン(C≦18)、ジアルキルアミン(C≦36)、ヘテロシクロアルカン(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000004
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000005
の基であり;
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000006
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000007
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、
式中、
R11は水素、アルキル(C≦6)もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩を提供する。いくつかの態様において、デンドリマーの構造はさらに定義される:
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000008
式中、
X1はアミノもしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、ヘテロシクロアルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、もしくはその置換型であり;
R1はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
aは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000009
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000010
の基であり;
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000011
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000012
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、
式中、
R11は水素、アルキル(C≦6)もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。いくつかの態様において、デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位)n-末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000013
式中、
X2はN(R5)yであり;
R5は水素もしくはアルキル(C≦8)、もしくは置換アルキル(C≦18)であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R2はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3であり;
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000014
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000015
の基であり;
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000016
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000017
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。他の態様において、デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位)n-末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000018
式中、
X3は-NR6-であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、もしくは置換アルキル(C≦8)、-O-、もしくはアルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、アレーンジイル(C≦8)、ヘテロアレーンジイル(C≦8)、ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R3およびR4は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH2CH2N)e(Rc)Rdの基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000019
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000020
の基であり;
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000021
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000022
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、
式中、
R11は水素、アルキル(C≦6)もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。他の態様において、デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位)n-末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアはアルキルアミン(C≦18)、ジアルキルアミン(C≦36)、ヘテロシクロアルカン(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000023
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000024
の基であり;
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000025
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000026
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、
式中、
R11は水素、アルキル(C≦6)もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。いくつかの態様において、末端基は下記式:
Figure 0007041616000027
によってさらに定義され、
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり; および
R10は水素である。
他の態様において、末端基は下記式:
Figure 0007041616000028
によってさらに定義され、
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)であり; および
R10は水素である。
いくつかの態様において、Y4はアルカンジイル(C4～18)である。他の態様において、末端基は下記式:
Figure 0007041616000029
によってさらに定義され、
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10はアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)である。
いくつかの態様において、末端基は下記式:
Figure 0007041616000030
によってさらに定義され、
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
R10はヒドロキシである。
いくつかの態様において、コアは下記式:
Figure 0007041616000031
によってさらに定義され、
式中、
X1はアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、ヘテロシクロアルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、もしくはその置換型であり;
R1はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; および
aは1、2、3、4、5、もしくは6である。
いくつかの態様において、X1はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、X1はエチルアミノである。他の態様において、X1はジアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換ジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、X1はジメチルアミノである。他の態様において、X1はヘテロシクロアルキル(C≦12)もしくは置換ヘテロシクロアルキル(C≦12)である。他の態様において、X1は4-ピペリジニル、N-ピペリジニル、N-モルホリニル、N-ピロリジニル、2-ピロリジニル、N-ピペラジニルもしくはN-4-メチルピペラジニル(N-4-methylpiperadizinyl)である。他の態様において、X1はヘテロアリール(C≦12)もしくは置換ヘテロアリール(C≦12)である。いくつかの態様において、X1は2-ピリジニルもしくはN-イミダゾリルである。いくつかの態様において、R1はヒドロキシである。他の態様において、R1はアミノである。他の態様において、R1はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R1はアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R1はメチルアミノもしくはエチルアミノである。いくつかの態様において、aは1、2、3、もしくは4である。いくつかの態様において、aは2もしくは3である。いくつかの態様において、aは2である。他の態様において、aは3である。いくつかの態様において、コアは下記式の化合物としてさらに定義される:
Figure 0007041616000032
いくつかの態様において、コアは
Figure 0007041616000033
としてさらに定義される。
他の態様において、コアは下記式によってさらに定義される:
Figure 0007041616000034
式中、
X2はN(R5)yであり;
R5は水素もしくはアルキル(C≦18)、または置換アルキル(C≦18)であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R2はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3である。
いくつかの態様において、X2はNである。他の態様において、X2はNR5であり、式中、R5は水素もしくはアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R5は水素である。他の態様において、R5はメチルである。いくつかの態様において、zは3である。他の態様において、zは2である。いくつかの態様において、R2はヒドロキシである。他の態様において、R2はアミノである。他の態様において、R2はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R2はアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R2はメチルアミノである。他の態様において、R2はジアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換ジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R2はジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R2はジメチルアミノである。いくつかの態様において、bは1、2、3、もしくは4である。いくつかの態様において、bは2もしくは3である。いくつかの態様において、bは2である。他の態様において、bは3である。いくつかの態様において、コアは
Figure 0007041616000035
としてさらに定義される。
いくつかの態様において、コアは
Figure 0007041616000036
としてさらに定義される。
他の態様において、コアは
Figure 0007041616000037
としてさらに定義され、
式中、
X3は-NR6-であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、もしくは置換アルキル(C≦8)、-O-、もしくはアルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、アレーンジイル(C≦8)、ヘテロアレーンジイル(C≦8)、ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R3およびR4は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH2CH2N)e(Rc)Rdの基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6である。
いくつかの態様において、X3は-O-である。他の態様において、X3は-NR6-であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、X3は-NH-もしくは-NCH3-である。他の態様において、X3はアルキルアミノジイル(C≦8)もしくは置換アルキルアミノジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、X3は-NHCH2CH2NH-もしくは-NHCH2CH2NHCH2CH2NH-である。他の態様において、X3はアルコキシジイル(C≦8)もしくは置換アルコキシジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、X3は-OCH2CH2O-である。他の態様において、X3はアレーンジイル(C≦8)もしくは置換アレーンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、X3はベンゼンジイルである。他の態様において、X3はヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)もしくは置換ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、X3はN,N'-ピペラジンジイルである。
いくつかの態様において、R3はアミノである。他の態様において、R3はヒドロキシである。他の態様において、R3はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R3はアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R3はメチルアミノである。他の態様において、R3はジアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換ジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R3はジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R3はジメチルアミノである。
いくつかの態様において、R4はアミノである。他の態様において、R4はヒドロキシである。他の態様において、R4はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R4はアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R4はメチルアミノである。他の態様において、R4はジアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換ジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R4はジアルキルアミノ(C≦12)である。いくつかの態様において、R4はジメチルアミノである。他の態様において、R4は-(CH2CH2N)e(Rc)Rdであり: 式中、 eは1、2、もしくは3であり; ならびにRcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)である。いくつかの態様において、eは1もしくは2である。いくつかの態様において、eは1である。いくつかの態様において、Rcは水素である。いくつかの態様において、Rdは水素である。
いくつかの態様において、cは1、2、3、もしくは4である。いくつかの態様において、cは2もしくは3である。いくつかの態様において、cは2である。他の態様において、cは3である。いくつかの態様において、dは1、2、3、もしくは4である。いくつかの態様において、dは2もしくは3である。いくつかの態様において、dは2である。他の態様において、dは3である。いくつかの態様において、コアは
Figure 0007041616000038
としてさらに定義される。
いくつかの態様において、コアは
Figure 0007041616000039
としてさらに定義される。
他の態様において、コアはアルキルアミン(C≦18)、ジアルキルアミン(C≦36)、ヘテロシクロアルカン(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型である。いくつかの態様において、コアはアルキルアミン(C≦18)もしくは置換アルキルアミン(C≦18)である。いくつかの態様において、コアはオクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、およびオクタデシルアミンである。他の態様において、コアはジアルキルアミン(C≦36)もしくは置換ジアルキルアミン(C≦36)である。いくつかの態様において、コアはN-メチル、N-ドデシルアミン、ジオクチルアミン、もしくはジデシルアミンである。他の態様において、コアはヘテロシクロアルカン(C≦12)もしくは置換ヘテロシクロアルカン(C≦12)である。いくつかの態様において、コアは4-N-メチルピペラジニルである。いくつかの態様において、Y1はアルカンジイル(C≦8)もしくは置換アルカンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、Y1はアルカンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、Y1は-CH2CH2-である。いくつかの態様において、Y3はアルカンジイル(C≦8)もしくは置換アルカンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、Y3はアルカンジイル(C≦8)である。いくつかの態様において、Y3は-CH2CH2-である。他の態様において、Y3は以下である:
Figure 0007041616000040
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型である。
いくつかの態様において、X3はアルカンジイル(C≦12)もしくは置換アルカンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、X3は-CH2CH2-である。いくつかの態様において、X4はアルカンジイル(C≦12)もしくは置換アルカンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、X4は-CH2CH2-である。いくつかの態様において、Y5は共有結合である。いくつかの態様において、Y3は以下である:
Figure 0007041616000041
式中、
X3およびX4はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y5は共有結合、アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型である。
いくつかの態様において、X3はアルカンジイル(C≦12)もしくは置換アルカンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、X3は-CH2CH2-である。いくつかの態様において、X4はアルカンジイル(C≦12)もしくは置換アルカンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、X4は-CH2CH2-である。いくつかの態様において、Y5は共有結合である。いくつかの態様において、Y5は-CH2-もしくは-C(CH3)2-である。いくつかの態様において、A1は-O-である。他の態様において、A1は-NRa-である。いくつかの態様において、Raは水素である。いくつかの態様において、A2は-O-である。他の態様において、A2は-NRa-である。いくつかの態様において、Raは水素である。いくつかの態様において、R9はアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R9はメチルである。いくつかの態様において、nは0、1、2、3もしくは4である。いくつかの態様において、nは0、1、2、もしくは3である。いくつかの態様において、nは0である。他の態様において、nは1である。他の態様において、nは2である。他の態様において、nは3である。
さらに別の局面において、本開示は、
(a) 本明細書において記述されるデンドリマー; および
(b) 核酸
を含む組成物を提供する。
いくつかの態様において、核酸は短干渉RNA(例えば低分子干渉RNA) (siRNA)、マイクロRNA (miRNA)、pri-miRNA、メッセンジャーRNA (mRNA)、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(cluster regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)関連核酸、単一ガイドRNA (sgRNA)、CRISPR-RNA (crRNA)、トランス活性化crRNA (tracrRNA)、プラスミドDNA (pDNA)、トランスファーRNA (tRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、ガイドRNA、二本鎖DNA (dsDNA)、一本鎖DNA (ssDNA)、一本鎖RNA (ssRNA)、および二本鎖RNA (dsRNA)である。いくつかの態様において、核酸は、siRNA、tRNA、もしくはCRISPRプロセスにおいて使用されうる核酸である。核酸はsiRNAでありうる。他の態様において、CRISPRプロセスにおいて使用されうる核酸、例えばクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連核酸、単一ガイドRNA (sgRNA)、CRISPR-RNA (crRNA)、もしくはトランス活性化crRNA (tracrRNA)。いくつかの態様において、核酸は、配列:
Figure 0007041616000042
を含む第VII因子に対するsiRNAである。
他の態様において、核酸はmiRNAである。他の態様において、核酸はmRNAである。他の態様において、核酸はtRNAである。他の態様において、核酸はガイドRNAである。いくつかの態様において、ガイドRNAはCRISPRプロセスにおいて用いられる。他の態様において、核酸はpDNAである。
いくつかの態様において、デンドリマーおよび核酸は、約100:1～約1:5の重量比で存在する。いくつかの態様において、デンドリマーと核酸との重量比は、約50:1～約2:1である。いくつかの態様において、デンドリマーと核酸との重量比は、25:1である。他の態様において、デンドリマーと核酸との重量比は、7:1である。いくつかの態様において、組成物は、1つもしくは複数のヘルパー脂質をさらに含む。いくつかの態様において、ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロイド誘導体、PEG脂質、もしくはリン脂質から選択される。いくつかの態様において、ヘルパー脂質は、ステロイドもしくはステロイド誘導体である。いくつかの態様において、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体およびデンドリマーは、約10:1～約1:20のモル比で存在する。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体およびデンドリマーのモル比は、約1:1～約1:10である。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体およびデンドリマーのモル比は、約38:50である。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体およびデンドリマーのモル比は、約1:5である。
他の態様において、ヘルパー脂質はPEG脂質である。いくつかの態様において、PEG脂質は下記式の化合物のようなPEG化ジアシルグリセロールである:
Figure 0007041616000043
式中、
R12およびR13は各々独立してアルキル(C≦24)、アルケニル(C≦24)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Reは水素、アルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり; および
xは1～250である。
いくつかの態様において、PEG脂質はジミリストイル-sn-グリセロールもしくは下記式の化合物である:
Figure 0007041616000044
式中、
n1は5～250であり; ならびに
n2およびn3は各々独立して2～25である。
いくつかの態様において、PEG脂質およびデンドリマーは、約1:1～約1:250のモル比で存在する。いくつかの態様において、PEG脂質およびデンドリマーのモル比は、約1:10～約1:125である。いくつかの態様において、PEG脂質およびデンドリマーのモル比は、約1:20～約1:50である。
他の態様において、ヘルパー脂質はリン脂質である。いくつかの態様において、リン脂質は1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)である。他の態様において、リン脂質は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である。いくつかの態様において、リン脂質およびデンドリマーは、約10:1～約1:20のモル比で存在する。いくつかの態様において、リン脂質およびデンドリマーのモル比は、約1:1～約1:10である。いくつかの態様において、リン脂質およびデンドリマーのモル比は約4：5である。いくつかの態様において、リン脂質およびデンドリマーのモル比は約1：5である。いくつかの態様において、組成物は、デンドリマー、核酸、および1つもしくは複数のヘルパー脂質から本質的になる。
さらに別の局面において、本開示は、
(a) 本明細書において記述される組成物もしくはデンドリマー; および
(b) 薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、溶媒もしくは溶液である。いくつかの態様において、薬学的組成物は経口的に、脂肪内に(intraadiposally)、動脈内に、関節内に、頭蓋内に、皮内に、病変内に、筋肉内に、鼻腔内に、眼内に、心膜内に、腹腔内に、胸膜内に、前立腺内に、直腸内に、くも膜下腔内に、気管内に、腫瘍内に、臍帯内に、膣内に、静脈内に、膀胱内に、硝子体内に、リポソーム的に、局所的に、粘膜的に、非経口的に、直腸的に、結膜下に、皮下に、舌下に、局所に、経頬的に、経皮的に、経膣的に、クリーム中で、脂質組成物中で、カテーテルを介して、洗浄を介して、持続注入を介して、注入を介して、吸入を介して、注射を介して、局所送達を介して、もしくは限局性かん流を介して投与するために製剤化される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、静脈内もしくは動脈内注射のために製剤化される。いくつかの態様において、薬学的組成物は単位用量として製剤化される。
さらに別の局面において、本開示は、核酸を細胞に送達する段階を含む遺伝子の発現を調節する方法であって、細胞への核酸の取り込みを引き起こすのに十分な条件の下で本明細書において記述される組成物もしくは薬学的組成物と細胞を接触させる段階を含む、該方法を提供する。いくつかの態様において、細胞をインビトロで接触させる。他の態様において、細胞をインビボで接触させる。他の態様において、細胞をエクスビボで接触させる。いくつかの態様において、遺伝子発現の調節は、疾患もしくは障害を処置するのに十分である。いくつかの態様において、疾患もしくは障害はがんである。いくつかの態様において、疾患もしくは障害は肝臓がんである。いくつかの態様において、疾患もしくは障害は肝細胞がんである。
さらに別の局面において、本開示は、本明細書において記述される組成物もしくは薬学的組成物の薬学的有効量を、それを必要とする患者に投与する段階を含む、患者における疾患もしくは障害を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、疾患もしくは障害はがんである。いくつかの態様において、疾患もしくは障害は肝臓がんである。いくつかの態様において、疾患もしくは障害は肝細胞がんである。いくつかの態様において、本方法は、患者に1つもしくは複数のさらなるがん療法を投与する段階をさらに含む。いくつかの態様において、がん療法は、化学療法化合物、外科手術、放射線療法、もしくは免疫療法である。いくつかの態様において、組成物もしくは薬学的組成物は、1回患者に投与される。他の態様において、組成物もしくは薬学的組成物は2回もしくはそれ以上の回数、患者に投与される。いくつかの態様において、患者はヒトのような哺乳動物である。
さらに別の局面において、
本開示は下記式のデンドリマー:
コア-(繰り返し単位)n-末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000045
式中、
X3は-NR6-であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、もしくは置換アルキル(C≦8)、-O-、もしくはアルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、アレーンジイル(C≦8)、ヘテロアレーンジイル(C≦8)、ヘテロシクロアルケンジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R3およびR4は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; または
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000046
式中、
A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000047
式中、
Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000048
式中、
Y4はアルカンジイル(C≦18)であり; ならびに
R10は水素であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩を提供する。
用語「含む(comprise)」(ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」のような、含む(comprise)の任意の形態)、「有する(have)」(ならびに「有する(has)」および「有する(having)」のような、有する(have)の任意の形態)、「含む(contain)」(ならびに「含む(contains)」および「含む(containing)」のような、含む(contain)の任意の形態)、ならびに「含む(include)」(ならびに「含む(includes)」および「含む(including)」のような、含む(include)の任意の形態)は、制限のない連結動詞である。結果として、1つもしくは複数の列挙された段階もしくは要素を「含む(comprises)」、「有する(has)」、「含む(contains)」もしくは「含む(includes)」方法、組成物、キットもしくはシステムは、列挙された段階もしくは要素を保有するが、しかしそれらの段階もしくは要素だけを保有することに限定されない; それは、列挙されていない要素もしくは段階を保有(すなわち、網羅)しうる。同様に、1つもしくは複数の列挙された特徴を「含む(comprises)」、「有する(has)」、「含む(contains)」もしくは「含む(includes)」方法、組成物、キットもしくはシステムの要素は、それらの特徴を保有するが、しかしそれらの特徴だけを保有することに限定されない; それは、列挙されていない特徴を保有しうる。
本方法、組成物、キットおよびシステムのいずれかの任意の態様は、記述された段階および/もしくは特徴を含む(comprise)/含む(include)/含む(contain)/有する(have)のではなく、それらからなり、もしくはそれらから本質的になりうる。したがって、特許請求の範囲のいずれかにおいて、「からなる」もしくは「から本質的になる」という用語は、所与の特許請求の範囲を、普通なら制限のない連結動詞を用いているものから変更するために、上記に列挙した制限のない連結動詞のいずれかに代えて使用されうる。
特許請求の範囲における「もしくは」という用語の使用は、代替物だけをいうことが明示されていない限り、または代替物が相互排他的でない限り「および/もしくは」を意味するように用いられるが、本開示は、代替物だけをいう定義ならびに「および/もしくは」を支持する。
[本発明1001]
下記式のデンドリマー:
コア-(繰り返し単位) n -末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000049
式中、
X 1 はアミノもしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、ヘテロアリール (C≦12) 、もしくはその置換型であり;
R 1 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
aは1、2、3、4、5、もしくは6であり; あるいは
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000050
式中、
X 2 はN(R 5 ) y であり;
R 5 は水素、アルキル (C≦18) 、もしくは置換アルキル (C≦18) であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R 2 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3であり; あるいは
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000051
式中、
X 3 は-NR 6 -であり、式中、R 6 は水素、アルキル (C≦8) 、もしくは置換アルキル (C≦8) 、-O-、もしくはアルキルアミノジイル (C≦8) 、アルコキシジイル (C≦8) 、アレーンジイル (C≦8) 、ヘテロアレーンジイル (C≦8) 、ヘテロシクロアルカンジイル (C≦8) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R 3 およびR 4 は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH 2 CH 2 N) e (R c )R d の基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
R c およびR d は各々独立して水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; または
コアはアルキルアミン (C≦18) 、ジアルキルアミン (C≦36) 、ヘテロシクロアルカン (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000052
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000053
の基であり;
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000054
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000055
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) またはアルカンジイル (C≦18) 上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール (C≦12) 、アルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)N(R 11 )-アルカンジイル (C≦6) -ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)-アルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-ジアルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) であり、式中、
R 11 は水素、アルキル (C≦6) もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。
[本発明1002]
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000056
式中、
X 1 はアミノもしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、ヘテロアリール (C≦12) 、もしくはその置換型であり;
R 1 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
aは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000057
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000058
の基であり;
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000059
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000060
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) またはアルカンジイル (C≦18) 上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール (C≦12) 、アルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)N(R 11 )-アルカンジイル (C≦6) -ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)-アルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-ジアルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) であり、式中、
R 11 は水素、アルキル (C≦6) もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001のデンドリマーまたは薬学的に許容されるその塩。
[本発明1003]
デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位) n -末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000061
式中、
X 2 はN(R 5 ) y であり;
R 5 は水素もしくはアルキル (C≦8) 、もしくは置換アルキル (C≦18) であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R 2 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3であり;
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000062
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000063
の基であり;
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000064
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000065
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) またはアルカンジイル (C≦18) 上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール (C≦12) 、アルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)N(R 11 )-アルカンジイル (C≦6) -ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)-アルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-ジアルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) であり、
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001のデンドリマーまたは薬学的に許容されるその塩。
[本発明1004]
デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位) n -末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000066
式中、
X 3 は-NR 6 -であり、式中、R 6 は水素、アルキル (C≦8) 、もしくは置換アルキル (C≦8) 、-O-、もしくはアルキルアミノジイル (C≦8) 、アルコキシジイル (C≦8) 、アレーンジイル (C≦8) 、ヘテロアレーンジイル (C≦8) 、ヘテロシクロアルカンジイル (C≦8) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R 3 およびR 4 は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH 2 CH 2 N) e (R c )R d の基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
R c およびR d は各々独立して水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000067
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000068
の基であり;
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000069
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000070
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) またはアルカンジイル (C≦18) 上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール (C≦12) 、アルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)N(R 11 )-アルカンジイル (C≦6) -ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)-アルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-ジアルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) であり、式中、
R 11 は水素、アルキル (C≦6) もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001のデンドリマーまたは薬学的に許容されるその塩。
[本発明1005]
デンドリマーは下記式を有する:
コア-(繰り返し単位) n -末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアはアルキルアミン (C≦18) 、ジアルキルアミン (C≦36) 、ヘテロシクロアルカン (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000071
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
Figure 0007041616000072
の基であり;
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000073
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基、末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000074
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) またはアルカンジイル (C≦18) 上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール (C≦12) 、アルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)N(R 11 )-アルカンジイル (C≦6) -ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、-C(O)-アルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-ジアルキルアミノ (C≦12) 、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) であり、式中、
R 11 は水素、アルキル (C≦6) もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001のデンドリマーまたは薬学的に許容されるその塩。
[本発明1006]
末端基は下記式:
Figure 0007041616000075
によってさらに定義され、
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり; および
R 10 は水素である、
本発明1001～1005のいずれかのデンドリマー。
[本発明1007]
末端基は下記式:
Figure 0007041616000076
によってさらに定義され、
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) であり; および
R 10 は水素である、
本発明1001～1006のいずれかのデンドリマー。
[本発明1008]
Y 4 はアルカンジイル (C4～18) である、本発明1001～1007のいずれかのデンドリマー。
[本発明1009]
末端基は下記式:
Figure 0007041616000077
によってさらに定義され、
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 はアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、N-ヘテロシクロアルキル (C≦12) である、
本発明1001～1005のいずれかのデンドリマー。
[本発明1010]
末端基は下記式:
Figure 0007041616000078
によってさらに定義され、
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) または水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH 3 、-OCH 2 CH 3 、-SCH 3 もしくは-OC(O)CH 3 で置換されているアルカンジイル (C≦18) であり;
R 10 はヒドロキシである、
本発明1001～1005のいずれかのデンドリマー。
[本発明1011]
コアは下記式:
Figure 0007041616000079
によってさらに定義され、
式中、
X 1 はアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、ヘテロシクロアルキル (C≦12) 、ヘテロアリール (C≦12) 、もしくはその置換型であり;
R 1 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり; および
aは1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001～1002および1006～1010のいずれかのデンドリマー。
[本発明1012]
X 1 はジアルキルアミノ (C≦12) もしくは置換ジアルキルアミノ (C≦12) である、本発明1011のデンドリマー。
[本発明1013]
X 1 はヘテロシクロアルキル (C≦12) もしくは置換ヘテロシクロアルキル (C≦12) である、本発明1011のデンドリマー。
[本発明1014]
X 1 は4-ピペリジニル、N-ピペリジニル、N-モルホリニル、N-ピロリジニル、2-ピロリジニル、N-ピペラジニルもしくはN-4-メチルピペラジニル(N-4-methylpiperadizinyl)である、本発明1013のデンドリマー。
[本発明1015]
R 1 はアミノである、本発明1011～1014のいずれかのデンドリマー。
[本発明1016]
aは1、2、3、もしくは4である、本発明1011～1015のいずれかのデンドリマー。
[本発明1017]
コアは下記式の化合物:
Figure 0007041616000080
としてさらに定義される、本発明1011～1016のいずれかのデンドリマー。
[本発明1018]
コアは
Figure 0007041616000081
としてさらに定義される、本発明1017のデンドリマー。
[本発明1019]
コアは下記式によってさらに定義される:
Figure 0007041616000082
式中、
X 2 はN(R 5 ) y であり;
R 5 は水素もしくはアルキル (C≦18) 、または置換アルキル (C≦18) であり; ならびに
yおよびzの和が3であるという条件で、yは0、1、もしくは2であり;
R 2 はアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
bは1、2、3、4、5、もしくは6であり; ならびに
zおよびyの和が3であるという条件で、zは1、2、3である、
本発明1001、1003、および1006～1010のいずれかのデンドリマー。
[本発明1020]
X 2 はNである、本発明1019のデンドリマー。
[本発明1021]
X 2 はNR 5 であり、式中、R 5 は水素もしくはアルキル (C≦8) である、本発明1019のデンドリマー。
[本発明1022]
R 5 は水素である、本発明1021のデンドリマー。
[本発明1023]
R 5 はメチルである、本発明1021のデンドリマー。
[本発明1024]
zは3である、本発明1019または1020のデンドリマー。
[本発明1025]
zは2である、本発明1019および1021～1023のいずれかのデンドリマー。
[本発明1026]
R 2 はアミノである、本発明1019～1025のいずれかのデンドリマー。
[本発明1027]
R 2 はアルキルアミノ (C≦12) もしくは置換アルキルアミノ (C≦12) である、本発明1019～1025のいずれかのデンドリマー。
[本発明1028]
R 2 はメチルアミノである、本発明1027のデンドリマー。
[本発明1029]
R 2 はジアルキルアミノ (C≦12) もしくは置換ジアルキルアミノ (C≦12) である、本発明1019～1025のいずれかのデンドリマー。
[本発明1030]
R 2 はジメチルアミノである、本発明1029のデンドリマー。
[本発明1031]
bは1、2、3、もしくは4である、本発明1019～1030のいずれかのデンドリマー。
[本発明1032]
コアは
Figure 0007041616000083
としてさらに定義される、本発明1019～1031のいずれかのデンドリマー。
[本発明1033]
コアは
Figure 0007041616000084
としてさらに定義される、本発明1032のデンドリマー。
[本発明1034]
コアは
Figure 0007041616000085
としてさらに定義され、
式中、
X 3 は-NR 6 -であり、式中、R 6 は水素、アルキル (C≦8) 、もしくは置換アルキル (C≦8) 、-O-、もしくはアルキルアミノジイル (C≦8) 、アルコキシジイル (C≦8) 、アレーンジイル (C≦8) 、ヘテロアレーンジイル (C≦8) 、ヘテロシクロアルカンジイル (C≦8) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R 3 およびR 4 は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式: -(CH 2 CH 2 N) e (R c )R d の基であり;
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
R c およびR d は各々独立して水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6である、
本発明1001、1004、および1006～1010のいずれかのデンドリマー。
[本発明1035]
X 3 はアルキルアミノジイル (C≦8) もしくは置換アルキルアミノジイル (C≦8) である、本発明1034のデンドリマー。
[本発明1036]
X 3 は-NHCH 2 CH 2 NH-もしくは-NHCH 2 CH 2 NHCH 2 CH 2 NH-である、本発明1035のデンドリマー。
[本発明1037]
X 3 はヘテロシクロアルカンジイル (C≦8) もしくは置換ヘテロシクロアルカンジイル (C≦8) である、本発明1034のデンドリマー。
[本発明1038]
X 3 はN,N'-ピペラジンジイルである、本発明1037のデンドリマー。
[本発明1039]
R 3 はアミノである、本発明1034～1038のいずれかのデンドリマー。
[本発明1040]
R 3 はアルキルアミノ (C≦12) もしくは置換アルキルアミノ (C≦12) である、本発明1034～1038のいずれかのデンドリマー。
[本発明1041]
R 3 はメチルアミノである、本発明1040のデンドリマー。
[本発明1042]
R 4 はアミノである、本発明1034～1041のいずれかのデンドリマー。
[本発明1043]
R 4 はアルキルアミノ (C≦12) もしくは置換アルキルアミノ (C≦12) である、本発明1034～1041のいずれかのデンドリマー。
[本発明1044]
R 4 はメチルアミノである、本発明1043のデンドリマー。
[本発明1045]
R 4 は-(CH 2 CH 2 N) e (R c )R d であり:
式中、
eは1、2、もしくは3であり;
R c およびR d は各々独立して水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) である、
本発明1034～1041のいずれかのデンドリマー。
[本発明1046]
コアは
Figure 0007041616000086
としてさらに定義される、本発明1034～1045のいずれかのデンドリマー。
[本発明1047]
コアは
Figure 0007041616000087
としてさらに定義される、本発明1046のデンドリマー。
[本発明1048]
コアはアルキルアミン (C≦18) 、ジアルキルアミン (C≦36) 、ヘテロシクロアルカン (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型である、本発明1001および1005～1010のいずれかのデンドリマー。
[本発明1049]
コアはオクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、N-メチル、N-ドデシルアミン、ジオクチルアミン、ジデシルアミン、もしくは4-N-メチルピペラジニルである、本発明1048のデンドリマー。
[本発明1050]
Y 1 はアルカンジイル (C≦8) もしくは置換アルカンジイル (C≦8) である、本発明1001～1049のいずれかのデンドリマー。
[本発明1051]
Y 1 は-CH 2 CH 2 -である、本発明1050のデンドリマー。
[本発明1052]
Y 3 はアルカンジイル (C≦8) もしくは置換アルカンジイル (C≦8) である、本発明1001～1053のいずれかのデンドリマー。
[本発明1053]
Y 3 は-CH 2 CH 2 -である、本発明1052のデンドリマー。
[本発明1054]
Y 3 は以下である:
Figure 0007041616000088
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; または
Y 3 は以下である:
Figure 0007041616000089
式中、
X 3 およびX 4 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Y 5 は共有結合、アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型である、
本発明1001～1051のいずれかのデンドリマー。
[本発明1055]
A 1 は-O-もしくは-NH-である、本発明1001～1054のいずれかのデンドリマー。
[本発明1056]
A 2 は-O-もしくは-NH-である、本発明1001～1055のいずれかのデンドリマー。
[本発明1057]
R 9 はアルキル (C≦8) である、本発明1001～1056のいずれかのデンドリマー。
[本発明1058]
R 9 はメチルである、本発明1057のデンドリマー。
[本発明1059]
nは1、2、もしくは3である、本発明1001～1058のいずれかのデンドリマー。
[本発明1060]
(A) 本発明1001～1059のいずれかのデンドリマー; および
(B) 核酸
を含む、組成物。
[本発明1061]
核酸はsiRNA、miRNA、pri-miRNA、メッセンジャーRNA (mRNA)、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(cluster regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)関連核酸、単一ガイドRNA (sgRNA)、CRISPR-RNA (crRNA)、トランス活性化crRNA (tracrRNA)、プラスミドDNA (pDNA)、トランスファーRNA (tRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、ガイドRNA、二本鎖DNA (dsDNA)、一本鎖DNA (ssDNA)、一本鎖RNA (ssRNA)、および二本鎖RNA (dsRNA)である、本発明1060の組成物。
[本発明1062]
核酸は、siRNA、tRNA、もしくはCRISPRプロセスにおいて使用されうる核酸である、本発明1061の組成物。
[本発明1063]
デンドリマーおよび核酸は、約100:1～約1:5の重量比で存在する、本発明1060～1062のいずれかの組成物。
[本発明1064]
1つもしくは複数のヘルパー脂質をさらに含む、本発明1060～1063のいずれかの組成物。
[本発明1065]
ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロイド誘導体、PEG脂質、もしくはリン脂質から選択される、本発明1064の組成物。
[本発明1066]
ヘルパー脂質は、ステロイドもしくはステロイド誘導体である、本発明1065の組成物。
[本発明1067]
ステロイドはコレステロールである、本発明1065の組成物。
[本発明1068]
ステロイドもしくはステロイド誘導体およびデンドリマーは、約10:1～約1:20のモル比で存在する、本発明1066の組成物。
[本発明1069]
ヘルパー脂質はPEG脂質である、本発明1065の組成物。
[本発明1070]
PEG脂質はPEG化ジアシルグリセロールである、本発明1069の組成物。
[本発明1071]
PEG脂質は下記式によってさらに定義され:
Figure 0007041616000090
式中、
R 12 およびR 13 は各々独立してアルキル (C≦24) 、アルケニル (C≦24) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R e は水素、アルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり; および
xは1～250である、
本発明1070の組成物。
[本発明1072]
PEG脂質はジミリストイル-sn-グリセロールもしくは下記式の化合物である:
Figure 0007041616000091
式中、
n 1 は5～250であり; ならびに
n 2 およびn 3 は各々独立して2～25である、
本発明1069の組成物。
[本発明1073]
PEG脂質およびデンドリマーは、約1:1～約1:250のモル比で存在する、本発明1069の組成物。
[本発明1074]
ヘルパー脂質はリン脂質である、本発明1065の組成物。
[本発明1075]
リン脂質は1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)もしくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である、本発明1065の組成物。
[本発明1076]
リン脂質およびデンドリマーは、約10:1～約1:20のモル比で存在する、本発明1074の組成物。
[本発明1077]
デンドリマー、核酸、および1つもしくは複数のヘルパー脂質から本質的になる、本発明1060～1076のいずれかの組成物。
[本発明1078]
(A) 本発明1060～1077のいずれかの組成物; および
(B) 薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
[本発明1079]
薬学的に許容される担体は、溶媒もしくは溶液である、本発明1078の薬学的組成物。
[本発明1080]
経口的に、脂肪内に(intraadiposally)、動脈内に、関節内に、頭蓋内に、皮内に、病変内に、筋肉内に、鼻腔内に、眼内に、心膜内に、腹腔内に、胸膜内に、前立腺内に、直腸内に、くも膜下腔内に、気管内に、腫瘍内に、臍帯内に、膣内に、静脈内に、膀胱内に、硝子体内に、リポソーム的に、局所的に、粘膜的に、非経口的に、直腸的に、結膜下に、皮下に、舌下に、局所に、経頬的に(transbuccally)、経皮的に、経膣的に、クリーム中で、脂質組成物中で、カテーテルを介して、洗浄を介して、持続注入を介して、注入を介して、吸入を介して、注射を介して、局所送達を介して、もしくは限局性かん流を介して投与するために製剤化される、本発明1078または1079の薬学的組成物。
[本発明1081]
静脈内もしくは動脈内注射のために製剤化される、本発明1080の薬学的組成物。
[本発明1082]
単位用量として製剤化される、本発明1078～1081のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1083]
核酸を細胞に送達する段階を含む遺伝子の発現を調節する方法であって、細胞への核酸の取り込みを引き起こすのに十分な条件の下で本発明1060～1082のいずれかの組成物もしくは薬学的組成物と細胞を接触させる段階を含む、方法。
[本発明1084]
細胞をインビトロでもしくはエクスビボで接触させる、本発明1083の方法。
[本発明1085]
細胞をインビボで接触させる、本発明1083の方法。
[本発明1086]
遺伝子発現の調節は、疾患もしくは障害を処置するのに十分である、本発明1083～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
疾患もしくは障害はがんである、本発明1086の方法。
[本発明1088]
本発明1060～1082のいずれかの組成物もしくは薬学的組成物の薬学的有効量を、それを必要とする患者に投与する段階を含む、患者における疾患もしくは障害を処置する方法。
[本発明1089]
疾患もしくは障害はがんである、本発明1088の方法。
[本発明1090]
患者に1つもしくは複数のさらなるがん療法を投与する段階をさらに含む、本発明1088または1089の方法。
[本発明1091]
がん療法は、化学療法化合物、外科手術、放射線療法、もしくは免疫療法である、本発明1090の方法。
[本発明1092]
組成物もしくは薬学的組成物は、1回患者に投与される、本発明1088～1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
組成物もしくは薬学的組成物は2回もしくはそれ以上の回数、患者に投与される、本発明1088～1091のいずれかの方法。
[本発明1094]
患者は哺乳動物である、本発明1088～1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
患者はヒトである、本発明1094の方法。
[本発明1096]
下記式のデンドリマー:
コア-(繰り返し単位) n -末端基(I)
式中、1つもしくは複数の水素原子をコアから除去して該原子を繰り返し単位で置換することによって、コアは、繰り返し単位に連結され、かつ
コアは下記式を有し:
Figure 0007041616000092
式中、
X 3 は-NR 6 -であり、式中、R 6 は水素、アルキル (C≦8) 、もしくは置換アルキル (C≦8) 、-O-、もしくはアルキルアミノジイル (C≦8) 、アルコキシジイル (C≦8) 、アレーンジイル (C≦8) 、ヘテロアレーンジイル (C≦8) 、ヘテロシクロアルケンジイル (C≦8) 、またはこれらの基のいずれかの置換型であり;
R 3 およびR 4 は各々独立してアミノ、ヒドロキシ、もしくはメルカプト、もしくはアルキルアミノ (C≦12) 、ジアルキルアミノ (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり; または
繰り返し単位は分解性ジアシルおよびリンカーを含み;
分解性ジアシル基は下記式を有し:
Figure 0007041616000093
式中、
A 1 およびA 2 は各々独立して-O-もしくは-NR a -であり、式中、
R a は水素、アルキル (C≦6) 、もしくは置換アルキル (C≦6) であり;
Y 3 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
R 9 はアルキル (C≦8) もしくは置換アルキル (C≦8) であり;
リンカー基は下記式を有し:
Figure 0007041616000094
式中、
Y 1 はアルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
繰り返し単位がリンカー基を含む場合、リンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み; ならびに
nは、繰り返し単位中に存在するリンカー基の数であり; ならびに
末端基は下記式を有し:
Figure 0007041616000095
式中、
Y 4 はアルカンジイル (C≦18) であり; ならびに
R 10 は水素であり;
鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されており;
nは0、1、2、3、4、5、もしくは6である;
または薬学的に許容されるその塩。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の特定の態様を示すものの、詳細な説明および具体的な実施例は、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内のさまざまな変更および修正が明らかになるものと思われるので、実例としてのみ与えられたものであると理解されるべきである。特定の化合物がある特定の一般的な式に帰されているからといって、それが別の一般的な式にも属しうることを意味するものではないことに留意されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の1つもしくは複数を参照することによってさらによく理解されうる。
図1A～1Dは、脆弱な肝臓がん内での低分子RNA療法には、腫瘍細胞に対する高い効能と正常細胞に対する低い毒性の組み合わせが必要とされることを示す。生体適合性の、エステルに基づくデンドリマーの化学官能性およびサイズを多様化するためのモジュール戦略により、低毒性と高インビボ低分子RNA送達効力とのバランスを保つデンドリマーの発見が可能とされた。直交反応は1,512個のG1モジュール方式の分解性デンドリマーの合成を促進し、それによって分子構造の数、サイズ、および化学的多様性を増加させた。各段階での分解性エステル結合の包含により、低い毒性が促進された。図1A: 低分子RNAはあまりに大きく、アニオン性でありすぎて、そのままで細胞に侵入することができない。RNAi機構を効率的に利用するために、送達担体は、多数の細胞外および細胞内障壁を通じて低分子RNAに付き添わねばならない。デンドリマー構造内の官能基の同一性および配置の微調整を可能にするモジュール方式のデザインが想定された。図1B: ライブラリは、連続的な直交反応を介して樹立された。第一に、一連の初期分枝中心(IBC)を有するアミンは、2つの分解性エステル基を含むAEMAの、より立体障害の少ないアクリレート基と定量的かつ選択的に反応した。生成物は次に、さまざまなチオールとのDMPP触媒反応を起こした。図1C: 複数の細胞外および細胞内送達障壁を克服するように低分子RNAを媒介する最適化された位相構造を有する分解性デンドリマーを同定するために、ライブラリを4つのゾーン: コア結合 - 周辺分安定化(ゾーンI)、コア結合 - 周辺部結合(ゾーンII)、コア安定化 - 周辺部安定化(ゾーンIII)、およびコア安定化 - 周辺部結合(ゾーンIV)に分ける。図1D: デンドリマーは、コアおよび周辺部のために化学的に多様なアミンおよびチオールで独立して調節される。選択されたアミンは2種類に分けられる: 1～6個の分枝種を生成するRNA結合用のイオン性アミンは1A～6Aと標識され、NP安定化用の疎水性アミンは1H～2Hと標識される。これらのアミンは、より高次デンドリマー世代により効力を増加させることが期待される。NP安定化のための疎水性アルキルアミンは、炭化水素の長さに基づいてSC1～SC19と標識される。化学的多様性を高めるために、アルコールおよびカルボン酸末端チオール(SO1～SO9)ならびにアミン官能化チオール(SN1～SN11)がライブラリデザインに含まれる。世代拡張反応を用いて、複数の分枝を有するG2～G4高次世代デンドリマーも合成された(図10Bおよび図11参照)。 50℃で5 mol%のブチル化ヒドロキシルトルエン(BHT)の存在下での2-(アクリロイルオキシ)エチルメタクリレート(AEMA)によるトリス(2-アミノエチル)アミン6A3の高いアザ-マイケル付加選択性を示す。トリス(2-アミノエチル)アミンの添加がないと、AEMA単独では24時間後に未反応であり、その変換は0%である。トリス(2-アミノエチル)アミンを添加した後、AEMA変換は、2時間後に82%前後、24時間後に98%であり、6つの分枝を有する第1世代デンドリマー6A3-G1を生成する。EAMAの1H NMR追跡によって反応を容易にモニターする目的で過剰なEAMA (6×0.05当量)を加えることに留意されたい。EAMA変換が完了しても、まだHaおよびHbの5%のシグナルが残存しているはずである。 50℃で5 mol%のブチル化ヒドロキシルトルエン(BHT)の存在下での2-(アクリロイルオキシ)エチルメタクリレート(AEMA)による長鎖アルキル鎖テトラデシルアミン2H4の高いアザ-マイケル付加選択性を示す。AEMA単独は24時間後に未反応であり、その変換は0%である。テトラデシルアミンを添加した後、AEMA変換は、24時間後に97%前後であり、長鎖アルキル鎖コアを有する第1世代デンドリマー2H4-G1を生成する。EAMAの1H NMR追跡によって反応を容易にモニターする目的で過剰なEAMA (2×0.05当量)を加えることに留意されたい。EAMA変換が完了しても、まだHaおよびHbの5%のシグナルが残存しているはずである。 48時間DMSO-D6 400 μL中60℃での2-(ブチルアミノ)エタンチオール(6×1.2当量)もしくは1-テトラデカンチオール(6×1.2当量)による6A3-G1 (125 mM)のスルファ-マイケル付加を示す。チオール化合物の添加がないと、6A3-G1はDMSO-D6中60℃で48時間同一のままである。触媒としての(5 mol%)ジメチルフェニルホスフィン(DMPP)の添加により、6A3-G1は48時間以内にDMSO-D6中60℃で100%の変換収率で1-テトラデカンチオールと反応するが、DMPPなしでは6A3-G1の変換収率はわずか57%である。2-(ブチルアミノ)エタンチオールでの6A3-G1の変換収率は、おそらく2-(ブチルアミノ)エタンチオールのアミン基が触媒として作用しうるため、DMPPの添加の有無にかかわらずほぼ定量的である。6A3-G1は2つの二重結合でチオール反応物(6×0.1当量)を消費する(6×0.05当量) EAMAを含むので、過剰なチオール(6×0.2当量)が添加されることに留意されたい。 48時間DMSO-D6中60℃での2-(ブチルアミノ)エタンチオール(2×1.2当量)もしくは1-テトラデカンチオール(2×1.2当量)による2H4-G1 (125 mM)のスルファ-マイケル付加を示す。チオール化合物の添加がないと、2H4-G1はDMSO-D6中60℃で48時間同一のままである。触媒としての(5 mol%)ジメチルフェニルホスフィン(DMPP)の添加により、2H4-G1は48時間以内にDMSO-D6中60℃で100%の変換収率で1-テトラデカンチオールと反応するが、DMPPなしでは2H4-G1の変換収率はわずか51%である。2-(ブチルアミノ)エタンチオールでの2H4-G1の変換収率は、おそらく2-(ブチルアミノ)エタンチオールのアミン基が触媒として作用しうるため、DMPPの添加の有無にかかわらず定量的である。2H4-G1は2つの二重結合でチオール反応物(2×0.1当量)を消費する(2×0.05当量) EAMAを含むので、過剰なチオール(2×0.2当量)が添加されることに留意されたい。 図6Aおよび6Bは、1,512個の第1世代分解性デンドリマーのライブラリが高い効率で樹立されたことを示す。図6A: さまざまな初期分枝中心(IBC)を有する異なるアミンCは、24時間50℃で5 mol%のブチル化ヒドロキシルトルエン(BHT)の存在下において正確な1:1の供給当量で2-(アクリロイルオキシ)エチルメタクリレート(AEMA)と反応した。1H NMRによって全42反応の変換収率はほぼ定量的である。図6B: 42個のC-L-G1の各々は、5% DMPPを有するDMSO 66 μL中の36個のチオール(P)の各々と小規模(平均でおよそ20 mg)で反応した。チオール濃度は750 mMであり、1An&1Hn、2An&2Hn、3An、4An、5An、および6Anの濃度は、それぞれ750 mM、275 mM、250 mM、187.5 mM、150 mMおよび125 mMである。いずれのチオール化合物の添加もないと、全42個のC-L-G1は60℃で48時間安定なままであった。SC4、SN8、およびSO9による全42の各反応は、ほぼ定量的な変換(1H NMRによって測定された)を有する。 図7A～7Cは、1,512個のG1DDのインビトロsiRNA送達スクリーニングによって、細胞内障壁を克服しうるデンドリマーの発見が可能とされ、構造-活性の関係が樹立されたことを示す(図7A)。図7B: デンドリマーナノ粒子(33 nM siLuc, n=3)による処理後のHeLa-Luc細胞におけるルシフェラーゼサイレンシングのヒートマップは、ゾーン活性の関係を示す。ルシフェラーゼ活性および細胞生存性を測定して、低毒性と高送達効力とのバランスを保つデンドリマーを同定した(図8中のさらなるデータを参照のこと)。図7C: 50%超のサイレンシングを可能にしたナノ粒子群の分析によって、細胞内送達障壁を克服するために最適化された位相構造を有するデンドリマーが同定された。娘ゾーンは、そのヒット率が一連の基準の下でその親ゾーンのヒット率よりも高い場合、さらに分析された。親ゾーンのヒット率はオレンジ色でマークされ、その娘群のヒット率の高い方もしくは低い方がそれぞれ緑色もしくは青色でマークされている。ライブラリ全体のおよそ6%が50%超の遺伝子サイレンシングを可能にした。コア結合 - 周辺部安定化ゾーンIは10%のヒット率を有した。ゾーンI内で、SC分枝を有するサブゾーンは15%をもたらしたが、SO分枝を有するサブゾーンには1%のヒット率しか有しなかった。SC分枝を有するサブゾーンでは、3～6分枝、SC5-8分枝、もしくはSC9-12分枝を有するデンドリマーは、siRNA送達を効率的に媒介するより高い機会を有した。 siLuc (33 nM siRNA、値はn=3の平均である)を含有する1,512個の第1世代分解性デンドリマー(G1DD) NPの添加後の細胞生存性を示す。G1DDは、12.5:1 (G1DD:siRNA)の重量比でホタルルシフェラーゼ標的化siRNA (siLuc)を含有するナノ粒子ならびに50:38:10:2 (G1DD:コレステロール:DSPC:lipid PEG)のモル比でヘルパー脂質コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および脂質PEG2000を含有するナノ粒子に製剤化された。細胞生存性をONE-Glo + Toxルシフェラーゼレポーターおよび細胞生存性アッセイ法(Promega)で、そのプロトコルにしたがうことによって測定した。未処理細胞に対して規準化することにより細胞生存性を得た。未処理対照(n=6)。実験サンプル(n=3)。 図9Aおよび9Bは、1,512個の第1世代分解性デンドリマー(G1DD)の細胞内siRNA送達活性を示す。G1DDは、12.5:1 (G1DD:siRNA)の重量比でホタルルシフェラーゼ標的化siRNA (siLuc)を含有するナノ粒子ならびに50:38:10:2 (G1DD:コレステロール:DSPC:lipid PEG)のモル比でヘルパー脂質コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および脂質PEG2000を含有するナノ粒子に製剤化された。図9A: 33 nM siRNAによるG1DDナノ粒子の処理後のホタルルシフェラーゼを安定的に発現するHeLa細胞のルシフェラーゼ活性低減のヒートマップを、樹状分析プロセスの内訳を記述するためのゾーンおよび領域に分けている(図9B部分を参照のこと)。細胞生存性およびルシフェラーゼ活性をONE-Glo + Toxルシフェラーゼレポーターおよび細胞生存性アッセイ法(Promega)で、そのプロトコルにしたがうことによって測定した。ルシフェラーゼ活性を未処理細胞のルシフェラーゼ活性および生存性に対して規準化することによりルシフェラーゼ低減を得た。未処理対照(n=6)。実験サンプル(n=3)。図9B: 50%超のルシフェラーゼ活性低減でヒット率を分析することにより、siRNAを媒介して細胞内送達障壁を克服するために最適化された構造を有する分解性デンドリマーを同定するためのデンドリマー由来樹木分析プロセスの利用。娘ゾーンは、そのヒット率が一連の基準の下でその親ゾーンのヒット率よりも高い場合、さらに分析される。親ゾーンのヒット率は黒の棒グラフであり、その娘群のヒット率の高い方もしくは低い方が青色もしくは赤色のフォントである。ライブラリ全体のおよそ6%が50%超の遺伝子サイレンシングを誘導した。コア結合 - 周辺部安定化ゾーン(ゾーンI)は10%のヒット率を有する。ゾーンI中で、SC分枝を有するサブゾーンは15%を有するが、SO分枝を有するサブゾーンは1%を有する。SC分枝を有するサブゾーンでは、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの分枝SC5-8分枝またはSC9-12分枝を有するデンドリマーは、細胞内送達障壁を克服するためにsiRNAを効率的に媒介するより高い機会を有する。 図10A～10Cは、系統的インビボsiRNA送達スクリーニングによって、細胞外障壁を克服することもできるデンドリマーがさらに同定されたことを示す。分析によって、予想される活性を有するさらなるデンドリマーをデザインするためのSARが提供された。図10A: 多様な構造を有する26個の第1世代分解性デンドリマーを、1 mg/kg (n=3)のsiRNA投与量でマウスにおける第VII因子ノックダウンについて評価した。PBS対照(n=3)。データは平均± s.dとして示される。図10B: 複数の分枝を有する分解性デンドリマーの合理的なデザインは、(I) 複数のIBCを有するポリアミンを選択すること、および(II) 世代拡張を介して分枝を増加させることによって達成された。天然ポリアミンであるスペルミジン5A5およびスペルミン6A4を利用した。世代拡張を介して複数の分枝を有する分解性デンドリマーを合成するために、1A2 (1個のIBC)、2A2および2A11 (2個のIBC)、3A3および3A5 (3個のIBC)、ならびに4A1および4A3 (4個のIBC)を選択した(図11も参照のこと)。図10C: 戦略IおよびIIを介して合理的にデザインされた分解性デンドリマー24個を、1 mg/kg (n=3)のsiRNA投与量でマウスにおける第VII因子ノックダウンについて評価した。PBS対照(n=3)。データは平均± s.dとして示される。合理的にデザインされたデンドリマーは、高いヒット率で活性であった。 世代拡張戦略によって複数の分枝を有する分解性デンドリマーを調製するための2A2および2A11 (2つのIBC)、3A3および3A5 (3つのIBC)、ならびに4A1および4A3 (4つのIBC)の合成経路を示す。 図12A～12Eは、高送達効力と低毒性とのバランスを保ちうるデンドリマーをさらに同定する、分解性デンドリマーのいくつかのインビボ毒性評価(95%超のインビボFVIIノックダウン)を示す。分解性デンドリマーNPのいくつかは、対照siRNA (siCTR)の結合後に(図12A)類似のサイズおよび(図12B)正味表面電荷を保有していた(図12Bの凡例に基づいて左から右へグラフ中にナノ粒子が描かれている)。C12-200リピドイドLNPは、同等なインビボ効力を有する非加水分解系の最良の例であるため、挑戦的な比較となった。図12C: 野生型マウス(p26)にいくつかのNPを4 mg siCTR/kg (100 mgデンドリマー/kgもしくは28 mg対照C12-200/kg)でi.v.注射した(n=3)。体重変化は、デンドリマーの同一性にしたがって製剤の間で変化したが、全てのNPが、正常なWTマウスにおいてほとんど無毒であった。図12D: 3 mg siCTR/kg (75 mg/kg 5A2-SC8および6A3-SC12もしくは21 mg/kg C12-200)の注射後の侵襲性MYC駆動腫瘍を担持するトランスジェニックマウス(p32)の体重変化(n=5)。図12E: 3 mg siCTR/kgの投与量(75 mgデンドリマー/kg)で5A2-SC8および6A3-SC12ナノ粒子を32、36、40、および44日目に注射したトランスジェニックマウスのカプラン-マイヤー生存曲線(n=5)。腫瘍担持マウス(脆弱な宿主)では、担体の毒性が悪化され、5A2-SC8のみが良好な耐容性を示すことができ、生存に影響を与えなかった。データは平均± s.dとして示される。統計分析は、(e) Mantel-Cox検定; n.s. P > 0.05; ＊P < 0.05で行った。 図13Aおよび13Bは、侵襲性トランスジェニックMYC駆動肝臓腫瘍モデルを選択して、腫瘍成長の抑制のためにmiRNAを送達するモジュール方式の分解性デンドリマーの毒性および効力を評価した(Nguyen et al., 2014)ことを示す。図13A: LAP-tTa; TRE-MYCトランスジェニックマウスモデルを示す概略図。ドキシサイクリン(Dox)の非存在下もしくは存在下においてLAP-tTA導入遺伝子を呈する場合、肝臓特異的LAPプロモーターによってTRE-MYCがオンもしくはオフされる。図13B: いずれの処置もないと、肝臓腫瘍はp20～26頃に目に見え、その後、肝臓はp32までに小さな腫瘍で満たされ、最終的に腫瘍は大きくなり、肝臓サイズはp42～p60の時点で劇的に増加する。 図14A～14Cは、蛍光画像化によって肝臓内の腫瘍細胞へのsiRNAの送達が確認されることを示す。図14A: 41日齢時の侵襲性肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスの肉眼的解剖学および蛍光画像化。蛍光画像化は、Cy5.5標識siRNAと共に製剤化された5A2-SC8ナノ粒子が、1 mg Cy5.5-siRNA/kgのi.v.注射から24時間後に、がん性肝臓全体では大量のsiRNA蓄積を媒介し、脾臓および腎臓では微量の蓄積であったことを示す。5A2-SC8 NPがインビボでsiRNAを腫瘍細胞に送達できるかどうかをさらに確認するために、i.v.注射から24時間後に肝臓の腫瘍組織を収集し、OTCに包埋し、H＆E染色および共焦点画像化のため切片にした。図14B: H＆E染色によって、肝臓が腫瘍を含むことが確認される。腫瘍組織の同じスライドを共焦点画像化によってスキャンし、3つのチャネル: 核の場合にはDAPI (青色)、ファロイジン染色アクチンの場合にはFITC (緑色)、およびsiRNAの場合にはCy5.5 (赤色)の下で捕捉した。図14C: 同じ領域の共焦点画像化によって、5A2-SC8がsiRNAを肝臓内の腫瘍細胞に効率的に送達できることが示される。 図15Aおよび15Bは、図15Aにおいて、正常な野生型マウスおよび肝臓腫瘍担持マウスにおけるCy5.5標識siRNAと共に製剤化された5A2-SC8 NPの生体内分布を、ならびに図15Bにおいて、腫瘍担持マウスからの肝臓のH＆E染色像を示す。5A2-SC8 NPは、1 mg siRNA/kgのi.v.注射から24時間後に正常マウスおよび肝臓腫瘍担持マウスの両方の肝臓全体におけるCy5.5標識siRNAの蓄積を媒介する。H＆E染色像は、腫瘍担持マウスの肝臓が腫瘍で満たされていること、および共焦点画像化に用いられたスライドが腫瘍細胞を含むことを示す。肝臓のサイズは、腫瘍が成長するにつれて増加することに留意されたい(図15A中の比例均等ボックスを参照のこと)。 図16A～16Hは、モジュール方式の分解性デンドリマーが、臨床的に関連性かつ侵襲性のMYC駆動遺伝子腫瘍モデルに治療用Let-7g miRNA模倣体を送達し、有意な生存利益をもたらしうることを示す。図16A: 5A2-SC8 NPは血液中および(図16B)採取された肝臓組織中で測定された場合に、MYC駆動肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスにおけるFVIIタンパク質のサイレンシングを可能にする(単回注射, 1 mg/kg, p26マウス、注射後48時間) (左にsiCTRおよび右にsiFVII)。図16C: 5A2-SC8 NPは、MYC駆動肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスの肝臓組織へのLet-7gの送達を可能にする(単回注射, 1 mg/kg, p26マウス, 注射後48時間)。Let-7g発現は有意に増加したが、他のLet-7ファミリーメンバーは影響を受けなかった(左にsiCTRおよび右にsiFVII)。図16D: 26日目(これは腫瘍発生の開始後である)に始めて61日目まで、MYC駆動肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスに毎週、1 mg/kg Let-7gのi.v.注射を行った。Let-7gを投与されたマウスは、明らかに小さい腹部を有していた。図16E: 腹囲は対照と比較して処置マウスでいっそう小さかった。図16F: Let-7g模倣体および対照模倣体注射マウスからの肝臓の代表的な画像は、腫瘍負荷の低減を示す。図16G: 5A2-SC8 NPの内部でのmiRNA模倣体の毎週の送達は、正常な体重増加に影響を与えず、その一方でC12-200 LNPの内部でのmiRNA模倣体の送達は体重減少および死を引き起こした。n=5。図16H: 26から61日までの毎週Let-7g送達により、生存が延長された。処置を受けない全ての対照マウス(n=9)および対照の非標的模倣体を含む5A2-SC8 NPを受けたマウス(n=5)は、出生後60日前後で死亡した。C12-200 LNP注射マウスは早期に死亡した(n=7)。C12-200 + Let-7g模倣体注射を受けた全てのマウスが死亡したので、#C12-200 + CTR模倣体実験は中止された(n=7)。5A2-SC8 NPの内部でのLet-7gを送達によって、顕著な生存利益が得られた。データは平均± s.dとして示される。統計分析を(a,b,c,e)両側スチューデントt検定、もしくは(h) Mantel-Cox検定で行った; n.s. P > 0.05; ＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001; ＊＊＊＊P < 0.0001。 図17A～17Cは、HeLa-Luc (図17A)、A549-Luc (図17B)、およびMDA-MB231-Luc (図17C)におけるコレステロール、リン脂質、およびPEG脂質の異なる組み合わせと共に製剤化されたデンドリマーナノ粒子を用いたsiLuc送達を示す。 図18Aおよび18Bは、図18Aにおいて、siLucをHeLa-Lucに送達する際のDSPC脂質 vs. PEG-DMGを有するDOPE脂質による異なる組成の製剤の比較を示す。図18Bにおいて、siLucをHeLa-Lucに送達する際のDSPC脂質 vs. PEG-DHDを有するDOPE脂質による異なる組成の製剤の比較を示す。 デンドリマーもしくはZ120を含有するナノ粒子組成物を用い、ナノ粒子製剤中にリン脂質DSPC有りおよび無しでのsgRNA送達を示す。 図20Aおよび20Bは、sgRNAのカプセル封入率(図20A)およびHeLa-Luc-Cas9細胞における送達(図20B)を示す。 図21Aおよび21Bは、Luc mRNAが24時間のインキュベーション(図21A)および48時間のインキュベーション(図21B)後に送達されているIGROV細胞の生存性を示す。 mCherry mRNAによる処理後の細胞の蛍光顕微鏡検査を示し、それらの細胞へのmRNAの送達を示す。
例示的な態様の説明
いくつかの局面において、本開示は、核酸の担体として使用されうるリポカチオン性デンドリマーを提供する。いくつかの態様において、デンドリマーは、生理学的条件下で分解を起こす1つもしくは複数の基を含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、デンドリマーおよび1つもしくは複数の核酸を含む組成物に製剤化される。これらの組成物はまた、コレステロールおよび/またはリン脂質のような1つもしくは複数のヘルパー脂質をさらに含みうる。最後に、いくつかの局面において、本開示はまた、デンドリマー組成物を用いて核酸治療用物質で処置されうる1つもしくは複数の疾患を処置する方法を提供する。
A. 化学的定義
化学基の文脈において用いられる場合:「水素」は-Hを意味し; 「ヒドロキシ」は-OHを意味し; 「オキソ」は=Oを意味し; 「カルボニル」は-C(=O)-を意味し; 「カルボキシ」は-C(=O)OH (-COOHもしくは-CO2Hとも書かれる)を意味し; 「ハロ」は独立して-F、-Cl、-Brもしくは-Iを意味し; 「アミノ」は-NH2を意味し; 「ヒドロキシアミノ」は-NHOHを意味し; 「ニトロ」は-NO2を意味し; イミノは=NHを意味し; 「シアノ」は-CNを意味し; 「イソシアネート」は-N=C=Oを意味し; 「アジド」は-N3を意味し; 一価の文脈において「リン酸塩」は-OP(O)(OH)2もしくはその脱プロトン化形態を意味し; 二価の文脈において「リン酸塩」は-OP(O)(OH)O-もしくはその脱プロトン化形態を意味し; 「メルカプト」は-SHを意味し; および「チオ」は=Sを意味し; 「スルホニル」は-S(O)2-を意味し; 「ヒドロキシスルホニル」は-S(O)2OHを意味し; 「スルホンアミド」は-S(O)2NH2を意味し; ならびに「スルフィニル」は-S(O)-を意味する。
化学式の文脈において、記号「-」は単結合を意味し、「=」は二重結合を意味し、および「≡」は三重結合を意味する。記号
Figure 0007041616000096
は任意の結合を表し、これは存在する場合、単結合もしくは二重結合のどちらかである。記号
Figure 0007041616000097
は単結合もしくは二重結合を表す。したがって、例えば、式
Figure 0007041616000098
は
Figure 0007041616000099
を含む。そのような環原子は2つ以上の二重結合の一部を形成しないことが理解される。さらに、共有結合記号「-」は、1個もしくは2個のステレオジェン原子を連結する場合、いかなる好ましい立体化学も示さないことに留意されたい。そうではなく、それは全ての立体異性体およびその混合物を網羅する。記号
Figure 0007041616000100
は結合を横切って垂直に描かれた場合
Figure 0007041616000101
基の結合点を示す。読者が結合点を明確に特定するのを補助するために、結合点は、典型的には、より大きな基についてこのようなやり方でのみ特定されることに留意されたい。記号
Figure 0007041616000102
は、くさびの太端に結合した基が「頁の外」にある単結合を意味する。記号
Figure 0007041616000103
は、くさびの太端に結合した基が「頁の中に」ある単結合を意味する。記号
Figure 0007041616000104
は、二重結合の周りの幾何(例えば、EもしくはZのどちらか)が定義されていない単結合を意味する。それゆえ、両方の選択肢、およびそれらの組み合わせが意図される。本出願において示される構造の原子上のいずれの未定義の原子価も、その原子に結合した水素原子を暗示する。炭素原子上の太点は、その炭素に結合している水素が紙面の外へ配向していることを示す。
基「R」が、例えば、式:
Figure 0007041616000105
において、環系上に「浮遊基」として描かれているなら、Rは、安定な構造が形成される限り、描写された、暗示された、または明確に定義された水素を含む、いずれかの環原子に結合した任意の水素原子に取って代わりうる。基「R」が、例えば式:
Figure 0007041616000106
にあるように、縮合環系上に「浮遊基」として描かれているなら、Rは、特別の定めのない限り、縮合環のいずれかの環原子のいずれかに結合した任意の水素に取って代わりうる。置換可能な水素には、安定な構造が形成される限り、描かれた水素(例えば、上記の式中の窒素に結合した水素)、含意された水素(例えば、示されていないが、存在するものと理解される上記の式の水素)、明確に定義された水素、および存在が環原子の同一性に依る任意の水素(例えば、Xが-CH-に等しい場合、基Xに結合した水素)が含まれる。描かれた例において、Rは、縮合環系の5員環もしくは6員環のどちらかに存在しうる。上記の式において、括弧で囲まれた基「R」の直後の下付き文字「y」は数値変数を表す。特別の定めのない限り、この変数は、環もしくは環系の置換可能な水素原子の最大数によってのみ制限される、0、1、2、もしくは2より大きい任意の整数とすることができる。
化学基および化合物クラスの場合、基もしくはクラスにおける炭素原子の数は以下のように示される: 「Cn」は基/クラスにおける炭素原子の正確な数(n)を定義する。「C≦n」は、基/クラスに入ることができる炭素原子の最大数(n)を定義し、最小数は対象となっている基/クラスに対して可能な限り小さいものとなり、例えば、基「アルケニル(C≦8)」もしくはクラス「アルケン(C≦8)」における炭素原子の最小数は2であるものと理解される。1～10個の炭素原子を有するアルコキシ基を示す「アルコキシ(C≦10)」と比較されたい。「Cn-n'」は、基中の炭素原子の最小数(n)と最大数(n')の両方を定義する。したがって、「アルキル(C2～10)」は、2～10個の炭素原子を有するアルキル基を示す。これらの炭素数インジケータは、それが修飾する化学基もしくはクラスの前もしくは後にあってもよく、意味のいずれの変化も示すことなく、括弧で囲まれていてもいなくてもよい。したがって、「C5オレフィン」、「C5-オレフィン」、「オレフィン(C5)」および「オレフィンC5」という用語は、全て同意語である。
「飽和した」という用語は、化合物もしくは化学基を修飾するために用いられる場合、化合物または化学基が、以下に記載の場合を除いて、炭素-炭素二重結合なしおよび炭素-炭素三重結合なしを意味する。この用語が原子を修飾するために用いられる場合、その原子が任意の二重結合もしくは三重結合の一部ではないことを意味する。飽和基の置換型の場合、1つもしくは複数の炭素酸素二重結合もしくは炭素窒素二重結合が存在しうる。そのような結合が存在するなら、ケト-エノール互変異性もしくはイミン/エナミン互変異性の一部として生じうる炭素-炭素二重結合は排除されない。「飽和した」という用語が物質の溶液を修飾するために用いられる場合、その物質がそれ以上その溶液に溶解しえないことを意味する。
「脂肪族」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、そのように修飾された化合物もしくは化学基は、非環式もしくは環式であるが、非芳香族の炭化水素化合物もしくは基であることを示す。脂肪族化合物/基において、炭素原子は、直鎖、分枝鎖、もしくは非芳香族環(脂環式)において一緒に連結されることができる。脂肪族化合物/基は、一重炭素-炭素結合によって連結された飽和(アルカン/アルキル)、あるいは1つもしくは複数の炭素-炭素二重結合(アルケン/アルケニル)または1つもしくは複数の炭素-炭素三重結合(アルキン/アルキニル)による不飽和であることができる。
「芳香族」という用語は、化合物もしくは化学基原子を修飾するために用いられる場合、環を形成する結合の相互作用によって安定化された原子の平面不飽和環を含む化合物もしくは化学基を意味する。
「アルキル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての炭素原子、直鎖もしくは分枝鎖非環式構造を有し、炭素および水素以外の原子を有していない、一価の飽和脂肪族基をいう。基-CH3 (Me)、-CH2CH3 (Et)、-CH2CH2CH3 (n-Prもしくはプロピル)、-CH(CH3)2 (i-Pr、iPrもしくはイソプロピル)、-CH2CH2CH2CH3 (n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3 (sec-ブチル)、-CH2CH(CH3)2 (イソブチル)、-C(CH3)3 (tert-ブチル、t-ブチル、t-BuもしくはtBu)、および-CH2C(CH3)3 (neo-ペンチル)は、アルキル基の非限定的な例である。「アルカンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての1つもしくは2つの飽和炭素原子、直鎖もしくは分枝鎖非環式構造を有し、炭素-炭素二重もしくは三重結合を有しておらず、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、二価の飽和脂肪族基をいう。基-CH2- (メチレン)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、および-CH2CH2CH2-はアルカンジイル基の非限定的な例である。「アルカン」は、Rが、この用語が上記で定義される通りのアルキルである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。以下の基は置換アルキル基の非限定的な例である: -CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2、および-CH2CH2Cl。「ハロアルキル」という用語は、置換アルキルの一部であり、炭素、水素およびハロゲン以外の他の原子が存在しないように、水素原子の置き換えがハロ(すなわち、-F、-Cl、-Br、もしくは-I)に限定されている。基-CH2Clは、ハロアルキルの非限定的な例である。「フルオロアルキル」という用語は、置換アルキルの一部であり、炭素、水素およびフッ素以外の他の原子が存在しないように、水素原子の置き換えがフルオロに限定されている。基-CH2F、-CF3、および-CH2CF3はフルオロアルキル基の非限定的な例である。
「シクロアルキル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての炭素原子を有し、該炭素原子は1つもしくは複数の非芳香環構造の一部を形成し、炭素-炭素二重もしくは三重結合を有しておらず、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、一価の飽和脂肪族基をいう。非限定的な例としては、-CH(CH2)2 (シクロプロピル)、シクロブチル、シクロペンチル、もしくはシクロヘキシル(Cy)が挙げられる。「シクロアルカンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての2つの炭素原子を有し、炭素-炭素二重もしくは三重結合を有しておらず、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、二価の飽和脂肪族基をいう。基
Figure 0007041616000107
は、シクロアルカンジイル基の非限定的な例である。「シクロアルカン」は、Rが、この用語が上記で定義される通りのシクロアルキルである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「アルケニル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての炭素原子、直鎖もしくは分枝鎖非環式構造、少なくとも1つの非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有しておらず、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、一価の不飽和脂肪族基をいう。非限定的な例としては、-CH=CH2 (ビニル)、-CH=CHCH3、-CH=CHCH2CH3、-CH2CH=CH2 (アリル)、-CH2CH=CHCH3、および-CH=CHCH=CH2が挙げられる。「アルケンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての2つの炭素原子、直鎖もしくは分枝鎖、直鎖もしくは分枝鎖非環式構造、少なくとも1つの非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有しておらず、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、二価の不飽和脂肪族基をいう。基-CH=CH-、-CH=C(CH3)CH2-、-CH=CHCH2-、および-CH2CH=CHCH2-はアルケンジイル基の非限定的な例である。アルケンジイル基は脂肪族であるが、両端で連結されると、この基は芳香族構造の一部を形成することから除外されないということが知られている。「アルケン」および「オレフィン」という用語は同意語であり、Rはこの用語が、上記で定義される通りのアルケニルである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。同様に、「末端アルケン」および「α-オレフィン」という用語は同意語であり、1つだけの炭素-炭素二重結合を有し、その結合は分子の末端のビニル基の一部であるアルケンをいう。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。基-CH=CHF、-CH=CHClおよび-CH=CHBrは置換アルケニル基の非限定的な例である。
「アルキニル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての炭素原子、直鎖もしくは分枝鎖非環式構造、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を有し、かつ炭素および水素以外の原子を有していない、一価の不飽和脂肪族基をいう。本明細書において用いられる場合、アルキニルという用語は、1つもしくは複数の非芳香族炭素-炭素二重結合の存在を除外しない。基-C≡CH、-C≡CCH3、および-CH2C≡CCH3はアルキニル基の非限定的な例である。「アルキン」は、Rがアルキニルである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「アリール」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての芳香族炭素原子を有し、該炭素原子は1つもしくは複数の6員芳香環構造の一部を形成し、環原子は全て炭素であり、かつ基は炭素および水素以外の原子からならない、一価の不飽和芳香族基をいう。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、第1の芳香環もしくは存在する任意のさらなる芳香環に結合された、1つもしくは複数のアルキルもしくはアラルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。アリール基の非限定的な例としては、フェニル(Ph)、メチルフェニル、(ジメチル)フェニル、-C6H4CH2CH3 (エチルフェニル)、ナフチル、およびビフェニルから誘導される一価の基が挙げられる。「アレーンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての2つの芳香族炭素原子を有し、該炭素原子は1つもしくは複数の6員芳香環構造の一部を形成し、環原子は全て炭素であり、かつ一価の基は炭素および水素以外の原子からならない、二価の芳香族基をいう。本明細書において用いられる場合、この用語は、第1の芳香環もしくは存在する任意のさらなる芳香環に結合された、1つもしくは複数のアルキル、アリールもしくはアラルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。非縮合環は下記の1つもしくは複数を介して連結されうる: 共有結合、アルカンジイル、もしくはアルケンジイル基(炭素数の制限が許容する)。アレーンジイル基の非限定的な例としては、
Figure 0007041616000108
が挙げられる。
「アレーン」は、Rが、その用語が上記で定義される通りのアリールである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。ベンゼンおよびトルエンはアレーンの非限定的な例である。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「アラルキル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、アルカンジイルおよびアリールという用語がそれぞれ前述の定義に一致した様式で用いられる、一価の基-アルカンジイル-アリールをいう。非限定的な例は、フェニルメチル(ベンジル, Bn)および2-フェニル-エチルである。アラルキルという用語が「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、アルカンジイルおよび/もしくはアリール基からの1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。置換アラルキルの非限定的な例は、(3-クロロフェニル)-メチル、および2-クロロ-2-フェニル-エタ-1-イルである。
「ヘテロアリール」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての芳香族炭素原子もしくは窒素原子を有し、該炭素原子もしくは窒素原子は1つもしくは複数の芳香環構造の一部を形成し、環原子の少なくとも1つは窒素、酸素もしくは硫黄であり、かつヘテロアリール基は炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素および芳香族硫黄以外の原子からならない、一価の芳香族基をいう。ヘテロアリール環は、窒素、酸素、および硫黄から選択される1つ、2つ、3つ、もしくは4つの環原子を含みうる。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、芳香環もしくは芳香環系に結合された1つもしくは複数のアルキル、アリール、および/もしくはアラルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、フラニル、イミダゾリル、インドリル、インダゾリル(Im)、イソキサゾリル、メチルピリジニル、オキサゾリル、フェニルピリジニル、ピリジニル(ピリジル)、ピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリル、キナゾリル、キノキサリニル、トリアジニル、テトラゾリル、チアゾリル、チエニル、およびトリアゾリルが挙げられる。「N-ヘテロアリール」という用語は、結合点としての窒素原子を有するヘテロアリール基をいう。「ヘテロアレーンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、2つの結合点としての2つの芳香族炭素原子、2つの芳香族窒素原子、もしくは1つの芳香族炭素原子および1つの芳香族窒素原子を有し、該原子は1つもしくは複数の芳香環構造の一部を形成し、環原子の少なくとも1つは窒素、酸素もしくは硫黄であり、かつ二価基は炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素および芳香族硫黄以外の原子からならない、二価の芳香族基をいう。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。非縮合環は下記の1つもしくは複数を介して連結されうる: 共有結合、アルカンジイル、もしくはアルケンジイル基(炭素数の制限が許容する)。本明細書において用いられる場合、この用語は、芳香環もしくは芳香環系に結合された1つもしくは複数のアルキル、アリール、および/もしくはアラルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。ヘテロアレーンジイル基の非限定的な例としては、
Figure 0007041616000109
が挙げられる。「ヘテロアレーン」は、Rがヘテロアリールである、式H-Rを有する化合物のクラスをいう。ピリジンおよびキノリンはヘテロアレーンの非限定的な例である。これらの用語が「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、結合点としての炭素原子もしくは窒素原子を有し、該炭素原子もしくは窒素原子は1つもしくは複数の非芳香環構造の一部を形成し、環原子の少なくとも1つは窒素、酸素もしくは硫黄であり、かつヘテロシクロアルキル基は炭素、水素、窒素、酸素および硫黄以外の原子からならない、一価の非芳香族基をいう。ヘテロシクロアルキル環は、窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される1つ、2つ、3つ、もしくは4つの環原子を含みうる。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、環もしくは環系に結合された1つもしくは複数のアルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。同様に、この用語は、得られる基が非芳香族のままであることを条件として、環もしくは環系における1つもしくは複数の二重結合の存在を除外しない。ヘテロシクロアルキル基の非限定的な例としては、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、オキシラニル、およびオキセタニルが挙げられる。「N-ヘテロシクロアルキル」という用語は、結合点としての窒素原子を有するヘテロシクロアルキル基をいう。N-ピロリジニルはそのような基の一例である。「ヘテロシクロアルカンジイル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、2つの結合点としての2つの炭素原子、2つの窒素原子、もしくは1つの炭素原子および1つの窒素原子を有し、該原子は1つもしくは複数の環構造の一部を形成し、環原子の少なくとも1つは窒素、酸素もしくは硫黄であり、かつ二価基は炭素、水素、窒素、酸素および硫黄以外の原子からならない、二価の環基をいう。2つ以上の環が存在する場合、環は縮合されても、縮合されなくてもよい。非縮合環は下記の1つもしくは複数を介して連結されうる: 共有結合、アルカンジイル、もしくはアルケンジイル基(炭素数の制限が許容する)。本明細書において用いられる場合、この用語は、環もしくは環系に結合された1つもしくは複数のアルキル基(炭素数の制限が許容する)の存在を除外しない。同様に、この用語は、得られる基が非芳香族のままであることを条件として、環もしくは環系における1つもしくは複数の二重結合の存在を除外しない。ヘテロシクロアルカンジイル基の非限定的な例としては、
Figure 0007041616000110
が挙げられる。これらの用語が「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「アシル」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rが、それらの用語が上記で定義される通りの、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アラルキルもしくはヘテロアリールである、基-C(O)Rをいう。基-CHO、-C(O)CH3 (アセチル, Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(イミダゾリル)はアシル基の非限定的な例である。「チオアシル」は、基-C(O)Rの酸素原子が硫黄原子で置き換えられていること以外は、同様の様式で定義され、-C(S)Rである。「アルデヒド」という用語は、水素原子の少なくとも1つが-CHO基で置き換えられている、上記で定義の、アルカンに対応する。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子(もしあれば、カルボニルもしくはチオカルボニル基の炭素原子に直接結合された水素原子を含む)は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。基-C(O)CH2CF3、-CO2H (カルボキシル)、-CO2CH3 (メチルカルボキシル)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2 (カルバモイル)、および-CON(CH3)2は置換アシル基の非限定的な例である。
「アルコキシ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rが、その用語が上記で定義される通りのアルキルである、基-ORをいう。非限定的な例としては、-OCH3 (メトキシ)、-OCH2CH3 (エトキシ)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2 (イソプロポキシ)、-OC(CH3)3 (tert-ブトキシ)、-OCH(CH2)2、-O-シクロペンチル、および-O-シクロヘキシルが挙げられる。「シクロアルコキシ」、「アルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ」、「アリールオキシ」、「アラルコキシ」、「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロシクロアルコキシ」、および「アシルオキシ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rがそれぞれシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、およびアシルである、-ORと定義される基をいう。「アルコキシジイル」という用語は、二価基-O-アルカンジイル-、-O-アルカンジイル-O-、もしくは-アルカンジイル-O-アルカンジイル-をいう。「アルキルチオ」および「アシルチオ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rがそれぞれアルキルおよびアシルである、基-SRをいう。「アルコール」という用語は、水素原子の少なくとも1つがヒドロキシ基で置き換えられている、上記で定義の、アルカンに対応する。「エーテル」という用語は、水素原子の少なくとも1つがアルコキシ基で置き換えられている、上記で定義の、アルカンに対応する。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。
「アルキルアミノ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rが、その用語が上記で定義される通りのアルキルである、基-NHRをいう。非限定的な例としては、-NHCH3および-NHCH2CH3が挙げられる。「ジアルキルアミノ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、RおよびR'が同じもしくは異なるアルキル基でありうるか、またはRおよびR'が一緒になって、アルカンジイルを表しうる、基-NRR'をいう。ジアルキルアミノ基の非限定的な例としては、-N(CH3)2および-N(CH3)(CH2CH3)が挙げられる。「シクロアルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」、「アリールアミノ」、「アラルキルアミノ」、「ヘテロアリールアミノ」、「ヘテロシクロアルキルアミノ」、「アルコキシアミノ」、および「アルキルスルホニルアミノ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rがそれぞれシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、およびアルキルスルホニルである、-NHRと定義される基をいう。アリールアミノ基の非限定的な例は-NHC6H5である。「アルキルアミノジイル」という用語は、二価基-NH-アルカンジイル-、-NH-アルカンジイル-NH-、もしくは-アルカンジイル-NH-アルカンジイル-をいう。「アミド」(アシルアミノ)という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rが、その用語が上記で定義される通りのアシルである、基-NHRをいう。アミド基の非限定的な例は-NHC(O)CH3である。「アルキルイミノ」という用語は、「置換された」という修飾語なしで用いられる場合、Rが、その用語が上記で定義される通りのアルキルである、二価基=NRをいう。これらの用語のいずれかが「置換された」という修飾語とともに用いられる場合、炭素原子に結合された1つもしくは複数の水素原子は独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH、もしくは-S(O)2NH2により置き換えられている。基NHC(O)OCH3および-NHC(O)NHCH3は置換アミド基の非限定的な例である。
「1つの(a)」もしくは「1つの(an)」という単語の使用は、特許請求の範囲および/もしくは本明細書において「含む(comprising)」という用語とともに用いられる場合、「1つ(one)」を意味しうるが、「1つもしくは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つもしくは2つ以上」の意味とも一致する。
本出願の全体を通して、「約」という用語は、値がその値をもとめるために用いている装置、方法の誤差の固有の変動、もしくは試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
本出願において用いられる場合、「平均分子量」という用語は、各重合体種のモル数とその種のモル質量との間の関係をいう。特に、各重合体分子は、異なるレベルの重合を有し、したがって、異なるモル質量を有しうる。平均分子量は、複数の重合体分子の分子量を表すために用いることができる。平均分子量は、典型的には、平均モル質量と同義である。特に、3つの主要なタイプの平均分子量がある: 数平均モル質量、重量(質量)平均モル質量、およびZ平均モル質量。本出願の文脈において、特別の定めのない限り、平均分子量は、式の数平均モル質量もしくは重量平均モル質量のどちらかを表す。いくつかの態様において、平均分子量は数平均モル質量である。いくつかの態様において、平均分子量は、脂質中に存在するPEG成分を記述するために使用されうる。
「含む(comprise)」、「有する(have)」および「含む(include)」という用語は、制限のない連結動詞である。「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(includes)」および「含む(including)」のような、これらの動詞の1つもしくは複数の任意の形式もしくは時制も制限がない。例えば、1つもしくは複数の段階を「含む(comprises)」、「有する(has)」もしくは「含む(includes)」任意の方法は、それらの1つもしくは複数の段階だけを有することに限定されることはなく、同様に他の列挙していない段階も網羅する。
「有効」という用語は、その用語が本明細書および/もしくは特許請求の範囲において用いられる場合、所望の、予想の、もしくは所期の結果を達成するのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療的有効量」もしくは「薬学的有効量」は、患者もしくは対象を化合物で処置するという文脈において用いられる場合、疾患を処置するために対象もしくは患者に投与されたときに、疾患に対するそのような処置を行うのに十分な化合物の量を意味する。
本明細書において用いられる場合、「IC50」という用語は、得られる最大の応答の50%である阻害用量をいう。この定量的尺度は、所与の生物学的、生化学的もしくは化学的プロセス(またはプロセスの成分、すなわち酵素、細胞、細胞受容体もしくは微生物)を半分だけ阻害するために、どれだけの特定の薬物もしくは他の物質(阻害剤)が必要とされるかを示す。
第一の化合物の「異性体」は、各分子が第一の化合物と同じ構成原子を含むが、それらの原子の三次元の配置が異なる、別の化合物である。
本明細書において用いられる場合、「患者」もしくは「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、もしくはそのトランスジェニック種のような、生きている哺乳類生物をいう。ある種の態様において、患者もしくは対象は霊長類である。ヒト対象の非限定的な例は、成人、少年、乳児および胎児である。
本明細書において一般に用いられる場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な損益比に相応の、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織、器官、および/または体液と接触して用いるのに適した、化合物、材料、組成物、および/または投与量形態をいう。
「薬学的に許容される塩」は、上記で定義される通り、薬学的に許容され、かつ所望の薬理活性を保有する、本発明の化合物の塩を意味する。そのような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸と; または1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、3-フェニルプロピオン酸、4,4'-メチレンビス(3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸)、4-メチルビシクロ[2.2.2]オクタ-2-エン-1-カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ-およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、o-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、シュウ酸、p-クロロベンゼンスルホン酸、フェニル-置換アルカン酸、プロピオン酸、p-トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸などのような有機酸と形成される酸付加塩が含まれる。薬学的に許容される塩には、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応可能な場合に形成されうる、塩基付加塩も含まれる。許容される無機塩基には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが含まれる。許容される有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどが含まれる。本発明の任意の塩の一部を形成している特定のアニオンもしくはカチオンは、塩が全体として薬理学的に許容される限り、重要ではないことが理解されるべきである。薬学的に許容される塩ならびにそれらの調製法および使用法のさらなる例は、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)に提示されている。
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、化学物質を担持もしくは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物もしくは媒体を意味する。
「予防」または「予防すること」には、(1) 疾患のリスクが高い、および/もしくは素因を有しうるが、疾患の任意の、もしくは全ての病態もしくは総体症状をまだ経験もしくは提示していない、対象もしくは患者における疾患の発症を阻害すること、ならびに/または(2) 疾患のリスクが高い、および/もしくは素因を有しうるが、疾患の任意の、もしくは全ての病態もしくは総体症状をまだ経験もしくは提示していない、対象もしくは患者における疾患の病態もしくは総体症状の発症を遅延させることが含まれる。
「繰り返し単位」は、ある種の材料、例えば、有機材料、無機材料もしくは有機金属のいずれかの、骨格および/もしくは重合体の最も単純な構造実体である。重合体鎖の場合、繰り返し単位は、ネックレスのビーズのように、鎖に沿って連続的に連結される。例えば、ポリエチレン-[-CH2CH2-]n-において、繰り返し単位は-CH2CH2-である。下付き文字「n」は、重合度、すなわち、ともに連結した繰り返し単位の数を示す。「n」の値が未定義のままである場合、または「n」がない場合、それは単に材料の重合体性だけでなく、括弧内の式の繰り返しを指定する。繰り返し単位の概念は、金属有機骨格、変性重合体、熱硬化性重合体などにおけるような、繰り返し単位間の連結が三次元的に伸びるところに等しく適用される。デンドリマーの文脈内で、繰り返し単位はまた、分枝単位、内部層、もしくは世代として記述されうる。同様に、末端基はまた、表面基として記述されうる。
「立体異性体」もしくは「光学異性体」は、同じ原子が同じ他の原子に結合しているが、それらの原子の三次元の配置が異なる、所与の化合物の異性体である。「鏡像異性体」は、左右の手のような、互いに鏡像である、所与の化合物の立体異性体である。「ジアステレオマー」は、鏡像異性体ではない、所与の化合物の立体異性体である。キラル分子は、立体中心もしくはステレオジェン中心ともいわれる、キラル中心を含み、これは任意の2つの基の交換が立体異性体につながるような基を担持する分子における任意の点であるが、必ずしも原子ではない。有機化合物において、キラル中心は典型的には炭素、リンもしくは硫黄原子であるが、有機および無機化合物において他の原子が立体中心であることも可能である。分子は複数の立体中心を有し、多くの立体異性体を生じることもできる。その立体異性が四面体ステレオジェン中心(例えば、四面体炭素)による化合物において、仮説上可能な立体異性体の総数は2nを越えず、nは四面体立体中心の数である。対称性を有する分子は多くの場合、可能な最大数よりも少ない立体異性体を有する。鏡像異性体の50:50混合物はラセミ混合物といわれる。あるいは、鏡像異性体の混合物は、1つの鏡像異性体が50％よりも多い量で存在するように、鏡像異性的に濃縮されうる。典型的には、鏡像異性体および/もしくはジアステレオマーは、当技術分野において公知の技術を用いて分割もしくは分離することができる。立体化学が定義されていないキラリティーの任意の立体中心もしくは軸について、キラリティーのその立体中心もしくは軸はそのR型、S型、もしくはラセミおよび非ラセミ混合物を含む、RおよびS型の混合物として存在しうることが企図される。本明細書において用いられる場合、「他の立体異性体を実質的に含まない」という語句は、組成物が≦15%、より好ましくは≦10%、さらにより好ましくは≦5%、もしくは最も好ましくは≦1%の別の立体異性体を含むことを意味する。
「処置」もしくは「処置すること」には、(1) 疾患の病態もしくは総体症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者における疾患を阻害する(例えば、病態および/もしくは総体症状のさらなる発生を停止する)こと、(2) 疾患の病態もしくは総体症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者における疾患を改善する(例えば、病態および/もしくは総体症状を逆転する)こと、および/または(3) 疾患の病態もしくは総体症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者における疾患の任意の測定可能な低減を行うことが含まれる。
前述の定義は、参照により本明細書に組み入れられる任意の参照文献における任意の相反する定義に取って代わる。しかし、ある種の用語が定義されているという事実は、定義されていない任意の用語が明確ではないことを示すと考えられるべきではない。むしろ、用いられる全ての用語は、当業者であれば本発明の範囲を理解し、本発明を実践しうるような用語で本発明を記述すると考えられる。
B. デンリマーおよび樹状構造
本開示のいくつかの局面において、親油性およびカチオン性成分を含有するデンドリマーが提供される。デンドリマーは、規則的な樹状分枝を示す重合体であり、枝分かれした層をコアにもしくはコアから順次もしくは世代的に添加することにより形成され、コア、少なくとも1つの内部分枝層および表面分枝層によって特徴付けられる。(Petar R. Dvornic and Donald A. Tomalia in Chem. in Britain, 641-645, August 1994を参照のこと)。他の態様において、本明細書において用いられる「デンドリマー」という用語は、限定するものではないが、内部コアを有する分子構造、この開始剤コアに規則的に結合した繰り返し単位の内部層(もしくは「世代」)、および最外の世代に結合した末端基の外部表面を含むことが意図される。「デンドロン」は、コアに直接もしくは連結部分を通じ連結されて、より大きなデンドリマーを形成する、もしくは形成しうる焦点から発する分枝を有するデンドリマーの一種である。いくつかの態様において、デンドリマー構造は、各分枝について各繰り返し単位を兼ねる中心コアからの放射性の繰り返し基を有する。いくつかの態様において、本明細書において記述されるデンドリマーは、小分子、中型の分子、脂質、もしくは脂質様材料として記述されうる。これらの用語は、デンドロン様の外観(例えば、単一の焦点から放射する分子)を有する、本明細書において記述される化合物を記述するために使用されうる。
デンドリマーは重合体であるが、デンドリマーは制御可能な構造、単一の分子量、多数の制御可能な表面官能基を有し、伝統的に特定の世代に到達した後に球状構造をとるため、伝統的な重合体より好ましい。デンドリマーは、単分散、樹状および/もしくは世代構造の重合体構造を生成するために、各繰り返し単位の逐次反応によって調製することができる。個々のデンドリマーは、その中心コア上の1つもしくは複数の機能的部位に結合した樹状のくさびを有する、中心のコア分子からなる。デンドリマー表面層は、調製中に用いられるアセンブリ単量体によって、アニオン性、カチオン性、親水性もしくは親油性基を含む種々の官能基をその上に配置することができる。
コア、繰り返し単位の官能基および/もしくは化学的性質、ならびに表面基もしくは末端基を修飾することにより、それらの物理的性質を調節することができる。変化させることができるいくつかの特性には、溶解性、毒性、免疫原性および生物学的付着能力が含まれるが、これらに限定されることはない。デンドリマーは、それらの世代もしくは枝中の繰り返し単位の数によって記述されることが多い。コア分子のみからなるデンドリマーは世代0といわれ、その一方で全ての分枝に沿った各連続繰り返し単位は末端基もしくは表面基まで、第1世代、第2世代などである。いくつかの態様において、チオールとの第2の縮合反応ではなく、アミンとの第1の縮合反応のみから生じる半世代が可能である。
デンドリマーの調製は、各連続した群によりデンドリマーを構築することを含む一連の段階的反応によって達成される合成制御のレベルを必要とする。デンドリマー合成は、収束型もしくは発散型のものであることができる。多様なデンドリマー合成の間に、分子は、前世代に1世代を付着させ、次に反応の次の段階のために官能基を変化させる段階的プロセスで、コアから周辺に組み立てられる。官能基の変換は、制御されない重合を防止するために必要である。そのような重合は、単分散ではなく、さもなければ超分枝重合体として知られている高度に分枝した分子をもたらす。立体効果のために、デンドリマー繰り返し単位を反応し続けると、立体的な過密状態が特定の世代で完全な反応を妨げ、分子の単分散性を破壊するまで、球状もしくは球形分子が生じる。したがって、いくつかの態様において、G1～G10世代のデンドリマーが特に企図される。いくつかの態様において、デンドリマーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の繰り返し単位、またはその中で導き出せる任意の範囲を含む。いくつかの態様において、本明細書において用いられるデンドリマーは、G0、G1、G2もしくはG3である。しかし、分枝重合体中の間隔単位を低減させることによって、可能な世代数(11、12、13、14、15、20、もしくは25のような)を増加させることができる。
さらに、デンドリマーは、2つの主要な化学的環境: 末端生成時に特定の表面基によって作出される環境と高次構造のためバルク媒体および表面基から遮蔽されうる樹状構造の内部とを有する。これらの異なる化学的環境のために、デンドリマーは、治療用途を含む多数の異なる潜在的用途を見出した。
いくつかの局面において、本開示のデンドリマーは、アクリレートおよびメタクリレート基とアミンおよびチオールとの示差反応性を用いて組み立てられる。本明細書において使用されうるデンドリマーには、アクリレート基と第1級もしくは第2級アミンとのおよびメタクリレートとメルカプト基との反応によって形成される第2級もしくは第3級アミンおよびチオエーテルが含まれる。さらに、本明細書において記述されるデンドリマーの繰り返し単位は、生理学的条件下で分解可能な基を含みうる。いくつかの態様において、これらの繰り返し単位は、1つもしくは複数の初期(germinal)ジエーテル、エステル、アミドもしくはジスルフィド基を含みうる。いくつかの態様において、コア分子は、一方向のみの樹状重合を可能にするモノアミンである。他の態様において、コア分子は、それぞれが1つもしくは複数の繰り返し単位を含みうる複数の異なる樹状分枝を有するポリアミンである。デンドリマーは、このコアから1つもしくは複数の水素原子を除去することによって形成されうる。いくつかの態様において、これらの水素原子は、窒素原子のようなヘテロ原子上にある。いくつかの態様において、末端基は、長鎖アルキル基もしくはアルケニル基のような親油性基である。他の態様において、末端基は、長鎖ハロアルキル基もしくはハロアルケニル基である。他の態様において、末端基は、アミン(-NH2)もしくはカルボン酸(-CO2H)のようなイオン化可能基を含む脂肪族基もしくは芳香族基である。さらに他の態様において、末端基は、水酸基、アミド基、もしくはエステルのような1つもしくは複数の水素結合供与体を含む脂肪族基もしくは芳香族基である。
本開示によって提供されるデンドリマーは、例えば、上記で本発明の節の概要および以下の特許請求の範囲に示される。それらは、実施例の節において概説された方法を用いて作出されうる。これらの方法は、当業者によって適用される有機化学の原理および技法を用いてさらに修飾および最適化することができる。そのような原理および技法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるMarch’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)に教示されている。
本開示のデンドリマーは、1つもしくは複数の非対称に置換された炭素原子もしくは窒素原子を含み、光学的に活性な形態もしくはラセミ形態で単離されうる。したがって、特定の立体化学もしくは異性体形態が具体的に示されない限り、化学式の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ形態、エピマー形態および全ての幾何異性形態が意図される。デンドリマーは、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一鏡像異性体、ジアステレオマー混合物ならびに個々のジアステレオマーとして生じうる。いくつかの態様において、単一のジアステレオマーが得られる。本開示のデンドリマーのキラル中心は、S配置またはR配置を有することができる。さらに、デンドリマーの1つもしくは複数が構造異性体として存在しうることが企図される。いくつかの態様において、化合物は同じ式を有するが、しかしコアの窒素原子との異なる結合性を有する。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、出発単量体が最初に第1級アミンと反応し、次いで統計的に、存在するいずれかの第2級アミンと反応するので、そのようなデンドリマーが存在するものと考えられる。したがって、構造異性体は、完全に反応した第1級アミン、次いで、反応した第2級アミンの混合物を提示しうる。
本開示のデンドリマーを表すために用いられる化学式は、典型的には、おそらくいくつかの異なる互変異性体のうちの1つのみを示すであろう。例えば、多くのタイプのケトン基が、対応するエノール基と平衡状態で存在することが知られている。同様に、多くのタイプのイミン基が、エナミン基と平衡して存在する。与えられた式についてどの互変異性体が描かれていても、どの1つが最も一般的であっても、所与の化学式の全ての互変異性体が意図される。
本開示のデンドリマーはまた、本明細書において記載される適応症でもしくはそれ以外で用いるかどうかにかかわらず、それらが先行技術において公知の化合物よりも効果的であり、低い毒性であり、長く作用し、強力であり、少ない副作用をもたらし、容易に吸収され、および/もしくは良好な薬物動態プロファイル(例えば、高い経口バイオアベイラビリティおよび/もしくは低いクリアランス)を有し、ならびに/または先行技術において公知の化合物に比べて他の有用な薬理学的、物理的、もしくは化学的性質を有しうるという利点がありうる。
さらに、本開示のデンドリマーを構成する原子は、そのような原子の全ての同位体形態を含むことが意図される。同位体は、本明細書において用いられる場合、同じ原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例として、限定するものではないが、水素の同位体には三重水素および重水素が含まれ、炭素の同位体には13Cおよび14Cが含まれる。
本明細書において提供されるデンドリマーの任意の塩形態の一部を形成している特定のアニオンもしくはカチオンは、塩が全体として薬理学的に許容される限り、重要ではないことが認識されるべきである。薬学的に許容される塩ならびにそれらの調製法および使用法のさらなる例は、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002)に提示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
C. ヘルパー脂質
本開示のいくつかの局面において、1つもしくは複数のヘルパー脂質を本開示の重合体と混合して組成物を作出する。いくつかの態様において、重合体は、1、2、3、4、もしくは5種類の異なるヘルパー脂質と混合される。重合体は、単一のタイプの複数の異なる脂質と混合できることが企図される。いくつかの態様において、脂質は、ステロイドもしくはステロイド誘導体でありうる。他の態様において、脂質はPEG脂質である。他の態様において、脂質はリン脂質である。他の態様において、デンドリマー組成物は、ステロイドもしくはステロイド誘導体、PEG脂質、およびリン脂質を含む。
1. ステロイドおよびステロイド誘導体
本開示のいくつかの局面において、重合体を1つもしくは複数のステロイドもしくはステロイド誘導体と混合してデンドリマー組成物を作出する。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体は、任意のステロイドもしくはステロイド誘導体を含む。本明細書において用いられる場合、いくつかの態様において、「ステロイド」という用語は、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、オキソ基、アシル基、または2つもしくはそれ以上の炭素原子間の二重結合を含む1つもしくは複数の置換をさらに含みうる四環17炭素環構造を有する化合物のクラスである。1つの局面において、ステロイドの環構造は、下記の式に示されるように、3つの縮合シクロヘキシル環および縮合シクロペンチル環を含む:
Figure 0007041616000111
いくつかの態様において、ステロイド誘導体は、1つもしくは複数の非アルキル置換を有する上記の環構造を含む。いくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体は、式が、
Figure 0007041616000112
のようにさらに定義される、ステロールである。本開示のいくつかの態様において、ステロイドもしくはステロイド誘導体は、コレスタンもしくはコレスタン誘導体である。コレスタンにおいて、環構造は、式:
Figure 0007041616000113
によってさらに定義される。上記のように、コレスタン誘導体は、上記環系の1つもしくは複数の非アルキル置換を含む。いくつかの態様において、コレスタンもしくはコレスタン誘導体は、コレステンもしくはコレステン誘導体またはステロールもしくはステロール誘導体である。他の態様において、コレスタンもしくはコレスタン誘導体は、コレステン(cholestere)およびステロールもしくはその誘導体の両方である。
いくつかの態様において、組成物は、約1:10～約1:20のステロイドのデンドリマーに対するモル比をさらに含みうる。いくつかの態様において、モル比は、約1:20、1:18、1:16、1:14、1:12、1:10、1:8、1:6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1～約10:1もしくはその中で導き出せる任意の範囲である。いくつかの態様において、モル比は約38:50もしくは約1:5である。
2. PEGもしくはPEG化脂質
本開示のいくつかの局面において、重合体は、デンドリマー組成物を作出するために1つもしくは複数のPEG化脂質(もしくはPEG脂質)と混合される。いくつかの態様において、本開示は、PEG基が結合した任意の脂質を用いることを含む。いくつかの態様において、PEG脂質は、グリセロール基に結合したPEG鎖をも含むジグリセリドである。他の態様において、PEG脂質は、PEG鎖でリンカー基に結合した1つもしくは複数のC6～C24長鎖アルキルもしくはアルケニル基またはC6～C24脂肪酸基を含む化合物である。PEG脂質のいくつかの非限定的な例としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、PEGセラミドコンジュゲート化PEG修飾ジアルキルアミンおよびPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミン、PEG修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが挙げられる。いくつかの態様においては、PEG修飾ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンもしくはPEG修飾ジミリストイル-sn-グリセロール。いくつかの態様において、PEG修飾は、脂質のPEG成分の分子量によって測定される。いくつかの態様において、PEG修飾は、約100～約15,000の分子量を有する。いくつかの態様において、分子量は、約200～約500、約400～約5,000、約500～約3,000、もしくは約1,200～約3,000である。PEG修飾の分子量は、約100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500～約15,000である。本発明において使用されうる脂質のいくつかの非限定的な例は、米国特許第5,820,873号、WO 2010/141069、もしくは米国特許第8,450,298号によって教示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
別の局面において、PEG脂質は下記式を有する:
Figure 0007041616000114
式中、 R12およびR13は各々独立してアルキル(C≦24)、アルケニル(C≦24)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Reは水素、アルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり; およびxは1～250である。いくつかの態様において、Reはメチルのようなアルキル(C≦8)である。R12およびR13は各々独立してアルキル(C≦4～20)である。いくつかの態様において、xは5～250である。1つの態様において、xは5～125であり、またはxは100～250である。いくつかの態様において、PEG脂質は1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコールである。
別の局面において、PEG脂質は下記式を有する:
Figure 0007041616000115
式中、 n1は1～100の整数であり、n2およびn3は各々独立して1～29の整数から選択される。いくつかの態様において、n1は5、10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100、またはその中で導き出せる任意の範囲である。いくつかの態様において、n1は約30～約50である。いくつかの態様において、n2は5～23である。いくつかの態様において、n2は11～約17である。いくつかの態様において、n3は5～23である。いくつかの態様において、n3は11～約17である。
いくつかの態様において、組成物は、約1:1～約1:250のPEG脂質のデンドリマーに対するモル比をさらに含みうる。いくつかの態様において、モル比は、約1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:125、1:150、1:175、1:200、1:225～約1:250もしくはその中で導き出せる任意の範囲である。いくつかの態様において、モル比は約1:25もしくは約3:100である。
3. リン脂質
本開示のいくつかの局面において、重合体は、デンドリマー組成物を作出するために1つもしくは複数のリン脂質と混合される。いくつかの態様においては、リン酸基をも含む任意の脂質。いくつかの態様において、リン脂質は、1つもしくは2つの長鎖C6～C24アルキルもしくはアルケニル基、グリセロールもしくはスフィンゴシン、1つもしくは2つのリン酸基、および任意で、有機小分子を含む構造である。いくつかの態様において、有機小分子は、アミノ酸、糖、またはコリンもしくはエタノールアミンのような、アミノ置換アルコキシ基である。いくつかの態様において、リン脂質はホスファチジルコリンである。いくつかの態様において、リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリンもしくはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。
いくつかの態様において、組成物は、約1:10～約1:20のリン脂質のデンドリマーに対するモル比をさらに含みうる。いくつかの態様において、モル比は、約1:20、1:18、1:16、1:14、1:12、1:10、1:8、1:6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1～約10:1もしくはその中で導き出せる任意の範囲である。いくつかの態様において、モル比は約38:50もしくは約1:5である。
D. 核酸および核酸に基づく治療剤
1. 核酸
本開示のいくつかの局面において、デンドリマー組成物は、1つもしくは複数の核酸を含む。いくつかの態様において、デンドリマー組成物は、約5:1～約1:100のデンドリマーに対する重量比で存在する1つもしくは複数の核酸を含む。いくつかの態様において、核酸のデンドリマーに対する重量比は、約5:1、2.5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、もしくは1:100、またはその中で導き出せる任意の範囲である。いくつかの態様において、重量比は約1:25もしくは約1:7である。さらに、本開示は、本明細書において開示される特定の核酸に限定されないことが明らかなはずである。しかしながら、当業者は、ヒト以外の種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、テナガザル、チンパンジー、類人猿、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよび他の種)由来の核酸を含む核酸のさまざまな他の供給源における関連した同族体を容易に同定することができるので、本発明は、核酸の任意の特定の供給源、配列、もしくはタイプに範囲が限定されない。本開示において用いられる核酸は、天然に存在する配列に基づく配列を含みうることが企図される。遺伝暗号の縮重を考慮すれば、天然配列のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチドの少なくとも約50%、一般的には少なくとも約60%、より一般的には約70%、最も一般的には約80%、好ましくは少なくとも約90%および最も好ましくは約95%を有する配列。別の態様において、核酸は、天然配列に対する相補配列であり、または75%、80%、85%、90%、95%および100%に相補的である。
いくつかの局面において、核酸は、インビボにおいて存在する別の配列をサイレンシングするか、該別の配列に相補的であるか、または取って代わる配列である。長さが17塩基の配列は、ヒトゲノムにおいて一度だけ出現するはずであり、それゆえ、独自の標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーは作出することがそれだけ容易であり、インビボでの接近性を増加させるが、ハイブリダイゼーションの特異性の決定には多数の他の要因が関与する。オリゴヌクレオチドのその相補標的に対する結合親和性および配列特異性の両方が、長さの増加とともに増加する。8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100もしくはそれ以上の塩基対の例示的なオリゴヌクレオチドが用いられるが、他のものも企図されると考えられる。250、500、1000、1212、1500、2000、2500、3000もしくはそれ以上をコードするより長いポリヌクレオチドが同様に企図される。
本明細書において用いられる核酸は、ゲノムDNAに由来してもよく、すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローン化されてもよい。しかし、好ましい態様において、核酸は相補的DNA (cDNA)を含むであろう。天然のイントロンもしくは別の遺伝子に由来するイントロンを加えたcDNAも企図される; そのように操作された分子は「ミニ遺伝子」といわれることもある。最低でも、本発明のこれらのおよび他の核酸は、例えば、ゲル電気泳動における分子量標準として使用されうる。
「cDNA」という用語は、鋳型としてメッセンジャーRNA (mRNA)を用いて調製されたDNAをいうように意図される。ゲノムDNAまたはゲノム、非プロセッシングもしくは部分的にプロセッシングされたRNA鋳型から重合されたDNAとは対照的に、cDNAを用いることの利点は、cDNAが主として、対応するタンパク質のコード配列を含むということである。最適な発現のために非コード領域が必要とされる場合、またはイントロンのような非コード領域がアンチセンス戦略において標的とされる場合のような、完全もしくは部分ゲノム配列が好ましい場合がありうる。
いくつかの態様において、核酸は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を阻害する1つもしくは複数のアンチセンスセグメントを含む。アンチセンス方法論は、核酸が「相補的」配列と対になる傾向があるという事実を利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン-クリック相補性規則にしたがって塩基対形成できるものであることを意味する。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対を形成して、シトシンと対になったグアニン(G:C)、DNAの場合にはチミンと対になったアデニン(A:T)、もしくはRNAの場合にはウラシルと対になったアデニン(A:U)の組み合わせを形成するであろう。イノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンおよび他のものなどの、あまり一般的でない塩基をハイブリダイズする配列に含めることで、対形成は妨害されない。
ポリヌクレオチドで二本鎖(ds) DNAを標的化すると三重らせん形成が起こる; RNAを標的化すると二重らせん形成が起こるであろう。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入されると、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳および/もしくは安定性を妨げる。アンチセンスRNA構築体、もしくはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、宿主細胞内で、インビトロもしくはインビボのどちらかで、例えばヒト対象を含む宿主動物内で遺伝子転写もしくは翻訳またはその両方を阻害するために利用されうる。
アンチセンス構築体は、プロモーターおよび他の制御領域、エクソン、イントロンもしくは遺伝子のエクソン-イントロン境界にさえも結合するようにデザインされうる。最も有効なアンチセンス構築体は、イントロン/エクソンスプライスジャンクションに相補的な領域を含むと考えられる。したがって、好ましい態様は、イントロン-エクソンスプライスジャンクションの50～200塩基内の領域に対して相補性を有するアンチセンス構築体を含むことが提案される。いくつかのエクソン配列を、その標的選択性に重大な影響を及ぼすことなく構築体に含めることができることが観察されている。含まれるエクソン材料の量は、用いられる特定のエクソンおよびイントロン配列に依って変化するであろう。単に、インビトロで構築体を試験して、正常細胞機能が影響を受けるかどうか、または相補配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けるかどうかを決定することによって、あまりにも多くのエクソンDNAが含まれているかどうかを容易に試験することができる。
上記のように、「相補的」もしくは「アンチセンス」は、それらの全長にわたって実質的に相補的であり、かつ塩基ミスマッチがほとんどないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さが15塩基の配列は、位置番号13もしくは14で相補的なヌクレオチドを有する場合、相補的と称されうる。当然のことながら、完全に相補的な配列は、その全長にわたって完全に相補的であり、かつ塩基のミスマッチを有しない配列であろう。相同性の程度がより低い他の配列も企図される。例えば、相同性の高い領域は限られているが、非相同領域も含むアンチセンス構築体(例えば、リボザイム; 以下参照)をデザインすることができる。これらの分子は、50%未満の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合するであろう。
ゲノムDNAの一部をcDNAもしくは合成配列と組み合わせてsiRNAを形成するか、もしくは特異的構築体を作出することが有利でありうる。例えば、イントロンが最終的な構築体において所望される場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。cDNA、siRNA、もしくは合成されたポリヌクレオチドは、より好都合な制限部位を構築体の残りの部分に提供することができ、それゆえ、配列の残部に用いられる。他の態様は、ゲノム配列もしくはコーディング/非コーディング転写産物を標的化するために使用されうるdsRNAもしくはssRNAを含む。
他の態様において、デンドリマー組成物は、遺伝子治療において用いられる1つもしくは複数の発現ベクターを含む核酸を含みうる。発現には、ベクターにおいて適切なシグナルが提供されることが必要とされ、これには宿主細胞における関心対象の遺伝子の発現を推進するウイルス源および哺乳動物源の両方由来のエンハンサー/プロモーターのような、さまざまな調節要素が含まれる。宿主細胞におけるメッセンジャーRNA安定性および翻訳可能性を最適化するようにデザインされた要素も定義される。薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に結びつける要素のように、産物を発現する永続的で安定な細胞クローンを樹立するためのいくつかの主要な薬物選択マーカーの使用条件も提供される。
本出願を通して、「発現構築体」という用語は、核酸コード配列の一部もしくは全部が転写されうる遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築体を含むことが意図される。転写産物はタンパク質に翻訳されてもよいが、そうである必要はない。ある種の態様において、発現は、遺伝子の転写および遺伝子産物へのmRNAの翻訳の両方を含む。他の態様において、発現は、関心対象の遺伝子をコードする核酸の転写を含むだけである。
「ベクター」という用語は、核酸配列が複製されうる細胞への導入のため核酸配列が挿入されうる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「外因性」であることができ、これにより、それがベクターを導入する細胞に対して外来であること、またはその配列が細胞における配列と相同であるが、配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあることが意味される。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、参照によりともに本明細書に組み入れられる、Sambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1994)に記述されている標準的な組み換え技法によりベクターを構築するために知識を身に付けているであろう。
「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。ある場合には、RNA分子はその後、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子もしくはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列をいう種々の「制御配列」を含むことができる。転写および翻訳を統べる制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能を果たす核酸配列を含むことができ、以下に記述される。
2. siRNA
上記のように、本発明は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現および/もしくは活性化を低減するための1つもしくは複数の阻害性核酸の使用を企図する。阻害性核酸の例としては、siRNA (低分子干渉RNA)、短鎖ヘアピンRNA (shRNA)、二本鎖RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムのような、核酸配列を標的にした分子およびアプタマーのような遺伝子もしくは遺伝子産物を標的にした分子が挙げられるが、これらに限定されることはない。
阻害性核酸は、遺伝子の転写を阻害するか、または細胞内の遺伝子転写産物の翻訳を妨げうる。阻害性核酸は、16～1000ヌクレオチド長、およびある種の態様において18～100ヌクレオチド長でありうる。
阻害性核酸は当技術分野において周知である。例えば、siRNA、shRNAおよび二本鎖RNAは、米国特許第6,506,559号および同第6,573,099号に、ならびに米国特許出願公開第2003/0051263号、同第2003/0055020号、同第2004/0265839号、同第2002/0168707号、同第2003/0159161号、および同第2004/0064842号に記述されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
1998年にFireおよび同僚らによるRNAiの発見以来、生化学的機構は急速に特徴付けられている。二本鎖RNA (dsRNA)は、RNAase IIIファミリーのリボヌクレアーゼであるDicerによって切断される。このプロセスにより、約21ヌクレオチド長のsiRNAが得られる。これらのsiRNAは、標的mRNAに導かれる多タンパク質RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み入れられる。RISCは、相補領域の中央で標的mRNAを切断する。哺乳動物細胞では、短いRNA断片(およそ22ヌクレオチド)である関連マイクロRNA (miRNA)が見出される。miRNAは、不完全なヘアピンRNA構造を有するより長い(およそ70ヌクレオチド)前駆体のDicer媒介切断後に生成される。miRNAは、標的mRNAの翻訳抑制をもたらすmiRNA-タンパク質複合体(miRNP)に組み入れられる。
RNAi効果を生じさせることができる核酸をデザインする際には、siRNAの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達系の選択のような、考慮する必要のあるいくつかの要因がある。RNAi効果をもたらすために、生物に導入されるsiRNAは、典型的には、エクソン配列を含むであろう。さらに、RNAiプロセスは相同性に依存するので、相同であるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性を最小にしながら、遺伝子特異性を最大とするように配列を注意深く選択しなければならない。特に、siRNAは、siRNAの配列とEphAヌクレオチド配列の一部との間で、80、85、90、95、98%あるいは100%超の同一性を示す。標的遺伝子と約80%未満の同一性の配列は実質的に有効性が低い。したがって、siRNAと阻害される遺伝子との間の同一性が高いほど、無関係の遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低くなるであろう。
さらに、siRNAのサイズは重要な考慮事項である。いくつかの態様において、本開示は、少なくとも約19～25ヌクレオチドを含み、遺伝子発現を調節することができるsiRNA分子に関する。本開示の文脈において、siRNAは特に、500、200、100、50、25、もしくは20ヌクレオチド長未満である。いくつかの態様において、siRNAは、約25ヌクレオチド～約35ヌクレオチド長もしくは約19ヌクレオチド～約25ヌクレオチド長である。
siRNA媒介遺伝子サイレンシングの有効性を改善するために、mRNA上の標的部位の選択のためのガイドラインが、siRNAの最適デザインのために開発されている(Soutschek et al., 2004; Wadhwa et al., 2004)。これらの戦略は、最大の遺伝子ノックダウンを達成するためにsiRNA配列を選択するための合理的なアプローチを可能にしうる。細胞および組織へのsiRNAの侵入を容易にするため、アデノウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスのようなプラスミドおよびウイルスベクターを含む種々のベクターが用いられている(Wadhwa et al., 2004)。
阻害性核酸内で、核酸の成分は、全体にわたって同じタイプもしくは同種のものである必要はない(例えば、阻害性核酸は、ヌクレオチドおよび核酸もしくはヌクレオチド類似体を含みうる)。典型的には、阻害性核酸は二本鎖構造を形成する; 二本鎖構造は、部分的にもしくは完全に相補的な2つの別個の核酸から生じうる。本発明のある種の態様において、阻害性核酸は、単一の核酸(ポリヌクレオチド)もしくは核酸類似体のみを含み、それ自体で相補的になる(例えば、ヘアピンループを形成する)ことにより二本鎖構造を形成しうる。阻害性核酸の二本鎖構造は、その導出可能な全ての範囲を含めて、16～500もしくはそれ以上の連続した核酸塩基を含みうる。阻害性核酸は、相補的核酸(これは同じ核酸の別の部分もしくは別個の相補的核酸でありうる)とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する17～35個の連続核酸塩基、より詳細には18～30個の連続核酸塩基、より詳細には19～25核酸塩基、より詳細には20～23個の連続核酸塩基、もしくは20～22個の連続核酸塩基、もしくは21個の連続核酸塩を含みうる。
siRNAは、商業的供給源、天然供給源から得ることができ、または当業者に周知のいくつかの技法のいずれかを用いて合成することができる。例えば、予めデザインされたsiRNAの商業的供給源にはInvitrogenのStealth(商標) Select技術(Carlsbad, CA)、Ambion(登録商標) (Austin, TX)、およびQiagen(登録商標) (Valencia, CA)が含まれる。本発明の組成物および方法に適用できる阻害性核酸は、遺伝子もしくは遺伝子産物の検証された下方調節因子であることが任意の供給源によって見出された任意の核酸配列でありうる。
いくつかの態様において、本発明は、遺伝子をコードする核酸の少なくとも10個、しかし30個以下の連続するヌクレオチドに実質的に相補的であり、かつ遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を低減させる少なくとも1つの鎖を有する、少なくとも19個のヌクレオチドの単離されたsiRNA分子を特徴とする。本開示の1つの態様において、siRNA分子は、遺伝子もしくは遺伝子産物をコードするmRNAの少なくとも10個、しかし30個以下の連続するヌクレオチドに実質的に相補的な少なくとも1つの鎖を有する。
1つの態様において、siRNA分子は、標的治療用タンパク質をコードする核酸配列のいずれかの少なくとも10個の連続するヌクレオチドと、少なくとも75、80、85、もしくは90%相同であり、特に少なくとも95%、99%、もしくは100%類似もしくは同一であり、または前記の間の任意の割合そうである(例えば、本発明は75%およびそれ以上、80%およびそれ以上、85%およびそれ以上などを企図し、前記範囲はそれらの間の全ての整数を含むように意図される)。
siRNAはまた、1つもしくは複数のヌクレオチドの改変を含みうる。そのような改変は、19～25ヌクレオチドRNAの末端もしくは内部(RNAの1つもしくは複数のヌクレオチドの位置)へのような、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。ある種の局面において、RNA分子は3'-ヒドロキシル基を含む。本発明のRNA分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドを含むこともできる。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当技術分野において公知の他の修飾骨格を含み、または非天然ヌクレオシド間結合を含みうる。siRNAのさらなる修飾(例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つもしくは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および逆位デオキシ塩基性残基の組み入れ)は、米国特許出願公開第2004/0019001号および米国特許第6,673,611号(この各々は、参照によりその全体が組み入れられる)において見出すことができる。集合的に、そのような改変された全ての上記核酸もしくはRNAは、修飾siRNAといわれる。
1つの態様において、siRNAは、特定の遺伝子産物の発現を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、もしくは少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、もしくは少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくはそれ以上、または前記の間の任意の範囲だけ減少させることができる。
3. CRISPR/CAS
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)は、塩基配列の短い繰り返しを含むDNA座である。各繰り返しの後に、ウイルスへの以前の曝露からの「スペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムの約40%および配列決定された古細菌の90%に見出される。CRISPRは、CRISPRに関連するタンパク質をコードするcas遺伝子と関係していることが多い。CRISPR/Casシステムは、原核生物の免疫系であり、プラスミドおよびファージのような外来遺伝子要素に対する耐性を付与し、後天性免疫の一形態を提供する。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのようなこれらの外因性遺伝要素を認識してサイレンスさせる。
繰り返しは、1987年に細菌の大腸菌(Escherichia coli)について最初に記述された。2000年には、同様のクラスター化した繰り返しが、さらなる細菌および古細菌において同定され、規則的な配置の短いリピート(Short Regularly Spaced Repeat: SRSR)と称された。SRSRは2002年にCRISPRと改名された。いくつかは推定上のヌクレアーゼもしくはヘリカーゼタンパク質をコードする遺伝子のセットが、CRISPR繰り返し(cas、もしくはCRISPR関連遺伝子)と関連していることが分かった。
2005年には、独立した3人の研究者によって、CRISPRスペーサーがいくつかのファージDNAおよびプラスミドのような染色体外DNAと相同性を示すことが示された。これは、CRISPR/casシステムが細菌における適応免疫において役割を有しうることの表れであった。Kooninおよび同僚らによって、スペーサーが、RNA干渉と呼ばれるシステムを用いる真核細胞と同様に、RNA分子の鋳型として働くことが提唱された。
2007年にBarrangou、Horvath (Daniscoの食品業界の科学者)および他者らにより、それらがサーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)の耐性をスペーサーDNAでのファージ攻撃に変えうることが示された。DoudnaおよびCharpentierにより、細菌が免疫防御においてスペーサーをどのように配備するかを知るため、CRISPR関連タンパク質が独立的に探索されていた。彼らにより、Cas9と呼ばれるタンパク質に依るさらに単純なCRISPRシステムが共同研究された。彼らは、スペーサーおよび回文DNAを長いRNA分子に転写することによって細菌が侵入ファージに応答し、細胞がtracrRNAおよびCas9を用いてcrRNAと呼ばれる断片に切断することを見出した。
CRISPRは、2012年までにヒト細胞培養におけるゲノムエンジニアリング/編集ツールとして働くことが初めて示された。それ以来、パン酵母(出芽酵母(S. cerevisiae))、ゼブラフィッシュ、線虫(C.エレガンス(C. elegans))、植物、マウス、およびいくつかの他の生物を含む広範囲の生物において用いられている。さらに、CRISPRは、科学者が特定の遺伝子を標的とし、活性化もしくはサイレンスさせることを可能にするプログラム可能な転写因子を作出するように修飾されている。何万ものガイドRNAのライブラリが現在、利用可能である。
CRISPRが生きた動物での疾患症状を食い止めることができるという最初の証拠は、2014年3月に、MITの研究者が稀有な肝臓障害のマウスを治癒させたときに実証された。2012年以来、CRISPR/Casシステムは、マウスおよび霊長類のような真核生物でも働く遺伝子編集(特定の遺伝子のサイレンシング、増強もしくは変更)に用いられている。cas遺伝子および特異的にデザインされたCRISPRを含むプラスミドを挿入することにより、生物のゲノムは任意の所望の場所で切断することができる。
CRISPRの繰り返しは、サイズが24～48塩基対の範囲に及ぶ。それらは通常、ヘアピンのような二次構造の形成を意味するいくらかの二分子対称性を示すが、しかし本当の意味で回文ではない。繰り返しは、類似の長さのスペーサーで区切られている。いくつかのスペーサーは原核生物のゲノム(自己標的化スペーサー)に一致するが、いくつかのCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージからの配列に正確に一致する。ファージ感染に応答して新しいスペーサーが迅速に付加されることができる。
CRISPR関連(cas)遺伝子は、CRISPR繰り返し-スペーサーアレイと関連することが多い。2013年現在、40種を超える異なるCasタンパク質ファミリーが記述されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は異なるCRISPR/Casシステムの間で遍在しているようである。8つのCRISPRサブタイプ(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube)を定義するためにcas遺伝子および繰り返し構造の特定の組み合わせが用いられており、それらのうちのいくつかは、繰り返し関連ミステリアスタンパク質(repeat-associated mysterious protein; RAMP)をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連している。単一のゲノム中に2つ以上のCRISPRサブタイプが存在しうる。CRISPR/Casサブタイプの散発的分布は、微生物の進化中にシステムが水平遺伝子移動を被ることを示唆している。
外因性DNAは、明らかに、Cas遺伝子によってコードされるタンパク質により小さな要素(長さがおよそ30塩基対)にプロセッシングされ、これが次に、リーダー配列の近くのCRISPR座に何らかの形で挿入される。CRISPR座からのRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質により、隣接する繰り返し配列を有する個々の外因的に誘導された配列要素から構成される小さなRNAにプロセッシングされる。RNAは、他のCasタンパク質をガイドしてRNAもしくはDNAレベルで外因性遺伝要素をサイレンスさせる。CRISPRサブタイプ間の機能的多様性が証拠から示唆されている。Cse (CasサブタイプEcoli)タンパク質(大腸菌(E. coli)中のCasA～Eと呼ばれる)は、CRISPR RNA転写産物を、Cascadeが保持するスペーサー-繰り返し単位にプロセッシングする機能的複合体Cascadeを形成する。他の原核生物において、Cas6はCRISPR転写産物をプロセッシングする。興味深いことに、大腸菌でのCRISPRに基づくファージ不活性化には、CascadeおよびCas3が必要とされるが、しかしCas1およびCas2は必要とされない。パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)および他の原核生物において見出されるCmr (Cas RAMPモジュール)タンパク質は、相補的な標的RNAを認識し切断する小さなCRISPR RNAとの機能的複合体を形成する。RNAガイドCRISPR酵素は、V型制限酵素として分類される。
米国特許出願公開第2014/0068797号も参照されたく、これは参照によりその全体が組み入れられる。
i. Cas9
Cas9はヌクレアーゼ、つまり二重らせんの各鎖に対して1つずつの、2つの活性切断部位を有する、DNAを切断するために特化した酵素である。Cas9のその標的DNAを位置付ける能力を保持しながら、一方もしくは両方の部位を無効にできることが実証されている。Jinekは、tracrRNAおよびスペーサーRNAを、Cas9と混合された、「単一ガイドRNA」分子に組み合わせて、正しいDNA標的を見つけて切断することができた。Jinekらは、そのような合成ガイドRNAを遺伝子編集に用いることができうることを提唱した。
Cas9タンパク質は、病原性細菌および共生細菌において高度に濃縮されている。CRISPR/Cas媒介遺伝子調節は、特に真核生物宿主との細菌の相互作用の間に、内因性細菌遺伝子の調節に寄与しうる。例えば、フランシセラノビサイダ(Francisella novicida)のCasタンパク質Cas9は、独自の小さなCRISPR/Cas関連RNA (scaRNA)を用いて、F.ノビサイダが宿主応答を弱め、病原性を促進するのに重要である細菌リポタンパク質をコードする内因性転写産物を抑制する。
ii. gRNAもしくはsgRNA
RNAガイドタンパク質として、Cas9はDNA標的の認識を指令する短いRNAを必要とする(Mali et al., 2013a)。Cas9は、PAM配列NGGを含むDNA配列を選択的に調べるが、それはプロトスペーサー標的なしでここに結合することができる。しかしながら、Cas9-gRNA複合体は、二本鎖切断を作出するためにgRNAに近い一致を必要とする(Cho et al., 2013; Hsu et al., 2013)。細菌におけるCRISPR配列は複数のRNAにおいて発現され、その後にプロセッシングされてRNAのためのガイド鎖を作出する(Bikard et al., 2013)。真核生物系は、CRISPR RNAをプロセッシングするために必要なタンパク質のいくつかを欠いているため、RNAポリメラーゼIII型プロモーターU6で発現される単一のRNAにCas9標的化に必須のRNA断片を組み合わせるために合成構築体gRNAが作出された(Mali et al., 2013a, b)。合成gRNAは、最小長で100 bpをわずかに上回り、PAM配列NGGの直前の20個のプロトスペーサーヌクレオチドを標的とする部分を含む; gRNAはPAM配列を含まない。
4. 修飾された核酸塩基
いくつかの態様において、本開示の核酸は、修飾された糖部分を含む1つもしくは複数の修飾されたヌクレオシドを含む。1つもしくは複数の糖修飾されたヌクレオシドを含むそのような化合物は、天然の糖部分を含むヌクレオシドのみを含むオリゴヌクレオチドと比べて、標的核酸との増大したヌクレアーゼ安定性もしくは増加した結合親和性のような、望ましい特性を有しうる。いくつかの態様において、修飾された糖部分は置換された糖部分である。いくつかの態様において、修飾された糖部分は糖代用物である。そのような糖代用物は、置換された糖部分の置換に対応する1つもしくは複数の置換を含みうる。
いくつかの態様において、修飾された糖部分は、2'位および/もしくは5'位の置換基を含むがこれらに限定されない、1つもしくは複数の非架橋糖置換基を含む置換された糖部分である。2'-位に適した糖置換基の例としては、2'-F、2'-OCH3 (「OMe」もしくは「O-メチル」)、および2'-O(CH2)2OCH3 (「MOE」)が挙げられるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、2'位の糖置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O--C1～C10アルキル、O--C1～C10置換アルキル; OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、およびO--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択され、各RmおよびRnは、独立して、Hまたは置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。5'位の糖置換基の例としては、5'-メチル(RもしくはS); 5'-ビニル、および5'-メトキシが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、置換された糖は、2つ以上の非架橋糖置換基、例えば、T-F-5'-メチル糖部分を含む(例えば、さらなる5',2'-ビス置換糖部分およびヌクレオシドの場合、PCT国際出願WO 2008/101157を参照のこと)。
2'-置換糖部分を含むヌクレオシドは2'-置換ヌクレオシドといわれる。いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、ハロ、アリル、アミノ、アジド、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S、もしくはN(Rm)-アルキル; O、S、もしくはN(Rm)-アルケニル; O、SもしくはN(Rm)-アルキニル; O-アルキレニル-O-アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール、O-アラルキル、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)もしくはO--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択される2'-置換基を含み、各RmおよびRnは、独立して、H、アミノ保護基または置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。これらの2'-置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ(NO2)、チオール、チオアルコキシ(S-アルキル)、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから独立して選択される1つもしくは複数の置換基でさらに置換することができる。
いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH=CH2、O--CH2-CH=CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、およびN-置換アセトアミド(O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択される2'-置換基を含み、各RmおよびRnは、独立して、H、アミノ保護基または置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。
いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、OCF3, O--CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(CH3)2, --O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、およびO--CH2--C(=O)--N(H)CH3から選択される2'-置換基を含む糖部分を含む。
いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、O--CH3、およびOCH2CH2OCH3から選択される2'-置換基を含む糖部分を含む。
ある種の修飾糖部分は、二環式糖部分を生じる第二の環を形成する架橋糖置換基を含む。いくつかのそのような態様において、二環式糖部分は、4'および2'フラノース環原子の間の架橋を含む。そのような4'-2'糖置換基の例としては、--[C(Ra)(Rb)]n--、--[C(Ra)(Rb)]n--O--、--C(RaRb)--N(R)--O--もしくは、--C(RaRb)--O--N(R)--; 4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)--O-2' (LNA); 4'-(CH2)--S-2'; 4'-(CH2)2--O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)--O-2' (cEt)および4'-CH(CH2OCH3)--O-2'、ならびにそれらの類似体(例えば、米国特許第7,399,845号参照); 4'-C(CH3)(CH3)--O-2'およびその類似体(例えば、WO 2009/006478参照); 4'-CH2--N(OCH3)-2'およびその類似体(例えば、WO2008/150729参照); 4'-CH2--O--N(CH3)-2' (例えば、2004年9月2日付で公開されたUS2004/0171570を参照のこと); 4'-CH2--O--N(R)-2'、および4'-CH2--N(R)--O-2'-が挙げられるが、これらに限定されることはなく、式中、各Rは、独立して、H、保護基、もしくはC1～C12アルキル; 4'-CH2--N(R)--O-2'であり、式中、RはH、C1～C12アルキル、もしくは保護基(米国特許第7,427,672号参照); 4'-CH2--C(H)(CH3)-2' (例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照のこと); ならびに4'-CH2--C(=CH2)-2'およびその類似体(PCT国際出願WO 2008/154401を参照のこと)である。
いくつかの態様において、そのような4'-2'架橋は独立して、--[C(Ra)(Rb)]n--、--C(Ra)=C(Rb)--、--C(Ra)=N--、--C(=NRa)--、--C(=O)--、--C(=S)--、--O--、--Si(Ra)2--、--S(=O)x--、および--N(Ra)--から独立して選択される1～4個の連結基を含み; 式中、
xは0、1、もしくは2であり;
nは1、2、3、もしくは4であり;
各RaおよびRbは、独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C1～C12アルキル、置換されたC1～C12アルキル、C2～C12アルケニル、置換されたC2～C12アルケニル、C2～C12アルキニル、置換されたC2～C12アルキニル、C5～C20アリール、置換されたC5～C20アリール、複素環基、置換された複素環基、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、C5～C7脂環式基、置換されたC5～C7脂環式基、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)--H)、置換されたアシル、CN、スルホニル(S(=O)2-J1)、もしくはスルホキシル(S(=O)-J1)であり; ならびに
各J1およびJ2は、独立して、H、C1～C12アルキル、置換されたC1～C12アルキル、C2～C12アルケニル、置換されたC2～C12アルケニル、C2～C12アルキニル、置換されたC2～C12アルキニル、C5～C20アリール、置換されたC5～C20アリール、アシル(C(=O)--H)、置換されたアシル、複素環基、置換された複素環基、C1～C12アミノアルキル、置換されたC1～C12アミノアルキル、または保護基である。
二環式糖部分を含むヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドもしくはBNAといわれる。二環式ヌクレオシドには、(A) α-L-メチレンオキシ(4'-CH2--O-2') BNA、(B) β-D-メチレンオキシ(4'-CH2--O-2') BNA (ロックされた核酸もしくはLNAともいわれる)、(C) エチレンオキシ(4'-(CH2)2--O-2') BNA、(D) アミノオキシ(4'-CH2--O--N(R)-2') BNA、(E) オキシアミノ(4'-CH2--N(R)--O-2') BNA、(F) メチル(メチレンオキシ) (4'-CH(CH3)--O-2') BNA (拘束エチルもしくはcEtともいわれる)、(G) メチレン-チオ(4'-CH2--S-2') BNA、(H) メチレン-アミノ(4'-CH2-N(R)-2') BNA、(I) メチル炭素環式(4'-CH2--CH(CH3)-2') BNA、(J) プロピレン炭素環式(4'-(CH2)3-2') BNA、および(K) メトキシ(エチレンオキシ) (4'-CH(CH2OMe)-O-2') BNA (拘束MOEもしくはcMOEともいわれる)が含まれるが、これらに限定されることはない。
さらなる二環式糖部分は、当技術分野において公知である、例えば: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 5561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 米国特許第7,053,207号、同第6,268,490号、同第6,770,748号、同第6,794,499号、同第7,034,133号、同第6,525,191号、同第6,670,461号、および同第7,399,845号; WO 2004/106356、WO 1994/14226、WO 2005/021570、およびWO 2007/134181; 米国特許出願公開第2004/0171570号、同第2007/0287831号、および同第2008/0039618号; 米国特許出願第12/129,154号、同第60/989,574号、同第61/026,995号、同第61/026,998号、同第61/056,564号、同第61/086,231号、同第61/097,787号、および同第61/099,844号; ならびにPCT国際出願番号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154、およびPCT/US2008/068922。
いくつかの態様において、二環式糖部分およびそのような二環式糖部分を組み入れたヌクレオシドは、異性立体配置によってさらに定義される。例えば、4'-2'メチレン-オキシ架橋を含むヌクレオシドは、α-L配置もしくはβ-D配置にありうる。これまでに、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2--O-2')二環式ヌクレオシドは、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れられている(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372)。
いくつかの態様において、置換された糖部分は、1つもしくは複数の非架橋糖置換基および1つもしくは複数の架橋糖置換基(例えば、5'-置換および4'-2'架橋糖; PCT国際出願WO 2007/134181、ここではLNAが、例えば、5'-メチルもしくは5'-ビニル基で置換されている)を含む。
いくつかの態様において、修飾された糖部分は糖代用物である。いくつかのそのような態様において、天然糖の酸素原子は、例えば、硫黄、炭素もしくは窒素原子で置換される。いくつかのそのような態様において、そのような修飾された糖部分はまた、上記のように架橋および/もしくは非架橋置換基を含む。例えば、ある種の糖代用物は、4'-硫黄原子および置換を2'-位(例えば、公開された米国特許出願第2005/0130923号を参照のこと)および/もしくは5'位に含む。さらなる例として、4'-2'架橋を有する炭素環式二環式ヌクレオシドが記述されている(例えば、Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443およびAlbaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740を参照のこと)。
いくつかの態様において、糖代用物は、5-原子以外の環を含む。例えば、いくつかの態様において、糖代用物は、6員テトラヒドロピランを含む。そのようなテトラヒドロピランは、さらに修飾されもしくは置換されうる。そのような修飾されたテトラヒドロピランを含むヌクレオシドには、ヘキシトール核酸(HNA)、アニトール核酸(ANA)、マンニトール(manitol)核酸(MNA) (Leumann, C J. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854を参照のこと)、およびフルオロHNA (F-HNA)が含まれるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7がそれぞれHである式VIIの修飾されたTHPヌクレオシドが提供される。ある種の態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7の少なくとも1つはH以外である。いくつかの態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7の少なくとも1つはメチルである。いくつかの態様において、R1およびR2の1つがFである式VIIのTHPヌクレオシドが提供される。ある種の態様において、R1はフルオロであり、かつR2はHであり、R1はメトキシであり、かつR2はHであり、およびR1はメトキシエトキシであり、かつR2はHである。
アンチセンス化合物への組み入れのためのヌクレオシドを修飾するために用いることができる多くの他のビシクロおよびトリシクロ糖代用物環系も当技術分野において公知である(例えば、総説: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854を参照のこと)。
非限定的に、2'-F-5'-メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5',2'-ビス置換ヌクレオシドの場合にはPCT国際出願WO 2008/101157を参照のこと)ならびにSでのリボシル環酸素原子の置換および2'位でのさらなる置換(米国特許出願第2005/0130923号参照)あるいは二環式核酸の5'置換(PCT国際出願WO 2007/134181を参照されたく、4'-CH2--O-2'二環式ヌクレオシドは、5'の位置で5'-メチルもしくは5'-ビニル基によりさらに置換されている)のような、修飾の組み合わせも提供される。また、炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製はそのオリゴマー化および生化学的研究とともに記述されている(例えば、Srivastava et al., 2007を参照のこと)。
いくつかの態様において、本発明は、修飾されたヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。それらの修飾されたヌクレオチドは、修飾された糖、修飾された核酸塩基、および/もしくは修飾された結合を含みうる。特定の修飾は、得られたオリゴヌクレオチドが所望の特徴を保有するように選択される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1つもしくは複数のRNA様ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1つもしくは複数のDNA様ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、本発明のヌクレオシドは、1つもしくは複数の未修飾核酸塩基を含む。ある種の態様において、本発明のヌクレオシドは、1つもしくは複数の修飾核酸塩基を含む。
いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は、本明細書において定義される普遍的塩基、疎水性塩基、無差別(promiscuous)塩基、サイズ拡張塩基、およびフッ素化塩基、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン; 5-プロピニルシトシン; 5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルCH3)ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アザ(azo)ウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルならびに他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン、本明細書において定義される普遍的塩基、疎水性塩基、無差別(promiscuous)塩基、サイズ拡張塩基、およびフッ素化塩基から選択される。さらに修飾された核酸塩基には、フェノキサジンシチジン([5,4-b][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)のような三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-13][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)のようなG-クランプが含まれる。修飾された核酸塩基はまた、プリンもしくはピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンを含みうる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859に開示されているもの; Englisch et al., 1991により開示されているもの; およびSanghvi, Y. S., 1993により開示されているものが含まれる。
ある種の上記の修飾された核酸塩基および他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第3,687,808号; 同第4,845,205号; 同第5,130,302号; 同第5,134,066号; 同第5,175,273号; 同第5,367,066号; 同第5,432,272号; 同第5,457,187号; 同第5,459,255号; 同第5,484,908号; 同第5,502,177号; 同第5,525,711号; 同第5,552,540号; 同第5,587,469号; 同第5,594,121号; 同第5,596,091号; 同第5,614,617号; 同第5,645,985号; 同第5,681,941号; 同第5,750,692号; 同第5,763,588号; 同第5,830,653号および同第6,005,096号が含まれ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、本発明は、結合したヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。そのような態様において、ヌクレオシドは、任意のヌクレオシド間結合を用いてともに連結されうる。ヌクレオシド間連結基の2つの主なクラスは、リン原子の存在もしくは非存在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル(P=O)、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデートおよびホスホロチオエート(P=S)が含まれるが、これらに限定されることはない。代表的な非リン含有ヌクレオシド間連結基には、メチレンメチルイミノ(--CH2--N(CH3)--O--CH2--)、チオジエステル(--O--C(O)--S--)、チオノカルバメート(--O--C(O)(NH)--S--); シロキサン(--O--Si(H)2--O--); およびN,N'-ジメチルヒドラジン(--CH2--N(CH3)--N(CH3)--)が含まれるが、これらに限定されることはない。天然のホスホジエステル結合と比較して、修飾された結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変化させる、典型的には増加させるために用いることができる。いくつかの態様において、キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ混合物として、または別個の鏡像異性体として調製することができる。代表的なキラル結合には、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されることはない。リン含有および非リン含有ヌクレオシド間結合の調製の方法は、当業者に周知である。
本明細書において記述されるオリゴヌクレオチドは、1つもしくは複数の不斉中心を含み、したがって絶対立体化学に関して、(R)もしくは(S)、糖アノマーの場合のようなαもしくはβ、またはアミノ酸などの場合のような(D)もしくは(L)として定義されうる鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の立体異性体配置を生じる。本明細書において提供されるアンチセンス化合物に含まれるのは、全てのそのような可能な異性体、ならびにそれらのラセミ体および光学的に純粋な形態である。
中性のヌクレオシド間結合には、非限定的に、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI (3'-CH2--N(CH3)--O-5')、アミド-3 (3'-CH2--C(=O)--N(H)-5')、アミド-4 (3'-CH2--N(H)--C(=O)-5')、ホルムアセタール(3'-O--CH2--O-5')、およびチオホルムアセタール(3'-S--CH2--O-5')が含まれる。さらなる中性のヌクレオシド間結合には、シロキサン(ジアルキルシロキサン)、カルボキシレートエステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホネートエステルおよびアミドを含む非イオン結合が含まれる(例えば: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi and P. D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65を参照のこと)。さらなる中性のヌクレオシド間結合には、混合されたN、O、SおよびCH2構成部分を含む非イオン結合が含まれる。
オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でさらなる修飾を行うこともできる。例えば、本発明のリガンド結合オリゴヌクレオチドの1つのさらなる修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを増強する1つもしくは複数のさらなる非リガンド部分もしくはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。そのような部分には、コレステロール部分(Letsinger et al., 1989)のような脂質部分、コール酸(Manoharan et al., 1994)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-5-トリチルチオール(Manoharan et al., 1992; Manoharan et al., 1993)、チオコレステロール(Oberhauser et al., 1992)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., 1991; Kabanov et al., 1990; Svinarchuk et al., 1993)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., 1995; Shea et al., 1990)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., 1995)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., 1995)、パルミチル部分(Mishra et al., 1995)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., 1996)が含まれるが、これらに限定されることはない。
そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号; 同第4,948,882号; 同第5,218,105号; 同第5,525,465号; 同第5,541,313号; 同第5,545,730号; 同第5,552,538号; 同第5,578,717号、同第5,580,731号; 同第5,580,731号; 同第5,591,584号; 同第5,109,124号; 同第5,118,802号; 同第5,138,045号; 同第5,414,077号; 同第5,486,603号; 同第5,512,439号; 同第5,578,718号; 同第5,608,046号; 同第4,587,044号; 同第4,605,735号; 同第4,667,025号; 同第4,762,779号; 同第4,789,737号; 同第4,824,941号; 同第4,835,263号; 同第4,876,335号; 同第4,904,582号; 同第4,958,013号; 同第5,082,830号; 同第5,112,963号; 同第5,214,136号; 同第5,082,830号; 同第5,112,963号; 同第5,214,136号; 同第5,245,022号; 同第5,254,469号; 同第5,258,506号; 同第5,262,536号; 同第5,272,250号; 同第5,292,873号; 同第5,317,098号; 同第5,371,241号、同第5,391,723号; 同第5,416,203号、同第5,451,463号; 同第5,510,475号; 同第5,512,667号; 同第5,514,785号; 同第5,565,552号; 同第5,567,810号; 同第5,574,142号; 同第5,585,481号; 同第5,587,371号; 同第5,595,726号; 同第5,597,696号; 同第5,599,923号; 同第5,599,928号および同第5,688,941号が含まれるが、これらに限定されることはなく、これらの各々は、参照により本明細書に組み入れられる。
E. キット
本開示はまた、キットを提供する。本明細書において開示される成分のいずれも、キットの形態で組み合わせることができる。いくつかの態様において、キットは、上記のもしくは特許請求の範囲におけるデンドリマーもしくは組成物を含む。
キットは一般に、成分が配され、好ましくは、適当に分注されうる、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジもしくは他の容器を含む。キット中に2つ以上の成分がある場合、キットはまた、一般に、さらなる成分が別個に配されうる、第2、第3もしくは他のさらなる容器を含む。しかしながら、成分のさまざまな組み合わせを容器に含めることができる。いくつかの態様において、核酸送達成分の全てが単一の容器中で組み合わされる。他の態様において、本重合体を有するデンドリマー送達成分の一部もしくは全部が別個の容器中で提供される。
本発明のキットはまた、典型的には、商業的販売のために密閉してさまざまな容器を含むための包装を含む。そのような包装は、所望の容器が保持される厚紙または射出もしくはブロー成形プラスチック包装を含みうる。キットはまた、キット成分を利用するための説明書を含みうる。説明書は、実行可能なバリエーションを含みうる。
F. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技法は、本発明の実践において良好に機能するように発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実践のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更をなすことができ、それでもなお、同様のもしくは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
実施例1: 材料および器具
1. 化学合成のための材料
全てのアミン、チオール、および他に特定されていない化学物質は、Sigma-Aldrichから購入された。1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)は、Avanti Lipidsから購入された。脂質PEG2000は、以下に記述されるように、化学的に合成された。報告された手順(Love et al., 2010)にしたがってC12-200は合成された。全ての有機溶媒はFisher Scientificから購入され、溶媒精製システム(Innovative Technology)で精製された。
2. インビトロおよびインビボ実験のための核酸および他の材料
全てのsiRNAは、Sigma-Aldrichから購入された。Let-7g miRNA模倣体およびその対照模倣体は、Ambion by Life Technologiesから購入された。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、Sigma-Aldrichから購入された。OptiMEM、DAPI、およびAlexa Fluor 488ファロイジンは、Life Technologiesから購入された。ONE-Glo + ToxはPromegaから購入された。Biophen FVIIはAniara Corporationから購入された。
siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった:
siLuc (ルシフェラーゼに対するsiRNA)。dTはDNA塩基である。他は全てRNA塩基である。
Figure 0007041616000116
siFVII (FVIIに対するsiRNA)。2'-フルオロ修飾ヌクレオチドは小文字である。
Figure 0007041616000117
siCTR (対照としてのsiRNA)
Figure 0007041616000118
Sigma-Aldrich MISSION siRNAユニバーサル陰性対照(Universal Negative Control) #1 (カタログ番号: SIC001)を対照実験において非標的siRNAとして用いた。2' OMe修飾された対照siRNA(Sigma-Aldrich, 独自の修飾)をインビボ研究で用いて、免疫刺激を低減させた。
Cy5.5標識siRNA (画像化のためのsiRNA)
Figure 0007041616000119
Let-7g miRNA模倣体
Ambion (Life Technologies) mirVana miRNA模倣体(カタログ番号: 4464070, 製品ID: MC11758, 名称: has-let-7g)。Ambionによって開示されていない正確な配列および修飾。成熟ヒトLet-7gを模倣する。
陰性対照(CTR) miRNA模倣体
Ambion (Life Technologies) mirVana miRNA模倣体, 陰性対照(Negative Control) #1 (カタログ番号: 4464061)。Ambionによって開示されていない正確な配列および修飾。
3. ロボット自動化
ナノ粒子(NP)製剤化およびインビトロスクリーニングは、8チャネル液体ハンドリングアーム(LiHa)、96チャネルヘッドを有するマルチチャネルアーム(MCA)、ロボットマニピュレータアーム(RoMa)、および統合InfiniTe F/M200 Proマイクロプレートリーダー(Tecan)を備えたTecan Freedom EVO 200流体ハンドリングロボットにて行われた。2つの統合されたカスタム加熱および撹拌化学反応ステーション(V&P Scientific 710E-3HM Series Tumble Stirrers)によって、反応および混合の支援が提供された。全ての操作はEVOware Standardソフトウェア(Tecan)でプログラムされていた。
4. 合成特性
1Hおよび13C NMRは、Varian 500 MHz分光計にて行われた。MSはVoyager DE-Pro MALDI TOFにて行われた。フラッシュクロマトグラフィーは、UV-visおよび蒸発光散乱検出器(ELSD)を備えたTeledyne Isco CombiFlash Rf-200iクロマトグラフィーシステムにて行われた。粒子サイズおよびゼータ電位は、Malvern Zetasizer Nano ZS (He-Neレーザー, λ = 632 nm)を用いた動的光散乱(DLS)によって測定された。
5. インビボ研究のためのナノ粒子製剤
インビボ研究のために製剤化されたデンドリマーナノ粒子は、ヘリンボーン迅速混合特性を有するマイクロ流体混合装置(Precision Nanosystems NanoAssemblr)を用いて調製された。デンドリマー、DSPC、コレステロール、および脂質PEG2000のエタノール溶液を、以下に記述するようにsiRNAの酸性溶液と迅速に混ぜ合わせた。水性:EtOHの典型的な比率は3:1 (容量)であり、典型的な流速は12 mL/分であった。
6. モジュール方式の分解性デンドリマーの自動インビトロ送達スクリーニング
ナノ粒子(NP)製剤およびインビトロスクリーニングは、8チャネル液体ハンドリングアーム(LiHa)、96チャネルヘッドを有するマルチチャネルアーム(MCA)、ロボットマニピュレータアーム(RoMa)、および統合InfiniTe F/M200 Proマイクロプレートリーダー(Tecan)を備えたTecan Freedom EVO 200流体ハンドリングロボットにて行われた。
ホタルルシフェラーゼを安定に発現するHeLa細胞(HeLa-Luc)は、レンチウイルス感染を用いたルシフェラーゼ遺伝子の安定したトランスフェクション、続いてクローン選択によってHeLa細胞(ATCC)から導出された。HeLa-Luc細胞を、不透明な白色96ウェルプレート(Corning)の各ウェルに播種し(10,000細胞/ウェル)、5% FBSを補充したフェノールレッド不含DMEMに終夜付着させた。トランスフェクションを開始する前の2日目に、培地を新鮮なFBS含有培地と交換した。
G1DD-siLucナノ粒子は、発見プロセスを加速するために自動化された流体ハンドリングロボットの助けを借りて製剤化された。全ての操作はEVOware Standardソフトウェアでプログラムされていた。最初に、デンドリマー反応溶液を元の反応濃度からエタノール中12.5 mMに希釈した。次に、デンドリマー溶液を二度目に、LiHaアームを用いてエタノール中12.5 mMから1 mMに希釈した。次いで、エタノール中の脂質混合物89.2 μLを96ウェル透明プレートに添加した。脂質混合物は、エタノール中のDSPC (0.0690 mM)、コレステロール(0.2622 mM)、および脂質PEG2000 (0.0138 mM)から構成された。引き続いて、96ウェルプレートの脂質混合物にLiHaを介して各デンドリマー(1 mM) 30.8 μLを添加し、その後迅速な混合を行った(15回; 75 μLの混合容量; 250 μL/秒の速度)。LiHaを添加し、一度に8チップ混合した。第2の透明96ウェルプレートに、クエン酸緩衝液(pH = 4.3)中のsiLuc (20 ng/μL) 50 μLをLiHaによって添加した。次いで、エタノール混合物(デンドリマー、DSPC、コレステロール、脂質PEG2000) 30 μLをsiLuc溶液50 μLに添加し、その後に迅速な混合(15回; 75 μLの混合容量; 250 μL/秒の速度)を行って、デンドリマーナノ粒子を形成させた。次に、LiHaを用い滅菌PBS(1×) 120 μLを添加および混合してNPを希釈し、pHを上昇させた。引き続き、プレートを再フォーマットして、増殖細胞への容易な移入を可能にした。最後に、NP溶液20 μLを、MCA96ヘッドを介し滅菌使い捨てチップを用いて培養細胞に添加して、混入を回避した。細胞は最終的にsiLuc (33 nM) 100 ngを受けた。このスクリーニング段階の間、デンドリマーのsiLucに対するモル比は100:1であった。製剤の最終組成は、G1DD:コレステロール:DSPC:脂質PEG2000: = 50:38:10:2 (モルで)であった。細胞を37℃、5% CO2で24時間インキュベートし、次いでホタルルシフェラーゼ活性と、生存性を、One Glo + Toxアッセイキット(Promega)を用いて分析した。
7. インビボ研究のためのデンドリマー-低分子RNA製剤
インビボ研究のために製剤化されたデンドリマーナノ粒子は、ヘリンボーン迅速混合特性を有するマイクロ流体混合装置(Precision Nanosystems NanoAssemblr)を用いて調製された。デンドリマー、DSPC、コレステロール、および脂質PEG2000 (50:38:10:2のモル比)のエタノール溶液を低分子RNAの酸性溶液と迅速に混ぜ合わせて、25:1 (デンドリマー:低分子RNA)の最終重量比を得た。水性:EtOHの典型的な比率は3:1 (容量)であり、典型的な流速は12 mL/分であった。報告された手順(Love et al., 2010)にしたがってC12-200 LNPは調製された。C12-200、DSPC、コレステロール、および脂質PEG2000 (50:38.5:10:1.5のモル比)のエタノール溶液を低分子RNAの酸性溶液と迅速に混ぜ合わせて、7:1 (C12-200:低分子RNA)の最終重量比を得た。全ての製剤化されたNPを、3.5kDのカットオフを用いた滅菌PBS中での透析によって精製し、サイズを、インビボ研究の前に動的光散乱(DLS)によって測定した。適用可能な場合、Ribogreen結合アッセイ(Invitrogen)を用いて、少量の溶液を取り、そのプロトコルにしたがうことにより、低分子RNAのカプセル封入を測定した。
8. 動物実験
全ての実験は、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの施設動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、適用可能な地方、州および連邦規則と一致していた。雌性C57BL/6マウスはHarlan Laboratories (Indianapolis, IN)から購入された。MYC駆動肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスは、TRE-MYC系統をLAP-tTA系統と交配させることによって作出された。LAP-tTAおよびTRE-MYC遺伝子型を担持するマウスを1 mg/mLのdoxで維持し、doxを取り除くことによってMYCを誘導した。統計的有意性を達成するのに必要とされる動物数を予測するために、検出力分析を行った。
9. マウスにおけるインビボ第VII因子サイレンシング
インビボ送達スクリーニングのため、雌性C57BL/6マウスは尾静脈にPBS (陰性対照, n=3)またはPBS中で希釈された非標的化siRNA (siCTR, 陰性対照, n=3)を含有するデンドリマーNPもしくは抗第VII因子siRNA (siFVII, n=3)を含有するデンドリマーNP (総量200 μLもしくはそれ以下)のi.v.注射を受けた。48時間後、体重増加/減少を測定し、マウスを、逆眼窩眼球出血による血液サンプル採取のためイソフルオレン吸入により麻酔した。血清分離管(Becton Dickinson)で血清を単離し、第VII因子タンパク質レベルを発色アッセイ法(Biophen FVII, Aniara Corporation)によって分析した。PBSを注射したマウス由来のサンプルを用いて標準曲線を構築し、処置群を未処置PBS対照と比較することにより相対的な第VII因子発現を決定した。
治療研究のため、トランスジェニックマウスにおけるFVIIノックダウンを、上記の血液アッセイ法でおよびqPCRによって採取された肝臓組織を用いて検証した。統計的有意性を評価するために、95%信頼水準の両側スチューデントt検定を実施した。
10. 生体内分布
肝臓腫瘍を担持する雌性C57BL/6マウスもしくはトランスジェニックマウスは尾静脈に、200 μL中1 mg/kgのsiRNAでCy5.5-siRNAを含有するデンドリマーNPのi.v.注射を受けた。注射後24時間の時点で、マウスを安楽死させ、臓器を取り出した。生体内分布は、Cy5.5フィルタの設定でIVIS Lumina System (Caliper Life Sciences)を用いて全臓器を画像化することによって評価された。
共焦点画像化のため、組織を凍結切片化(7 μm)し、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。スライドをPBSで3回洗浄し、1%アルブミンを有するPBS中で30分間ブロッキングした。次いで、切片を、1%アルブミンを有するPBS中のAlexa Fluor 488 Phalloidin (200分の1希釈, Life Technologies)とともに30分間インキュベートした。スライドを0.1% Tween 20で3回洗浄し、ProLong Gold Antifade (Life Technologies)を用いてマウントした。25×対物レンズを備えたLSM 700点走査共焦点顕微鏡(Zeiss)を用いて、切片を画像化した。
11. インビボ毒性評価およびLet-7g治療研究
肝臓腫瘍を担持する野生型マウスもしくはトランスジェニックマウスを、異なる群に無作為に分けた。マウスは尾静脈に、siCTRを含有するデンドリマーNPのi.v.注射を受けた。それらの体重を毎日モニターした。肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスの場合、複数回の尾静脈注射を行って、繰り返し投与をシミュレーションした。
Let-7gの治療研究の場合、肝臓腫瘍を担持するトランスジェニックマウスは尾静脈に、26日齢から61日齢までPBS 200 μL中1 mg/kgの投与量でLet-7g模倣体もしくはCTR模倣体を有するデンドリマーNPのi.v.注射を毎週受けた。処理順序無作為化を用いた。盲検は行われなかった。それらの体重、腹部サイズ、および生存を注意深くモニターした。統計的有意性を評価するために、95%信頼水準の両側T検定もしくはMantel-Cox検定を実施した。
実施例2: PEG脂質およびデンドリマーの合成および特徴付け
1. 1,512個の第1世代分解性デンドリマー(G1DD)を含むライブラリの合成
G1DDは、2つの連続した直交反応によって合成された。最初に、異なる初期分枝中心(IBC)を有するアミンを2-(アクリロイルオキシ)エチルメタクリレート(AEMA)のアクリレート基と、IBC数に等しいAEMAとのアミンのモル比で別々に反応された(例えば2Aアミン: 2当量のAEMAを添加した; 6Aアミン: 6当量のAEMAを添加した)。50℃で24時間、5 mol%のブチル化ヒドロキシルトルエン(BHT)の添加によって反応を実施した。次に、各第1段階添加物を各チオールと、アミンIBC数に等しいチオール添加物とのチオールのモル比で別々に反応させた(例えば2Aアミン第1段階添加物: 2当量の各チオールを添加した; 6Aアミン第1段階添加物: 6当量の各チオールを添加した)。60℃で48時間、5 mol%のジメチルフェニルホスフィン(DMPP)触媒の添加によって反応を実施した。ガラスバイアルおよびアルミニウム反応ブロック中で反応を実施することにより、1,512員ライブラリ合成が加速された。カスタム加熱および撹拌化学反応ステーション(V&P Scientific 710E-3HM Series Tumble Stirrers)を利用した。
初期のインビトロ送達スクリーニング実験を粗G1DDで実施した。精製されたデンドリマーを用いて活性を検証するための追跡研究を行った。
全てのインビボ動物実験は、精製されたG1DDで行われた。精製されたG1DDは、Teledyne Iscoクロマトグラフィーシステムを使いヘキサンおよび酢酸エチルの勾配溶出液を用いて中性アルミナカラムでのカラムフラッシュクロマトグラフィーによって得られた。
2. より高次世代の分解性デンドリマー(HGDD) (例として1A2-G2-SC8)の合成
Figure 0007041616000120
以前の方法(Ma et al., 2009)にしたがって、より高次世代の分解性デンドリマーを調製した。1A2-G1は、5 mol% BHTの存在下、50℃で24時間、1A2アミンを1当量のAEMAと反応させた直後に調製された。1A2-G1 (4.00 g, 11.7 mmol)をDMSO 10 mLに溶解した。上記溶液への2-アミノエタンチオール(1.37 g, 17.5 mmol)の添加後、反応物を室温で30分間撹拌した。次にジクロロメタン300 mLを直ちに反応溶液に加え、余分な2-アミノエタンチオールを除去するために冷塩水(50 mL×3)で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、回転蒸発により濃縮して次の段階に直接用いた。AEMA (4.75 g, 25.8 mmol)およびBHT (227 mg, 1.08 mmol)を上記溶液に加えた。反応物を50℃で撹拌し、1H NMRによってモニターした。反応が完了した後、TLCプレート分析によりEAMAが見られなくなるまで、ヘキサン部分20 mLで溶液を繰り返し洗浄した。洗浄した溶液を真空中で乾燥させて、次の段階のために粘性液体1A3-G2を直接得た。1A3-G2を、上記の二段階合成手順にしたがうことにより反応させて、次の段階のために粘性液体1A3-G3を直接得た。1A2-G3 (0.5 g, 0.3 mmol)をDMSO 0.5 mLに溶解した後、1-オクタンチオール(216 μL, 1.22 mmol)およびジメチルフェニルホスフィン(DMPP) (8.6 μL, 0.061mmol)を添加した。反応物を60℃で48時間撹拌し、次いでヘキサンおよび酢酸エチルの勾配溶出液を用いて中性アルミナカラムに流すことにより精製した。淡黄色の粘性液体1A2-G3-SC8を得た。
3. 脂質PEG2000の合成
Figure 0007041616000121
PEG44-OH (80 g, 40 mmol)およびピリジン(6.5 mL, 80 mmol)を無水DCM 250 mLに溶解し、0℃で冷却した。DCM 50 mL中の塩化メタンスルホニル(15.5 mL, 200 mmol)を30分かけて添加し、混合物を室温で終夜撹拌した。DCMさらに100 mLを添加し、有機相を飽和NaHCO3溶液(50 mL×3)、次いで塩水(50 mL×3)で洗浄した。得られた溶液を濃縮し、残渣をイソプロパノール中で再結晶し、乾燥して、白色粉末PEG2000-Ms (74 g, 93%)を得た。
PEG2000-Ms (35.41 g, 17.7 mmol)をDMF 250 mLに溶解した。次に、NaN3 (12.4 g, 19.0 mmol)を溶液に添加した。反応物を窒素下、50℃で2日間撹拌した。DMFの除去後、残渣をDCM 300 mLに溶解し、塩水(50 mL×3)で洗浄した。溶媒の除去後、残油をメタノール50 mLに溶解し、生成物をジエチルエーテル300 mLで3回沈殿させて、所望の化合物(25.55 g, 72%)を白色粉末PEG2000-N3として得た。
プロパルギルアミン(0.50 g, 9.1 mmol)、BHT (191 mg, 0.91 mmol)、およびEAMA (2.73 g, 18.2 mmol)を25 mLの反応バイアルに加えた。混合物を50℃で48時間撹拌した。反応物を冷却して、次の反応に用いるために精製することなく、無色の油状生成物T3-G1を得た。
4. 選択デンドリマーの特徴付け
Figure 0007041616000122
Figure 0007041616000123
Figure 0007041616000124
5A2-SC8はまた、6本のアーム(以下に示される構造)で調製された。
Figure 0007041616000125
Figure 0007041616000126
Figure 0007041616000127
実施例3: 第1世代分解性デンドリマー(G1DD)のライブラリデザインおよび合成
肝臓がんは、薬物誘発肝毒性が基礎肝臓疾患を悪化させうるため、治療的介入について困難な宿主である(Boyerinas et al., 2010)。それゆえ、効果的なRNAi媒介療法を達成するために、担体の高い効力と低い毒性のバランスが維持されなければならない。これには、サイズ、化学構造、および最終の物理的特性という点で送達担体を容易に調整するための多様な戦略が必要である(図1A)。いくつかの態様において、以下の特徴の1つもしくは複数を示すデンドリマーがデザインされた: 化学的およびサイズ操作に最適な単分散材料(Wu et al., 2004; Carlmark et al., 2009; Killops et al., 2008; Ma et al., 2009; Franc and Kakkar, 2010)。直交反応を利用して2-(アクリロイルオキシ)エチルメタクリレート(AEMA)と逐次的に反応させ、さまざまなパラメータ: コア(C)、連結もしくは繰り返し単位(L)および周辺部もしくは末端基(P)によって第1世代分解性デンドリマー(G1DD)を多様化させた(図1B)。いくつかの態様において、ポリエステルはFDAに認可された毒性最小限の製品において用いられるので、出発の分解性連結としてエステルを選択した。各成長段階で、エステル数が増加し、これによってバランスのとれた効力および毒性を有する分解性デンドリマーを同定する機会が提供される。
以前の結果から、これらの直交反応が一連の世代のポリエステルデンドリマーを構築できることが明らかである(Ma et al., 2009)。しかしながら、この戦略が利用される前に、この方法は、精製することなく種々の化学的に異なるアミンおよびチオール化合物を用いて多様なデンドリマーを生成できることが立証された。この化学反応のロバスト性を調べるために、最も困難な出発物質、つまり初期分枝中心(IBC)として6個のN-H結合を有するトリス(2-アミノエチル)アミンおよび14炭素長のアルキル鎖を有するテトラデシルアミンを用いて、直交マイケル付加反応の構造的限界を試験した。50℃で5 mol%のブチル化ヒドロキシルトルエン(BHT) (ラジカル形成を阻害する)の存在下において24時間後に、トリス(2-アミノエチル)アミンおよびテトラデシルアミンの両方は、AEMA中のアクリレート官能基と定量的かつ選択的に反応したが、これらの条件下でAEMAそれ自体は未反応のままである(図2および3)。第2の直交反応(スルファ-マイケル付加)において、ジメチルフェニルホスフィンは、低濃度(最低125 mMである)もしくは小規模(平均でおよそ20 mg)条件で最終生成物を達成するため、および高い変換(1H NMRによって100%)を達成するため触媒として必要とされ、その結果、その材料をその後の試験もしくは世代拡張のために精製することなく用いることができる(図4および5)。デンドリマーのいくつかは、より大規模で再合成され、インビボ研究を行う前にフラッシュクロマトグラフィーによって精製された。
複数の送達障壁のため、ナノカプセル封入による低分子RNA担体の効力はpKa、トポロジー/構造、および疎水性を含めて、さまざまな要因によって影響される(Siegwart et al., 2011; Jayaraman et al., 2012; Schaffert et al., 2011; Whitehead et al., 2014)。高い送達効力を有する分解性デンドリマーを容易に同定するために、コア形成アミンCおよび周辺部形成チオールPを化学的に多様化することによって、4つのゾーン: コア結合 - 周辺分安定化(ゾーンI)、コア結合 - 周辺部結合(ゾーンII)、コア安定化 - 周辺部安定化(ゾーンIII)、およびコア安定化 - 周辺部結合(ゾーンIV)でG1DDのライブラリをデザインした(図1Cおよび1D)。ゾーンIおよびIIにおいて、RNA結合は、1つ(1An)から6つ(6An)の初期分枝中心(IBC)を有するアミンによって調節された。それゆえ、対応するデンドリマーには、1～6個の分枝が含まれていた。ゾーンIIIおよびIVにおいて、RNA-デンドリマーNPの安定化は、アルキル鎖の異なる長さ(1Hnおよび2Hn)で主に変えられた。ゾーンIIおよびIVにおいて、アミノチオール(SNn)の結合能力は異なるアミンで主に調節されたが、ゾーンIおよびIIIにおいては、安定化がアルキルチオール(SCn)長ならびにカルボキシル-およびヒドロキシル-アルキルチオール(SOn)で変えられた。化合物のライブラリ全体をデンドリマーの有効性について試験した(図6)。
実施例4: siRNA細胞内送達のためのインビトロG1DDスクリーニング
送達担体は、一連の細胞外および細胞内障壁を克服して、低分子RNAが腫瘍細胞の内側で活性であることを可能にしなければならない。ルシフェラーゼを安定に発現したHeLa細胞にインビトロでsiRNAを送達する能力についての1,512員のG1DDライブラリのスクリーニングによりsiRNAを媒介して細胞内障壁を克服できるG1DDが同定された。G1DDは、ルシフェラーゼ標的化siRNA (siLuc)ならびにヘルパー脂質コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)および脂質PEG2000を含有するナノ粒子(NP)に製剤化された(Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010)。ルシフェラーゼ低減および細胞生存性を定量化することによって、細胞内送達能を評価した(図7～9)。
インビトロデータからSARを抽出するために、本発明者らはデンドリマー由来樹木分析プロセスを利用した(図7Bおよび9B)。1,512個のデンドリマーの中で、88個が50%超のルシフェラーゼサイレンシングを媒介し、ライブラリ全体のヒット率は6%であった。全4つのゾーン(I～IV)のヒット率が分析された場合、ゾーンIのヒット率は10%であったが、ゾーンII、III、およびIVのヒット率はそれぞれ0%、2%、および3%であった。この結果から、siRNA結合コアおよび安定化周辺部(ゾーンI)を有するこれらのデンドリマーがはるかに高い細胞内siRNA送達能を有することが示された。ゾーン1の分枝タイプ内では、SO周辺部を有するデンドリマーのヒット率は1%ほどに低いが、SC周辺部を有するデンドリマーのヒット率は15%ほどに高かった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、デンドリマー周辺部からの疎水性安定化は、ナノカプセル封入を通じて細胞にsiRNAを効率的に送達するために重要であると考えられている。これは、さらなるNP安定性を提供する疎水性パッキングの増加をもたらす可能性が高い(Leung et al., 2012)。結合コアおよびSC周辺部を有するこれらのデンドリマーの分枝数および分枝長さをさらに調べた後で、結合コアおよび3、4、5もしくは6個のSC5-8分枝もしくはSC9-12分枝を有するデンドリマーは、siLucをHeLa細胞へ送達する25%超の機会を有し、50%超のルシフェラーゼノックダウンを伴う。完全なG1DDライブラリのインビトロスクリーニングおよび樹状分析プロセスを通じて、細胞内siRNA送達の増加を示したデンドリマーの群: 結合コア/SC周辺部および3～6個のSC5-8もしくはSC9-12分枝を有する結合コアを有する群が同定された。
実施例5: 効果的なインビボsiRNA送達およびG2-G4デンドリマーのデザインのための分解性デンドリマーの同定
細胞内障壁を克服できるデンドリマーを同定したら、次に、インビボでsiRNAを効率的に送達するための細胞外障壁を克服できるデンドリマーが同定された。これらの2つのプロセスを分離することにより、血液安定性、肝臓(腫瘍)局在、細胞取り込み、および活性なsiRNA放出を含む障壁を克服する化学官能性を同定することができた。デンドリマーを、肝細胞における第VII因子をサイレンスさせるその能力について評価した。というのは、わずかな血清サンプルからこの血液凝固因子を容易に定量化できるからである(Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010)。ヒットした分解性デンドリマーのうち26種を選択して、化学的多様性を最大にさせた: 22種は樹状分析プロセスに基づいて最適化された化学構造を保有し、さらに4種(2A2-SC14、2A6-SC14、2A9-SC14、および6A1-SO9)は、その高い細胞内siRNA送達能力に基づいて選択された。デンドリマーを抗第VII因子siRNA (siFVII)とともに製剤化し、1 mg siFVII/kgの投与量でマウスへi.v.注射した。FVII活性を注射の3日後に定量化した。高いインビトロ効力にもかかわらず、2A2-SC14、2A6-SC14、2A9-SC14、6A1-SO9および大部分の3分枝デンドリマーは、最小のインビボFVIIノックダウンしか示さなかった(図3A)。結合コアおよび4、5もしくは6個のSC8もしくはSC12分枝を含んだデンドリマーは、より高いノックダウンを示した。これらの研究に基づいて、SC8分枝デンドリマーは一般的にSC12分枝化合物より有効であった。
インビトロおよびインビボのハイスループットスクリーニング結果を手にして、本発明者らは、今度は、そのSAR情報を用いて、本発明者らのアプローチを検証するための予測された活性を有するデンドリマーを合理的にデザインできるかどうかを問うた。一連の分解性デンドリマーは、2つの戦略を用いて: (I) 5もしくは6個のIBCを有するポリアミンを選択することによって; および(II) デンドリマー世代拡張を介して分枝を増加させることによって調製された(図10)。戦略Iを実施するために、2種の天然アミン、つまりスペルミジン(5個のIBC)およびスペルミン(6個のIBC)が選択された。戦略IIに関しては、世代拡張を介して複数の分枝を有する分解性デンドリマーを得るために、1A2 (1個のIBC)、2A2および2A11 (2個のIBC)、3A3および3A5 (3個のIBC)、ならびに4A1および4A3 (4個のIBC)が選択された(図10Cおよび11)。インビボSARをさらに調べるために、さらに24の分解性デンドリマーが評価された(図10C)。世代拡張の後、4もしくは6個のSC分枝を有する1A2 (1個のIBC)、2A2 (2個のIBC)ならびに3A3および3A5 (3個のIBC)のより高次世代のデンドリマーは、肝細胞への良好なインビボsiRNA送達を有していたが、8個の分枝を有するデンドリマーは活性が低かった。このプロセスにより、インビトロスクリーニングにおいて不活性であったアミンコアが転換され、次にインビボ活性を示したより高次世代のデンドリマーが合理的にデザインされる。
実施例6: MYC駆動肝臓腫瘍を担持するマウスにおける分解性デンドリマーのインビボ毒性評価
肝臓がん処置に必要とされる低い毒性および高い効力の必要なバランスを有する分解性デンドリマーを同定するために、分解性デンドリマーを選択してそのインビボ毒性を評価した。並行して、本発明者らは、マウスおよび非ヒト霊長類において以前に強力であることが示された非加水分解性システムの最良の例として選択したC12-200リピドイドLNPを分析した(Love et al., 2010)。リピドイドは、クラスとして、臨床研究の最前線でベンチマーク材料である(Kanasty et al., 2013; Love et al., 2010; Sahay et al., 2013)。非免疫原性対照siRNAを用いて、個々のデンドリマー自体の毒性を最もよく評価した。デンドリマーNPは、毒性をよりよく調べるのに必要とされるよりも高い、25:1 (デンドリマー:siCTR)の重量比で製剤化された。C12-200 LNPは、以前に報告されたものと同一の製剤パラメータを用いて調製された(Love et al., 2010)。PBS緩衝液中の各NPのサイズおよびゼータ電位を特徴付けた。それらは全て同様のサイズ、直径64～80 nmを保有し、それらの表面は電荷が中性に近かった(図12Aおよび12B)。各製剤化されたNPを4 mgのsiCTR/kg用量(100 mgのデンドリマー/kgもしくは28 mgのC12-200/kg)で野生型マウスへi.v.注射した。インビボ毒性を評価するための多くの異なる方法の中で、体重減少は簡単で有益なパラメータとして利用することができる。正常マウスでは、C12-200対照LNPを含む、選択されたNPについて最小限の体重変化があった。しかしながら、候補者の中で、5A2-SC8および6A3-SC12を注射されたマウスは、より迅速な回復を経験し、初日後に正常に体重を増加させた。
これらの結果に基づいて、5A2-SC8および6A3-SC12は、単回および複数回注射による侵襲性肝臓腫瘍を担持する慢性疾患のトランスジェニックマウスにおけるそれらのインビボ毒性のさらなる評価のために選択された。十分に確立されたTet-On MYC誘導性トランスジェニック肝臓がんモデルを選択した(図13A) (Nguyen et al., 2014)。早発性の時点でMYCが過剰発現すると腫瘍がより侵襲性であるため、MYCは出生直後(p0)に誘発され、急速に増殖する肝臓腫瘍が生じた。32日齢(p32)の時点で、侵襲性肝臓腫瘍を担持するこれらの病気のトランスジェニックマウスに、3 mgのsiCTR/kg投与量(75 mgのデンドリマー/kgもしくは21 mgのC12-200/kg)で5A2-SC8もしくは6A3-SC12 NPを注射した。5A2-SC8注射を受けたマウスは、最初の日に約5%の体重を失い、2日目にその開始体重にすぐに戻ったが、6A3-SC12注射を受けたマウスは3日目までに10%の体重を依然として失っており、回復できなかった(図12D)。複数回の注射の後、6A3-SC12担体の毒性のために処置を受けなかったマウスと比べて、これらのマウスは7日早く死亡した(図12E)。WTマウスにおける結果とは対照的に、侵襲性腫瘍を担持するマウスへのC12-200 LNPの注射は、5A2-SC8注射マウスよりも約3倍少ない脂質を受けたにもかかわらず、1日後に20%超の体重を失った(図12D)。これらのデータは、化学構造の小さな変化が毒性の大きな変化を生むことができることを示した。また、腫瘍を担持するマウスは、健常マウスよりも介入に対して敏感であることも示した。これらの結果に基づいて、5A2-SC8は低毒性（75 mg/kgまでの腫瘍担持マウスにおける耐性）および有効なインビボFVIIノックダウン(1 mg siFVII/kgで95%超)のバランスを保有する分解性デンドリマーとして現れた。これらのデンドリマーは用量制限毒性の臨床上の懸念を減らし、より広い治療濃度域を可能にするので、ベンチマーク化合物よりも毒性が低いことに加えて、5A2-SC8 NPはより有効である。
実施例7: Let-7g miRNA模倣体の全身投与による肝臓腫瘍成長の強力な抑制
さらなる毒性を引き起こすことなく治療的miRNA模倣体を送達するための分解性デンドリマーNPの能力を評価するために、p0時に誘導された侵襲性MYCトランスジェニック肝臓がんモデルを再び用いた(Nguyen et al., 2014)。これらのマウスは、HCCの分子的特徴の多くを共有する腫瘍型の小児肝芽腫(HB)に似た急速に成長するがんを発症した。腫瘤効果からの腹部膨満は20日後に肉眼で確認でき、腫瘍は急速に成長した。介入がないと、マウスは生後60日以内に死亡した。このモデルの速さと致死性を考えると、成功した治療の機会は限られている。
5A2-SC8は、インビボでの毒性が低く、肝細胞標的FVIIをサイレンシングするための有効性とバランスがとれているので、まず、5A2-SC8 NPが腫瘍細胞にsiRNAを送達できるかどうかを調べた。41日齢(p41)の時点で、これらのトランスジェニックマウスの肝臓は腫瘍に満ちている(図14A)。p40で、1 mg siRNA/kgの投与量でCy5.5標識されたsiRNAを有する5A2-SC8 NPをマウスに静脈注射した。注射から24時間後、蛍光画像化により、5A2-SC8は、脾臓および腎臓における蓄積はほんの少しだけで、がん性肝臓におけるsiRNAの蓄積を媒介したことが示された(図14A～14B)。5A2-SC8 NPは、がん性肝臓が正常肝臓よりたとえ大きくても、正常およびトランスジェニック肝臓にsiRNAを送達した(図15A)。
5A2-SC8 NPがインビボでsiRNAを腫瘍細胞に送達できるかどうかをさらに確認するために、肝臓の腫瘍組織を採取し、静脈内注射の24時間後に画像化した。H＆E染色によって、腫瘍組織は細胞核で密に満ちており、がん性表現型を示すことが示された(図15B)。共焦点画像化によって、5A2-SC8 NPが標識siRNAを腫瘍細胞に効果的に送達できることが確認された(図14C)。
これらの慢性的に病気のトランスジェニックマウスにおける5A2-SC8媒介性の低分子RNA送達の治療的有用性を次に評価した。最も重要なmiRNAの1つは、多くの腫瘍型においてダウンレギュレーションされている腫瘍抑制因子ファミリーであるLet-7である(Boyerinas et al., 2010; Roush and Slack, 2008)。内因性のLet-7gは肝臓HBにおいてダウンレギュレーションされることが知られている(Nguyen et al., 2014)ので、この侵襲性の、遺伝子操作されたマウスモデルにおけるLet-7g模倣体の送達が肝臓がんの発症を阻害しうるかどうかを決定するために試験を実施した。
5A2-SC8 NPはこのモデルにおいてsiRNA送達を可能にできることが確認された。siFVIIの単回用量のi.v.送達により、血液アッセイ法(図16A)を用いておよび採取された肝臓組織におけるqPCR(図16B)によって、FVIIタンパク質の強力なサイレンシングが示された。このサイレンシングは、腫瘍発生が開始した後のp26で達成された。次に、1 mg/kgのLet-7gを5A2-SC8 NPにおいて腫瘍担持マウスへi.v.送達した(p26)。Let-7gの発現は、注射から48時間後に肝臓組織において7倍増加した(図16C)。
次いで、Let-7g模倣体もしくは対照模倣体を1 mg/kgで含有する5A2-SC8 NPの週1回投与によるp26からの治療レジメンが開始された。p50の時点で、Let-7g模倣体を受けたマウスは、著しく小さい腹部を有し、腫瘍負荷を低減させた(図16D～16F)。Let-7gは、腹囲の低減、定量性の腫瘍成長を引き起こした(図16E)。腫瘍成長に及ぼす効果は、エクスビボ肝臓画像化によって確認された(図16F)。最も重要なことには、26～61日の週1回Let-7gの送達は、体重増加(図16G)および有意に延長された生存(図16H)に影響を与えなかった。処置を受けていない全ての対照マウスおよびCTR模倣体を有する5A2-SC8 NPを受けているマウスは、60日齢前後に死亡した。C12-200 LNP (Let-7gもしくは対照模倣体)は早期死を誘導し、実験の停止を要した。5A2-SC8 NPの内部でのLet-7gの送達は、劇的な生存利益を提供し、1匹のマウスが100日まで生存した。これらの結果は、5A2-SC8が、肝臓腫瘍成長の効果的な阻害によって、慢性的に病気のトランスジェニックマウスに有意な治療的有用性を提供するように、高い送達効力と低毒性とのバランスをとることができることを示した。
実施例8: siRNA送達のための異なる脂質組成物の評価
デンドリマーナノ粒子内のどの脂質組成がsiRNA送達の改善をもたらすかを評価するために、異なるリン脂質およびPEG脂質の同一性および濃度を変化させた。3つの異なる細胞株(HeLa-Luc、A549-Luc、およびMDA-MB231-Luc)を用いた。細胞は、1ウェルあたり10K個の細胞で存在し、24時間インキュベーションした。トランスフェクションから24時間後に読み取り値を決定した。ナノ粒子においては、DSPCおよびDOPEをリン脂質として用い、PEG-DSPE、PEG-DMG、およびPEG-DHDをPEG脂質として用いた。組成物は、50:38:10:2の脂質もしくはデンドリマー:コレステロール:リン脂質:PEG脂質モル比を含む。siRNAに対する脂質/デンドリマーのモル比は、100 ngの用量を用いて100:1であった。RiboGreen、Cell-titer Fluor、およびOneGloアッセイ法を用いて、これらの組成物の有効性を決定した。結果は、HeLa-Luc細胞(図17A)、A549-Luc (図17B)、およびMDA-MB231-Luc (図17C)における相対ルシフェラーゼ活性を示す。研究において用いられた6つの製剤は、デンドリマー(脂質) + コレステロール + DSPC + PEG-DSPE (製剤1)、デンドリマー(脂質) + コレステロール + DOPE + PEG-DSPE (製剤2)、デンドリマー(脂質) + コレステロール + DSPC + PEG-DMG (製剤3)、デンドリマー(脂質) + コレステロール + DOPE + PEG-DMG (製剤4)、デンドリマー(脂質) + コレステロール + DSPC + PEG-DSPE (製剤5)、およびデンドリマー(脂質) + コレステロール + DOPE + PEG-DHD (製剤6)を含む。
さらなる実験を行って、どのリン脂質がsiRNA分子の送達の増加を示したかを決定した。HeLa-Luc細胞株を、1ウェルあたり10K個の細胞で用い、24時間インキュベーションし、トランスフェクションから24時間後に読み取りをした。組成物は、PEG脂質としてのPEG-DHDとともにリン脂質としてDOPEもしくはDOPCのいずれかを含んだ。200:1のデンドリマー(もしくは脂質)のsiRNAに対するモル比で、脂質(もしくはデンドリマー):コレステロール:リン脂質:PEG脂質の比はモル比で50:38:10:2であった。これらの組成物を、Cell-titer FluorおよびOneGloアッセイ法を用いて50 ng用量で試験した。これらの結果を図18Aおよび18Bに示す。
実施例9: sgRNAおよび他のCRISPR核酸の送達のためのデンドリマーナノ粒子の評価
CRISPR/Cas遺伝子編集のための核酸を送達する組成物を評価するために、sgRNAおよびmRNAの送達を試験した。sgRNA送達のためのZ120およびデンドリマーNPの迅速なスクリーニングを可能にしうる細胞株を作製した。例えば、HeLa (子宮頸がん)およびA549 (肺がん)細胞を樹立して、ルシフェラーゼおよびCas9を同時発現させた。選択および品質管理を検証した。所望の標的遺伝子の第1エクソンを標的とする以前に報告された方法にしたがって、ガイドRNAをデザインした。切断活性および配列特異性を示す最高スコアを保有する標的は、確立されたプロトコルを用いてsgRNA調製のために持ち越された。DNAオリゴヌクレオチドを商業的に合成し、アニールさせ、BsbI消化によってクローニングし、Cas9を含むプラスミド骨格にライゲーションした。インビトロでの転写により、sgRNAの単離が可能となり、これを送達用デンドリマーNPにパッケージングすることができた。ルシフェラーゼのために、一連の5つの異なるガイドがデザインされた。これらのガイドは、sgLuc-Cas9 pDNAトランスフェクションにより、市販の試薬を用いて最良のsgRNA配列を選択することによって検証された。次に、本発明者らは、sgLucをデンドリマーNPにパッケージングし、sgRNAの送達のためのHeLa-Luc-Cas9細胞における送達を評価した。決定した数の曝露時間後、ルシフェラーゼおよび生存性を、One Glo + Tox (Promega)を用いて未処理細胞と比べて測定した。典型的な実験では、1ウェル当たり10K個の細胞をプレーティングし、続いて24時間のインキュベーション、sgLucを含むデンドリマーナノ粒子の添加、およびトランスフェクションから24～48時間後の読み取りを行った。これらの組成物は、デンドリマー、DSPCもしくはDOPE、コレステロール、およびPEG脂質の組み合わせを含有していた。さらに、組成物はさまざまな濃度のMgCl2を含有していた。脂質(もしくはデンドリマー):コレステロール: PEG脂質のモル比は、50:38.5:0.5で、脂質の核酸(sgRNA)に対するモル比200:1および50 ngの用量であった。再び、Cell-titer FluorおよびOneGloアッセイ法を用いて結果を得た。リン脂質なしでの結果を図19に示す。リン脂質ありで同様の研究を行った。これらの組成物では、リン脂質DSPCを製剤に用いた。リン脂質を含まない組成物についての上記と同じ比を用いて、リン脂質含有組成物は、同じ投薬量を用いて50:38.5:10:0.5 (脂質/デンドリマー:コレステロール:リン脂質:PEG脂質)のモル比を有した。これらの組成物を、RiboGreen、Cell-titer Fluor、およびOneGloを用いて、2つの期間、つまり24時間および72時間の時点で試験した。24時間の時点で得られたデータを図20Aに示し、72時間のものを図20Bに示す。
実施例10: mRNA送達のためのデンドリマーナノ粒子の評価
siRNAを用いて行われた研究と同様に、mRNA分子の送達を、本明細書において記述されるデンドリマーおよびZ120で試験した。1ウェルあたり4K個の細胞の濃度、24時間のインキュベーション、トランスフェクション後24時間および48時間の読み出しで、IGROV1細胞株を用いた。これらの組成物は、DSPC、DOPE、もしくはリン脂質なしのいずれかおよびPEG-DHDをPEG脂質として含有した。脂質(もしくはデンドリマー):コレステロール:リン脂質:PEG脂質のモル比は50:38.5:0(10):2であり、デンドリマーの核酸(mRNA)に対する重量比5、10、20、30、もしくは40 対 1および2つの異なる用量: 50 ng用量および100 ng用量であった。Cell-titer FluorおよびOneGloアッセイ法を用いて結果を得た。これらの結果を図21A (24時間)および図21B (48時間)に示す。さらに、20:1比のN/Pならびにリン脂質としてのDSPCおよびPEG脂質としてのPEG-DHDを有するナノ粒子組成物を用いたmCherry mRNAの送達を図22において視覚化した。
本明細書において開示および主張される組成物および方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行されることができる。本発明の組成物および方法はある種の態様に関して記述されているが、当業者には、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書において記述される、組成物および方法にならびに方法の段階においてもしくは段階の順序において変形が適用されうることが明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある種の薬剤が、本明細書において記述される薬剤に代用されても、同じもしくは同様の結果が達成されうることが明らかであろう。当業者には明らかなそのような同様の置換および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書において記載されたものに補足的な例示的な手順もしくは他の詳細を提供する限り、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 0007041616000128
Figure 0007041616000129
Figure 0007041616000130
Figure 0007041616000131
Figure 0007041616000132
Figure 0007041616000133
Figure 0007041616000134
Figure 0007041616000135
Figure 0007041616000136
Figure 0007041616000137

Claims (13)

  1. 下記式のデンドリマー、または薬学的に許容されるその塩:
    コア-繰り返し単位-末端基(I)
    式中、複数の水素原子をコアから除去して該水素原子を複数の繰り返し単位で置換することによって、コアは、該繰り返し単位に連結され、かつ
    コアは下記式を有し:
    Figure 0007041616000138
    式中、
    X3は-NR6-、-O-、アルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、または置換アルキル(C≦8)であり;
    R3およびR4は各々独立してアミノ、もしくはアルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型; または式:
    Figure 0007041616000139
    の基であり;
    式中、
    eは1、2、もしくは3であり;
    RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
    cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6であり;
    繰り返し単位は分解性ジアシルおよび任意でリンカーを含み;
    分解性ジアシル基は下記式を有し:
    Figure 0007041616000140
    式中、
    A1およびA2は各々独立して-O-もしくは-NRa-であり、式中、
    Raは水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
    Y3はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;
    R9はアルキル(C≦8)もしくは置換アルキル(C≦8)であり;
    リンカー基は下記式を有し:
    Figure 0007041616000141
    式中、
    Y1はアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; ならびに
    繰り返し単位がリンカー基を含む場合、繰り返し単位中のリンカー基の数は１つまたは２つであり、かつリンカー基はリンカー基の窒素原子および硫黄原子の両方で分解性ジアシル基に結合しており、繰り返し単位中の第1の基は分解性ジアシル基であり、各リンカー基について、隣の基は、リンカー基の窒素原子に結合した2つの分解性ジアシル基を含み;ならびに
    末端基は下記式を有し:
    Figure 0007041616000142
    式中、
    Y4はアルカンジイル(C≦18)またはアルカンジイル(C≦18)上の水素原子の1つもしくは複数が、-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-SCH3もしくは-OC(O)CH3で置換されているアルカンジイル(C≦18)であり;
    R10は水素、カルボキシ、ヒドロキシ、もしくはアリール(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)N(R11)-アルカンジイル(C≦6)-ヘテロシクロアルキル(C≦12)、-C(O)-アルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-ジアルキルアミノ(C≦12)、-C(O)-N-ヘテロシクロアルキル(C≦12)であり、式中、
    R11は水素、アルキル(C≦6)もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
    繰り返し単位の鎖中の最後の分解性ジアシルは末端基に結合されている。
  2. X3は-NR6-、アルキルアミノジイル(C≦8)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、または置換アルキル(C≦8)であり;
    R3およびR4は各々独立してアミノ、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12); または式:
    Figure 0007041616000143
    の基であり;
    式中、
    eは1、2、もしくは3であり;
    RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
    cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6である、
    請求項1記載のデンドリマー。
  3. X3は-NR6-、-O-、アルキルアミノジイル(C≦8)、アルコキシジイル(C≦8)、またはヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)であり、式中、R6は水素、アルキル(C≦8)、または置換アルキル(C≦8)であり;
    R3およびR4は各々独立してアミノ、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12); または式:
    Figure 0007041616000144
    の基であり;
    式中、
    eは1、2、もしくは3であり;
    RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であり;
    cおよびdは各々独立して1、2、3、4、5、もしくは6である、
    請求項1記載のデンドリマー。
  4. (i) X3は-NH-もしくは-NCH3-であるか、
    (ii) X3はアルキルアミノジイル(C≦8)もしくは置換アルキルアミノジイル(C≦8)であるか、
    (iii) X3は-NHCH2CH2NH-もしくは-NHCH2CH2NHCH2CH2NH-であるか、
    (iv) X3はヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)もしくは置換ヘテロシクロアルカンジイル(C≦8)であるか、
    (v) X3はN,N'-ピペラジンジイルであるか、
    (vi) R3はアミノであるか、
    (vii) R3はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)であるか、
    (viii) R4はアミノであるか、
    (ix) R4はアルキルアミノ(C≦12)もしくは置換アルキルアミノ(C≦12)であるか、
    (x) R4は
    Figure 0007041616000145
    であり:
    式中、
    eは1、2、もしくは3であり;
    RcおよびRdは各々独立して水素、アルキル(C≦6)、もしくは置換アルキル(C≦6)であるか、
    (xi) cは2もしくは3であるか、または
    (xii) dは2もしくは3である、
    請求項1記載のデンドリマー。
  5. コアは
    Figure 0007041616000146
    としてさらに定義される、請求項1記載のデンドリマー。
  6. Y4はアルカンジイル(C≦18)であり、かつ
    R10は水素である、
    請求項1～5のいずれか一項記載のデンドリマー。
  7. A1は-O-であり、
    A2はO-であり、
    Y3はアルカンジイル(C≦8)であり、かつ
    R9はアルキル(C≦8) である、
    請求項1～6のいずれか一項記載のデンドリマー。
  8. (i) A1は-O-もしくは-NH-であるか、
    (ii) A2は-O-もしくは-NH-であるか、
    (iii) R9はアルキル(C≦8)であるか、または
    (iv) R9はメチルである、
    請求項1～6のいずれか一項記載のデンドリマー。
  9. 各末端基が独立して以下：
    Figure 0007041616000147
    からなる群より選択される、請求項1～8のいずれか一項記載のデンドリマー。
  10. (A) 請求項1～9のいずれか一項記載のデンドリマー; および
    (B) 核酸
    を含む、組成物。
  11. (i) 核酸はsiRNA、miRNA、pri-miRNA、メッセンジャーRNA (mRNA)、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(cluster regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)関連核酸、単一ガイドRNA (sgRNA)、CRISPR-RNA (crRNA)、トランス活性化crRNA (tracrRNA)、プラスミドDNA (pDNA)、トランスファーRNA (tRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、ガイドRNA、二本鎖DNA (dsDNA)、一本鎖DNA (ssDNA)、一本鎖RNA (ssRNA)、もしくは二本鎖RNA (dsRNA)であるか
    (ii) 核酸は、siRNA、tRNA、もしくはCRISPRプロセスにおいて使用されうる核酸であるか、
    (iii) デンドリマーおよび核酸は、約100:1～約1:5の重量比で存在するか、
    (iv) 1つもしくは複数のヘルパー脂質をさらに含むか、または
    (v) 1つもしくは複数のヘルパー脂質をさらに含み、ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロイド誘導体、ポリエチレングリコール(PEG)脂質、もしくはリン脂質から選択される、
    請求項10記載の組成物。
  12. (A) 請求項10または11記載の組成物; および
    (B) 薬学的に許容される担体
    を含む、薬学的組成物。
  13. 請求項10～12のいずれか一項記載の組成物もしくは薬学的組成物の薬学的有効量を含む、患者における疾患もしくは障害を処置するための薬学的組成物。
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